NO174207B

NO174207B - Analogifremgangsm}te for fremstilling av terapeutisk aktivt konjugat av membrananker-virksomt stoff

Info

Publication number: NO174207B
Application number: NO862511A
Authority: NO
Inventors: Guenther Jung; Karl-Heinz Wiesmueller; Joerg Metzger; Hans-Joerg Buehring; Gerhard Becker; Wolfgang Bessler
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1985-06-24
Filing date: 1986-06-23
Publication date: 1993-12-20
Also published as: CA1340656C; FI94419C; PT82826A; DK172399B1; NO174207C; JPS6263600A; AU5894386A; FI862631A7; ES8801677A1; PT82826B; DK294086A; KR930008091B1; NO862511L; EP0210412A3; KR870000359A; ES556417A0; DK294086D0; EP0210412A2; NO862511D0; JP2594259B2

Abstract

Konjugater av mentorananker-virksctnt stoff er beskrevet, hvor det virksomme stoffet er kovalent bundet til membranankeret som er en av forbindelsene av formlene:. hvori A kan være svovel, oksygen, disulfid (-S-S-J, metylen (-CH) eller -NH-; n = 0 til 5; m = 1 eller 2; C= asymmetrisk karbon-ater! med R eller S konfigurasjon, R, R'," er like eller forskjellige og er en alkyl-, alkenyl-eller alkenylgruppe med 7-25 karbonatomer eller hydrogen, san eventuelt kan være substi-tuert med hydroksy-, amino-, okso-, acyl-, alkyl-, eller cykloalkylgrupper og og R 2 er like eller ulike og er definert som R, R' eller R" henholdsvis kan være -OR, -OCOR, -COOR, -NHCOR, -CONHR og X er virksomt stoff eller en avstan dsgivende virksomt stoff-gruppe.Konjugatet av membrananker-virksomt stoff aker antistoffdannelsen.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktivt konjugat av membrananker-virksomt stoff, hvor et virksomt stoff er kovalent bundet til en membrananker-forbindelse.

Membrananker-forbindelser er forbindelser som kan innføres i biologiske og kunstige membraner.

Eksempelvis kan slike membrananker-forbindelser være naturlige membran-lipoproteiner, slik de allerede er isolert fra ytter-membranen fra Escherichia coli og i mellomtiden også syntetisert. E. coli membrananker-forbindelsen består i det N-terminale området av tre fettsyrer som er bundet til S-glyceryl-L-cystein (G. Jung et al. i "Peptides, Structure and Function", V.J. Hruby og D.H. Rich, side 179-182, Pierce Chem. Co. Rockford, Illinois, 1983).

Ved modellmessig undersøkelse av biologiske membraner er også allerede konformasjonsstabiliserte alfa-heliks-polypeptider beskrevet, se bl.a. alameticin, et alfa-helikalt amfifilt eicosapeptid-antibiotikum, som danner spenningsavhengige ioneledende systemer i lipidmembraner (Boheim, G. , Hanke W. , Jung G., Biphys. Struct. Mech. 9, side 181-191 (1983); Schmitt, E. og Jung, G., Liebigs Ann. Chem., side 321 til 344 og 345 til 364 (1985).

I EP-A1-330 er det beskrevet at lipopeptider, som er analogene av de allerede siden 1973 kjente 1ipoproteinene fra E. coli, virker immunpotenserende. En ytterligere europeisk patentpublikasjon, EP-A2-114787, vedrører slike lipopeptiders evne til å aktiveres rotte- og muse-alveolar makrofager in vitro, slik at disse etter 24 timers inkubering med stoffet kan eliminere tumorcellene og spesielt i betydelig grad øke antistoffproduksjonen, f.eks. mot svineserumalbumin.

I EP-A2-114787 foreslås det å anvende disse lipoprotein-etterkommerne som adjuvanser ved immuniseringen, dvs. å anvende lipoprotein-etterkommerne av E. coli membranproteinet i blanding med antigener til forbedring av immunresponsen.

Det foreligger et stort behov for stoffer som stimulerer og forsterker immunresponsen, spesielt idet rensede gener ofte bare foreligger i svært små mengder; videre finnes ved anvendelse av nye porsjoner av antigener alltid muligheten for nye forurensninger, henholdsvis dekomponeringsprodukter.

Videre foreligger et ønske om ikke å måtte vaksinere et forsøksdyr ofte, men derimot fortrinnsvis ved en enkelt tilførsel av det immunogene materialet å kunne oppnå den ønskede immunresponsen.

Til grunn for foreliggende oppfinnelse ligger følgelig den oppgaven å øke antistoffdannelsen mot antigener henholdsvis haptener for dermed å oppnå en spesifikk immunpotenserende virkning.

Ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilles et terapeutisk aktiv konjugat av membrananker-virksomt stoff hvor membrananker-forbindelsen er en forbindelse av følgende generelle formel:

hvori A kan være svovel, oksygen, disulfid (-S-S-), metylen (-CH2-) eller -NH-;

n = 0-5; m = 1 eller 2; C<*> = asymmetrisk karbonatom med R— eller S-konflgurasjon; R, R', R" er like eller forskjellige og står for en alkyl-, alkenyl- eller alkinylgruppe med 7-25

karbonatomer eller hydrogen, som eventuelt kan være sub-stituert med hydroksygrupper og X er et virksomt stoff eller en avstandsgivende virksom stoffgruppe.

Ifølge oppfinnelsen fremstilles det terapeutisk aktive konjugatet av membrananker-virksomt stoff ved en fremgangsmåte som innbefatter at det beskyttede peptidet som er beskyttet med beskyttelsesgrupper på i og for seg kjent måte ved de funksjoner hvor det ikke skal finne sted noen reaksjon, syntetiseres ved hjelp av kjente koblingsfremgangsmåter til en fast eller oppløselig bærer, som en polymer, (f.eks. Merrifield-harpiks), på en slik måte at det syntetiserte, til bæreren bundne peptidet, er kovalent bundet til membrananker-forbindelsen over N-terminalene eller sidefunksjonene av peptidet; slik at det fremstilte peptidkonjugatet kan isoleres ved at beskyttelsesgruppene samt bindingen peptid/bærer spaltes på i og for seg kjent måte, slik at membrananker-peptidet eller konjugatet av membrananker-virksomt stoff utvinnes.

Forbindelsene kan anvendes til fremstilling av konvensjonelle og monoklonale antistoffer in vitro; fortrinnsvis kan også forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen anvendes innenfor genteknologien for å lette cellesammensmeltningen, til fremstilling av syntetiske vaksiner, til fremstilling av cellemarkører med fluorescensmerker, "spin"-merker, radioaktive merker o.l., for affinitetskromatografi, spesielt for affinitetssøyler; for liposompreparater; som tilsats til næringsmidler eller forstoffer innenfor human- og dyreernær-ing, samt som tilsats til kulturmedier for mikroorganismer og generelt for cellekulturer. Herved kan forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen eventuelt anvendes sammen med i og for seg kjente bærere i oppløsning, som salver, absorbert til faste bærere, i emulsjoner eller sprayer for human- eller veterinærmedisinske formål.

Forbindelsen peptid/membrananker-forbindelse kan fremstilles ved kondensasjon, addisjon, substitusjon, oksydasjon (eksempelvis disulfid-dannelse). Fortrinnsvis kan det som membrananker anvendes konformasjonsstabiliserende alfa-alkylaminosyre-helikser med alternerende aminosyresekvens, hvor alfa-heliksen ikke må kunne destabiliseres av andre aminosyrer, som av typen X-(Ala-Aib-Ala-Aib-Ala)n-Y, hvori n = 2 henholdsvis 4, og X, Y er i og for seg kjente beskyttelsesgrupper eller -H, -0H eller -NH2.

Det kan være fordelaktig at det virksomme stoffet er kovalent bundet til to eventuelle forskjellige membrananker-forbindelser .

I tillegg kan det virksomme stoffet også være kovalent bundet til en i og for seg kjent adjuvans for immuniseringsformål, som f.eks. muramylpeptid og/eller et lipopolysakkarid.

Som virksomme stoffer foreslås eksempelvis: et antigen, som eksempelvis en lavmolekylær delsekvens av et protein eller proteid, eksempelvis et glykoprotein, et virusomhyllingspro-tein, et bakterie-celleveggprotein eller proteiner av protozooer (antigen determinanter, epitop), et intakt protein, et antibiotikum, bakteriemembranbestanddeler, som muramyldipeptid, lipopolysakkarid, et naturlig eller syntetisk hapten, et antibiotikum, hormoner, som f.eks. steroider, et nukleosid, et nukleotid, en nukleinsyre, et enzym, enzymsubstrat, en enzyminhibitor, blotin, avidin, polyetylenglykol, et peptidvirksomt stoff, som eksempelvis tuftsin, polylysin, en fluorescensmarkør (f.eks. FITC, RITC, dancyl, luminol eller cumarin), en bioluminiscensmarkør, et "spin"-merke, et alkanoid, et steroid, biogent amin, vitamin eller også et toksin som f.eks. digoksin, falloidin, amantin, tetrodoksin e.l., en kompleksdanner eller et farmakon.

Alt etter typen av det virksomme stoffet oppstår fullstendig nye anvendelsesområder for stoffene fremstilt ifølge oppfinnelsen.

Det kan også være nyttig når flere membrananker-virksomt stoffkonjugatforbindelser er tverrbundet med hverandre i lipid- og/eller virksomt stoffdelen.

Membrananker-forbindelsene og det virksomme stoffet kan også være bundet med hverandre over en tverrbinder, dette har til følge at det virksomme stoffet fjernet seg mer fra membranen hvortil det er festet med membranankeret. Som tverrbinder egner seg eksempelvis en dikarboksylsyre eller et dikarboksy-syrederivat, dioler, diaminer, polyetylenglykol, epoksyder, maleinsyrederivater o.l.

Ifølge oppfinnelsen fremstilles altså et entydig definert lavmolekylært konjugat som bl.a. egner seg til immunisering, som forbinder prinsippene bærer-antigen-adjuvans kovalent med hverandre. Bærer og adjuvans kan være både et mitogent virksomt lipopeptid, som f.eks. tripalmitoyl-S-glycerylcystein (Pam3Cys) og analoger derav, men også lipofile, konformasjonsstabiliserende alfahelikser samt kombinasjoner av slike, som Pam3Cys-antigen-heliks, alfa-heliks-antigen-hellks, eller også bare Pam3Cys-antlgen henholdsvis antigen-Pam3Cys (N- eller C-terminal tilkobling), samt antigen-heliks eller heliks-antigen (N- eller C-terminal), eller ved sidekjeder av Glu, Lys e.l. innebygget i heliksen). Dermed adskiller de nye forbindelsene seg på vesentlige punkter fra alle hittil anvendte høymolekylære konjugater av antigener med høymolekylære bærestoffer, eksempelvis proteiner som serumalbuminer, globuliner eller polylycin eller generelt høymolekylære, lineære eller tverrbundne polymerer.

Spesielt adskiller de nye forbindelsene seg imidlertid også fra alle hittil kjente adjuvanser, som eventuelt tilsettes og følgelig ikke muliggjør noen målrettet presentasjon av antigenet på celleoverflaten. De hittil kjente adjuvansene krever ofte flere immuniseringer og fører også til betennel-sesreaksjoner ved dyreforsøk. En spesiell fordel ved oppfinnelsen er den reproduserbare fremstillbarheten av pyrogenfrie, rene, kjemisk entydig definerte forbindelser, som - i motsetning til konvensjonelle forbindelser henholdsvis blandinger av forskjellige stoffer - også fører til forbedret reproduserbarhet for antistoffdannelsen. Dermed blir et spesielt anvendelsesområde for forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen området knyttet til antistoff-utvinning, genteknologi, fremstillingen av syntetiske vaksiner, diagnostikk og terapi innenfor veterinær- og humanmedisin, idet de nye konjugatene først og fremst har en spesifikk stimulerende virkning på immunresponsen, mens de hittil anvendte adjuvansene ofte har hatt en uspesifikk stimulerende virkning på immunresponsen. Overraskende kan man ved hjelp av forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen også omvandle svakt immunogene forbindelser til sterkt immunogene forbindelser. Dermed ligger en spesiell betydning av oppfinnelsen i muligheten for å spare inn dyreforsøk samt kostnader for fremstilling av antistoffene, idet de nye immunogenene også er høyaktive in vitro. På grunn av den ikke-betennelsesfremmende immuniseringsfremgangsmåten kan også et dyr anvendes flere ganger for forskjellige antistoff-utvinninger.

Endelig kan det med de nye immunogenene også fremstilles flerverdige vaksinasjonsstoffer, dvs. eksempelvis et membrananker til hvis sidekjede det er knyttet flere antigener eller haptener, slik at ved hjelp av en immunisering, flere forskjellige aktive antistoffer kan fremstilles.

En vannoppløselig, mitogen lipidanker-gruppe er eksempelvis PamsCys-Ser(Lys)n-0H, som spesielt egner seg til fremstilling av de nye immunogenene, men også til fremstilling av fluorescerende, radioaktive og biologisk aktive cellemarkø-rer. En spesielt ønsket egenskap for membrananker-virksomt stoffkonjugatene fremstilt ifølge oppfinnelsen er deres ampifili, dvs. en delvis vannoppløselighet, idet biologiske forsøk på dyr og undersøkelser med levende celler derved kan gjennomføres vesentlig enklere. Også de kunstige lipid-dobbeltsjikt membranene, liposomene og vesiklene som er påkrevet for mange forsøk, er også bare fremstillbare og stabile i vandig medium.

Et egnet ampifilt, biologisk aktivt membrananker er f.eks. Pam3Cys-Ser(Lys)n-0H. Den til Pan^Cys koblede serinresten fremmer immunogene egenskaper, mens de polare, protonerte epsilon-aminogruppene av lysinresten utgjør den hydrofile delen av molekylet. På grunn av de mange ladningene oppviser denne forbindelsestypen andre interessante egenskaper. Den kan ved induksjon av cellevekselvirkning anvendes som fusjonsaktivator ved fremstillingen av hybridom-celler, spesielt ved lengre lycinkjeder, ved kobling til polyetylenglykol eller ved kovalent inkorporering av biotin/avidin-systemet.

Videre kan forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen med fordel anvendes til fremstilling av nye liposomer ved tverrbinding, som enten kan finne sted i fettsyre- eller i peptidelen.

Membranankeret (Pam3Cys og analoger, samt heliksene) egner seg videre til forsterkning av celle/cellelvekselvirkningen, når de eksempelvis kombineres kovalent med biotin/avidinsys-temet. Ytterligere fordelaktige egenskaper ved forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen er at de kan lette cellesammensmeltningen, dette er eksempelvis påkrevet for genteknologiske arbeider. Herved kan de nye Immunogenene også anvendes ved ELISA, RIA og Bioluminescensanalyser.

Forskjellige Pam3Cys-derivater er lipid- og vannoppløselige, og er sterkt mitogent virksomme in vivo og in vitro. De egner seg også meget godt til merking av celler med FITC og andre markører som RITC, dansyl og cumarln. Spesielt kan de også anvendes ved fluorescensmikroskopi og "Fluorescence Activated Cell Sorting" (FACS).

Et prisgunstig membrananker med analog virkning som Pam3Cys er S-(1,2-dioktadecyloksykarbonylmetyl)-cystein, hvis fremstilling beskrives nøyaktig i den eksperimentelle delen.

Spesifikke koblinger av det mitogent virksomme lipidankeret til antigener kan også foregå over tverrbindere, som eksempelvis med dikarboksylsyre monohydrazinderivatene av den generelle formelen: eller også

hvori A, B = aminosyre eller (CH2)n og X, Y er i og for seg kjente beskyttelsesgrupper.

Det kan imidlertid også anvendes enhver annen tverrbinder eller avstandsgiver til fremstilling av de nye stoffene, hvorved alltid prinsippet (lavmolekylær bærer og adjuvans)-(antigen) utgjør en spesielt foretrukket utførelse av oppfinnelsen, så lenge de inneholder lipopeptidstrukturer med lipidmembrananker-funksjon og/eller konformasjonsstabiliserte helikser.

Spesielle fordelaktige virkninger kan finnes ved anvendelse av forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen innenfor affinitetskromatografi, for dette formålet egner seg spesielt lipopeptid-antigen-(hapten)-konjugater. Disse egner seg fremragende til belegging av vanlig reversert fase-HPLC-søyler (eller også preparative RP-søyler), hvorved eksempelvis en i organisk vandige systemer påført tripalmitoylforbin-delse, er festet i det apolare alkylsjiktet. Antigenet presenteres f.eks. på celleoverflatene for den mobile vandige fasen og innbyr dermed antistoffene til adsorbsjon. Dermed kan antistoffer, som reagerer spesifikt med det aktuelle antigenet, anrikes henholdsvis isoleres direkte på en slik affinitetssøyle. Elueringen av antistoffene foregår som ved andre affinitetssøyler, f.eks. ved innstilling av pH-verdien.

I det følgende skal oppfinnelsen beskrives nærmere ved hjelp av eksempler, hvorved først de anvendte forkortelsene skal gjennomgås:

Aib = 2-metyl-alanin

TFE = trifluoreddiksyre

EGF R = reseptor for epidermisk vekstfaktor

Pam = palmitoylrest

DCC = dicykloheksylkarbodiimid

DMF = dimetylformamid

FITC = fluoresceinisotiocyanat

Fmoc = fluorenylmetoksykarbonyl

But = tert.butylrest

PS-DVB = styren - divinylbenzen-kopolymerer med 4-(hydroksymetyl)fenoksymetyl-ankergrupper

HOBt = 1-hydroksybenzotriazol

RITC = rodaminisotiocyanat

Hu IFN-(Ly) 11-20 = antigendeterminanter av humant

interferon

DCH = N,N'-dicykloheksylurinstoff

EE = etylacetat

De vedlagte figurene, som skal tjene til å belyse oppfinnelsen, viser: Fig. 1 - fremstillingsskjema for Pam-Cys(C^g)2-Ser-Ser-Asn-Ala-OH

Fig. 2 - tabellene for <13>C-NMR-spektrene

Fig. 3 - <13>C-NMR-spekteret for Pam3Cys-Ser-(Lys)4-0H x 3

TFA i CDC13

Fig. 4 - <13->NMR-spekteret for Pam-CysCPanO-OBu<t> i CDCI3 Fig. 5 - <13>C-NMR-spekteret for Pam-Cys(Pam)-OH i

CDCI3/CD3OD 1:1

Fig. 6 - <13>C-NMR-spekteret (J-modulert spin-ekko-spektrum) for Pam(alfa-Pam)Cys-OBu<t>

Fig. 7 - <13>C-NMR (100 MHz) for alfa-heliks

Fig. 8 - CD-spekteret for a-heliks av HuIFN-(alfa-Ly)-ll-20 Fig. 9 - antistoffutvinningen med Pam3Cys-Ser-EGF-R (516

til 529)

Fig. 10 - et in vivo immuniseringsforsøk

Fig. 11 - en sammenligning av in vivo/in vitro immunise- ringsforsøk, og Fig. 12 - den mitogene aktiveringen av Balb/c-mus-miltceller med Pam3Cys-Ser-(Lys^FITC.

I det følgende skal det først beskrives noen fremstil-lingsfremgangsmåter for stoffer som omtalt ovenfor, samt deres forstadier.

I. Fremstilling av Pam3Cys-EGF-R(516-529)

Etter vanlig trinnvis oppbygning (Merrifield-syntese under N alfa-Fmoc/(Bu<t>)-beskyttelse, DCC/EOBt og symmetriske anhydrider av EGF-R segmentet (516-529) ble det til sist aminosyren Fmoc-Ser(Bu<t>)-0H påbygget. Etter avspaltning av Fmoc-gruppen med piperidin/DMF (1:1, 15 min.), ble det harpiksbundne pentadekapeptidet av EGF-RE:Ser(Bu<*>)-Asn-Leu-Leu-Glu- ( OBu* ) -Gly-Glu( OBu* )-Pro-Arg(H+)-Glu(OBu*)-Phe-Val-Glu(0But )-Asn-Ser-(Bu* )-0-p-alkoksy-benzyl-kopoly(dlvinyl-benzen-styren) (1 g, belegging 0,5 mmol/g) koblet sammen med Pam-Cys (CH2-CH(0Pam(CE2(0Pam) (2 mmol, i DMF/CE2C12 (1:1)) og DCC/EOBt (2 mmol, foraktivert ved 0"C, 20 minutter) (16 timer), deretter ble det utført en etterkobling (4 timer). Lipoheksadekapeptidet ble avspaltet med trifluoreddiksyre (5 ml) under tilsats av tioanisol (0,25 ml) i løpet av 2 timer.

Utbytte:

960 mg = (76*) Pam.Cys (CH2-CH(0PAM)CH2(0Pam))Ser-Asn-Leu-Leu-Glu-Gly-Glu-Pro-Arg-Glu-Phe-Val-Glu-Asn-Ser-OH X CF3C00H (korrekt aminosyreanalyse, ingen racemisering).

II. Fremstilling av S-(12,2-dioktadecyloksykarbonyletyl-N-palmitoyl-L(eller D)cystein-tert-butylester

Maleinsyre-di-oktadecylester er tilgjengelig ifølge den generelle fremgangsmåten for forestring av maleinsyre (H. Klostergaard, J. Org. Chem. 23 (1958), 108).

13 C -NMR- spek t rum:

Se fig. 2.

1,2 mmol (500 mg) N-palmitoyl-L-cystein-tert.-butylester og 1,2 mmol (745 mg) maleinsyre-di-oktadecylester oppløses i 20 ml THF. Etter tilsats av 20 mmol (3 ml) N,N,N',N'-tetrametyl-etylendiamin omrøres det under nitrogen ved tilbakeløpskjøler i 12 timer. Etter tilsats av 100 ml metanol og 5 ml vann, frasuges det fargeløse bunnfallet, vaskes med vann og metanol og tørkes i vakuum over P2n5.

Utbytte: 1 g (83*).

Smeltepunkt: 51°C.

Tynnsj iktkromatografi:

Rf = 0,80 (elueringsmiddel; CHCl3/eddikester = 14,1).

13C-NMR: Se fig. 2.

Molekylvekt: C63H121N07S (1035,7).

III. Fremstilling av S-(1,2-dioktadecyloksykarbonyletyl)-N-palmitoyl-cystein

0,48 mmol (500 mg) av den under II omtalte t-butylesteren omrøres i 65,3 mmol (7,45 g, 5 ml) trifluoreddiksyre i 1 time ved romtemperatur i en lukket beholder. Det inndampes på rotasjonsfordamper i høyvakuum, resten opptas I 1 ml kloroform, utfelles med 50 ml petroleumseter ved -20°C og tørkes i vakuum over P2°5•

Utbytte: 420 mg (89*).

Smeltepunkt: 64°C.

Tynnsjiktkromatografi på silikagelplater:

Rf = 0,73; elueringsmiddel; CHCl3/MeOH/H20 65:25:4)

<13>C-NMR: Se tabell 1.

Molekylvekt: C5gH113N07S (980,6)

Elementæranalyse:

Det nye cysteinderivatet og dets t-butylester lar seg adskille til diastereoisomerene på kieselgel og ved RP-fasekromatografi. Begge diastereomerparene av L- og D-cysteinderivatet kan fremstilles.

IV. Fremstilling av S-(1,2-dioktadecyloksykarbonyletyl)-N-palmitoyl-Cys-SertBu*)-Ser(But J-Asn-Ala-OBu*

0,2 mmol (196 mg) S-(1,2-dioktadecyloksykarbonyletyl-N-palmitoyl-cystein oppløses i 5 ml diklormetan og foraktiveres med 0,2 mmol (27 mg) HOBt i 0,5 ml DMF samt 0,2 mmol (41 mg) DCC i 30 minutter ved 0°C under omrøring. Etter tilsats av 0,2 mmol (109 mg) H-Ser(But )-Ser (Bu* J-Asn-Ala-OBu* I 3 ml diklormetan omrøres det i 12 timer ved romtemperatur. Uten ytterligere opparbeidelse tilsettes 40 ml metanol til

reaksjonsblandingen. Etter 3 timer kan et fargeløst produkt frasuges. Det opptas I litt diklormetan og utfelles på nytt med metanol. Etter vasking med metanol tørkes i vakuum over <P>2°5-

Utbytte: 260 mg (86*).

Smeltepunkt: 194°C.

Tynnsj iktkromatografi:

Rf - 0,95; (elueringsmiddel: CHCl3/MeOH/H20 = 65:25:4)

Rf = 0,70; (elueringsmiddel: CHCl3/MeOH/iseddik = 90:10:1)

13C-NMR: Se fig. 2

Molekylvekt: Cq^ E^58N6°14S (1508,3)

Elementæranalyse:

V. Fremstilling av S-(l,2-dioktadecyloksykarbonyletyl)-N-palmitoyl-Cys-Ser-Ser-Asn-Ala

53 pmol (80 mg) beskyttet lipopeptid (IV) omrøres med 13 mmol (1,5 g; 1 ml) trifluoreddiksyre i 1 time ved romtemperatur i lukket beholder. Etter avdamping i høyvakuum opptas 2 ganger med 10 ml diklormetan og det avdampes på rotasjonsfordamper hver gang. Resten opptas i 3 ml kloroform og utfelles med 5 ml metanol ved 4°C i løpet av 12 timer. Etter frasuging vaskes med metanol og tørkes i eksikator på P2°5'

Utbytte: 64 mg (87*)

Smeltepunkt: 208°C (dekomponering)

Tynnsj iktkromatografi:

Rf = 0,63; (elueringsmiddel: CHCl3/MeOH/iseddik/H20 64:25:3:4)

Rf = 0,55; (elueringsmiddel: CHCl3/MeOH/H20 = 64:25:4)

Rf = 0,06; (elueringsmiddel: CHCl3/MeOH/iseddik = 90:10:1).

Aminosyreanalyse:

Cysteinsyre 0,6; asparaginsyre 0,93; serin 1,8; alanin 1,0.

Molekylvekt: C72<H>134<N>6014S (1340)

IV. Fremstilling av Pam3Cys-Ser-(Lys)4~0H Pam3Cys-Ser(Lys)4-0H ble oppbygget ifølge fast-fase fremgangsmåten (Merrifield) på en p-alkoksybenzylalkohol-PS-DVB(15)-kopolymer med N-Fmoc-aminosyrer og syrelabil sidekjedebeskyttelse (tBu for serin og Boe for lysin). De symmetriske anhydridene av Fmoc-aminosyrene ble anvendt. Koblingen til Pam3Cys-0H ble gjennomført ifølge DCC/HOBt-fremgangsmåten og ble gjentatt for å oppnå en mest mulig kvantitativ omsetning. For å avspalte lipopeptidet fra bærerharpiksen og å fjerne sidekjedebeskyttelsen, ble harpiksen behandlet 2 ganger i 1,5 timer med trifluoreddiksyre, som deretter ble fjernet på rotasjonsfordamper 1 høyvakuum. Produktet ble omkrystallisert fra aceton.

Elementæranalysen tyder på samme måte som <13>C-spekteret på at lipopeptidet foreligger som trifluoracetat. Under antagelsen at Pam3Cys-Ser-(Lys)4-0H foreligger som dobbeltion, forblir fremdeles 3 epsilon-aminogrupper til overs, disse kan protoneres av tre trifluoreddiksyremolekyler.

<13>C-NMR-spekteret for Pam3-Cys-Ser-(Lys)4-0H x 3 TFE, viser at forbindelsen foreligger som trifluoracetat. (Kvartett for CF3~gruppen ved 110-120 ppm, samt karbonylsignaler ved 161-162 ppm). Ved aggregering av den polare molekyldelen utbres linjene for Lys- og Ser-C-atomene sterkt. Karbonylsignalet ved 206,9 stammer fra fremdeles tilstedeværende aceton som ble anvendt til omkrystallisasjonen.

Molekylvekt: 1510,4

Elementæranalyse:

Aminosyreanalyse: Aminosyreanalysen ga et forhold mellom serin og lysin på 1:4,2. De karakteristiske dekomponeringsproduktene av S-glyseryl-cystein som oppstår ved hydrolysen (6N HC1, 110°C, 18 timer) var tilstede (sammenligning med kjente standarder). Peptidandelen ble beregnet til 83*. 3 TFE-molekyler pr. lipopeptid tilsvarer en peptidandel på 80,2*, i god over-ensstemmelse med analysen.

VII. Fremstilling av Pam3Cys-Ser-(Lys>4-0H x 3 TFE

VII. l. Kobling av Fmoc- Lvs( Boc )- 0H til baererharpiksen Fmoc-Lys(Boc)-0H (4,5 g, 9,6 mmol) blandes i 15-20 ml DMF/CH2C12 1:1 (volum/volum) ved 0' C med DCC (0,99 g, 4,8 mmol). Etter 30 minutters frafUtreres det utfelte urinstoffet direkte i en ristetrakt hvori det befinner seg p-benzyloksy-benzylalkoholharpiks (2,5 g, 1,6 mmol OH-grupper). Etter tilsats av pyridin (0,39 ml, 4,8 mmol) ristes det i 18 timer ved romtemperatur. Oppløsningsmidlet frasuges og harpiksen vaskes 3 ganger, hver gang med 20 ml DMF/CH2C12 og DMF. Harpiksen blandes i 20 ml CH2C12 først med pyridin (28,8 mmol, 6 ekvivalenter) og deretter med benzoylklorid (28,8 mmol, 6 ekvivalenter). Det ristes I 1 time ved romtemperatur. Oppløsningsmidlet frasuges og harpiksen vaskes 3 ganger, hver gang med 20 ml CH2C12, DMF, isopropanol og PE-30/50.

VII. 2. Symmetrisk Fmoc- aminosyreanhydrld

Fmoc-Lys(Boc)-0H (4,5 g, 9,6 mmol, 3 ekvivalenter) oppløses i 15 ml CH2C12/DMF og blandes ved CC med DCC (4,8 mmol, 1,5 ekvivalenter). Etter 30 minutter ved 0°C frafUtreres urinstoffet direkte i reaktoren og det bearbeides videre som angitt i den etterfølgende tabellen.

Følgende fremgangsmåte gjelder for 1/5 av den innledningsvis anvendte harpiksmengden (0,5 g, 0,3 mmol OH-grupper).

Fmoc-O-butyl-serin (0,74 g, 1,92 mmol) oppløses i 4 ml CH2C12/D]VIF og blandes ved 0°C med DCC (0,96 mmol).

Etter 30 minutters frafiltreres urinstoffet direkte i reaktoren ved 0°C, og opparbeides på vanlig måte.

VII.3. Kobling til Pam3Cys-0H

Pam3Cys-0H (0,58 g, 0,64 mmol) oppløses i 5 ml CH2C12/DMF 1:1 (volum/volum) og blandes ved 0"C med HOBt (0,93 mg, 0,64 mmol) og DCC (0,64 mmol). Etter 30 minutter ved 0°C fylles blandingen direkte i reaktoren. Etter 16 timers risting etterkobles i 4 timer med molforholdet angitt ovenfor. Oppløsningsmidlet frasuges og harpiksen vaskes 3 ganger, hver gang med 20 ml DMF/CH2C12 og DMF.

VI1. 4. Avspaltnlng av heksapeptldet fra polymeren

Den Boc-beskyttede peptid-polymerharpiks-forbindelsen (ca. 1 g) fra VII.3 vaskes godt med CH2C12 og ristes i 2 x 1,5 timer med en blanding av 5 ml TFE og 0,5 ml anisol. Filtratet Inndampes i vakuum og resten opptas i 5 ml CHC13. Pam3Cys-Ser-(Lys)4-0H x 3 TFE utkrystalliseres etter tilsats av 50 ml aceton ved -20"C, det frasentrifugeres og tørkes i høyvakuum.

Utbytte: 0,41 g (85*)

Smeltepunkt: 205"C (dekomponering)

Tynnsjiktkromatografi på silikagelplater:

Rf = 0,42; (elueringsmiddel: n-BuOH/pyridin/H20/iseddik = 4:1:1:2).

Rf = 0,82; (elueringsmiddel: n-Bu0H/Me0H/H20/lseddik = 10:4:10:6).

Aminosyreanalyse:

Ser 0,95 (1); Lys 4 (4).

Molekylvekt: CgyHjLs<gN>jgOigSFg (1852,6).

Elementæranalyse: VIII. Fremstilling av Pam3Cys-Ser-(Lys)4-OH-FITC x 2 TFE Fluoresceinisotiocyanat (3,9 mg, 10 jjmol) oppløses i 2 ml kloroform og tilsettes til en oppløsning av Pam3Cys-Ser-(Lys)4-0H x 3 TFE (18,5 mg, 10 >imol) i 2 ml kloroform. Etter tilsats av 4-metylmorfolin (10 pl, 10 pmol) omrøres i 1 time og oppløsningsmidlet fjernes deretter i rotasjonsfordamper. Resten oppløses i 10 ml kloroform/aceton 1:1. Det gule produktet utfelles voluminøst ved -20°C og frasentrifugeres og tørkes i høyvakuum.

Utbytte:

16 mg etter rensing på "Sephadex LH20".

Produktet foreligger som trifluoracetat og fluorescerer meget sterkt ved aktivering med UV-lys av bølgelengde 366 nm. Sammenlignet med utgangsproduktet er en epsilon-aminogruppe kovalent bundet til FITC. Herav resulterer summeformelen Pam3Cys-Ser-(Lys)4-0H-FITC x 2 TFE, forutsatt at den dobbeltioniske strukturen bevares.

Molekylvekt: C106<H>16g<N>11<0>22S2F6 (2127,68)

Kromatografi på silikagelplater:

Rf = 0,72 (elueringsmiddel: n-butanol/pyridin/vann/iseddik = 4:1:1:2)

Rf = 0,73 (elueringsmiddel: n-butanol/maursyre/vann = 7:4:2).

Aminosyreanalyse:

Ser 1,11 (1,00), Lys 4,00 (4,00)

Hydrolyseproduktene av glycerylcystein er tilstede.

IX. Fremstilling av Pam3Cys-Ser-(Lys )4-OH x 3 HC1 Pani3Cys-Ser-(Lys )4-0H x 3 TFE (185,2 mg, 0,1 mmol) oppløses akkurat i litt kloroform, og tilnærmet det samme volumet av eterisk HCl-oppløsning tilsettes. Det ristes godt, hvorved en del utfelles, den største delen forblir imidlertid I oppløsning. Det inndampes til tørrhet på rotasjonsfordamper og tilsettes på nytt eter/HCl. Etter flere gangers gjentag-else av denne fremgangsmåten løses resten i litt kloroform og aceton tilsettes til oppløsningen inntil uklarhet. Produktet utkrystalliseres som fargeløst pulver ved -20"C og frasuges og tørkes i høyvakuum.

Utbytte: 153 mg.

Molekylvekt: C18H15g<N>1o<O>i3SCl3 (1619,63)

Elementæranalyse:

I produktet finnes fremdeles overskytende HC1.

Feltdesorbsjons-massespektrometri:

M<+->toppen kommer til syne ved m/e 1510, samt M<+>+l og M<+>+2. Karakteristiske er de protonerte fragmentene Pam3Cys-NH (908,5) ved m/e 909, 910, 911 og 912.

X. N,S-dipalmitoyl-cystein-tert.-butylester

Palmitinsyre (2,5 g, 9,6 mmol), dimetylaminopyridin (130 ml, 0,9 mmol) og dicykloheksylkarbodiimid (9,6 mmol) oppløses i 100 ml kloroform. Oppløsningen omrøres i 1/2 time og N-palmitoyl-cystein-tert.butylester (2 g, 4,8 mmol), som på forhånd er oppløst i 50 ml kloroform, tilsettes dråpevis til den andre oppløsningen. Etter 1,5 timer fjernes oppløsnings-midlet på rotasjonsfordamper, og resten opptas i 100 ml kloroform/metanol 1:5. Produktet utfelles voluminøst ved-20°C. Det frasuges og tørkes i høyvakuum.

Utbytte: 2,3 g (73*).

Molekylvekt (massespektrometri ): C3gH75N04S (655,20)

Elementæranalyse:

Tynnsjiktkromatografi på silikagelplater:

Rf = 0,67 (elueringsmiddel: kloroform/eddikester 95:5).

Rf = 0,73 (elueringsmiddel: kloroform/cykloheksan/MeOH 10:7:1).

13C-NMR: Se fig. 4.

XI. N-(a-tetradecyl-p<->hydroksy-oktadekanoyl)-cystein-tert.butylester

N-(a-palmitoyl-palmitoyl)-cystein-tert.butylester (1,5 g, 2,3 mmol) oppløses i 10 ml i-propanol og 1,5 ganger den molare mengden natriumborhydrid tilsettes. Det omrøres i 2 timer, og etter avsluttet reaksjon tilsettes nitrogenmettet N saltsyre inntil ingen hydrogenutvikling lenger foregår. Derved utfelles produktet voluminøst. Det frasuges, vaskes flere ganger med nitrogenmettet vann og tørkes i høyvakuum.

Utbytte: 1,4 g (93*).

Molekylvekt: (bestemt fra massespektrum): C39H77NO4S = 656,11

Tynnsjiktkromatografi på silikagelplater:

Rf = 0,84 (elueringsmiddel: kloroform/eddikester 95:5).

Elementæranalyse:

XII. N-(a-tetradecyl-p<->nydroksy-oktadekanoyl)-cystein

N-(cx-tet radecyl-3-hydroksy-oktadekanoyl)-cystein-tert.butylester (1 g, 1,5 mmol) behandles i 1/2 time med vannfri trifluoreddiksyre og denne fjernes deretter i høyvakuum på rotasjonsfordamper. Resten løses 1 tert.butanol og lyofiliseres.

Utbytte: 0,7 g (78*).

Molekylvekt: (bestemt fra massespektrum) C35H69NO4S (600,0)

Elementæranalyse:

Tynnsjiktkromatografi på silikagelplater:

Rf = 0,43 (elueringsmiddel: kloroform/metanol/vann 65:25:4)

XIII. N,S-dipalmitoyl-cystein

N,S-dipalmitoyl-cystein-tert.butylester (1 g, 1,5 mmol) behandles i 1 time med vannfri trifluoreddiksyre. Deretter fjernes denne på rotasjonsfordamper i høyvakuum, resten opptas i tert.butanol og lyofiliseres.

Utbytte: 0,8 g (89*).

Molekylvekt: (bestemt fra massespektrum) C35H57NO4S (598,00)

Elementæranalyse:

Tynnsj iktkromatografi:

Rf = 0,30 (elueringsmiddel: kloroform/metanol/iseddik 90:10:4 )

Rf = 0,75 (elueringsmiddel: kloroform/metanol/vann 65:24:4) Rf = 0,81 (elueringsmiddel: kloroform/metanol/ammoniakk (25*)/vann 65:25:3:4)

13C-NMR: Se fig. 5.

XIV. N-(a-palmitoyl-palmitoyl )-N' -palmitoyl-cystein-di-tert.butylester

Palmitoylklorid (8 g, 30 mmol) oppløses 1 40 ml nitrogenmettet dimetylformamld og trietylamin (60 ml, 60 mmol) tilsettes. Blandingen kokes i 3 timer i nitrogenstrøm under tilbakestrømning, hvorved det trietylammoniumkloridet som oppstår ved dannelsen av tetradecylketendimeren utfelles som fargeløst salt. Tilbakeløpskjøleren erstattes deretter av en dråpetrakt og en oppløsning av cystein-di-tert.butylester (4,9 g, 15 mmol) i 20 ml dimetylformamld tilsettes langsomt og dråpevis. Etter 6 timer fjernes oppløsningsmidlet på rotasjonsfordamper, resten opptas i kloroform og vaskes 2 ganger med 100 ml 5* kaliumhydrogensulfatoppløsning og 1 gang med 1200 ml vann. Den organiske fasen tørkes over vannfritt natriumsulfat og oppløsningsmidlet fjernes på nytt. Ved -20°C utkrystalliseres en blanding av N-(a-palmitoyl-palmitoyl)-N'-palmitoyl-cystein-tert.butylester og N,N'-dipalmitoyl-cystein-di-tert.butylester, som adskilles ved gelfiltrering på "Sephadex LH-20" i kloroform/metanol 1:1.

Utbytte: 6,4 g (40*).

Molekylvekt: (massespektrum)

Tynnsjiktkromatografi på silikagelplater:

Rf = 0,69 (elueringsmiddel: kloroform/eddikester (91:5)).

XV. N-(a-palmitoyl-palmitoyl)-cystein-tert.butylester N-(a-palmitoyl-palmitoyl)-N'-palmitoyl-cystein-di-tert.butyl-eter (3,2 g, 3 mmol) oppløses i litt metylenklorid og 100 ml 9,1 N metanolisk saltsyre tilsettes. Oppløsningen overføres i en elektrolysecelle med en sølvelektrode som anode og kvikksølv som katode, og reduseres med en konstant spenning på -1,1V. Strømstyrken avtar ved avslutningen av den elektrokjemiske reduksjonen fra ca. 200 mA til tilnærmet 0. Oppløsningsmidlet fjernes deretter på rotasjonsfordamper og produktblandingen av N-(a-palmitoyl-palmitoyl)-cystein-tert.butylester og N-palmitoyl-cystein-tert.butylester utfelles fra metanol ved -20°C. Forbindelsene adskilles ved gelfiltrering på "Sephadex LH-20" i kloroform/metanol 1:1.

Utbytte: 1,5 g (76*).

Molekylvekt: (bestemt ved massespektrum) €39117511048 (654 ,09).

Tynnsjiktkromatografi på silikagelplater:

Rf = 0,75 (elueringsmiddel: kloroform/eddikester 95:5).

Elementæranalyse:

XVI. Fremstilling av et antigenkonjugat med et konforma-sjonsstabilisert a-helikalsk membrananker

Syntese av HuIFN-a(Ly)(ll-20)-(L-Ala-Aib-Ala-Aib-Ala)2-OMe, et 20-peptid som N-terminalt bærer en antigen determinant fra menneskelig interferon (ot(LY)).

Syntesen av det lipofile membranankeret med funksjonell amino-hodegruppe H-(Ala-Aib-Ala-Aib-Ala)2-0Me kan overføres på andre konjugater. Alfa-heliksen kan også være forlenget en eller to ganger med enheten Ala-Aib-Ala-Aib-Ala. Det utgås herved fortrinnsvis fra pentapeptid Boc-Ala-Aib-L-Ala-Aib-L-Ala-OMe. (R. Oekonomopulos, G. Jung, Liebigs Ann. Chem. 1979, 1151; H. Schmitt, W. Winter, R. Bosch, G. Jung, Liebigs Ann. Chem. 1982, 1304).

XVII. Fremstilling av Boc-Asn-Arg(N02)-Arg(N02)-0H

XVII.l. Boc-Arg(N02)-0Me

Boc-Arg(N02)-0Me (15,97 g, 50 mmol) og EOBt (6,67 g, 50 mmol) i DMF (100 ml) ble innrørt ved -10° C i HC1 x H.Arg(N02 )-0Me (13,49 g, 50 mmol) og NMM (5,5 ml, 50 mmol) i CH2C12 (12 ml) i 30 minutter ved -10°C, 1 time ved 0°C og 3 timer ved romtemperatur. Det utfelte DCH ble frafUtrert og oppløs-ningsmidlet avdampet i høyvakuum. Den oljeformige resten ble oppløst I iseddik under tilsats av noe n-butanol. Etter vasking med 5* KHSO4-, 5* KECO3- og mettet NaCl-oppløsning ble den organiske fasen tørket over Na2S04, blandet med petroleumseter (30-50) og utfelt under avkjøling.

Utbytte: 20,30 g (76*).

Smeltepunkt: 130°C (dekomponering).

Tynnsj iktkromatografi:

Rf (I) = 0,69

Rf (II) = 0,87

Rf (III) = 0,81

Rf (IV) = 0,32

Rf (V) = 0,42.

Molekylvekt: C18H54<N>10°9 (534,5)

Elementæranalyse:

XVII.2. EC1 x H-Arg(N02)-Arg(N02)-0Me

Boc-Arg-(N02)-Arg(N02)-0Me (20,00 g, 37,42 mmol) ble blandet med 1,2 N HCl/eddiksyre (110 ml) og etter 30 minutter heilt i omrørt eter (600 ml). Derved ble det utfelt tynnsjikt-kromatograf isk ren HC1 x H-Arg(N02)-Arg(N02)-0Me.

Utbytte: 17,3 g (98*).

Tynnsjiktkromatografi på silikagelplater:

Rf (I) = 0,37

Rf (II) = 0,29

Rf (III) = 0,44

Rf (IV) = 0,07

Rf (V) = 0,10.

XVII.3. Boc-Asn-Arg(N02)-Arg(N02)-OMe

Boc-Asn-OE (8,39 g, 36,10 mmol) og EOBt (4,89 g, 36,10 mmol) i DMF (75 ml) ble ved -10° C tilsatt til EC1 x E-Arg(N02 )-Arg(N02)-OMe (1,700 g, 36,10 mmol) og NMM (3,98 mmol) i DMF (75 ml). Etter tilsats av DCC (7,53 g, 36,50 mmol) i CE2C12 (10 ml) ble det omrørt 30 minutter ved -10°C, 1 time ved CC og 3 timer ved romtemperatur. Etter avbrudd av reaksjonen med noen dråper iseddik, fordampes oppløsningsmidlet I vakuum og resten opptas i litt metanol. Denne oppløsningen tilsettes dråpevis under omrøring til tørr eter. Resten frafUtreres og opptas i metanol. Rent produkt utfelles under avkjøling.

Utbytte: 18,25 g (78*)

Smeltepunkt: 170°C

Tynnsj iktkromatografi:

Rf (I) = 0,59

Rf (II) = 0,67

Rf (III) = 0,66

Rf (IV) = 0,45

Rf (V) = 0,65

Aminosyreanalyse:

Asx 1,00 (1), Arg 1,85 (2).

Molekylvektbestemmelse: C22E4o<N>i2On (648,6)

Elementæranalyse:

XVII.4. Boc-Asn-Arg(N02)-Arg(N02)-0E

Boc-Asn-Arg(N02)-Arg(N02)-0Me (18,00 g, 27,75 mmol) ble forsåpet i metanol (180 ml) med IN NaOE (80 ml). Etter 2 timer ble den nøytralisert med fortynnet EC1 og metanolen ble avdampet i vakuum. Ved pH 3 ble det ekstrahert grundig med eddikester. Den organiske fasen ble vasket med litt mettet NaCl-oppløsning, tørket over Na2S04 og utkrystallisert fra en metanolisk oppløsning ved -20"C.

Utbytte: 15,84 g (90*)

Smeltepunkt: 228"C (dekomponering)

Tynnsj iktkromatografi:

Rf (I) = 0,49

Rf (II) = 0,21

Rf (III) - 0,26

Rf (IV) = 0,05

Rf (V) = 0,21

XVIII. Boc-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-(Ala-Aib-Ala-Aib-Ala^OMe.

XVIII. 1. Boc- Ala- Aib- Ala- Aib- Ala- OH

Boc-Ala-Aib-Ala-Aib-Ala-OMe (10,03 g, 20 mmol) ble forsåpet i MeOH (150 ml) med IN NaOH (40 ml, 40 mmol). Etter 2,5 timer ble det nøytralisert med IN HC1, inndampet i vakuum og fordelt mellom EE/5* KHC03 (1:1; 1000 ml). Den vandige fasen ble surgjort med 5* KHSO4 til pH 4 og ekstrahert 5 ganger med EE/l-butanol (5:1). Den organiske fasen ble tørket over Na2SC"4, blandet med PE (30-50) og pentapeptidsyren ble utfelt under avkjøling.

Utbytte: 6,54 g (65*)

Smeltepunkt: 195<0>C (dekomponering)

Tynnsj iktkromatografi:

Rf (I) = 0,72

Rf (II) = 0,80

Rf (III) = 0,87

Rf (IV) = 0,95

Rf (V) = 0,80

Aminosyreanalyse:

Ala 3,08 (3), Aib 1,98 (2).

Molekylvekt: 022<2>39^<0>3 (501,6)

Elementæranalyse:

XVIII.2. Boc-(Ala-Aib-Ala-Aib-Ala)2-0Me

Boc-Ala-Alb-Ala-Aib-Ala-OH (1,75 g, 3,48 mmol) og HOBt (470 mg, 3,48 mmol) i DMF (10 ml) ble ved -10°C tilsatt til HC1 x H-Ala-Aib-ala-Aib-Ala-OMe (1,57 g, 3,48 mmol) og NMM (384 pl, 3,48 mmol) i DMF (8 ml). Etter tilsats av DCC (825 mg, 4,00 mmol) i CH2CI2 (3 ml) ved -ICC, ble det langsomt under selvstendig oppvarming omrørt i 15 timer. Etter at reaksjonen var stoppet med noen dråper iseddik, ble det utfelte DCH frasentrifugert, resten ble vasket 2 ganger med kald DMF og oppløsningsmidlet ble avdampet i vakuum. Resten ble opptatt i 10 ml CHCl3/MeOH 1:1 og kromatografert på "Sephadex LH 20" i CHCl3/MeOH 1:1.

Utbytte: 2,246 g (72*)

Smeltepunkt: 160°C

Tynnsjiktkromatografi:

Rf (I) = 0,61

Rf (II) = 0,76

Rf (III ) = 0,83

Rf (IV) = 0,95

Rf (V) = 0,81

Molekylvektbestemmelse: C40H70N10<O>13 (899,1)

Elementæranalyse:

XVIII .3. HC1 x H-(Ala-AIb-Ala-Ail)-Ala)2-0Me

Boc-Ala-Aib-ala-Aib-Ala2-0Me (2,046 g, 2,276 mmol) ble blandet med 1,2 N ECl/AcOH (10 ml). Etter 30 minutters omrøring ble hydroklorldet utfelt med eter, frafUtrert og i oljepumpevakuum tørket over KOH.

Utbytte: 1,805 g (95*)

Tynnsj iktkromatografi:

Rf (I) = 0,50

Rf (II) = 0,38

Rf (III) = 0,71

Rf (IV) = 0,48

Rf (V) = 0,53

XVIII.4. Boc-Gln-(Ala-Aib-Ala-Aib-Ala)2-OMe

Boc-Gln-OH (997 mg, 4,05 mmol) og HOBt (547 mg, 4,05 mmol) i DMF (10 ml) ble ved -10° C tilsatt til HC1 x H-(Ala-Aib-Ala-Aib-Ala)2-OMe (2,250 g, 2,70 mmol) og NMM (298 pl, 2,70 mmol) i DMF (13 ml). Etter tilsats av DCC (846 mg, 4,10 mmol) i CH2C12 (2 ml) ved -10°C ble det under langsom, selvstendig oppvarming omrørt i 15 timer. Etter avbrudd av reaksjonen med noen dråper iseddik, ble det utfelte DCH frasentrifugert, resten ble vasket 2 ganger med litt kald DMF og oppløsnings-midlet ble fjernet i oljepumpevakuum. Resten ble opptatt i 10 ml CHCl3/MeOH 1:1 og kromatografert på "Sephadex LH 20" i CHCl3/MeOE (1:1).

Utbytte: 2,60 (94*)

Smeltepunkt: 223°C (dekomponering)

Tynnsj iktkromatografi:

Rf (I) = 0,66

Rf (II) = 0,73

Rf (III) = 0,79

Rf (IV) - 0,94

Rf (V) = 0,80.

Molekylvektbestemmelse: C45H7g<N>i2°i5 (1027,2)

Elementæranalyse:

XVIII.5. HC1 x H-Gln-(Ala-Aib-Ala-Aib-Ala)2-0Me

Boc-Gln-(Ala-Aib-Ala-Aib-Ala)2-OMe (2,60 g," 2,701 mmol) ble tørket med 1,2 N HCl/AcOH (15 ml). Etter 40 minutter ble hydrokloridet utfelt med eter under omrøring, frafUtrert og tørket i oljepumpevakuum over K0H.

Utbytte: 2,209 g (85*)

Tynnsj iktkromatograf i:

Rf (I) = 0,48

Rf (II) = 0,25

Rf (III) = 0,54

Rf (IV) = 0,24

Rf (V) = 0,35

XVIII.6. Boc-Ala-Leu-Ile-Leu-Ala-Gln-(Ala-Aib-Ala-Aib-Ala)2-OMe

Boc-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-OH (760 mg, 1,07 mmol) og HOBt (145 mg, 1,07 mmol) i DMF (12 ml) ble ved romtemperatur tilsatt til HC1 x H-Gln-(Ala-Aib-Ala-Aib-Ala)2-OMe (818 mg, 0,85 mmol) og NMM (94 pl, 0,85 mmol) i DMF (10 ml). Etter tilsats av DCC (227 mg, 1,10 mmol) i CH2C12 (1,5 ml) ble det omrørt i 64 timer. Etter avbrudd av reaksjonen med noen dråper iseddlk, ble det utfelte DCH frasentrifugert, resten ble vasket 2 ganger med litt kald DMF og oppløsningsmidlet ble fjernet i oljepumpevakuum. Resten ble opptatt i 8 ml CHCl3/MeOH (1:1) og kromatografert på "Sephadex LH 20" CHCl3/MeOH (1:1).

Utbytte: 774 mg (57*)

Smeltepunkt: 260°C (dekomponering)

Tynnsj iktkromatografi:

Rf (I) = 0,80

Rf (II) = 0,86

Rf (III) = 0,91

Rf (IV) = 0,77

Rf (V) = 0,78

Aminosyreanalyse:

Glx 1,00 (1), Ile 0,89 (1), Leu 3,10 (3), Aib 4,08 (4), Ala 7,95 (8).

Molekylvektbestemmelse: C75Hi32<N>i8°21 (1622,0)

Elementæranalyse:

XIX. Fremstilling av Boc-Asn-Arg(N02 )-Arg(N02 )-Ala-Leu-Ile-Leu-Ala-Gln-(Ala-Aib-Ala-Aib-Ala)2-0Me

XIX.l. HC1 x H-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-(Ala-Aib-Ala-Aib-Ala)2-0Me

Boc-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln - (Ala-Aib-Ala-Aib-Ala)2-0Me (754 mg, 0,465 mmol) ble blandet med 1,2 N HCl/AcOE (10 ml). Etter 50 minutter ble det inndampet noe i oljepumpevakuum, og etter tilsats av vann (10 ml) ble det lyofilisert.

Utbytte: 690 mg (95*)

Tynnsj iktkromatografi:

Rf (I) = 0,71

Rf (II) = 0,52

Rf (III) = 0,78

Rf (IV) = 0,56

Rf (V) = 0,54

XIX.2. Boc-Asn-Arg(N02)-Arg(N02)-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-(Ala-Aib-Ala-Aib-Ala)2-0Me

Boc-Asn-Arg(N02)-Arg(N02)-OH (634 mg, 0,995 mmol) og HOBt (135 mg, 1,13 mmol) i DMF (5 ml) ble ved -5°c tilsatt til HC1 x A-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-(Ala-Aib-Ala-Aib-Ala)2-0Me (20 mg, 0,398 mmol) og NMM (44 pl, 400 pmol) i DMF (7 ml). Etter tilsats av DCC (217 mg, 1,05 mmol) 1 CH2C12 (1,5 ml) ved -5°C, ble det under selvstendig oppvarming omrørt i 48 timer. Etter avbrudd av reaksjonen med 3 dråper iseddik, ble det utfelte DCH frasentrifugert. Opparbeidelsen og rensingen ved kromatografi foregår som beskrevet tidligere.

Utbytte: 630 mg (74*)

Smeltepunkt: 195°C (dekomponering)

Tynnsj iktkromatografi:

Rf (I) = 0,70

Rf (II) =0,51

Rf (III) = 0,56

Rf (IV) = 0,45

Rf (V) - 0,68

Aminosyreanalyse:

Asx 0,94 (1), Glx 1,00 (1), Ile 0,89 (1), Leu 3,16 (3), Arg 1,95 (2).

Molekylvektbestemmelse: Cgi<H>i6ø<N>3o<0>2g (2138,5) Elementæranalyse:

XX. Fremstilling av det frie eicosapeptidet

XX.1. Boc-Asn-Arg-Årg-Ala-Leu-Ile-Leu-Åla-Gln-(Ala-Aib-Ala-Aib-Ala )2-0Me x 2 HC1

Boc-Asn-Arg(N02 )-Arg(N02 )-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-(Ala-Aib-Ala-Aib-Ala)2-0Me (350 mg, 0,164 mmol) ble i 3 ml vannfri metanol blandet med 35 mg Pd/aktivt kull samt 12 pl (0,075 mmol) 6 N HC1. Under omrøring ledes ved romtemperatur hydrogen gjennom oppløsningen. Etter 20 minutter ble 8 pl (49 pmol) og etter 35 minutter 7 pl (42 pmol) 6 N BX1 tilsatt. Etter en hydrering i ca. 50 minutter var avspaltningen kvantitativ ifølge DC-kontroll. Katalysatoren ble frafUtrert og vasket flere ganger med litt metanol. Oppløsningsmidlet ble raskt avdestillert på rotasjonsfordamper (oljepumpevakuum, badtemperatur 25°C), resten ble opptatt i litt vann og lyofilisert.

Utbytte: 332 mg (95*)

Tynnsj iktkromatografi:

Rf (I) =0,16

Rf (II) = 0,11

Rf (III) = 0,21

Rf (IV) = 0,10

XX.2. H-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-1le-Leu-Leu-Ala-Gln-(Ala-Aib-Ala-Aib-Ala )2-0Me x 3 HC1

Boe-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-(Ala-Aib-Ala-Aib-Ala)2-0Me x 2 HC1 (600 mg, 0,283 mmol) ble blandet med 1,2 N HCl/AcOH (5 ml). Etter 30 minutter ble det inndampet noe på rotasjonsfordamper, blandet med vann (10 ml) og lyofilisert.

Utbytte: 564 mg (97*)

Smeltepunkt: 45°C (dekomponering)

Tynnsjiktkromatografi:

Rf (I) - 0,11

Molekylvektbestemmelse: Cg6Hi57N2gC>23Cl3 (2057,7)

Elementæranalyse:

Materialer og fremgangsmåter ved forsøkene.

Kjemikalier

Oppløsningsmiddel p.a. ble tilveiebragt fra Fa. Merck, forøvrig tørket etter vanlige fremgangsmåter og destillert. N-metylmorfolin (Merck) ble for fjernelse av sekundære aminer destillert over ninhydrin. 1-hydroksybenzotriazol og dicykloheksylkarbodiimid kom også fra Merck. Alle L-amino-syrederivatene kom fra Fa. Bachem. Boc-Aib-OH og H-Aib-OMe x HC1 ble syntetisert ved fremgangsmåter angitt i litteraturen.

Tvnns. 1 iktkromatograf i

Det ble anvendt ferdigplater "Kieselgel 60 F254" (Fa. Merck) og følgende elueringsmidler:

(I) 1-butanol/iseddik/vann 3:1:1

(II) kloroform/metanol/iseddik/vann 65:25:3:4

(III) kloroform/metanol/konsentrert ammoniakk/vann 65:35:3:4

(IV) kloroform/metanol/vann 65:25:4

(V) kloroform/metanol 1:1

Som spylereagenser ble det anvendt: ninhydrinreagens, klor/4,4'-bis(dimetylamino)difenylmetan (TDM-reagens ) og Sakaguchi-reagens. Som referanse tjente dicykloheksyl-urea med følgende verdier: Rf (I) 0,91, Rf (II) 0,82, Rf (III) 0,92, Rf (IV) 0,81, Rf (V) 0,83.

Amlnosvreanalvser

For å bestemme identiteten av mellomtrinnene ble 20 pg prøver av de beskyttede peptidene hydrolysert i 6 N HC1 i 24 timer ved 110°C. Mellomtrinn og målsekvensen av heptapeptidsegmen-tet, som inneholder Leu-Leu-bindingen, ble under ellers like betingelser hydrolysert i 72 timer. Åminosyreanalysene ble gjennomført ved hjelp av en Biotronik-aminosyreanalysator "LC 6000 E" under anvendelse av standard programmering.

Racematbestemmelse

De hydrolyserte aminosyrene ble avledet som pentafluorpropio-nylaminosyre-n-propylester og enantiomerene ble adskilt gasskromatografisk på glasskaplllarsøyler med "Chirasil-Val". De angitte prosentandelene av D-aminosyrer er ikke korrigert for hydrolysebetinget racemisering.

Elementæranal<y>se

Det ble gjennomført C,E,N-enkeltbestemmelser på en "Elemental Analyzer Modell 1104" (Carlo Erba, Milano).

Smeltepunkter

Smeltepunktene ble bestemt ifølge Tottoli og er ikke korrigerte.

Opptak av spektrene

<13>C-NMR spekteret: 30 mg av det beskyttede eicosapeptidet ble oppløst i 400 pl 12C2HC13/12C2H0<2>H (1:1) (Fa. Merck) og målt i NMR-spektrometeret "WM 400" (Fa. Bruker) i 12 timer ved 30°C. "Circulardichroismus"-spekteret: oppløsninger av det frie eicosapeptidet (c = 1-1,7 mg/ml) i etanol, trlfluoreta-nol, metanol, 1,1,1,3,3,3-heksafluorpropanol-(2 ), vann samt etanol/vann-blandlnger ble målt med "Dichrograph II" (Fa. Jouhan-Roussel).

Kromatografisk rensing

De beskyttede peptid-mellomtrinnene ble etter avslutning av koblingsreaksjonen og fjernelse av oppløsningsmidlet i oljepumpevakuum oppløst ved tilsats av et like stort volum av CHCl3/MeOH 1:1, frasentrifugert fra dicykloheksylurinstoff og kromatograf ert på "Sephadex LH 20": søyle 3 x 115 cm; elueringsmiddel CHCls/MeOH 1:1; påføringsmengde 35 ml; flythastighet 8,40 ml/10 min. De 3 ml fraksjonene ble undersøkt tynnsjiktkromatografisk i system II (TDM-reagens). Peptidene kommer til syne i eluerlngsvolumene 165-190 ml. Fraksjonene ble samlet, oppløsningsmidlet fjernet i vakuum, og resten tørket over ?2®5' Aminosyreanalysen gir de forventede verdiene og et peptidinnhold på 92-96*.

Immuniseringsforsøk

Først ble et B-cellemitogen, som samtidig er en utmerket bærer og en sterkt virksom adjuvans, forbundet kovalent med syntetiske antigendeterminanter. For dette formål ble det bl. a. anvendt det syntetiske lipopeptidet S-(2,3-bis(pal-mitoyloksy )propyl)-N-palmitoylcystelnyl-serin (Pam3Cys-Ser), som utgjør N-terminalen av lipoproteinet fra den ytre membranen av Escherichia coli. De i kovalent forbindelse med et antigen spesielt utpregede ampifile egenskapene sikrer på den ene siden en stabil forankring av S-glyceryl-forbindelsen som bærer de 3 fettsyrerestene, i lipidsjiktet av celle-membranen. På den andre siden presenteres derved også det mest polare antigenet (henholdsvis haptenet) i det ytterste hydrofile sjiktet av membranen. Idet den aktiverende virkningen av lipoproteinet alene er bestemt av denne N-terminale delen, finnes denne immunstimulerende virkningen i alle konjugatene som bærer Pan^Cys-Ser eller analoger derav.

Som eksempel anføres anvendelsen av konseptet til oppnåelse av spesifikke antistoffer mot den epidermiske vekstfaktor-reseptoren (EGF-R) fig. 9. For dette formål ble det ved hjelp av datamaskinunderstøttet epitop-søk, det ekstra cytoplas-matiske området 516-529 valgt, oppbygget ved Merrifield-syntese og til sist ble Fmoc-Ser(Bu<*>)-0H og deretter Pan^Cys-OH påbygget. Etter avspaltning av harpiksen ble det analytisk enhetlige konjugatet uten ytterligere tilsatser tilført i en engangsdose til mus i.p. Ved hjelp av ELISA analyser ble det allerede etter 2 uker fastslått høye titere av spesifikke antistoffer mot tetradekapeptidet. Vesentlig er at det ved kontrollforsøk med det alene åpenbart svakt immunogene tetradekapeptidet ikke ble oppnådd antistofftitere.

Idet Pam3Cys-konjugater også i cellekulturer er sterkt Immunogene kan det ved in vitro immunisering på en rask og elegant måte oppnås konvensjonelle og monoklonale antistoffer også mot svakt immunogene forbindelser.

Fordelene ved foreliggende konsept i forbindelse med cellekulturer er: enkel fremstilling av et kjemisk entydig definert antigen-adjuvans-konjugat i en hvilken som helst mengde, i motsetning til andre konjugater ved engangstilfør-sel eller flere "forsterkninger", med høy effektivitet in vivo og in vitro. En betydelig innsparing av forsøksdyr, ofte kan man også gi fullstendig avkall på in vivo immuniseringer og en drastisk tidsbesparelse, spesielt innenfor genteknologiske arbeider, oppnås også. Forsøk kan også gjennomføres med humancellekultursystemer.

Eksempel på en ln vivo immunisering

6 til 10 uker gamle Balb/c-mus immuniseres ved enkelt i.p. tilførsel av 50 pg og 500 jjg (0,2 ml av en 10"<1> til IO"<2 >molar oppløsning av adjuvans kovalent koblet til antigen). Pam3Cys-Ser-(EGF-R 515-529). Som kontroller tjente antigen, adjuvans og en blanding av antigen og adjuvans i sammen-lignbare molare mengder, samt medium. To uker etter in-jeksjonen ble det tatt blod fra musene ved det retroorbltale venepleksus for utvinning av serum, og antistofftiteren ble bestemt ved hjelp av ELISA.

Analoge immuniseringer kan også oppnås ved andre tilførsels-måter f.eks. i.v., oral, rektal, i.m., s.c.

Dannelsen av spesifikke antistoffer uten Freund's adjuvans mot tetradekapeptidet EGF-R 516-529 etter in vivo immunisering ble undersøkt.

Balb/c-mus ble, som vist i fig. 10, immunisert en gang i.p. med

I. Konjugat Pam3Cys-Ser (EGF-R 516-526)

II. Fritt tetradekapeptid EGF-R 516-529, alene

III. Pam3Cys-Ser alene

IV. Fritt tetradekapeptid (EGF-R 516-529) i blanding med

Pam3Cys-Ser,

med 0,2 pmol av konjugatet. Antistofftiteren ble bestemt ved hjelp av ELISA analyse. (Ordinat OD ved 405 nm) (Fig. 10). 14 dager etter immuniseringen ble det tatt blodprøver fra musene ved øyevenen og det utvunnede serumet ble anvendt 1 ELISA. Verdiene angis fra middelverdien (3-5 mus) av forskjellen mellom ELISA-verdiene av PEP 14 - BSA konjugat og BSA (Fig. 10).

Det viste seg at bare ved anvendelse av membrananker-virksomt stoff konjugatet fremstilt ifølge oppfinnelsen ble det funnet drastisk forhøyede antistoffkonsentrasjoner som langt overgår virksomheten ved hittil kjente fremgangsmåter.

Eksempel på en ln vitro Immunisering

Miltceller fra mus ble i nærvær av konjugat Pam3Cys-Ser-(EGF-R 515-529), av adjuvans Pan^Cys-Ser, av tetradekapeptid EGF-R 516-529, en blanding av antigen og adjuvans og medium, kultivert i 5 dager.

Lymfocyttene ble ved en celletetthet på 2,5 x 10^/ml 1 48 timer kultivert i 0,2 ml porsjoner i TPMI-1640 medium, anriket med 10* varmeinaktivert FCS, glutamin (2 mM), penicillin (100 U/ml), streptomycin (100 jig/ml) og 2-merkaptoetanol (5 x IO-<5> M).

Overvæskene ble utvunnet for undersøkelse av spesifikke antistoffer ved ELISA analyse.

Mitogen aktivering av mus- miltceller

Den mitogene aktiveringen av Balb/c-miltceller ved Pam3Cys-Ser-(Lys)4-FITC (sirkler), Pam3Cys-Ser-(Lys)4-0H x 3 HC1 (trekanter) og Pam3Cys-Ser-(Lys)4-0H x 2 TFE (firkanter) fremgår av fig. 12. Betingelsene for cellekultiveringen er beskrevet. (Z. Immunforsch. 153, 1977, s. 11 og Eur. J. Biochem. 115, 1981). I tegningen er på ordinaten stimule-ringsindeksen for innbygning av <3>H-thymidin i DNA (cpm-verdier for inkorporering/cpm-verdier for kontrollen uten mitogen) avsatt som funksjon av konsentrasjonen av det anvendte virksomme stoffet.

Sammenligning av in vivo/ ln vitro

I fig. 11 er det ovenfor angitte forsøket stilt overfor et in vitro forsøk: In vitro forsøk i mikrotiterplater: celletetthet: 2,5 x 10^ celler/ml; stoffkonsentrasjon: 5 x IO"<7> mmolar; inkuberings-betingelser: 37°C, 5* CO2, 5 dager.

Konj.: Konjugat Pam3Cys-Ser-(EGF-R 515-529)

Pep.: Tetradekapeptid EGF-R 516-529)

Adj.: Pam3Cys-Ser

Bland.: Blanding av fritt tetradekapeptid EGF-R 516-529 og

Pam3Cys-Ser.

Også in vitro finnes en drastisk økning av antistoffkon-sentrasjonen, hvorved anvendeligheten av cellekulturene, spesielt for fremstilling av antistoffer, utvides betydelig.

Claims

Analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktivt konjugat av membrananker-virksomt stoff hvor membrananker-forbindelsen er en forbindelse av følgende generelle formel:

hvori A kan være svovel, oksygen, disulfid"(—S—S—), metylen (-CH2-) eller -NE-;

n = 0-5; m = 1 eller 2; C<*> = asymmetrisk karbonatom med R— eller S—konfigurasjon; R, R', R" er like eller forskjellige og står for en alkyl—, alkenyl— eller alkinylgruppe med 7-25 karbonatomer eller hydrogen, som eventuelt kan være sub-stituert med hydroksygrupper og X er et virksomt stoff eller en avstandsgivende virksom stoffgruppe, karakterisert ved at den innbefatter

at det beskyttede peptidet som er beskyttet med beskyttelsesgrupper på i og for seg kjent måte ved de funksjoner hvor det ikke skal finne sted noen reaksjon, syntetiseres ved hjelp av kjente koblingsfremgangsmåter til en fast eller oppløselig bærer, som en polymer, (f.eks. Merrifield-harpiks), på en slik måte at det syntetiserte, til bæreren bundne peptidet, er kovalent bundet til membrananker-forbindelsen over N-terminalene eller sidefunksjonene av peptidet; slik at det fremstilte peptidkonjugatet kan isoleres ved at beskyttelsesgruppene samt bindingen peptid/bærer spaltes på i og for seg kjent måte, slik at membrananker-peptidet eller konjugatet av membrananker-virksomt stoff utvinnes.