NO325823B1 - Humaniserte antistoffer, fremgangsmate for a fremstille humaniserte antistoffer og anvendelsen av slike. - Google Patents

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse er rettet mot humaniserte antistoffer, fremgangsmåter for å fremstille humaniserte antistoffer og anvendelse av slike. Spesielt er foreliggende oppfinnelse rettet mot fremgangsmåter for å fremstille humaniserte antistoff ved å bruke monovalente fagdisplaysystem og antistoff-mutanter fremstilt ved tilfeldig mutagenese av en liten del av kritiske grunnresidier fremstilt fra en enkel human grunnstruktur. Mer spesielt, er denne oppfinnelsen rettet mot humanisering av et murint antistoff som binder til vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF).

Bakgrunn for oppfinnelsen

Monoklonale antistoff (mAb) har et enormt potensiale som terapeutisk middel, spesielt når de kan bli brukt for å regulere definerte systemer. For eksempel er det i noen tilfeller ønskelig å regulere et system slik som angiogenese, hvor nye blodkapillærer blir dannet fra veggene i eksisterende små årer. Angiogenese er generelt viktig etter påføring av et sår eller infeksjon slik at kapillærvekst kan bli stimulert i naboområdet til det ødelagte vevet. Imidlertid er angiogenese også viktig ved tumorvekst, for at tumoren skal fortsette å vokse må tumoren indusere dannelsen av et kapillærnettverk som invaderer tumormassen.

Visse vekstfaktorer har blitt identifisert som regulerer angiogenese. Av spesiell interesse er vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) som ser ut til å være den forbindelsen som er nødvendig for at tumorer erverver deres rike blodforsyning. Molecular Biology of the Cell. 3rd Ed., Alberts et al., Garland Publishing, side 1154

(1994). Derfor kan for eksempel mAbs mot VEGF være nyttige av forskjellige grunner, inkludert anvendelse ved regulering av angiogenese og mer spesielt, som antitumormiddel. Et murint antiVEGF mAb A4.6.1 som blokkerer VEGF reseptorbinding har tidligere blitt beskrevet. Dette antistoffet har blitt vist å inhibere mitogen signalisering. Kim et al., Growth Factors 7, 53 (1992); Kim et al., Nature, 841

(1993).

De fleste mAbs inkludert anti-VEGF beskrevet over er avledet fra murin eller andre ikke-humane kilder, noe som begrenser deres kliniske effektivitet. Spesielt regarerer kroppen ofte med en immunogen respons mot ikke-humane antistoff hvorved antistoffene raskt blir fjernet fra systemet før en terapeutisk effekt inntreffer. I tillegg til immunogenitet av ikke-humant mAb som induseres når den blir administrert til mennesker, oppstår ytterligere begrensning på grunn av svak rekruttering av effektorfunksj on.

Som et middel for å omgå disse manglene kan antigenbindingsegenskapene til ikke-humant mAb bli overført til humane antistoffer gjennom en prosess kjent som antistoff "humanisering". Et humanisert antistoff inneholder aminosyresekvensen fra seks komplementærbestemmende regioner (CDR) (antigenbindingssetet til antistoff-molekylet) av opprinnelig eller korresponderende ikke-humant mAb, podet på en human antistoffstruktur. Derfor er humanisering av ikke-humane antistoff vanligvis reflektert til som CDR-poding. Det lave innholdet av ikke-human sekvens i slike humaniserte antistoff (~5%) har vist seg å være effektivt til å redusere immunigenisiteten og til å forlenge serum halveringstiden til antistoffene administrert til mennesker. Blant annet er humaniserte monoklonale antistoff ("kimære immunoglobuliner") beskrevet i US patent nr. 4,816,567.

Uheldigvis gir enkel poding av CDR sekvenser ofte humaniserte antistoff som binder antigen mye svakere enn opprinnelig ikke-humant mAb. For å få tilbake høy affinitet må antistoffet ytterligere bli bearbeidet for å fininnstille strukturen til antigenbindingsløkkene. Dette oppnås ved å erstatte nøkkelresidier i grunnstrukturregionene til antistoffVariable domener med tilpassede sekvenser fra opprinnelig murint antistoff. Disse gnmnstruktur-residiene er vanligvis involvert i å understøtte konformasjonen av CDR-løkkene, selv om noen grunnstrukturresidier i seg selv direkte kan komme i kontakt antigenet. Studier har blitt utført som viser viktigheten av visse gninnstrukturresidier for CDR-konformasjon og en omfattende liste over alle grunnstrukturresidiene som kan innvirke på antigenbinding har blitt sammenstilt. Chothia et al., J. Mol Biol. 224,487 (1992); Foote et al., J. Mol Biol 224,489 (1992). Den omfattende listen inkluderer omtrent fretti"fininnstillings"residier som potensielt kan bidra til CDR-strukturen. Selv om en høyere antigenaffinitet antagelig ville være resultatet av en redigering av hele settet av fininnstillingsresidier innen et humant antistoff for tilpasning til den korresponderende opprinnelige ikke-humane sekvensen, er dette generelt ikke ønskelig på grunn av økt risiko for immunogenisitet tilført ved å tillegge ytterligere elementer fra ikke-human sekvens. Ut i fra et terapeutisk standpunkt er det derfor å foretrekke å begrense grunnstrukturendringer til et minimum som gir et høyaffinitets humanisert antistoff.

Derfor er det ønskelig å identifisere et lite sett av endringer som er tilstrekkelig for å optimalisere binding, imidlertid er de påkrevde endringene forventet å være forskjellig fra ett humanisert antistoff til ett annet. For å oppnå det ønskede resultatet har en tilnærmingsmåte vært å identifisere en korrekt kombinasjon av mutasjoner ved å konstruere et panel av mutanter som har "mistenkte" grunnstrukturresidier erstattet av deres murine motstykker. Hver av disse variantene er laget og testet mot antigen, og deretter kombinert med andre varianter funnet å ha fordelaktige bindingsafifniteter. Imidlertid involverer denne metoden sykluser av individuell setedirigert mutagenese, isolering og screening, og er derfor ikke ønskelig på grunn av stort tidsforbruk og at den er langtekkelig.

Som en metode for å forenkle antistoffhumanisering har et antall forskjellige tilnærminger blitt utviklet. Se for eksempel Queen et al., PNAS USA 86,10029 (1989); Kettleborough et al, Protein Eng. 4,773 (1991); Tempest et al., Biotechnology 9,266

(1991) ; Padian, Mol. Immunol. 28,489 (1991): Roguska et al., PNAS USA 91, 969

(1994); Studnicka et al., Protein Eng. 7, 805 (1994); Allen et al., J. Immunol. 135,368

(1985); Carter et al., PNAS USA 89,4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151,2623

(1993); Eigenbrot et al., Proteins 18,49 (1994); Shalaby et al., J. Exp. Med. 175,217

(1992) ; Kabat et al., Sequences of Proteins of hnmunological Interest,_(5th), Public Health Service, NTH, Bethesda, MD (1991); og Rosok et al., J. Biol. Chem. 271,22611

(1996).

Det er et formål ifølge foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe generelle metoder for raskt å selektere grunnstrukturmutasjoner som øker bindingen av humaniserte antistoff til deres kognate antigener hvori nåværende metoder av grurmstruktur-optimalisering basert på sykluser ved individuell setedirigert mutagenesescreening blir eliminert.

Det er også et formål å tilveiebringe raske metoder for å humanisere antistoffer som tilveiebringer antistoff med lav immunogenisitet og som utnytter en enkel human grunnstruktur som et generisk skjelett.

Det er et ytterligere formål ifølge foreliggende oppfinnelsen å tilveiebringe humaniserte antistoff som er mutert for å øke affiniteten til antigener i forhold til det initielle humaniserte antistoffet uten grunnstrukturendringer.

I tillegg er det et ytterligere formål ifølge oppfinnelsen å tilveiebringe humaniserte antistoff som har en redusert eliminasjonshastighet og derved lengre rentensjon i kroppen etter systemisk administrering slik at lavere doser av materialet er tilgjengelig for systemisk administrering og kan gi terapeutisk effekt.

Det er også et ytterligere formål ifølge oppfinnelsen å tilveiebringe humanisert monoklonale antistoff mot VEGF.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et humanisert antistoff mot vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) kjennetegnet ved at de komplementærbestemmende regioner (CDR) til et ikke-humant antistoff blir transplantert på en human grunnstruktur som omfatter VlKundergruppe I (VlkI) grunnstrukturen ifølge SEQ ID NO: 7 og Vh undergruppen HI (VrITT) grunnstrukturen ifølge SEQ ID NO: 10, der minst en av de representativt nummererte residiene 4 og 71 i VL-domenet er substituert med en forskjellig aminosyre, og minst tre av de representativt nummererte residiene 37, 67,69, 71, 73, 75,76, 78 og 94 i Vn-domenet er substituert med en forskjellig aminosyre, og der residiet 46 i VL-domenet eventuelt er substituert med aminosyren valin, og der residienummereringen er ifølge Kabat-nummereringen som vist i figuren 1.

Det initielle humaniserte anti-VEGF har en grunnstruktur avledet fra konsensus-sekvensen til de vanligste humane subklasser, dvs. Vlksubgruppe I (VikI) og Vh subgruppe m (VHnT) hvori CDR fra ikke-human anti-VEGF blir innpodet. Tilfeldig mutagenese av kritiske grunnstrukturerresidier av utgangskonstruksjonen produserte det humaniserte anti-VEGF beskrevet heri som har 125 ganger øket affinitet for antigenet i forhold til det utgangshumaniserte antistoff hvor ingen gruimstnikturendringer er foretatt. En enkel addisjonsmutasjon ga en ytterligere seks gangers økning i binding. Dette humaniserte anti-VEGF kan bli reprodusert ved fremgangsmåten beskrevet heri eller ved tradisjonelle rekombinante teknikker når sekveninformasjonen tilveiebragt heri er tilgjengelig.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for å humanisere et ikke-humant anti-vaskulært endotelial vekstfaktorantistoff, kjennetegnet ved at den omfatter trinnene: å transplantere komplementærbestemmende regioner (CDR) fra et ikke-humant antistoff til en human grunnstruktur som omfatter VLK-subgruppen I (Vlk-I) og VH-undergruppen HI (VHI1I); å substituere minst en av residiene 4 og 71 i VL-domenet med en forskjellig aminosyre og subsitutere minst 3 av residiene 37,67, 69,71, 73, 75, 76, 78 og 94 i Vn-domenet med en forskjellig aminosyre, der residienummereringen er iføgle Kabat-nummereringen vist i figure 1.

Fremgangsmåten medfører at det raskt produseres og identifiseres grunnstrukturmutasjoner som forbedrer binding av humaniserte antistoff til deres kognate antigener. I en foretrukken utførelsesform blir ikke-humant CDR podet på en human (VikT)-VhIII grunnstruktur. Tilfeldig mutagenese av et lite antall av kritiske grunnstruktur-residier ble også utført etterfulgt av en monovalent fremvisning av det resulterende biblioteket av antistoffmolekyler på overflaten av en filamentøs fag. De optimale grunnstruktursekvensene ble deretter identifisert ved affinitetsbasert seleksjon. Eventuelt, kan utvalgte antistoff ytterligere bli mutert for å erstatte fininnstillings-residiene som sitter på "Vl-Vh" grenseflaten med residier som er tilpasset det ikke-humane opprinnelige antistoffet.

Foreliggende oppfinnelsen angår videre anvendelse av det humaniserte antistoffet ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et medikament for behandling av tumorvekst.

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1 viser aminosyresekvensen til murint A4.6.1. (SEQ ID nr. 6 og 9 for henholdsvis VLOg Vh domenene, humanisert A4.6.1 variant hu2.0, SEQ ID nr. 7 og 10 for henholdsvis Vlog Vh domenene, og humanisert A4.6.1 variant hu2.10 (SEQ ID nr. 8 og 11 for henholdsvis Vlog Vh domenene). Sekvensnummereringen er i overensstemmelse med Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,_

(5th), Public Health Service, NIH, Bethesda, MD (1991) og feiltilpasning er indikert med stjerner (murin A4.6.1 vs hu2.0) eller kuler (hu2.0 vs. hu2.10). Variant hu2.0 inneholder bare CDR sekvenser (uthevet) fra murint antistoff innpodet på en human lettkjede K subgruppe I, tungkjede subgruppe HI grunnstruktur. Variant hu2.10 er konsensus humanisert klon ervervet fra fagsorteringseksperimentene beskrevet heri.

Figur 2 viser grunnstrukturresidier som er målet for randomisering.

Figur 3 viser fagemidkonstruksjonene for overflaterfemvisning av Fab-pHI-fusjoner på fag. Fagemid-konstruksjonene koder en humanisert versjon av Fab-fragmentet for antistoff A4.6.1 satt sammen til en del av M13 gen HI kappeprotein. Fusjonsproteinet består av Fab bundet til den karboksyterminale enden til den tunge kjeden til en enkel glutaminresidie (fra suppresjonen av et amber kodon i sup. E E. coli), deretter den C-terminale regionen til gen HI protein (residiene 249-406). Transformasjonen inn i F<+>E. coli, etterfulgt av superinfeksjon med M13K07 hjelperfag, produserer fagemidpartikler hvori en liten del av disse utviser en enkel kopi av fusjonsproteinet.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

A. Definisjoner

"Antistoff (Ab) og "immunoglobuliner" (lg) er glykoproteiner som har de samme struktuelleegenskaper. Mens antistoff utviser bindingsspesifisitet til et spesifikt antigen, inkluderer immunoglobulinet både antistoff og andre antistoff-lignende molekyler som mangler antigenspesifisitet. Polypeptider av den sistnevnte typen produseres for eksempel i lave nivåer av lymfesystemet og i økte nivåer av myelomer.

"Native antistoff og "native immunoglobuliner" er vanligvis heterotetramere glykoproteiner på omtrent 150.000 dalton, sammensatt av to identiske lette (L) kjeder og to identiske tunge (H) kjeder. Hver lette kjede er koblet til en tung kjede med en kovalent disulfidbinding, mens antallet disulfidbindinger varierer mellom tunge kjeder av forskjellig immunoglobulinisotype. Hver tunge og lette kjede har også intrakjededisulfidbroer med jevne mellomrom. Hver tunge kjede har i den ene enden et variabelt domene (Vh) etterfulgt av et antall konstante domener. Hver lette kjede har et variabelt domene i en ende og (Vl) et konstant domene i den andre enden. Det konstante domenet til den lette kjeden er sidestilt med det første konstante domenet til den tunge kjeden, og den lette kjedens variable domene er sidestilt med det variable domenet til den tunge kjeden. Man tror at spesielle aminosyreresidier danner en inter-fase mellom lett- og tungkjede variable domener. Clothia et al., J. Mol. Biol. 186,651,

(1985); Novotny et al., PNAS USA 82,4592 (1985).

Betegnelsen "variable" refererer til det faktum at visse deler av variabeldomener i stor utstrekning er forskjellig i sekvensen blant antistoff og benyttes i bindingen og spesifisiteten av hvert spesielle antistoff til dets spesielle antigen. Imidlertid er variasjonen ikke likt fordelt gjennom de variable domenene til antistoffene. Den er konsentrert i tre segmenter som kalles "komplementaritetsbestemmende regioner"

(CDR) eller "hypervariable regioner" både i den lette kjedens og tunge kjedens variable domene. De mer høyt konserverte delene av de variable domener blir kalt grunnstruktur (FR). De variable domenene til native tunge og lette kjeder omfatter hver fire FR-regioner, som stort sett har en "p-plate" konfigurasjon, bundet med tre CDR, som danner løkker som forbinder, og i noen tilfeller utgjør deler av "6-plate" strukturen. CDR i hver kjede holdes sammen tett nær FR-regionene og, sammen med CDR fra den andre kjeden, bidrar disse til dannelse av det antigenbindendesete til antistoffet. Kabat

et al., supra. De konstante domenene er ikke direkte involvert i binding av antistoff til antigen, men utviser forskjellige effektorfunksjoner, slik som deltagelse av antistoffet i antistoffavhengig cellulær toksisitet. Papainkutting av antistoff produserer to identiske antigenbindende fragmenter, kalt Fab-fragmenter, hver med et enkelt antigenbindende sete, og et "Fc"-fragment, der navnet reflekterer dets evne til å krystallisere raskt. Pepsinbehandling gir et F(ab')2-fragment som har to antigenkombinerende seter og som fortsatt i stand til å kryssbinde antigenet.

"Fv" er det minste antistoff-rfagmentet som inneholder et fullstendig antigen-

gjenkjennings- og bindingssete. Denne regionen består av en dimer av et tungt og et lett kjede variabelt domene i tett ikke-kovalent assosiering. Det er i denne konfigurasjonen at tre CDR fra hvert variabelt domene reagerer for å definere et antigenbindingssete på overflaten av Vh-Vldimer. Til sammen meddeler de seks CDR

antigenbindingsspesifisitet til antistoffet. Selv et enkelt variabelt domene (eller halvdelen av en Fv som omfatter bare tre CDR spesifikke for et antigen) har evnen til å gjenkjenne og binde antigenet, skjønt men lavere affinitet enn hele bindingssetet.

Et "Fab" fragment inneholder det konstante domenet til den lett kjeden og det første konstante domenet (CH1) til den tunge kjeden. Fab'-fragmentene er forskjellig fra Fab-fragmentene med et tilsegg på noen få residier i den karboksyterminale enden til tungkjede CH1-domenet inkludert en eller flere cysteiner fra antistoffhengsels-regionen. Fab -SH er betegnelsen heri for Fab' hvori cysteinresidien(e) i de konstante domenene

bærer en fri tiolgruppe. F(ab )2 antistoff-rfagmenter ble i utgangspunktet produsert som par av Fab'-fragmenter som har hengselscysteinet mellom seg. Andre kjemiske koblinger av antistoff-rfagmentene er også kjent.

De lette kjedene til antistoffene (immunoglobulinet) fra en hvilken som helst vertebrat

art kan tilordnes en av to distinkte typer, kalt kappa (k) og lambda ( X), basert på aminosyresekvensene til deres konstante domene.

Avhengig av aminosyresekvensen til det konstante domenet av deres tunge kjeder, kan immunoglobuliner bli tilodnet forskjellige klasser. Det er fem hovedklasser av immunoglobuliner: IgA, IgD, IgE, IgG og IgM og flere av disse kan ytterligere bli delt inn i subklasser (isotyper): for eksempel IgG-1, IgG-2, IgG-3 og IgG-4; IgA-1 og IgA-2.

De tunge kjede konstant domenene som korresponderer med forskjellige klasser av immunoglobuliner blir henholdsvis kalt a, delta, epsilon, y og u. Subenhetstrukturene og tredimensjonale konfigurasjonene av forskjellige klasser av immunoglobuliner er velkjente.

Betegnelsen "antistoff' blir brukt i den bredeste betydning og dekker spesielt enkle monoklonale antistoff (inkludert agonist- og antagonistantistoff), antistoff-sammensetninger med polyepitopisk spesifisitet, så vel som antistoff-fragmenter (for eksempel Fab, F(ab')2og Fv) så lenge de utviser ønsket biologisk aktivitet.

Betegnelsen "monoklonalt antistoff' som brukt heri refererer seg til antistoff ervervet fra en populasjon av vesentlig homogene antistoff, dvs. enkletantistoffene som omfatter populasjonen er identiske med unntak av mulige naturlige forekommende mutasjoner som kan være tilstede i en mindre mengde. Monoklonale antistoff er høyt spesifikke, og blir rettet mot et enkelt antigensete. Videre, i motsetning til konvensjonelle (polyklonale) antistoff-fremstillinger som typisk inkluderer forskjellige antistoff rettet mot forskjellige determinanter (epitoper), blir hvert monoklonalt antistoff rettet mot en spesiell determinant på antigenet. I tillegg til deres spesifisitet, er de monoklonale antistoffene fordelaktige fordi de er syntetisert i hybridomkultur, og de er ikke kontaminert med andre immunoglobuliner. Betegnelsen "monoklonal" indikerer egenskapen til antistoffet som er ervervet fra en vesentlig homogen populasjon av antistoff, og skal ikke bli forstås som om de er produsert ifølge en hvilken som helst spesiell metode. For eksempel kan monoklonale antistoff som blir brukt i samsvar med foreliggende oppfinnelse bli fremstilt ved hybridommetoden først beskrevet av Kohler et al., Nature 256,495 (1975) eller de kan bli fremstilt ved rekombinante DNA-metoder, se for eksempel US patent nr. 4,816,567.

"Kimære" antistoff (immunoglobuliner) er antistoff hvori en del av den tunge og/eller lette kjeden er identisk eller homolog med korresponderende sekvenser i antistoff avledet fra en spesiell art eller tilhørende en spesiell antistoff-klasse eller subklasse, mens den gjenværende delen av kjeden (ene) er identisk eller homolog med korresponderende sekvenser i antistoffene avledet fra andre arter eller tilhørende en annen antistoffklasse eller subklasse, så vel som fragmenter av slike antistoff, så lenge de utviser ønsket biologisk aktivitet, US patent nr. 4,816,567.

"Humaniserte" former av ikke-humane (for eksempel) murine antistoff er kimære immunoglobuliner, immunoglobulinkjeder eller fragmenter derav (slik som Fv, Fab, Fab<t>, F(ab')2eller andre antigenbindende subsekvenser av antistoff) som inneholder minimal sekvens avledet fra ikke-humant immunoglobulin. For det meste er

humaniserte antistoff humane immunoglobuliner (resipient antistoff) hvori residier fra en komplementaritetsbestemmende region (CDR) fra resipienten er erstattet med residier fra en CDR fra en ikke-human art (donor antistoff) slik som mus, rotte eller kanin som har ønsket spesifisitet, affinitet og kapasitet. I noen tilfeller blir Fv grunnstruktur-residiene til humant immunoglobulin erstattet med korresponderende ikke-humane residier. Videre, kan humaniserte antistoff omfatte residier som verken er funnet i resipient-antistoff eller i den importerte CDR eller grunnstruktursekvenser. Disse modifiseringene er utført for ytterligere å forfine og optimalisere

antistoffutførelsen. Generelt vil humaniserte antistoff omfatte vesentlig alle eller minst en og typisk to variable domener hvori vesentlig alle CDR-regionene korresponderende til de fra et ikke-humant immunoglobulin, og alle eller vesentlig alle FR-regionene er fra en human immunoglobulin konsensussekvens. Humaniserte antistoff vil også eventuelt omfatte minst en del av en immunoglobulin konstant region (Fc), typisk den fra et humant immunoglobulin. For ytterligere detaljer se Jones et al., Nature 321, 522

(1986); Reichmann et al., Nature 332,323 (1988), og Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593 (1992).

"Ikke-immunogen i et menneske" betyr at ved å bringe humanisert antistoff i en terapeutisk effektiv mengde i kontakt med egnet vev fra et menneske, kan det ikke i noen vesentlig grad demonstreres en tilstand av sensitivitet eller resistens mot det humaniserte antistoffet ved administrering.

Som brukt heri, "vaskulær endotelial cellevekstfaktor" eller "VEGF" refererer til en mammalsk vekstfaktor som definert i US patent nr. 5,332,671, inkludert den humane aminosyresekvens i figur 1. Den biologiske aktiviteten til nativt VEGF er felles for enhver analog eller variant derav som er i stand til å fremme selektiv vekst av vaskulære endotelceller, men ikke fra bovine korneaendotelceller, linseepitelceller, binyrebarkceller, BHK-21 fibroblaster eller keratinocytter, eller som utviser et immun-epitop som er immunologisk kryssreaktiv med et antistoff indusert mot minst en epitop fra det korresponderende native VEGF.

"Sete-dirigert mutagenese" er en standardteknikk innen feltet, og blir utført ved å bruke en syntetisk oligonukleotidprimer som er komplementær med en enkelttrådet fag-NA som blir mutagenisert, med unntak av begrenset feiltilpasning, som representerer den ønskede mutasjonen. I korthet blir syntetiske oligonukleotider brukt som primere for å dirigere syntese av en tråd som er komplementær med fagen, og den resulterende dobbelt-trådete DNA blir transformert inn i fag-støttet vertsbakterie. Kulturene til de

transformerte bakteriene blir sådd ut i toppagar, som tillater plakkdannelse av enkle celler som har fag. Teoretisk vil 50% av de nye plakkene inneholde fag som har en enkelt tråd, den muterte formen; 50% vil ha originalsekvensen. Plakkene blir hybridisert med kinasebehandlet syntetisk primer ved en temperatur som tillater hybridisering av en fullstendig tilpasning, men som ved en feiltilpasning med originaltråden er tilstrekkelig til å forhindre hybridisering. Plakkene som hybridiserer med proben blir deretter selektert og dyrket, og DNA blir gjenvunnet.

"Ekspresjonssystem" refererer til DNA-sekvenser som inneholder en ønsket kodende sekvens og kontrollsekvenser som er operativt koblet, slik at vertene som transformeres med disse sekvensene er i stand til å produsere de kodede proteinene. For å effektuere transformering, kan ekspresjonssystem inkluderes i en vektor; imidlertid, kan det relevante DNA også bli integrert i vertskromosomet.

Heri blir "celle", "cellelinje" og "cellekultur" brukt om hverandre og alle slike betegnelser inkluderer avkom. Følgelig inkluderer "transformanter" eller "transformerte celler" primærcellen og kulturer avledet derfra uten hensyn til antallet. Det skal også forstås at ikke alt avkom behøver å være fullstendig identisk i DNA innhold, på grunn av tilsiktede eller utilsiktede mutasjoner. Mutant avkom som har samme funksjonalitet som de som det blir screenet for i de originale transformerte cellene er inkludert. Der distinkte betegnelser er tilsiktet, vil det gå klart fram fra sammenhengen.

"Plasmider" er betegnet med en liten p foran og/eller etterfulgt av store bokstaver og/eller nummer. Startsplasmidene heri er kommersielt tilgjengelige, offentlig tilgjengelig i ubegrensete mengder, eller kan konstrueres fra slike tilgjengelige plasmider i samsvar med publiserte prosedyrer. I tillegg er andre ekvivalente plasmider kjent innen fagfeltet og vil være opplagte for en som kjenner fagfeltet.

"Affimtetsbinding" refererer seg til styrken av totalsummen av ikke-kovalente interaksjoner mellom et enkelt antigen-bindingssete til et antistoff på en enkelt epitop. Lavaffinitetsantistoff som binder antigen svakt tenderer til å dissosiere lett, mens høy-affinitetsantistoff binder antigen tettere og forblir bundet lenger.

"Transformasjon" betyr introdusering av DNA i en organisme slik at DNA kan replikeres, enten som et ekstra kromosomalt element eller ved kromosomal integrasjon. Avhengig av vertscellen som blir brukt, blir transformasjonen gjort ifølge standardteknikker som er egnet for slike celler. Kalsiumbehandling som anvender

kalsiumklorid, som beskrevet av Cohen, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 69,2119 (1972) og Mandel et al., J. Mol. Biol. 53,154 (1970) er generelt brukt for prokaryoter og andre

celler som inneholder vesentlig celleveggbarrierer. For pattedyrceller uten cellevegg er kalsiumfosfatpresipiteringsmetoden fra Graham og van der Eb, Virology 52,456 (1978) foretrukket. Generelle aspekter ved mammalske cellevertssystem-transformasjoner har blitt beskrevet av Axel i US patent nr. 4,399,216 utgitt 16. august 1983. Transformasjoner i gjær blir typisk utført ifølge metoden til Van Solingen et al., J. Bact. 130,946 (1977) og Hsiao et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 76,3829 (1979). Imidlertid kan også andre metoder for å introdusere DNA i celler slik som nukleær injeksjon, elektroforering eller protoplastfusjon også bli brukt.

"Gjenvinning" eller "isolering" av et gitt fragment av DNA fra en restriksjonskutting betyr separasjon av kuttingen på polyakrylamid eller agarosegel ved elektroforese, identifisering av fragmenter av interesse ved å sammenligne dets mobilitet versus det markør-DNA-fragmentet med kjent molekylvekt har, fjerning av den delen av gelen som inneholder det ønskede fragmentet og separering av gelen fra DNA. Denne prosedyren er generelt kjent. Se for eksempel Lawn et al., Nucleic Acides Res. 9,6103 (1981) og Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8,4057 (1980).

"Ligering" refererer seg til prosessen for å danne fosfodiesterbindinger mellom to dobblt-trådede nukleinsyrerfagmenter. Hvis ikke annet er angitt kan ligeringen utføres ved å bruke kjente buffere og betingelser med 10 enheter av T4 DNA ligase, ("ligase") pr. 0,5 mg av omtrent ekvimolare mengder av DNA fragmenter som skal ligeres.

Betegnelsen "kontrollsekvenser" refererer til DNA sekvenser som er nødvendig for å uttrykke en operativ koblet kodende sekvens i en spesiell vertsorganisme. Kontrollsekvensene som er egnet for prokaryoter inkluderer for eksempel en promoter, eventuelt en operatorsekvens, et ribosombindingssete og muligens andre enda dårligere forståtte sekvenser. Eukaryote celler er kjent for å benytte promotere, pplyadenylerings-signaler og enhancere.

Nukleinsyren er "operabelt koblet" eller "operativt koblet" når den er plassert i en funksjonell stilling med en annen nukleinsyresekvens. For eksempel er DNA for en presekvens eller en sekretorisk leder operativ koblet til DNA for et polypeptid hvis den blir uttrykt som et preprotein som deltar i sekresjon av polypeptidet; en promoter eller enhancer er operativt koblet til en kodende sekvens hvis den innvirker på transkripsjonen av sekvensen; eller et ribosombindingssete er operativt koblet til en kodende sekvens hvis den blir posisjonert slik at den fremmer translasjon. Generelt betyr "operabelt koblet" eller "operativt koblet" at DNA sekvensene som er koblet er i nærheten og, i tilfelle av en sekretorisk leder, i nærheten og i leserammen. Imidlertid behøver ikke enhancerne å være i nærheten. Koblingen blir fullført ved ligering av hensiktsmessige restriksjonsseter. Hvis slike seter ikke eksisterer, da blir syntetiske oligonukleotid-adaptorer eller linkere brukt i overensstemmelse med konvensjonell praksis.

Som brukt heri, betegner "representativt nummerert" et posisjonstall av en residie i en spesiell sekvens og korresponderende posisjonsnummer i forskjellige sekvenser. Korresponderende posisjonsnummer er de posisjonene innen sekvensene, generelle humane antistoff grunnstruktursekvenser som er funksjonelt ekvivalente med de representative nummererte posisjonene som blir brukt i konstruksjonen av et humanisert antistoff.

Vanligvis refererer betegnelsene "aminosyre" og "aminosyrer" til alle naturlige forekommende L-a-aminosyrer. I noen utførelsesformer kan imidlertid aminosyrene være tilstede i polypeptidene eller peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse for å lette konfirmasjonsrestriksjon. Aminosyrene blir identifisert ved enten en enkel bokstav eller tre-bokstav-betegnelser:

Betegnelsen "aminosyresekvensvariant" refererer seg til molekyler med noen forskjeller i deres aminosyresekvenser sammenlignet med en nativ aminosyresekvens.

Substitusjonene varianter er de som har minst en aminosyreresidie i en nativ sekvens fjernet og en forskjellig aminosyre innført på dets plass i samme posisjon. Substitusjonene kan være enkle, hvor bare en aminosyre i molekylet har blitt substituert, eller de kan være multiple, hvor to eller flere aminosyrer har blitt substituert i samme molekyl.

Hybridisering blir fortrinnsvis utformet under "stringente betingelser" som betyr

(1) å anvende lav ionestyrke og høy temperatur for vasking, for eksempel, 0,015 natriumkloird/0,0015 M natriumsitrat/0,1% natriumdodesylsulfat ved 50°C, eller (2) å anvende under hybridiseringen et denatureringsmiddel, slik som formamid, for eksempel 50% (vol/vol) formamid med 0,1% bovint serum albumin/0,1% Ficoll/0,1% polyvinylpyrrolidon/50 nM natriumfosfatbuffer ved pH 6,5 med 750 mM natriumklorid, 75 mM natriumsitrat ved 42°C.

Et annet eksempel er bruk av 50°C formamid, 5 x SSC (0,75 molar NaCl, 0,075 M natriumsitrat), 50 mM natriumfosfat (pH 6/8), 0,1% natriumpyrofosfat, 5 x Denhardfs løsning, sonikerte laksespermer DNA (50 ug/ml), 0,1% SDS, og 10% dekstransulfat ved 42°C, med vasker ved 42°C i 0,2 x SSC og 0,1% SDS. Enda et annet eksempel er å bruke hybridiseirngsbuffer av 10% dekstransulfat, 2 x SSC (natriumklorid/natriumsitrat) og 50% formamid ved 55°C, etterfulgt av en høystringens vask bestående av 0,1 x SSC som inneholder EDTA ved 55°C. Når en nukleinsyresekvens av et nukleinsyremolekyl er tilveiebragt, blir andre nukleinsyremolekyler som hybridiserer dertil under betingelser beskrevet over betraktet innenfor området av sekvensen.

Hvor aminosyresekvensene blir beskrevet er det å forstå at disse sekvensene kan bli reprodusert ved konstruksjon av aminosyresekvensen syntetisk eller ved mutasjon. Alternativt, er det å forstå at rekombinante teknikker kan bli brukt slik at DNA som koder for aminosyresekvensene blir gjenvunnet. DNA blir gjenvunnet ved å danne et bibliotek fra DNA som koder for de ønskede aminosyresekvensene. Probene blir deretter dannet basert på aminosyreskevensene. DNA hybridisering til probene blir deretter isolert og analysert for å bestemme om produktet kodet for av DNA er det ønskede produktet. Generelt blir cellene transformert med DNA (eller RNA) og ekspresjonsstudier blir utført.

B. Generell metodologi for humanisering av antistoff

Metodene beskrevet heri kan bli brukt for å humanisere et hvilket som helst antistoff. På samme måte er det å forstå at humanisert antistoff som er spesifikt beskrevet heri, humanisert anti-VEGF, kan bli reprodusert ved metoder beskrevet heri eller ved tradisjonelle rekombinante DNA-teknikker. Spesifikt, siden de kritiske grunnstruktur-residiemutasjonene er beskrevet heri, kan det humaniserte antistoffet bli reprodusert og ha samme mutasjoner uten å bli reprodusert ved å bruke mono valent fagfremvisnings-system. Heller, kan DNA som koder for de beskrevne aminosyresekvensene bli syntetisert eller reprodusert ved tradisjonele rekombinante DNA-teknikker. DNA produktet kan deretter bli uttrykt, identifisert og gjenvunnet. Alternativt kan sete-dirigert mutagenese bli utført på antistoffet ved kjente metoder innen fagfeltet, eller antistoffet kan bli syntetisert for å ha mutasjonene som er beskrevet heri.

En spesielt foretrukket metode for å produsere humanisert anitstoff beskrevet heri involverer følgende: • fremstille en antistoff fagmidvektor for monovalent fremvisning av Fab-fragmenter som har CDR-sekvenser transplantert ved sete-dirigert mutagenese på en vektor som koder for en human VlkI-Cki lett kjede og human Yi HI-C ly tunge kjede Fd; • konstruere antistoff Fab fagemidbibliotek ved tilfeldig mutagenese av et lite sett av selekterte kritiske grunnstrukturresidier; • uttrykke og rense de humaniserte Fab-fragmentene;

• selektere humaniserte Fab-varianter; og

• bestemme bindingsaffinitetene.

Disse trinnene behøver ikke å bli utført i noen spesiell rekkefølge. Disse trinnene er spesifikt beskrevet under i "spesifikt eksempel" men er generelt utført som følger: Fremstilling av antistoff- fagemidvektor for monovalent fremvisning av Fab- fragmenter Et antistoff som skal humaniseres blir først selektert og de komplementarites-bestemmende regionene (CDR) identifisert. CDR-sekvensene til antistoffet kan bli identifisert i samsvar med sekvensdeifnisjonen hos Kabat et al., supra. CDR-sekvensene blir transplantert ved setedirigert mutagenese på en vektor som koder for en human VlkI-Ckilett kjede og human VH ni-CHfyitung kjede Fd. Fab-kodende sekvens kan deretter bli subklonet inn i en fagemidvektor. Denne konstruksjonen koder for et initielt humanisert antistoff hvori C-terminalen til tungkjeden blir nøyaktig satt sammen med karboksyldelen til et fagkappeprotein. Fortrinnsvis blir en fagemidvektor selektert som tilveiebringer ekspresjon av både utskilt tung kjede eller tungkjedegen IQ fusjoner i supE suppressorstammer av E. coli.

Konstruksjon av antistoff Fab fagemid bibliotek

Basert på kumulative resultater fra humanisering av et antall ikke-humane antistoff på en human VlkI-Vh HI grunnstruktur, ble det overveiet at grunnstrukturendringer som kreves for å optimalisere antigensbinding er begrenset til noen undergrupper av residier. Se Carter et al., PNAS USA 89,4285 (1992), Presta et al., J. Immunol. 151,2623

(1993); Eigenbrot et al., Proteins 18,49-62 (1994); Shalaby et al., J. Exp. Med. 175,217

(1992). Deretter ble en ny gruppe av residier utvalgt for randomisering. Randomiseringen av disse identifiserte nøkkelgninnstrukturresidiene tilveiebragte det ønskede biblioteket av Fab-varianter som skulle fremvises på overflaten av den filamentøse fagen. Spesielt har VLresidier 74 og V-residier 24,37, 67,69,71, 75,76, 78, 93, og 94 blitt utvalgt som nøkkelgruimstrukturresidier som er viktig for antigenbinding og mål for randomisering.

Ekspresjon og rensning av humaniserte Fab- fragmenter

Forskjellige metoder er kjent innen fagfeltet for å uttrykke og rense fragmenter. Som beskrevet heri, ble en E. coli stamme 34B8, en ikke-suppressor, transformert med fagemid pMB419, eller varianter derav. Enkle kolonier ble dyrket natten over ved 37°C i 5 ml 2YT som inneholder 50 ug/ml karbenicillin. Disse kulturene ble fortynnet i 200 ml AP5 medium, beskrevet i Chang et al., Gene 55,189 (1987) som inneholder 20Hg/ml karbenicillin og inkubert i 26 timer ved 30°C. Cellene ble pelletert ved 4000 x g og frosset ved -20°C i minst 2 timer. Cellepelletene ble deretter resuspendert i 5 ml 10 mM tris-HCl (pH 7,6) som inneholder 1 mM EDTA, rystet ved 4°C i 90 minutter og sentrifugert ved 10.000 x g i 15 minutter. Supernatanten ble satt på en 1 ml streptokokkprotein G-SEPHAROSE kolonne (en kolonne produsert i Pharmacia) og vasket med 10 ml 10 mM MES (pH 5,5). Det bundne Fab-fragmentet ble eluert med 2,5 ml 100 mM eddiksyre og umiddelbart nøytralisert med 0,75 ml IM TrisHCl, pH 8,0. Fab-fremstillingene ble buffer-byttet til PBS og konsentrert ved å bruke CENTRICON-30 konsentratorer (produsert av Amicon). Typiske utbytter av Fab var omtrent 1 mg/l kultur, post-protein G rensning. Renset Fab-prøver blekarakterisert vedelektrospray-massespektrometri og konsentrasjonene ble bestemt ved aminosyreanalsyer.

Seleksjon av humaniserte Fab- varianter

Renset merket antigen belegges på en mikrotiterplate. Beleggingsløsningen blir fjernet, brønnene blir blokkert og fagemid-stamløsningne blir tilsatt. Etter en periode blir brønnene vasket og bundet fage eluert og titrert. De gjenværende fagene eluert fra VEGF-belagte brønner og dyrket opp for anvendelse i neste seleksjonssyklus. Denne prosessen kan repeteres flere ganger for å erverve ønsket antall av kloner. For eksempel kan noen få dusin individuelle kloner bli selektert og sekvensert.

Bestemmelse av VEGF- bindings affiniteter

Assosisasjons- og disassosiasjonskonstanter for binding av humaniserte varianter til VEGF blir målt. Bindingsprofiler blir analysert og de varianter som viser de høyeste affiniteter blir selektert.

Administrering av humanisert anti- VEGF

Administrering av humanisert anti-VEGF kan bli ekstrapolert fra data presentert på murine anti-VEGF beskrevet i Kim et al., Growth Factors 7,53 (1992); Kim et al., Nature 362, 841 (1993). Spesielt demonstrerer Kim et al., at så lite som 10 ug to ganger ukentlig av VEGF antistoff resulterte i signifikant inhibering av tumorvekst. Maksimale effekter ble oppnådd med antistoffdoser på 50-100 \ ig.

Det følgende eksemplet har til hensikt bare å illustrere den beste metoden som man nå kjenner for å utøve oppfinnelsen, men oppfinnelsen er ikke betraktes som begrenset til detaljene i dette eksemplet.

SPESIFIKT EKSEMPEL 1

Konstruksjon av fagemidvektor og initiell humanisert anti- VEGF

Det murine anti-VEGF mAb A4.6.1 har tidligere blitt beskrevet av Kim et al., Growth Factors, 7, 53 (1992); Kim et al., Nature, 362, 841 (1993). Den første Fab-varianten til humanisert A4.6.1, hu2.0, ble konstruert ved setedirigert mutagenese ved å bruke deoksyuridin-inneholdende templat av plasmid pAK2 som koder for human Vlk-Ckilett kjede og human VhJU-ChIyitung kjede Fd fragment, Carter et al., PNAS USA 89, 4285 (1992). De transplanterte A4.6.1 CDR sekvensene ble valgt i samsvar med sekvensdeifnisjonen til Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunolo<g>ical Interest (5th), Public Health Service, National Institutes of Health, MD (1991), unntatt CDR-H1 som er utvidet til å omfatte både sekvens- og strukturdefinisjoner, dvs. Vn-residier 26-35, Chothia et al., J. Mol. Biol. 196, 901 (1987). Fab-kodende sekvenser ble subklonet inn i fagemidvektoren phGHamg3, Bass and Wells, Proteins, 8,309 (1990); Lowman et al., Biochem, 30,10832 (1991). Denne konstruksjonen, pMB4-19, koder for det initielle humaniserte A4.6.1 Fab, hu2.0, med den C-terminale enden av den tunge kjeden satt sammen eksakt på karboksyldelen av Ml3 gen HI kappeproteinet. pMB4-19 har samme oppbyggnming som pDH188, en tidligere beskrevet plasmid for monovalent fremvisning av Fab-fragmenter. Garrard et al., Biotechn. 9: 1373-1377 (1991). Betydelige forskjeller mellom pMB4-19 og pDH188 omfatter et kortere M13 gen UJ segment (kodoner 249-406) og anvendelse av et amberstoppkodon umiddelbart etterfulgt av antistoff tungkjede Fd fragment. Dette tillater ekspresjon av både utskilte tunge kjeder eller tung kjede-gen Ul fusjoner i supE suppressor stammer av E. coli.

Det initielle humaniserte A4.6.1 fragmentet (hu2.0) hvori CDR fra A4.6.1 ble podet på en humann VlkI-VhUJ grunnstruktur er vist i figur 1. VL-domenet til hu2.0 er vist i SEQ ID nr. 7 og VH domenet til hu2.0 er vist i SEQ ID nr. 10.

Alle residiene forskjellig fra podet CDR ble opprettholdt som den humane sekvensen. Bindingen av dette initielle humaniserte antistoffet til VEGF var så svak at den ikke kunne detekteres. Basert på relativ affinitet av andre svakt bindende humaniserte A4.6.1 varianter (data ikke vist) ble Kdfor binding av hu2.0 estimert til >7 uM. Dette står i kontrast til affinitet på 1,6 nM for en kimær Fab-konstruksjon som består av intakte Vlog Vh domener fra murint A4.6.1 og humane konstante domener. Således var binding av hu2.0 til VEGF minst 4.000 ganger redusert i forhold til kimæren.

Design av anti- VEGF Fab- fagemidbibliotek

Gruppen av grunnstrukturendringer som kreves for å optimalisere antigenbinding når en bruker humant VlkI-VhIII grunnstruktur ble utvalgt som vist i tabell 1 og figur 2. Humanisert A4.6.1 fagemidbibliotek ble konstruert ved setedirigert mutagenese ifølge metoden til Kunkel et al., Methods Enzymol. 204,125 (1991). Et derivat av pMB4-19 som inneholder TAA stopp tripletter ved Vh kodonet 24,37, 67 og 93 ble fremstilt for anvendelse som mutagenesetemplat (alle sekvenser var nummererte ifølge Kabat et al., supra.) Denne modifiseringen ble gjort for å forhindre etterfølgende bakgrunns- kontaminering av villtypesekvenser. Kodonene som var målet for randomiseringen var 4 og 71 (lett kjede) og 24,37, 67,69, 71,73,75,76,78, 93 og 94 (tung kjede).

Av interesse når en designer humanisert A4.6.1 fagemidbibliotek var at residiene som var målet for randomisering ble bredt fordelt utover Vlog Vh sekvensene. Begrensninger i lengden av syntetiske oligonukleotider krever at samtidig randomisering av hver av disse grunnstrukturposisjonene bare kan oppnås gjennom anvendelse av multiple oligonukleotider. Siden det totale antall av oligonukleotider øker, minsker imidlertid effektiviteten av mutagenesen (dvs. andelen av mutanter ervervet som inkorporerer en sekvens avledet fra alle de mutagene oligonukleotidene). For å omgå dette problemet ble to trekk inkorpoert i bibliotekskonstruksjonen. Det første var å fremstille fire forskjellige mutagenesetemplater som koder for hver av de mulige Vlgrunnstruktur-kombinasjoner. Dette var enkelt å utføre gitt den begrensete diversitet til lettkjede-gunnstrukturenbare fire forskjellige sekvenser), men var fordelaktig ved den eliminerte behovet for to oligonukleotider fra mutagenesestrategien. For det andre ble to 126 base oligonukleotider på forhånd satt sammen fra mindre syntetiske fragmenter. Dette gjorde det mulig å randomisere Vh kondonene 67,69,71, 73, 75, 76,93 og 94 med etenkelt langt oligonukleotid, heller enn to små. Sluttrandomiseringsmutagenese-strategien anvendte derfor bare to oligonukleotider samtidig på fire forskjellige templater.

Mer spesifikt, for å randomisere tungkjedekodonene 67,69, 71,73,75, 76,78,93 og 94 med et enkelt mutagent oligonukleotid, ble to 126-mer oligonukleotider på forhånd satt sammen fra 60 og 66-mer fragmenter ved témplatassistert enzymatisk ligering. Spesifikt ble 1,5 nmol av 5' fosforylert oligonukleotid GAT TTC CGT NYT ACT WTT

TCT AGA GAC AAC TCC AAA AAC ACA BYT TAC CTG CAG ATG AAC (SEQ ID. NO. 12) eller GAT TTC AAA CGT CGT NYT ACT WTT TCT TTA GAC ACC

TCC GCA AGC ACA BYT TAC CTG CAG ATG AAC (SEQ ID NR. 1) kombinert

med 1,5 nmol AGC CTG CGC GCT GAT GAC ACT GCC GTC TAT TAC TGT DYA ARG TAC CCC CAC TAT TAT GGG (SEQ ID. NR. 2). De randomiserte kodonene er understreket og N representerer A/G/T/C; W representerer A/T; B representerer G/T/C; D representerer G/A/T; R representerer A/G; og Y representerer C/T ("/" representerer "eller"). Deretter ble 1,5 nmol av templat oligonukleotidet CTC AGC GCG CAG GCT GTT CAT CTG CAG GTA (SEQ ID NR. 3), med komplementær sekvensen til de 5' ender av SEQ ID nr. 12 og 1 og den 3' enden av SEQ ID nr. 3 tilsatt for å hybridisere til hver ende til ligeringskoblingen. Til denne blandingen ble Taq ligase (termostabil ligase fra New England Biolabs) og buffer tilsatt, og reaksjonsblandingen ble utsatt for 40 runder med termiske sykluser (95°C i 1,25 minutter og 50°C i 5 minutter) for å syklisere templatoligonukleotiden mellom ligerte og uligerte koblinger. Produktet 126-mer oligonukleotid ble renset på en 6% urea/TBE polyakrylamid gel og ekstrahert fra polyakrylamid i buffer. De to 126-mer produktene ble kombinert i et likt forhold, etanol presipitert og tilslutt løst i 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA. Det blandede 126-mer oligonukleotid produktet ble merket 504-01.

Randomisering av selektert grunnstruktur kodoner (VL4, 71; VH 24, 37,67,69, 71,73, 75,76,93, 94) ble således effektuert i to trinn. Først ble Vl randomisering oppnådd ved å fremstille tre ytterligere derivater av modifisert pMB4-19 templat. Grunnstruktur- kodonene 4 og 71 i lett kjede ble erstattet individuelt eller parvis ved å bruke to mutageniserte oligonukleotider GCT GAT ATC CAG TTG ACC CAG TCC CCG

(SEQ ID. NR. 13) og TCT GGG ACT GAT TAC ACT CTG ACC ATC (SEQ ID. NR. 4). Deoksyuridin-inneholdende templat ble fremstilt fra hver av disse nye derivatene. Sammen med originaltemplaten kodet disse fire konstruksjonene fra hver av de fire mulige lettkjede grunnstruktursekvens-kombinasjonene (se tabell 1).

Oligonukleotidene 504-01, blandingen av to 126-mer oligonukleotider, og CGT TTG

TCC TGT GCA RYT TCT GGC TAT ACC TTC ACC AAC TAT GGT ATG AAC

TGG RTC CGT CAG GCC CCG GGT AAG (SEQ ID NR. 5) ble anvendt for å randomisere tungkjede grunnstrukturkodoner ved å bruke hver av de fire templatene som er beskrevet. De fire bibliotekene ble elektektoporert inn i E. coli XL-1 BLÅ CELLER (markørceller som produseres av Stratagene) og kombinert. Det totale antallet uavhengige transformanter ble beregnet til >1,2 x 10<8>, ca. 1,500 ganger høyere enn maksimumsantallet av DNA sekvenser i biblioteket.

Fra denne strategien ble hver av residiene 4 og 71 i lettkjeden og 24, 37,67,78 og 93 fra den tunge kjeden delvis randomisert for å tillate seleksjon av enten den murine A4.6.1, den humane VlkI-VhUI sekvensen, eller sekvenser som vanligvis finnes i andre humane og murine grunnstrukturer (tabell 1). Bemerk at randomiseringen av disse residiene ikke ble begrenset til et valg mellom human VlkI-VhUJ konsensus eller A4.6.1 grunnstruktursekvenser. Heller tillater inneslutning av ytterligere aminosyrer som vanligvis finnes i andre humane og murine grunnstruktursekvenser gjør det mulig ay ytterligere diversitet kan føre til seleksjon av tettere bindingsvarianter.

Noen av tungkjede grunnstrukturresidiene ble randomisert på en binær måte i forhold til humant VhIII og murint A4.6.1 grurmstruktur sekvenser. Residiene VH 71,73, 75 og 76 er posisjonert i en hårnålsløkke ved siden anantigenbindingssetet. Sidekjedene til Vh 71 og 73 er for det meste begravet i kanoniske antistoffstrukturer og deres potensielle rolle for konformasjonen til CDR-H2 og CDR-H3 er vel kjent. Kettleborough et al., Protein Eng. 4, 773 (1991): Carter et al., PNAS USA 89,4285 (1992); Shalaby et al., J. Exp. Med. 175,217 (1992). På den annen side, selv om sidekjedene til VH 75 og 76 er løsningsmiddeleksponert (figur 2) har det allikevel blitt observert at disse to residiene også kan påvirke antigenbinding (Eigenbrot, Protein, 18,49, (1994), antagelig på grunn av den direkte antigenkontakt i noen antistoff-antigenkomplekser. På grunn av deres nærhet i sekvens og mulige gjensidig avhengighet ble VH, 71, 73, 75 og 76 randomisert sammen slik at bare to mulige kombinasjoner av dennee tetrade kunne bli selektert; enten alle human VhTH eller alle murin A4.6.1 sekvensene. Til slutt ble Vh residiene 69 og 94 randomisert, men bare for å representere VhIII og A4.6.1 sekvensene. Vh 69 og 94 ble ikke erstattet i tidligere antistoff humaniseringer, men fordi de er forskjellig mellom VhHI konsensus og A4.6.1 sekvenser (figur 1) og har blitt notert som potensielt viktige for en riktig CDR konformasjon (Foote et al., J. Mol. Biol. 224,487 (1992), ble de inkludert i denne randomiseringsstrategien.

Humanisert A4. 6. 1 Fab- bibliotek fremvist på overflaten av en fagemid

Mange systemer har blitt utviklet for funksjonell fremvisning av antistoff-fragmenter på overflaten av filamentøse fag, Winter et al., Ann. Rev. Immunol. 12,433 (1994). Disse inkluderer fremvisning av Fab eller enkeltkjedete Fv (scFv) fragmenter som fusjoner til enten gen EI eller gen VIH kappeproteiner hos Ml3 bakteriofag. Systemet valgt heri er lik det som er beskrevet ved Garrard et al., Biotechn. 9,1373 (1991) hvori et Fab-fragment er monovalent fremvist som et gen HJ fusjon (figur 3). Dette systemet har to spesielle trekk. Spesielt, til forskjell fra scFvs har Fab-fragmentene ingen tendens til å danne dimere arter hvis forekomst kan forhindre seleksjon av de som bindes tettest på grunn av aviditetseffekter. I tillegg eliminerer monovalensitet til det fremviste proteinet en annen potensiell kilde for aviditetseffekter som på annen måte ville være resultatet av tilstedeværelse av mange kopier av et protein på hver fagemidpartikkel, Bass and Wells, Proteins 8, 309 (1990); Lowman et al., Biochemistry 30, 10832 (1991).

Fagemidpartiklene som fremvises på de huminserte A4.6.1 Fab-fragmenter ble dyrket i E. coli XL-1 Blå celler. I korthet fikk cellene som innehar randomisert pMB4-19 konstruksjon vokse natten over ved 37°C i 25 ml 2YT medium som inneholdt 50 ug/ml karbenicillin og omtrent 10<10>M13K07 hjelperfage (Viera og Messing, Methods Enzymol. 153, 3 (1987). Fagemidstamløsningene ble renset fra kultursupernatantene ved presipitering med saltvannspolyetylenglykolløsning og resuspendert i 100 ul PBS (ca. 10<14>fagemid/ml).

Seleksjon av humanisert A4. 6. 1 Fab- varianter

Renset VEGF (100 ml ved 10 ug/ml i PBS) ble belagt på en mikrotiterplatebrønn natten over ved 4°C. Belegningsløsningen ble slått av og denne og en ubelagt brønn ble blokkert med 6% skummet melk i en time og vasket med PBS som inneholdt 0,05% TWEEN-20 (detergent). Deretter ble 10 ul av fagemidstamløsning fortynnet til 100 ul med 20 mM Tris (pH 7,5) som inneholdt 0,1% BSA og 0,05% TWEEN-20, tilsatt til hver brønn. Etter to timer ble brønnene vasket og bundet fag eluert med 100 ul 0,1 M glysin (pH 2,0) og nøytralisert med 25 fil IM Tris pH 8,0. En alikvot av dette ble brukt for å titrere antallet av fag som ble eluert. De gjenværende fagene som var eluert fra VEGF-belagte brønner ble dyrket for anvendelse i neste seleksjonssyklus. Totalt 8 seleksjonsrunder ble utført,hvorpå 20 individuelle kloner ble selektert og sekvensert (Sanger et al., PNAS USA 74, 5463 (1997)).

Varianter fra det humaniserte A4.6.1 Fab-fagemidbiblioteket ble deretter selektert basert på binding til VEGF. Anrikning av funksjonelle fagemid, målt ved å sammenligne titrene fra fag eluert fra en VEGF-belagt versus ubelagt mikrotiterplatebrønn, økte opp til den syvende runden med "affinity panning". Etter en ytterligere runde med sortering, ble 20 kloner sekvensert for å identifisere foretrukkete gninnstrukturresidier selektert ved hver randomisert posisjon. Disse resultatene som er summert i tabell 2, ga sterk konsensus blant de klonene som ble selektert. Ti av tyve kloner hadde identisk DNA sekvens, betegnet hu2.10. Av de 13 gnmnstrukturposisjonene som ble randomisert ble 8 substitusjoner selektert i hu2.10 (VL71; VH 37,71,73, 75, 76, 78 og 94). Interessant nok ble residiene VH 37 (Ile) og 78 (Val) hverken selektert som human VhUI eller murin A4.6.1 sekvens. Dette resultatet indikerer at noen grunnstrukturposisjoner kan dra nytte av å utvide diversiteten utover de målsøkte humane og opprinnelige murine grunnstruktursekvenser.

Forskjeller mellom hu2.0 og murint A4.6.1 antistoff er understreket. Antallet identiske kloner identifisert for hver fageselektert sekvens er indikert i parenteser. Strekene i sekvensene til fagselekterte kloner indikerer seleksjon av human VlkI-VhHI grunnstruktursekvens (dvs. som i hu2.0).

Det var fire andre unike aminosyresekvenser blant de gjenværende ti klonene som ble analysert: hu2.1, hu2.2, hu2.6 og hu2.7. Alle disse klonene i tillegg til hu2.10 inneholdt identiske grunnstruktursubstitusjoner ved posisjonene Vh37 (Ile), 78 (Val) og 94 (Lys), men bibeholdt human VhUI konsensus sekvens i posisjonene 24 og 94. Fire kloner hadde mistet den lettkjedekodende sekvens og bandt ikke VEGF når de ble testet i fag ELISA analyse (Cunningham et al., EMBO J, 13,2508 (1994)). Vi har av og til bemerket tap av tung- eller lettkjedesekvens med andre Fab-fagemidbiblioteker (upubliserte data) og disse klonene er antagelig selektert på basis av økt ekspresjon. Slike artifakter kan ofte bli minimalisert ved å redusere antall av sorteringssykluser eller ved å dyrke bibliotekene på fast medium.

Bestemmelse av VEGF- bindingsaffiniteter

Assosiasjons- (Kon) og dissosiasjons- (Koff) konstanter for binding av humanisert A4.6.1 Fab-varianter til VEGF121ble målt ved overflateplasmonresonnans (Karlsson et al., J. Immun. Methods 145,229 (1991)) på et Pharmacia BIAcore instrument. VEGF121var kovalent immobilisert på biosensor chip via primære aminogrupper. Binding av humanisert A4.6.1 varianter ble målt ved strømningsløsninger av Fab i PBS/0,05% TWEEN-20 (detergent) over chipen med en strørnningsrate på 20 ul/min. Ved å følge hver bindingsmåling ble gjenværende Fab fjernet fra den immobiliserte liganden med vasking med 5 ul 50 mM vandig HC1 ved 3 ul/min. Bindingsprofiler ble analysert av ikke-lineær regresjon ved å bruke en enkel monovalent bindingsmodell (BIA evalueringssoftware v2.0; Pharmacia).

Fag-selekterte varianter hu2.1, hu2.2 hu2.6, hu2.7 og hu2.10 ble uttrykt i E. coli ved å bruke risteflasker og Fab-fragmenter ble renset fra periplasmiske ekstrakter med protein G affinitetskromatografi. Gjenvunnet utbytte av Fab fra disse fem klonene varierte fra 0,2 (hu2.6) til 1,7 mg/l (hu2.1). Affiniteten til hver av disse variantene av antigen (VEGF) målt ved overflateplasmonresonnans på et BIAcore instrument vises i tabell 3. Analyse av disse bindingsdataene viste at konsensuklon hu2.10 utviste den høyeste affiniteten for VEGF av de fem varianter som ble testet. Således ble vårt Fab-fagemid bibliotek selektivt anriket for den tetteste bindende klonen. Beregnet Kdfor hu2.10 var 55 nM, minst 125 ganger sterkere enn for hu2.0 som ikke inneholdt grunnstrukturendringer (Kd> 7 uM). De andre fire selekterte variantene utviste alle svakere binding til VEGF som varierte ned til en KDpå 360 nM for den svakeste (hu2.7). Det som var interessant var at KDfor hu2.6,67 nM bare var svakere enn den for hu2.10 og kun en kopi av denne klonen ble funnet blant de tyve klonene som ble sekvensert. Dette kan skyldes et lavere nivå av ekspresjon og fremvisning, som var tilfelle når en uttrykte løselig Fab av denne varianten. Til tross for lavere ekspresjonsrate er denne varianten imidlertid nyttig som et humanisert antistoff.

Ytterligere forbedring av humanisert variant hu2. 10

Til tross for stor forbedring i antigenaffinitet av den intielle humaniserte varianten var bindingen av hu2.10 til VEGF fortsatt 35-ganger svakere enn et kimært Fab-fragment som inneholdt de murine A4.6.1 Vlog Vh domener. Denne betydelige forskjellen indikerer at ytterligere optimalisering av den humaniserte grunnstruktur kan være mulig gjennom ytterligere mutasjoner. Av fininnstillingsresidier identifisert av Foote et al., J. Mol. Biol. 196,901 (1992) var bare residiene VL46, VH2 og VH48 forskjellig i A4.6.1 versus human VikI-VhHI grunnstruktur (figur 1), men ble ikke randomisert i vårt fagebibliotek. En molekylær modell av humanisert A4.6.1 Fv fragment viste at Vl46 sitter ved Vl-Vh interfasen og kunne påvirke konfirmasjonen av CDRH3. Videre er denne aminosyren nesten alltid leucin i de fleste Vlkgrunnstrukturer (Kabat et al., supra), men den er valin i A4.6.1. Følgelig ble en Leu -» Val substitusjon gjennomført i denne posisjonen i en bakgrunn av hu2.10. Analyse av bindingskinetikken for denne nye varianten, hu2.10V indikerte en ytterligere seks gangers forbedring i Kdfor VEGF-binding. Kdfor hu2.10V (9.3 nM) var således innenfor 6 ganger den til den kimære. I motsetning til Vl46 ble ingen forbedring i bindingsafflniteten til hu2.10 observert ved erstatning av Vh 2 eller Vu 48 med korresponderende residier fra murin A4.6.1.

En del av forbedringen forut for siste endring i affinitet skyldtes en økning i assosiasjonskonstanten (Kon), som indikerer at Vl46 kan spille en rolle i preorganisseringen av antistoffstrukturen til en konformasjon som er mer egnet for antigenbinding. Andre mutasjoner som innvirker på antigenaffinitet skyldes primært endringer i dissosiasjonskonstanten (Koff) for binding. Sammenligning av hu2.1 og hu2.10 avslører en 5 gangers forbedring i affinitet for substitusjon av Vh residiene 71, 73, 75 med A4.6.1 sekvensen. Endring av VL-71 til A4.6.1 sekvens (Phe -> Tyr) hadde så og si ingen effekt på binding (hu2.2 vs. hu2.7), mens varianter med leucin ved VLbandt marginalt dårligere (<2 ganger) enn de med metionin, den naturlige forekommende residiene i både A4.6.1 og den humane VklI grunnstrukturen (hu2,2 vs. hu2.1). Sammenligning med andre humaniserte A4.6.1 varianter ikke vist her avslørte at VH94 Arg - > Lys endring resulterte i en 5 gangers forbedring i Kd, enten på grunn av direkte antigenkontakt med denne residien eller på grunn av en strukturell rolle i å opprettholde en riktig konformasjon av CDR-H3. Variant hu2.6 har tre sekvens-forskjeller i forhold til konsensusklonen hu2.10, men har ikke desto mindre en lik KD, dette indikerer at disse substitusjonene har liten effekt på antigenbinding. En neglisjerbar effekt på konservative endringer i Vl4 og 71 stemmer overens med bindingsdata for andre varianter, skjønt endringen i Vh 67 (Phe -> Thr) hadde liten effekt på binding..

Claims (29)

1. Humanisert anti-vaskulær endothelial vekstfaktor-antistoff, karakteri sert ved at de komplementaritetsbestemmende regioner (CDR) til et ikke-humant antistoff blir podet på en human grunnstruktur som omfatter Vlkundergruppe I (VlkI) gnmnstrukturen ifølge SEQ ID NO: 7 og VH undergruppen m (VHni) grunnstrukturen ifølge SEQ DD NO: 10, der minst en av de representativt nummererte residiene 4 og 71 i VL-domenet er substituert med en forskjellig aminosyre, og minst tre av de representativt nummererte residiene 37,67,69,71,73,75, 76, 78 og 94 i VH-domenet er substituert med en forskjellig aminosyre, og der residiet 46 i VL-domenet eventuelt er substituert med aminosyren valin, og der residienummereringen er ifølge Kabat-nummereringen som vist i figuren 1.

2. Humanisert antistoff ifølge krav l,karakterisert vedat det har minst en av de følgende substitusjoner: ved Vl4 leucin og Vl71 tyrosin; og minst tre av de følgende substitusjoner: ved Vh37 isoleucin; ved Vh67 treonin; ved VH69 fenylalanin; ved VH75 alinin; ved VH76 serin; ved VH78 valin; og ved VH94 lysin.

3. Humanisert antistoff ifølge krav l eller 2,karakterisertv e d at residiene 37, 78 og 94 i Vn-domenet er substituert med henholdsvis aminosyrene isoleucin, valin og lysin.

4. Humanisert antistoff ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat residiene 71, 73,75 og 76 i Vn-domenet er substituert med henholdsvis aminosyrene leucin, treonin, alanin og serin.

5. Humanisert antistoff ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat residiet 46 i VL-domenet er substituert med aminosyren valin.

6. Humanisert antistoff ifølge ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4,karakterisert vedat VL-domenet har sekvensen vist i SEQ ID NO: 8 og Vn-domenet har sekvensen vist i SEQ ID NO: 11.

7. Humanisert antistoff iføgle et hvilket som helst av kravene 1 -5,karakterisert vedat VL-domenet har sekvensen vist i SEQ ID NO: 8 der residiet 46 leucin er subsitutert med valin og Vn-domenet har sekvensen vist i SEQ ID NO: 11.

8. Humanisert antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4,karakterisert vedat VL-domenet har sekvensen vist i SEQ ID NO: 8 der residiet 4 metionin og 71 tyrosin er substituert med henholdsvis leucin og fenylalanin; og Vn-domenet har sekvensen vist i SEQ ID NO: 11, der residiet 67 fenylalanin er substituert med treonin.

9. Humanisert antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4,karakterisert vedat VL-domenet har sekvensen vist i SEQ ID NO: 7, der residiet 71 fenylalanin er substituert med tyrosin; og Vn-domenet har sekvensen vist i SEQ ID NO: 10, der residiene 37 valin; 78 leucin og 94 argjnin er substituert med henholdsvis isoleucin, valin og lysin.

10. Humanisert antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4,karakterisert vedat VL-domenet har sekvensen vist i SEQ ID NO: 7 der residiene 4 metionin og 71 fenylalanin er substituert men henholdsvis leucin og tyrosin; ov VH-domenet har sekvensen vist i SEQ ID NO: 10, der residiene 37 valin, 78 leucin og 94 arginin er substituert med henholdsvis isoleucin, valin og lysin.

11. Humanisert antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4,karakterisert vedat VL-domenet har sekvensen vist i SEQ ID NO: 7, der residiet 4 metionin er substituert med leucin; og Vn-domenet har sekvensen vist i SEQ ID NO: 10, der residiene 37 valin; 67 fenylalanin; 78 leucin og 94 arginin er resubstituert med henholdsvis isoleucin, treonin, valin og lysin.

12. Fremgangsmåte for å humanisere et ikke-humant anti-vaskulært endotelial vekstfaktoranitstoff,karakterisert vedat det omfatter trinnene : transplantere komplementaritetsbestemmende regioner (CDR) fra et ikke-humant antistoff til en human grunnstruktur som omfatter VLK-subgruppen I (Vlk-I) og Vn-undergruppen HJ (VhID); substituere minst en av residiene 4 og 71 i VL-domenet med en forskjellig aminosyre og subsitutere minst 3 av residiene 37, 67,69,71, 73,75, 76,78 og 94 i Vn-domenet med en forskjellig aminosyre, der residienummereringen er iføgle Kabat-nummereringen vist i flgure 1.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12,karakterisert vedat den humane grunnstrukturen omfatter, forut for substitusjon grunnstrukturen ifølge VlK-undergruppe I (VlkI) ifølge SEQ ID NO: 7 og Vn-undergruppen m (VHni) ifølge SEQ ID NO: 10.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 12 eller 13,karakterisert vedat det omfatter minst en av de følgende substitusjoner: ved Vl4 leucin og VL71 tyrosin; og minst tre av de følgende substitusjoner: ved VH37 isoleucin; ved VH67 treonin; ved Vn69 fenylalanin; ved VH75 alanin; ved VH76 serin; ved VH78 valin; og ved VH94 lysin.

15. Fremgangsmåte ifølgeet hvilket som helst av kravene 12 -14,karakterisert vedat residiene 37,78 og 94 i Vn-domenet er substituert med henholdsvis aminosyrene isoleucin, valin og lysin.

16. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 12-15,karakterisertve d at residiene 71, 73, 75 og 76 er substituert med henholdsvis aminosyrene leucin, treonin, alanin og serin.

17. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 12-16,karakterisertve d at residiet 46 i VL-domenet er substituert med aminnosyren valin.

18. Fremgangsmåte ifølge ifølge et hvilket som helst av kravene 12-16,karakterisert vedat VL-domenet har sekvensen vist i SEQ ID NO: 8 og Vn-domenet har sekvensen vist i SEQ DD NO: 11.

19. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 12-17,karakterisert vedat VL-domenet har sekvensen vist i SEQ DD NO: 8 der residiet 46 leucin er subsitutert med valin og Vn-domenet har sekvensen vist i SEQ ID NO: 11.

20. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 12-16,karakterisert vedat VL-domenet har sekvensen vist i SEQ DD NO: 8, der residiet 4 metionin og 71 tyrosin er substituert med henholdsvis leucin og fenylalanin; og VH-domenet har sekvensen vist i SEQ ID NO: 11, der residiet 67 fenylalanin er substituert med treonin.

21. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 12-15,karakterisert vedat VL-domenet har sekvensen vist i SEQ TD NO: 7, der residiet 71 fenylalanin er substituert med tyrosin; og Vn-domenet har sekvensen vist i SEQ ID NO: 10, der residiene 37 valin; 78 leucin og 94 arginin er substituert med henholdsvis isoleucin, valin og lysin.

22. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 12-15,karakterisert vedat VL-domenet har sekvensen vist i SEQ ID NO: 7, der residiene 4 metionin og 71 fenylalanin er substituert men henholdsvis leucin og tyrosin; og Vn-domenet har sekvensen vist i SEQ ID NO: 10, der residiene 37 valin, 78 leucin og 94 arginin er substituert med henholdsvis isoleucin, valin og lysin.

23. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav 12 - 15,karakterisert vedat VL-domenet har sekvensen vist i SEQ ID NO: 7, der residiet 4 metionin er substituert med leucin; og Vn-domenet har sekvensen vist i SEQ ID NO: 10, der residiene 37 valin; 67 fenylalanin; 78 leucin og 94 arginin er resubstituert med henholdsvis isoleucin, treonin, valin og lysin.

24. Fremgangsmåte ifølge kravene 12-17,karakterisertv e d at den ytterligere omfatter trinnene: fremvisning av Vl og Vn-domener med subsitutsjoner på et fagemid; bestemme om VEGF vil binde til VL- og VH-domenene ved substitusjoner; selektere humaniserte antistoff som vil binde til VEGF.

25. Humanisert antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1-11,karakterisert vedat det er et antistoff-fragment.

26. Antistoffragment ifølge krav 25,karakterisert vedat det er et Fab, Fab, F(ab')2eller Fv-fragment.

27. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 12-24,karakterisert vedat det humane antistoffet er et antistoff-fragment.

28. Fremgangsmåte ifølge krav 27,karakterisert vedat fragmenet er et Fab, Fab', F(ab')2eller Fv-fragment.

29.. Anvendelse av det humaniserte antistoffet ifølge et hvilket som helst av kravene 1-11, 25,26 og 29 for fremstilling av et medikament for behandling av tumorvekst.