NO333932B1 - Sirkulært DNA-molekyl med betinget replikasjonsorigo samt fremgangsmåte for dets fremstilling. - Google Patents

Abstract

En prokaryot rekombinant vertscelle omfattende et heterologt replikasjonsinitieringsprotein som aktiverer et kondisjonalt replikasjonsorigo og et ekstrakromosomalt DNA-molekyl omfattende et heterologt terapeutisk gen og et kondisjonelt replikasjonsorigo der funksjonaliteten i den prokaryote rekombinant vertscelle krever et replikasjonsinitieringsprotein som er fremmed for vertscellen beskrives. Vertscellen kan omfatte et pir-gen med minst en mutasjon, som kan opptre i pir-genkopikontrollområdet, pir-genets gli-delåsliknende leucin motiv eller pir-genets DNA-bindende region.

Description

Foreliggende oppfinnelse gjelder et nytt DNA-molekyl med betinget replikasjon til anvendelse innen genterapi eller til produksjon av rekombinante proteiner. De nye DNA-molekylene i henhold til foreliggende oppfinnelse betegnes heretter "pCOR™".

Genterapi går ut på å avhjelpe en mangel eller korrigere en anomali ved å innføre genetisk informasjon i den berørte cellen eller det berørte organet. Denne informasjonen kan innføres enten in vitro, slik at informasjonen innføres i en celle som er tatt ut av organet og deretter igjen injiseres i organismen, eller in vivo, der den innføres direkte i de berørte vevene. I forbindelse med et molekyl med høy molekylvekt og negativ ladning er det vanskelig for DNA-molekylet spontant å trenge gjennom de fosforlipide cellemembranene. Det benyttes i denne forbindelse forskjellige former for vektorer for å muliggjøre genoverføringen: Virale vektorer på den ene side, samt på den annen side kjemiske og/eller biokjemiske, naturlige eller syntetiske vektorer.

De virale vektorene (retrovira, adenovira, adenoassosierte virus osv.) er meget effektive særlig med henblikk på gjennomtrengning av membranen, men de er forbundet med en rekke risikoer som for eksempel patogenesitet, rekombinasjon, replikasjon, immunogenesitet osv.

De kjemiske og/eller biokjemiske vektorene gjør det mulig å unngå disse risikoer (for nærmere omtale se Behr, 1993, Cotten og Wagner, 1993). Disse kan f.eks. være kationer (kalsiumfosfat, DEAE-dekstran osv.), som virker ved å danne presipitater med DNA-molekylet, som kan "fagocyteres" i cellene. Eller de kan være liposomer som DNA-molekylet føres inn i. Deretter fusjonerer DNA-molekylet med plasmamembranen. De syntetiske vektorene til overføring av gener vil normalt være lipider eller kationiske polymerer, som danner komplekser med DNA molekylet og sammen med dette danner en partikkel med positive ladninger på overflaten. Som eksempel på denne type vektor kan nevnes dioctadecylamidoglycylspermin (DOGS, Transfectam™) eller N-[l-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimetylammonium (DOTMA, Lipofectin™).

Bruk av kjemiske og/eller biokjemiske vektorer eller av nakent DNA innebærer imidlertid muligheten for å fremstille store mengder av farmakologisk rent DNA. Selve medikamentet som brukes innen genterapi er rent DNA, og det er derfor av avgjørende betydning at dette kan fremstilles i nødvendig omfang og med de egenskapene som gjør det anvendelig i den genterapeutiske behandlingen av mennesker.

Når det gjelder ikke-virale vektorer, dreier det seg her om plasmider med bakteriologisk opprinnelse. De plasmider som normalt anvendes innen genterapi, har (i) et replikasjonsorigo, (ii) et markørgen som f.eks. et gen som er resistent overfor antibiotika (kanamycin, ampicillin osv.) og (iii) en eller flere transgener med sekvensene som trengs for ekspresjon (enhancere, promotere, polyadenylasjonssekvenser osv.). Den teknologien som foreløpig er tilgjengelig, er imidlertid ikke fullt ut tilfredsstillende.

WO 9710343 beskriver en E.coli vertscelle, XAC-1 pir-166 som omfatter er pir gen som inneholder en 116 mutasjon og er transformert med vektoren PXL2774. Nevnte vektor inneholder en ori R6K-cer-tRNA amber mutasjon, phe suppressor tRNA og en ekspresjonskassett for luciferase. Vertscellen mangler genet endA.

Soubier F et al. pCOR: a new design of plasmid vectors for nonviral gene therapy. Gene therapy, 1999, Vol.6, side 1482-1488 og Carriere M. et al. Optmization of plasminds for gene delivery. S.T.P. Pharma Science. 2001, Vol.l 1, No. 1, side 1-6, beskriver også E.coli versceller som inneholder et pir gen med pir 116 mutasjon.

På den ene side er det stadig risiko for spredning i organismen. Det er altså en svak risiko for at en bakterie i organismen vil være mottakelig overfor dette plasmidet. Det er større risiko for at dette skjer ved genterapeutisk behandling in vivo, der DNA-molekylet kan bli spredt i pasientens organisme og dermed komme i kontakt med bakterier som infiserer pasienten, eller med bakterier fra den kommensale flora. Hvis den bakterien som mottar plasmidet, er en enterobakterie, som f.eks. E. coli, kan dette plasmidet replikere. Hvis dette skjer, skjer det dermed en spredning av det terapeutiske genet. I den utstrekning de terapeutiske genene som brukes i genterapeutiske behandlinger, er i stand til f.eks. å kode for en lymfokine, en vekstfaktor, et anti-onkogen eller et protein i tilfeller der funksjonen mangler i vertsorganismen, og det dermed gis mulighet for korrigering av en genetisk mangel, kan spredningen av visse av disse genene ha uforutsigelige og urovekkende virkninger (f.eks. hvis en patogen bakterie mottar genet fra en human vekstfaktor).

På den annen side inneholder de plasmider som normalt anvendes innen den ikke-virale genterapien, også en markør som er resistent overfor antibiotika (ampicillin, kanamycin osv.). Den bakterien som mottar et slikt plasmid, har dermed uten tvil en seleksjonsmessig fordel, da enhver antibiotisk behandling, der det anvendes et antibiotikum av samme familie som den som velger plasmidets resistensgen, vil resultere i seleksjon av det aktuelle plasmidet. I denne forbindelse er ampicillin en del av alfa-laktamene, som tilhører den familien av antibiotika som er mest benyttet på verdensplan. Bruk av seleksjonsmarkører hos bakteriene som ikke er antibiotika-resistente gener, ville altså være særlig fordelaktig. På denne måten ville man kunne unngå seleksjon av bakterier som kan oppta plasmider som bærer en slik markør.

Det er altså spesielt viktig i størst mulig grad å forsøke å begrense spredningen av terapeutiske gener og resistensgener.

Foreliggende oppfinnelse omfatter 1 en prokaryot rekombinant vertscelle, kjennetegnet ved at den omfatter et heterologt pir gen som koder for et pi protein og et ekstrakromosomalt DNA molekyl som omfatter et heterologt terapeutisk gen og et betinget replikasjonsorigo hvis funksjonalitet i den prokaryote rekombinante vertscellen forutsetter pi proteinet, hvori det heterologe pir genet omfatter minst en mutasjon i tillegg til pir 116 mutasjonen, nevnte ytterligere mutasjon blir valgt fra gruppen bestående av residue 130 fra pi proteinet som er en valin, residue 292 fra pi proteinet som er en metionin eller residue 117 fra pi proteinet som er en glycin.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å produsere et plasmid, kjennetegnet ved at den omfatter et heterologt terapeutisk gen og et betinget replikasjonsorigo, som for å kunne fungere i en prokaryot vertscelle forutsetter et replikasjonsinitierende protein fremmed for vertscellen som omfatter: a) å dyrke den prokaryote rekombinante vertscellen i følge et hvilket som helst av de foregående krav under betingelser der plasmidet produseres, og

b) å isolere plasmidet.

Foreliggende oppfinnelse har spesielt som formål å utvikle nye DNA-molekyler

som kan anvendes innen genterapi eller til fremstilling av rekombinante proteiner in vitro og som kun replikerer i de celler som har mulighet til å utfylle visse av disse ikke-virale vektorenes funksjoner.

Oppfinnelsen inneholder også en meget effektiv metode til fremstilling av disse DNA-molekylene.

Disse DNA-molekylene innebærer den fordelen at de risikoer som er forbundet med spredningen av plasmidet, elimineres, som f.eks. (1) replikasjonen og spredningen som kan medføre en ukontrollert overekspresjon av det terapeutiske genet, (2) resistensgenenes spredning og ekspresjon. Den genetiske informasjonen som er inneholdt i oppfinnelsens DNA-molekyler, omfatter faktisk de(t) terapeutiske gen(er) og signalene for regulering av ekspresjon, et funksjonelt, betinget replikasjonsorigo som i stort omfang begrenser spektret for dette plasmidets vertsceller, en seleksjonsmarkør av begrenset størrelse som helst atskiller seg fra et antibiotika-resistent gen, og der dette er hensiktsmessig, et DNA-fragment som muliggjør oppløsning av plasmid-multimerer. Sannsynligheten for at disse molekylene (og dermed den genetiske informasjonen de inneholder) overføres til en mikroorganisme og fastholdes der, er meget begrenset.

Ifølge oppfinnelsen har vektorene, som også kalles miniplasmider på grunn av deres sirkulære struktur, begrensede størrelse og supertvunnede form, også følgende fordeler: Som følge av deres begrensede størrelse sammenlignet med plasmider avledet av ColEl, som normalt er blitt benyttet, har DNA-molekylene ifølge oppfinnelsen potensielt sett en bedre biotilgjengelighet in vivo, og DNA-molekylene eller pCOR står i en stabil ekstrakromosomal form i de prokaryotiske eller eukaryotiske vertscellene som ikke inneholder det utløsende proteinet. Spesielt er evnen til inntrenging og spredning av cellene blitt forbedret. Det er anerkjent at spredningskoeffisienten i vevet er omvendt proporsjonal med molekylvekten (Jain, 1987). På cellenivå er det på samme måte vanskeligere for de molekylene som har en høy molekylvekt, å trenge gjennom plasmamembranen. I tillegg er den høye molekylvekten heller ingen fordel når plasmidet skal trenge inn i kjernen, noe som er en forutsetning for ekspresjon, da de nukleære porene kun tillater en bestemt størrelse ved spredning mot kjernen (Landford et al., 1986). Reduksjonen av størrelsen av de ikke-terapeutiske delene av DNA-molekylet (herunder særlig replikasjonsorigo og seleksjonsgen) ifølge oppfinnelsen gjør det dessuten mulig å forminske DNA-molekylenes størrelse. Den delen som gjør replikasjonen og seleksjonen av dette plasmidet hos bakterien (1 kb) mulig, er forminsket med faktor 3, der replikasjonsorigo og resistensmarkør for vektordelens vedkommende var 3 kb. Denne reduksjonen (i) av molekylvekten og (ii) av negativ ladning gir oppfinnelsens molekyler bedre muligheter for spredning og biotilgjengelighet når det gjelder vev, celler og kjerner.

Foreliggende oppfinnelse gjelder mer presist et DNA-molekyl i sirkulær form, som kan brukes innen genterapi og som minst inneholder én relevant nukleinsyresekvens; denne sekvensen erkarakterisert vedat området som gjør replikasjonen mulig, inneholder et replikasjonsorigo der funksjonaliteten i en prokaryotisk vertscelle er betinget av nærværet av minst ett spesifikt protein som er fremmed for nevnte vertscelle.

Dette DNA-molekylet kan være enkelt- eller dobbeltstrenget, og det er en fordel hvis det er fullt ut supertvunnet.

Vertscellene som aktiveres, være av forskjellig opprinnelse. Dette kan være eukaryotiske eller prokaryotiske celler. I henhold til den utformingen som er blitt valgt i denne oppfinnelsen, dreier det seg her om prokaryotiske celler.

I forbindelse med replikasjon av bakerieplasmider har det hittil vært vanlig å inndra minst ett protein som var kodet av vertscellen av typen RNA polymerase, Rnase, DNA-polymerase osv. Av årsaker som allerede er angitt, kan man ved anvendelse av denne replikasjonsmetoden ikke helt utelukke eventuelle risikoer for spredning i den behandlede organismen. Med fordel er funksjonaliteten ifølge oppfinnelsen betinget av at det finnes et spesielt protein som ikke er tilknyttet vertscellen. Denne egenskapen bevirker at spektrum for plasmidets vertscelle begrenses til særskilte stammer som uttrykker dette utløsende proteinet. DNA-molekylet i denne oppfinnelsen inneholder altså med fordel et såkalt betinget replikasjonsorigo.

Det betingede replikasjonsorigoet som benyttes i denne oppfinnelsen, kan stamme fra plasmider eller bakteriofager, som har følgende egenskaper: De inneholder repetisjonssekvenser eller iteroner i sitt replikasjonsorigo, og er kodet for minst ett replikasjonsutløsende protein (Rep), som er spesifikt for dem. Som eksempel kan nevnes følgende replikasjonssystemer betinget av plasmider og bakteriofager:

I henhold til en utforming som er blitt valgt i oppfinnelsen, stammer det replikasjonsorigoet som aktiveres i de aktuelle DNA-molekylene, fra et naturlig E. co//'-plasmid, kalt R6K.

R6K-plasmidets replikasjonsfunksjoner er gruppert i et DNA-fragment på 5,5 kbp (Figur 1), som inneholder 3 replikasjonsorigoer alfa, beta og gamma (gamma og alfa sikrer 90 % av replikasjonen) og et operon kodet for de pi-proteiner som utløser replikasjonen og proteinet Bis. Den minimale mengden av genetisk informasjon som trengs for at dette plasmidet kan replikere det karakteristiske antallet ganger (15 kopier per genom), er inneholdt i to elementer: 400 bp Ori y og genet pir, som gir som produkt det utløsende pi-proteinet.

Ori y kan deles i 2 funksjonelle deler: Det sentrale området og det aktiverende elementet (Figur 1). Det sentrale området som er av avgjørende betydning for replikasjonen, inneholder iteronene (7 direkte repetisjoner å 22 bp), som får tilknyttet det pi-proteinet som er gjengitt i SEKVENS NR. 1, og flankerende segmenter som er mål for vertsproteinene (IHF, DnaA).

I henhold til oppfinnelsens foretrukne utforming består vektorens replikasjonsorigo helt eller delvis av R6K-plasmidets y-replikasjonsorigo og fortrinnsvis helt eller delvis av SEKVENS NR. 1 eller et av dennes derivater.

Replikasjonsorigoet som er beskrevet ovenfor, som har fordelen av å være av svært begrenset størrelse, er utelukkende funksjonelt i nærvær av et særskilt utløsende protein, pi-proteinet, produsert av^/'r-genet (SEKVENS NR. 2). Da dette proteinet kan reagere i trans, er det mulig å skille ori y fra pir- genet, som kan føres inn i genomet i den cellen som velges som spesifikk vert for disse plasmidene. Mutasjoner i "pi" risikerer å endre proteinets inhibitoriske funksjoner (Inuzuka og Wada, 1985) og føre til økning av antallet kopier av R6K-derivater, opptil 10 ganger det opprinnelig antallet kopier. Disse substitusjonene kan ligge innenfor et område på 40 aminosyrer, som dermed viser seg å være ansvarlige for pi's kontroll av antallet plasmide kopier (Figur 2), eller i andre områder av pi-proteinet.

På bakgrunn av oppfinnelsens særlige utforming genereres pi-proteinet, uttrykt i vertscellen, av det genet som er representert i SEKVENS NR. 2 eller et av dettes derivater, som definert ovenfor, og spesielt av genet pir 116, som omfatter en mutasjon i forhold til pir-genet. Denne mutasjonen tilsvarer substitusjon av en prolin med en leucin på posisjon 106 fra startkodon. I denne sammenheng er antall kopier av R6K-derivatene ca. 250 per genom.

I forbindelse med denne oppfinnelsen betegner begrepet derivat enhver sekvens som avviker fra den angjeldende sekvensen som følge av en eller flere genmodifiseringer og/eller kjemiske modifiseringer, samt enhver sekvens som krysser disse sekvensene eller fragmenter av disse, med et produkt som inneholder den aktiviteten som er angitt med hensyn til det replikasjonsutløsende pi-proteinet. Begrepet modifisering av genetisk og/eller kjemisk art dekker enhver mutasjon, substitusjon, sletting, addisjon og/eller modifisering av ett eller flere reststoffer. Begrepet derivat dekker også de sekvenser som homologerer med den angjeldende sekvensen som er avledet av andre cellulære kilder, derav særlig humane celler, eller av andre organismer, og som erkarakterisert veden aktivitet av samme type. Slike homologe sekvenser kan oppnås ved krysningsforsøk. Krysningene kan foretas ved hjelp av nukleinsyrebanker og ved å benytte den opprinnelige sekvensen eller et fragment av denne som sonde - det må her tas vanlige strenge forholdsregler (Maniatis et al, jvf. Generelle molekylbiologiske teknikker-General techniques of molecular biology) eller helst enda strengere forholdsregler.

Foruten et betinget replikasjonsorigo, som beskrevet ovenfor, inneholder de patentanmeldte DNA-molekylene et område som består av ett (eller flere) gen(er), som gjør det mulig å sikre seleksjonen av DNA-molekylet i den valgte verten.

Dette kan være en vanlig genmarkør som gir resistens overfor et antibiotikum som kanamycin, ampicillin, klorampenikol, streptomycin, lividomycin eller andre.

På bakgrunn av oppfinnelsens særlige utforming skiller dette området seg imidlertid fra et antibiotika-resistent gen. Det kan altså være et gen, der produktet er av avgjørende betydning for den aktuelle vertens levedyktighet under spesielt definerte dyrkingsforhold. Det kan f.eks. være: - et gen som koder for en naturlig eller syntetisk tRNA-suppressor. Dette vil helst være et amber kodon tRNA (TAG) - et gen med et produkt som er en forutsetning for cellens stoffskifte under visse dyrkingsforhold: Gen som intervenerer i en metabolitts biosyntese (aminosyre, vitamin osv.), nedbrytningsgen som gjør det mulig å assimilere et stoff som finnes i bakteriekulturen (særlige nitrogen- eller karbonkilder) osv.

På bakgrunn av oppfinnelsens særlige utforming inneholder dette området en ekspresjonskassett for et gen som koder for en RNA-suppressor for spesifikke kodoner. Sistnevnte kan fortrinnsvis velges blant de som koder for penylalanin, prolin, alanin og histidin-aminosyrer. Dette er fortrinnsvis en suppressor-tRNA for amberkodoner (TAG).

I dette tilfellet er systemet som brukes med henblikk på å velge de DNA-molekylene i vertscellene som omhandles i denne oppfinnelsen, basert på to elementer: 1) på DNA molekylet, et gen som koder for en suppressoroverførings-RNA for amberkodonet (TAG), som utgjør seleksjonsmarkøren kalt gen ( sup og 2) en spesifikk vert, der et av genene som er av avgjørende betydning under visse dyrkingsforhold, inneholder et amber-TAG-kodon. Denne cellen vil kun kunne vokse under de dyrkingsforholdene som er av avgjørende betydning for produktet av genet med TAG-kodon dersom plasmidet som gjør swp-ekspresjon mulig, er til stede i cellen. Dyrkingsforholdene utgjør altså trykket for seleksjon av DNA molekylet. De benyttede swp-genene kan være naturlige (Glass et al, 1982) eller stamme fra syntetisk fremstilling (Normanly et al, 1986: Kleina et al, 1990).

I et slikt system er det innebygd en stor fleksibilitet i den utstrekning det er mulig å bestemme forskjellige valgbare områder, alt etter det genet som inneholder en amber-mutasjon. F.eks. i bakterien Lactococcus lactis er amberkodon lokalisert i et purin-biosyntesegen. Dette gjør det mulig å velge det plasmidet som bærer det genet som er kodet for tRNA-suppressoren, på det tidspunkt da bakteriene formerer seg i melken. En slik markør har den fordel at den er svært liten og at den ikke inneholder "fremmede" sekvenser som stammer fra fag eller transposoner.

På bakgrunn av oppfinnelsens særlige utforming inneholder DNA-molekylet dessuten et DNA-fragment, som er mål for stedspesifikke rekombinaser, som muliggjør oppløsningen av plasmid-multimerer.

Dermed gjør et slikt fragment, som føres inn i et sirkulært DNA-molekyl med f.eks. ori y som replikasjonsorigo, det mulig å oppløse slike plasmid-multimerer. Slike multimerer kan særlig observeres i de tilfeller da DNA-molekylet forberedes i en stamme som bærer en mutert pir- allel, som f.eks. pir 116, som gjør det mulig å øke antallet kopier av R6K-derivatene.

Denne rekombinasjonen kan utføres ved hjelp av forskjellige systemer som resulterer i stedspesifikk rekombinasjon mellom sekvensene. Oppfinnelsens stedspesifikke rekombinasjon oppnås fortrinnsvis ved hjelp av spesifikke intramolekylære rekombinasjonssekvenser som kan rekombinere innbyrdes ved nærvær av spesifikke proteiner, vanligvis kalt rekombinaser. I dette presise tilfellet er dette XerC- og XerD-rekombinaser. Av denne grunn inneholder oppfinnelsens DNA-molekyler normalt i tillegg en sekvens som muliggjør denne stedspesifikke rekombinasjonen. Det spesielle rekombinasjonssystemet som finnes i de genetiske konstruksjonene i henhold til oppfinnelsen (rekombinaser og spesifikt rekognoseringssted), kan ha forskjellig utspring. De spesifikke sekvensene og de benyttede rekombinasene kan spesielt tilhøre forskjellige strukturelle klasser, bla. særlig transposon-Tn3-resolvase-familien eller bakteriofag-lambda-integrase-familien. Blant de rekombinasene som hører til transposon-Tn3-familien, kan særlig nevnes resolvase transposon Tn3 eller transposonene Tn2i og Tn522 (Stark et al, 1992), Gin-invertase av bakteriofag-mu eller plasmid-resolvaser som f.eks. den frapar-fragmentet av RP4 (Abert et al, Mol. Microbiol. 12 (1994) 131). Blant de rekombinasene som tilhører bakteriofag-lambda-integrase-familien, kan særlig nevnes lambdafagintegrasen (Landy et al, Science 197 (1977) 1147), P22 og phi 80 (Leong et al, J. Biol. Chem. 260 (1985) 4468), Haemophilus injluenzae HP1 (Hauser et al, J. Biol. Chem. 267 (1992) 6859), Cre integrase fag Pl, integrasen av plasmid pSAM2 (EP 350 341) eller FLP-rekombinase av 2u-plasmidet og XerC-og XerD-rekombinaser fra E. coli.

Denne oppfinnelsens DNA-molekyler inneholder fortrinnsvis cer-fragmentet av det naturlige E. co//'-plasmidet ColEl. cer-fragmentet som brukes, er et 382 bp HpaYL-fragment fra ColEl, som beviselig genererer, i cis, oppløsning av plasmid-multimerer (Summers et al, 1984; Leung et al, 1985). Det er også mulig å bruke et Hpall- Taql-fragment av mindre størrelse (280 bp) eller et mindre fragment (ca. 220 bp), inneholdt i Æpall-fragmentet, og som inneholder de samme egenskapene (Summers and Sherratt, 1988). Denne oppløsningen skjer via en særlig intramolekylær rekombinasjon, som involverer fire proteiner kodet av E. coli- genomet: ArgR, PepA, XerC og XerD (Stirling et al, 1988,1989; Colloms et al, 1990, Blakely et al, 1993). Det ble funnet at innsetting av cer-fragmentet fra det naturlige E. coli-plasmidet ColEl gjør det mulig å oppnå en høy oppløsning av plasmid-multimere, som genererer en høy andel av monomere på reproduktiv måte. Dette er spesielt uventet, da det er blitt påvist at innsettingen av cer-stedet i en minisirkel som inneholder ColEl-replikasjonsorigoet fra pBluescript SK+, ikke resulterte i effektiv multimer-oppløsning (Kreiss et al., Appl. Microbiol. Biotechnol, 49:560-567 (1998)). Dermed er det umulig å forutse plasmidenes effektive oppløsning i cis - det synes som om denne avhenger av plasmidkonformasjonen. Når det gjelder pCOR-plasmidet, oppnås en effektiv cis-oppløsning når cer finnes på pCOR og dermed fører til uventede høye pCOR-monomerer på reproduktiv måte.

I denne forbindelse er det særlig fordelaktig å anvende hele eller en del cer-fragmentet av ColEl eller et av dettes derivater som definert ovenfor.

Ifølge en alternativ implementering kan oppfinnelsens DNA-molekyler dessuten inneholde en sekvens som er i stand til å interagere spesifikt med en ligand. Fortrinnsvis er dette en sekvens som via krysning kan danne en trippel-heliks med et spesifikt oligonukleotid. Denne sekvensen gjør det dermed mulig å rense oppfinnelsens molekyler ved selektiv krysning med et komplementært oligonukleotid som er immobilisert på en støtte (se patent WO 96/18744 og WO 02/07727). Sekvensen kan være naturlig foreliggende i plasmidets replikasjonsorigo, som beskrevet i søkerens amerikanske publikasjonssøknad 2003/186268, eller i transgenet, som forklart i WO 02/07727, eller plasseres hvor som helst på DNA-molekylet i henhold til oppfinnelsen, under forutsetning av at den ikke influerer på funksjonaliteten til de angjeldende genene eller til replikasjonsorigoet.

En trippel-heliks dannes altså ved krysning mellom oligonukleotidet og den spesifikke komplementære sekvensen i DNAet. I denne forbindelse og for å oppnå best mulig ytelser og best selektivitet, bruker oppfinnelsesmetoden et oligonukleotid og en spesifikk sekvens, som er totalt komplementære. Dette kan særlig være en oligonukleotid-poly(CTT) og en spesifikk sekvenspoly(GAA). For eksempel: Oligonukleotider som inneholder repeterte motiver som CTT, er i stand til å danne en trippel—heliks med en spesifikk sekvens som inneholder komplementære enheter (GAA). Denne sekvensen kan være et område med 7, 14 eller 17 GAA-enheter, og, i oligonukleotidene, et tilsvarende antall repetisjons-CTTer. I dette tilfellet binder oligonukleotidet i en antiparallell orientering til polypurinstrengen. Disse trippel-heliksene er kun stabile ved nærvær av Mg<2+>

(Vasquez et al., Biochemistry, 34: 7243-7251 (1995); Beal og Dervan, Science, 251:1360-1363 (1991)).

Som angitt ovenfor kan den spesifikke sekvensen være en sekvens som foreligger naturlig i pCOR eller en syntetisk sekvens som føres kunstig inn i sistnevnte. Det er spesielt fordelaktig å bruke et oligonukleotid som kan danne en trippel-heliks med en sekvens som naturlig forekommer i pCOR, f.eks. i replikasjonsorigoet til et plasmid eller i et markørgen. Syntesen av oligonukleotider som kan danne trippel-helikser med disse naturlige homopurin-homopyrimidin-områdene er spesielt fordelaktig, da den kan brukes på ikke-modifiserte pCOR-plasmider. Spesielt foretrukne målsekvenser som kan danne trippel-strukturer med spesielle oligonukleotider, er blitt identifisert i ColEl og pCOR-replikasjonsorigoer. ColEl-deriverte plasmider inneholder en 12-mer-homopurin-sekvens (5-AGAAAAAAAGGA-3') (SEKVENS NR. 33), kartlagt oppstrøms RNA-II-transkriptet som er involvert i plasmidreplikasjonen (Lacatena et al., Nature, 294:623 (1981)). Denne sekvensen danner en stabil tripleks-struktur med 12-mer komplementært oligonukleotid av typen 5'-TCTTTTTTTCCT-3' (SEKVENS NR.

34). pCOR-ryggraden inneholder en homopurin-strekning på 14 ikke-repetitive baser (5'-AAGAAAAAAAAGAA-3') (SEKVENS NR. 35) i det A+T-rike segmentet av pCOR-y-origoreplikonet (Levchenko et al, Nucleic Acids Res., 24:1936 (1996)). Denne sekvensen danner en stabil tripleks-struktur med 14-mer komplementært oligonukleotid av typen 5'-TTCTTTTTTTTCTT-3' (SEKVENS NR. 36). De tilsvarende oligonukleotidene 5'-TCTTTTTTTCCT-3' (SEKVENS NR. 37) og 5'-TTCTTTTTTTTCTT-3' (SEKVENS NR. 38) er effektivt og spesifikt rettet mot sine respektive komplementære sekvenser innen replikasjonsorigoet ColEl ori eller pCOR (oriy). Dessuten er det spesielt fordelaktig å benytte et oligonukleotid som kan danne en trippel-heliks med en sekvens foreliggende i et replikasjonsorigo eller en genmarkør, da dette muliggjør bruk av samme oligonukleotid til å rense ethvert DNA som inneholder nevnte replikasjonsorigo eller markørgen. Dermed blir det overflødig å modifisere plasmidet eller det dobbeltstrengede DNAet for innføring av en kunstig spesifikk sekvens.

Selv om totalt komplementære sekvenser foretrekkes, kan visse uoverensstemmelser tolereres mellom oligonukleotidets sekvens og sekvensen i DNAet, under forutsetning av at de ikke fører til for sterk affinitet. Sekvensen 5'-AAAAAAGGGAATAAGGG-3' (SEKVENS NR. 39) som foreligger i genet E. coli beta-lactamase kan her nevnes. I dette tilfellet kan thymin som avbryter polypurin-sekvensen, gjenkjennes av en guanin av den tredje strengen og dermed danne en G<*>TA-triplett som er stabil når den omgis av to T* AT-tripletter (Kiessling et al., Biochemistry, 31:2829-2834 (1992)).

I henhold til en spesiell utforming kan de anvendte oligonukleotidene omfatte sekvensene (CCT)n, (CT)neller (CTT)n, der "n" er et heltall fra 1 til 15. Det er spesielt gunstig å bruke sekvenser av typen (CT)neller (CTT)n. Oligonukleotider kan også kombinere (CCT)-, (CT> eller (CTT)-enheter.

De anvendte oligonukleotidene kan være naturlige (sammensatt av ikke-modifiserte naturlige baser) eller kjemisk modifiserte. Spesielt kan oligonukleotidet med fordel ha visse kjemiske modifiseringer som muliggjør økning av resistensen overfor eller beskyttelsen mot nukleaser eller av affiniteten for den spesifikke sekvensen.

Som representant for foreliggende oppfinnelses DNA-molekyler kan særlig gjøres krav på pXL 2774-plasmidet og dettes derivater. Innen rammen av denne oppfinnelsen forstås ved et derivat enhver konstruksjon som avledes av pXL2774 og som inneholder en eller flere relevante gener utover luciferase-genet. Her kan også nevnes plasmidene pXL3029 og pXL3030, samt plasmidet pXL3179 eller NV1FGF, som inneholder en ekspresjonskassett fra et terapeutisk gen. I en spesiell utforming, som foretrekkes, gjelder oppfinnelsen genet FGFa eller FGF-1, som beskrevet i søkerens amerikanske patent 4,686,113, som kalles pXL 3179 eller NV1FGF.

Det er også mulig å utvikle en fremgangsmåte for fremstilling av spesifikke vertsceller, som er særlig effektive i forbindelse med produksjonen av disse terapeutiske DNA-molekylene.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også utviklingen av en prosess for fremstilling av sirkulære DNA-molekyler, som erkarakterisert vedat man dyrker en vertscelle med minst ett DNA-molekyl, som tidligere beskrevet, og et protein, uttrykt eller ikke in situ, som betinger funksjonaliteten til DNA-molekylets replikasjonsorigo - dette replikasjonsorigoet er spesifikt og fremmed for den aktuelle vertscellen. Denne dyrkingen skal skje under forhold som muliggjør seleksjon av vertsceller transformert av de nevnte DNA-molekylene.

Fortrinnsvis uttrykkes proteinet som betinger funksjonaliteten til DNA-molekylets replikasjonsorigo, in situ fra et tilsvarende gen. Genet som koder for replikasjonens utløsende protein, kan bæres av et subsidiært replikon, som er kompatibelt med det betingede replikasjonsorigoets anvendte derivater, eller som er ført inn i vertscellens genom ved rekombinasjon takket være et transposon, en bakteriofag eller enhver annen vektor. I det spesielle tilfellet der genet som uttrykker proteinet, er plassert på et subsidiært replikon, inneholder sistnevnte også et område (promoterområdet) som aktiverer den funksjonelle transkripsjonen i cellen, samt et område i 3'-enden og som angir et signal for fullført transkripsjon. Promoterområdet kan være et område som naturlig er ansvarlig for det aktuelle genets ekspresjon, når dette er i stand til å fungere i cellen. Det kan også være områder av forskjellig opprinnelse (ansvarlig for ekspresjon av andre proteiner), til og med syntetiske. Det kan særlig være promoter-sekvenser prokaryotiske gener eller bakteriofager. Det kan f.eks. være promoter-sekvenser som utledes fra cellens genom.

Som gener som koder for replikasjonens utløsende protein vil man kunne anvende enten villtypegener eller muterte alleler, som gjør det mulig å oppnå et økt antall kopier av de plasmider (eller derivater) som er spesifikke for det utløsende proteinet som betinger funksjonaliteten av det replikasjonsorigoet som benyttes i DNA-molekylet.

Slike mutanter er særlig blitt beskrevet når det gjelder R6K (Inuzuka og Wada, 1985; Greener et al, (1990), Rtsl (Terawaki og Itoh, 1985, Terawaki et al, 1990; Zeng et al, 1990), F (Seelke et al, 1982; Helsberg et al, 1985; Kawasaki et al, 1991), RK2 (Durland et al, 1990; Haugan et al, 1992, 1995), pSClOl (Xia et al, 1991; Goebel et al, 1991; Fang et al, 1993).I det spesielle tilfellet der de anvendte DNA-molekylene inneholder et replikasjonsorigo som er avledet av R6K-plasmidet, er det utløsende proteinet en avledning av pi-proteinet i samme plasmid. Det er særlig fordelaktig å uttrykke en mutert form av dette proteinet som kan øke antallet opprinnelige kopier betraktelig. Med henblikk på dette skal det genet som er integrert på vertscellenivå, fortrinnsvis være representert av hele eller en del av den sekvensen som er representert i SEKVENS NR. 2, eller et av dettes derivater, og i ennå mer ønskelig grad et pir 116- gen. Den tilknyttede mutasjonen svarer til at et prolin blir substituert med et leucin. I henhold til oppfinnelsens særlige utforming er dette pirll6- geneX direkte inkorporert i vertscellens genom.

Et av de spesifikke vertscellegener som er av avgjørende betydning under de valgte dyrkingsforholdene, inneholder et spesifikt kodon som kan gjenkjennes av den valgte tRNA-suppressoren i DNA-molekylet. Som følge av oppfinnelsens særlige utforming er dette et amber-TAG-kodon. I dette særlige tilfellet vil cellen bare kunne vokse under de dyrkingsforholdene som er avgjørende for å produsere det genet som inneholder TAG-kodonet, dersom plasmidet som muliggjør sup-ekspresjon, er til stede i vertscellen. Dyrkingsforholdene utgjør altså trykket for seleksjon av DNA-molekylet.

Det genet som inneholder amber-kodonet, skal helst være et gen som intervenerer i en aminosyres biosyntese, arginin. Dette genet, argE, koder for en N-acetylomithinase (Meinnel et al, 1992) og inneholder i dette tilfellet et TAG-kodon som svarer til en punktmutasjon Gin-53 (CAG)-> TAG; trykket for seleksjon av det plasmidet som inneholder .swp-genet ivaretas dermed ved hjelp av dyrking i minimalmedium M9 (Maniatis et al, 1989). Dette kunne også vært f.eks. et biosyntesegen fra et vitamin, en nukleidbase eller et gen som gjør det mulig å bruke spesielle karbon- eller nitrogenkilder eller et hvilket som helst annet gen med en funksjonalitet som avhenger av den cellulære levedyktigheten under de valgte dyrkingsbetingelsene.

Vertscellen skal fortrinnsvis selekteres blant E. cø//'-stammene, og her er stammen E. coliXAC- 1 det beste valg.

Ifølge oppfinnelsens særlige utforming er den vertscellen som aktiveres i denne prosessen, en celle fra-E. coli XAC- 1 -stammen med et genom som inneholder pir 775-genet og som er transformert av pXL2774-plasmidet eller et av dettes derivater.

Ifølge oppfinnelsens fordelaktige utforming er den vertscellen som aktiveres i denne prosessen, en prokaryotisk celle, der endAl- genet eller et homologt gen er inaktivert. endAl- genet koder for E. coli endonuklease I. Dette periplasmiske enzymet inneholder en ikke-spesifikk aktivitet til kløyving av dobbeltstrenget DNA (Lehman, I. R., G. G. Roussos og E. A. Pratt (1962) J. Biol. Chem. 237: 819-828; Wright M. (1971) J. Bacteriol. 107: 87-94). En undersøkelse av forskjellige stammer av Escherichia coli (villtype eller endA) har vist at nedbrytingen av plasmid DNA, inkubert i ekstrakter av disse bakteriestammene, skjedde i endA+-stammene men ikke i endA -mutantene (Wnendt S. (1994) BioTechniques 17:270-272). Kvaliteten av plasmid DNA isolert fra e/jcjL4+-stammer eller fra endA-mutanter er blitt undersøkt av firmaet Promega ved hjelp av et eget rensesystem (Shoenfeld, T., J. Mendez, D. Storts, E. Portman, B.+Patterson, J. Frederiksen and C. Smith. 1995. Effects of bacterial strains carrying the endAl genotype on DNA quality isolated with Wizard plasmid purification systems. Promega notes 53). De når frem til følgende konklusjon: Kvaliteten av DNAet som fremstilles på grunnlag av e«dL4-mutanter er generelt sett høyere enn kvaliteten av det DNA som er blitt fremstilt i de testede ew£4+-stammer.

Kvaliteten på det fremstilte plasmid-DNAet påvirkes altså av enhver form for kontaminasjon av denne endonukleasen (nedbrytning av DNA på relativt lang sikt).

Sletting eller mutasjon av endA- genet kan planlegges uten problemer i den grad de mutantene som ikke lenger representerer denne endonukleastiske aktiviteten, oppfører seg som villtypebakterier (Durwald, H. and H. Hoffmann-Berling (1968) J. Mol. Biol. 34: 331-346).

endAl- genet kan inaktiveres ved mutasjon, hel eller delvis mutasjon, disrupsjon osv. Inaktivering av endA- genet fra den E. cø//'-stammen som er blitt valgt til fremstilling av pCOR-plasmidene, kan oppnås mer spesifikt ved hjelp av bakteriofag-Pl ved overføring av Delta endA::Tc<R->sletting, beskrevet av Cherepanov og Wackernagel (Cherepanov, P. P. og W. Wackernagel. 1995. Gene disruption in Escherichia coli: Tc R and Km R cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene 158:9-14") eller ved å skifte ut villtypeallelet som forekommer i genomet i den gjeldende bakterien, med en mutert eller slettet endA- a\\ e\ ved hjelp av homolog rekombinasjon. Anvendelsen av denne typen stamme innen rammen av denne oppfinnelsen gjør det mulig å forbedre kvaliteten av det fremstilte DNA på en fordelaktig måte.

Enhver rekombinant celle som inneholder et DNA-molekyl, som definert over er mulig å fremskaffe. Dette kan være celler av forskjellig opprinnelse, eukaryotiske, prokaryotiske celler osv.

I henhold til en annen utforming av oppfinnelsen, er TEX1 navnet på vertscellen E. coli XAC-1 anvendt i denne prosessen. Denne cellen består av et traD- gen, eller et homologt gen, som er inaktivert for å oppheve F'-overføring. traD befinner seg på 5'-enden på et av/rø-operonene og innkoder en 81.7 kDa-membranprotein, som er direkte involvert i DNA-overføring og DNA-metabolisme (Frost et al., Microbiology Reviews, 1994,58: 162-210). #*a£>-mutanter overfører ikke DNA (Panicker et al., J. BacterioL, 1985,162:584-590). Det episomale traD- genet kan inaktiveres ved mutasjon, total eller delvis sletting eller disrupsjon med velkjente fagmetoder (se eksempel 9). En fremgangsmåte for inaktivering av dette genet er forklart i Eksempel 1, og E. co//'-stammen XAC-1 pirll6 endA" traD" som dermed oppnås, kalles TEX1 (Soubrier et al., Gene Therapy, 1999, 6:1482-1488).

I henhold til en utforming av oppfinnelsen, er vertscellen som brukes i denne prosessen en celle av E. cø//'-stammen XAC-1 inneholdt i />/W./6-mutasjonen kombinert med/>/W2-mutasjonen. pirll6- og/>/W2-mutasj onene virker inn på forskjellige områder av pi-proteinet. p/W75-mutasjonen virker inn på kontrollområdet for kopiantall, og />/W2-mutasjonen virker inn på det glidelåslignende putative leucinmotivet gjengitt i Figur 11. Nukleotide- og aminosyresekvensene av pir- genet som inneholder pirllé- og />/W2-mutasjonene, er henholdsvis angitt i Figur 12 og SEKVENS NR. 21 og 22./>/W2-mutasjonen omfatter en C til T-overgang på posisjon 124 fra methionin-utløsningskodonet, og fører dermed til substitusjon av prolinet med en leucin på posisjon 42. pir42-mutasjonen er beskrevet av Miron et al. (Proe Nati Acad Sei USA, 1994.91 (14): p. 6438-42; EMBO J, 1992.11 (3): p. 1205-16), og ble angitt å øke antallet kopier av et plasmid av typen "ori y R6K-Km<R>- pir42" 2,5 ganger mer enn samme plasmid som nærer pir-villtypegenet. Men p/W2-mutasjonen ble aldri brukt eller beskrevet i kombinasjon medp/W75-mutasjonen, og mens andre oppkopieringsmutasjoner som cop21 i pir- genet kombinert med pirll6 ikke viser økning av plasmidkopiantallet, viste kombinasjonen av pirlW- og p/W2-mutasjonene i en E. co//-stamme av typen XAC-1 endA~ traD~ overraskende nok en vesentlig økning av plasmidkopiantallet. Søkerne har dermed påvist uventede resultater av denne kombinasjonen når det gjelder antallet kopier av plasmider produsert i E. coli-vertsstammer, som omfatter det muterte pirll6- og pir42- genet i sammenligning med stammer som bare verter pirll6, eller i en vertscelle som omfatter pirll6-mutasjonen kombinert med en annen mutasjon av pir- genet, som mutasjonen cop21 (Inuzuka et al, FEBS Lett, 1988.228 (1): p. 7-11). For eksempel viste E. coli TEXlpir42 (=XAC-1 endA" traD" pirll6pir42) en 2-5-gangers økning i antallet plasmider sammenlignet med en pirll6- stamme, eller stammer som omfatter pirll6- og cop2i-mutasjoner (se Eksempel 11). I andre utforminger omfatter pir-genet minst en mutasjon, som kan forekomme for eksempel i kontrollområdet for kopiantall, i det glidelåslignende leucinmotivet, i det DNA-bindende området eller i ett eller flere av disse områdene eller et annet område av pi-proteinet som er kodet av pir-genet.

I henhold til foreliggende oppfinnelse omfatter den prokaryotiske vertscellen også en eller flere mutasjoner i samme eller et annet område av pi-proteinet, kodet av p/r-genekopien, som det DNA-bindende området, og/eller kontrollområdet for kopiantall og/eller det glidelåslignende leucinmotivet. Den prokaryotiske rekombinante vertscellen, som kan omfatte det heterologe pir- genet, befinner seg i et plasmid eller i vertscellens genom.

Slike mutasjoner kan filtreres ved hjelp av den fluorescensbaserte filtreringsmetoden i henhold til ett aspekt av foreliggende oppfinnelse, som er beskrevet nedenfor. Som nevnt i Eksempel 13 ble vertscellene som minst omfattet én mutasjon i pir-genet, mutasjonen pir II 6 og en mutasjon i det DNA-bindende området filtrert ved hjelp av den fluorescensbaserte filtreringsmetoden i henhold til foreliggende oppfinnelse. Kapasiteten til å produsere et stort antall plasmider med fluorescensbasert filtrering ble testet for vertsceller som omfatter mutasjoner i det DNA-bindende området i tillegg til pirll6, dvs. som f.eks. i konstruksjonen 100B, der tyrosin (K) på posisjon 292 er erstattet med en methionin (M), i konstruksjonen 114C, der en glutaminsyre (E) på posisjon 130 er erstattet med en valin (V), eller i konstruksjonen 201C, der en asparaginsyre (D) på posisjon 117 er erstattet med en glysin (G) (Fig. 26).

I henhold til en annen utforming av foreliggende oppfinnelse er vertscellen som anvendes i denne prosessen, en prokaryotisk vertscelle der recA- genet eller et homologt gen er blitt inaktivert. Fortrinnsvis er vertscellen i foreliggende oppfinnelse stammen E. coli XAC-1 med mutasjonene pirll6, pir42, endA", traD~, recA~. Denne stammen kalles TEX2pir42. recA kan inaktiveres med velkjente fagmetoder. recA innkoder et hovedrekombinasjonsprotein, og mutasjoner i dette genet reduserer frekvensen til rekombinasjonsbetinget endring i plasmider, og intramolekylær rekombinasjon som kan føre til multimerisering av plasmider. Som forklart i Eksempel 12, kan et slettet recA- gen med 3 kodoner for translasjonsstopp (en i hver ramme) på 5'-enden oppnås ved PCR. Det resulterende inaktiverte genet ble så ført inn i TEXl-genomet ved generstatning (Eksempel 12.1).

Disse cellene dannes ved hjelp av enhver kjent fagteknikk, der det angjeldende plasmidet kan innføres i en gitt celle. Denne teknikken kan være transformasjon, elektroporasjon, konjugasjon, protoplastfusjon eller en annen kjent fagteknikk.

Stammen XAC-\ pirl 16 ble innlevert, i henhold til vilkårene i Budapest-avtalen, til Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM), Institut Pasteur, 28, rue Dr. Roux, 75724 Paris Cedex 15, Frankrike, 10. oktober 2003, med referansenr. 1-3108.

Stammen TEX2pir42 ble innlevert, i henhold til vilkårene i Budapest-avtalen, til Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM), Institut Pasteur, 28, rue Dr. Roux, 75724 Paris Cedex 15, Frankrike, 10. oktober 2003, med referansenr. 1-3109.

DNA-molekylene kan anvendes i forbindelse med enhver vaksinasjonsbehandling eller genetisk og cellulær terapi, til overføring av et gen til et organ, et vev eller en gitt celle eller i forbindelse med in v/Yro-fremstilling av rekombinante proteiner.

De kan særlig anvendes i forbindelse med direkte in vzVo-administrering eller til in vivo- eller ex v/vo-modifisering av celler med henblikk på implantasjon i en pasient.

Videre kan også en farmasøytisk komposisjon som inneholder minst ett DNA-molekyl som definert ovenfor anvendes. Dette molekylet kan være knyttet til en kjemisk og/eller biokjemisk transfeksjonsvektor eller ikke. Dette kan særlig gjelde kationer (kalsiumfosfat, DEAE-dekstran osv.) eller liposomer. De tilknyttede syntetiske vektorene kan være kanoniske lipider eller polymerer. Som eksempler på slike vektorer kan nevnes DOGS (Transfectam™) eller DOTMA (lipofectin™).

De farmasøytiske komposisjonene kan formuleres med henblikk på en topisk, oral, parenteral, intranasal, intravenøs, intramuskulær, subkutan eller transdermal administrering. Fortrinnsvis skal plasmidet anvendes i injeksjonsform eller applikasjonsform. Det kan blandes med enhver løsning som er akseptabel fra et farmasøytisk synspunkt, med henblikk på en injektiv formulering, særlig for direkte injeksjon på det stedet som skal behandles. Dette kan særlig være sterile, isotoniske oppløsninger eller tørre komposisjoner, særlig frysetørkede komposisjoner, som dessuten, alt etter om det dreier seg om sterilisert vann eller fysiologisk serum, gjør det mulig å fremstille vannoppløsninger for injeksjon. Det kan særlig anvendes Tris- eller PBS-buffere som er oppløst i glukose eller natriumklorid. En injeksjon foretatt direkte på det angrepne området er interessant, da den terapeutiske virkningen dermed konsentreres omkring det angrepne vevet. Dosene som brukes, kan tilpasses til forskjellige parametere og særlig i forhold til genet, vektoren, den anvendte administreringsmetoden, den aktuelle patologien og dessuten den aktuelle behandlingens varighet.

Oppfinnelsens DNA-molekyler kan inneholde én eller flere relevante gener, dvs. én eller flere nukleinsyrer (syntetisk eller semisyntetisk DNA, gDNA, cDNA osv.), der transkripsjon og eventuelt translasjon i målcellen genererer produkter av interesse innen behandling, vaksine, agronomi eller veterinærmedisin.

Blant de genene som har terapeutisk interesse, kan særlig nevnes de genene som koder for enzymer, blodderivater, hormoner og lymfokiner: interleukiner, interferoner, TNF osv. (FR 92/03120), vekstfaktorer, neurotransmittere eller deres forgjengere eller syntetiske enzymer, og trofiske faktorer (BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, VEGF-B, VEGF-C osv.; apolipoproteiner: ApoAI, ApoAIV, ApoE osv. (FR 93/05125), dystrofin eller en minidystrofin (FR 91/11947), svulstfjernende gener: p53, Rb, Rap IA, DCC, k-rev osv. (FR 93/04745), gener som koder for faktorer involvert i koagulasjon: Faktorer VII, VIII, IX osv., suicidale gener: Tymidin kinase, cytosin dearninase osv., eller, i tillegg, hele eller en del av en naturlig eller kunstig immonoglobulin (Fab, ScFv osv.), en RNA-ligand (WO 91/19813) osv. Det terapeutiske genet kan også være en antisens-sekvens eller et gen, der ekspresjonen i målcellen gjør det mulig å kontrollere genekspresjonen eller transkripsjonen av cellulære mRNAer. Slike sekvenser kan f.eks. transskriberes i målcellen til RNAer som er komplementære til cellulære mRNAer og dermed blokkere deres translasjon til protein i henhold til teknikken beskrevet i patent EP 140,308. En innsetting av interesse som kan foretas av oppfinnelsens pCOR, er en RN Ai som kan interferere med translasjonen av et målgen (Wilson et al., Curr Opin Mol Ther. 2003 Aug; 5(4):389-96) og dermed regulere ekspresjonen av et slikt gen.

Et gen av interesse kan også være et vaksinegen, dvs. et gen som koder for et antigenpeptid, som hos mennesker eller dyr kan generere et immunsvar med henblikk på fremstilling av vaksiner. Disse antigenpeptidene kan særlig være spesifikke antigenpeptider av Epstein-Barr-virus, HIV-virus, hepatitt B-virus (EP 185,573), pseudorabies (falsk hundegalskap) eller dessuten spesifikt antigenpeptid mot kreft (EP 259,212).

Genet i oppfinnelsens DNA-molekyler av interesse innen behandling, vaksine, agronomi eller veterinærmedisin inneholder vanligvis også et promoter-område for den funksjonelle transkripsjonen i cellen eller målorganismen samt et område plassert i 3'-enden som angir et signal for fullført transkripsjon og et polyadenylasjonssted. Promoter-området kan være et område som naturlig er ansvarlig for det angjeldende genets ekspresjon, når dette området er i stand til å fungere i den angjeldende cellen eller det angjeldende organet. Promoter-områdene kan også være områder av forskjellig opprinnelse (ansvarlig for ekspresjon av andre proteiner) eller til og med syntetiske. Dette kan særskilt være sekvenser som aktiverer prokaryotiske eller virale gener. Det kan f.eks. være promoter-utledet av målcellens genom. Blant de eukaryotiske promoterne kan man anvende enhver promoter eller avledet sekvens som stimulerer eller demper genets transkripsjon på spesifikk eller ikke-spesifikk måte, induktibelt eller ikke-induktibelt, sterkt eller svakt. De eukaryotiske promoterne kan særlig være ubikvitære (promotere av genene HPRT, PGK, alfa-aktin, tubulin osv.), intermediære filament-promotere (promotere av genene GFAP, desmin, vimentin, neurofilamenter, keratin osv.), promotere av terapeutiske gener (f.eks. promotere av genene MDR, CFTR, faktor VIII, ApoAI osv.), vevsspesifikke promotere (promotere av genene pyruvatkinase, villin, intestinal fettsyrebindende protein, alfa-aktin for smidige muskler osv.). Det kan også være promotere som reagerer på et stimulus (steroidhormonreseptor, retionisk syrereseptor osv.). Det kan også være promoter-sekvenser utledet av et virusgenom, f.eks. promotere av adenovirus-genene EIA og MLP, CMV tidlig promoter eller alternativt LTR RSV-promoteren osv. Dessuten kan disse promoter-områdene modifiseres ved tilføyelse av aktiverende eller regulerende sekvenser eller sekvenser som muliggjør en vevsspesifikk ekspresjon eller ekspresjon som er overveiende vevsspesifikk.

Dessuten kan genet av interesse også inneholde en signalsekvens som leder det syntetiserte produktet inn i målcellens sekresjons-pathways. Denne signalsekvensen kan forekomme naturlig i det syntetiserte produktet, men det kan også dreie seg om enhver annen funksjonell signalfrekvens eller om en kunstig signalfrekvens. Den foretrukne signalsekvensen som benyttes i henhold til foreliggende oppfinnelse, er sekresjonssignal-peptidet til det menneskelige interferonet, beskrevet av Taniguchi et al. (Gene, 1980,233 (4763):541-5).

Alt etter hvilket gen det dreier seg om, kan oppfinnelsens DNA-molekyler brukes i forbindelse med behandling eller forebyggelse av en rekke patologier, derav genetiske sykdommer, dystrofi, cystisk fibrose osv.), neurodegenerative sykdommer (Alzheimer, Parkinson, ALS osv.), kreft, patologier knyttet til koagulasjonsforstyrrelser eller til dyslipoproteinemi, patologier knyttet til virale infeksjoner (hepatitt, AIDS osv.) eller på det agronomiske og veterinære området osv.

I henhold til en fordelaktig utforming kan DNA-molekylene i foreliggende oppfinnelse benyttes til å behandle kritiske iskjemiske patologier som f.eks. perifer arterieokklusjon og intermitterende klaudikasjon.

Dessuten gjelder foreliggende oppfinnelse også anvendelsen av DNA-molekyler med betinget replikasjon til fremstilling av rekombinante proteiner. Bakteriene kan anvendes til fremstilling av proteiner av forskjellig opprinnelse, eukaryotiske eller prokaryotiske. Blant bakteriene er E. coli den foretrukne organismen til ekspresjon av heterologe gener fordi den er så lett å håndtere og på grunn av det høye antallet tilgjengelige ekspresjonssystemer og de store mengder proteiner som man kan fremstille. Oppfinnelsens system kan selvsagt anvendes i andre organismer, idet tropismen bestemmes av arten av replikasjonsorigo, som anført ovenfor. I forbindelse med denne anvendelsen inneholder den relevante nukleinsyresekvensen et område som koder under kontroll av ekspresjonssignaler tilpasset den valgte verten, særlig en prokaryotisk vert. Det kan f.eks. være promoterne Plac, Ptrp, PT7, Ptrc, Ptac, PL, PBadeller PR, Shine-Dalgarno-sekvensen osv. (denne gruppen utgjør ekspresjonskassetten). Den relevante nukleinsyresekvensen kan være enhver sekvens som koder for et protein av farmasøytisk, kjemisk eller landbrukskjemisk interesse eller av interesse for næringsmiddelsektoren. Det kan dreie seg om et strukturgen, en komplementær DNA-sekvens, en syntetisk eller semisyntetisk sekvens osv.

Ekspresjonskassetten kan innføres på den betingede replikasjonsvektoren som ligger til grunn for oppfinnelsen og utgjør altså en betinget replikasjonsvektor som muliggjør ekspresjon av relevante proteiner i E. coli. Denne vektoren har flere fordeler: Det skal ikke brukes antibiotika for å velge den i bakterien (lavere kostnader, det er ikke nødvendig å undersøke om sluttproduktet inneholder antibiotika eller potensielt giftige derivater), det er praktisk talt ingen risiko for spredning av plasmidet i naturen (betinget replikasjonsorigo), mulighet for fermentering i et fullt ut definert medium. De eksemplene som er angitt, viser de fordelaktige egenskapene for disse betingede vektorene til fremstilling av rekombinante proteiner.

Som forklart ovenfor omfatter DNA-molekylet i henhold til foreliggende oppfinnelse et replikasjonsorigo, ORIy, avledet fra R6K, der pir- genet fjernes og føres inn i genomet til en spesifikk vertscelle som brukes til å produsere DNA-molekyler i stor målestokk Det er alltid et behov for å produsere økende mengder plasmid for kliniske forsøk og/eller til bruk i DNA-basert genterapi. Det er blitt utviklet produksjonsvertsceller for å transportere pir-genet med minst én mutasjon, som feks. mutasjons-^/Wi^ og/eller pir42. Bruk av slike muterte vertsstammer fører til økning av plasmidenes kopiantall, og øker dermed betraktelig produksjonsresultatene. Altså er plasmidenes form meget tilfredsstillende.

Det er mulig å benytte en ny fluorescensbasert filtreringsmetode for oppkopieringsmutanter. Denne metoden er helt overlegen den klassiske filtreringsmetoden basert på resistens overfor bakterienes antibiotika, som ikke kan brukes når plasmidets basiskopiantall allerede er svært høyt, som det som oppnås med mutanten pirll6, feks. ca. 400 kopier av plasmid per celle. Den fluorescensbaserte filtreringsmetoden bruker fortrinnsvis cobA- genet som reportergen med rød fluorescens til oppkopieringsnummeret. coM-genet, som er et gen fra Pseudomonas denitrificans (Crouzet et al., J. Bacteriol 1999,172:5968-79) innkoder uro III metyltransferase, et enzym av B12-vitamin-pathway, som tilføyer to metylgrupper til urogen Hl-molekylet Wildt et al. (Nature Biotechnology, vol. 17,1999, pp. 1175) har beskrevet bruken av cobA som et fluorescent transkripsjonalt reportergen for E. coli, gjær og pattedyrceller. For eksempel ble dette fluorescente reportergenet brukt for valget av rekombinante plasmider med E. co//-stammer som kumulerer fluorescente porfyrinoide sammensetninger grunnet overekspresjon av cobA- genet som innkoder uroIII metyltransferase. Ved belysning med UV-lys fluorescerte cellene med en klart rød farge (Biotechniques, 1995, vol 19, no. 7, p. 760).

Søkeren har overraskende funnet en nær korrelasjon mellom antallet plasmidkopier som transporterer cobA- genet og fluorescensnivået fra rosa til rødt. Den fluorescensbaserte metoden for filtrering av oppkopieringsmutanter er altså nyttig for filtrering av ulike mutanter, som så kan evalueres i genomet til produksjonsvertscellen, som feks. E. coli eller mutanter av enhver type gener som i pir- gen, som innføres i genomet til produksjonsvertscellen eller transporteres i et plasmid.

I tillegg til korrelasjonen med antallet plasmidkopier, er utførelsen av den fluorescensbaserte filtreringsmetoden enkel og rask, da fluorescensintensiteten ganske enkelt påvises etter spredning av de transformerte vertscellene over natten og påføring av UV-lys - dermed avledes antallet plasmidkopier direkte i vertscellen.

En metode for detektering av en oppkopieringsmutasjon med plasmid kan omfatte:

(a) Innføring av minst en mutasjon i en målsekvens,

(b) Transformering av den muterte målsekvensen i en vertscelle med et plasmid som omfatter en nukleotidsekvens som innkoder uroIII metyltransferase og der plasmidets kopiantall påvirkes av målsekvensen, (c) Dyrking av vertscellen under forhold der nukleotidsekvensen uttrykkes for å produsere en dyrking av vertsceller,

(d) Påføring av UV-lys til vertscellekulturen, og

(e) Detektering av fluorescens produsert av dyrkingen av vertsceller.

I henhold til foreliggende oppfinnelse omfatter metoden videre sammenligning av fluorescensen detektert i trinn (e) med fluorescens generert av en dyrking av vertsceller som omfatter en ikke-mutert vertssekvens.

UroIII metyltransferase-genet kodes fortrinnsvis av cobA- geaet fra. Pseudomonas denitrificans.

Mutasjonen kan foreligge i et plasmid som består av et heterologt pir- gen med minst én mutasjon. Plasmidet kan bestå av minst en mutasjon i pir- genet, i andre områder som f.eks. området for kopikontroll og/eller det DNA-bindende området og/eller det glidelåslignende leucinmotivet og/eller et annet område i pir- genet. Altså kan plasmidet omfatte minst én mutasjon i kontrollområdet for kopi av det heterologe pir- genet og det glidelåslignende leucinmotivet. Plasmidet kan også omfatte en mutasjon i pir- genets DNA-bindende område. Plasmidet kan videre omfatte en eller flere mutasjoner i samme område eller i et annet område i pir- genet som koder for kopikontrollområdet og/eller det DNA-bindende området og/eller det glidelåslignende leucinmotivet eller et annet område av pi-proteinet.

Innen angitte grenser omfatter den prokaryotiske, rekombinante vertscellen i henhold til foreliggende oppfinnelse pirl 16-mutasjonen og en annen mutasjon i det DNA-bindende området, som f.eks. pir292, pirl 30 eller pirl 17 (Fig. 26).

Denne muterte produksjonsvertsstammen kan fordelaktig produseres ved hjelp av et universelt plasmidverktøy som minisirkelen. Minisirkelteknologien er bl.a beskrevet i søkerens amerikanske patenter 6,143,530 og 6,492,164, samt i PCT-søknaden WO 96/26270.

Minisirkler er rekombinante DNA-molekyler som ikke inneholder noe replikasjonsorigo og dermed utgjør en ypperlig suicidalvektor for generstatning av genomet til enhver mikroorganisme. I særdeleshet er de angjeldende genene (genet) flankert av to sekvenser som muliggjør stedsspesifikk rekombinasjon, plassert i direkte retning i minisirkelen. Posisjon i direkte retning angir at de to sekvensene følger samme 5'-3'-polaritet i den rekombinante DNA-minisirkelen. Minisirkelens genetiske konstruksjoner er vanligvis sirkulære, dobbeltstrengede DNA-molekyler uten replikasjonsorigo, men kan også være i lineær form og inneholde angjeldende gen(-er) flankert av de to sekvensene som muliggjør stedsspesifikk rekombinasjon, plassert i den direkte retningen. I henhold til denne spesielle utformingen av oppfinnelsen, kan minisirkelen brukes til å transformere enhver relevant mikroorganisme for generstatning i det tilsvarende genomet (Figur 31).

Minisirkelen for generstatning genereres fra et parentalt plasmid som minst omfatter:

a) Et replikasjonsorigo og et seleksjonsmarkørgen,

b) To sekvenser som muliggjør stedsspesifikk rekombinasjon, plassert i direkte

retning, og,

c) Et eller flere relevante gener plassert mellom sekvensene nevnt under b).

Det spesifikke rekombinasjonssystemet, som foreligger i de genetiske konstruksjonene, kan være av forskjellig opprinnelse. De spesifikke sekvensene og rekombinasene som brukes, kan tilhøre forskjellige strukturelle klasser, spesielt integrase-familien av bakteriofag-X eller resolvase-familien til Tn3-transposonet. Blant rekombinaser som tilhører integrase-familien bakteriofag-X, kan spesielt nevnes integrasen til lambda-fagene (Landy et al, Science 197:1147,1977), P22 og <D80 (Leong et al, J. Biol. Chem. 260:4468,1985), HP1 av Haemophilus influenza (Hauser et al, J. Biol. Chem. 267 6859,1992), Cre-integrasen til fagen Pl, integrasen til plasmidet pSAM2 (EP 350,341) eller FLP-rekombinase til 2u-plasmidet. Minisirklene prepareres ved rekombinasjon ved hjelp av et stedsspesifikt system av integrase-familien av bakteriofag-X. I henhold til oppfinnelsen omfatter DNA-molekylene dessuten en sekvens som genereres av rekombinasjonen mellom to aW-tilknytningssekvenser av den tilsvarende bakteriofagen eller det tilsvarende plasmidet.

Blant rekombinasene som tilhører familien til transposonet Tn3, kan spesielt nevnes resolvasen til transposonet Tn3 eller til transposonene Tn2i og Tn522 (Stark et al, Trends Genet, 8,432-439,1992); Gin-invertasen til bakteriofagen mu, eller resolvasen av plasmider, f.eks. den til/?ar-fragmentet av RP4 (Albert et al., Mol. Microbiol. 12:131, 1994). Når minisirklene prepareres ved rekombinasjon ved hjelp av et stedsspesifikt system til familien til transposonet Tn3, omfatter de vanligvis, i tillegg til det relevante genet som skal innføres i mikroorganismens genom, en sekvens som genereres av rekombinasjonen mellom to gjenkjenningssekvenser til resolvasen til angjeldende transposon. Sekvenser som muliggjør stedsspesifikk rekombinasjon, kan også avledes av tøcP-området til fagen Pl, som hovedsakelig består av to repetisjonssekvenser som kan rekombineres spesifikt med hverandre i nærvær av et protein, kalt Cre (Sternberg et al, J. Mol. Biol. 150:467,1971). Plasmidet som brukes til å produsere minisirkelen omfatter altså (a) et bakterie-replikasjonsorigo og et seleksjonsmarkørgen, (b) repetisjonssekvensene av bakteriofagen Pl (/oxP-område); og (c) ett eller flere relevante gener plassert mellom sekvensene nevnt under (b) og som man ønsker å sette inn i genomet til en mikroorganisme.

Minisirkler kan omfatte sekvenser for stedsspesifikk rekombinasjon og som er avledet av en bakteriofag, f.eks. tilknytningssekvenser ( qttP- og a#2?-sekvenser) til en bakteriofag eller sekvenser avledet av slike tilknytningssekvenser. Disse sekvensene kan rekombineres spesielt med hverandre i nærvær av en rekombinase henvist til som integrase med eller uten eksisjonase. Begrepet "sekvenser avledet av slike tilknytningssekvenser" omfatter sekvensene oppnådd ved endring(-er) av tilknytningssekvensene til bakteriofager som holder igjen sin evne til å rekombineres, spesielt i nærvær av den rette rekombinasen. Dermed kan slike sekvenser reduseres av slike sekvenser eller fragmenter utvidet ved tillegg av andre sekvenser (restriksjonssteder o.L). Det kan også være varianter oppnådd ved mutasjon(-er), særlig ved punktmutasjon(-er). Termene " attF'- og "atfiT-sekvenser til en bakteriofag eller et plasmid betyr, i henhold til oppfinnelsen, sekvensen av rekombinasjonssystemet som er spesifikt for nevnte bakteriofag eller plasmid, dvs. a«P-sekvensen i nevnte fag eller plasmid og den tilsvarende kromosomale atfÆ-sekvensen. Tilknytningssekvensene er velkjent i faget, og omfatter bla. tilknytningssekvensene til fagene X, P22, <D80, Pl og HP1 til Haemophilus influenzae eller til plasmid pSAM2 eller 2u-plasmidet.

Minisirklene produseres på en enkel måte fra det overordnede plasmidet beskrevet ovenfor. Metoden for produksjon av minisirkelen består i bringe i kontakt dyrkede celler som er transformert med det overordnede plasmidet, med integrasen, med eller uten eksisjonasen, for å indusere den stedsspesifikke rekombinasjonen. Cellekulturen og integrasen med eller uten eksisjonasen føres i kontakt enten ved transfeksjon eller infeksjon med et plasmid eller en fag som inneholder genet for nevnte integrase og eventuelt genet for eksisjonasen. Alternativt induseres, for eksempel, ekspresjonen av gener som koder for nevnte integrase og eventuelt eksisjonasen som foreligger i vertscellen. Som nevnt nedenfor kan disse genene forekomme i vertscellen i integrert form i genomet, på et replikativt plasmid eller i den ikke-terapeutiske delen på plasmidet i oppfinnelsen.

For å muliggjøre produksjonen av minisirkler, i henhold til oppfinnelsen, ved stedsspesifikk rekombinasjon in vivo, innføres eller induseres integrasen med/uten eksisjonase i cellene eller kulturmediet på et bestemt tidspunkt. Med henblikk på dette kan det benyttes forskjellige metoder. I henhold til den første metoden brukes det en vertscelle som f.eks. inneholder rekombinase-genet, dvs. integrase-genet med eller uten eksisjonase-genet, i en form som muliggjør dennes regulerte ekspresjon. Integrase-genet med eller uten eksisjonase-genet kan f.eks. innføres under kontroll fra en promoter, fra et system med indusible promotere eller i et temperaturfølsomt system.

Integrase-genet kan spesielt være til stede i en temperaturfølsom fag, latent i vekstfasen, og induseres ved egnet temperatur (feks. lysogenisk fag X Xis~ c7857).

Eller genet kan være under kontroll fra en regulert promoter, feks. placUV5-promoteren

- vertscellen kalles E. coli G6191.

Integrasen med eller uten eksisjonase-genet kan fortrinnsvis være under kontroll fra en regulert promoter, feks. PBAD-promoteren til araBAD-operonet (arabinose), som reguleres med arabinose (Guzman et al, J. Bacteriol, 1995,4121-4130; US 5,028,530). Bruk av PBAD-promoteren muliggjør spesielt tilstrekkelig ekspresjon av eksisjonase og integrase i nærvær av arabinose som induseringsagent, og dermed mer enn 90% av rekombinasjonen av plasmidene som finnes i høyt kopiantall i bakteriene, mens promoteren er sterkt inhibert i fravær av arabinose. Kassetten for ekspresjon av integrasen med/uten eksisjonase kan transporteres av et plasmid, en fag eller til og med av oppfinnelsens plasmid i det ikke-terapeutiske området. Den kan innføres i vertscellens genom eller opprettholdes i replikativ form. Sike vertsceller er spesielt E. coli G6264 og E. coli G6289.1 henhold til en annen metode transporteres kassetten for ekspresjon av genet(-ene) av et plasmid eller en fag som brukes til transfeksjon eller infeksjon av cellekulturen etter vekstfasen. I dette tilfellet er det ikke nødvendig for genet å ha en form som muliggjør dets regulerte ekspresjon. Enhver konstitutiv promoter kan benyttes. DNAet kan også føres i kontakt med integrasen og eventuelt eksisjonasen in vitro, på en plasmid-preparasjon, ved direkte inkubasjon med proteinet.

Minisirkelen som dermed produseres, omfatter altså en ekspresjonskassett som inneholder et eller flere relevante gener som skal settes inn i mål-mikroorganismen, mangler et replikasjonsorigo og omfatter en sekvens attR generert av stedsspesifikk rekombinasjon mellom en attB- og en attP-sekvens, eller en sekvens attL generert av en stedsspesifikk rekombinasjon mellom en attB- og en attP-sekvens. Minisirkelen kan altså benyttes som en universell suicidalvektor for generstatning i enhver type mikroorganismer. Minisirkelen som transporterer et gen for erstatning flankert av homologe sekvenser og et antibiotisk resistensgen, vil lett integreres i et måldefinert sted i genomet til en hvilken som helst mikroorganisme ved homolog rekombinasjon, som vist i Figur 31. En annen eksisjonshendelse, som kan utløses av et annet seleksjonstrykk, kan så effektivt velge mikroorganismene som bare transporterer det nye, innsatte genet innen deres genom.

Foreliggende oppfinnelse gjelder altså en metode for genkonstruksjon av en mikroorganisme. Denne nye metoden kan brukes til å konstruere en hvilken som helst mikroorganisme uansett opprinnelse. Minisirkelen inneholder ikke noe replikasjonsorigo og kan dermed brukes universelt til generstatning i mikroorganismer uansett opprinnelse. Denne metoden utgjør et fordelaktig alternativ til bruken av M13-bakteriofagen ved dobbel homolog rekombinasjon i en mikroorganisme.

I henhold til en spesiell utforming av foreliggende oppfinnelse, omfatter minisirkelen en første velgbar markør, som feks. et antibiotisk resistensgen, som muliggjør valg for den første rekombinasjonshendelsen. Den foretrukne andre velgbare markøren er HI-genet eller det funksjonelle, slettede HI-genet. HI-genet eller dets funksjonelle variant er i stand til å gi sensitivitet til deoksycholat, som forklart i Boecke et al. (Mol. Gen. Genet., 186, 185-92,1982) og gjør det dermed mulig å foreta fravelging av den andre rekombinasjonshendelsen (Fig. 31).

Metoden går altså ut på å føre minisirkelen inn i mikroorganismen ved en transformasjonsmetode som er velkjent innen faget, og fortrinnsvis ved elektroporasjon, der minisirkelens integrasjonshendelse velges i en kultur som er utvidet med et antibiotikum eller under et annet seleksjonstrykk, og der den andre eksisjonshendelsen velges ved behandling med deoksycholat eller et annet egnet seleksjonstrykk.

Foreliggende oppfinnelse vil bli mer detaljert beskrevet ved hjelp av følgende ikke begrensende eksempler og referanseeksempler.

Kort beskrivelse av tegningene:

Figur 1: Funksjonell organisering av R6K området som er involvert i replikasjonen Figur 2: Organisering av de funksjonelle områdene til R6K-plasmidets pi-protein Figur 3: Gjengivelse av protokollen for innføring av pir- genet i E. coli XAC1-genomet

Figur 4: Konstruksjonsskjema for vektorene pxl2666, pxl2730 og pxl2754

Figur 5: Konstruksjon av pxl2774

Figur 6: Vekst- og produksjonskinetikk i en 2 liters fermentor

Figur 7: Vekst- og produksjonskinetikk i en 800 liters fermentor

Figur 8: Konstruksjon av pxl3056

Figur 9: Visualisering av aFGF-protein produsert av E. coli XAC- lpir 116 (pxl3056+PT7pol23) etter induksjon. Alle de denaturerte celleekstraktene plasseres på 12,5 %-SDS polyakrylamidgel. M: molekylær massemarkør (Biorad, Low range). Hvert bånd er identifisert ved hjelp av en pil og et tall som angir massen i kDalton. 1: XAC- lpir 116 (pxl3056 + pUC4K) ikke indusert; 2: XAC- lpir 116 (pxl3056 + pUC4K) indusert ved 42° C; 3: XAC- lpir 116 (pxl3056 + PT7pol23) klon 1, ikke indusert; 4: XAC- lpir 116 (pxl3056 + PT7pol23) klon 1, indusert ved 42° C; 5: XAC-1 pir 116 (pxl3056 + PT7pol23) klon 2, ikke indusert; 6: XAC-1 pir 116 (pxl3056 + PT7pol23) klon 2, indusert ved 42 °C; ti: 1 ug renset aFGF; t4: 4 ug renset aFGF. Figur 10: Konstruksjonsskjema for vektorene pxl3029, pxl3030 og pxl3179 eller NV1FGF. Figur 11: Skjematisk gjengivelse av de funksjonelle områdene til R6K pi-utløsningsproteiner. Figur 12: Nukleotidsekvenser og aminosyresekvenser av genet som omfatter mutasjonene pirlW og pir42. Figur 13: Konstruksjon avp/W76p/W2-suicidalvektor for homolog rekombinasjon. Figur 14: Skjematisk gjengivelse av PCR-produkter oppnådd ved amplifikasjon av området uidA::pirll6 +/- pir42. Figur 15: Agarose-gel-elektroforese som viser topologien til pCOR-plasmidet pXL3179 produsert i TEX1 eller TEXlpir42. Figur 16: Skjematisk gjengivelse av pXL3749-suicidal-plasmid som transporterer genet pirll6cop2l. Figur 17: Agarose-gel-elektroforese som viser plasmid-kopiantallet forpXL2979 når det produseres iE. coli- vertscellen TEXlcop2l (linje 1-4), iE. coli-verts cellen XAClpir (linje 5-8), i E. coli TEX1 (linje 9-12). Figur 18: Representasjon av kloningsstrategi for konstruksjonen av recA-suicidalvektor. Figur 19: Skjematisk gjengivelse av PCR-produktene oppnådd ved amplifikasjon av områder av E. coli TEX2-stammen. Figur 20: Agarose-gel-elektroforese som viser topologien til pCOR pXL3179 produsert i E. coli TEX2pir42 (linje B), i E. coli TEX\ pir42 (linje C), i E. coli TEX1 (linje D). Figur 21: Analyse av plasmid pXL3179 produsert ved gjæring i E. coli TEX2pir42. Figur 22: Fluorescensbasert prøve som viser at fluorescensen øker med plasmidets kopiantall.

Figur 23: Diagram over plasmider filtrert i den fluorescensbaserte prøven.

Figur 24: Diagram over plasmid pXL3830.

Figur 25: Agar-plate som viser fluorescensbasert filtrering for oppkopieringsmutanter generert av vilkårlig mutagenese. Figur 26: Evaluering av oppkopieringsmutanter identifisert av den fluorescensbaserte filtreringsmetoden. Figur 27: Diagram over strategien for evaluering av pirl 1 ^-mutanter som er satt inn i det bakterielle genomet. Figur 28: Evaluering av pXL3179-kopiantallet i forskjellige E. co//'-stammer med pirll6*- mutant. Figur 29: Konstruksjon av et plasmid som brukes til å generere minisirkelvektorer for homolog rekombinasjon i E. coli. Figur 30: Konstruksjon av en minisirkelvektor som brukes til å generere E. coli-stammer med pirll6*- rta\ tarit. Figur 31: Diagram over generstatning med homolog rekombinasjon ved hjelp av en minisirkelvektor. Figur 32: Demonstrasjon av dobbelt rekombinante kloner dyrket på et medium med natriumdeoksycholat.

Figur 33A og B: Resultater av kontroll-PCR på dobbelte rekombinanter.

1 - MATERIALER OG METODER

A) Materialer

1) Dyrkingsmedier

De komplette mediene LB, 2XTY og SOC samt minimalmedium M9 (Maniatis et al, 1989) er blitt anvendt. Agarmediene er blitt dannet ved tilsetning av 15 g Difco agar. Dessuten er disse mediene blitt beriket med antibiotika (ampicillin eller kanamycin) i en konsentrasjon på respektive 100 mg/l og 50 mg/l, i den grad dette var nødvendig. Kromogen-substratene X-Gal og X-Gluc ble brukt i en konsentrasjon på 40 mg/l.

2) E. cø//-stammer, plasmider og bakteriofag

De E. co//-stammene, plasmidene og bakteriofagene som brukes i eksemplene nedenfor, er identifisert separat.

B) Metoder

1) DN A- manipulasi on

Isoleringen av bakteriell DNA (plasmid og genomisk) og fag-DNA (replikativ form av Ml3), oppløsning med restriksjonsendonukleaser, ligatur av DNA-fragmenter, agarose-gel-elektroforese (TBE-buffer) og andre standardteknikker er blitt utprøvd i henhold til leverandørenes veiledninger for anvendelse av enzymer eller ved bruk av de metodene som er beskrevet i "Molecular Cloning: a Laboratory Manual"

(Maniatis et al, 1989).

De DNA-størrelsesmarkørene som er blitt anvendt i forbindelse med elektroforesene, er følgende: 1 kb-skala (BRL) for de lineære fragmentene og den supertvinnede DNA-markøren (Stratagene) for de ikke-oppløste plasmidene.

Sekvenseringen er blitt utført i henhold til Sanger-teknikken (Sanger et al, 1977), tilpasset den automatiserte metoden ved bruk av fluorescerende dideoksynukleotider og Taq DNA-polymerase (PRISM Ready Reaction DyeDideoxy Terminator Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems).

Oligodeoksynukleotidene som ble anvendt (angitt med "sekvens + nr.", se nedenfor) ble syntetisert på "Applied Biosystems 394 DNA/RNA Synthesizer" ved hjelp av fosforamid-metoden ved hjelp av alfa-cyanoetyl-beskyttende grupper (Sinha et al, 1984). Etter syntesen er de beskyttende gruppene blitt fjernet ved ammoniakkbehandling. To butanol-presipitasjoner gjør det mulig å rense og konsentrere oligonukleotidet (Sawadogo et al, 1991).

Sekvensen for oligodeoksynukleotidene som brukes til PCR- amplifikasion:

PCR-reaksjonene (Salki et al, 1985) ble utført under følgende forhold, med et samlet volum på 100 (il. Reaksionsblandin<g>en inneholder 150 ng genomisk DNA fra den stammen som skal undersøkes, 1 ug av hver av de 2 oligonukleotidprimere (24- mer), 10 ul buffer 10XPCR, med følgende sammensetning: "500 mM KC1,0,1 % gelatin, 20 mM MgCl2,100 mM Tris-HCl pH 7.5", og 2,5 enheter Taq DNA polymerase (Amplitaq Perkin-Elmer). PCR- forholdene på Perkin-Elmer Cetus DNA Thermal Cycler er som følger: 2 min. ved 91 °C, 30 suksessive denatureringssykluser (1 min ved 91 °C), hybridisasjon (2 min. ved 42 °C) og elongasjon (3 min. ved 72 °C), og 5 min ved 72 °C. De fremstilte produktene som eventuelt, men ikke nødvendigvis, er blitt oppløst av et restriksjonsenzym, analyseres ved agarose-gel-elektroforesen.

Analyse av de forskjellige plasmidartene ved hjelp av DNA topo-isomeraser ble foretatt på grunnlag av følgende metode: enzymene som renses i laboratoriet, inkuberes i 1 time ved 37 °C. Reaksjonsblandingene (samlet volum: 40 (il) har følgende komposisjon: 150 ng plasmid, 300 ng DNA topoisomerase I eller 150 ng E. coli DNA gyrase eller 160 ng S. aureus DNA topoisomerase IV og 20 ul særskilt buffer for hvert enkelt enzym. Sammensetningen av disse bufrene er angitt nedenfor:

For DNA topoisomerase I:

50 mM Tris-HCl pH 7.7,40 mM KC1,1 mM DTT, 100 ug/ml BSA, 3 mM MgCl2, 1 mM EDTA;

For DNA topoisomerase IV:

60 mM Tris-HCl pH 7.7, 6 mM MgCl2,

10 mM DTT, 100 ug/ml BSA, 1.5 mM ATP, 350 mM kalium glutamat;

For DNA gyrase:

50 mM Tris-HCl pH 7.7, 5 mM MgCl2,

1.5 mM ATP, 5 mM DTT, 100 ug/ml BSA, 20 mM KC1.

2) E . co//- transformasion

Denne ble gjennomført rutinemessig vis på grunnlag av TSB-metoden (Transformation and Storage Buffer), beskrevet av Chung og Miller (1988). For en stamme som f.eks. TG1 (Gibson et al, 1984) er transformasjonens effektivitetsgrad i størrelsesorden 10<5->10<6>transformanter per ug pUC4K (Vieira og Messing; 1982). I de tilfellene der en større effektivitetsgrad har vært påkrevd, er bakteriene blitt transformert ved hjelp av elektroporasjon i henhold til den metoden som er anbefalt av elektroporator-fabrikanten

(Biorad). Ved hjelp av denne metoden er det mulig å oppnå en effektivitetsgrad på 10<8->10<10>t<r>ansformanter per ug pUC4K.

3) Cellulær transfeksjon mediert av en kationisk lipofektant

Cellene som brukes, er NIH 3T3 musfibroblaster, som dagen før er blitt tilsådd i 24 brønnplater med en tetthet på 50 000 celler per brønn. Det anvendte dyrkingsmediet er et DMEM-medium som inneholder 4,5 g/l glukose, supplert med 10 % føtalt kalveserum og 1 % oppløsninger å 200 mM glutamin og antibiotika (5,10<3>ug/ml streptomycin, 5,10<3>ug/ml penicillin) (Gibco). Plasmid-DNAet (1 ug i 25 ul 9 °/oo NaCl) er blitt blandet, på volumenbasis, med en lipofektant suspensjon. Fire utvekslingsforhold (lipofektant-ladninger/DNA-ladninger) testes: 0, 3, 6, 9. Disse utvekslingsforholdene beregnes ved å ta i betraktning at 1 ug DNA-plasmid inneholder 3,1 nmol negative ladninger og at lipofektanten inneholder 3 positive ladninger per molekyl. Etter en kontakttid på 10 minutter der DNA/lipid-komplekset dannes, innføres 50 (il DNA-lipofektant-blanding i cellene i dyrkingsmedium uten serum (500 (il). Cellene ble på forhånd skylt 2 ganger med det samme medium. Hindring av transfeksjonen grunnet serum unngås på denne måten. Når inkubasjonstiden er utløpt (2 timer ved 37 C i CCvinkubatoren), tilføres medium 10 % føtalt kalveserum. Cellene inkuberer deretter på nytt i 24 timer.

4 ) Måling av eukaryotiske cellers luciferase- aktivitet

Denne utføres 24 timer etter transfeksjonen. Luciferasen katalyserer luciferin-oksyderingen i nærvær av ATP, Mg<2+>og O2, med samtidig produksjon av et foton. Den samlede mengden lysavgivelse, som måles av et luminometer, er proporsjonalt med prøvens luciferase-aktivitet. De anvendte reagentene leveres av Promega (Luciferase assay system), og den anbefalte metoden benyttes. Etter oppløsning av cellene elimineres den uoppløselige fraksjonen fra hvert ekstrakt ved sentrifugering. Analysen inneholder 5 (il supernatant, som eventuelt men ikke nødvendigvis er blitt oppløst i cellenes lysisbuffer.

5) Måling av celleekstraktenes proteinkonsentrasjon

Denne målingen utføres etter BCA-metoden (Pierce) ved anvendelse av bicinchonin-syre (Wiechelman et al, 1988). BSA-standardprøver utføres i lysisbufferen (se III-B-4). De prøvene som skal doseres, samt standardene, forbehandles på volumbasis med 0,1 M iodoacetamid/0,1 M Tris buffer, pH 8.2 i en time ved 37 C. Ved denne behandlingen unngås interferens fra reduksjonsmidlet (DTT) i lysisbufferen under prøven. Testmålingen foretas ved 562 nm.

EKSEMPEL 1: Konstruksjon av XAC- 1 pir og pirl 16 vertsstammer ved hjelp av homolog rekombinasjon

Den stammen som iverksettes, er E. cø//'-stammen XAC-1 (Normanly et al, 1980). ArgE- genet i denne stammen inneholder fortrinnsvis en mutasjon av glutamin-53 (CAG) i amberkodon (TAG) (Meinnel et al, 1992). ArgE- genet hører til arg£CÆ//-divergent-operonet, og koder for et enzym av typen arginin-biosyntese, N-acetylomithinase. XAC-1 kan altså ikke syntetisere argeninen og vokse i et minimalmedium. Denne auxotropien vil bli opphevd dersom stammen inneholder et plasmid som muliggjør ekspresjonen av en tRNA-suppressor. Det vil altså være mulig ved dyrking i minimalmedium å velge de bakteriene som inneholder et slikt plasmid. For å muliggjøre replikasjon av plasmider avledet av R6K har det vært nødvendig ved homolog rekombinasjon å innføre pir- genet i XAC-1-genomet. Pir-genet (villtype eller mutert) innføres ved uidA- lokus via utveksling mellom villtype-w/dL4-genet og en kopi avbrutt av pir- genet (eller pirl 16). UidA- genet koder for beta-glukuronidase, enzym for hydrolyse-beta-glukuronider. Dette genet kan inaktiveres uten problemer, da det ikke er av avgjørende betydning for veksten i de konvensjonelle syntetiske mediene, der beta-glukuronidene ikke benyttes. Dessuten kan beta-glukuronidase-aktiviteten følges ved hjelp av et kromogent substrat, X-Gluc, der hydrolysen frigjør et blått pigment.

1) Konstruksjon av en suicidalvektor som bærer kassetten " KmR - uidA::pir

( eller pirl 16 )

Vi har benyttet en strategi som involverer en enkelt vertsbakterie og minimerer genmodifiseringene knyttet til den relevante stammen. Fag M13mpl0 (Messing og Vieira; 1982) er blitt anvendt som suicidalvektor (Blum et al, 1989). En amber-mutasjon i gen II som er av avgjørende betydning for replikasjonen, reduserer vertsspektrum for denne Ml3 til stammer, som TG1 ( supE), som produserer en amber-suppressor tRNA; den vil altså ikke kunne replikere i E. ca//'.swp+-starnmer som f.eks. XAC-1.

3,8 kb Æa/ttHI-kassettene, som inneholder kanamycin-resistens-genet for Tn5 og _ uidA::pir eller pirl 16, ble opprenset henholdsvis fra M13wm34 og 33 (Metcalf et al, 1994). De ble klonet i M13mpl0 linearisert av BamHI. De rekombinante klonene ble utvalgt ved spredning på et LB-agarmedium med kanamycin, etter elektroporasjon av blandingsligaturen i TG1. De fremstilte klonenes ensartethet ble bekreftet ved analyse av restriksjonsprofilen og ved sekvensering av det området som svarer til p/Witf-mutasjonen.

2) Innføring av pir - eller pirl 1 6- gener i genomet til E . coli XAC- 1 ved homolog rekombinasjon

Strategien som ble anvendt og de forskjellige involverte hendelser fremgår av Figur 3.

a) Første rekombinasjonshendelse

XAC-1-stammen er blitt transformert ved elektroporasjon med 10, 100 eller 2000

ng av hver RF ( mpl0-_ uidA::pir eller pirl 16). En tredjedel av hver ekspresjonsblanding ble spredt på LB-bokser med kanamycin og inkubert natten over ved 37 C. MplO-_ uidA::pir eller pirl 16- fagene kan ikke replikere i stammen XAC-1 ( sup+). Markøren for kanamysin-resistens kan altså utelukkende fastholdes ved integrasjon i bakteriens genom via en homolog rekombinasjon med villtypekopien av uidA-genet. Resultatene av XAC-1-elektroporasj onene fremgår av Tabell 1. Transformasjonens effektivitetsgrad var i størrelsesorden 4,IO<9>transformanter per ug pUC4K.

Under forsøksbetingelsene stiger antallet integranter på en ikke-lineær måte i forhold til DNA-mengden. Grunnet transformasjonens effektivitetsgrad og RF-størrelsen (11,7 kbp) er det mulig å få et omtrentlig overblikk over rekombinasjonsgraden. Ved å betrakte punktet ved 100 ng når man frem til en rekombinasjonsfrekvens i størrelsesorden IO"<6>.

b) Annen rekombinasjonshendelse

Den andre rekombinasjonshendelsen velges deretter av stammenes resistens

overfor deoksycholat ("DocR ).

Med sikte på dette ble 5 integranter av hver konstruksjon oppdyrket i 2XTY-medium tilsatt 0,2 % natrium deoksycholat. Det fremkom to særskilte populasjoner. Visse kloner fremviste ganske synlig grumsethet etter ca. 8 timer ved 37° C (to kloner for konstruksjonen pir og tre kloner for konstruksjonen pirl 16). De andre klonene fremviste en tett kultur etter bare én natt ved 37° C. De var stort sett alle følsomme overfor kanamycin ("Km<s>"), som ventet. For hver av de undersøkte elektroporantene ble 50 Km -descendenter stripet ut på LB-medium tilsatt X-Gluc. Etter 48 timer ved 37° C var UidA+-klonene blekblå, mens de som var blitt erstattet med alleler (Eksempel 1, Figur 3), forble hvite på dette mediet (UidA). I Tabell 2 sammenfattes fenotypeanalysen av de genererte dobbelte rekombinantene. Mellom 18 og 30 % av de dobbelte rekombinantene ble erstattet av alleler.

3) Kontroll av . P/' r+- egenskapene for de stammene som ble dannet ved rekombinasjon

For å sikre Pir+-egenskapene for de stammer som ble dannet ved dobbelt rekombinasjon, har vi transformert tre kloner av hver konstruksjon med pBW30 (Metcalf et al, 1994). Da det ble dannet transformanter for alle de testede stammene, ble det mulig å påvise virkningen av pir- og pirll6- genene integrert i XAC-1-genomet. Under samme betingelser ble det ikke dannet noen transformanter med den parentale stammen XAC-1. Vi fortsatte med å undersøke to XAC-lp/r-kloner (B og C) og to XAC- lpir 116-\ donor (E og D). 4) Kontroll ved hjelp av PCR- amplifikasion av de stammer som ble dannet ved rekombinasjon.

For å bekrefte allel-erstatningen kontrollerte vi ved hjelp av PCR-amplifikasjon de genomiske områdene på begge sider av uidA- lokus. Hvert oligonukleotid-par består av et oligonukleotid som svarer til et internt pir- otaikde og av et annet oligonukleotid som svarer til et område som ligger nært inntil kromosomalt uidA, men ikke er inneholdt i det fragmentet som er blitt anvendt ved rekombinasjonen. Sekvensen for dette sistnevnte oligonukleotidet ble bestemt ved hjelp av sekvensen ECOUIDAA fra Genbank (adgangskode: Ml4641). Vi har altså vært i stand til å sjekke pir-genets nøyaktige posisjonering i bakteriens genom. De amplifiserte fragmentenes egenskaper med en størrelse som stemmer overens med den som man kunne forvente, ble bekreftet ved hjelp av oppløsning med Mlul.

EKSEMPEL 2: Konstruksjon av plasmidvektorer avledet av R6K som bærer seleksjonsmarkøren sup Phe

Vi konstruerte vektorer som inneholder ori y fra R6K og det kanamycin-resistente genet (pXL2666). Observasjonen av pXL2666 multimerer i stammen BW19610 { pirl 16) 5 (Metcalf et al, 1993) førte til at vi undersøkte effekten av cer-fragmentet fra ColEl på dette fenomenet. Vi innførte deretter ekspresjonskassetten med penylalanin-suppressoren tRNA ( sup Phe) på ori y Km<R->cer (pXL12730). Denne vektoren, pXL2760, danner grunnlag for konstruksjonen av vektorer til bruk innen genterapi. 1) Konstruksjon og analyse av vektorer med ori y fra R6K og det kanam<y>cin-resistente genet

a) Konstruksjoner

I det første konstruerte plasmidet, pXL2666, stammer det kanamycin-resistente

genet fra pUC4K (Vieira og Messing; 1982) og applikasjonsopprinnelsen, inneholdt i et 417 bp £cøÆ/-2?awHI-fragment, kommer fra suicidalvektoren pUT-T7pol (Herrero et al, 1990) (Figur 4). Overføringen av pXL2666 til stammene BW19094 og 19610 (Metcalf et al, 1994) har gjort det mulig å påvise at antallet av plasmider er klart økt i en pirl 16-stamme i forhold til det samme plasmidet i en />/'r-stamme. Elektroforeseanalysen av de ikke-oppløste plasmidene viser imidlertid at denne stigningen går hånd i hånd med fremkomsten av noen få multimeriske former. Dette fenomenet er høyst sannsynlig forbundet med en intramolekylær rekombinasjon mellom de mange kopiene av plasmidet. På denne måten konstruerte vi pXL2730 ved å klone cer-fragmentet av det naturlige E. coli-plasmidet, ColEl, som hadde vist seg å muliggjøre, i cis, oppløsningen av plasmid-dimere (Summers og Sherrat, 1984), i pXL2666. Det anvendte fragmentet svarer altså til et 382 bp /føall-fragment fra ColEl (Leung et al, 1985). Det inneholder et spesifikt intramolekylært rekombinasjonssted. For å kunne fungere er det bare nødvendig å benytte vertsproteiner, herunder rekombinasene XerC og XerD og ekstrafaktorene ArgR og PepA (Stirling et al, 1988, 1989; Colloms et al, 1990). For å sikre at de observerte virkningene rent faktisk skyldes cer-fragmentet, konstruerte vi også kontrollplasmidet pXL2754, der cer-fragmentet har en 165 bp-sletting. Det viste

seg at denne slettingen opphevet cer-påvirkningen på multimer-oppløsningen (Leung et al, 1985). De forskjellige fasene i kloningen som førte til konstruksjonen av disse plasmidene, fremgår av Figur 4.

b) Kvantitativ og kvalitativ analyse av plasmidartene

(i) Analyse ved agarose- gel- elektroforese

Elektroforeseanalysen av de forskjellige konstruerte plasmidene har gjort det mulig å vise forskjellige plasmidarter som er variable alt etter stammene som anvendes. Størrelsen av de ikke-oppløste plasmidene ble evaluert i forhold til en supertvunnet DNA-markør. I p/r-stammen (BW19094) er plasmidene pXL2666, pXL2754 og pXL2730 nesten utelukkende monomeriske. Båndene over hvert hovedbånd svarer til forskjellige, noe mindre supertvinnede topoisomer, slik det ble bekreftet av den profilen som ble observert etter DNA-gyrasepåvirkning på pXL2730.

Når det gjelder pirl 16- stammen (BW19610), er profilene annerledes: For plasmidene pXL2666 og pXL2754 kan man observere forskjellige arter fra monomer til multimerer (2,3 eller 4 enheter), da den hyppigste formen er dimeren. Etter oppløsning med EcoRI finner man kun det lineære plasmid-DNAet; disse plasmidartene svarer enten til plasmidmultimerer eller til forskjellige topoisomer. Da størrelsen på de formene som er fastsatt i henhold til supertvunnet DNA-markør, er et helprodukt av plasmidmonomerens størrelse, er det svært sannsynlig at det dreier seg om multimerer. Dannelsen av multimerer skyldes høyst sannsynlig p/rii<5-mutasjonen, selv om de to stammene BW19094 og BW19610 strengt tatt ikke er isogeniske (BW19610 er recA). Den profilen som oppnås med pXL2730, er annerledes: Selv om de multimetriske formene stadig er synlige, er den hyppigste formen den monomeriske formen. Cer-fragmentet kan altså bane vei for oppløsningen av plasmid-multimerene som vi har konstruert, uavhengig av recA, i BW19610.

(ii) Analyse etter behandling med DNA topoisomeraser

For å avvise hypotesen som går ut på at formene som er observert i de stammene som bærer pirl 16- allelen, er særlige topoisomerer, gjennomgikk hvert enkelt plasmids preparering DNA-topoisomerase. De forskjellige enzymenes aktiviteter under testbetingelsene er følgende: DNA-relaksasjon for E. coli DNA topoisomerase I, negativ supertvinning av relaksert DNA for E. coli DNA gyrase og frigjørelse av de sammenfiltrede DNAene og relaksasjon av supertvunnet DNA av S. aureus DNA topoisomerase IV. Påvirkningen fra DNA topoisomerase IV gjorde det mulig å påvise at plasmidformer med høy molekylvekt ikke er et resultat av sammenfiltringen av flere plasmidmolekyler - da ville de vært konvertert til monomeriske arter. Enzymets funksjonalitet ble naturligvis kontrollert på grunnlag av en kinetoplast-DNA-preparering med sammenfiltrede DNA-molekyler (ikke vist). Relaksasjonsaktiviteten er også synlig, da det dannes arter som emigrerer i mindre grad enn tilfellet er ved ubehandlet kontroll. DNA-gyrase-påvirkningen gjorde det mulig å konvertere de svakt relakserte topoisomene til de mer supertvinnede artene, ekstrahert fra bakterien (primært monomer eller dimer). Dessuten gjorde den det mulig å få bekreftet at de DNAene som er blitt fremstilt, hovedsakelig er i supertvunnet form. De behandlede prøvene gjør det mulig å bekrefte de tidligere resultatene når det gjelder de primære artene for hver enkelt konstruksjon. DNA topoisomerase I har ganske riktig relaksert DNA, men bare delvis. Dette kunne skyldes det faktum at de plasmider som er blitt undersøkt, kun inneholder noen få enkeltstrengede områder, som dette enzymet fortrinnsvis binder til (Roca, 1995).

2) Innføring av seleksjonsmarkøren sup Phe i pXL2730

Vi benyttet ekspresjonskassetten for det syntetiske suppressor-tRNA-genet (Phe)

(Kleina et al, 1990). Denne innførte penylalanin i den voksende polypeptid-kjeden som respons på et TAG-kodon. Dessuten muliggjør den produksjon i XAC-1 av et ArgE-protein som er tilstrekkelig aktivt til å danne basis for god vekst i et arginin-manglende medium, sup Phe er grunnleggende uttrykt på plasmidet pCT-2-F (Normanly et al, 1986) fra en syntetisk promoter som er avledet av promotersekvensen, Vipp, av genet E. coli Ipp. Nedstrøms dette genet stoppes transkripsjonen av operonets syntetiske terminator, E. coli rrnC, Tmc(Normanly et al, 1986). De forskjellige fasene i kloningen fremgår av Figur 5.

De forskjellige underkloningene ble gjennomført i XAC-1. tRNA-suppressor-ekspresjonskassettens funksjonalitet kontrolleres altså ved hjelp av denne stammens alfa-galactosidase-aktivitet, som utelukkende er foreliggende ved sletting av amber-kodonet til genet lacZungam- Den siste fasen består i innføring av sup Phe-ekspresjonskassetten i pXL2730. De resultatene som ble oppnådd med cer-fragmentet (B-l-6), førte til at vi valgte dette plasmidet fremfor pXL2666. Vi bevarte kanamycin-resistens-genet for å lette den etterfølgende kloningen, herunder særlig for å ha supplerende filtrering til rådighet under den endelige kloningsprosessen (tap av Km<R>).

EKSEMPEL 3: Validering av plasmidvektoren for applikasjoner innen genterapi ved transfeksjon av musefibroblaster

1) Konstruksjon av reportervektor pXL2774

For å kontrollere validiteten innen genterapi av systemet for produksjon av plasmid-DNA innførte vi et reportergen i pXL2760 som kan brukes i eukaryotiske celler. Vi benyttede genet lue som koder for Photinus ^yrafo-luciferasen, da bioluminescens-testmålingen er svært følsom og lineær over en stor skala, og den bakgrunnsstøyen som skyldes de eukaryotiske cellenes endogene aktivitet, er svært lav. £wc-genet kontrolleres av promoter-enhancer-sekvenser for et humant, tidlig utviklet cytomegalovirus-gen (CMV promoter) som gir mulighet for et høyt ekspresjonsnivå. Det finnes et ikke-translatert område i lue ' s 3'-ende som stammer fra virus SV40 med polyadenylasjon-signalet (poly(A)+). Etter en intermediær kloning som muliggjør en økning av de tilgjengelige restriksjonsstedene, føres "CMV promoter- luc- poly( A)+"-kassetten inn i den minimale vektoren ori y- cer- sup Phe (pXL2760) i stedet for markøren Km<R>. Det resulterende plasmidet er blitt kalt pXL2774. Alle fasene i kloningsprosessen fremgår av Figur 6. Ligaturblandingene ble transformert til XAC- lpirll6 ved hjelp av elektroporasjon. Inkubasjonen som muliggjør bakteriens ekspresjon av seleksjonsmarkører, foregår i et rikt medium (SOC-medium) - det var altså nødvendig å rense cellene to ganger med M9-medium før utleggingen. Dette gjorde det mulig å fjerne restmediet, som ville ha ført til en kulturbakgrunnsstøy på minimalmedium.

Mediet som ble valgt til utlegging av de elektroporerte cellene, er minimalmediet M9, som gjør det mulig å velge bakterier som uttrykker en tRNA-suppressor og altså nærværet av våre plasmider. Tilsetning av X-Gal gjør det mulig å visualisere tRNA-suppressorens ekspresjon ved hjelp av den blå fargen. Platene undersøkes etter ca. 20 timer ved 37° C. Fravær av kolonier på kontroll uten DNA forsikrer oss om at seleksjonen er korrekt selv ved tett dyrking. Alle de kloner som undersøkes ved restriksjon (8), inneholder faktisk et plasmid som svarer til den forventede profilen. Det plasmidet, pXL2774, som dermed ble konstruert, ble fremstilt på grunnlag av en klon, dyrket i en liter flytende M9-medium (ca. 18 timer ved 37° C), ved hjelp av en teknikk som bl.a. innebærer en ioneveksling (Promega kit, MegaPreps). Det ble samlet inn DNA i størrelsesorden 2 mg.

2) Analyse av reportervektor pXL2774, transfektert inn i pattedyrsceller

Vektor pXL2774's evne til å transfektere eukaryotiske celler og til å gi mulighet for luciferase-ekspresjon evalueres ved hjelp av transfeksjon inn i NIH 3T3 musefibroblaster. Den vektoren som er valgt som referanse, er plasmid pXL2622-vektoren (dette er plasmidet pGL2 fra Promega, der SV40-promoteren er blitt erstattet av CMV-promotoren), som inneholder den samme luciferase-ekspresjonskassetten som pXL2774-vektoren, men på et annet replikon. Dette er et 6,2 kb ColEl-derivat som inneholder ampicillin-resistens-genet. Dette plasmidet fungerer som en kontroll. Luciferase-aktivitetene (uttrykt i RLU eller relative luminescens-enheter) fremgår av Tabell 3.

De beste resultatene ble oppnådd med et forhold mellom "lipofectant-ladninger og DNA-ladninger" lik 6 - under disse betingelsene ser pXL2622 og pXL2774 ut til å være ekvivalente.

EKSEMPEL 4: Verifisering av suicidalvektorens karakter i E. coli i pCOR-plasmidene

Den ikke-replikative karakteren til pCOR-plasmider avledet av R6K ble bekreftet ved hjelp av et elektroporasjonsforsøk i JM109 E. coli (Yanisch-Perron et al., 1985) i plasmidene pUC4K (ori ColEI-KmR, (Vieira og Messing, 1982)) og pXL2730 (ori y fra R6K-KmR, se Eksempel 2). Vi benyttet elektroporatoren Biorad Gene Pulser, og de elektrokompetente JM109-cellene ble forbehandlet og anvendt i overensstemmelse med den metoden som anbefales av fabrikanten (Bacterial electro-transformation and pulse controller instruction manual, catalog number 165-2098).

De elektrotransformerte cellene ble utlagt på et LB-medium tilsatt kanamycin (50 mg/l) og inkubert natten over ved 37° C. De oppnådde resultatene fremgår av

tabellen nedenfor.

Disse resultatene viser at det finnes minst 5 registrerte forskjeller mellom effektivitetsgraden forbundet med transformasjonen av et ColEI-derivat (pUC4K) i forhold til transformasjonen av et R6K derivativ (pXL2730) i en stamme som ikke uttrykker pir- genet I en pir+-stamme, som f.eks. XAC- lpir 116, når effektivitetsgraden av elektrotransformasjonen av R6K-avledede plasmider normalt opp på eller overstiger 108 transformanter/ug plasmid.

EKSEMPEL 5: Produksjon av plasmid- DNA ved tett dyrking av E. coli- stamme XAC- lpirll6 ( pXL2774) : Fermenteringsprosess

5.1 Stammer:

Produksjon i XAC- lpirl 16E. coli (Eksempel 1) av et minimal plasmid, pXL2774 - dette plasmidet inneholder følgende elementer: ori R6K-cer-tRNAamsupPhe og en ekspresjonskassett fra luc-reportergenet under kontroll av CMV-promoteren (se Eksempel 3). Det er blitt utviklet en prosess for fremstilling av denne typen plasmider i store mengder.

5.2 Dyrkingsmedier og betingelser:

a) Vekstmedium:

Sammensetning av det anvendte definerte mediet for de inokulume kulturene (g/l): Na2HP046, KH2P043, NaCl 0,5, NH4CI1, NH4H2P043, glukose 5, MgS04.7H20 0,24, CaCl2.2H20 0,015, tiamin HC10,010.

Sammensetning av det anvendte komplekse mediet for fed-batch-kulturene (g/l): KH2P048, K2HP046,3, Na2HP041,7, (NH4)2S04 0,74, NFLiCl 0,12, gjærekstrakt 3, glukose 2, MgS04.7H20 2,4 g/l, CaCl2.2H20 0,015, tiamin 0,010, saltoppløsning (Fe, Mn, Co, Zn, Mo, Cu, B, Al).

Sammensetning av det definerte mediet for kulturer i fed-batch-medium som er identisk med det komplekse mediet, men der gjærekstraktet er erstattet av 2,5 g/l NFLtCl.

b) Betingelser for fed- batch dyrking:

Undersøkelser i 2 liters fermentorer (Setric France) med 1 liter medium ble foretatt

for å definere de optimale betingelsene for vekst og fremstilling av plasmid-DNA. Fermentoren ble inokulert med 80 ml-inokulum-kultur som ankom i starten av den stasjonære vekstfasen.

Under fermenteringen ble pH-verdien automatisk kontrollert og justert mellom 6,9 og 7,0 med 10 % (w/v) med vannholdig ammoniakk: Temperaturen ble fastholdt på 37° C, lufttilførselen ble regulert til 75 l/h (1,1 wm) ved et trykk på 0,2 bar, og det oppløste oksygenet ble justert til 40 % av luftmetningen ved hjelp av retroaksjon på blandingshastighet og om nødvendig ved tilføring av rent oksygen.

Alle parametere (pH, temperatur, blanding, OD, O2og CO2i de utstrømmende gassartene) ble innsamlet og utregnet ved hjelp av et HP3852-grensesnitt koblet til en Hewlett-Packard 9000.

Tilførselsmediets grunnkomposisjon inneholder følgende: 50 % karbonkilde, 0,7 % magnesiumsulfat, 0,02 % tiamin - det komplekse mediet ble tilsatt gjærekstrakt fortrinnsvis i en konsentrasjon på mellom 5 og 10 %.

For å tilpasse dyrkingsbetingelsene til 800 liters fermentorer ble det gjennomført produksjonssekvenser av to suksessive inokulume kulturer på laboratorienivå: inokulum I i en ristet Erlenmeyer-kolbe og inokulum II i en 2 liters fermentor (batch-dyrking), etterfulgt av fed-batch-dyrking i en 7 liters fermentor.

5.3. Resultater:

Forskjellige dyrkingsbetingelser ble undersøkt i komplekst medium, i definert medium og ved forskjellige vekstrater. Etter innledende batch-dyrking av bakteriestammen og konsumering av karbonkilden ble tilførselsmediet hver gang tilsatt fermentoren ved hjelp av en peristaltisk pumpe koblet til en forhåndsdefinert tilsetningsprofil. Denne profilen ble utledet av tidligere forsøk der hvor tilsetningsmengden var blitt kontrollert enten via oksygenoppløsningsgraden eller via en konstant vekstgrad.

For å kunne ekstrapolere 2 liters-fermenteringsbetingelsen til en 800 liters fermentor uten risiko for overoksidering av mediet, ble det maksimale oksygenbehovet i dyrkingens siste fase stilt inn på 2,5-3 mM/min. I denne forbindelse ble mikroorganismens vekstrate redusert i de tilfellene der det viste seg å være nødvendig, ved variasjon av den komplementære ladningens forsyningsgrad.

Som det fremgår av Tabell 4, ble det oppnådd svært gode resultater både i komplekst medium og i definert medium og både på laboratorienivå og i 800-liter-fermentoren - dessuten er plasmid DNAens vekst- og produksjonskinetikk fullt og helt sammenlignbare (se Figur 6 og Figur 7).

Følgende kan utledes av de globale resultatene:

- Fermentor kan endres fra en 2 liters til en 800 liters fermentor helt uten problemer, - Det forbrukte oksygenet er sterkt korrelert med den fremstilte biomassen (1,08 g CVg fremstilt biomasse),

- Plasmidet er stabilt i minst 50 generasjoner uten seleksjonstrykk,

- En høy biomasse, over 40 g tørre celler per liter, kan oppnås i et komplekst medium, - Plasmid DNA-produksjonen kommer opp på 100 mg supertvunnet DNA per liter medium, - Det er en svært god korrelasjon mellom DNA-produksjonen og biomassen: Produksjonen kan beregnes til 1 mg plasmid DNA/OD-enhet eller 2,7 mg plasmid DNA/g biomasse uansett fermenteringens varighet. - Anvendelsen av et definert medium gjør det også mulig å oppnå en høy biomasse (30 g tørre celler per liter) og høy plasmid DNA-produksjon (100 mg per liter) uten noe produksjonstap.

EKSEMPEL 6: Overføring av pXL2774 til animalske celler, in vitro og in vivo

6.1 In v/ Yro- overføring av pXL2774 til animalske celler Minimalplasmidet pXL2774's evne til å transfektere forskjellige cellelinjer ble testet in vitro på både humane celler og museceller. Plasmidet pXL2784 ble benyttet som kontroll. Dette inneholder den samme eukaryotiske ekspresjonskassetten (CMV promoter-luciferase-polyA) som pXL2774, men dette er et 6,4 kb ColEl-derivat som inneholder det genet som overfører kanamycin-resistens i E. coli.

Transfeksjonsbetingelsene var følgende:

D-l: Inokulasjon av cellene ved en tetthet på 100 000 celler per 2 cm<2>brønn (24 brønnplate) i DMEM-medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium) tilsatt 10 % føtalt kalveserum (FCS). D-3: Transfeksjon av cellene med en 10 ul transfeksjonsoppløsning som inneholder: 0,5 ug DNA, 150 mM NaCl, 5 % glukose og 3 nmol RPR120 535 lipofectant per ug DNA, i 250 ul kulturmedium, tilføyd eller ikke tilføyd 10 % FCS (føtalt kalveserum). Etter en inkubasjonstid på 2 timer erstattes mediet av 500 (il DMEM-medium tilsatt 10 % FCS.

D-4: Fornyelse av kulturmedium

D-5: Vasking av cellene med PBS etterfulgt av oppløsning med 100 (il Promega lysisbuffer (Promega Cell Lysis Buffer E153 A). Kontroll av luciferase-aktiviteten foretas i et Lumat LB 9501-luminometer (Berthold) på grunnlag av 10 (il lysat. Integreringsvarigheten er 10 sekunder. Den anvendte reagenten kommer fra Promega (Promega Luciferase Assay Substrate). Resultatene som er samlet i de følgende tabeller, er angitt i RLU (Relative Lights Units) per 10 (il lysat (gjennomsnittsmåling på 4 brønner). Variasjonskoeffisienten (VK) angis også.

Resultatene av transfeksjonene uten serum er angitt nedenfor.

Resultatene av transfeksjoner med serum (10 %) er angitt nedenfor:

Disse resultatene viser pXL2774-plasmidets evne til å transfektere, in vitro, forskjellige typer av celler på en effektiv måte, både museceller og humane celler. Z,wc-reportergenets ekspresjon gjør det mulig å vise at dette genets transfeksjonseffektivitet er minst på høyde med effektiviteten knyttet til et "standard" plasmid, avledet av ColEl som inneholder den samme luciferase-ekspresjonskassetten.

6.2 In v/ vQ- overføring av pXL2774 til dyr ( mus)

a) Modell 1: Nakent DNA i kranial skinnebenmuskel i mus

Nakent plasmid DNA, oppløst i "5 % glukose, 150 mM NaCl" injiseres i den

kraniale skinnebenmuskelen i OF 1-mus. Musklene fjernes 7 dager etter injeksjonen, hakkes i stykker, homogeniseres i 750 ul lysisbuffer (Promega Cell Ly sis Buffer El 53 A) og sentrifugeres så ved 20 000 x g i 10 minutter.

Kontroll av luciferase-aktiviteten foretas på grunnlag av 10 (il supernatant etter tilførsel av 50 (il reagent (Promega Luciferase Assay Substrate). Målingen foretatt i et Lumat LB9501 luminometer (Berthold). Integreringsvarigheten er 10 sekunder.

Resultatene er angitt i tabellen nedenfor.

Disse resultatene viser at et plasmid med betinget replikasjon, som pXL2774, er vel i stand til å transfektere muskelceller fra mus in vivo, og at dette gjøres med forholdsmessig - eller til og med overlegen - effektivitet sammenlignet med effektiviteten knyttet til et "standard" plasmid avledet av ColEl, som inneholder den samme luciferase-ekspresjonskassetten.

b) Modell 2: 3T3 HER2 tumormodell

Modellen er som følger:

- Typen sveitsisk/naken voksen mus av hunkjønn

- Eksperimentell tumor indusert etter injeksjon av 107 stk. 3T3 HER2-celler under huden i flanken. - Transfeksjonsblandingen injiseres 7 dager etter injeksjon av cellene. Injiserte oppløsninger: DNA oppløses først i bufferen. Etter tilsetning av alle produktene inneholder blandingen utover DNA, NaCl (150 mM) og 5 % D-glukose i vann eller 5 mM HEPES-buffer. - To dager etter injeksjonen blir tumorvevet fjernet, veid og deretter hakket i stykker og homogenisert i 750 (il lysisbuffer (Promega Cell Lysis Buffer E153 A). Etter sentrifugering (20 000 x g i 10 minutter) fjernes 10 (il supernatant, og det blir deretter mulig å evaluere luciferase-aktiviteten. Denne aktiviteten fastsettes ved måling av den samlede oppnådde lysavgivelsen etter tilførsel av 50 (il reagent (Promega Luciferase Assay Substrate) i et Lumat LB9501-luminometer (Berthold) med en integreringsvarighet på 10 sekunder.

Den resulterende aktiviteten er uttrykt i RLU (Relative Light Units) vurdert i hele tumor-lysis-supernatant.

Disse resultatene viser at et plasmid med betinget replikasjon som pXL2774 er i stand til å transfektere tumorceller fra mus in vivo, og at dette kan gjøres med forholdsmessig - til og med overlegen - effektivitet sammenlignet med effektiviteten knyttet til et "standard" plasmid, avledet av ColEl som inneholder den samme luciferase-ekspresjonskassetten.

Disse forskjellige forsøkene har gjort det mulig å påvise at plasmider med betinget replikasjon, og spesielt pXL2774, faktisk hadde tranfeksjonsegenskapene til animalske celler, som er av avgjørende betydning innen den genterapeutiske behandlingen. Mer nøyaktig ble følgende påvist: 1) pXL2774-plasmidets evne til effektiv in v/Yro-transfeksjon av forskjellige typer av celler: humane celler eller museceller, 2) pXL2774-plasmidets evne til in vz'vø-transfeksjon av musas muskel, 3) pXL2774 plasmidets evne til in vz'vø-transfeksjon av tumorceller innført i mus.

Forsøk med elektrotransformasjon, fermentering og transfeksjon gjorde det altså mulig å validere plasmider med betinget replikasjon som vektorer som kan benyttes innen den genterapeutiske behandlingen, ved å påvise: i) at de ikke replikerte på detekterbar måte i en E. coli-stamme som ikke uttrykker pir- genet (betinget replikasjonsorigo),

ii) at de kunne fremstilles i en mengde som er kompatibel med industriell fremstilling, i et definert medium som ikke inneholder antibiotika,

iii) at disse plasmidene kunne transfektere pattedyrsceller in vitro og særlig in vivo.

EKSEMPEL 7: In vitro- produksjon av rekombinante proteiner

7.1 Konstruksjon av ekspresjonsvektoren

For å vise at denne metoden kan anvendes, konstruerte vi en ekspresjonsvektor på grunnlag av de kriteriene som er beskrevet ovenfor (Eksempel 2 og 3). Denne pXL3056-vektoren inneholder: 1) Den bakterielle delen, som innbefatter betinget replikasjonsorigo (ori y), cer-fragmentet av ColEl og genet som sikrer seleksjon i bakteriene ( sup) 2) Ekspresjonskassetten, som er basert på systemet beskrevet av Studier (Studier et al., 1990), omfatter promoteren til gen 10 til bakteriofagen T7, /acO-operatoren, genet som koder for aFGF 154 ("acidic Fibroblast Growth Factor" eller "sur fibroblastvekstfaktor", form som inneholder 154 aminosyrer)

(Jaye et al., 1986), TF-terminatoren til bakteriofagen T7. Denne ekspresjonskassetten er identisk med kassetten på plasmid pXL2434 som er beskrevet i patent WO 96/08572.

Konstruksjonen av pXL3056-vektoren er illustrert i Figur 8. pXL2434-vektorens (1,1 kb) ÆcoRI-ÆgÆI-fragment, som inneholder aFGF-ekspresjonskassetten, er klonet i den betingede replikasjons vektoren pXL2979 (1,1 kb renset fragment) på BglYL og .EcøRI-stedene for å generere pXL3056.

pXL2979 dannes på grunnlag av en ligatur av 3 fragmenter: i) Accl- Xbal-fragmentet av pXL2730 (0,8 kb, som tilfører ori y og cer), ii) Narl- SaR fragmentet av pXL2755 (0,18 kb som tilfører sup Phe- genet), iii) Sall- Spel-fragmentet av pXL2660 (1,5 kb, som tilfører det kanamycin-resistente genet).

pXL2660 er et resultat av kloningen av Pstl-fragmentet av pUC4K på 1,2 kb (Vieira og Messing, 1982) i pMTL22 (Chambers et al, 1988) linearisert ved hjelp av Pstl.

7.2 Produksjon av ekspresjonsstammen

Plasmidet pXL3056 innføres ved transformasjon i XAC-l^/rii^-stammen. Denne stammen transformeres deretter ved hjelp av plasmid PT7pol23 (Mertens et al., 1995) ved 30° C. For å uttrykke det genet som har interesse, under T7 promoterens kontroll, må bakterien i sitt genom på et plasmid eller en bakteriofag inneholde en kassett for ekspresjon av RNA-polymerasen til T7-bakteriofagen. I det angitte eksemplet brukte vi plasmid PT7pol23, som er kompatibelt med R6K-derivater som pXL3056, og som muliggjør den temperatur-induktible ekspresjonen av RNA-polymerasen til bakteriofag T7. Man kan imidlertid også overveie lysogenitet av XAC-l/»/W75-stammen med lambda DE3 (Studier et al., 1990) for å beholde bare ett plasmid samt indusere produksjonen av T7 RNA polymerase ved hjelp av IPTG i stedet for temperaturen.

7.3 Ekspresjon av aFGF

XAC-lpir 116 stammen (pXL3056 + PT7pol23) dyrkes ved 30° C i M9 minimalmedium tilsatt 0,2 % casaminosyre (DIFCO) og kanamycin (25 ug/ml) med en optisk tetthet til 600 nm fra 0,6-1,0. Halvparten av kulturen plasseres deretter ved 42° C (induksjon av T7 RNA polymerase), mens den andre halvparten holdes ved 30° C (negativ kontroll). Det samme forsøket gjennomføres med stammen XAC- lpirll6 (pXL3056 + pUC4K), som utgjør en kontroll for en aFGF-ekspresjon uten nærvær av T7 RNA polymerase.

De genererte resultatene fremgår av Figur 9. De viser at produksjonen av aFGF er sammenlignbar med eller større enn produksjonen som ble oppnådd ved anvendelse av BL21(DE3)(pXL2434) (WO 96/08572), som klart viser potensialet for plasmider med betinget replikasjon til ekspresjonen av rekombinante proteiner in vitro, særlig i forbindelse med E. coli.

EKSEMPEL 8: Konstruksjon av en pCOR- vektor som uttrykker et p53- protein, villtype eller hybrid, eller det humane FGF1- proteinet

Dette eksemplet beskriver konstruksjonen av vektorer med betingede replikasjonsvektorer som i henhold til oppfinnelsen inneholder en nukleinsyre som koder for et p53-protein. Disse vektorene kan brukes for å gjenopprette en p53-type-aktivitet i manglende (muterte, slettede) celler, f.eks. særlig tumorceller.

Den eukaryotiske ekspresjonskassetten inneholder følgende elementer:

1) CMV "immediate early" promoter (posisjoner -522 til +72) etterfulgt av leader-sekvensen for tymidin kinase-genet av type I, virus herpes simplex (posisjon -60 til +1 av genet, med referanse til sekvensen beskrevet i artikkelen skrevet av McKnight, S.+L. (1980) Nucleic Acids Res. 8:5949-5964),

2a) En nukleinsyre som koder for villtype-p53-protein eller for en p53-variant, som beskrevet i søknaden PCTVFR 96/01111 (V325K-variant = V325 med en Kozak-sekvens med ATG)

2b) En nukleinsyre som koder for human FGFa eller FGF-1, beskrevet av Jaye M. (Sciences 1986; 233 (4763):451, amerikansk patent nr. 4,686,113, og europeisk patent nr. 259 475,

2c En nukleinsyre som koder for et fusjonsgen mellom sekresjonssignal for human fibroblast-interferon (Taniguchi et al.), og den naturlige avkuttede formen av human FGF-1 fra aminosyre 21-154, beskrevet av Jaye et al., og i amerikansk patent nr. 5,849,538.

3) PolyA polyadenylasjon-sekvensen for SV40.

Disse elementene ble plassert i form av et Ascl - Xbal fragment på pCOR-vektoren pXL2988 mellom stedene BssRJl og Spel . pXL-2988 vektoren er identisk med pXL2979-vektoren (Eksempel 7.1), bortsett fra nærværet av et ekstraelement, en sekvens som er i stand til å danne en DNA-trippelheliks som består av 17 ganger trinukleotid GAA plassert ved siden av y-replikasjonsorigoet.

De resulterende plasmidene ble kalt pXL3029, pXL3030, pXL3179 eller NV1FGF (Figur 10).

Funksjonaliteten til disse konstruksjonene ble verifisert in vitro på p53-SAOS2-celler under dyrking ved måling av transkripsjonsaktivator-aktiviteten for p53 eller p53superWT, eller ved å måle sekresjonen av FGF1, for eksempel ved hjelp av ELISA-eksprimenter, som er velkjent i faget.

EKSEMPEL 9: Konstruksjon av TEX 1 ( XAC1 pirl 16. endA~.traDI

E. coli XAC- lpirll6 inneholder et F'-episom, et sirkulært DNA-molekyl på ca. 100 kb, som bærer proB+ lacl373lacZuii8am. Mange mannlige E. coli-laboratoriestammer bærer en/raZ)36-mutasjon på sitt episom, men ingen mutasjon som berører F'- overføringsevnen, er blitt beskrevet for XAC-1./raD-genet er på 5'-enden til et av/ra-operonene (tra: transfer, overføring) og innkoder et membranprotein som er direkte involvert i DNA-overføring og -metabolisme (Frost et al., BBRC, 1994, 58:162-210). Et sentralfragment på 2 kb fra traD, som omfatter 92% av genet, ble erstattet med omegaelementet på 2 kb (Genbank-adgangskode M60473) fra pHP45£2 (Prentki og Krisen, 1984, Gene, 29:303-313) ved homolog rekombinasjon i XAC-\ pirll6 endA". Omega-elementet inneholder det antiobiotika-resistente genet aadA, flankert av korte, inverterte repetisjoner. Genet aadA innkoder aminoglycoside-3 adenyltransferase, og gir resistens til streptomycin og spectinomycin ("Sp<R>"). Omega-fragmentet ble benyttet fordi det avslutter RNA- og proteinsyntese på et tidlig tidspunkt - dette fører til inaktivering av hele traD-operonet. Denne nye pCOR-stammen XAC- lpir 116 endA" traDy. SpR ble kalt TEX1. Overføring av eventuelle residente plasmider, pCOR eller pUC, kunne ikke detekteres, da donoren var TEX1.

Den nye pCOR-vertsstammen TEX1 ble evaluert i fermenteringseksperimenter. Komplekse medier med gjærekstrakt ble brukt for fed-batch-fermentering med XACApirlW. pCOR-stabilitet (over 50 generasjoner) gjør det mulig å bruke et ikke-selektivt medium. Under disse forholdene produserte XAC-\ pirll6 over 40 g/l tørrcellevekt, og 100 mg/l av pCOR pXL2774 ble oppnådd fra 2-liter-fermentorer. pCOR-kopiantallet ble anslått til 400-500 kopier per celle, og raten av plasmid DNA-syntese var konstant under hele fermenteringen. Disse resultatene ble ekstrapolert til en 800-liters fermentor egnet for fabrikasjon. Fermenteringen ble også utført i fravær av gjærekstrakt eller annet råmateriale av animalsk opprinnelse. Lignende resultater (30 g/l tørrcellevekt og 100 mg/l plasmid-DNA) ble oppnådd med et definert medium i 2-literskulturer uten tap av produktivitet.

EKSEMPEL 10: Konstruksjon av XAC - lpirll6pir42 vertsstammer ved homolog rekombinasjon

1) Konstruksjon av en suicidalvektor som inneholder kassetten "KmR-uidA :pirll 6:pir42"

KmR- uidA::pirll6- ksLSsetten fra M13wm33 beskrevet i Eksempel 1 (Metcalf W. et al. Gene, 1994,138(1-2): p. 1-7), ble modifisert av stedsorientert mutagenese med PCR (QuickChange stedsorientert mutagenese-kit, Stratagene, La Jolla, CA) for å innføre/>/W2-mutasjonen i pirll6- genet. De forskjellige skrittene for kloning/mutagenese er beskrevet i Figur 13.

Oligonukleotidene som brukes til mutagenesen inneholdt/>/W2-mutasjonen sammen med en stille mutasjon som opprettet et C/al-sted for enkel angivelse av behandling av pir42 ved restriksjonsanalyse om nødvendig.

Følgende sens- og antisens-oligonukleotider benyttes:

Teknikken som brukes til å erstatte pirll6 med pirll6pir42 i genomet til E. coli pCOR-verts-TEXl var basert på teknikken til Blum et al. (J. Bacteriol. 1989,171, pp. 538-46). Den rekombinante bakteriofagen pXL3723 vist i Figur 13 er en suicidalvektor i alle E. cø//'-stammer av ikke-suppressor-type, fordi den har en ikke-sens-mutasjon i gen II for innkoding av M13-nickase, som hindrer viral genomreplikasj on.

Dobbeltrekombinasjon ble utført som beskrevet for konstruksjonen av XAC-] pirll6 (Eksempel 1, punkt 2). Kloner som har opplevd hendelser med dobbelt homolog rekombinasjon, ble filtrert av PCR for å lete etter nærvær av /?/W2-mutasjon i TEX 1-genomet. Genomisk DNA isolert fra kandidater til dobbelt rekombinasjon ble brukt som modell for PCR. Deretter ble det utført sekvensering på hvert unike, amplifiserte fragment -samtlige fragmenter hadde den forventede størrelsen. PCR-fragmentene er vist i Figur 14.

Følgende PCR-primere ble brukt:

Denne analysen viste at et av de seks dobbelte rekombinantene som ble testet, har gjennomgått allele-utvekslingen. Denne nye stammen, kalt TEXlpir42, ble så evaluert med hensyn til evne til å replisere pCOR-plasmider sammenlignet med den overordnede stammen TEX1.

2) Evaluering av TEX \ pir42

pCOR-plasmider ble transformert parallelt til TEX1 og TEX\ pir42 og dyrket natten over i 2 ml selektivt M9-medium. Deretter ble plasmid-DNAet ekstrahert med Wizard SV pluss minipreps-kit (Promega) for å evaluere det relative plasmidkopiantallet og topologien av pCOR-plasmider i begge stammer.

En dobbelt økning i kopiantallet ble oppnådd ved formering i TEXlpir42 transformert med pCOR-plasmidet pXL3516 (2.56 kb). For videre karakterisering av TEX\ pir42 ble kopiantallet og topologien til pCOR-plasmider som pXL3179 og pXL2774 evaluert med analyse av typen agarose-gel-elektroforese etter rensing i liten skala av plasmid-DNA (4-6 kloner/stamme). Kopiantallet ble evaluert på plasmider linearisert med ÆcoRI-restriksjonsenzym. Det ble foretatt en topologitest på ikke-oppløste plasmider, i fravær av ethidium bromide. Det resulterende agarose-gelet er gjengitt i Figur 15, og viser klart et høyere antall plasmidkopier når plasmid pXL3179 produseres i TEX\ pir42, enn ved produksjon i TEX1-stamme. Figur 15 illustrerer også topologien av plasmidet pXL3179, og viser en økning i plasmidkopiantallet, hovedsakelig i form av monomere, med få plasmider i form av multimere. Resultatene oppnådd med disse pCOR-plasmidene er også oppsummert i Tabell 5. Det relative kopiantallet ble beregnet i sammenligning med det samme plasmidet i TEX1. En 2-3 gangers økning i plasmidkopiantallet ble observert med plasmidene pXL3179 og 2774 produsert i TEX\ pir42.

EKSEMPEL 11: Komparative eksperimenter: Konstruksjon av TEXlcop2l ( XAC - \ endA ~ traD ~ pirll6cop21 )

1) Konstruksjon av TEXlcop21

TEXlcop21 -stammen ble konstruert på lignende måte som den beskrevet i Eksempel 10 for TEXlpir42. Følgende oligonukleotider brukt for å innføre cop21 i pirll6- genet ved orientert mutagenese var som følger: Sens-oligonukleotider:

cop21 -mutasjonen ble innført som et TCC-serinkodon i stedet for TCA-serinkodonet for å eliminere et //wc/III-restriksjonssted nær mutasjonen.

Modellen brukt for orientert mutagenese var pXL3395 (se Figur 13). Resultant-plasmidet kalt pXL3432 ble brukt til å konstruere suicidalvektoren Ml3 på lignende måte som vist for pir42 i Figur 13. Suicidalvektoren pXL3749 er vist i

Figur 16.

E. cø//'-klonene oppnådd etter homolog rekombinasjon med pXL3749 ble filtrert av PCR, og senere restriksjon meåHindBl og sekvensering for å overvåke cop21- og p/W/6-mutasjonene. Én klon av de seks dobbelte rekombinantene som ble testet, hadde gjennomgått generstatningen. Den resulterende stammen ble kalt TEXlcop21.

2) Evaluering av TEX \ cop21

TEXlcop21 ble transformert av forskjellige pCOR-plasmider, iberegnet pXL2979, en 2.5 kb KmR pCOR-vektor (Se Eksempel 7.1), og prøvd med hensyn til økt kopiantall ved gel-elektroforese. Et slikt eksperiment med pXL2979 er vist i Figur 17. Plasmid-DNA fra fire uavhengige kloner for hver stamme forberedt med Promega-miniprep-kit ble linearisert med EcoRI, gjennomgikk elektroforese på agarose-gel, og ble så farget med ethidium bromide. Hver prøve representerte en lignende mengde bakterier, målt med optisk tetthet ved 600 nm. Agarose-gel-elektroforesen oppnådd for pCOR-plasmidet pXL2979 produsert i E. coli TEXlcop2l, XAClpir, og TEX1 er gjengitt i Figur 17. Det fremgår klart at det ikke var noen økning i plasmidkopiantallet når plasmidene produseres i TEXlcop21-stammen sammenlignet med TEX1.

EKSEMPEL 12: Konstruksjon av TEX2pir42 ( XAC-] pirll6pir42 recA")

Først ble det konstruert et recA-derivat av TEX1. p/W2-mutasjonen ble så innført i den resulterende stammen kalt TEX2 for å generere TEX2pir42.

1) Konstruksjon av E. coli TEX2, et ravl-derivat av TEX1

Et slettet recA- gen som inneholder 3 translasjons-stoppkodoner (ett i hver ramme) på den tilsvarende 5'-enden ble oppnådd med PCR. Dette slettede recA-genet ble innført ved generstatning (Blum et al., J. Bacteriol, 1989, 171, pp. 538-46) i TEX 1-genomet. Konstruksjonen av suicidalvektoren for homolog rekombinasjon er vist i Figur 18.

PCR-primere brukt for amplifikasjonen av rec^-fra<g>menter vises i følgende Tabell 6:

Restriksjonsstedene tilføyd til ravl-sekvensen er understreket.

For å opprettholde RecA+-fenotypen som er nødvendig for at det skal skje homolog rekombinasjon, ble recv4-funksjonen gitt E. coli TEX1 med et plasmid som inneholder et heterologt recA- gen som kan fylle ut E. coli rec^l-mutanter, som f.eks. recA -genet til bakteriet Agrobacterium radiobacter, og en antibiotisk gen-resistens, som f.eks. ampicillin-resistensgenet. Etter generstatningen ble plasmidet eliminert fra den rekombinante stammen ved kulturoppløsning i ikke-selektivt medium (LB). Plasmidets fravær ble filtrert for tap av antibiotisk resistens.

Den resulterende stammen ble kalt TEX2. Generstatningen ble overvåket av PCR i

Figur 19. PCR-primere er beskrevet i følgende Tabell 7.

Den første primeren var basert på sekvensen til recA- geneX. Den andre var basert på en sekvens nær, men utenfor homologi-området i suicidalvektoren pXL3457 (øyeblikkelig 5' eller 3' av recA) for å sikre at amplifikasjonen bare kan skje på et genomisk fragment. Sekvensen av begge oligonukleotider ble valgt i henhold til E. cø//'-sekvensen, som omfatter recA- lokus (Genbank ECAE000354).

PCR-fragmentene oppnådd fra en recA- slettet stamme var kortere sammenlignet med de som ble oppnådd med en villtypestamme, gjengitt i følgende Tabell 8. Den oppnådde PCR-profilen var, som forventet og påvist, nærværet av et avkuttet recA-gen i genomet til TEX2. re& 4-fenotvpen (sensitivitet overfor UV-lys), samt fenotypiske karakteristikker til TEX2, ble kontrollert. De fenotypiske karakteristikkene til TEX2 var som forventet de samme som for TEX 1-stammen dvs. ara-, RifR, NalR, SpR, UidA-, Arg-, Km<s>Amp<s>).

B) Konstruksjon av E . coli TEK2pir42

En TEX2/?/W2-stamme ble konstruert for dobbelt homolog rekombinasjon, i henhold til strategien beskrevet i Eksempel 10, med det unntak at rekombinasjonen i TEX2 ble utført i nærvær av et plasmid som bærer et heterologt recA -gen som kan utfylle E. coli recA -mutanter for å opprettholde en røvl+-fenotype, som trengs for homolog rekombinasjon.

Generstatning ble overvåket ved restriksjonsanalyse av PCR-produktet oppløst med Clal (se Figur 14). Generstatning skjedde i to av de fire undersøkte dobbelte rekombinantklonene.

C) Evaluering av E. coli TEX2pir42

1) Evaluering ved plasmid- produksjon i laboratorieskala:

TEX2pir42 ble transformert av pCOR plasmid pXL3179 (2.4 kb). Produksjonen av pXL3179 i TEX2pir42 ble grundig undersøkt i laboratorieskala, med hensyn til formeringsmulighetene for forbedring av antallet plasmidkopier, dyrkingsbetingelsene og stabiliteten (antall generasjoner). Alle undersøkelser viste konsekvent 2-5 gangers økning av plasmidkopiantallet sammenlignet med produksjon av pXL3179 i TEX1 under samme betingelser. Plasmidkopiantallet ble så vurdert etter produksjonen av pXL3179 i TEX2pir42, og TEXlpir42 og TEX1 som komparative eksperimenter. I dette eksperimentet ble plasmider ekstrahert fra identisk bakteriell biomasse, basert på OD ved 600 nm, og analysert ved hjelp av agarose-gel-elektroforese. Gelen ble farget med ethidium bromide etter elektroforese. Agarose-gel-elektroforesen, som er gjengitt i Figur 20, viser klart at plasmid-multimeterne reduseres ved produksjon i TEX2pir42 i stedet for TEX\ pir42.

2) Evaluering i fermentorer:

Disse resultatene ble bekreftet i større skala i 7-liters fermentorer, som forklart nedenfor.

a) Sammensetning av fermenteringsmedier

Sammensetningen av mediet brukt til inoculum-kulturer var følgende: Na2HP046 g/l,

KH2PO43 g/l, NaCl 0,5 g/l, NH4CI1 g/l, NH4H2PO43 g/l, glukose 5 g/l, MgSO4,7H20 0,24 g/l, CaCl2,2H20 0,015 g/1, tiamin HC10,010 g/l.

Sammensetningen av mediet brukt til fed-batch-kulturen var følgende: KH2PO48 g/l, K2HPO46,3 g/l, Na2HP041,7 g/l, NH4CI 2,5 g/l, glukose 10 9/1, MgS04,7H20 2,6 g/l, tiamin 0,011 g/l, Biospumex36 antiskum 0,1 ml/l, saltblanding (se Tabell 9) 2,5 ml/l.

Tilførselsmediet hadde følgende sammensetning: 50% glukose, 0,7% magnesium, 0,02% tiamin-HCl, 1% Biospumex36 antiskum.

b) Fermenteringsparametere

En 7-liters fermentor med 3 liter fed-batch-medium ble inokulert med 1,2%

inoculumkultur. Inoculum ble preparert som følger: 250 ml av inoculummediet i en 2-liters kolbe ble inokulert med 0,25 ml av en frossen cellesuspensjon av E. coli-stammen TEX2pir42 (pXL3179).

Kolber ble inkubert i 24 timer ved 37° C og 220 omdr./min. Etter 24 timer ble forskjellige parametere målt: Restglukose: 0 g/l, ODeoonmvar 2,7 og pH 6,24. Under fermenteringen ble pH kontrollert og justert automatisk mellom 6,9 og 7 med NH3. Temperaturen ble opprettholdt på 37° C, og det oppløste oksygenet justert til 45% p02 ved retroaksjon på blandingshastigheten.

Etter den første batch-dyrkingen av bakteriestammen i ca. 17 timer og forbruk av karbonkilden (glukose), ble tilførselsmediet tilføyd. Glukose og syrer, som f.eks. lactat og acetat, ble opprettholdt i en konsentrasjon nær 0.

c) Resultater

Sluttresultatene er presentert i Tabell 10, sammenlignet med produksjon i en 100

liters fermentor medii, coli TEX1 (pXL3179) under optimaliserte forhold.

Når det gjelder XAC- lpirll6, var det ingen forskjell mellom 7- og 800-liters fermentorer med hensyn til plasmidantallet pXL3179 produsert i TEX1. pXL3179-plasmider produsert i en 7-liters fermentor med en E. coli TEK2pir42 ble sammenlignet med produksjon av pXL3179 i en 100-liters fermentor med E. coli TEX1, under optimaliserte forhold. Det ble påvist at det for XAC- lpir 116 (se Eksempel 5.3) er en stabil plasmid-produksjonsrate i en 7-liters, 100-liters eller 800-liters fermentor i TEX1.

Det fantes 3 ganger flere kopier av plasmid pXL3179 per bakterie i TEX2pir42, sammenlignet med TEX1.

Plasmider som tilsvarer de forskjellige tidspunktene for fermentering, ble ekstrahert fra den identiske bakterielle biomassen, basert på OD ved 600 nm, og analysert ved hjelp av agarose-gel-elektroforese. Figur 21 viser klart en økning i antallet plasmidkopier med fermenteringens varighet. Figur 21 viser topologien til pXL3179-plasmidet produsert i Opl32ES5 TEX2pir42, som var nesten utelukkende i monomerisk form.

Konklusjon: I henhold til foreliggende oppfinnelse viste E. cø//'-vertsstammen TEX2pir42 en uventet høy forbedring i antallet kopier av pCOR-plasmider, f.eks. pXL3179 - 2 til 5 ganger for TEX2pir42 sammenlignet med TEX1, i en laboratorieskala og i fermentorer. Videre, da plasmidkopiantallet ble vesentlig forbedret, oppviste plasmidene som dermed ble produsert, en monomerisk topologi, ikke bare på laboratorieskala, men også i større skala (7-liters fermentor), kompatibel med industriell produksjon.

EKSEMPEL 13: Nye oppkopieringsmutanter av pirl 16 identifisert med en ny fluorescensbasert filtreringsmetode

For å øke antallet pCOR-plasmidkopier i bakterielle vertsceller har vi mutagenisert pirll6- genet, som innkoder en oppkopiert mutert versjon av pir-<g>enet Til dags dato er alle mutasjoner som øker antallet kopier av R6K-deriverte plasmider, som f.eks. pCOR-utforminger, blitt funnet innen deres pir- gen.

Etter tilfeldig mutagenese ved PCR ble muterte pirlW- genei innført i en pCOR-vektor som inneholder cø&4-reportergenet, som er beskrevet nedenfor. Etter fluorescensbasert filtrering ble kopiantallet og topologien til det valgte mutantplasmidet evaluert. Vi oppnådde tre forskjellige mutanter av pirll6- genet som øker antallet plasmidkopier. Disse nye mutasjonene er ikke beskrevet tidligere.

En klassisk filtreringsmetode for oppkopieringsmutanter er basert på antiobiotika-resistens. Med denne metoden avhenger en vertsbakteries resistens overfor et antibiotisk stoff av kopiantallet til et antiobiotika-resistens-gen på et plasmid i cellen. Etter hvert som plasmidets kopiantall og dermed det antiobiotika-resistens-genet øker, øker også antibiotika-resistensnivået. Men denne metoden kunne ikke brukes på R6K-deriverte plasmider i vertsceller som inneholdt en p/W/tf-mutasjon grunnet et for høyt basiskopiantall (ca. 400 kopier/celle) til plasmidet i disse cellene. I samsvar med dette ble det utviklet en ny filtreringsmetode basert på fluorescens for å identifisere oppkopieringsmutasjoner av pirlW- geneX.

For denne nye metoden ble cobA- genet innført i en pCOR-vektor for å fremskaffe en enkel fremgangsmåte for å styre forbedring i plasmidkopiantallet. cobA- genet

ble oppnådd fra Pseudomonas denitriflcans (Crouzet et al, J. Bacteriol, 172:5968-79 (1990)). Det enkoder uroIII metyltransferase, et enzym av vitamin-B12-pathway som tilføyer to metylgrupper til urogen Ill-molekylet. Ved overekspresjon i E. coli fører cobA til akkumulasjonen av røde produkter under nært UV-lys. Ved eksponering med UV vises bakterielle kolonier som fører til overekspresjon av

dette genet, i fargen rosa til rødt. Vi testet dette genet for å bestemme om det kunne fungere som reporter-gen for plasmidkopiantallet i pCOR-systemet.

For å evaluere forholdet mellom plasmidkopiantallet og fluoresensnivået av transformerte bakterier utsatt for UV-lys ble det konstruert et kontrollplasmid (pXL3767) med cobA slettet av sin egen promoter (Fig. 22). Dette plasmidet ble transformert til tre forskjellige vertsstammer ( XACXpir, XAClpirll6 og TEXlpir42). Disse stammene ble valgt ut fra tidligere erfaringer, som viser at det gjennomsnittlige kopiantallet av et pCOR-plasmid i XAClpir er 1, det er ca. fem til ti ganger høyere i TEX1, og 15-30 ganger høyere i TEX\ pir42.

Rekombinante kolonier ble stripet ut på M9-minimalmedium, og utsatt for UV-lys på en transilluminator som vist i Figur 22. Vi observerte at kolonienes fluorescensintensiteten var positivt korrelatert med plasmidets kopiantall - XAClpirll6 oppviste høyere fluorescens enn XACpir, og TEXlpir42 oppviste høyere fluorescens enn XAClpirll6.

Resultatene vist i Fig. 22 viser at denne fluorescensbaserte prøvemetoden lett skjelner mellom de testede plasmidkopiantallene, særlig mellom plasmidets kopiantall fastslått i stammene TEX1 og TEXlpir42, dvs. at intensiteten av rød fluorescens observert i denne prøven øker med plasmidets pCOR-co&4-kopiantall.

Etter å ha demonstrert en positiv korrelasjon mellom fluorescens og cobA-kopiantallet konstruerte vi et plasmid der vi mutageniserte pirll6- gener for filtrering. Fire plasmider med forskjellige kombinasjoner av konstitutive moduler, som vist i Figur 23, ble konstruert og testet. Ett av disse plasmidene viste et klart forskjellig fluorescensnivå ved transformering til isogeniske pirl 16- og pirl 16pir42- stammer. Dette plasmidet, pXL3830, er vist i den relevante delen i

Fig. 24.

Kontrollplasmider ble brukt under filtrerings- og evalueringseksperimentene. Først ble det brukt et basisnivå-kontrollplasmid, pXL3830, med "villtype"-p/W/5 for å definere et basisfluoresesensnivå. Deretter ble pXL3795, som inneholder denne dobbelte pH/6-/?/W2-mutasjonen for økning av plasmidkopiantallet med 4-6 i sammenligning med pXL3830, brukt som en positiv kontroll.

Vilkårlig mutagenese ble foretatt på pirll6- genet med kitet Diversify PCR random mutagenesis (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, USA), Condition 1, som i gjennomsnitt innførte 2 mutasjoner per 1000 basispar. Et foreløpig eksperiment utført med "condition 1" har vist, ved sekvensering av 12 mutanter, at den faktiske mutasjonsraten var ca. 2 mutasjoner i pirl 16- genet. pirl 16- genet ble amplifisert som et EcoRl- Sstl- fragment, med oligonukleotider C8832 (5-CTTAACGGCTGACATGGGAATTC-3') (SEKVENS NR. 23) og C8833 (5'-CGATGGGCGAGCTCCACCG-3') (SEKVENS NR. 24). Etter oppløsning med EcoRl og Ss il ble det mutageniserte fragmentet med pirl! 6 klonet inn i pXL3830 i stedet for "villtype"-/?H/tf-genet.

Plasmider som inneholder mutagenisert pirl 16 (" pirll6*") ble transformert til E. co//-stamme XAC-1, parentalstamme i forhold til pCOR-verten XAClpirll6. Transformanter ble filtrert for økt fluorescens under UV-lys, og sammenlignet med XAC1 (pXL3830) og XAC1 (pXL3795)-kontroller. En duplisert plate ble ikke utsatt for UV-lys, for å minimere sekundære mutasjoner. En representativ filtreringsplate under UV-lys er vist i Fig. 25.

Følgende diagram oppsummerer resultatene av filtreringseksperimentet.

Evalueringen av de tre valgte mutantene er oppsummert i Fig. 26. Hver mutant viste en økning i kopiantallet sammenlignet med />/Wi<5-plasmidet. For mutantene 114C og 100B var plasmidet hovedsakelig i monomerisk form. Dette kunne være en fordel sammenlignet med et pirll6pir4 2- plasmid, som har et økt kopiantall og et høyt multimerinnhold, lik mutant 201C.

pirll6*- genet for hver mutant var sekvensiert. Hver klon inneholder en enkelt ikke-isokodant mutasjon i pirll60RF. Alle tre mutasjoner virker inn på C-terminus til pi-proteinet, som er involvert i DNA-binding. Ingen av disse mutasjonene er beskrevet tidligere.

Når de er detektert ved filtrering i et plasmidsystem, evalueres disse mutasjonene i et produksjonssystem, dvs. der pirll6*- geneX er innført i genomet til en E. coli pCOR-vertsstamme. Strategien for denne evalueringen er oppsummert i Fig. 27.

For denne evalueringen ble plasmid pXL3179 transformert til hver av de tre E. cø//'-stammene som bærer mutasjonene identifisert i Fig. 26, og plasmidkopiantall og topologi ble vurdert. Resultatene av disse eksperimentene er gjengitt i Fig. 28. Det ble observert at plasmidkopiantallet økte vesentlig i forhold til XAClpirll6 bare for 201C-mutanten.

EKSEMPEL 14: Minisirkel med M13 gen III som verktøy for integrering med homolog rekombinasjon i E . coli

1. Suicidalvektorer

Generstatning ved dobbelt homolog rekombinasjon i E. coli forutsetter bruk av en suicidalvektor. Disse vektorene er konstruert og produsert i en vert som kan replikere dem, og brukes deretter for rekombinasjon til kromosomet til en vert som ikke kan replikere dem.

Bakteriofagen Ml3 er et svært nyttig genetisk verktøy som kan brukes i rep-mutanter (Metcalf, W., W. Jiang, et al, Gene 138:1-7 (1994)) eller i ikke- suppressor-stammer av E. coli når Ml3 mp8 til 11 brukes (Blum, P. et al., L BacterioL. 171:538-46 (1989)).

Visse begrensninger med hensyn til konstruksjon, innsettingsstørrelse og ustabilitet inntrer ofte. Plasmider som bærer R6K y DNA-replikasjonsorigo er velkjente suicidalvektorer (Miller, V. og J. Mekalanos, J. BacterioL, 170:2575-83 (1988)), men de er ikke nyttige for modifisering av E. co//-stammer som uttrykker pi-proteinet, som muliggjør replikering av slike plasmider.

En universell suicidalvektor ble konstruert med en ny motseleksjonsmarkør og brukt til å konstruere E. co//-stammer der mutanter av pirl 16- genet ( pirl 16*) settes inn i et bakterielt genom ved homolog rekombinasjon. Strategien som her er presentert, er demonstrert for mutant 114C, men er også blitt brukt til å produsere stammer som bærer andre pirll6*- mutanter.

2. Motseleksjonsmarkør

Forskjellige markører kan brukes til å velge bakterier som har gjennomgått en annen rekombinasjonshendelse. Denne hendelsen fører til tapet av denne markøren, og i visse tilfeller til generstatning etter rekombinasjon mellom kromosomet og en suicidalvektor. For eksempel er SacB- genet fra Bacillus dødelig når bakteriene som uttrykker genet, spres på et medium som inneholder sukrose (Ried, J. L. og A. Collmer, Gene 57:239-46 (1987)). Ifølge et annet eksempel gir tetracyclin-resistensgenet sensitivitet til fusarsyre (Bochner, B. R., et al., J. BacterioL 143(2):926-3 (1980)). Infeksjonen av bakteriofagen M13 gir sensitivitet til detergent-deoksycholatet (Blum, P., et al., J. BacterioL 171:538-46 (1989)).

Grunnet en mangel på effektivitet i visse E. co//-strenger ble det utviklet en positiv seleksjonsmetode for dobbelte rekombinanter. Gen III fra bakteriofagen Ml3 ble evaluert som en motseleksjonsmarkør (counter-selectable marker). Dette genet innkoder en mindre virion-komponent ansvarlig for partiklenes infektivitet. Ved overekspresjon fra flerkopiplasmid pBR322, gir gen III deoksycholat-sensitivitet på cellene grunnet innsetting av gen HI-proteinet i bakterienes membran (Boeke, J. D. et al., Mol Gen Genet 186:185-92 (1982)). Ingen rapport genereres hvis dette genet kan brukes som en effektiv motseleksjonsmarkør og det foreligger som en enkelt kopi i genomet til E. coli. Derfor testet vi denne hypotesen med en minisirkel-suicidalvektor.

3. Amplifikasjon med PCR av den slettede versionen av gen III fra Ml3

For å redusere størrelsen på minisirkelvektoren som skal konstrueres, ble det valgt en slettet versjon av gen III (gen III') som fortsatt kan tilføre sensitivitet til deoksycholat (Boeke, J. D., P. Model, et al, Mol Gen Genet 186:185-92 (1982)). Den ble amplifisert ved PCR sammen med sin egen promoter fra M13mpl8 (Yanisch-Perron, C, J. Vieira, et al, Gene 33:103-19 (1985)) som et B<g>UI-XhoI-fragment (se Figur 29).

Det amplifiserte fragmentet ble klonet ved T-A-kloning i pGEMT-easy (Promega Corporation, Madison, WI, USA) for å generere pXL4230 (Fig. 29). Det ble fastslått at innsettingens nukleotidsekvens stemmer med den beskrevet i GenBank under adgangsnr. VB0018. pXL4230 tilfører sensitivitet til deoksycholat ved transformasjon i E. cø//'-stammen DH10B (Invitrogen), og angir at den fungerer som forventet.

4. Minisirkelbasert suicidalvektor

Da minisirkelplasmidet ikke inneholder noe replikasjonsorigo, kan et minisirkelplasmid brukes som suicidalvektor. Av denne grunn må en seleksjonsmarkør som f.eks. kanamycin-resistensgenet tilføyes for å selektere en første homolog rekombinasjonshendelse. For å motselektere bakterier som ikke har gjennomgått en annen rekombinasjonshendelse, ble III'-genet tilføyd til minisirkelvektoren. Konstruksjonen av plasmidet benyttet til å produsere minisirkel for rekombinasjon er vist i Fig. 29.

Minisirkelen genereres fra et plasmid, som f.eks. pXL4235, etter induksjon av bakteriofag-lambda-integrasen, som rekombinerer mellom attP og attB på plasmidet (Darquet, A. M et al.. GeneTher 4(12): 1341-9 (1997)). Denne rekombinasen uttrykkes under kontroll fra Pbadpå en arabinose-avhengig måte i E. co//-stammen G6264, som er beskrevet i det amerikanske søknaden nr. 09/981,803. Den resulterende minisirkelen inneholder attL, en TH (trippel-heliks)-dannende sekvens for rensing, kanamycinresistens-genet til seleksjonsmarkøren Tn903, motseleksjonsmarkørens gen III', og fragmentet som er relevant for homolog rekombinasjon, klonet på flerklonestedet til pXL4235 (Fig. 29).

For eksempel brukes konstruksjonene til å generere E. co//-stammer som uttrykker en oppkopieringsmutasjon av pirl 16, beskrevet i Fig. 30. Disse stammene kan brukes til å produsere pCOR-plasmider (Soubrier, F. et al., Gene Ther 6:1482-1488

(1999)). Da det ikke er noen homologi mellom pir og det bakterielle genomet, ble/>/Wi6<*->sekvenser innsatt i E. coli kromosomalt uidA- gen, som innkoder B-D-glukuronidase. Dette genet gir tilstrekkelig sekvenslikhet med E. co//-genomet til at det skal kunne skje en homolog rekombinasjon.

Følgende protokoll gjelder for rengjøring av minisirkel og rekombinasjon. Plasmid pXL4256 (Fig. 30) ble transformert til E. co//-stammen G6264 for å generere G6656. 50 ml LB-medium med tilsatt ampicillin (100 mg/l) ble inokulert med 0,5 ml av en G6656-kultur natten over, og inkubert ved 37° C, med risting på 200 omdr./min. til den optiske tettheten ved 600 nm nådde 0,7. Minisirkelproduksjonen ble indusert ved tilføyelse av 250 ul av en steril oppløsning av 10% arabinose til mediet. Etter 30 minutter ved 37 °C, 200 omdr./min. ble total plasmid-DNA ekstrahert med Wizard Plus Midipreps DNA Purification System (Promega Corporation, Madison WI, USA). 6 ug plasmid-DNA-preparasjon ble lastet i en 0,8% preparasjonsgel av agarose. En supertvunnet DNA-skala (Promega Corporation, Madison WI, USA) ble brukt som molekylær vektstandard. Etter elektroforese natten over på 50V, ble den supertvinnede minisirkelkonstruksjonen (5.1 kb) ekstrahert og renset fra gelen med et SV-gelrengjøringskit (Promega Corporation, Madison WI, USA). 5. Dobbelt homolog rekombinasjon med minisirkel 4256 ( uidA::pir ! 16 * minisirkel- suicidalvektor)

Rekombinasjonsskrittene for konstruksjon av stammene og de tilsvarende fenotypene er forklart i Fig. 31.

For den første rekombinasjonshendelsen (integrering) ble 0,2,1 og 5 ul renset minisirkel 4256 elektroporert i E. cø//-stammen XAC1 (Normanly, J. et al., Proe Nati Acad Sei USA 83:6548-52 (1986)), som er parentalstammen for pCOR-verter. Kanamycin-resistente kolonier ble oppnådd på LB Agar, tilsatt kanamycin (50 mg/l) etter inkubasjon natten over ved 37° C.

For å evaluere antallet kolonier som potensielt inneholder kontaminent, ikke-rekombinert pXL4256, ble 50 Km<R>kolonier stripet ut parallelt på LB Agar, tilsatt kanamycin eller ampicillin. Bare 4 av 50 kolonier var resistente overfor kanamycin og ampicillin, og viste seg, ved plasmid-restriksjonsanalyse, å inneholde ikke-rekombinert pXL4256. Dette betydde at 46 av 50 kolonier oppnådd med elektroporasjon faktisk var minisirkel-4256-integranter.

For den andre rekombinasjonshendelsen (eksisjon), ble alle 46 Km-integrantene isolert på ferskt preparerte LB Agar-plater med 1,5 % natrium deoksycholat ("Doc"; Sigma) og inkubert ved 37° C natten over. Bare noen få deoksycholat-resistente kolonier (DocR) (1-15) ble oppnådd for hver integrant, som vist i Fig. 32. Dette resultatet stemte med valget av en forholdsvis sjelden hendelse, som den andre rekombinasjonshendelsen. 100 Doc<R->kolonier oppnådd fra 15 integranter ble patch'et parallelt på LB Agar med 1,5% Doc og LB Agar pluss kanamycin for å filtrere med henblikk på Doc<R->og Km<s->dobbeltrekombinanter. 86 % av de filtrerte koloniene var Km<s>, noe som viser at de hadde mistet suicidalvektoren.

For å filtrere med henblikk på allele-erstatning, ble det kromosomale uidA- lokmtt amplifisert med PCR. Hvis allele-erstatning har skjedd, er størrelsen på det forventede PCR-fragmentet 1,3 kb. Fragmentstørrelsen som svarer til villtype-w/c£4-lokus, dvs. uten en integrert p/r//5*-mutasjon, er 0,85 kb. Resultatene presentert i Fig. 33-panel A angir at allele-erstatning har skjedd i 30 % av dobbeltrekombinantene. Dette ble bekreftet av fenotypisk analyse, da disse klonene også er UidA- (beta glukuronidase-) og genererer hvite kolonier på LB-agar tilsatt Xgluc.

Integriteten til det bakterielle genomet i området nær stedet for homolog rekombinasjon ble sjekket med PCR på to uavhengige rekombinanter. Den første primeren (seq6113 eller seq6115) var basert på sekvensen til pir-genet, og den andre (seq6112 eller seq6116) hadde en sekvens basert på en annen sekvens nær, men utenfor, homologi-området (øyeblikkelig 5' eller 3' av uidA). XAC1 DNA ble brukt som en negativ kontroll, mens XAClpirll6 eller TEX1 (Soubrier, F. et al, Gene Ther 6:1482-1488 (1999)) ble brukt som positive kontroller.

Følgende oligonukleotider ble brukt som PCR-primere:

Den forventede størrelsen på PCR-produktet er 0,83 kb med primerne sekv. 6112 og sekv. 6113, og 0,88 kb ved bruk av primerme sekv. 6114 og sekv. 6115. Resultatene fremgår av Figur 33-panel B. De to dobbeltrekombinantene oppnådd med minisirkelsuicidalvektoren viste forventet PCR-profil. Dette viser at dobbelt homolog rekombinasjon lett kan oppnås i E. coli med minisirkelplasmider som suicidalvektor, og M13-genet III' som en motseleksjonsmarkør. Denne generstatningsteknikken kan utføres universelt i alle mikroorganismers genetiske bakgrunn.

BIBLIOGRAFI

Alting-Mees, M. A., J. A. Sorge, og J. M. Short. 1992. Methods Enzymol. 216:483-495 Blum, R, D. Holzschu, H.S. Kwan, D. Riggs, og S. Artz. 1989. J. BacterioL 171:538-546.

Brosius, J. 1989. Methods Enzymol. 216:469^83.

Chambers, S. P., S. E. Prior, D. A. Barstow, ogN. P. Minton. 1988. Gene 68:139-149. Chung, C. T., og R. H. Miller. 1988. Nucleic Acids Res. 16:3580.

Colloms, S. D., P. Sykora, G. Szatmari, og D. J. Sherrat. 1990 J. BacterioL 172:6973-6980.

Darta, N., og P. Kontomichalou. 1965. Nature 208:239-241.

Dickely, F., D. Nilsson, E. B. Hansen, og E. Johansen. 1995. Mol. Microbiol. 15:839-847.

Filutowicz, M., S. Dellis, I. Levchenko, M. Urh, F. Wu, og D. York. 1994. Prog. in Nucleic Acid Res. og Mol. Biol. 48:239-273.

Gibson, T. J. 1984. Ph.D Thesis. University of Cambridge.

Greener, A., M. Filutowicz, M. McEachern, og D. Helsinki. 1990. Mol. Gen. Genet. 224:24-32.

Herrero, M., V. de Lorenzo, og K.N. Timmis. 1990. J. BacterioL 172:6557-6567. Hodgson, C. P. 1995. Bio/Technology 13:222-225.

Inuzuka, M., og Y. Wada 1985. EMBO J. 4:2301-2307.

Jaye, M. et al., (1986) Science 233:541-5

Kleina, L. G., J. M. Masson, J. Normanly, J. Abelson, og J. H. Miller. 1990. J. Mol. Biol. 213:705-717.

Kowalczykowski, S. C, og A. BL Eggleston. 1994. Annu. Rev. Biochem 63:9991-10043.

Leung, D. W., E. Chen, G. Cachianes, og D. V. Goeddel. 1985. DNA 4:351-355. Maniatis, T., E. F. Fritsch, og J. Sambrook. 1989. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.

Meinnel, T., E. Schmitt, Y. Mechulam, og S. Blanquet. 1992. J. BacterioL 174:2323-2331.

Mertens, N., E. Remant og W. Fiers. (1995) Bio/Technology 13:175-179

Messing, J., og J. Vieira. 1982. Gene 19:269-276.

Metcalf, W. W., W. Jiang, og B. L. Wanner. 1994. Gene 138:1-7.

Miller, V. L., og J. J. Mekalanos. 1988. J. BacterioL 170:2575-2583.

Normanly, J., J. M. Masson, L. G. Kleina, J. Abelson, og J. H. Miller. 1986. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83:6548-6552.

Normanly, J., L. G. Kleina, J. M. Masson, J. Abelson, og J. H. Miller. 1990. J. Mol. Biol. 213:719-726.

Roca, J. 1995. TIBS 20:156-160.

Saiki, R. K., S. Scharf, F. Faloona, K B. Mullis, G. T. Horn, H.A. Erlich, og N. Arnheim. 1985. Science 230:1350-1354.

Sanger, F., S. Nicklen, og A. R. Coulson. 1977. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74:5463-5467.

Sawadogo, M., og M. W. Van Dyke. 1991. Nucleic Acids Res. 19:674.

Scott, J. R. 1984. Microbiol. Rev. 48:1-23.

Simoes, D. A., M. Dal Jensen, E. Dreveton, M. O. Loret, S. Blanchin-Roland, J. L. Uribelarrea, og J. M. Masson. 1991. Ann. N.Y. Acad. Sei. 646:254-258.

Simon, R., U. Priefer, og A. Puhler. 1983. Bio/Technology 1:784-791.

Sinha, N. D., J. Biernat, J. McManus, og H. Koster. 1984. Nucleic Acids Res. 12:4539-4557.

Stirling, C. J. G. Stewart, og D. J. Sherrat. 1988. Mol. Gen. Genet. 214:80-84.

Stirling, C. J., S. D. Colloms, J. F. Collins, G. Szatmari, og D. J. Sherrat. 1989. EMBO J. 8:1623-1627.

Studier, F. W., A. H. Rosenberg., J. J. Dunn og J. W. Dubendorff (1990). Methods Enzymol 185:60-89.

Summers, D. K., og D. J. Sherrat. 1984. Cell 36:1097-1103.

Takahashi, K, Y. Sawasaki, J. Hata, K. Mukai og T. Goto. (1990) In Vitro Cell Dev. Biol. 26:265-74.

Vieira, J., og J. Messing. 1982. Gene 19:259-268.

Wiechelman, K., R. Braun, og J. Fitzpatrick. 1988. Anal. Biochem. 175:231-237. Yanisch-Perron, C. Vieira og J. Messing (1985) Gene 33:103-119 13.

Claims (14)

1. En prokaryot rekombinant vertscelle,karakterisertv e d at den omfatter et heterologt pir gen som koder for et pi protein og et ekstrakromosomalt DNA molekyl som omfatter et heterologt terapeutisk gen og et betinget replikasjonsorigo hvis funksjonalitet i den prokaryote rekombinante vertscellen forutsetter pi proteinet, hvori det heterologe pir genet omfatter minst en mutasjon i tillegg til pir 116 mutasjonen, nevnte ytterligere mutasjon blir valgt fra gruppen bestående av residue 130 fra pi proteinet som er en valin, residue 292 fra pi proteinet som er en metionin eller residue 117 fra pi proteinet som er en glycin.

2. Prokaryot rekombinant vertscelle i følge krav 1, hvori det heterologe pir genet er et plasmid.

3. Prokaryot rekombinant vertscelle i følge krav 1, hvori det heterologe pir genet finnes i genomet til vertcellen.

4. Prokaryote rekombinante vertscelle i følge et hvilket som helst av de foregående krav, hvori det betingede replikasjonsorigo er fra et bakterielt plasmid eller en bakteriofag.

5. Prokaryot rekombinant vertscelle i følge krav 4, der det betingede replikasjonsorigoet er R2K, R6K, RI, pSClOl, Rtsl, F, RSF1010, Pl, P4, lambda, Phi82 eller Phi80.

6. Prokaryot rekombinant vertscelle i følge krav 5, der det betingede replikasjonsorigoet er fra bakterielt plasmid R6K.

7. Prokaryot rekombinant vertscelle i følge krav 6, der replikasjonsorigoet omfatter SEQIDNO:l.

8. Prokaryot rekombinant vertscelle i følge et hvilket som helst av kravene 4-7, der plasmidet ytterligere omfatter et seleksjonsgen som ikke gir resistens mot et antibiotikum.

9. Prokaryot rekombinant vertscelle i følge krav 8, der seleksjonsgenet koder et suppressor transfer RNA for spesifikke kodon.

10. Prokaryot rekombinant vertscelle i følge krav 8, der seleksjonsgenet er en suppressor av et amber transfer RNA, og at verscellen ytterligere omfatter et gen som omfatter en amber mutasjon.

11. Prokaryot rekombinant vertscelle i følge et hvilket som helst av de foregående krav, der nevnte vertscelle mangler genet endA.

12. Prokaryot rekombinant vertscelle i følge et hvilket som helst av de foregående krav, der nevnte vertscelle mangler genet traD.

13. Prokaryot rekombinant vertscelle i følge et hvilket som helst av de foregående krav, der nevnte vertscelle ytterligere omfatter et mutert recA gen.

14. En fremgangsmåte for å produsere et plasmid,karakterisert vedat den omfatter et heterologt terapeutisk gen og et betinget replikasjonsorigo, som for å kunne fungere i en prokaryot vertscelle forutsetter et replikasjonsinitierende protein fremmed for vertscellen som omfatter: a) å dyrke den prokaryote rekombinante vertscellen i følge et hvilket som helst av de foregående krav under betingelser der plasmidet produseres, og b) å isolere plasmidet.