NO314586B1

NO314586B1 - Isolert peptid av et proteinallergen av slekten Dermatophagoides, hele eller en del av et isolert peptid av Der p I omfattende minst en T-celle-epitop av Derp p I, isolert nukleinsyre, isolert peptid samt farmasöytiskpreparat

Info

Publication number: NO314586B1
Application number: NO19941371A
Authority: NO
Inventors: Richard D Garman; Julia L Greenstein; Mei-Chang Kuo; Bruce L Rogers
Original assignee: Immulogic Pharma Corp
Priority date: 1991-10-16
Filing date: 1994-04-15
Publication date: 2003-04-14
Also published as: PT100979A; IL103452A; KR940702936A; EP0623168B1; HU9401108D0; ATE444360T1; EP0623168A1; AU676668B2; JPH07502890A; MX9205985A; NO941371D0; NO941371L; PT100979B; FI941757A0; DE69233772D1; KR100260342B1; IL103452A0; ES2334179T3; WO1993008279A1; HU220462B1

Abstract

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer isolerte peptider av hovedproteinallergenene av slekten Dermatophafioides. Peptider innenfor rammen av denne oppfinnelse omfatter minst en T-celle-epitop, eller fortrinnsvis minst to T-celle-epitoper av et proteinallergen valgt fra allergenene Der p. Der p II, Der f I eller Der f II. Oppfinnelsen angår også modifiserte peptider som har lignende eller forbedrede terapeutiske egenskaper som det tilsvarende, naturlig forekommende allergen eller del derav, men som har reduserte sidevirkninger. Oppfinnelsen tilveiebringer dessuten nukleinsyresekvenser som koder for peptider ifølge oppfinnelsen. Det tilveiebringes også fremgangsmåter for behandling eller diagnose av følsomhet for hus-støv-midd hos et individ, og terapeutiske preparater omfattende ett eller flere peptider ifølge denne oppfinnelsen.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører isolert peptid Der p I omfattende minst en T-celle-epitop av Derp p I, isolert nukleinsyre, isolert peptid samt farmasøytisk preparat.

Ralrgninn for oppfinnelsen

Nye rapporter har dokumentert viktigheten av responser på gruppe I (f.eks. Derp I og Der fl) og gruppe II (f.eks. Derp H ng Der f TT) proteinallergener ved allergi mot husstøvmidd. F.eks. er det dokumentert at over 60% av pasientene har minst 50% av sine antimiddantistoffer rettet mot disse proteiner (f.eks. Lind, P. et al., Allergy., 32:259-274 (1984); van der Zee, J.S. et al., Journal Allergy and ninical TmmnnologVj &1:884-896 (1988)). Det er mulig at barn har en høyere grad av reaktivitet mot gruppe I og gruppe II allergenene (Thompson, P.J. et al., Immunologi 154:301-314 (1988)). Allergi mot midd av slekten DermatophagoiHes (D.) henger sammen med tilstander som eksempel astma, rhinitis og ektopisk dermatitt. To arter, D pternnyssinus og D. farinaeJ er overveiende, og som resultat er det gjort betydelige anstrengelser for å forsøke å identifisere de allergener som frembringes av disse to arter.

Det er gjort en samlet anstrengelse for ved genkloning å karakterisere hoved-allergenene fra både D. pteronyssinus og D farinae Følgelig har flere publikasjoner rapportert de fullstendige nukleotidsekvenser for flere allergener omfattende Derp I (Thomas, W. R., et al., International Arehives of Allergy and Applied Immunologyj RS - 127-129 (1988); Og Chua, K.Y., et al., Journal of F. xpeHmental Medir. ine, 16J: 175-182

(1988)), Derp II (Chua, K.Y., et al., International Archives of Allergy and Applied Immunologi 91-118-m (1990)), Dcjif I (Dilworth. R.J., et al., Clinical and Hxperimental Allergy 21:32 (1991)), Dexf II (Yuuki, T. et al., Japan Journal Allergol, 32:557-461 (1990); og Trudinger, M., et al., Clinical anrl Rvperimental Allergi 21:33-37 (1991)) og et lavmolekylært allergen (Ovey, E.R., et al., Journal of FxpeHmental Medidne, HQ: 1457-1462 (1989)).

De publiserte nukleotidsekvenser for cDNA som koder for Derp I og Der_f I, viser at disse to proteiner er høyt homologe på aminosyrenivå (81% identitet) og at de modne proteinprodukter omfattes av hhv. 222 og 223 rester (Chua, K.Y., et al., Journal of F. vperimental Mediene 162:175-182 (1988); og Dilworth, R.J., et al., supra)). Proteinallergenene Derp II og Der_f II omfattes begge av 129 rester, og er også høyt homologe (88% identitet) i aminosyresekvens (Trudinger, M., et al. supra; Yuuki, T., et al., supra; Chua, K.Y., et al., International Archives of Allergy and Applied Immunology 21:118-123 (1990)).

Isoleringen av cDNA-kloner som koder for Derp I og Der_p II har tillatt antistoffbindingsstudier på de rekombinante antigener (Green, W.K., et al., International Arenie ves of Allergy and Applied Tmrminology, 22:30-38 (1990); Chua, K.Y., et al., International Arehives pf AH<p>rgy and Appl fed Tmmnnology, 21:124-129

(1990)). Komplementære DNA-fragmenter av Der„p I er blitt uttrykt i F,, coli, og IgE-bindingsstudier med oppsamlede humane midd allergiske IgE-sera har demonstrert bindings- og ikke-bindingsregioner gjennom hele molekylet (Thomas, W.R., et al., I: Rpitopes of Atopic Allergens, Proceedings of Workshop from YTV Congress of the European Aeademy of Allergy and Clinieal Tmrminology, Berlin, Sept. 1989, pp 77-82). T-celle-epitoper av Der .p I er blitt rapportert (0'Hehir, R.E., et al., Annnal Review Immunologi 2:67-95 (1991); Stewart, G.A., et al., I: Rpitopes of Atopic Allergens, Proceedings of Workshop from XTV Congress of the Rnropean Aeademy of Allergy and Clinical Tmmunology, Berlin, sept. 1989, pp 41-47; Yessel, H., et al., I: T cell Activation in Health and Disease: Discrimination Between Immunity and Tolerance, Conference 22-26 sept., 1990, Trinity College, Oxford, U.K. og Hessel, H., et al., Journal of Tmmiinnlogg 148 (3): 738-745 (1. februar 1992).

Sammendrag av oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer isolert peptid av et proteinallergen av slekten np - rmntnphavnidps kjennetegnet ved at nevnte peptid omfatter minst én T-celle-epitop av nevnte proteinallergen, idet nevnte peptid har en positivitetsindeks på minst omtrent 150 og gjennomsnittlig T-cellestimulerings-indeks på minst omtrent 4,0 bestemt i en populasjon av individer som er følsomme for nevnte proteinallergen, hvor nevnte peptid omfatter hele eller en T-celle-epitop-inneholdende del av region 1, region 2, region 3, region 4, region 5, region 6a, region 6b, region 7, region 8, region 9, region 10, eller et funksjonelt ekvivalent peptid derav, hvor

region 1 omfatter aminosyreresidiene 1-28 av Der plog Der fl proteinallergener; region 2 omfatter aminosyreresidiene 36-68 av Der ploo Der fl proteinallergenene; region 3 omfatter aminosyreresidiene 74-109 av Der plog Der fl proteinallergener; region 4 omfatter aminosyreresidiene 118-139 av Der plog Der fl proteinallergener; region 5 omfatter aminosyreresidiene 141-166 av Der plog Der fl proteinallergener; region 6a omfatter amniosyreresidiene 161-185 av Der plog Der fl proteinallergener; region 6b omfatter aminosyrene 173-201 av Der plog Der fl allergene;

region 7 omfatter aminosyreresidiene 1-26 av Der p II og Der fil proteinallergenene; region 8 omfatter aminosyreresidiene 33-67 av Der p II og Der fil proteinallergenene; region 9 omfatter aminosyreresidiene 79-104 av Der pil og Der fil proteinallergenene; region 10 omfatter aminosyreresidiene 107-129 av Der pil og Der fil proteinallergenene.

Oppfinnelsen tilveiebringer dessuten eller en del av et isolert peptid av Derp I omfattende minste én T-celle-epitop av Derp I, kjennetegnet ved at nevnte peptid er valgt fra gruppen bestående av: a) DPI-1 (SEKVIDNR: 9); b) DP 1-2 (SEKV ID NR: 10); c) DP 1-3 (SEKV ID NR: 11); d) DP 1-4 (SEKV ID NR: 12); e) DP I-l 1,1 (SEKV ID NR: 13); f) DP 1-12,1 (SEKV ID NR: 14); g) DP 1-5 (SEKV ID NR: 15); h) DP I-13 (SEKV ID NR: 17); i) DP I-14 (SEKV ID NR: 18); j) DP I-15 (SEKV ID NR: 19); k) DP 1-6,1 (SEKV ID NR: 20); 1) DP 1-7,1 (SEKV ID NR: 21);

m) DP 1-8 (SEKV ID NR: 22);

n) DP 1-9 (SEKV ID NR: 23);

o) DP I-16 (SEKV ID NR: 24);

p) DP I-10 (SEKV ID NR: 25);

q) DP I-17 (SEKV ID NR: 26);

r) DP 1-21,1 (SEKV ID NR: 27);

s) DP 1-21,2 (SEKV ID NR: 28);

t) DP 1-22,1 (SEKV ID NR: 29);

u) DP 1-22,2 (SEKV ID NR: 30);

v) DP 1-22,3 (SEKV ID NR: 31);

w) DP 1-22,4 (SEKV ID NR: 32);

x) DP 1-23,1 (SEKV ID NR: 33);

y) DP 1-23,2 (SEKV ID NR: 34);

z) DP 1-25,1(SEKV ID NR: 35);

a') DP 1-25,2 (SEKV ID NR: 36);

b<*>) DP 1-26,1 (SEKV ID NR: 37);

c') DP 1-27,1 (SEKV ID NR: 38);

d') DP 1-28,1 (SEKV ID NR: 39); og e') DP 1-28,2 (SEKV ID NR:40).

Oppfinnelsen tilveiebringer også isolert nukleinsyre, kjennetegnet ved at den har en sekvens som koder for hele eller en del av et peptid ifølge krav 10, eller den funksjonelle ekvivalent av nevnte nukleinsyresekvens. Peptider ifølge oppfinnelsen er i stand til å modifisere, i et husstøvmiddfølsomt individ til hvilket de administreres, den allergiske respons av individet på et husstøvmidd-allergen eller et allergen som er immunologisk kryssreaktivt med husstøvmiddallergen. Denne oppfinnelse tilveiebringer også isolert peptid, kjennetegnet ved at det er immunologisk kryssreaktivt med antistoffer spesifikke for hele eller en del av et peptid ifølge krav 10.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre isolert peptid, kjennetegnet ved at det er immunologisk kryssreaktivt med T-celler reaktive med hele eller en del av et peptid ifølge krav 10.

Det er videre beskrevet isolert peptid av Der p I, kjennetegnet ved en aminosyresekvens i alt vesentlig tilsvarende en aminosyresekvens av et peptid valgt fra gruppen bestående av: a) DP I-1 (SEKV ID NR: 9); b) DP 1-2 (SEKV ID NR: 10); c) DP 1-3 (SEKV ID NR: 11); d) DP 1-4 (SEKV ID NR: 12); e) DP 1-11,1 (SEKV ID NR: 13); f) DP I-12,1 (SEKV ID NR: 14); g) DP 1-5 (SEKV ID NR: 15); h) DP I-13 (SEKV ID NR: 17); i) DP 1-14 (SEKV ID NR: 18); j) DP 1-15 (SEKV ID NR: 19); k) DP 1-6,1 (SEKV ID NR: 20); 1) DP 1-7,1 (SEKV ID NR: 21); m) DP 1-8 (SEKV ID NR: 22); n) DP 1-9 (SEKV ID NR: 23); o) DP I-16 (SEKV ID NR: 24); p) DP I-10 (SEKV ID NR: 25); q) DP I-17 (SEKV ID NR: 26); r) DP 1-21,1 (SEKV ID NR: 27); s) DP 1-21,2 (SEKV ID NR: 28); t) DP 1-22,1 (SEKV ID NR: 29); u) DP 1-22,2 (SEKV ID NR: 30); v) DP 1-22,3 (SEKV ID NR: 31); w) DP 1-22,4 (SEKV ID NR: 32); x) DP 1-23,1 (SEKV ID NR: 33); y) DP 1-23,2 (SEKV ID NR: 34); z) DP 1-25,1 (SEKV ID NR: 35); a') DP 1-25,2 (SEKV ID NR: 36); b') DP 1-26,1 (SEKV ID NR: 37); c') DP 1-27,1 (SEKV ID NR: 38); d<*>) DP 1-28,1 (SEKV ID NR: 39); e') DP 1-28,2 (SEKV ID NR: 40); og f) DP 1-5,1 (SEKV ID NR: 16).

Det er også beskrevet isolert nukleinsyre, kjennetegnet ved en sekvens som

koder for et peptid ifølge krav 17, eller den funksjonelle ekvivalent av nevnte nukleinsyresekvens.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre isolert peptid omfattende minst to regioner, idet hver region omfatter minst én T-celle-epitop av et proteinallergen av slekten Dermatophagoides, kjennetegnet ved at nevnte regioner er avledet fra de samme eller fra forskjel-lige proteinallergener av slekten Dermatophagoides, og nevnte regioner alle omfatter hele eller en del av en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av: a) DP 1-21,1 (SEKV ID NR: 27); b) DP 1-21,2 (SEKV ID NR: 28); c) DP 1-22,1 (SEKV ID NR: 29); d) DP 1-22,2 (SEKV ID NR: 30); e) DP 1-22,3 (SEKV ID NR: 31); f) DP 1-22,4 (SEKV ID NR: 32); g) DP 1-23,1 (SEKV ID NR: 33); h) DP 1-23,2 (SEKV ID NR: 34); i) DP 1-25,1 (SEKV ID NR: 35); j) DP 1-25,2 (SEKV ID NR: 36); k) DP 1-26,1 (SEKV ID NR: 37); 1) DP 1-27,1 (SEKV ID NR: 38); m) DP 1-28,1 (SEKV ID NR: 39); n) DP 1-28,2 (SEKV ID NR: 40); o) DP I-l (SEKV ID NR: 9); p) DF I-1 (SEKV ID NR: 72); q) DF 1-21,1 (SEKV ID NR: 90); r) DF 1-21,2 (SEKV ID NR: 91); s) DF 1-22 1 (SEKV ID NR: 92); t) DF 1-22,2 (SEKV ID NR: 93); u) DF 1-22,4 (SEKV ID NR: 94); v) DF 1-23,1 (SEKV ID NR: 95); w) DF 1-23,2 (SEKV ID NR: 96); x) DF 1-25,1 (SEKV ID NR: 97); y) DF 1-25,2 (SEKV ID NR: 98); z) DF 1-26,1 (SEKV ID NR: 99); a') DF 1-27,1 (SEKV ID NR: 100); b') DF 1-28,1 (SEKV ID NR: 101); c') DF 1-28,2 (SEKV ID NR: 102); d') DP 11-20 (SEKV ID NR: 50); e') DP 11-20,1 (SEKV ID NR:51); f) DP 11-20,2 (SEKV ID NR: 52); g') DP 11-20,3 (SEKV ID NR: 53); h') DP 11-20,4 (SEKV ID NR: 54); i') DP 11-20,5 (SEKV ID NR: 55); j') DP 11-20,6 (SEKV ID NR: 56); k') DP II-1 (SEKV ID NR: 41); 1') DP II-1,1 (SEKV ID NR: 57); rn') DP II-1,2 (SEKV ID NR: 58); n') DP II-2,1 (SEKV ID NR: 59); o') DP 11-2,2 (SEKV ID NR: 60); p') DP 11-2,3 (SEKV ID NR: 61); q') DP II-21 (SEKV ID NR: 62); r') DP 11-22 (SEKV ID NR: 63); s') DP 11-26 (SEKV ID NR: 64); f) DP 11-26,1 (SEKV ID NR: 65); u') DP 11-23 (SEKV ID NR: 66); v') DP 11-23,1 (SEKV ID NR: 67); w') DP 11-24 (SEKV ID NR: 68); x') DP 11-25 (SEKV ID NR: 69); y') DP 11-25,1 (SEKV ID NR: 70); z') DP H-25,2 (SEKV ID NR: 71); a") DF II-1 (SEKV ID NR: 103); b") DF II-2 (SEKV ID NR: 104); c") DF II-l3,1 (SEKV ID NR: 105); d") DF 11-3,1 (SEKV ID NR: 106); e") DF 11-4,5 (SEKV ID NR: 107); f) DF 11-4,3 (SEKV ID NR: 108); o") DF II-15 (SEKV ID NR: 109);

h") DF 11-16 (SEKV ID NR: 110); i") DF II-17 (SEKV ID NR: 111);

j") DF 11-18 (SEKV ID NR: 112);

k") DF II-19 (SEKV ID NR: 113);

1") DF 11-19,1 (SEKV ID NR: 114);

m") DF II-21 (SEKV ID NR: 115) og

n") DF 11-29 (SEKV ID NR: 116).

Foreliggende oppfinnelse vedrører isolert nukleinsyre, kjennetegnet ved en sekvens som koder for hele eller en del av et peptid ifølge krav 26, eller den funksjonelle ekvivalent av nevnte nukleinsyresekvens.

Det er også beskrevet isolert peptid, kjennetegnet ved at det er fremstilt i en vertscelle transformert med nukleinsyren ifølge krav 26.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også isolert nukleinsyre, kjennetegnet ved en sekvens som koder for hele eller en del av et peptid ifølge krav 20, eller den funksjonelle ekvivalent av nevnte nukleinsyresekvens.

Det er også beskrevet isolert peptid, kjennetegnet ved at det er fremstilt i en vertscelle transformert med nukleinsyren ifølge krav 30.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre hele eller en del av et isolert peptid av et proteinallergen av slekten Dermatophagoides, kjennetegnet ved at nevnte peptid eller del derav omfatter minst én T-celle-epitop av nevnte proteinallergen, og at nevnte peptid har formelen Xn-Y-Zm, hvori Y er en aminosyresekvens valgt fra gruppen

bestående av:

a) DF 1-21,1 (SEKV ID NR: 90); b) DF 1-21,2 (SEKV ID NR: 91); c) DF 1-22,1 (SEKV ID NR: 92); d) DF 1-22,2 (SEKV ID NR: 93); e) DF 1-22,4 (SEKV ID NR: 94); f) DF 1-23,1 (SEKV ID NR: 95); g) DF 1-23,2 (SEKV ID NR: 96); h) DF 1-25,1 (SEKV ID NR: 97); i) DF 1-25,2 (SEKV ID NR: 98); j) DF 1-26,1 (SEKV ID NR: 99); k) DF 1-27,1 (SEKV ID NR 100); 1) DF 1-28,1 (SEKV ID NR: 101); m) DF 1-28,2 (SEKV ID NR: 102); n) DF I-1 (SEKV ID NR: 72); o) DP 11-20 (SEKV ID NR: 50); p) DP 11-20,1 (SEKV ID NR: 51); q) DP 11-20,2 (SEKV ID NR: 52); r) DP 11-20,3 (SEKV ID NR: 53); s) DP 11-20,4 (SEKV ID NR: 54); t) DP 11-20,5 (SEKV ID NR: 55); u) DP II 20,6 (SEKV ID NR: 56); v) DP II-l (SEKV ID NR: 41); w) DP II-1,1 (SEKV ID NR: 57); x) DP II-1,2 (SEKV ID NR: 58); y) DP II-2,1 (SEKV ID NR: 59); z) DP 11-2,2 (SEKV ID NR: 60); a') DP 11-2,3 (SEKV ID NR: 61); b') DP II-21 (SEKV ID NR: 62); c') DP 11-22 (SEKV ID NR: 63); d') DP 11-26 (SEKV ID NR: 64); e') DP 11-26,1 (SEKV ID NR: 65); f) DP 11-23 (SEKV ID NR: 66); g') DP 11-23,1 (SEKV ID NR: 67); h') DP 11-24 (SEKV ID NR: 68); i') DP 11-25 (SEKV ID NR: 69); j') DP H-25,1 (SEKV ID NR:70); k') DP 11-25,2 (SEKV ID NR:71); 1') DF II-1 (SEKV ID NR: 103); m') DF II-2 (SEKV ID NR: 104); n') DF 11-13,1 (SEKV ID NR: 105); o') DF II-3,1 (SEKV ID NR: 106); p') DF 11-4,5 (SEKV ID NR: 107); q') DF 11-4,3 (SEKV ID NR: 108); r") DF II-15 (SEKV ID NR: 109); s') DF II-16 (SEKV ID NR: 110); f) DF II-17 (SEKV ID NR: 111);

u') DF II-18 (SEKV ID NR: 112);

v') DF II-19 (SEKV ID NR: 113);

w') DF II-l9,1 (SEKV ID NR: 114);

x') DF II-21 (SEKV ID NR: 115); og

/) DF 11-22 (SEKV ID NR: 116) hvor Xn er aminosyrerester i nabostilling til aminoterminus av Y i amionsyresekvensen av nevnte proteinallergen, hvor Zm er aminosyrerester i nabostilling til karboksyterminus av Y i aminosyresekvensen av nevnte proteinallergen, hvori n er 0-30 og hvor m er 0-30.

Det er også beskrevet hele eller en del av et isolert peptid av et proteinallergen av slekten Dermatophagoides, kjennetegnet ved at nevnte peptid eller del derav omfattende minst én T-celle-epitop av nevnte proteinallergen, og at nevnte peptid omfatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av: a) DF I-l (SEKV ID NR 72); b) DF 1-2,1 (SEKV ID NR: 73); c) DF 1-3 (SEKV ID NR: 74); d) DF 1-4 (SEKV ID NR: 75); e) DF I-11 (SEKV ID NR: 76); f) DF I-12 (SEKV ID NR: 77); g) DF 1-5 (SEKV ID NR: 78); h) DF 1-13 (SEKV ID NR: 79); i) DF 1-14 (SEKV ID NR: 80); j) DF 1-15 (SEKV ID NR: 81); k) DF 1-6 (SEKV ID NR: 82); 1) DF 1-7 (SEKV ID NR: 83); m) DF 1-8,1 (SEKV ID NR: 84); n) DF 1-8 (SEKV ID NR: 85); o) DF 1-9 (SEKV ID NR: 86); p) DF I-16 (SEKV ID NR: 87); q) DF I-10 (SEKV ID NR: 88); r) DF I-17 (SEKV ID NR: 89); s) DF 1-21,1 (SEKV ID NR: 90); t) DF 1-21,2 (SEKV ID NR: 91); u) DF 1-22,1 (SEKV ID NR: 92); v) DF 1-22,2 (SEKV ID NR: 93); w) DF 1-22,4 (SEKV ID NR: 94); x) DF 1-23,1 (SEKV ID NR: 95); y) DF 1-23,2 (SEKV ID NR: 96); z) DF 1-25,1 (SEKV ID NR: 97); a") DF 1-25,2 (SEKV ID NR: 98); b') DF 1-26,1 (SEKV ID NR: 99); c') DF 1-27,1 (SEKV ID NR: 100); d') DF 1-28,1 (SEKV ID NR: 101); e') DF 1-28,2 (SEKV ID NR: 102); f) DP 11-20 (SEKV ID NR: 50); g') DP 11-20,1 (SEKV ID NR: 51); h') DP 11-20,2 (SEKV ID NR: 52); i') DP 11-20,3 (SEKV ID NR: 53); j') DP 11-20,4 (SEKV ID NR: 54); k') DP 11-20,5 (SEKV ID NR: 55); V) DP II-20,6(SEKV ID NR: 56); m') DP II-l (SEKV ID NR: 41); o') DP II-2 (SEKV ID NR: 42); p') DP II-3,1 (SEKV ID NR: 43); q') DP II-4 (SEKV ID NR: 44); r') DP II-5 (SEKV ID NR: 45); s') DP II-6 (SEKV ID NR: 46); f) DP II-7 (SEKV ID NR: 47); u') DP II-8 (SEKV ID NR: 48); v') DP II-9 (SEKV ID NR: 49); w') DP II-l,1 (SEKV ID NR: 57); x') DP II-1,2 (SEKV ID NR: 58); y') DP II-2,1 (SEKV ID NR: 59); z') DP 11-2,2 (SEKV ID NR: 60); a") DP 11-2,3 (SEKV ID NR: 61); b") DP II-21 (SEKV ID NR: 62); c") DP 11-22 (SEKV ID NR: 63); d") DP 11-26 (SEKV ID NR: 64); e<M>) DP 11-26,1 (SEKV ID NR: 65); f) DP 11-23 (SEKV ID NR: 66); g") DP 11-23,1 (SEKV ID NR: 67);

h") DP 11-24 (SEKV ID NR: 68); i") DP 11-25 (SEKV ID NR: 69); j") DP 11-25,1 (SEKV ID NR: 70); k") DP 11-25,2 (SEKV ID NR: 71); 1") DF II-1 (SEKV ID NR: 103); m") DF II-2 (SEKV ID NR: 104);

n") DF 11-13,1 (SEKV ID NR: 105); o") DF II-3,1 (SEKV ID NR: 106); p") DF 11-4,5 (SEKV ID NR: 107); q") DF 11-4,3 (SEKV ID NR: 108); r") DF II-15 (SEKV ID NR: 109); s") DF II-16 (SEKV ID NR: 110); t") DF 11-17 (SEKV ID NR: 111); u") DF II-18 (SEKV ID NR: 112);

v") DF 11-19 (SEKV ID NR: 113);

w") DF 11-19,1 (SEKV ID NR: 114);

x") DF 11-21 (SEKV ID NR: 115); og

y") DF 11-22 (SEKV ID NR: 116).

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre isolert nukleinsyre, kjennetegnet ved at den har en sekvens som koder for hele eller en del av et peptid ifølge krav 38, eller den funksjonelle ekvivalent av nevnte nukleinsyresekvens.

Det er også beskrevet isolert peptid, kjennetegnet ved at det er immunologisk kryssreaktivt med antistoffer som er spesifikke for hele eller en del av et peptid ifølge krav 38.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også isolert peptid, kjennetegnet ved at det er immunologisk kryssreaktivt med T-celler som er reaktive med hele eller en del av et peptid ifølge krav 38.

Det er også beskrevet isolert peptid av et proteinallergen av slekten Dermatophagoides, kjennetegnet ved at nevnte peptid er valgt fra gruppen bestående av: a) DF I-1 (SEKV ID NR: 72); b) DF 1-21,1 (SEKV ID NR: 90); c) DF 1-22,1 (SEKV ID NR: 92); d) DF 1-25,1 (SEKV ID NR: 97); e) DF 1-23,1 (SEKV ID NR: 95); f) DF 1-9 (SEKV ID NR: 86); g) DF 1-21,2 (SEKV ID NR: 91); h) DP II-l (SEKV ID NR: 41); i) DP II-1,2 (SEKV ID NR: 58); j) DP 11-22 (SEKV ID NR: 63); k) DP 11-25,1 (SEKV ID NR: 70); 1) DP II-21 (SEKV ID NR: 62);

m) DP 11-25 (SEKV ID NR: 69);

n) DP 11-20,6 (SEKV ID NR: 56);

o) DP 11-20 (SEKV ID NR: 50);

p) DF 11-4,5 (SEKV ID NR: 107);

q) DF II-2 (SEKV ID NR: 104);

r) DF 11-19,1 (SEKV ID NR: 114);

s) DF II-17 (SEKV ID NR: 111);

t) DF II-15 (SEKV ID NR: 109);

u) DP 11-25,2 (SEKV ID NR: 71) og

v) DF 1-22,2 (SEKV ID NR: 92).

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre isolert peptid eller et proteinallergen av slekten Dermatophagoides, kjennetegnet ved at nevnte peptid er valgt fra gruppen bestående av: a) DF I-1 (SEKV ID NR: 72); b) DF 1-2,1 (SEKV ID NR: 73); c) DF 1-3 (SEKV ID NR: 74); d) DF 1-4 (SEKV ID NR: 75); e) DF I-11 (SEKV ID NR: 76); f) DF I-12 (SEKV ID NR: 77); g) DF 1-5 (SEKV ID NR: 78); h) DF I-13 (SEKV ID NR: 79); i) DF 1-14 (SEKV ID NR: 80); j) DF 1-15 (SEKV ID NR: 81); k) DF 1-6 (SEKV ID NR: 82); 1) DF 1-7 (SEKV ID NR: 83); m) DF 1-8,1 (SEKV ID NR: 84); n) DF 1-8 (SEKV ID NR: 85); o) DF 1-9 (SEKV ID NR: 86); p) DF I-16 (SEKV ID NR: 87); q) DF I-10 (SEKV ID NR: 88); r) DF I-17 (SEKV ID NR: 89); s) DF 1-21,1 (SEKV ID NR: 90); t) DF 1-21,2 (SEKV ID NR: 91); u) DF 1-22,1 (SEKV ID NR: 92); v) DF 1-22,2 (SEKV ID NR: 93); w) DF 1-22,4 (SEKV ID NR: 94); x) DF 1-23,1 (SEKV ID NR: 95); y) DF 1-23,2 (SEKV ID NR: 96); z) DF 1-25,1 (SEKV ID NR: 97); a') DF 1-25,2 (SEKV ID NR: 98); b') DF 1-26,1 (SEKV ID NR: 99); c') DF 1-27,1 (SEKV ID NR: 100); d') DF 1-28,1 (SEKV ID NR: 101); e') DF 1-28,2 (SEKV ID NR: 102); f) DP 11-20 (SEKV ID NR: 50); g) ' DP 11-20,1 (SEKV ID NR: 51); h') DP 11-20,2 (SEKV ID NR: 52); i') DP 11-20,3 (SEKV ID NR: 53); j') DP 11-20,4 (SEKV ID NR: 54); k') DP 11-20,5 (SEKV ID NR: 55); Y) DP II 20,6 (SEKV ID NR: 56); rn') DP II-1 (SEKV ID NR: 41); o') DP II-2 (SEKV ID NR: 42); p') DP 11-3,1 (SEKV ID NR: 43); q') DP II-4 (SEKV ID NR: 44); r') DP II-5 (SEKV ID NR: 45); s') DP II-6 (SEKV ID NR: 46); f) DP II-7 (SEKV ID NR: 47); u') DP II-8 (SEKV ID NR: 48); v') DP II-9 (SEKV ID NR: 49); w') DP II-1,1 (SEKV ID NR: 57); x') DP 11-1,2 (SEKV ID NR: 58); y') DP II-2,1 (SEKV ID NR: 59); z<*>) DP 11-2,2 (SEKV ID NR: 60); a") DP 11-2,3 (SEKV ID NR: 61); b") DP II-21 (SEKV ID NR: 62); c") DP 11-22 (SEKV ID NR: 63); d") DP 11-26 (SEKV ID NR: 64); e") DP 11-26,1 (SEKV ID NR: 65); f) DP 11-23 (SEKV ID NR: 66); g<M>) DP 11-23,1 (SEKV ID NR: 67);

h") DP 11-24 (SEKV ID NR: 68); i") DP 11-25 (SEKV ID NR: 69); j") DP 11-25,1 (SEKV ID NR: 70); k") DP 11-25,2 (SEKV ID NR: 71); 1") DF II-l (SEKV ID NR: 103); rn") DF II-2 (SEKV ID NR: 104);

n") DF 11-13,1 (SEKV ID NR: 105); o") DF 11-3,1 (SEKV ID NR: 106); p") DF 11-4,5 (SEKV ID NR: 107); q") DF 11-4,3 (SEKV ID NR: 108); r") DF II-15 (SEKV ID NR: 109); s") DF II-16 (SEKV ID NR: 110); t") DF II-17 (SEKV ID NR: 111); u") DF II-18 (SEKV ID NR: 112); v") DF 11-19 (SEKV ID NR: 113);

w") DF II-19,1 (SEKV ID NR: 114);

x") DF II-21 (SEKV ID NR: 115); og

y") DF 11-22 (SEKV ID NR: 116).

Det er videre beskrevet terapeutisk preparat, kjennetegnet ved minst ett isolert peptid ifølge krav 1, 17,22,28, 32, 38 eller 49, og en farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynningsmiddel.

Det er også beskrevet terapeutisk preparat omfattende en farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynningsmiddel og minst to peptider, kjennetegnet ved at nevnte peptider begge omfatter minst én T-celle-epitop av et proteinallergen av slekten Dermatophagoides, og at nevnte peptider er avledet fra de samme eller fra forskjellige proteinallergener av slekten Dermatophagoides.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også t erapeutisk preparat, kjennetegnet ved minst ett peptid av minst ett proteinallergen av slekten Dermatophagoides og en farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynningsmiddel, idet preparatet omfatter en tilstrekkelig prosentandel av T-celle-epitopene av nevnte minst ene proteinallergen slik at ved administrering av preparatet til et individ som er følsomt for et husstøvmidd-allergen, blir T-cellene hos individet gjort tålbare for nevnte minst ene proteinallergen.

Kort beskrivelse, av tegningen e

Fig. 1 viser subkloning og ekspresjon av gruppe I og gruppe II allergener fra EL pternnyssiniis og D. farinae. Fig. 2a viser adaptorer som anvendes ved ekspresjonen av Derp I og Der f I og fig. 2b viser primere for oppformering av Der f IT og Derp II og en Der f IT mutageneseprimer. Fig. 3 viser forskjellige peptider av ønsket lengde avledet fra Derp I og Der p II proteinallergener. Fig. 4 viser forskjellige peptider av ønsket lengde avledet fra Der f T og Der f II proteinallergener. Fig. 5 er en grafisk fremstilling som viser responsen av T-cellelinjer fra 33 pasienter primet in vitrrt med enten renset naturlig (N) eller rekombinant (R) Her p I protein og analysert på respons for forskjellige overlappende Derp I peptider i prosent av responser med en T-cellestimuleringsindeks (S.I.) på minst 2 innenfor de testede individer, den gjennomsnittlige T-cellestimuleringsindeks for positive responser på peptidet og den rangerte sum av peptidresponser. Fig. 6 er en grafisk fremstilling som viser responsen av T-celle-Iinjer fra 16 pasienter primet in virro med Der f T proteinet og analysert for respons på forskjellige overlappende Der_f I peptider ved prosent respons med en (S.I.) på minst 2 innenfor de testede individer, den gjennomsnittlige T-cellestimuleringsindeks for positive responser på peptidet og den rangerte sum av peptidresponser. Fig. 7 er en grafisk fremstilling som viser responsen av T-cellelinjer fra 14 pasienter primet in vitro med Derp I proteinet og analysert for respons på forskjellige overlappende Derp I peptider og i alt vesentlig matchende Der_f I peptider i prosent respons med en S.I. på minst 2 innenfor de testede individer, den gjennomsnittlige T-cellestimuleringsindeks av positive responser for peptidet og den rangerte sum av peptidresponser. Fig. 8 er en grafisk fremstilling som viser responsen av T-cellelinjer fra 8 pasienter primet in vitro med Der fl proteinet og analysert for respons på forskjellige overlappende Dexf I peptider og i alt vesentlig matchende Derp I peptider i prosent respons med en S.I. på minst 2 innenfor de testede individer, den gjennomsnittlige T-cellestimuleringsindeks av positive responser for peptidet og den rangerte sum av peptidresponser. Fig. 9 er en grafisk fremstilling som viser responsen av T-cellelinjer fra 29 pasienter primet in vitro med Derp II-proteinet og analysert for respons på forskjellige overlappende Der p II peptider i prosent respons med en S.I. på minst 2 innenfor de testede individer, den gjennomsnittlige T-cellestimuleringsindeks av positive responser for peptidet og den rangerte sum av peptidresponser. Fig. 10 er en grafisk fremstilling som viser responsen av T-cellelinjer fra 10 pasienter primet in vitro med Her f II proteinet og analysert for respons på forskjellige overlappende Der f TI peptider i prosent respons med en S.I. på minst 2 innenfor de testede individer, den gjennomsnittlige T-cellestimuleringsindeks av positive responser for peptidet og den rangerte sum av peptidresponser. Fig. 11 er en grafisk fremstilling som viser responsen av T-cellelinjer fra 10 pasienter primet in vitro med Der f IT proteinet og analysert for respons på forskjellige overlappende Der f IT peptider og i alt vesentlig matchende Tier p II peptider i prosent respons med en S.I. på minst 2 innenfor de testede individer, den gjennomsnittlige T-cellestimuleringsindeks av positive responser for peptidet og den rangerte sum av peptidresponser. Fig. 12 er en grafisk fremstilling som viser responsen av T-cellelinjer fra 26 pasienter primet in vitro med Derp II proteinet og analysert for respons på forskjellige overlappende Der f II peptider i prosent av responser med en S.I. på minst 2 innenfor de testede individer, den gjennomsnittlige T-cellestimuleringsindeks av positive responser for peptidet og den rangerte sum av peptidresponser. Fig. 13 er en grafisk fremstilling som viser responsen av T-cellelinjer fra 33 pasienter primet in vitro med Derp I proteinet og analysert for respons på valgte peptider av ønsket lengde avledet fra Derp I proteinallergenet i prosent respons med en S.I. på minst 2 innenfor de testede individer, den gjennomsnittlige T-cellestimuleringsindeks av positive responser for peptidet og den rangerte sum av peptidresponser. Fig. 14 er en grafisk fremstilling som viser responsen av T-cellelinjer fra 9 pasienter primet in vitro med Der fl proteinet og analysert for respons på valgte peptider av ønsket lengde avledet fra Der fl proteinallergenet, i prosent respons med en S.I. på minst 2 innenfor de testede individer og den gjennomsnittlige T-cellestimuleringsindeks av positive reseponser for peptidet og den rangerte sum av peptidresponser. Fig. 15a er en grafisk fremstilling som viser responsen av T-cellelinjer fra 30 matcheded pasienter primet in vitro med Derp I proteinet og analysert for respons på valgte peptider av ønsket lengde avledet fra Derp I og Der f T proteinallergenene, i prosent respons med en S.I. på minst 2 innenfor de testede individer og den gjennomsnittlige T-cellestimuleringsindeks av positive responser for peptidet. Fig. 15b er en grafisk fremstilling avledet fra de samme data som er vist i fig. 15a og som viser responsen av Derp I primede T-celler på foretrukne Dex.p I peptider analysert i prosent respons med en S.I. på minst to innenfor de testede individer (over hver søyle), den gjennomsnittlige T-cellestimuleringsindeks (over hver søyle i parentes) og den rangerte sum av peptidresponser. Fig. 16a er en grafisk fremstilling som viser responsen av T-cellelinjer fra 9 pasienter primet in vitro med Der fl proteinet og analysert for respons på utvalgte peptider av ønsket lengde avledet fra Der fl og Derp I proteinallergenene, i prosent respons med en S.I. på minst 2 innenfor de testede individer og den gjennomsnittlige T-cellestimuleringsindeks av responser med en S.I. på minst 2 for peptidet. Fig. 16b er en grafisk fremstilling avledet fra de samme data som er vist i fig. 16a og som viser responsen av Derp I primede T-cellelinjer på foretrukne Der fl og Derp I peptider i prosent respons med en S.I. på minst 2 innenfor de testede individer og den gjennomsnittlige T-cellestimuleringsindeks av responser med en S.I. på minst 2 for peptidet. Fig. 17a er en grafisk fremstilling som viser responsen av T-celler fra 29 pasienter primet in_v.itro. med Derp II proteinet og analysert for respons på utvalgte peptider av ønsket lengde avledet fra Derp II proteinet som T-cellestimuleringsindeksen av en respons med en S.I. på minst 2 for peptidet. Fig. 17b er en grafisk fremstilling som viser responsen av 30 pasienter primet in vitro med Derp II proteinet og analysert for respons på utvalgte peptider avledet fra Derp II proteinet i prosent response med en S.I. på minst 2 innenfor de testede individer (over hver søyle), den gjennomsnittlige T-cellestimuleringsindeks (over hver søyle i parentes) og den rangerte sum av peptiderespons (X-aksen). Fig. 18a er en grafisk fremstilling som viser responsen av T-celler fra 10 pasienter primet in vitro med Her f II proteinet og analysert for respons på utvalgte peptider av ønsket lengde avledet fra Derp II og Der f TT proteinet, som T-cellestimuleringsindeksen av en respons med en S.I. på minst 2 for peptidet. Fig. 18b er en grafisk fremstilling avledet fra de samme data som er vist i fig. 18a og som viser responsen av Der f TT primede T-cellelinjer på foretrukne ner p II peptider analysert som prosent respons med en S.I. på minst 2 innenfor de testede individer (over hver søyle), den gjennomsnittlige T-cellestimuleringsindeks (over hver søyle i parentes) og den rangerte sum av peptidresponser (X-aksen). Fig. 18c er en grafisk fremstilling som viser responsen av T-cellelinjer fra 4 matchede pasienter primet in vitro med midd-gruppe I allergen og analysert for respons på foretrukne Her p I og Her f T peptider i prosent respons med en S.I på minst 2 innenfor de testede individer og den gjennomsnittlige T-cellestimuleringsindeks av positive responser for peptidet. Fig. 18d er en grafisk fremstilling som viser responsen av T-cellelinjer fra 6 matchede pasienter primet in vitro med midd gruppe II allergen og analysert for respons på foretrukne Her p II peptider i prosent respons med en S.I. på minst 2 innenfor de testede individer og den gjennomsnittlige stimuleringsindeks av positive responser for peptidet. Fig. 19a-19b er grafiske fremstillinger av resultatene av en direkte bindingassay av IgE til affinitetsrensede og rekombinante Derp I og Derp II proteiner og visse Der p I og Derp II overlappende peptider. Fig. 20a-20b er grafiske fremstillinger av resultatene av en direkte bindingassay av IgE til affinitetsrensede og rekombinante Der f I og Der f TT proteiner og visse Der f I og Der f TT overlappende peptider. Fig. 21a-21h er grafiske fremstillinger av resultatene av en direkte bindingsassay av IgE til en blanding av biokjemisk rensede midd-allergener (PMA) og forskjellige peptider avledet fra Derp I} Eter_f I, Der_p II og Der f TT. Fig. 22 er en sammensatt oppstilling av aminosyresekvensene av fem Derp I kloner (a)-(e) som illustrererpolymorfismen Derp I proteinet. Nummereringen refererer til sekvensen av Derp I(a) klonen. Symbolet (-) anvendes til å angi at aminosyreresten av en Derp I klon er identisk med de tilsvarende aminosyresekvenser av Derp I(a) i denne posisjon. Aminosyresekvensene av disse kloner viser at det kan være signifikant variasjon i Derp I, med fem polymorfe aminosyrerester funnet i de fem sekvenser. Fig. 23 er en sammensatt oppstilling av aminosyresekvensene av tre Derp II kloner(c), (1) og (2) som illustrererpolymorfisme i Derp II-proteinet. Nummereringen refererer til sekvensen av Derp II (c)-klonen. Symbolet (.) anvendes til å angi at aminosyreresten i en Her p II klon er identisk med den tilsvarende aminosyrerest i Derp II (c) i denne posisjon. Fig. 24 er en sammensatt oppstilling av aminosyresekvensene av 6 Der f II kloner (dvs. pFLl, pFL2, MT3, MT5, MT18 og MT16) som illustrerer polymorfisme i Der fil proteinet. Nummereringen refererer til sekvensene av Der f PT .Fl-klonen Symbolet (.) anvendes til å angi at aminosyreresten av en Der f II klon er identisk med den tilsvarende aminosyrerest av Der f II pFLl i denne posisjon. Fig. 25 viser nukleotid- og aminosyresekvensene av et valgt peptid som omfatter forskjellige regioner avledet av Derp I, Derp II og Der f T proteinallergener. Fig. 26 viser nukleotid- og aminosyresekvensene av et valgt peptid som omfatter forskjellige regioner avledet fra Derp I, Derp II og Der f I proteinallergener. Fig. 27 viser nukleotid- og aminosyresekvensene av et utvalgt peptid som omfatter forskjellige regioner avledet fra Derp I, Derp n og Der f I proteinallergener. Fig. 28 viser aminosyresekvensene av modifiserte peptider ifølge denne oppfinnelse.

Detaljer t beskrivelse av oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer isolerte peptider avledet fra de viktigste proteinallergener av slekten Dermatophagoides Som anvendt heri skal et peptid eller et fragment av et protein referere til en aminosyresekvens som har færre aminosyrerester enn hele aminosyresekvensen av proteinet.

Peptider omfattende minst to regioner, og hver region omfattende minst én T-celle-epitop av et proteinallergen av slekten Dermatophagoides er også innenfor rammen av denne oppfinnelsen. Hver region av slike peptider er avledet fra de samme eller fra forskjellige middallergener. Isolerte peptider eller regioner av isolerte peptider, alle omfattende minst to T-celle-epitoper av et middproteinallergen er særlig ønskelige for øket terapeutisk effektivitet. Peptider som er immunologisk beslektede (f.eks. ved antistoff- eller T-celle kryss-reaktivitet) med peptider ifølge den foreliggende oppfinnelse, er også innenfor rammen av denne oppfinnelse. Peptider immunologisk beslektet ved antistoff kryss-reaktivitet er bundet av antistoffer som er spesifikke for et peptid av et proteinallergen av slekten Dermatophagoides. Peptider immunologisk relatert ved T-celle kryss-reaktivitet er i stand til å reagere med de samme T-celler som et peptid ifølge denne oppfinnelsen.

Isolerte peptider ifølge denne oppfinnelse kan fremstilles ved rekombinant DNA-teknikk i en vertscelle omdannet med en nukleinsyre som har en sekvens som koder for et slikt peptid. De isolerte peptider ifølge denne oppfinnelse kan også fremstilles ved kjemisk syntese. I visse begrensede situasjoner kan isolerte peptider fremstilles ved kjemisk spalting av proteinallergenet. Når det fremstilles et peptid ved rekombinant teknikk, blir det dyrket vertsceller omdannet med en nukleinsyre som har en sekvens som koder for peptidet eller den funksjonelle ekvivalent av nukleinsyresekvensen i et medium som egner seg for cellene, og peptider kan renses fra celle-kulturmedium, vertsceller, eller begge ved anvendelse av teknikker som er kjent på dette området for rensing av peptider og proteiner omfattende ionebytterkromatografi, gelfiltreringskromatografi, ultrafiltrering, elektroforese eller immunorensing med anti-stoffer som er spesifikke for peptidet, proteinallergenet av slekten Dermatnphagoidfls hvorifra peptidet er avledet, eller en porsjon derav. Isolerte peptider ifølge denne oppfinnelse er i alt vesentlig fri for cellemateriale eller kulturmedium når de fremstilles ved rekombinant DNA-teknikk, eller i alt vesentlig fri for kjemiske forløpere eller andre kjemiske forbindelser når de syntetiseres kjemisk.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer eksepresjonsvektorer og vertsceller omdannet til å uttrykke nukleinsyresekvensene ifølge denne oppfinnelse. En nukleinsyresekvens som koder for et middallergen, eller i alle fall et fragment derav, kan uttrykkes i bakterieceller som f.eks. E. coli, insektceller (baculovirus), gjær, eller pattedyrceller som f.eks. ovarieceller fra kinesisk hamster (CHO) "Chinese hamster ovary cells". Egnede ekspresjonsvektorer, promotorer, enhancere, og andre ekspresjonskontrollelementer kan finnes hos Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989). Andre egnede ekspresjonsvektorer, promotorer, enhancere, og andre ekspresjonselementer er kjent for fagfolk på dette området. Ekspresjon i pattedyr-, gjær- eller insektceller fører til delvis eller fullstendig glykosylering av det rekombinante materialet og dannelse av hvilke som helst inter- eller intra-kjededisulfidbindinger. Egnede vektorer for ekspresjon i gjær omfatter YepSecl (Baldari et al. (1987) Embo J. 6: 229-234); pMFa (Kurjan og Herskowitz (1982) Cell 20:933-943); JRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54: 113-123) og pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Disse vektorer er fritt tilgjengelige. Baculovirus og pattedyrekspresjonssystemer er også tilgjengelige. F.eks. er et baculovirussystem kommersielt tilgjengelig (PharMingen, San Diego, CA) for ekspresjon i insektceller, mens pMSG-vektoren er kommersielt tilgjengelig (Pharmacia, Piscataway, NJ) for ekspresjon i pattedyrceller.

For ekspresjon i E. coli, vil egnede ekspresjonsvektorer omfatte blant andre pTRC (Amann et al. (1988) Gene 6^:301-315); pGEX (Amrad Corp., Melbourne, Australia); pMAL (N.E. Biolabs, Beverly, MA); pRIT5 (Pharmacia Piscataway, NJ); pET-lld (Novagen, Madison, WI) (Jameel et al., 1990) J. Virol. 64:3963-3966); og pSEM (Knapp et al. (1990) BioTechniques &:280-281). Anvendelsen av f.eks. pTRC og pET-1 ld vil føre til ekspresjon av ikke sammensmeltet protein. Anvendelse av pMAL, pRIT5, pSEM og pGEX vil føre til ekspresjon av allergen sammensmeltet med maltose E bindingsprotein (pMAL), protein A (pRIT5), avkuttet /3-galaktosidase (PSEM), eller glutation S-transferase (pGEX). Når et middproteinallergen, fragment, eller fragmenter derav blir uttrykt som et fusjonsprotein, er det særlig fordelaktig å innføre et enzymatisk spaltesete i fusjonsforbindelsen mellom bærerproteinet og et middproteinallergen eller fragment derav. Et middproteinallergen eller fragment derav kan deretter gjenvinnes fra fusjonsproteinet ved enzymatisk spalting i det enzymatiske setet og biokjemisk rensing ved anvendelse av konvensjonell teknikk for rensing av proteiner og peptider. Egnede enzymatiske spalteseter omfatter dem for blodlevrings-faktor Xa eller trombin, for hvilket de hensiktsmessige enzymer og protokoller for spalting er kommersielt tilgjengelige fra f.eks. Sigma Chemical Company, St. Louis, MO og N.E. Biolabs, Beverly, MA. De forskjellige vektorer har også forskjellige promotorregioner som tillater konstitutiv eller induserbar ekspresjon med f.eks. IPTG-induksjon (PRTC, Amann et al., (1988) supra; pET-1 ld, Novagen, Madison, WI) eller temperaturinduksjon (pRIT5, Pharmacia, Piscataway, NJ).

For å oppnå isolerte peptider ifølge den foreliggende oppfinnelse blir et midd-allergen oppdelt i ikke-overlappende peptider av ønsket lengde eller overlappende peptider av ønskede lengder som diskutert i eksempel III og som kan produseres rekombinant, syntetisk, eller i visse begrensede situasjoner, ved kjemisk spalting av allergenet. Peptider omfattende minst én T-celle-epitop er i stand til å fremkalle en T-cellerespons, som f.eks. stimulering (dvs. formering eller lymfokinsekresjon) og/eller er i stand til å indusere T-celleanergi (dvs. tålbargjøring). For å bestemme peptider omfattende minst én T-celle-epitop blir isolerte peptider testet ved f.eks. T-cellebiologiteknikk, for å bestemme hvorvidt peptidene fremkaller en T-cellerespons eller induserer T-celleanergi. De peptider som finnes å fremkalle T-cellerespons eller indusere T-celleanergi, blir definert til å ha T-cellestimulerende aktivitet.

Som diskutert i eksemplene kan human T-cellestimulerende aktivitet testes ved å dyrke T-celler oppnådd fra et individ som er følsomt for et middallergen, (dvs., et individ som har en IgE-befordret immunrespons på et middallergen) med et peptid avledet fra allergenet, og bestemme hvorvidt formering av T-celler foregår i respons på peptidet, som målt f.eks. ved celleopptak av tritiert tymidin. Stimuleringsindekser for respons av T-celler på peptider kan beregnes som maksimum av CPM i respons på et peptid dividert med kontroll CPM. En T-celle stimuleringsindeks (S.I.) lik eller høyere enn to ganger bakgrunnsnivået blir betraktet som "positiv". Positive resultater anvendes til beregning av den gjennomsnittlige stimuleringsindeks for hvert peptid for gruppen av testede peptider. Foretrukne peptider ifølge denne oppfinnelse omfatter minst én T-celle-epitop og har en gjennomsnittlig T-cellestimuleringsindeks på høyere enn eller lik 2,0. Et peptid som har en T-cellestimuleringsindeks på høyere enn eller lik 2,0, blir ansett som anvendbart som terapeutisk middel. Foretrukne peptider har en gjennomsnittlig T-cellestimuleringsindeks på minst 2,5, mer fortrinnsvis minst 3,5, enda mer fortrinnsvis minst 4,0, og mest fortrinnsvis minst 5,0.

Dessuten har foretrukne peptider en positivitetsindeks (P.I.) på minst ca. 100, mer fortrinnsvis minst 150, enda mer fortrinnsvis minst ca. 200 og mest fortrinnsvis minst ca. 250. Positivitetsindeksen for et peptid blir bestemt ved å multiplisere den gjennomsnittlige T-cellestimuleringsindeks med den prosent av individer, i en populasjon av individer som er følsomme mot husstøvmidd (f.eks. fortrinnsvis minst 9 individer, mer fortrinnsvis minst 16 individer eller flere, mer fortrinnsvis minst 29 individer eller flere, eller enda mer fortrinnsvis minst 30 individer eller flere), som har T-celler som responderer på peptidet. Positivitetsindeksen representerer således både styrken av en T-cellerespons på et peptid (S.I.) og frekvensen av en T-cellerespons på et peptid i en populasjon av individer som er følsomme for husstøvmidd. F.eks., som vist i fig. 5, har peptidet DP-I-1 en gjennomsnittlig S.I. på 4,7 og 73% av positive responser i gruppen av testede individer som fører til en positivitetsindeks på 343,1. Peptider av Der_p I med en positivitetsindeks på misnt ca. 150 og en gjennosnittlig T-cellestimuleringsindeks på minst ca. 4, omfatter: DP I-l (SEKV. ID NR.:9); DP I-21.1 (SEKV. ID NR.: 27); DP 1-21.2 (SEKV. ID NR.: 28); DP 1-23.1 (SEKV. ID NR.: 33); DP 1-23.2 (SEKV. ID NR.:34); DP 1-25.2 (SEKV. ID NR: 36); og DP 1-26.1 (SEKV. IDNR.:37).

For å bestemme presise T-celle-epitoper med f.eks. finkartleggingsteknikk, modifiserer man et peptid med T-cellestimulerende aktivitet og således omfattende minst én T-celle-epitop som bestemt ved T-cellebiologiteknikk, ved addisjon eller delesjon av aminosyrerester i enten amino- eller karboksyterminus av peptidet, og tester for å betemme en forandring i T-cellereaktivitet på det modifiserte peptid. Dersom to eller flere peptider som deler et overlappingsområde i den naturlige protein-sekvens blir funnet å ha human T-cellestimulerende aktivitet, som bestemt ved T-cellebiologiteknikk, kan det fremstilles ytterligere peptider omfattende hele eller en del av slike peptider, og disse ytterligere peptider kan testes ved en lignende fremgangsmåte. Ifølge denne teknikk blir peptider utvalgt og fremstilt rekombinant eller syntetisk. Peptider blir utvalgt basert på forskjellige faktorer, omfattende styrken av T-celleresponsen på peptidet (dvs. stimuleringsindeks), frekvensen av T-celleresponsen på peptidet i en populasjon av individer som er følsomme for husstøvmidd, og den potensielle kryssreaktivitet av peptidet med andre allergener av slekten Dermatophagnides. De fysiske og kjemiske egenskaper av disse utvalgte peptider (f.eks. løselighet, stabilitet) blir undersøkt for å bestemme hvorvidt peptidene er egnet for anvendelse i terapeutiske blandinger eller hvorvidt peptidene krever modifikasjon som beskrevet heri. Evnen hos de utvalgte peptider eller utvalgte modifiserte peptider til å stimulere humane T-celler (f.eks. indusere formering, lymfokinsekresjon) blir bestemt.

Dessuten, foretrukne peptider ifølge denne oppfinnelse binder ikke immunoglobulin E(IgE) eller binder IgE i en betydelig mindre utstrekning enn det protein-allergen fra hvilket peptidet er avledet, binder IgE. De viktigste komplikasjoner ved standard immunoterapi er IgE-befordrede responser som f.eks. anafylaksi. Immunoglobulin E er en mediator for anafylaktiske reaksjoner som er resultatet av bindingen og kryssbindingen av antigen til IgE på mastceller eller basofiler og frigjøringen av mediatorer (f.eks. histamin, serotonin, eosinofile kjemotaksiske faktorer). Anafylaksi i en betydelig prosent av en populasjon av individer som er følsomme for husstøvmidd kan således unngås ved anvendelse i immunoterapien av et peptid eller peptider som ikke binder IgE i en betydelig prosentsats (f.eks. minst ca. 75%) av en populasjon av individer som er følsomme mot et husstøvmiddallergen, eller dersom peptidet binder IgE, vil slik binding ikke føre til avgivelse av mediatorer fra mastceller eller basofiler. Risikoen for anafylaksi kan reduseres ved anvendelse i immunoterapien av et peptid eller peptider som har redusert IgE-binding. Peptider som har minimal IgE-stimulerende aktivitet er dessuten ønskelige for terapeutisk effektivtet. Minimal IgE-stimulerende aktivitet refererer til IgE-produksjon som er mindre enn mengden av IgE-produksjon og/eller IL-4-produksjon som stimuleres av det naturlige proteinallergen (f.eks. Dct p I).

Et peptid ifølge denne oppfinnelse, når det administreres til et individ som er følsomt for hus-støv-midd, er i stand til å modifisere den allergiske respons hos individet på allergenet. Nærmere bestemt vil peptider ifølge denne oppfinnelse omfattende minst én T-celle-epitop av et middallergen eller minst to regioner avledet fra et middallergen, alle omfattende minst én T-celle-epitop, når de administreres til et individ som er følsomt for husstøvmidd, være i stand til å modifisere T-celleresponsen hos individet på allergenet. Som anvendt heri kan modifikasjon av den allergiske respons hos et individ på et husstøvmiddallergen defineres som ikke-mottakelighet eller reduksjon i symptomer ved eksponering for et middallergen, som bestemt ved standard kliniske fremgangsmåter (se f.eks. Varney et al., British Medinal Tnnrnal 3H2: 265-269 (1990)) omfattende reduksjon av astmatiske symptomer indusert av midd-proteinallergen. Som referert til heri skal en reduksjon i symptomer omfatte en hvilken som helst reduksjon i allergisk respons hos et individ på allergenet, etter at individet har fullført et behandlingsregime med et peptid eller protein ifølge denne oppfinnelse. Reduksjonen kan være subjektiv (dvs. at pasienten føler seg mer komfortabel i nærvær av allergenet). Reduksjon i symptomer kan dessuten bestemmes klinisk ved anvendelse av standard hudtester som er kjent på dette området.

Som resultat av arbeidet beskrevet heri er det fremstilt peptider avledet fra middallergener omfattende minst én T-celle-epitop. T-celle-epitoper blir antatt å være involvert i initiering og fortsettelse av immunresponsen på middallergen(er) som er ansvarlig for de kliniske symptomer ved middallergi. Disse T-celle-epitoper blir antatt å utløse tidlige hendelser på T-hjelpecellenivået ved å binde seg til et hensiktsmessig HLA-moIekyl på overflaten av en antigenpresenterende celle og stimulere den relevante T-celle subpopulasjon. Disse hendelser fører til T-celleformering, lymfokinsekresjon, lokale inflammatoriske reaksjoner, rekruttering av ytterligere immunceller til stedet, og aktivering av B-cellekaskaden som fører til fremstilling av anti-stoffer. En isotype av disse antistoffer, IgE, er fundamentalt viktig for utviklingen av allergiske symptomer, og dens fremstilling blir påvirket tidlig i kaskaden av hendelser på T-hjelpecellenivå, ved karakteren av de sekreterte lymfokiner. En T-celle-epitop er hovedelementet eller den minste enhet for gjenkjenning av en T-cellereseptor hvor epitopen omfatter aminosyrerester essensielle for reseptorgjenkjenning og som kan være nærliggende og/eller ikke-nærliggende i proteinets aminosyresekvens. Aminosyresekvenser som etterligner T-celle-epitopenes sekvenser og som modifiserer den allergiske respons på proteinallergener av slekten Derrnatophagnides^ er innenfor rammen av denne oppfinnelse.

Eksponering av middallergiske pasienter for peptider ifølge den foreliggende oppfinnelse kan gjøre tålbare eller anergisere hensiktsmessige T-celle-subpopulasjoner slik at de blir uten respons på middallergen(er) og ikke deltar i fremkalling av en immunrespons på slik eksponering. Dessuten kan administrering av et peptid ifølge denne oppfinnelse modifisere lymfokin sekresjonsprofilen sammenlignet med eksponering for det naturlig forekommende middproteinallergen eller del derav (f.eks. føre til en nedsettelse av IL-4 og/eller en økning i IL-2). Videre kan eksponering for et peptid ifølge denne oppfinnelse påvirke T-celle-subpopulasjoner som normalt deltar i responsen på middallergen(er) slik at disse T-celler blir trukket bort fra sted(ene) for normal eksponering for allergenet (f.eks. neseslimhinnen, huden, og lungene) mot sted(ene) for terapeutisk administrering av peptidet. Denne omfordeling av T-celle-subpopulasjoner kan forbedre eller redusere evnen til individets immunsystem til å fremkalle en immunrespons på stedet for normal eksponering for middallergenene, hvilket fører til en reduksjon i allergiske symptomer.

Isolerte peptider ifølge denne oppfinnelse omfatter minst én T-celleepitop av et proteinallergen av slekten Dermatophagoides, og følgelig omfatter peptidet minst ca. 7 aminosyrerester av proteinallergenet. For det formål å oppnå terapeutisk effektivitet vil terapeutiske blandinger ifølge denne oppfinnelse fortrinnsvis omfatte minst to T-celle-epitoper av et midd-allergen. Følgelig omfatter isolerte peptider ifølge denne oppfinnelse fortrinnsvis minst to T-celle-epitoper, og følgelig omfatter peptidet minst ca. åtte aminosyrerester, og fortrinnsvis femten aminosyrerester. Dessuten omfatter terapeutiske blandinger ifølge denne oppfinnelse fortrinnsvis en tilstrekkelig prosentandel av T-celle-epitopene i hele proteinallergenet, slik at et terapeutisk regime for administrering av blandingen til et individ som er følsomt for husstøvmidd, fører til at individets T-celler blir gjort tålbare for proteinallergenet. Syntetisk fremstilte peptider ifølge denne oppfinnelse omfattende opp til ca. 45 aminosyrerester i lengde, og mest fortrinnsvis opp til ca. 30 aminosyrerester i lengde er særlig ønskelige, ettersom økning i lengden kan føre til vanskelighet i peptidsyntesen, samt bibehold av en uønsket egenskap (f.eks. immunoglobulinbinding eller enzymatisk aktivitet) pga. opprettholdelse av konformasjonslikhet mellom peptidet og det proteinallergen som det er avledet fra. Alle av peptidene vist i fig. 3 og 4 ble funnet å ha human T-cellestimulerende aktivitet.

Foretrukne peptider omfatter hele eller en del av områdene for viktig T-cellereaktivitet innenfor Derp I, Der_f I, Her p II og Der f TT proteinallergenene, dvs. region 1, region 2, region 3, region 4, region 5, region 6a, region 6b, region 7, region 8, region 9 og region 10. Hvert område er definert som følger: Region 1 omfatter aminosyrerestene 1-28 av Derp I og Der f T proteinallergenene; region 2 omfatter aminosyrerestene 36-68 av Derp I og Der f T proteinallergenene; region 3 omfatter aminosyrerestene 74-109 av Derp I og Der f T proteinallergenene; region 4 omfatter aminosyrerestene 118-139 av Der p T og Der f T proteinallergenene; region 5 omfatter aminosyrerestene 141-166 av Derp I og Dexi I proteinallergenene; region 6a omfatter aminosyrerestene 161-185 av Derp I og Dexf I proteinallergenene; region 6b omfatter aminosyrerestene 173-201 av Derp I og Der f T allergenene; region 7 omfatter aminosyrerestene 1-26 av Derp II og Der f TT proteinallergenene; region 8 omfatter aminosyrerestene 33-67 av Derp II og Der f TT proteinallergenene; region 9 omfatter aminosyrerestene 79-104 av Derp II og Der f TT proteinallergenene og region 10 omfatter aminosyrerestene 107-129 av Derp II og Der f TT proteinallergenene.

Foretrukne peptider avledet fra Derp I proteinet omfatter hele eller en del av de følgende peptider: DP I-l (SEKV ID NR: 9); DP 1-2 (SEKV ID NR: 10); DP 1-3 (SEKV ID NR: 11); DP 1-4 (SEKV ID NR: 12); DP I-l 1,1 (SEKV ID NR: 13); DP 1-12,1 (SEKV ID NR: 14); DP 1-5 (SEKV ID NR: 15); DP 1-13 (SEKV ID NR: 17); DP 1-14 (SEKV ID NR: 18); DP 1-15 (SEKV ID NR: 19); DP 1-6,1 (SEKV ID NR: 20); DP 1-7,1 (SEKV ID NR: 21); DP 1-8 (SEKV ID NR: 22); DP 1-9 (SEKV ID NR: 23); DP 1-16 (SEKV ID NR: 24); DP 1-10 (SEKV ID NR: 25); DP 1-17 (SEKV ID NR: 26); DP 1-21,1 (SEKV ID NR: 27); DP 1-21,2 (SEKV ID NR: 28); DP 1-22,1 (SEKV ID NR: 29); DP 1-22,2 (SEKV ID NR: 30); DP 1-22,3 (SEKV ID NR: 31); DP 1-22,4 (SEKV ID NR: 32); DP 1-23,1 (SEKV ID NR: 33); DP 1-23,2 (SEKV ID NR: 34), DP 1-25,1 (SEKV ID NR: 35); DP 1-25,2 (SEKV ID NR: 36); DP 1-26,1 (SEKV ID NR: 37); DP 1-27,1 (SEKV ID NR: 38); DP 1-28,1 (SEKV ID NR:39); og DP 1-28,2 (SEKV ID NR: 40),

hvor delen av peptidet har en gjennomsnittlig T-cellestimuleringsindeks i alt vesentlig

tilsvarende eller høyere enn den gjennomsnittlige T-cellestimuleringsindeks for det peptid som den er avledet fra, som vist i fig. 5 og fig. 13. Mer fortrinnsvis vil peptider avledet fra Derp I proteinet omfatte hele eller en del av følgende peptider: DPI-21.2, DPI-22.2, DPI-23.1, DPI-25.2, DPI.26.1, DPI-27.1 og DPI-28.1, og mest fortrinnsvis vil peptider avledet fra Der p I proteinet omfatte hele eller en del av DPI-21.2, DPI-23.1 og DPI-26.1, hvor delen av peptidet har en gjennomsnittlig T-cellestimulerings-indeks i alt vesentlig tilsvarende eller høyere enn den gjennomsnittlige T-cellestimuleringsindeks for det peptid som den er avledet fra, som vist i fig. 5 og fig. 13.

Foretrukne peptider avledet fra Der fl, Derp II ng Der f TT proteinene omfatter: DF I-l (SEKV ID NR: 72); DF 1-2,1 (SEKV ID NR: 73); DF 1-3 (SEKV ID NR: 74); DF 1-4 (SEKV ID NR: 75); DF I-l 1 (SEKV ID NR: 76); DF 1-12 (SEKV ID NR: 77); DF 1-5 (SEKV ID NR: 78); DF 1-13 (SEKV ID NR: 79); DF 1-14 (SEKV ID NR: 80); DF 1-15 (SEKV ID NR: 81); DF 1-6 (SEKV ID NR: 82); DF 1-7 (SEKV ID NR: 83); DF 1-8,1 (SEKV ID NR: 84); DF 1-8 (SEKV ID NR: 85); DF 1-9 (SEKV ID NR: 86); DF 1-16 (SEKV ID NR: 87); DF I-10 (SEKV ID NR: 88); DF 1-17 (SEKV ID NR: 89); DF 1-21,1 (SEKV ID NR: 90); DF 1-21,2 (SEKV ID NR: 91); DF 122,1 (SEKV ID NR: 92); DF 1-22,2 (SEKV ID NR: 93); DF 1-22,4 (SEKV ID NR: 94); DF 1-23,1 (SEKV ID NR: 95); DF 1-23,2 (SEKV ID NR: 96); DF 1-25,1 (SEKV ID NR: 97); DF I- 25,2 (SEKV ID NR: 98); DF 1-26,1 (SEKV ID NR: 99); DF 1-27,1 (SEKV ID NR: 100); DF 1-28,1 (SEKV ID NR: 101); DF 1-28,2 (SEKV ID NR: 102); DP 11-20 (SEKV ID NR: 50); DP 11-20,1 (SEKV ID NR: 51); DP 11-20,2 (SEKV ID NR: 52); DP 11-20,3 (SEKV ID NR: 53); DP 11-20,4 (SEKV ID NR: 54); DP 11-20,5 (SEKV ID NR: 55); DP II 20,6 (SEKV ID NR: 56); DP II-l (SEKV ID NR: 41); DP II-2 (SEKV ID NR: 42); DP 11-3,1 (SEKV ID NR: 43); DP II-4 (SEKV ID NR: 44); DP II-5 (SEKV ID NR: 45); DP II-6 (SEKV ID NR: 46); DP II-7 (SEKV ID NR: 47); DP II-8 (SEKV ID NR: 48); DP II-9 (SEKV ID NR: 49); DP 11-1,1 (SEKV ID NR: 57); DP II- 1,2 (SEKV ID NR: 58); DP 11-2,1 (SEKV ID NR: 59); DP 11-2,2 (SEKV ID NR: 60); DP 11-2,3 (SEKV ID NR: 61); DP 11-21 (SEKV ID NR: 62); DP 11-22 (SEKV ID NR: 63); DP 11-26 (SEKV ID NR: 64); DP 11-26,1 (SEKV ID NR: 65); DP 11-23 (SEKV ID NR: 66); DP 11-23,1 (SEKV ID NR: 67); DP 11-24 (SEKV ID NR: 68); DP 11-25 (SEKV ID NR: 69); DP 11-25,1 (SEKV ID NR: 70); DP 11-25,2 (SEKV ID NR: 71); DF II-l (SEKV ID NR: 103); DF II-2 (SEKV ID NR: 104); DF II-l3,1 (SEKV ID NR: 105); DF 11-3,1 (SEKV ID NR: 106); DF 11-4,5 (SEKV ID NR: 107); DF 11-4,3 (SEKV ID NR: 108); DF 11-15 (SEKV ID NR: 109); DF 11-16 (SEKV ID NR: 110); DF 11-17 (SEKV ID NR: 111); DF 11-18 (SEKV ID NR: 112); DF 11-19 (SEKV ID NR: 113); DF 11-19,1 (SEKV ID NR: 114); DF 11-21 (SEKV ID NR: 115); og DF 11-22 (SEKV ID NR: 116).

eller deler av peptidene omfattende minst én T-celle-epitop. Fortrinnsvis vil en del av

et peptid avledet fra Der<_>f I, Derp II og Der f II ha en gjennomsnittlig T-cellestimuleringsindeks tilsvarende eller høyere enn den gjennomsnittlige T-cellestimuleringsindeks for det peptid som den er avledet fra som vist i fig. 10, fig. 15a, fig. 15b og fig. 16. Mer fortrinnsvis vil peptider avledet fra Her p II og Der fl proteinene omfatte hele eller en del av følgende peptider: DF 1-22.2, DPII-20.6, DPII-22, DPII-24 og DPII-25.2.

En utførelse av den foreliggende oppfinnelse vedrører et peptid av et protein-allergen av slekten Dermatophagoides- Peptidet eller delen derav omfatter minst én T-celle-epitop av proteinallergenet, og har formelen Xn-Y-Zm. Ifølge denne formel er Y en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av: DF 1-21,1 (SEKV ID NR:90); DF 1-21,2 (SEKV ID NR:91); DF 1-22,1 (SEKV ID NR: 92); DF 1-22,2 (SEKV ID NR: 93); DF 1-22,4 (SEKV ID NR: 94); DF 1-23,1 (SEKV ID NR: 95); DF 1-23,2 (SEKV ID NR: 96); DF 1-25,1 (SEKV ID NR: 97); DF 1-25,2 (SEKV ID NR: 98); DF 1-26,1 (SEKV ID NR: 99); DF 1-27,1 (SEKV ID NR: 100); DF I- 28,1 (SEKV ID NR: 101); DF 1-28,2 (SEKV ID NR: 102); DF I-l (SEKV ID NR: 72); DP 11-20 (SEKV ID NR: 50); DP 11-20,1 (SEKV ID NR: 51); DP 11-20,2 (SEKV ID NR: 52); DP 11-20,3 (SEKV ID NR: 53); DP 11-20,4 (SEKV ID NR: 54); DP 11-20,5 (SEKV ID NR: 55); DP II 20,6 (SEKV ID NR: 56); DP II-l (SEKV ID NR: 41); DP II- 1,1 (SEKV ID NR: 57); DP 11-1,2 (SEKV ID NR: 58); DP 11-2,1 (SEKV ID NR: 59); DP H-2,2 (SEKV ID NR: 60); DP 11-2,3 (SEKV ID NR: 61); DP 11-21 (SEKV ID NR: 62); DP 11-22 (SEKV ID NR: 63); DP 11-26 (SEKV ID NR: 64); DP 11-26,1 (SEKV ID NR:65); DP 11-23 (SEKV ID NR: 66); DP 11-23,1 (SEKV ID NR: 67); DP 11-24 (SEKV ID NR: 68); DP 11-25 (SEKV ID NR: 69); DP 11-25,1 (SEKV ID NR: 70); DP 11-25,2 (SEKV ID NR: 71); DF II-l (SEKV ID NR: 103); DF II-2 (SEKV ID NR: 104); DF 11-13,1 (SEKV ID NR: 105); DF 11-3,1 (SEKV ID NR: 106); DF 11-4,5 (SEKV ID NR: 107); DF 11-4,3 (SEKV ID NR: 108); DF 11-15 (SEKV ID NR: 109); DF II-16 (SEKV ID NR: 110); DF 11-17 (SEKV ID NR: 111); DF 11-18 (SEKV ID NR: 112); DF 11-19, (SEKV ID NR: 113); DF 11-19,1 (SEKV ID NR: 114); DF 11-21 (SEKV ID NR: 115) og DF 11-22 (SEKV ID NR: 116).

Dessuten skal Xn være aminosyrerester i nabostilling til aminoterminus av Y i amionsyresekvensen av proteinallergenet, og Zm være aminosyrerester i nabostilling til karboksyterminus av Y i aminosyresekvensen av proteinallergenet. I denne formel skal n være 0-30 og m være 0-30.

Peptidene kan omfatte minst to regioner, idet hver region omfatter minst én T-celle-epitop av et proteinallergen av slekten DermatophagoideSj og følgelig skal hver region omfatte minst ca. 7 aminosyrerester. Disse peptider omfattende minst to regioner kan omfatte så mange aminosyrerester som ønskelig, og omfatter fortrinnsvis minst ca. 14, enda mer fortrinnsvis ca. 30, og mest fortrinnsvis minst ca. 40 aminosyrerester av et middallergen. Hver region av et slikt peptid omfatter fortrinnsvis opp til 45 aminosyrerester i lengde, mer fortrinnsvis opp til 40 rester i lengde og mest fortrinnsvis opp til 30 aminosyrerester i lengde, ettersom økning i lengde av en region kan føre til vanskelighet i peptidsyntesen så vel som bibehold av en uønsket egenskap (f.eks. iirimunoglobulinbinding eller enzymatisk aktivitet) pga. opprettholdelse av konformasjonslikhet mellom peptidet og det proteinallergen som det er avledet fra. Om ønsket, kan aminosyresekvensene i regionene fremstilles og bindes sammen med en linker for å øke følsomheten for bearbeiding med antigen-presenterende celler. En slik linker kan være en hvilken som helst ikke-epitop-aminosyresekvens eller et annet hensiktsmessig linking- eller sammenbindingsmiddel. For å oppnå foretrukne peptider omfattende minst to regioner, hver omfattende minst én T-celle-epitop, blir regionene arrangert i en konfigurasjon forskjellig fra en naturlig forekommende konfigurasjon av regionene i allergenet eller en kombinasjon av forskjellige midd-proteinallergener. F.eks. kan regionene inneholdende T-celle-epitop(er) arrangeres i en ikke-nabostilling-konfigurasjon, og kan fortrinnsvis avledes fra det samme proteinallergen eller en kombinasjon av proteinallergener. Ikke i nabostilling er definert som et arrangement av regioner inneholdende T-celle-epitop(er) som er forskjellige fra det for en aminosyresekvens som er tilstede i det proteinallergen som regionene er avledet fra. Dessuten kan regionene som ikke er i nabostilling og som inneholder T-celle-epitoper, arrangeres i ikke i rekkefølge (feks. i en rekkefølge som er forskjellig fra rekkefølgen i aminosyrene i det naturlige proteinallergen som regionen inneholdende T-celle-epitop(ene) er avledet fra og hvori aminosyrene er arrangert fra en aminoterminus til en karboksyterminus). Et peptid kan omfatte minst 15%, minst 30%, minst 50% eller opp til 100% av T-celle-epitopene i et middallergen.

De individuelle peptidregioner kan fremstilles og testes for å bestemme hvilke regioner som binder immunoglobulin E spesifikt for et midd-allergen, og hvilke av slike regioner som ville forårsake avgivelse av mediatorer (f.eks. histamin) fra mastceller eller basofiler. De peptidregioner funnet å binde immunoglobulin E og forårsake avgivelse av mediatorer fra mastceller eller basofiler i mer enn ca. 10 - 15% av de allergiske sera som testes, blir fortrinnsvis ikke innbefattet i de peptidregioner som arrangeres for å danne peptider ifølge denne oppfinnelse.

Foretrukne peptider ifølge denne oppfinnelse omfatter to eller flere regioner avledet fra de samme eller fra forskjellige middallergener (f.eks. Derp I, D_er_p II, Ber f I og Der f II). F.eks. kan én region avledes.fra Derp I og én region kan avledes fra Derp II; én region kan avledes fra Derp I og én region kan avledes fra Der fl; én region kan avledes fra Derp II og én region kan avledes fra De r, fl; én region kan avledes fra Dexp II og én region kan avledes fra Derf II; én region kan avledes fra Der p I og én region kan avledes fra Dfitf II; og én region kan avledes fra Der f I og én region kan avledes fra Der f TT Dessuten kan regionene avledes fra det samme proteinallergen, f.eks. Derp I og Derp I osv..

Regioner av et peptid ifølge denne oppfinnelse omfatter fortrinnsvis hele eller en del av de ovenfor diskuterte foretrukne områder av betydelig T-cellereaktivitet innenfor hvert middallergen (dvs. regionene l-6a-6b i Derp I og Der f T og regionene 7-10 i Derp II og Der f TT). F.eks. kan én region omfatte hele eller en del av regoin 1 (amionsyrerestene 1-28 i Derp I eller Der f T) og én region kan omfatte hele eller en del av region 2 (aminosyrerestene 36-68 i Derp I eller Der f I). Peptider ifølge denne oppfinnelse kan omfatte hele eller en del av to eller flere av disse regioner (dvs. regionene 1-10) og foretrukne resulterende peptider vil ikke binde IgE og forårsake avgivelse av mediatorer fra mastceller eller basofiler. Foretrukne peptider avledet fra Derp I og Der_f I omfatter hele eller en del av region 1, region 2, region 3 og eventuelt region 4. Foretrukne peptider avledet fra Derp II og Der f II omfatter hele eller en del av region 7 og region 8, og region 10. Dersom én av disse regioner blir funnet å binde IgE og forårsake avgivelse av mediatorer fra mastceller eller basofiler, da blir det videre foretrukket at peptidet ikke omfatter slike regioner, men heller omfatter forskjellige regioner avledet fra slike regioner som ikke vil binde IgE eller forårsake avgivelse av mediatorer fra mastceller eller basofiler.

Eksempler på foretrukne regioner omfatter hele eller en del av følgende aminosyresekvenser: DP 1-21,1 (SEKV ID NR: 27); DP 1-21,2 (SEKV ID NR: 28); DP I 22,1 (SEKV ID NR: 29); DP 1-22,2 (SEKV ID NR: 30); DP 1-22,3 (SEKV ID NR: 31); DP 1-22,4 (SEKV ID NR: 32); DP 1-23,1 (SEKV ID NR: 33); DP 1-23,2 (SEKV ID NR: 34); DP 1-25,1 (SEKV ID NR: 35); DP 1-25,2 (SEKV ID NR: 36); DP 1-26,1 (SEKV ID NR: 37); DP 1-27,1 (SEKV ID NR: 38); DP 1-28,1 (SEKV ID NR: 39); DP 1-28,2 (SEKV ID NR: 40); DP I-l (SEKV ID NR: 9); DF I-l (SEKV ID NR: 72); DF 1-21,1 (SEKV ID NR: 90); DF 1-21,2 (SEKV ID NR: 91); DF 1-22,1 (SEKV ID NR: 92); DF I 22,2 (SEKV ID NR: 93); DF 1-22,4 (SEKV ID NR: 94); DF 1-23,1 (SEKV ID NR: 95); DF 1-23,2 (SEKV ID NR: 96); DF 1-25,1 (SEKV ID NR: 97); DF 1-25,2 (SEKV ID NR: 98); DF 1-26,1 (SEKV ID NR: 99); DF 1-27,1 (SEKV ID NR: 100); DF I- 28,1 (SEKV ID NR: 101); DF 1-28,2 (SEKV ID NR: 102); DP 11-20 (SEKV ID NR: 50); DP 11-20,1 (SEKV ID NR: 51); DP 11-20,2 (SEKV ID NR: 52); DP H-20,3 (SEKV ID NR: 53); DP 11-20,4 (SEKV ID NR: 54); DP 11-20,5 (SEKV ID NR: 55); DP 11-20,6 (SEKV ID NR: 56); DP II-l (SEKV ID NR: 41); DP 11-1,1 (SEKV ID NR: 57); DP II- 1,2 (SEKV ID NR: 58); DP 11-2,1 (SEKV ID NR: 59); DP 11-2,2 (SEKV ID NR: 60); DP 11-2,3 (SEKV ID NR: 61); DP 11-21 (SEKV ID NR: 62); DP 11-22 (SEKV ID NR: 63); DP 11-26 (SEKV ID NR: 64); DP 11-26,1 (SEKV ID NR: 65); DP 11-23 (SEKV ID NR: 66); DP 11-23,1 (SEKV ID NR: 67); DP 11-24 (SEKV ID NR: 68); DP 11-25 (SEKV ID NR: 69); DP 11-25,1 (SEKV ID NR: 70); DP 11-25,2 (SEKV ID NR: 71); DF II-l (SEKV ID NR: 103) DF II-2 (SEKV ID NR: 104); DF 11-13,1 (SEKV ID NR: 105); DF 11-3,1 (SEKV ID NR: 106); DF 11-4,5 (SEKV ID NR: 107); DF 11-4,3 (SEKV ID NR: 108); DF 11-15 (SEKV ID NR: 109); DF 11-16 (SEKV ID NR: 110); DF II-l7 (SEKV ID NR: 111); DF 11-18 (SEKV ID NR: 112); DF 11-19 (SEKV ID NR: 113); DF 11-19,1 (SEKV ID NR: 114); DF 11-21 (SEKV ID NR: 115); og DF 11-22 (SEKV ID NR: 116), idet aminosyresekvensene i slike regioner er vist i fig. 3 og fig. 4, eller deler av nevnte regioner omfattende minst én T-celle-epitop.

Foretrukne peptider omfatter forskjellige kombinasjoner av to eller flere regioner, idet hver region omfatter hele eller en del av de ovenfor diskuterte foretrukne områder med betydelig T-cellereaktivitet. Foretrukne peptider omfatter en kombinasjon av to eller flere regioner (idet hver region har en aminosyresekvens som vist i fig. 3 og fig. 4) omfattende: DP 1-22,1 (SEKV ID NR: 29) og DP 1-25,1 (SEKV ID NR: 35); DP 1-21,1 (SEKV ID NR: 27) og DP 1-25,2 (SEKV ID NR: 36); DP 1-22,1 (SEKV ID NR: 29) og DP I-l (SEKV ID NR: 9); DP 1-21,1 (SEKV ID NR: 27), DP 1-22,1 (SEKV ID NR: 29), og DP 1-25,2 (SEKV ID NR: 36); DP 1-21,2 (SEKV ID NR: 28), DP 1-22,1 (SEKV ID NR: 29), og DP 1-23,1 (SEKV ID NR: 39); DP I-l (SEKV ID NR: 9), DP 1-22,1 (SEKV ID NR: 29), og DP 1-23,1 (SEKV ID NR: 33); DP I-l (SEKV ID NR:9); DP 1-22,1 (SEKV ID NR: 29), og DP 1-25,2 (SEKV ID NR: 36); DP 1-21,2 (SEKV ID NR: 27), DP 1-22,1 (SEKV ID NR: 29), DP 1-23,1 (SEKV ID NR: 33), og DP 1-25,2 (SEKV ID NR: 36); DP 1-21,2 (SEKV ID NR: 28), DP 1-22,1 (SEKV ID NR: 29), og DP 1-25,2 (SEKV ID NR: 36); DP 1-21,2 (SEKV ID NR: 27), DP 1-22,1 (SEKV ID NR: 29), DP 1-25,2 (SEKV ID NR: 36), og DP 1-26,1 (SEKV ID NR: 37); DF 1-21,2 (SEKV ID NR: 91) og DF 1-22,1 (SEKV ID NR: 92); DF 1-21,1 (SEKV ID NR: 90), DF 1-22,1 (SEKV ID NR: 92), og DF 1-25,1 (SEKV ID NR: 97); DF 1-21,2 (SEKV ID NR: 91), DF 1-22,1 (SEKV ID NR: 92), og DF 1-25,1 (SEKV ID NR: 97); DF I-l (SEKV ID NR: 72) og DF 1-22,1 (SEKV ID NR: 92); DF I-l (SEKV ID NR: 72), DF 1-22,1 (SEKV ID NR: 92), og DF 1-25,1 (SEKV ID NR: 97); DF 1-22,1 (SEKV ID NR: 29), og DF 1-25,1 (SEKV ID NR: 35); DF 1-21,1 (SEKV ID NR: 90), DF 1-22,1 (SEKV ID NR: 92), og DF 1-23,1 (SEKV ID NR: 95); DP 1-21,1 (SEKV ID NR: 27), og DF 1-22,1 (SEKV ID NR: 92); DP I-l (SEKV ID NR: 9), DP 1-23,1 (SEKV ID NR: 33), DP 1-25,1 (SEKV ID NR: 35), og DF I-l (SEKV ID NR: 72); t) DP I-l (SEKV ID NR: 9), DP 1-25,1 (SEKV ID NR: 35), DP 1-23,1 (SEKV ID NR: 33), og DF 1-21,2 (SEKV ID NR: 91); DP I-l (SEKV ID NR: 9), DP 1-25,1 (SEKV ID NR: 35), DP 1-23,1 (SEKV ID NR: 33), og DF 1-21,1 (SEKV ID NR: 90); DP 11-22 (SEKV ID NR: 63), og DP 11-25,2 (SEKV ID NR: 71); DP 11-22 (SEKV ID NR: 63), DP H-25,2 (SEKV ID NR: 71), og DP 1-21,1 (SEKV ID NR: 27) og DP 1-22,1 (SEKV ID NR: 29); DP 11-22 (SEKV ID NR: 63), DP 11-25,2 (SEKV ID NR: 71), DP 11-20,6 (SEKV ID NR: 56), DP 1-22,1 (SEKV ID NR: 29), DP 1-21,1 (SEKV ID NR: 27), og DP I-23.1 (SEKV ID NR: 33); DP 11-22 (SEKV ID NR: 63), DP 11-25,2 (SEKV ID NR: 71), DP 11-20,6 (SEKV ID NR: 56), DP 1-21,1 (SEKV ID NR: 27), DP 1-22,1 (SEKV ID NR: 29), og DP 1-25,2 (SEKV ID NR: 36); DP 11-22 (SEKV ID NR: 63), DP 11-25,2 (SEKV ID NR: 71), DP 1-21,1 (SEKV ID NR: 27), DP 1-22,1 (SEKV ID NR: 29), og DP 1-25,2 (SEKV ID NR: 36); DP 11-22 (SEKV ID NR: 63), DP 11-25,2 (SEKV ID NR: 71), DP 1-21,1 (SEKV ID NR: 27), DP 1-22,1 (SEKV ID NR: 29), og DP 1-23,1 (SEKV ID NR: 33); DP 11-22 (SEKV ID NR: 63), DP 11-25,2 (SEKV ID NR: 71), DP I-l (SEKV ID NR: 9), og DP 1-22,1 (SEKV ID NR: 29); DF 11-4,5 (SEKV ID NR: 107) og DF II-2 (SEKV ID NR: 104); DF 11-4,5 (SEKV ID NR: 107) og DF 11-19,1 (SEKV ID NR: 114); DF 11-4,5 (SEKV ID NR: 107), DF II-2 (SEKV ID NR: 104), og DF 11-19,1 (SEKV ID NR: 114); DF 11-4,5 (SEKV ID NR: 107), DF II-2 (SEKV ID NR: 104), og DF II-9 (SEKV ID NR: 86); DF 11-4,5 (SEKV ID NR: 107); og DF I- 21,1 (SEKV ID NR: 90); DF 11-4,5 (SEKV ID NR: 107), DP 11-22 (SEKV ID NR: 63), og DP 11-25,2 (SEKV ID NR: 71); og

i') DF 11-4,5 (SEKV ID NR: 107), DF II-2 (SEKV ID NR: 104), og DP 11-22 (SEKV ID NR: 63).

Ytterligere foretrukne peptider omfatter en kombinasjon av to eller flere regioner og innbefatter følgende kombinasjoner: DP 1-21.2, DP 1-23.1, DP 1-26.1, DP II- 20.6, DP 11-22, DP II-25.2 og DF II-22.2, DP 1-21.2, DF II-22.2; DP 1-21.2, DF I-22.2, DP 1-23.1, DP 1-25.2, DP 1-26.1, DP 1-27.1, DP II-20.6, DP 11-22, DP 11-24 og DP II-25.2; DP 1-23.1, DP 1-21.2, DP 1-22, DF 1-22.2, DP II-20.6 og DP II-25.2; DP I-23.1, DP 1-21.2, DF 1-22.2, DP II-20.6 og DP 11-25.2; DP 1-23.1, DF 1-22 og DP II-20.6; DP 1-26.1, DF 1-22.2 og DP II-25.2; DP 1-21.2, DF 1-22.2 og DP 11-22; og DP I-21.2 og DP 11-22.

De mest foretrukne peptider omfatter en kombinasjon av to eller flere regioner (idet hver region har en aminosyresekvens som vist i fig. 3 og fig. 4) avledet fra middallergenene Derp I, Derp II og Der_f I, idet hvert av nevnte foretrukne peptider har følgende spesifikke sekvensielle arrangement av aminosyresekvenser som vist i fig. 25-27: hhv. DPI-26.1, DPII-25.2, DFI-22, DPII-20.6 og DPI-21.2; DPII-25.2, DFI-22.2, DPI-23.1, DPII-22, DPI-21.2 og DPII-20.6; og DPII-25.2, DPI-21.2, DPI-23.1, DPI-26.1, DPII-22, DPII-20.6 og DFI-22.2. Nukleinsyre- og aminosyresekvensene for peptidene ovenfor er vist i hhv. fig. 25,26 og 27.

Peptider av proteinallergener av slekten Dermatnphagnides innenfor rammen av denne oppfinnelse, kan anvendes i fremgangsmåter for behandling og forebyggelse av allergiske reaksjoner på midd-allergener. Ett trekk av den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således terapeutiske blandinger omfattende et peptid av Derp I, Derp II, Der f T eller Der f TT omfattende minst én T-celle-epitop, eller fortrinnsvis minst to T-celle-epitoper, og en farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynningsmiddel. I et annet trekk omfatter den terapeutiske blanding en farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynningsmiddel og et peptid omfattende minst to regioner, idet hver region omfatter minst én T-celle-epitop av et midd-allergen og avledet fra det samme eller fra forskjellige middproteinallergener.

Foretrukne terapeutiske preparater omfatter minst ett peptid av minst ett protein-allergen av slekten Dermatophagoides. Preparatet omfatter en tilstrekkelig prosentandel av T-celle-epitopene av minst ett proteinallergen, slik at et terapeutisk admini-strasjonsregime av preparatet til et individ som er følsomt for et husstøvmiddallergen fører til at T-cellene hos individet blir gjort tålbare for proteinallergenet. Fortrinnsvis omfatter preparatet en tilstrekkelig prosentandel av T-celle-epitopene av ett eller flere proteinallergener slik at minst ca. 40%, og mer fortrinnsvis minst ca. 60% av T-cellereaktiviteten av hvert protein er innbefattet i preparatet. Slike preparater kan administreres til et individ for å behandle eller forebygge følsomhet mot husstøvmidd eller mot et allergen som er immunologisk kryss-reaktivt med husstøvmidd.

Administrering av de terapeutiske preparater ifølge den foreliggende oppfinnelse for å desensibilisere et individ kan utføres ved anvendelse av kjente teknikker. F.eks. kan et peptid avledet fra et midd-allergen omfattende minst én T-celle-epitop, administreres i kombinasjon med et hensiktsmessig fortynningsmiddel, en bærer, og/eller en adjuvant. For å indusere T-celleanergi i et individ blir det terapeutiske preparat fortrinnsvis administrert i ikke-immunogen form, dvs. at det ikke inneholder adjuvant. Farmasøytisk akseptable fortynningsmidler omfatter saltløsning og vandige bufferløsninger. Farmasøytisk akseptable bærere omfatter polyetylenglykol (Wie et al. International Archives of Allergy and Applied Tmmunnlogy £4: 84-99 (1981)) Og liposomer (Strejan et al., Journal of Neuroimmnnology 2: 27 (1984)). Slike preparater vil vanligvis bli administrert ved injeksjon, (subkutan, intravenøs, osv.) oral administrering (f.eks. som i form av en kapsel), inhalasjon, transdermal påføring eller rektal administrering. De terapeutiske preparater ifølge denne oppfinnelse blir administrert til individer som er følsomme mot hus-støv-midd i doseringer og i tidsrom som effektivt vil redusere følsomheten (dvs. redusere den allergiske respons) av individet mot et hus-støvmiddallergen. En terapeutisk effektiv mengde av ett eller flere av de samme eller av forskjellige terapeutiske preparater kan administreres samtidig eller i rekkefølge til et individ som er følsomt for hus-støv-midd. Effektive mengder av de terapeutiske preparater vil variere ifølge faktorer som f.eks. graden av sensitivitet hos individet mot husstøvmidd, individets alder, kjønn og vekt, og peptidets evne til å stimulere en T-celle-respons hos individet.

Preparatene kan omfatte minst to peptider (f.eks. en fysisk blanding av minst to peptider), hvert omfattende minst én T-celle-epitop av et proteinallergen av slekten

DennatnphlfgoiHfis Peptidene avledes fra det samme eller fra forskjellige midd-allergener. Slike preparater kan administreres i form av en terapeutisk blanding med en farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynningsmiddel. En terapeutisk effektiv mengde av ett eller flere av slike preparater kan administreres samtidig eller i rekke-følge til et individ som er sensitivt mot husstøvmidd.

Preparater og kombinasjoner av peptider som kan administreres samtidig eller i rekkefølge (omfattende peptider som har aminosyresekvenser vist i fig. 3 og 4) omfatter følgende kombinasjoner: DP 1-22,1 (SEKV ID NR: 29) og DP 1-25,1 (SEKV ID NR: 35); DP 1-21,1 (SEKV ID NR: 27) og DP 1-25,2 (SEKV ID NR: 36); DP 1-22,1 (SEKV ID NR: 29) og DP I-l (SEKV ID NR: 9); DP 1-21,1 (SEKV ID NR: 27), DP 1-22,1 (SEKV ID NR: 29), og DP 1-25,2 (SEKV ID NR: 36); DP 1-21,2 (SEKV ID NR: 28), DP 1-22,1 (SEKV ID NR: 29), og DP 1-23,1 (SEKV ID NR: 39); DP I-l (SEKV ID NR: 9), DP 1-22,1 (SEKV ID NR: 29), og DP 1-23,1 (SEKV ID NR: 33); DP I-l (SEKV ID NR: 9), DP 1-22,1 (SEKV ID NR: 29), og DP 1-25,2 (SEKV ID NR: 36); DP 1-21,1 (SEKV ID NR: 27), DP 1-22,1 (SEKV ID NR: 29), DP 1-23,1 (SEKV ID NR: 33), og DP 1-25,2 (SEKV ID NR: 36); DP 1-21,2 (SEKV ID NR: 28), DP 1-22,1 (SEKV ID NR: 29), og DP 1-25,2 (SEKV ID NR: 36); DP 1-21,2 (SEKV ID NR: 27), DP 1-22,1 (SEKV ID NR: 29), DP 1-25,2 (SEKV ID NR: 36), og DP 1-26,1 (SEKV ID NR: 37); DF 1-21,2 (SEKV ID NR: 91) og DF 1-22,1 (SEKV ID NR: 92); DF 1-21,1 (SEKV ID NR: 90), DF 1-22,1 (SEKV ID NR: 92), og DF 1-25,1 (SEKV ID NR: 97); DF 1-21,2 (SEKV ID NR: 91), DF 1-22,1 (SEKV ID NR: 92), og DF 1-25,1 (SEKV ID NR: 97); DF I-l (SEKV ID NR: 72) og DF 1-22,1 (SEKV ID NR: 92); DF I-l (SEKV ID NR: 72), DF 1-22,1 (SEKV ID NR: 92), og DF 1-25,1 (SEKV ID NR: 97); DF 1-22,1 (SEKV ID NR: 29), og DF 1-25,1 (SEKV ID NR: 35); DF 1-21,1 (SEKV ID NR: 90), DF 1-22,1 (SEKV ID NR: 92), og DF 1-23,1 (SEKV ID NR: 95); DP 1-21,1 (SEKV ID NR: 27), og DF 1-22,1 (SEKV ID NR: 92); DP I-l (SEKV ID NR: 9), DP 1-23,1 (SEKV ID NR: 33), DP 1-25,1 (SEKV ID NR: 35), og DF I-l (SEKV ID NR: 72); DP I-l (SEKV ID NR: 9), DP 1-25,1 (SEKV ID NR: 35), DP 1-23,1 (SEKV ID NR: 33), og DF 1-21,2 (SEKV ID NR: 91); DP I-l (SEKV ID NR: 9), DP 1-25,1 (SEKV ID NR: 35), DP 1-23,1 (SEKV ID NR: 33), og DF 1-21,1 (SEKV ID NR: 90); DP 11-22 (SEKV ID NR: 63), og DP 11-25,2 (SEKV ID NR: 71); DP II-22 (SEKV ID NR: 63), DP 11-25,2 (SEKV ID NR: 71), og DP 1-21,1 (SEKV ID NR: 27) og DP 1-22,1 (SEKV ID NR: 29); DP 11-22 (SEKV ID NR: 63), DP 11-25,2 (SEKV ID NR:71), DP H-20,6 (SEKV ID NR: 56), DP 1-22,1 (SEKV ID NR: 29), DP 1-21,1 (SEKV ID NR:27) og DP 1-23,1 (SEKV ID NR: 33); DP 11-22 (SEKV ID NR: 63), DP 11-25,2 (SEKV ID NR: 71), DP H-20,6 (SEKV ID NR: 56), DP 1-21,1 (SEKV ID NR: 27), DP 1-22,1 (SEKV ID NR: 29), og DP 1-25,2 (SEKV ID NR: 36); DP 11-22 (SEKV ID NR: 63), DP 11-25,2 (SEKV ID NR: 71), DP 1-21,1 (SEKV ID NR: 27), DP 1-22,1 (SEKV ID NR: 29), og DP 1-25,2 (SEKV ID NR: 36); DP 11-22 (SEKV ID NR: 63), DP 11-25,2 (SEKV ID NR: 71), DP 1-21,1 (SEKV ID NR: 27), DP 1-22,1 (SEKV ID NR: 29), og DP 1-23,1 (SEKV ID NR: 33); DP 11-22 (SEKV ID NR: 63), DP 11-25,2 (SEKV ID NR: 71), DP I- l (SEKV ID NR:9), og DP 1-22,1 (SEKV ID NR: 29); DF 11-4,5 (SEKV ID NR: 107) og DF II-2 (SEKV ID NR: 104); DF 11-4,5 (SEKV ID NR: 107) og DF 11-19,1 (SEKV ID NR: 114); DF 11-4,5 (SEKV ID NR: 107), DF II-2 (SEKV ID NR: 104), og DF II-19,1 (SEKV ID NR: 114); DF 11-4,5 (SEKV ID NR: 107), DF II-2 (SEKV ID NR: 104), og DF II-9 (SEKV ID NR: 86); DF 11-4,5 (SEKV ID NR: 107); og DF I 21,1 (SEKV ID NR:90); DF 11-4,5 (SEKV ID NR: 107), DP 11-22 (SEKV ID NR: 63), og DP 11-25,2 (SEKV ID NR: 71); og DF 11-4,5 (SEKV ID NR: 107), DF II-2 (SEKV ID NR: 104), og DP 11-22 (SEKV ID NR: 63); og DP 1-26,1, DP 11-25,2, DF 1-22, DP II- 20,6 og DP 1-21,2.

Det er også mulig å modifisere strukturen av et peptid ifølge oppfinnelsen for slike formål som å øke løseligheten, forbedre den terapeutiske eller preventive effektivitet, eller stabiliteten (f.eks. lagringsbestandighet ex vivo] og bestandighet mot proteolytisk nedbrytning in vivo). Det kan fremstilles et modifisert peptid hvor aminosyresekvensen er blitt forandret, som f.eks. ved aminosyresubstitusjon, delesjon, eller addisjon, for å modifisere immunogenisiteten og/eller redusere allergenisiteten, eller til hvilket det er blitt tilsatt en komponent for det samme formål.

F.eks. kan et peptid modifiseres slik at det beholder evnen til å indusere T-celleanergi og binde MHC-proteiner uten evnen til å indusere en kraftig proliferativ respons eller muligens en hvilken som helst proliferativ respons når det administreres i immunogen form. I dette tilfellet kan det bestemmes kritiske bindingsrester for T-cellereseptoren ved anvendelse av kjent teknikk (f.eks. substitusjon av hver rest og bestemmelse av tilstedeværelsen eller fraværet av T-cellereaktivitet). De rester som er vist å være essensielle for å virke sammen med T-cellereseptoren, kan modifiseres ved å erstatte den essensielle aminosyre med en annen, fortrinnsvis lignende aminosyrerest (en konservativ substitusjon) hvis tilstedeværelse er vist å øke, nedsette, men ikke eliminere, eller ikke fremkalle T-cellereaktivitet. Dessuten kan de aminosyrerester som ikke er essensielle for T-cellereseptorinteraksjon, modifiseres ved å bli erstattet med en annen aminosyre hvis inkorporering kan øke, nedsette eller ikke fremkalle T-cellereaktivitet, men som ikke eliminerer binding til relevant MHC.

Dessuten kan peptider ifølge denne oppfinnelse modifiseres ved å erstatte en aminosyre som er vist å være essensiell for å virke sammen med MHC-proteinkomplekset med en annen, fortrinnsvis lignende aminosyrerest (konservativ substitusjon) hvis tilstedeværelse er vist å øke, nedsette, men ikke eliminere eller ikke forårsake T-celleaktivitet. I tillegg kan aminosyrerester som ikke er essensielle for interaksjon med MHC-proteinkomplekset, men som fremdeles binder MHC-proteinkomplekset, modifiseres ved å bli erstattet med en annen aminosyre, hvis inkorporering kan øke, ikke forårsake, eller nedsette, men ikke eliminere T-cellereaktiviteten. Foretrukne aminosyresubstitusjoner for ikke-essensielle aminosyrer omfatter, men er ikke begrenset til substitusjoner med alanin, glutaminsyre eller en metylaminosyre.

Et annet eksempel på en modifikasjon av peptider er substitusjon av cystein-rester fortrinnsvis med serin, treonin, leucin eller glutaminsyre for å minimalisere dimerisering via disulfidbindinger. F.eks. kan man øke stabiliteten av et peptid av f) er p II eller Der_f II som innbefatter de første 10 aminosyrerester av det ene eller det andre allergen, ved å erstatte cysteinet plassert på den 8. aminosyrerest, fortrinnsvis med alanin, eller glutaminsyre, eller alternativt med serin eller treonin.

For å øke stabilitet og/eller reaktivitet kan peptider også modifiseres til å inkorporere én eller flere polymorfismer i aminosyresekvensen av et proteinallergen som skriver seg fra naturlig allel variasjon som vist i fig. 25-27. Dessuten kan D-aminosyrer, ikke-naturlige aminosyrer eller ikke-aminosyreanaloger substitueres eller adderes for å frembringe et modifisert peptid innenfor rammen av denne oppfinnelse. Videre kan peptider ifølge den foreliggende oppfinnelse modifiseres ved anvendelse av polyetylenglykol (PEG) metoden til A. Sehon og medarbeidere (Wie et al. supra) for å frembringe et peptid konjugert med PEG. Dessuten kan PEG adderes under kjemisk syntese av et peptid ifølge oppfinnelsen. Modifikasjoner av peptider eller deler derav kan også innbefatte reduksjon/alkylering (Tarr i: Methods of Protein Mierodiarae-terizflrion^ J.E. Silver ed. Humana Press, Clifton, NJ, pp 155-194 (1986)); acylering (Tarr, supra); forestring (Tarr, supra); kjemisk kobling til en hensiktsmessig bærer (Mishell og Shiigi, utgivere Selected Methods in Cellular Tmmnnology, WH Freeman, San Francisco, CA (1980); US patent 4.939.239); eller mild formalinbehandling (Marsh International Archieves of Allergy and Applied Immnnology 41: 199-215

(1971)).

I en annen utførelse kan peptider innenfor en allergengruppe (f.eks. Derp I eller Der p II) modifiseres for å øke T-cellereaktiviteten. Gitt kryss-reaktiviteten innenfor gruppe I og gruppe II allergener kan et peptid fra ett gruppeallergen som kan være mindre reaktivt enn et peptid fra et annet gruppeallergen med en tilsvarende amino-syreposisjon, ha én eller flere aminosyrer substituert med én eller flere aminosyrer fra det tilsvarende peptid (f.eks. kan peptid DF II-l, rest 17 [metionin] i Her f Tf aminosyresekvensen substitueres med aminosyren plassert på rest 17 i Derp II [leucin] for å øke reaktiviteten av Der f TT peptidet). Dessuten kan peptider modifiseres til å inkorporere en polymorfisme i amionsyresekvensen av et proteinallergen som skriver seg fra naturlig allelvariasjon. Modifikasjon av peptider til å innbefatte én eller flere av disse polymorfismer kan føre til øket stabilitet og/eller reaktivitet.

For å lette rensing og potensielt øke løseligheten av peptider ifølge denne oppfinnelse, er det mulig å addere reportergruppe(r) til peptidhovedkjeden. F.eks. kan poly-histidin adderes til et peptid for å rense peptidet på immobilisert metallion-affinitetskromatografi (Hochuli, E. et al., BioZT^cJmoJogy., 6:1321-1325 (1988)). Dessuten kan det, om ønsket, innføres spesifikke endoproteasespalteseter mellom en reportergruppe og aminosyresekvenser av et peptid for å lette isolering av peptider fri for irrelevante sekvenser. For med hell å desensibilisere et individ mot et protein-antigen kan det være nødvendig å øke løseligheten av et peptid ved å addere funksjonelle grupper til peptidet, eller ved ikke å inkludere hydrofobe T-celle-epitoper eller regioner inneholdende hydrofobe epitoper i peptidene.

For potensielt å hjelpe opp riktig antigen bearbeiding av T-celle-epitoper innenfor et peptid, kan det rekombinant eller syntetisk konstrueres kanonisk protease-følsomme seter mellom regioner, hvert omfattende minst én T-celle-epitop. F.eks. kan det innføres ladede aminosyrepar, som f.eks. KK eller RR mellom regioner innenfor et peptid under rekombinant konstruksjon av peptidet. Det resulterende peptid kan gjøres følsomt for cathepsinspalting og/eller spalting med andre trypsinlignende enzymer for å danne deler av peptidet inneholdende én eller flere T-celle-epitoper. Dessuten kan slike ladede aminosyrerester føre til en økning av løseligheten for et peptid.

Seterettet mutagenese av DNA som koder for et peptid ifølge denne oppfinnelse, kan anvendes til å modifisere peptidets struktur. Slike fremgangsmåter kan involvere PCR (Ho et al.., Gene, 77:51-59 (1989) eller totalsyntese av muterte gener (Hostomsky, Z., et al., Rior. hem Ftiophys Res Cnmrn ; Ml: 1056-1063 (1989)). For å øke bakteriell ekspresjon kan de forannevnte metoder anvendes i forbindelse med andre fremgangsmåter for å forandre de eukaryotiske kodoner i DNA-konstrukter som koder for peptider ifølge denne oppfinnelse til slike som fortrinnsvis anvendes i F. coli.

Spesifikke eksempler på peptider ifølge denne oppfinnelse modifisert ifølge én eller flere av de modifikasjonsfremgangsmåter som er diskutert ovenfor, omfatter, men er ikke begrenset til modifikasjoner av peptid DPI-23.1 som vist i fig. 28 og av peptid DPII-22 som vist i fig. 28. Nærmere bestemt omfatter modifikasjoner av peptider 23.1 addisjon av ladede aminosyrer (23.1.2) ladede aminosyrepar (23.1.1) for å øke løselighet og erstatning av en cysteinrest med serin 23.1.3 eller glutaminsyre (23.1.4) for å øke løseligheten. Forandringer av peptid 22 omfatter addisjon av ladede aminosyrepar (22.1 og 22.2) for å øke løseligheten.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også nukleinsyrer som har sekvenser som koder for peptider ifølge denne oppfinnelse. Nukleinsyresekvenser som anvendes i en hvilken som helst utførelse av denne oppfinnelse, kan være cDNA som beskrevet heri, eller kan alternativt være en hvilken som helst oligodeoksynukleotid-sekvens som har hele eller en del av en sekvens representert heri, eller deres funksjonelle ekvivalenter. Slike oligodeoksynukleotidsekvenser kan frembringes kjemisk eller mekanisk ved anvendelse av kjent teknikk. En funksjonell ekvivalent av en oligo-nukleotidsekvens er én som er 1) en sekvens i stand til å hybridisere til et komplemen-tært oligonukleotid til hvilket sekvensen (eller tilsvarende sekvensdeler) av SEKV. ID NR.: 1, SEKV. ID NR.: 3, SEKV. ID NR.: 5 og SEKV. ID NR.: 7, eller fragmenter derav hybridiserer, eller 2) sekvensen (eller tilsvarende sekvensdel) komplementær til SEKV. ID NR.: 1, SEKV. ID NR. 3, SEKV. ID NR.:5 og SEKV. ID NR.: 7 og/eller 3) en sekvens som koder for et produkt (f.eks. et polypeptid eller peptid) som har de samme funksjonelle egenskaper som produktet innkodet av sekvensen (eller tilsvarende sekvensdel) av SEKV. ID NR.: 1, SEKV. ID NR.: 3, SEKV. ID NR.: 5 og SEKV. ID NR.: 7. Hvorvidt en funksjonell ekvivalent må tilfredsstille ett eller flere kriterier vil avhenge av dens anvendelse (f.eks. om den skal anvendes bare som en oligoprobe, behøver den å tilfredsstille bare det første og andre kriterium, og dersom den skal anvendes til å frembringe et peptid ifølge den foreliggende oppfinnelse, behøver den å tilfredsstille bare det tredje kriterium.

Denne oppfinnelse illustreres ytterligere ved følgende eksempler.

Eksempel I: Rensing av naturlig middallergen

Det som følger er en beskrivelse av det arbeid som er utført for å rense gruppe I og gruppe II allergener av husstøvmidden Dermatophagoides pteronyssinns og Dermatophagoides farinae i sin naturlige form som primære antigener for kartlegging av human T-celle-epitop.

Alle fire proteinallergener, Der_f I, Derp I, Der f IT og Derp II, ble immuno-affinitetsrenset fra brukte midd-kulturmedia levert fra enten Commonwealth Sera Laboratories Melbourne, Australia eller Dr. Larry G. Arlian ved Wright State University Dayton, Ohio. Et 10% (vekt/volum) vandig ekstrakt av tørkede brukte midd-kulturmedia ble fremstilt i PBS (fosfatbufret saltløsning) under omrøring over natten ved 4°C. Uløselig materiale ble fjernet ved sentrifugering ved 10.000 x g i 1 time ved 4°C. Supernatanten ble deretter filtrert på en vakuummanifold gjennom Whatman #1 papir, og sentrifugert om igjen ved 15.000 x g i 1 time ved 4°C. En slutt-filtrering ble utført gjennom et 0,45 fim celluloseacetatfilter.

Monoklonale antistoffer 4C1 og 6D6 (Univeristy of Virginia, NC) ble anvendt for immunoaffinitetsrensing av hhv. gruppe I eller gruppe II middallergener (Chapman et al., T. Allergy Clin. Immnnol SQ: 1479-1484 (1987); Heymann et al., I Allergy Hin Tmmnnol. 83: 1055-1067(1989)). Det 4C1 monoklonale antistoff reagerer med en epitop felles for både Der f I og Her p I proteinene; på lignende måte reagerer det 6D6 monoklonale antistoff med både Der f II og Oerp II proteinene.

For hvert monoklonalt antistoff ble ascitesfluid kuttet i 50% ammoniumsulfat, og antistoffene koblet til CNBr-aktivert Sepharose 4B (Pharmacia) i 100 mM NaHC03, 500 mM NaCl, pH 8,3, over natten ved 4°C.

Kolonner med monoklonalt antistoff ble ekvilibrert i PBS, og de filtrerte ekstrakter påsatt med 15 ml pr. time. Kolonnen ble deretter vasket i 20 volumer PBS, hvoretter en mer stringent vasking med 20 kolonnevolumer ble utført med PBS supplementert med 500 mM NaCl. Proteinene ble eluert i 500 mM NaCl, 100 mM glycin pH 11,0, og fraksjonene evaluert for proteininnhold ved spektrofotometrisk absorbans ved 280 nm. Toppfraksjonene ble slått sammen og inngående dialysert mot PBS, konsentrert med et dialyseapparat med negativt trykk (levert fra Amicon, Beverly MA) og ble anvendt i T-celle-epitopkartleggingsstudier av midd-gruppe I- og gruppe II- allergenene. Gjenvunnede proteiner ble oppnådd i en renhet i området fra 80%

(gruppe II) til 90% (gruppe I).

Revers fase HPLC kromatografi ble anvendt til ytterligere å rense det immuno-affinitetsrensede gruppe II midd-proteinallergen ifølge betingelsene hos Heymann et al., T Allergy Clin Tmmnnnl & 1: 1055-1067 (1989). Kort fortalt ble immuno-affinitetsrenset protein påsatt på en 5 fim 300 Å C-8 kolonne (Applied Biosystems Inc.) i 0,1% vol/vol TFA/H2O. Strømningshastigheten for kolonnen var 1 ml/min. med en gradient på 0-60% acetonitril/0,1% TFA i løpet av 60 min.. Gruppe II proteinene eluerte omkring 45% acetonitril/0,1% TFA. Fraksjonene ble analysert på renhet ved SDS-polyakrylamidgelelektroforese etterfulgt av densitometrisk scanning. De fraksjoner med gruppe II protein som hadde en renhet høyere enn 90%, ble deretter anvendt for human T-cellekartlegging av allergenet.

Eksempel II Ekspresjon av rekombinant middallergen

Det som følger er en beskrivelse av arbeidet som er gjort for å frembringe gruppe I- og gruppe II-allergenene av hus-støv-middene Dermatophagoides pteronyssinns og Dermatophagoides farinae som rekombinante proteiner i F. coli

Alle fire proteinallergener, Der fl, Derp I, Der f TI og Derp II, ble sammensmeltet i sine modne aminotermini med ledersekvensen MGHHHHHHEF (hvor aminosyrene EF er innkodet av EcoR I restriksjonssetet GAATTC). Siden H6-strekningen av aminosyrer koordinerer Ni -ioner på NTA-agarosekolonner (Diagen GmbH) ble denne aktivitet utnyttet ved rensingen av de rekombinante proteiner (Hochuli et al., Biolechnology 1321-1325 (1988)). Til slutt ble alle fire allergener subklonet inn i ekspresjonsvektoren pET 1 ld (Studier et al., Methods Tn F. nzymology 185: 60-88 (1990)) under transkripsjonskontroll av fag T7 gn 10 promotoren.

De cDNA som koder for gruppe I allergenene fra D pteronyssinns og D farinae ble levert fra Dr. Wayne Thomas i plasmid form som subkloner fra ngtl 1 (Chua et al.,

■ I F. xp Med 167: 175-182 (1988); Dilwnrtri et al., Hin. Fxp Allergy 71 • 25-32

(1991)). T>rp I cDNA var blitt subklonet fra et M13 RF plasmid som et EcoRI-fragment inn i pUC18 av Dr. Roland Buelow ved ImmuLogic (Palo Alto), mens Der f T cDNA ble manipulert direkte fra M13mpl9 rF plasmidet Df 1(1). Først ble cDNA subklonet inn i ekspresjonsvektoren pTrc99A His6 Insert RRRS som er en modifisert versjon av pTrc99A (Amann et al., Gene £3: 301-315 (1988)). Den originale vektor ble modifisert ved addisjon av en syntetisk adaptor (bestående av to komplimentære oligonukleotider) som koder for ledersekvensen MGHHHHHHEF mellom dens Ncol (MG) og EcoRI (EF) seter i 5'-enden av polylinkeren, og en RRS ( Rerrnregnlatorisk sekvens) inn i dens Hind III sete i polylinkerens 3r<->ende. Ledersekvensen ble anvendt som en rensehjelp som beskrevet ovenfor, mens RRS ble tilsatt for å forbedre rekombinant meldingsstabilitet og derved øke rekombinant protein-utbytte (Skoglund et al., Gene SS: 1 -5 (1990)). Til sist ble et insert, i dette tilfellet et Amb a 1.1 cDNA som koder for hovedallergenet av den korte landøyda (Rafhar et al., . I. Rini, Chem. 226: 1229-1236 (1991)) subklonet i ramme med Hg-lederen som et EcoRI til Pstl fragment. For å uttrykke midd-gruppe I allergener ble Amb a 1.1 cDNA skåret ut ved EcoRI/Hind III spalting og erstattet med adaptorer med </>EcoRl/Hind III overheng (sammensatt av et par av komplementære oligonukleotider). Disse adaptorer (fig. 2a) kodet for de første 5 aminosyrer, opp til Pst I-setet, av den modne Derp INH2-terminus, og de første 10 aminosyrer, opp til Hpal-setet, av den modne Der_f INH2-terminus. Etter ligering av EcoRI-setet i vektoren og øEcoRI-setet i adaptorene, ble EcoRI-setet i vektoren ødelagt, og etterlot EcoRI-setet internt kodet til adaptoren som det eneste EcoRI-setet i mellomproduktkonstruktene pTrc99A Hise 5' pl RRS og pTrc99A His6 5' fl RRS. Derp I cDNA ble insertert som et Pstl/EcoRI-fragment i Pstl/EcoRI-spaltet pTrc99A His6 5'pl RRS, mens Der_f I cDNA ble insertert som et Hpal/EcoRI-fragment i Hpal/EcoRI spaltet pTrc99A His<5 5' fl RRS. Sekvensen av 5'enden av hvert konstrukt, pTrc99A His6 5'pl RRS og pTrc99A His6 fl RRS, ble veri-fisert ved dideoksykjedeterminerings DNA-sekvensering ved anvendeles av en Sequenase™ II kit (U.S. Biochemicals). Både Hgpl- og Hefl-kodekasettene ble utskåret ved NcoI/Nhel-spalting (et Nhel-sete utskåret i 3-enden av RRS-adaptoren) og insertert i NcoI/Nhel-spaltet pETl ld. Disse to konstrukter, pETl ld His6 pl RRS og pETl ld Hise fl RRS, ble transformert i kompetente BL21 [DE3] bakterier for ekspresjon av de rekombinante proteiner. BL21 [DE3] inneholder et rekombinant fag X lysogen, DE 3, med et fag T7 RNA polymerasegen under transkripsjonskontroll av lac UV5-promotoren. T7 RNA-polymerase-genekspresjon blir indusert ved tilsetning av IPTG (Isopropyl-B-D-tiogalaktopyrano-sid), som i sin tur fører til et høyt ekspre-sjonsnivå av rekombinantgenet subklonet 3' av pET-vektorens T7 gn 10 promotor. De cDNA som koder for gruppe II allergenene fra D. pteronyssinns og D. farinae ble også levert fra Dr. Wayne Thomas i plasmid form som subkloner fra Agtl 1 (Chua et al., Tnt Arrh Appl Tmmnn 9_L: 118-123 (1990); Trudinger et al., Clin F. xp Allergy 21:33-37 (1991)). Det originale Derp II cDNA ble subklonet fra et M13RF-plasmid inn i pCA- og pGEX-vektorene av Dr. Roland Buelow ved ImmuLogic (Palo Alto). Dr. Thomas<1> gruppe hadde levert Der f II cDNA som en subklon i pGEX. Begge pGEX-plasmidene som inneholdt gruppe II cDNA, ble anvendt som templater for PCR-oppformering med det samme 5* sense/3' antisense primer par (fig. 2b). Primerne ble utformet for å sammensmelte et EcoRI-sete (GAATTC som koder for aminosyrerne EF) i ramme med Nfb-terminus av de modne gruppe II proteiner og plassere et Pstl sete 3' i den gruppe II kodende region. En MJ Research Thermal Controller med et program på 30 X (94°C lmin./55°l min. 30 sek./72°C 2 min.) ble anvendt i forbindelse med reagenser fra en Perkin Eimer - Cetus Gene Amp kit for PCR oppformering. PCR-produktene ble EcoRI/Pstl-spaltet og subklonet inn i EcoRI/Pstl-spaltet M13mpl9RF. DNA-sekvensanalyse ble gjennomført for å verifisere sekvensen av PCR-produktene. Korrekt M13RF ble EcoRI/Pstl spaltet, deres gruppe II cDNA-inserter ble isolert, og subklonet inn i EcoRI/PsI spaltet pTrc99A His6 Amb a 1.1 RRS (som tjente til å bytte ut gruppe II cDNA med landøyda cDNA (fig. 1)). Der f TT cDNA har en sekvenspolymorfisme i posisjon 54 (dvs. treoninrest istedenfor isoleucin). For å forandre denne polymorfisme ble det gjennomført seterettet mutagenese av Ts4-resten i Der f 11 cDNA ved anvendelse av en Muta-Gene kit fra Bio-Rad Laboratories, basert på metoden til Kunkel, Proe, Nati Acad Sei TISA £2:488-492 (1985). Det originale M13mpl9RF med T54 Der_f II cDNA ble transformert inn i CJ236 bakterier, som tåler inkorporeringen av uracil istedenfor thymidin under DNA-replikasjon, og enkeltstrenget fag DNA fremstilt som templat. En mutagen 17 basepar primer (fig. 2b) ble annilert til fagtemplat DNA. T4 DNA-polymerase ble anvendt til å kopiere templat-DNA primet av det mutagene oligonukleotid, og T4 DNA-Iigase tjente til å forsegle gapene i DNA-strengen. Reaksjonen ble transformert inn i MV1190-bakterier som er villtypen for redigering av uracilrester fra DNA, og derfor selektivt replikerer den mutageniserte (ikke-uracilholdige) streng, og enkeltstrenget fag DNA fremstilt fra rekombinante (hvite) plaker. Flere rekombinanter ble underkastet DNA-sekvensanalyse, og Der f TT cDNA med den korrigerte 154-sekvens subklonet som EcoRI/Pstl-fragmenter inn i EcoRI/Pstl-spaltet pTrc9A His6 Amh a 1.1

RRS.

Siden ett tidligere arbeide hadde vist at pETl ld-vektoren i de fleste tilfeller var i stand til å uttrykke rekombinante proteiner ved høyere nivå enn pTrc99A-vektoren, ble de to midd-gruppe II cDNA-er subklonet som Hg-fusjonsproteiner inn i T7-vektorer. pTrc ppA His6 fli RRS og pTrc99A His6 p II RRS ble Nco I/Nhel spaltet, cDNA-insertene isolert, og subklonet inn i NcoI/Nhel-spaltet pETl ld His6 pl (fig. 1). Rekombinante plasmider ble transformert inn i BL 21 [DE3] bakterier for ekspresjon.

BL21 DE3 vertsbakterier som inneholder pETl ld middallergenekspresjons-konstruktene, ble friskt utstrøket på en BHI agarplate (3,7% vekt/volum Difco Brain Heart Infusion; 1,5% vekt/volum Difco agar) supplementert med 200 /xg/ml ampicillin og inkubert over natten ved 37°C. En enkelt koloni ble inokulert i 2 ml av 200 /xg/ml ampicillin/BHl medium (3,7% vekt/volum Difco Brain Heart Infusion) og rystet ved 300 opm ved 37°C inntil blakking, men ikke mettet. 2 ml kulturen ble deretter tilsatt til 100 ml av 200 ug/ ml ampicillin/BHl-medium, rystet ved 300 opm ved 37°C inntil blakking, men ikke mettet, på hvilket punkt kulturen ble oppdelt i 18 x 500 ml (9 liter) av 200 Jig/ml ampicillin/BHl-medium og rystet ved 300 opm ved 37°C. Når OD595 av kulturen nådde 1,0, ble ekspresjon av de rekombinante molekyler indusert ved tilsetning av IPTG til 400 fiM, og fikk fortsette i 2 timer.

Bakteriene ble høstet ved sentrifugering ved 10.000 x g i 15 min., og resuspendert i 1/20 volum av lysebuffer (0,2 mg/ml lysozym, 100 mM NaPC«4 pH 8,0, 50 mM NaCl), inkubert på is i 30 min. og frosset ved -70°C. De frosne bakterier ble brutt opp ved en rask tining ved 37°C og deretter ultralydbehandlet 5 ganger i 20 sekunder med 30 sekunders mellomrom. De ultralydbehandlede prøver ble sentrifugert med 15.000 X g for å skille fra hverandre løselige og partikkelformige bakterie-proteiner. De løselige proteiner ble helt fra, og det pelleterte protein slemmet opp igjen i 6 M guanidin HC1, 100 mM 2-merkaptoetanol, 100 mM NaP04) 10 mM Tris pH 8,0. Denne suspensjon ble underkastet sentrifugering ved 15.000 X g, og supernatanten fjernet, justert til pH 8,0 med 10N NaOH, og påsatt på en NTA-agarosekolonne som var ekvilibrert i 6 M guanidin HC1, 100 mM NaP04, 10 mM Tris pH 8,0. Kolonnen ble vasket i 6 M guanidin HC1, 100 mM NaP04,10 mM Tris pH 8,0 inntil OD280 av utløpet nådde bakgrunnen. Kolonnebufferen ble så koblet om til 8 M urea, 100 mM NaP04, 10 mM Tris pH 8,0. Etter ekvilibrering ble det utført en mer inngående vasking i 8 M urea, 100 mM NaOAc, 10 mM Tris pH 6,3 inntil OD280 av utløpet nådde bakgrunnen. Rekombinant midd protein (som en H6-fusjon) ble så eluert i 8 M urea, 100 mM NaOAc, 10 mM Tris pH 4,5 og oppsamlet i alikvoter med overvåket OD280-profil. Proteintoppen ble dialysert 3 ganger i 500 volumer av PBS for human T-celleanalyse. Utbytte var i området fra 10 til 70 mg rekombinant protein pr. liter med en renhet (som bestemt ved densitometrisk scanning) i området fra 80 ( Der f IT) til 95%.

For ytterligere å rense det rekombinante Der f TT proteinallergen ble det anvendt revers fase HPLC-kromatografi. Ca. 100 mg av His6- Der f TT protein ble redusert i 20 mM DTT ved 36°C i 30 min. og deretter påsatt på en Pharmacia PRO RPC HR 10/10 kolonne i 0,1% vol/vol TFA/H2O. Strørnningshastigheten for kolonnen var 1,5 ml/ min. med en gradient på 0-70% acetonitril i 0,1% TFA i løpet av 40 min., etterfulgt av en gradient på 70-100% acetonitril i 0,1% TFA. His6- Der f TT protein eluerte mellom 54 og 96% acetonitril. Fraksjoner påvist ved 214 nm og 280 nm ble analysert på renhet ved SDS-polyakrylamidgelelektroforese/densitometrisk scanning. Fraksjonene med His6- Der f TT protein med en renhet høyere enn 95% ble deretter anvendt for human T-cellekartlegging av allergenet. Utbytte fra den preparative reversfase HPLC var ca. 69%.

Bestemmelse av nukleotidsekvenspolymorfisme i Der p I, Der p II og Der f II allergenene

Det var ventet at det var sekvenspolymorfisme i nukleinsyresekvensen som koder for Derp I, Derp II, Der f I og Der f II, pga. naturlig allel variasjon blant individuelle midder. Flere nukleotid- og resulterende aminosyresekvenspolymorfismer var blitt oppdaget under sekvenseringen av forskjellige Derp I, Derp II og Her f TT kloner. Aminosyresekvenspolymorfismene er vist i fig. 22,23 og 24.

Eksempel III Syntese av overlappende peptider

Derp I, Ber_f I, Derp II og DexiTI overlappende peptider som vist i fig. 3 og 4, ble syntetisert ved anvendelse av standard Fmoc/tBoc syntetisk kjemi og renset ved dialyse eller reversfase HPLC. Aminosyrerestene i de syntetiserte peptider er i parentes etter peptidnavnet, og aminosyresekvensen (i enkelt bokstavkode) følger etter peptidnavnet. Peptidnavnene er konsistente gjennom alle figurene. Derp I} Der f I, Derp II og Der f II proteinene ble oppdelt i overlappende peptider på en slik måte at de overlappende peptider av Derp I og Der f I så vel som for Derp II og Der f II har tilsvarende aminosyrerestnumre, f.eks. inneholder DP I-l og DF I-l begge aminosyrerestene 1-20 av hhv. Derp I og Der f T allergenene. Denne motsvarighet i aminosyre-posisjon mellom Derp I og Der f T peptidene ble gjort med hensikt for på beste måte å teste for kryssreaktivitet av Derp I og Der f T T-celle-epitopene, og således bestemme peptider som ved administrering til et individ følsomt for støvmidd, ville behandle sensitivitet mot både Derp og Der f allergener. Ved utformingen av de overlappende peptider ble det tatt hensyn til forholdet av gruppe I og gruppe II allergenene på nivået av T-cellekryssreaktivitet. Dessuten ble det tatt hensyn til funksjonen av gruppe I allergenene som serinproteaser, og aminosyresekvensene av andre kjente serinproteaser, f.eks. papain, actinidin, ble undersøkt for å identifisere lignende bevarte og variable regioner innenfor gruppe I allergenene. Det var ventet at bevarte regioner innenfor gruppe I allergenene ville inneholde "felles" T-celle-epitoper.

Eksempel IV: Primære T-celleresponser på Der p I og Der p II proteiner og peptider hos midd-allergiske pasienter

Mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) "Peripheral blood mononuclear cells" ble renset ved Ficoll-Hypaque-sentrifugering av en prøve av perifert blod fra den midd-allergiske pasient R.B., og ble undersøkt på formering som respons på forskjellige antigener, dvs. affinitets-renset Derp I, affinitetsrenset Derp II, forskjellige Der_p I og Derp II peptider. For bestemmelse ble 5 X IO<4> PBMC dyrket i triplikate mikrobrønner i 7 dager ved 37°C i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av antigen i 200 fil RPMI-1640 inneholdende 5% humant AB-serum. Deretter fikk hver brønn 1 { id tritiert thymidin i 16 timer. De inkorporerte tellinger ble oppsamlet på glassfiber-filtre og bearbeidet for væskescintillasjonstelling. Tabell I viser resultatene av denne bestemmelse. Det er vist CPM +/- standardavvik. Stimuleringsindeksen for hver respons (S.I.) er forholdet av 3H-thymidin CPM inkorporert av cellene i respons på antigen dividert med <3>H-thymidin CPM inkorporert av celler utelukkende i medium. Resultatene viser at denne pasienten responderer med en S.I. på minst 2,0 på peptidene DP I-l, DP 1-3, DP 1-8, DP 1-10, DP 1-5.2, DP II-4 og DP II-9. Disse peptider inneholder således Derp I eller Derp II T-celle-epitoper gjenkjent av T-celler fra denne spesielle allergiske pasient.

Eksempel V: T-celle-epitopstudier med Der p I

Mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) "Peripheral blood mononuclear cells" ble renset ved Ficoll-Hypaque-sentrifugering av 60 ml heparinisert perifert blod fra individer allergiske mot hus-støv-midd, og som hadde kliniske symptomer på middallergi og som var hudtestpositive for hus-støv-midd.

IO7 PBMC fra individ 543 ble dyrket i 10 ml RPMI-1640 inneholdende 5% oppsamlet humant AB-serum og supplementert med glutamin, penicillin, streptomycin og HEPES-buffer i nærvær av 20 jig/ml renset naturlig Derp I/ml ved 37°C i 7 dager. Levedyktige celler ble deretter renset ved Ficoll-Hypaque-sentrifugering og dyrket i ytterligere 2 uker i RPMI-1640/5% AB-serum inneholdende 5 enheter rekombinant human IL-2/ml og 5 enheter rekombinant human IL-4/ml. De hvilende T-celler ble deretter testet i en sekundær formeringsassay for å vurdere T-cellerespons på forskjellige husstøvmiddproteiner og peptider. For bestemmlese ble 2 X IO<4> hvilende T-celler dyrket i 200 /il av RPMI-1640/5% AB serum i 3 dager ved 37°C i nærvær av 2 X 10<4> autologe Epstein-Barr-virus-transformerte B-celler (20.000 Rads) som antigen presenterende celler med forskjellige konsentrasjoner av rensede naturlige Derp I eller syntetiske Derp I peptider. Hver brønn fikk deretter 1 ( id tritiert thymidin i 16 timer. De inkorporerte tellinger ble oppsamlet på glassfiberfiltere og bearbeidet for væskescintillasjonstelling. Medium alene, som virket som negativ kontroll, inneholdt intet allergen eller peptid. Resultatene av dette eksperiment viser at denne spesielle pasient responderer med en S.I. på minst 2,0 på flere peptider avledet fra Derp I proteinet, omfattende DP I-l, DP 1-2, DP 1-4, DP I-l 1, DP 1-5, DP 1-13, DP 1-15, DP 1-6,1, DP I-8, DP 1-9, DP 1-16, DP I-10 og DP 1-17 (data ikke vist).

Fremgangsmåten ovenfor ble fulgt med flere andre individer allergiske mot hus-støvmidd, bortsett fra at a) i enkelte tilfeller varierte lengden av dyrkingstiden med IL-2 og IL-4; b) i enkelte tilfeller ble T-cellene primet med enten renset naturlig (N) eller rekombinant (R) Derp I-protein i enten 20 pig/ml eller 10 /ig/ml; og c) i enkelte tilfeller ble det anvendt røntgenbestrålte (3500 Rads) autologe PBMC som antigen-presenterende celler i den sekundære formeringsbestemmelse. Dessuten ble det funnet at tre peptider (DP I-l 1 (SEKV. ID NR.: 117), DP 1-12 (SEKV: ID NR.: 118) og DP II-3 (SEKV. ID NR.: 119)) inneholdt et lavt antall av konservative forandringer fra den naturlige sekvens i sin aminosyresekvens. Tre ytterligere peptider (DP I-11.1 (SEKV. ID NR.: 13), DP 1-12.1 (SEKV. ID NR: 14) og DP II-3.1 (SEKV. ID NR.: 43) ble syntetisert uten noen forandringer fra den naturlige sekvens. Noen T-celleanalyser ble utført med de originale peptider (dvs. DP I-l 1, DP 1-12 og DP II-3). Etter T-celle-analyse gjennomført med de ytterligere peptider (dvs. DP I-l 1.1, DP 1-12.1 og DP II-3.1) ble det ikke påvist noen signifikant forskjell i midlere S.I. eller prosentandel av positive responser mellom de originale peptider og de ytterligere peptider. Data fra begge grupper av peptider ble således oppsamlet.

Enkeltresultater ble ansett som positive og anvendt dersom individet responderte på Derp I proteinet og minst ett peptid avledet fra Derp I ved en S.I. på 2,0 eller høyere. Et sammendrag av resultatene av 33 positive eksperimenter er vist i fig. 5. De hvilende T cellelinjer primet med rekombinante eller naturlige Derp I stimulerte PBMC ble testet på reaktivitet mot syntetiske Per p I peptider. Maksimum respons for hvert peptid i en titrering av antigenet er uttrykt som T-cellestimuleringsindeksen (S.I.). S.I. er tellingene pr. min. (CPM) inkorporert av cellene i respons på peptidet, dividert med CPM inkorporert av cellene bare i medium. En S.I. verdi høyere enn bakgrunnsnivået viser at peptidet inneholder en T-celle-epitop. Bare individuelle S.I. verdier høyere enn eller lik 2,0 (en respons på to ganger eller mer over bakgrunnen), referert til heri som "positive" resultater, ble imidlertid anvendt ved beregning av midlere T-cellestimuleringsindekser for hvert peptid for den pasient eller gruppe av pasienter som ble testet. I parentes over hver søyle på histogrammet er den midlere T-cellestimuleringsindeks beregnet etter forkasting av den høyeste og laveste positive respons for hvert peptid for å minimalisere effekten av ekstreme resultater. T-cellestimuleringsindeksen blir beregnet ved:

( CPM forT- nelle+ APC+ antigen)

CPM forT-celle+APC-kontroll

Søylen representerer den kumulative rangering av peptidresponsen i gruppen av pasienter. For å bestemme den kumulative rangering bestemte man de 5 peptider med den høyeste S.I. hos hvert individ, og ga en numerisk rangering i avtagende rekkefølge, med 5 som representerte den kraftigste respons. Rangeringen for hvert peptid ble deretter summert sammen i gruppen av pasienter for å bestemme den kumulative rangering for peptidet. Over hver søyle er prosenten av positive responser med en S.I. på minst 2 på peptidet i gruppen av testede pasienter. Gitt den prosentvise positive og den gjennomsnittlige T-cellestimuleringsindeks, kan man beregne positivitetsindeksen (P.I.) for hvert peptid. P.I. for hvert enkelt individ blir bestemt ved å multiplisere den gjennomsnittlige S.I. med den prosentvise andel av individer i en populasjon av individer som er følsomme for hus-støv-midd (f.eks. fortrinnsvis minst 15 individer, mer fortrinnsvis minst 30 individer eller mer) som responderte med en S.I. på minst 2,0 på dette peptid (f.eks. for DP I-l i fig. 5 ville P.I. være ca. 343 (73% x 4,7)). P.I. representerer derfor både styrken av en T-cellerespons på et peptid (S.I.) og frekvensen av en T-cellerespons på et peptid i en populasjon av individer som er følsomme for hus-støv-midd. Fig. 5 demonstrerer at peptidene DP I-l, DP 1-2, DP 1-3, DP 1-4, DP I-5, DP 1-6.1, DP 1-7.1, DP 1-8, DP 1-9, DP 1-16 og DP I-10 inneholder signifikante regioner av T-cellereaktivitet i dette panel av pasienter.

Eksempel VI: T-celle-epitopstudier med Der fl

Det ble gjennomført eksperimenter i likhet med dem i eksempel V for å bestemme de T-celle-reaktive områder av Der fl proteinet. F.eks. ble PBMC fra hus-støvmiddallergisk pasient 783 isolert som beskrevet i eksempel V og stimulert in vitro med rekombinant renset DerJf I ved 20 fig/ m\. Resultatene av formeringsassayet med Der fl peptider ved anvendelse av røntgenbestrålte (3500 Rads) autologe PBMC som antigen-presenterende celler, viser at T-celler fra denne pasient gir respons på peptidene DF 1-8.1, DF 1-9, DF 1-6, DF 1-10, DF 1-2.1, DF 1-3, DF Ml, DF 1-5, DF I-l og DF 1-17 (data ikke vist).

Fremgangsmåten ovenfor ble fulgt for flere pasienter, bortsett fra at i enkelte tilfeller ble T-cellelinjer primet med affinitetsrenset Der f I ved 20 /tg/ml eller ved 10 /tg/ml og røntgen-bestrålte (25.000 Rads) autologe Epstein-Barr virus-transformerte B-celler anvendt som antigenpresenterende celler. Et sammendrag av resultatene av 16 positive eksperimenter er vist i fig. 6. Disse data ble analysert som beskrevet i eksempel V. Disse data viser at signifikante områder av T-celleereaktivitet i Der f I proteinet finnes i peptidene DF I-l, DF 1-2, DF 1-3, DF 1-4, DF I-l 1, DF 1-5, DF 1-6, DF 1-7, DF 1-14, DF 1-15, DF 1-8.1 og DF 1-9.

Eksempel VII: En studie som viser kryss-reaktiviteten av Der p I og Der f I T-celle-epitoper

Per p I og Der f I proteinene er svært homologe (81 % identitet). Eksperimenter i likhet med dem i eksempel V ble derfor utført for å bestemme T-celleresponsen av Per p I primede T-cellelinjer når de ble utfordret med forskjellige Der p I peptider og i alt vesentlig tilsvarende Der f II peptider. T-cellelinjer ble primet in vitro som beskrevet i eksempel V og testet for respons på et sett av i alt vesentlig tilsvarende Der p I og Per fl peptider (f.eks. DP I-l (aminosyrerestene 1-20 av Derp I) eller DF I-l (aminosyrerestene 1-20 av Der f T) Disse data ble analysert som beskrevet i eksempel V, bortsett fra at den høyeste og laveste S.I. verdi for de positive responser på hvert peptid, ikke ble utelatt fra gjennomsnittsberegningene av S.I.. Et sammendrag av flere slike eksperimenter er vist i fig. 7. Resultatene av 14 positive eksperimenter viser at Derp I primede T-celler gir respons på forskjellige Der fl peptider, hvilket viser kryssreaktivitet innenfor gruppe I allergenene. Derp I primede T-celler gir signifikant respons på peptidene DF I-l, DF 1-2, DF 1-3, DF 1-4, DF M1, DF 1-12, DF 1-15, DF I-8, DF 1-9, DF I-l 5 og DF 1-6. Hos noen pasienter var Dejjf I peptidet en mer potent stimulator av Derp I primede T-celler enn det tilsvarende D, er_p I peptid. Fig. 8 viser resultatene av inverse eksperimenter, hvori T-celler fra flere pasienter ble primet in vitro på Der_f I proteinet og analysert for respons på forskjellige Derp I peptider og et sett av i alt vesentlig tilsvarende Der f I peptider. Resultatene av 8 positive eksperimenter viser at Der f T primede T-celler gir signifikant respons på peptidene DP I- l, DP 1-3, DP 1-4, DP I-l 1/11.1, DP 1-14, DP 1-5, DP 1-15 og DP 1-8.

Eksempel VIII: T-celle-epitopstudier med Der p II

Eksperimenter i likhet med dem i eksempel V ble gjennomført for å bestemme de T-cellereaktive områder av Derp II proteinet. F.eks. ble PBMC fra husstøvmidd-allergisk pasient 348 isolert som beskrevet i eksempel V og stimulert in vitro med 20 /ig/ml renset naturlig Derp II. Resultatene av en formeringsanalyse ved anvendelse av røntgenbestrålte (25.000 Rads) Epstein-Barr virustransformerte autologe B-celler som antigenpresenterende celler med forskjellige Derp II peptider viser at denne spesielle pasient gir god respons på peptidene DP II-l, DP II-7, DP II-8, DP II-2 og DP II-9 (data ikke vist).

Fremgangsmåten ovenfor ble fulgt for flere pasienter bortsett fra at i enkelte tilfeller ble T-cellelinjer primet med rekombinant Derp II ved 20 /xg/ml eller ved 3 /tg/ml og røntgenbestrålte (3500 Rads) autologe PBMC ble anvendt som antigen-presenterende celler. Et sammendrag av resultatene av 26 positive eksperimenter er vist i fig. 9. Disse data ble analysert som beskrevet i eksempel V, bortsett fra at den rangerte sum av peptidresponser ble analysert ved å gi en verdi på 3,2 eller 1 til de tre høyeste S.I. responser. Områder for siginifikant T-cellereaktivitet innenfor Derp II proteinet for dette panel av pasienter finnes i peptidene DP II-l, DP II-2, DP II-3, DP II- 4, DP II-7, DP II-8 og DP II-9.

Eksempel IX: T-celle-epitopstudier med Der f II

Eksperimenter i likhet med dem i eksempel V ble gjennomført for å bestemme de T-cellereaktive områder av Der f II proteinet. F.eks. ble PBMC fra husstøvmidd-allergisk pasient 384 stimulert in.v,i,tr.o. med renset rekombinant Derf II, og T-celle-linjen ble deretter utfordret i nærvær av røntgen-bestrålte (25.000 Rads) autologe Epstein-Barr virustransformerte B-celler som antigenpresenterende celler med forskjellige overlappende Der f II peptider. Resultatene av denne formeringsanalyse viser at T-celler fra denne spesielle pasient ga god respons på peptidene DF II-l, DF II-2, DF II-3.1, DF II-4.5, DF 11-15, DF 11-16 og DF II-19.1 (data ikke vist).

Fremgangsmåten ovenfor ble fulgt med 10 pasienter, bortsett fra at i enkelte tilfeller ble T-cellelinjer primet ved å stimulere pasientens PBMC med 20 /ig/ml eller 3 /ig/ml renset naturlig DexiTI, og bestemt i nærvær av røntgenbestrålte (3500 Rads) autologe PBMC som antigenpresenterende celler. Et sammendrag av resultatene av 10 positive eksperimenter er vist i fig. 10. Disse data ble analysert som vist i detalj i eksempel IX, bortsett fra at den høyeste og laveste S.I.-verdi av de positive responser på hvert peptid, ikke ble utelatt fra beregningene. Disse data viser at signifikante områder av T-cellereaktivitet innenfor Der_f II proteinet finnes i peptidene DF II-l, DF II-2, DF II-l3.1, DF II-4.5, DF 11-15, DF 11-17 og DF II-19.1.

Eksempel X: En studie som viser kryssreaktiviteten av Der p II og Der f IIT-celle-epitoper

En studie i likhet med den som er beskrevet i eksempel VII, ble utført for å bestemme T-celle kryssreaktiviteten av Derp II og Der f IT proteinene. T-celler primet med Dex_f II proteinet ble utfordret med forskjellige Der_f II peptider og et sett av i alt vesentlig tilsvarende Derp II peptider. Et sammendrag av resultatene av 10 positive eksperimenter er vist i fig. 11. Resultatene viser at Der f II primede T-celler gir signifikant respons på peptidene DP II-l, DP II-3/3.1, DP II-4 og DP II-7. Fig. 12 viser resultatene av inverse eksperimenter, hvori T-celler fra flere pasienter ble primet in vitro på Derp II proteinet og analysert for respons på forskjellige Der f TI peptider. Resultatene av 26 positive eksperimenter viser at Derp II primede T-celler gir signifikant respons på peptidene DF II-l, DF II-4.5, DF 11-15, DF 11-17, DF 11-18 og DF II-19.1.

Eksempel XI: Syntese av dominante peptider

Basert på analysene beskrevet i eksemplene V-X ble det identifisert hoved-områder av T-cellereaktivitet innenfor Derp I, Derp II, Der fl og Der f II I hver studie ga alle de testede pasienter respons på proteinallergenet (f.eks. Derp I) og minst ett peptid avledet fra et hovedområde av T-cellereaktivitet innenfor proteinet. Syv regioner (region 1, region 2, region 3, region 4, region 5, region 6a og region 6b) med betydelig T-cellereaktivitet ble identifisert i Derp I og Der fl proteinene. Disse regioner defineres som følger: Region 1, aminosyrerestene 1-28 av Derp I og Der f I proteinene; region 2, aminosyrerestene 36-68 av Derp I og Der fl proteinene; region 3, aminosyrerestene 74-109 av Derp I og Der f I proteinene; region 4, amionsyrerestene 118-139 av Derp I og Der f I proteinene; region 5, amionsyrerestene 141-166 av Derp I og Der f I proteinene; og region 6a, aminosyrerestene 161-185 av Der p I og Der f I proteinene og region 6b, aminosyrerestene 173-201 av Derp I og Der f I proteinene.

På lignende måte ble fire regioner av betydelig T-cellereaktivitet (region 7, region 8, region 9 og region 10) identifisert i Derp II og Der_f II proteinene. Disse regioner defineres som følger: region 7, aminosyrerestene 1-26 av Derp II og Der_f II proteinene; region 8, aminosyrerestene 33-67 av Derp II og Der f IT proteinene; region 9, aminosyrerestene 79-104 av Derp II og Der f TT proteinene; og region 10, aminosyrerestene 107-129 av Derp II og Der f TT proteinene. Basert delvis på T-cellereaktiviteten beskrevet i eksemplene V-X ble peptider avledet fra Derp I, Der f I, Derp II og Der f TT utvalgt og modifisert ved addisjon eller delesjon av aminosyrerester på enten 5'- eller 3'-enden av peptidet. Ved utforming av disse utvalgte peptider ble forskjellige faktorer tatt i betraktning, omfattende den rangerte sum av de overlappende peptider, prosentandelen av responser med en S.I. på minst 2,0 på peptidene, den potensielle kryss-reaktivitet av peptidene, vanskeligheten ved fremstilling av peptidene osv.. T-cellestudier i likhet med dem beskrevet i eksemplene V-X ble gjennomført ved anvendelse av disse utvalgte peptider for mer presist å definere hovedområdene av T-cellereaktivitet innenfor regionene l-6a og 6b av Derp I og Der f T proteinet og regionene 7-10 av Derp II og Der f TT proteinet.

Resultatene av T-cellestudier ved anvendelse av utvalgte peptider avledet fra Derp I, Der f f, Derp II og Der f TT proteinene er vist i fig. 13-18a-d. Fremgangsmåten beskrevet i eksempel V ble fulgt med T-cellelinjer fra flere pasienter primet in vitro på Derp I proteinet og deretter analysert for respons på utvalgte peptider avledet fra Derp I sekvensen. Resultatene av 33 positive eksperimenter vist i fig. 13, viser at Der p I primede T-celler gir signifikant respons på peptider funnet i peptidene DP I-21.1, DP 1-21.2, DP 1-22.2, DP 1-25.2, DP 1-22.1, DP 1-23.1, DP 1-23.2, DP 1-26.1 og DP 1-28.1.

På lignende måte fulgte man fremgangsmåten beskrevet i eksempel VI med T-cellelinjer fra 9 pasienter primet in vitro til Der f I proteinet og deretter analysert for respons på utvalgte peptider avledet fra proteinet. Disse data ble analysert som beskrevet i eksempel VI. Resultatene av de 9 pasienter vist i fig. 14, demonstrerer T-cellereaktivitet på utvalgte peptider fra Der f T.

I et annet eksperiment ble T-cellelinjer fra flere pasienter primet in vitro med Derp I proteinet og analysert for respons på utvalgte peptider avledet fra Derp I proteinet og et sett av i alt vesentlig tilsvarende peptider avledet fra Der f T proteinet. Data fra 30 positive eksperimenter ble analysert som beskrevet i eksempel V. Som vist i fig. 15a ga Derp I primede T-celler signifikant respons på peptidene DF 1-21.1, DF I-21.2, DF 1-23.1, DF 1-22.2, DF 1-22.3, DF 1-22.4, DF 1-23.2, DF 1-25.1, DF 1-26.1 og DF 1-27.1. Fig. 15b er et undersett av de data som er vist i fig. 15a, og viser responsen av Der p I primede T-celler på peptider analysert etter rangert sum. Fig. 15b viser at DPI-23.1 hadde den høyeste rangerte sum av denne gruppe av peptider i denne studie. Fig. 16a viser resultatene av det inverse eksperiment, hvori T-celler fra 9 pasienter ble primet in vitro på Dfirf I proteinet og utfordret med utvalgte Der fl peptider og et sett av i alt vesentlig tilsvarende Her p I peptider. Resultatene viser at Der f T primede T-celler fra 9 pasienter gir respons på utvalgte peptider fra Derp I. Fig. 16a viser at DF 1-22.1 og DF 1-25.1 hadde de høyeste stimuleringsindekser av denne gruppe av peptider. Fig. 16b er et undersett av de samme data som vist i fig. 16a, og viser responsen av foretrukne Der f T og Derp I peptider. Fig. 16b viser at DF 1-22.2 hadde den høyeste stimuleringsindeks av denne gruppe av foretrukne peptider i dette eksperiment.

Et annet eksperiment ifølge fremgangsmåten beskrevet i eksempel VIII analyserte responsen hos 29 pasienter primet in vitro med Derp II proteinet, og utfordret med utvalgte peptider avledet fra Derp II sekvensen. Fig. 17a viser at Derp II primede T-celler fra én pasient gir respons på utvalgte peptider fra Derp II. Fig. 17b viser resultatene fra et eksperiment i likhet med det som er vist i fig. 17a med et sett av 30 pasienter, og med den høyeste og laveste utelatt fra gjennomsnittet. Fig. 17b viser at DPII-20.6 hadde den høyeste rangerte sum av denne gruppe av foretrukne peptider i denne studie. Fig. 18a viser det inverse eksperiment hvori T-celler fra 1 pasient ble primet in vitro på Der_f II proteinet og utfordret med utvalgte peptider avledet fra Derp II sekvensen. Fig. 18a viser at Der f II primede T-celler fra 10 pasienter gir respons på utvalgte peptider fra Derp II. Som vist i fig. 18a har DP 11-25 den høyeste stimuleringsindeks. Fig. 18b er et undersett av de samme data vist i fig. 18a, og viser responsen hos naturlige Der f TI primede T-cellelinjer på foretrukne Derp II peptider analysert etter rangert sum. Som vist i fig. 18b har DPII-25.2 den høyeste rangerte sum av de foretrukne peptider i denne studie.

Eksempel XII: Studie som viser kryss-reaktivitet av utvalgte gruppe I og gruppe II epitoper

En studie i likhet med den som er beskrevet i eksempel VII, ble utført med T-celler fra 4 matchede pasienter primet in vitro med gruppe I proteiner fra Der f T og Derp I og deretter analysert for respons på utvalgte foretrukne peptider fra Derp I og Der f T- Resultatene i fig. 18c viser at T-cellereaktivitet på flere av de utvalgte foretrukne Derp I peptider var i alt vesentlig tilsvarende for deres Der f I motpart og vice-versa.

Fig. 18d viser resultatene av en lignende studie med T-celler fra 6 matchede pasienter primet in vitro med gruppe II proteiner fra Derp og Der f, og deretter analysert for respons på utvalgte foretrukne Derp II og Der f II peptider. I likhet med resultatene i fig. 18c, er T-cellereaktivitet på flere av de utvalgte foretrukne peptider av Der_p II i alt vesentlig tilsvarende deres Der f II motparter og vice-versa.

Eksempel XIII: Direkte bindingsassay av IgE til midd allergenproteiner og peptider

Corning assay plater (#25882-96) ble belagt med 5 /ig/ml av hvert belegg antigen oppført i fig. 19, 20 og 21 med 50 jtl/100ml/brønn og inkubert over natten ved 4°C. Beleggantigenene ble fjernet, og brønnene blokkert med 0,5% gelatin i PBS, 300 /d/brønn i 2 timer ved romtemperatur. Oppsamlet humant plasma (en blanding av plasmaprøver fra 20 pasienter som var hudtestpositive for kommersielt middekstrakt) ble seriefortynnet med PBS-Tween 20 (PBS med 0,05% ikke-ionisk tensid Tween-20 Sigma, St. Louis, MO) og 100 ^l/brønn ble tilsatt og inkubert over natten ved 4°C (plasmafortynningene ble testet i duplikat). Det andre antistoff (biotinylert geit anti-human IgE, 1:1000, Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., Gaithersburg, MD), ble tilsatt i 100 jil/brønn i 1 time ved romtemperatur. Denne løsningen ble fjernet, og streptavidin-HRPO, 1:10000, (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL) ble så tilsatt i 100 /il/brønn i 1 time ved romtemperatur (alle brønner vaskes 3 ganger med PBS-Tween mellom inkuberingstrinnene). TMB membranperoksydase-substratsystem (Kirkegaard & Perry Laboratories) ble friskt blandet og tilsatt i 100 pil/brønn. Fargen fikk utvikle seg i 2-5 min.. Reaksjonen ble stanset ved tilsetning av 100 ml/brønn av IM fosforsyre. Platene ble avlest på en mikroplate IL310 Autoreader (Biotech Instruments, Winooski, VT) med et 450 nm filter. Det ble tatt gjennomsnitt av absorbansnivået av duplikate brønner. Diagrammet over resultatene (log av for-tynningen versus absorbansen) av ELISA-bestemmelsene er vist i fig. 19a-b, 20a-b og 21 a-h. Rekkefølgen av beleggantigener oppført vertikalt i disse ifgurforklaringer tilsvarer i rekkefølge fra venstre til høyre de beleggantigener som er oppført for hvert histogram.

Resultatene av ELISA-bestemmelsen vist i fig. 19b viser god binding av både biokjemisk renset Derp II og rekombinant Der p II ( rDer p II) med human IgE og ingen påvisbar binding til Derp II peptidene. IgE-bindingen til Denp-settet av peptider og proteiner (fig. 20a og 20b) viser det samme reaktivitetsmønster som Der f-settet. Dvs. ingen påvisbar binding til Der f I eller Der f II peptider eller rekombinant Der f T med binding til bare biokjemisk renset Dex_f I og rekombinant og biokjemisk renset Der fil I begge tilfeller synes det å være bedre binding til rekombinant Derp II eller Der f II enn til de biokjemisk rensede former. Alle konklusjonene avledet fra de ovennevnte ELISA-assaydata ble bekreftet ved en annen assaymetode, dot blots på nitrocellulosepapir, ved anvendelse av det samme sett av antistoff og antigenreagenser.

Antigenpreparatet som ble anvendt som positiv kontroll, var en blanding av de fire viktigste biokjemisk rensede middallergener (PMA for Purified Mite Allergen); Der f I, Der f TT, Derp I og Derp II. Stokkløsningen ble laget ved en konsentrasjon på 100 [ lg av hvert protein pr. milliliter eller 400 fig totalprotein/ml. Dette preparat ble anvendt på hver belagte ELISA-plate. Resultatene fra disse ELISA-bestemmelser er vist i fig. 21 a-h. Det er klar binding til enten det rensede eller rekombinante protein eller PMA-antigenpreparatet på hver plate, hvilket viser god IgE-reaktivitet. PMA-antigenpreparatet har imidlertid en høy grad av ikke-spesifikk reaktivitet vist i bakgrunnsfortynningen hvor ingen første antistoffløsning ble tilsatt. Denne ikke-spesifikke reaktivitet forekommer mellom PMA-antigenet og det biotinylerte andre antistoff, og kompromitterer ikke funnet av spesifikk IgE-reaktivitet på antigenet. Ved anvendelse av en kvantitativ verdi på to ganger over bakgrunnen ved den høyeste plasmakonsentrasjonen som en positiv avlesning, er det ingen påvisbar IgE-reaktivitet på noen av de 56 peptider screenet ved denne assay-metode.

Claims

1. Isolert peptid av et proteinallergen av slekten Dermatnphagnides , karakterisert ved at nevnte peptid omfatter minst én T-celle-epitop av nevnte proteinallergen, idet nevnte peptid har en positivitetsindeks på minst omtrent 150 og gjennomsnittlig T-cellestimuleringsindeks på minst omtrent 4,0 bestemt i en populasjon av individer som er følsomme for nevnte proteinallergen, hvor nevnte peptid omfatter hele eller en T-celle-epitop-inneholdende del av region 1, region 2, region 3, region 4, region 5, region 6a, region 6b, region 7, region 8, region 9, region 10, eller et funksjonelt ekvivalent peptid derav, hvor region 1 omfatter aminosyre-residiene 1-28 av Der p I og Der fl proteinallergener; region 2 omfatter aminosyreresidiene 36-68 av Der ploo Der fl proteinallergenene; region 3 omfatter aminosyreresidiene 74-109 av Der p I og Der fl proteinallergener; region 4 omfatter aminosyreresidiene 118-139 av Der p I og Der fl proteinallergener; region 5 omfatter aminosyreresidiene 141-166 av Der pl og Der fl proteinallergener; region 6a omfatter amniosyreresidiene 161-185 av Der plog Der fl proteinallergener; region 6b omfatter aminosyrene 173-201 av Der p I og Der fl allergene; region 7 omfatter aminosyreresidiene 1-26 av Der p II og Der fil proteinallergenene; region 8 omfatter aminosyreresidiene 33-67 av Der p II og Der/II proteinallergenene; region 9 omfatter aminosyreresidiene 79-104 av Der pil og Der fil proteinallergenene; region 10 omfatter aminosyreresidiene 107-129 av Der pil og Der fil proteinallergenene.

2. Isolert peptid ifølge krav 1,karakterisert ved at det er valgt fra gruppen bestående av: DP I-l (SEKV. ID NR.: 9); DP 1-21.1 (SEKV. ID NR.: 27); DP 1-21.2 (SEKV. ID NR.: 28); DP 1-23.1 (SEKV. ID NR.: 33); DP 1-23.2 (SEKV. ID NR.: 34); DP 1-25.2 (SEKV. ID NR.: 36) og (DP 1-26.1 (SEKV. ID NR.: 37).

3. Isolert peptid ifølge krav 1, karakterisert ved at det er valgt fra gruppen bestående av DP 1-21.2, DP I 23.1, DP I 26.1, DP II-20.6, DP 11-22, DP II-25.2 og DF 1-22.2 som vist i fig. 3 og 4.

4. Isolert peptid ifølge krav 1, karakterisert ved at det ikke binder immunoglobulin E som er spesifikt for et proteinallergen av slekten Dermatophagoides i minst omtrentt 75% av en populasjon av individer som er følsomme for proteinallergenet eller dersom det foregår binding av peptidet til nevnte immunoglobulin E, vil slik binding ikke resultere i avgivelse av mediatorer fra mastceller eller basofiler i minst omtrent 75% av en populasjon av individer følsomme for proteinallergenet.

5. Isolert peptid ifølge krav 1, karakterisert ved at det binder immunoglobulin E i en mindre utstrekning enn proteinallergenet, fra hvilket peptidet er avledet, binder nevnte immunoglobulin E.

6. Isolert peptid ifølge krav 2, karakterisert ved at populasjonen av individer er minst 16 individer.

7. Isolert peptid ifølge krav 2, karakterisert ved at populasjonen av individer er minst 29 individer.

8. Isolert peptid ifølge krav 1, karakterisert ved at det omfatter minst to T-celle-epitoper.

9. Isolert peptid ifølge krav 1, karakterisert ved at når det administreres til et individ som er følsomt mot husstøvmidd, induserer T-cellealleri i individet eller modifiserer den lymfokine sekresjonsprofil av T-celler i individet.

10. Hele eller en del av et isolert peptid av Derp I omfattende minste én T-celle-epitop av Derp I, karakterisert ved at nevnte peptid er valgt fra gruppen bestående av:

11. Hele eller en del av et isolert peptid ifølge krav 10, karakterisert ved at det ikke binder immunoglobulin E spesifikt for Der p I i minst omtrent 75% av en populasjon av individer følsomme for Der p I, eller dersom det foregår binding av peptidet eller en del derav til nevnte immunoglobulin E, vil en slik binding ikke resultere i avgivelse av mediatorer fra mastceller eller basofiler i minst omtrent 75% av en populasjon av individer som er følsomme for Der p I.

12. Hele eller en del av et isolert peptid ifølge krav 10, karakterisert ved at det i et individ som er følsomt for hus-støv-midd og som det blir administrert til, modifiserer den allergiske respons hos individet på et husstøv-midd-allergen.

13. Del av et isolert peptid ifølge krav 10, karakterisert ved at denne del omfatter minst 15 aminosyrerester.

14. Isolert nukleinsyre, karakterisert ved at den har en sekvens som koder for hele eller en del av et peptid ifølge krav 10, eller den funksjonelle ekvivalent av nevnte nukleinsyresekvens.

15. Isolert peptid, karakterisert ved at det er immunologisk kryssreaktivt med antistoffer spesifikke for hele eller en del av et peptid ifølge krav 10.

16. Isolert peptid, karakterisert ved at det er immunologisk kryssreaktivt med T-celler reaktive med hele eller en del av et peptid ifølge krav 10.

17. Isolert peptid av Der pl, karakterisert ved en aminosyresekvens i alt vesentlig tilsvarende en aminosyresekvens av et peptid valgt fra gruppen bestående av:

18. Isolert nukleinsyre,karakterisert ved en sekvens som koder for et peptid ifølge krav 17, eller den funksjonelle ekvivalent av nevnte nukleinsyresekvens.

19. Isolert peptid ifølge krav 17, karakterisert ved at det er valgt fra gruppen bestående av:

20. Isolert peptid omfattende minst to regioner, idet hver region omfatter minst én T-celle-epitop av et proteinallergen av slekten Dermatophagoides, karakterisert ved at nevnte regioner er avledet fra de samme eller fra forskjel-lige proteinallergener av slekten Dermatophagoides, og nevnte regioner alle omfatter hele eller en del av en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av:

21. Isolert peptid ifølge krav 20, karakterisert ved at nevnte regioner omfatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av:

22. Isolert peptid ifølge krav 20, karakterisert ved at nevnte regioner omfatter hele eller en del av en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av: alle som vist i fig. 3 og 4.

23. Isolert peptid ifølge krav 20, karakterisert ved at nevnte regioner omfatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av: alle som vist i fig. 3 og 4.

24. Isolert peptid ifølge krav 20, karakterisert ved at nevnte peptid omfatter en kombinasjon av regioner valgt fra gruppen bestående av:

25. Isolert peptid ifølge krav 20, karakterisert ved at nevnte peptid omfatter følgende kombinasjon av regioner: DP 1-21.2 (SEKV. ID NR.:27), DP 1-23.1 (SEKV, ID NR.:33), DP 1-26.1 (SEKV. ID NR.:37), DP II-20.6 (SEKV. ID NR.:56), DP 11-22 (SEKV. ID NR.:63), DP 11-25.2 (SEKV. ID NR.:71) og DF 1-22.2 (SEKV. ID NR.:93).

26. Isolert nukleinsyre, karakterisert ved en sekvens som koder for hele eller en del av et peptid ifølge krav 26, eller den funksjonelle ekvivalent av nevnte nukleinsyresekvens.

27. Isolert peptid, karakterisert ved at det er fremstilt i en vertscelle transformert med nukleinsyren ifølge krav 26.

28. Isolert peptid ifølge krav 20, karakterisert ved at nevnte peptid har et spesielt sekvensarrangement av aminosyresekvensene, idet nevnte arrangement av amionsyresekvenser er valgt fra gruppen bestående av: a) hhv. DP 1-26.1, DP II-25.2, DF 1-22, DP II-20.6 og DPI-21.2 som vist i fig. 25; b) hhv. DP II-25.2, DF 1-22.2, DP 1-23.1, DP 11-22, DP 1-26.1, DPI-21.2 og DP II-20.6 som vist i fig. 26; og c) hhv. DP II-25.2, DP 1-21.1, DP 1-26.1, DP 11-22, DP II-20.6 og DF 1-22.2 som vist i fig. 27.

29. Isolert peptid ifølge krav 20, karakterisert ved at regionene omfatter en amionsyresekvens valgt fra gruppen bestående av:

30. Isolert nukleinsyre, karakterisert ved en sekvens som koder for hele eller en del av et peptid ifølge krav 20, eller den funksjonelle ekvivalent av nevnte nukleinsyresekvens.

31. Isolert peptid, karakterisert ved at det er fremstilt i en vertscelle transformert med nukleinsyren ifølge krav 30.

32. Hele eller en del av et isolert peptid av et proteinallergen av slekten Dermatophagoides, karakterisert ved at nevnte peptid eller del derav omfatter minst én T-celle-epitop av nevnte proteinallergen, og at nevnte peptid har formelen X„- Y-Zm, hvori Y er en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av: hvor Xn er aminosyrerester i nabostilling til aminoterminus av Y i amionsyresekvensen av nevnte proteinallergen, hvor Zm er aminosyrerester i nabostilling til karboksyterminus av Y i aminosyresekvensen av nevnte proteinallergen, hvori n er 0-30 og hvor m er 0-30.

33. Hele eller en del av et isolert peptid ifølge krav 32, karakterisert ved at n = 0 og m = 0.

34. Del av et isolert peptid ifølge krav 32, karakterisert ved at delen omfatter minst 15 aminosyrerester.

35. Isolert peptid ifølge krav 32, karakterisert ved at peptidet omfatter opp til 45 amionsyrer.

36. Hele eller en del av et isolert peptid ifølge krav 32, karakterisert ved at det ikke binder immunoglobulin E som er spesifikt for et proteinallergen av slekten Dermatophagoides i minst omtrent 75% av en populasjon av individer som er følsomme for proteinallergenet, eller dersom det foregår binding av peptidet eller en del derav til nevnte immunoglobulin E, resulterer slik binding ikke i avgivelse av mediatorer fra mastceller eller basofiler i minst omtrent 75% av en populasjon av individer som er følsomme for proteinallergenet.

37. Isolert peptid ifølge krav 32, karakterisert ved at det binder immunoglobulin E i en betydelig mindre utstrekning enn proteinallergenet fra hvilket peptidet er avledet, binder nevnte immunoglobulin E.

38. Hele eller en del av et isolert peptid av et protein-allergen av slekten Dermatophagoides, karakterisert ved at nevnte peptid eller del derav omfattende minst én T-celle-epitop av nevnte proteinallergen, og at nevnte peptid omfatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av:

39. Del avet isolert peptid ifølge krav 3 8, karakterisert ved at delen omfatter minst 15 amionsyrerester.

40. Isolert peptid ifølge krav 38, karakterisert ved at peptidet omfatter opptil 45 amionsyrer.

41. Hele eller en del av et isolert peptid ifølge krav 38, karakterisert ved at det har minimal immunoglobulin-E-stimulerende aktivitet.

42. Hele eller en del av et isolert peptid ifølge krav 38, karakterisert ved at det ikke binder immunoglobulin E som er spesifikt for et proteinallergen av slekten Dermatophagoides i minst omtrent 75% av en populasjon av individer som er følsomme for proteinallergenet, eller dersom det foregår binding av peptidet eller en del derav til nevnte immunoglobulin E, resulterer slik binding ikke i avgivelse av mediatorer fra mastceller eller basofiler i minst omtrent 75% av en populasjon av individer som er følsomme for proteinallergenet.

43. Hele eller en del av et isolert peptid ifølge krav 38, karakterisert ved at det binder immunoglobulin E i en mindre utstrekning enn proteinallergenet som peptidet er avledet fra, binder nevnte immunoglobulin E.

44. Hele eller en del av et isolert peptid ifølge krav 3 8, karakterisert ved at det i et individ som er følsomt for husstøvmidd og som det administreres til, modifiserer den allergiske respons av individet på et husstøvmiddallergen.

45. Isolert nukleinsyre, karakterisert ved at den har en sekvens som koder for hele eller en del av et peptid ifølge krav 38, eller den funksjonelle ekvivalent av nevnte nukleinsyresekvens.

46. Isolert peptid, karakterisert ved at det er immunologisk kryssreaktivt med antistoffer som er spesifikke for hele eller en del av et peptid ifølge krav 38.

47. Isolert peptid, karakterisert ved at det er immunologisk kryssreaktivt med T-celler som er reaktive med hele eller en del av et peptid ifølge krav 38.

48. Isolert peptid av et proteinallergen av slekten Dermatophagoides, karakterisert ved at nevnte peptid er valgt fra gruppen bestående av:

49. Isolert peptid eller et proteinallergen av slekten Dermatophagoides, karakterisert ved at nevnte peptid er valgt fra gruppen bestående av:

50. Terapeutisk preparat, karakterisert ved minst ett isolert peptid ifølge krav 1,17,22,28,32,38 eller 49, og en farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynningsmiddel.

51. Terapeutisk preparat omfattende en farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynningsmiddel og minst to peptider, karakterisert ved at nevnte peptider begge omfatter minst én T-celle-epitop av et proteinallergen av slekten Dermatophagoides, og at nevnte peptider er avledet fra de samme eller fra forskjellige proteinallergener av slekten Dermatophagoides.

52. Preparat ifølge krav 51, karakterisert ved at nevnte peptider er valgt fra gruppen bestående av: hvor nevnte preparat omfatter en tilstrekkelig prosentandel av T-celle-epitopene av minst ett proteinallergen, slik at ved administrering av preparatet til et individ som er følsomt for et hus-støv-midd-allergen, blir T-celler hos individet gjort tålbare for nevnte minst ene proteinallergen.

53. Preparat ifølge krav 52,karakterisert ved at nevnte peptider er valgt fra gruppen bestående av:

54. Preparat ifølge krav 52, karakterisert ved en kombinasjon av peptider valgt fra gruppen bestående av:

55. Preparat ifølge krav 52, karakterisert ved følgende kombinasjon av peptider: DP 1-21.2 (SEKV. ID NR.:27), DP 1-23.1 (SEKV. ID NR.:33), DP 1-26.1 (SEKV. ID NR.:37), DP 11-20.6 (SEKV. ID NR.: 56), DP 11-22 (SEKV. ID NR.:63), DP 11-25.2 (SEKV. ID NR.71) og DF 1-22.2 (SEKV. ID NR.:93).

56. Terapeutisk preparat, karakterisert ved minst ett peptid av minst ett proteinallergen av slekten Dermatophagoides og en farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynningsmiddel, idet preparatet omfatter en tilstrekkelig prosentandel av T-celle-epitopene av nevnte minst ene proteinallergen slik at ved administrering av preparatet til et individ som er følsomt for et husstøvmiddallergen, blir T-cellene hos individet gjort tålbare for nevnte minst ene proteinallergen.

57. Terapeutisk preparat ifølge krav 56, karakterisert ved at nevnte proteinallergen er valgt fra gruppen bestående av: Der p I; Der fl; Der p II og Der fil.