PT1549735E

PT1549735E - Molécula de adn de circular tendo uma origem de replicação condicional, processo para a sua preparação e a sua utilização em terapia génica

Info

Publication number: PT1549735E
Application number: PT03777599T
Authority: PT
Inventors: Fabienne Soubrier
Original assignee: Aventis Pharma Sa
Priority date: 2002-10-11
Filing date: 2003-10-14
Publication date: 2011-11-30
Also published as: JP4750203B2; ATE521695T1; NO20052276D0; ZA200503039B; EP1549735B1; ES2372599T3; AU2009201405A1; US20090252713A1; JP2006502714A; CN1717476A; NO333932B1; US7807444B2; CN101182534B; KR20050084847A; US20070141708A2; HK1082761B; IL167706A; WO2004033664A3; NO20052276L; HK1086297A1

Description

DESCRIÇÃO

"MOLÉCULA DE ADN DE CIRCULAR TENDO UMA ORIGEM DE REPLICAÇÃO CONDICIONAL, PROCESSO PARA A SUA PREPARAÇÃO E A SUA UTILIZAÇÃO EM TERAPIA GENICA" A presente invenção refere-se a uma nova molécula de ADN de replicação condicional que pode ser utilizada em terapia génica ou para a produção de proteínas recombinantes. As novas moléculas de ADN de acordo com a presente invenção são aqui, de seguida, designadas pCOR™. A terapia génica consiste na correcção de uma deficiência ou de uma anomalia pela introdução de informação genética no orgão ou célula afectados. Esta informação pode ser introduzida in vitro numa célula extraída do órgão e depois reinjectada no organismo ou in vivo, directamente no tecido alvo. Como uma molécula de elevado peso molecular e de carga negativa, o ADN tem dificuldade a atravessar espontaneamente membranas celulares fosfolipídicas. São consequentemente utilizados vários vectores para permitir a realização da transferência génica: vectores virais, por um lado, e vectores químicos e/ou bioquímicos naturais ou sintéticos, por outro lado.

Os vectores virais (retrovírus, adenovírus, vírus adeno-associados, etc.) são muito eficazes, em particular, para atravessar membranas, mas apresentam alguns riscos, tais como patogenicidade, recombinação, replicação e imunogenicidade. 1

Os vectores químicos e/ou bioquímicos permitem que estes riscos sejam evitados (para revisões, ver Behr, 1993, Cotten e Wagner 1993) . Estes são, por exemplo, catiões (fosfato de cálcio, DEAE-dextrano, etc.) que actuam por formação de precipitados com o ADN que podem ser "fagocitados" pelas células. Estes podem ser também lipossomas, nos quais o ADN é incorporado e que se fundem com a membrana plasmática. Os vectores de transferência génica sintéticos são geralmente lípidos ou polímeros catiónicos que complexam o ADN e formam com este uma partícula contendo cargas superficiais positivas. Como ilustrações de vectores deste tipo, pode ser feita referência, em particular, a dioctadecilamidoglicilespermina (DOGS, Transfectam™) ou N-[1-(2,3-dioleiloxil)propil]-N,N,N-trimetilamónio (DOTMA, Lipofectin™).

No entanto, a utilização de vectores químicos e/ou bioquímicos ou ADN nu implica a possibilidade de produzir grandes quantidades de ADN de pureza farmacológica. A razão para isto é que nas técnicas de terapia génica, o produto medicinal consistir no próprio ADN e ser essencial ter capacidade de produzir ADN que tem propriedades que são adequadas para utilização terapêutica no homem, em quantidades adequadas.

No caso da vectorologia não-viral, os vectores utilizados são plasmideos da origem bacteriana. Os plasmídeos geralmente utilizados em terapia génica contêm (i) uma origem de replicação, (ii) um gene marcador tal como um gene da resistência a um antibiótico (canamicina, ampicilina, etc.) e (iii) um ou mais transgenes com sequências necessárias para a sua expressão (intensificador(es), promotor(es), sequências de poliadenilação, etc.). No entanto, a tecnologia actualmente disponível não é completamente satisfatória. 2

Por um lado, permanece o risco da disseminação no organismo. Assim, uma bactéria que esteja presente no organismo, numa frequência baixa, pode receber este plasmideo. Existe uma maior probabilidade disto ocorrer, se este envolver um tratamento de terapia génica in vivo, em que o ADN pode ser disseminado no organismo do doente e pode entrar em contacto com bactérias que infectam este doente ou bactérias da flora comensal. Se a bactéria que recebe o plasmideo for uma enterobactéria, tal como E. coli, este plasmideo pode ser replicado. Esse evento leva então à disseminação do gene terapêutico. Na medida que os genes terapêuticos utilizados em tratamentos de terapia génica podem codificar, por exemplo, para uma linfocina, um factor de crescimento, um anti-oncogene ou uma proteína cuja função seja deficiente no hospedeiro e que permita assim corrigir um defeito genético, a disseminação de alguns destes genes pode ter efeitos imprevisíveis e preocupantes (por exemplo, se uma bactéria patogénica adquirir um gene do factor de crescimento humano).

Por outro lado, os plasmídeos geralmente utilizados em terapia génica não-viral também possuem um marcador de resistência a um antibiótico (ampicilina, canamicina, etc.). A bactéria que adquire esse plasmideo tem consequentemente uma vantagem selectiva inegável uma vez que qualquer terapia com antibiótico, utilizando um antibiótico da mesma família do que a que selecciona o gene de resistência do plasmideo, irá originar a selecção do plasmideo em questão. No que a isto respeita, a ampicilina pertence às α-lactamas, o qual é a família de antibióticos mais frequentemente utilizada no mundo. A utilização em bactérias de marcadores de selecção que não sejam genes de resistência a antibióticos irá ser assim particularmente vantajosa. Isto irá evitar a selecção de 3 bactérias que possa ter recebido um plasmideo contendo um desses marcadores. 0 documento WO9710343 divulga a estirpe XAC-1 pirll6 (ara, Δ (lac-proB) xlll, gyrA, argEam, rpoB, thi, uidA (AMlul) : :pirll6/F' [proB + lac1373 lacZull8am] ) . SOUBRIER et al. (GENE THERAPY, vol. 6, 1999, 1482-1488) e CARRIÈRE et al. (S.T.P. PH ARMA SCIENCES, vol. 11, n° 1, 2001, 1-6), ambos divulgam a estirpe XAC pirllô assim como um derivado traD da referida estirpe. MIRON ALEXANDER et ai. (PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, vol. 91, n° 14, 1994, 6438-6442) divulga a caracterização de várias mutações pir, incluindo pir 42, mas não divulga, nem sugere, a produção de mutantes duplos e nem a sua utilização para aumentar o número de cópias. É assim particularmente importante procurar limitar a disseminação de genes terapêuticos e genes de resistência tanto quanto possível. A invenção refere-se à reivindicação 1

As moléculas de ADN têm a vantagem de remover os riscos associados à disseminação do plasmideo, tais como (1) replicação e disseminação que podem originar a sobreexpressão descontrolada do gene terapêutico, (2) disseminação e expressão de genes de resistência. A informação genética contida nas moléculas de ADN de acordo com a invenção compreende efectivamente o(s) gene(s) terapêutico(s) e os sinais para a regulação da sua expressão, 4 uma origem de replicação condicional funcional que limita significativamente a gama de células hospedeiras deste plasmideo, um marcador de selecção de tamanho reduzido que é, de um modo preferido, diferente de um gene que confere resistência a um antibiótico e, quando adequado, um fragmento de ADN que permita a resolução dos multimeros do plasmideo. A probabilidade destas moléculas (e consequentemente a informação genética que estas contêm) serem transferidas para um microrganismo e serem mantidas de forma estável, é muito limitada.

Finalmente, os vectores de acordo com a invenção, também designados miniplasmídeos devido à sua estrutura circular, ao seu tamanho reduzido e à sua forma super-enrolada, têm as vantagens adicionais seguintes: devido ao seu tamanho que é reduzido em comparação com os plasmideos derivados de ColEl utilizados convencionalmente, as moléculas de ADN de acordo com a invenção têm potencialmente melhor biodisponibilidade in vivo e as moléculas de ADN ou pCOR mantêm-se sob uma forma extracromossómica estável nas células hospedeiras procariotas ou eucariotas que não contêm a proteina iniciadora. Em particular, estes têm capacidades melhoradas de penetração e distribuição celular. Assim, é reconhecido que o coeficiente de difusão em tecidos é inversamente proporcional ao peso molecular (Jain, 1987) . De um modo semelhante na célula, as moléculas com peso molecular elevado têm uma permeabilidade mais baixa através da membrana plasmática. Além disso, para o plasmideo passar para o interior do núcleo, o que é essencial para a sua expressão, o peso molecular elevado é também uma desvantagem, impondo os poros nucleares, um limite de tamanho para a difusão para o núcleo (Landford et al. , 1986) . A redução em tamanho das partes não-terapêuticas da molécula de ADN (a origem de replicação e o gene de selecção em particular) de acordo com a invenção permite 5 também reduzir o tamanho das moléculas de ADN. A parte que permite a replicação e a selecção deste plasmideo na bactéria (1 kb) é reduzida por um factor de 3, contando, por exemplo, 3 kb para a parte do vector da origem de replicação e do marcador de resistência. Esta redução (i) no peso molecular e (ii) na carga negativa, confere biodisponibilidade tecidular, celular e nuclear e difusão às moléculas da invenção melhoradas.

Mais precisamente, a presente invenção refere-se a uma molécula de ADN circular, que é útil em terapia génica, compreendendo essa molécula, pelo menos, uma sequência de ácido nucleico de interesse, caracterizada por a região que permite a sua replicação compreender uma origem de replicação cuja funcionalidade numa célula hospedeira requer a presença de, pelo menos, uma proteína especifica que seja exógena à referida célula hospedeira.

Esta molécula de ADN pode estar na forma de cadeia simples ou dupla e possui vantajosamente uma forma super-enrolada.

Para os objectivos da presente invenção, as células hospedeiras utilizadas podem ser de várias origens. Estas podem ser células eucariotas ou procariotas. De acordo com uma forma de realização preferida da invenção, estas são células procariotas. A replicação de plasmídeos bacterianos requer convencionalmente a presença de, pelo menos, uma proteína, o qual é codificada pela célula hospedeira, do tipo polimerase de ARN, ARNase, polimerase de ADN, etc. Pelas razões já explicadas acima, não é possível superar completamente, com este tipo de replicação, qualquer risco possível de disseminação no organismo 6 tratado. Vantajosamente, a funcionalidade da origem de replicação da molécula de ADN, de acordo com a invenção, requer a presença de uma proteína específica que seja exógena às células hospedeiras. 0 significado desta característica é reduzir o espectro de hospedeiro do plasmídeo reivindicado a estirpes específicas que expressem esta proteína iniciadora. A molécula de ADN desenvolvida dentro do contexto da presente invenção possui assim, vantajosamente, uma designada origem de replicação condicional. A origem de replicação condicional utilizada de acordo com presente invenção, pode originar de plasmídeos ou de bacteriófagos que partilham as características seguintes: estes contêm na sua origem de replicação sequências de replicação ou iterões e estes codificam, pelo menos, uma proteína de iniciação da replicação (Rep) que é específica destes. A título de exemplo, pode ser feita referência aos seguintes de replicação condicional dos sistemas plasmídeos e bacteriófagos: plasmideo ou bacteriófago proteína iniciadora especifica RK2 (Stalker et al., 1981) Trf A RI (Ryder et al., 1981) RepA pSClOl (Vocke e Bastia, 1983) RepA F (Murotsu et al., 1981) proteína E Rtsl (Itoh et al., 1982,1987) RepA RSF1010 (Miao et al., 1995) RepC PI (Abeles et al., 1984) RepA P4 (Flensburg e Calendar, 1987) proteína alfa lambda (Moore et al., 1981) proteína 0 phi 82 (Moore et al., 1981) proteína 0 de phi 82 phi 80 proteína 0 de phi 80 7

De acordo com uma forma de realização preferida da invenção, a origem de replicação utilizada nas moléculas de ADN reivindicadas é derivada de um plasmídeo de E. coli natural designado como R6K.

As funções de replicação de R6K são agrupadas em conjunto num fragmento de ADN com 5,5 kpb (Figura 1) compreendendo 3 origens de replicação α, β e γ (γ e a proporcionando 90% da replicação) e um operão codificando para a proteína Π iniciadora da replicação e a proteína Bis. A quantidade mínima de informação genética necessária para manter este plasmídeo no seu número característico de cópias (15 cópias por genoma) é contida em dois elementos: os 400 pb de ori γ e o gene pir, cujo produto é a proteína iniciadora Π. A ori γ pode ser dividida em duas partes funcionais: a parte principal e o elemento activador (Figura 1) . A parte principal, que é essencial para a replicação, contém os iterões (7 repetições directas de 22 pb) ao qual a proteína Π representada na SEQ ID N° 1 fica ligada e segmentos flanqueadores, que são alvos das proteínas do hospedeiro (IHF, DnaA).

De acordo com um modo preferido da invenção, a origem de replicação do vector reivindicado consiste totalmente ou parcialmente nesta origem γ de replicação do plasmídeo R6K e de um modo mais preferido, totalmente ou parcialmente na SEQ ID N° 1 ou num dos seus derivados. A origem de replicação descrita acima, a qual tem a vantagem de ser de um tamanho muito limitado, é funcional apenas na presença de uma proteína iniciadora específica, proteína Pi, produzida pelo gene pir (SEQ ID N° 2) . Uma vez que esta proteína pode actuar em trans, é possível dissociar fisicamente a ori gama do gene pir, a qual pode ser introduzida no genoma da célula que é seleccionada como o hospedeiro específico destes plasmídeos. As mutações em Π podem alterar as suas funções inibidoras (Inuzuka e Wada, 1985) e originar um aumento no número de cópias dos derivados R6K, até mais de 10 vezes o número inicial de cópias. Estas substituições podem ser dentro de um domínio de 40 aminoácidos que, consequentemente, parece ser responsável pelo controlo por Π do número (Figura 2) de cópias de plasmídeo ou em outras regiões da proteína Π.

De acordo com uma forma de realização vantajosa da presente invenção, a proteína Π, expressa na célula hospedeira, resulta da expressão do gene representado na SEQ ID N° 2 ou de um dos seus derivados como definido acima e, mais particularmente, do gene pir 116 que compreende uma mutação quando comparado com o gene pir. Esta mutação corresponde à substituição de uma prolina por uma leucina na posição 106 a partir do codão de iniciação. Neste contexto, o número de cópias dos derivados R6K é cerca de 250 cópias por genoma.

Para os objectivos da presente invenção, o termo derivado designa que qualquer sequência que difere da sequência considerada, obtida por uma ou mais modificações de natureza genética e/ou química, assim como qualquer sequência que hibride com estas sequências ou os seus fragmentos e cujo produto possui a actividade indicada no que respeita à proteína iniciadora da replicação Π. 0 termo modificação da natureza genética e/ou química pode ser entendido como referindo-se a qualquer mutação, substituição, eliminação, adição e/ou modificação de um ou mais resíduos. O termo derivado compreende também as sequências 9 homólogas à sequência considerada, derivadas de outras fontes celulares e, em particular, células de origem humana ou de outros organismos e possuindo uma actividade do mesmo tipo.

Essas sequências homólogas podem ser obtidas por experiências de hibridação. As hibridações podem ser realizadas partindo de bibliotecas de ácidos nucleicos, utilizando a sequência nativa ou um seu fragmento como sonda, sob condições de restringência convencionais (Maniatis et ai., ver General techniques of molecular biology) ou, de um modo preferido, sob condições de restringência elevada.

Além de uma origem de replicação condicional como definida acima, as moléculas de ADN reivindicadas contêm uma região compreendendo um (ou mais) gene(s) que permite(m) assegurar a selecção da molécula de ADN no hospedeiro seleccionado.

Este pode ser um marcador convencional do tipo génico que confere resistência a um antibiótico, tais como canamicina, ampicilina, cloranfenicol, estreptomicina, espectinomicina, lividomicina ou semelhantes.

No entanto, de acordo com uma forma de realização preferida da invenção, esta região é diferente de um gene que confere a resistência a um antibiótico. Este pode ser assim um gene cujo produto seja essencial para a viabilidade do hospedeiro considerado, em condições de cultura definidas. Este pode ser, por exemplo: um gene codificando para um ARNt supressor, de origem natural ou sintética. Este é, de um modo mais preferido, um codão de ARNt âmbar (TAG). 10 um gene cujo produto que seja necessário para o metabolismo da célula, em determinadas condições de cultura, nomeadamente um gene envolvido na biossintese de um metabolito (aminoácido, vitamina, etc.) ou um gene do catabolismo que possibilita a assimilação de um substância presente no meio de cultura (fonte específica de azoto ou de carbono), etc.

De acordo com um modo preferido da invenção, esta região contém uma cassete de expressão de um gene codificando para um ARNt supressor para codões específicos. Este último pode ser seleccionado, em particular, daqueles codificando para os aminoácidos fenilalanina, cisteína, prolina, alanina e histidina. Este é mais particularmente um ARNt supressor para codões âmbar (TAG).

Neste caso particular, o sistema utilizado para seleccionar, nas células hospedeiras, as moléculas de ADN que são o objecto da presente invenção incluem dois elementos: 1) um gene codificando para um ARN de transferência de supressor do codão âmbar (TAG), na molécula de ADN que constitui o marcador de selecção, conhecido como gene (sup) e 2) um hospedeiro especifico, de que um gene que é essencial em determinadas condições de cultura, contém um codão TAG âmbar. Esta célula pode crescer, sob as condições de cultura para as quais o produto do gene contendo o codão TAG é essencial, apenas se estiver presente o plasmídeo que permite a expressão de sup na célula. As condições de cultura constituem assim a pressão para a selecção da molécula de ADN. Os genes sup utilizados podem ser de origem natural (Glass et al., 1982) ou pode originar de uma construção sintética (Normanly et al. , 1986, Kleina et al. , 1990) . 11

Esse sistema oferece uma grande flexibilidade dado que, dependendo do gene contendo uma mutação âmbar, é possível determinar vários meios selectivos. Na bactéria Lactococcus lactis, por exemplo, o codão âmbar está localizado num gene de biossíntese da purina. Isto permite a selecção do plasmídeo contendo o gene codificando para o ARNt supressor quando as bactérias se multiplicam em leite. Esse marcador tem a vantagem de ser muito pequeno e de não conter qualquer sequência "exógena", originando de fagos ou transposões.

De acordo com uma forma de realização particular da invenção, a molécula de ADN compreende também um fragmento de ADN, o alvo de recombinases específicas para um local, o que permite a resolução de multímeros do plasmídeo.

Assim, esse fragmento introduzido numa molécula de ADN que é circular e cuja origem de replicação, é, por exemplo, ori gama, permite a resolução de multímeros desse plasmídeo. Esses multímeros são observados, em particular, quando a molécula de ADN é preparada numa estirpe contendo um alelo transformado de pir, tal como pírll6, que permite aumentar o número de cópias dos derivados R6K.

Esta recombinação pode ser realizada através de vários sistemas envolvendo a recombinação específica para um local entre sequências. De um modo mais preferido, a recombinação específica para um local da invenção é obtida através de sequências de recombinação intramoleculares específicas que têm capacidade da recombinação entre si na presença de proteínas específicas, geralmente referidas como recombinases. Neste caso específico, estas são as recombinases XerC e XerD. Por essa razão, as moléculas de ADN de acordo com a invenção compreendem 12 geralmente também uma sequência que permite esta recombinação específica para um local. 0 sistema de recombinação específico presente nas construções genéticas, de acordo com a invenção (recombinases e o local de reconhecimento específico), pode ser de origens diferentes. Em particular, as sequências específicas e as recombinases utilizadas podem pertencer a classes estruturais diferentes e, em particular, à família das resolvases do transposão Tn3 ou à família da integrase do bacteriófago lambda. De entre as recombinases pertencentes à família do transposão Tn3, pode ser feita referência, em particular, à resolvase do transposão Tn3 ou dos transposões Tn21 e Tn522 (Stark et al., 1992); a invertase Gin do bacteriófago mu ou alternativamente resolvases de plasmídeo, tal como as do fragmento par de RP4 (Abert et al. , Mol. Microbiol. 12 (1994) 131) . De entre as recombinases pertencendo à família da integrase do bacteriófago À, pode ser feita referência, em particular, à integrase dos fagos lambda (Landy et al., Science 197 (1977) 1147), P22 e Φ80 (Leong et al., J. Biol. Chem. 260 (1985) 4468), HP1 de Haemophilus influenzae (Hauser et al., J.

Biol. Chem. 267 (1992) 6859), integrase Cre do fago Pl, integrase do plasmídeo pSAM2 (documento EP 350341) ou alternativamente a recombinase FLP do plasmídeo 2 μ e as recombinases XerC e XerD de E. coli.

De um modo preferido, as moléculas de ADN que formam o objecto da presente invenção contêm o fragmento cer do plasmídeo natural de E. coli ColEl. 0 fragmento cer utilizado é um fragmento Hpall de ColEl com 382 pb que revelou originar, em eis, a resolução de multímeros de plasmídeos (Summers et al., 1984; Leung et al., 1985). É também possível utilizar um fragmento Hpall-Taql de tamanho mais pequeno (280 pb) ou um fragmento mais pequeno (cerca de 220 pb) , contido no fragmento 13 de Hpall, em que os fragmentos possuem as mesmas propriedades (Summers e Sherratt, 1988). Esta resolução realiza-se através de uma recombinação intramolecular específica, envolvendo quatro proteínas codificadas pelo genoma de E. coli: ArgR, PepA, XerC e XerD (Stirling et al., 1988, 1989; Colloms et al., 1990, Blakely et al., 1993). Foi verificado que a inserção do fragmento cer do plasmídeo natural de E. coli ColEl permite obter uma elevada resolução de multímeros de plasmídeos, resultando assim numa proporção elevada de monómeros de uma forma reproduzível. Isto é particularmente inesperado na medida em que foi demonstrado que a inserção do local cer num minicírculo contendo a origem de replicação ColEl de pBluescript SK+ não resultou numa resolução de multímeros eficiente (Kreiss et al., Appl. Microbiol. Biotechnol, 49:560-567 (1998)) e assim a resolução eficaz de plasmídeos em eis é imprevisível e parece depender da conformação do plasmídeo. No caso do plasmídeo pCOR, é obtida uma resolução em cis eficaz quando cer está presente no pCOR, resultando assim em monómeros inesperadamente elevados de pCOR de uma forma reproduzível.

Neste aspecto, é particularmente vantajoso utilizar a totalidade ou parte do fragmento cer de ColEl ou de um dos seus derivados como definido acima.

De acordo com uma variante de implementação, as moléculas de ADN da invenção podem também compreender uma sequência capaz de interagir especificamente com um ligando. De um modo preferido, esta é uma sequência capaz de formação, por hibridação, de uma hélice tripla com um oligonucleótido específico. Esta sequência permite assim purificar as moléculas da invenção por hibridação selectiva com um oligonucleótido complementar imobilizado num suporte (ver pedidos WO 96/18744 e 14 WO 02/07727). A sequência pode estar presente naturalmente na origem de replicação do plasmídeo como descrito na publicação do pedido US 2003/186268 da Requerente ou presente naturalmente no transgene como descrito no documento WO 02/07727 e, alternativamente, pode ser posicionada em qualquer local na molécula de ADN da invenção, desde que esta não afecte a funcionalidade do gene de interesse e da origem de replicação. Ocorre assim a formação de uma hélice tripla por hibridação entre o oligonucleótido e a sequência complementar especifica presente no ADN. Nesta ligação, são utilizados no método da invenção um oligonucleótido e uma sequência especifica que são totalmente complementares para obter os melhores rendimentos e a melhor selectividade. Estes podem ser, em particular, um oligonucleótido poli(CTT) e uma sequência especifica poli(GAA). Por exemplo, os oligonucleótidos contendo motivos repetidos tal como CTT têm capacidade para formar uma hélice tripla com uma sequência específica contendo unidades complementares (GAA). A sequência em questão pode, em particular, ser uma região contendo 7, 14 ou 17 unidades GAA e nos oligonucleót idos um número correspondente da repetição CTT. Neste caso, o oligonucleótido liga-se numa orientação antiparalela à cadeia de polipurina. Estas hélices triplas são estáveis apenas na presença de Mg2+ (Vasquez et al. , Biochemístry, 34: 7243-7251 (1995); Beal e Dervan, Science, 251: 1360-1363 (1991)).

Como mencionado acima, a sequência especifica pode ser uma sequência presente naturalmente no pCOR ou pode ser uma sequência sintética introduzida artificialmente neste último. É especialmente vantajoso utilizar um oligonucleótido capaz de formar uma hélice tripla com uma sequência presente naturalmente no pCOR, por exemplo na origem de replicação de um plasmídeo ou num gene marcador. A síntese de oligonucleótidos capazes de 15 formar hélices triplas com estas regiões homopurina-homopirimidina naturais é particularmente vantajosa, na medida em que pode ser aplicada a plasmideos pCOR não-modifiçados. Foram identificadas em ColEl e em origens de replicação de pCOR sequências alvo particularmente preferidas que podem formar estruturas em triplex com oligonucleótidos particulares. Os plasmideos ColEl derivados contêm uma sequência homopurina 12-mera (5'-AGAAAAAAAGGA-3') (SEQ ID N° 33) mapeada a montante do transcrito de ARN-II envolvido na replicação plasmidica (Lacatena et ai., Nature, 294: 623 (1981)). Esta sequência forma uma estrutura em triplex estável com o oligonucleótido 12-mero complementar 5'-TCTTTTTTTCCT-3' (SEQ ID N° 34) . A estrutura base de pCOR contém uma porção de homopurina de 14 bases não repetitivas (5'-AAGAAAAAAAAGAA-3') (SEQ ID N° 35) localizadas no segmento rico em A+T da origem γ do replicão de pCOR (Levchenko et ai., Nucleic Acids Res., 24:1936 (1996)). Esta sequência forma uma estrutura em triplex estável com o oligonucleótido complementar 14-mero 5'-TTCTTTTTTTTCTT-3' (SEQ ID N° 36). Os oligonucleótidos correspondentes 5'-TCTTTTTTTCCT-3' (SEQ ID N° 37) e 5'-TTCTTTTTTTTCTT-3' (SEQ ID N° 38) visam eficientemente e especificamente as suas respectivas sequências complementares localizadas dentro da origem de replicação de ColEl ori ou de pCOR (oriY). Também, é especialmente vantajosa a utilização de um oligonucleótido capaz de formar uma hélice tripla com uma sequência presente numa origem de replicação ou um gene marcador, uma vez que este permite, com o mesmo oligonucleótido, purificar qualquer ADN contendo a referida origem de replicação ou o referido gene marcador. Assim não é necessário modificar o plasmideo ou o ADN de cadeia dupla para incorporar uma sequência especifica artificial neste. 16

Embora sejam preferidas sequências totalmente complementares, é entendido, no entanto, que podem ser toleradas algumas não-correspondências entre a sequência do oligonucleótido e a sequência presente no ADN, na condição de que estas não originem uma perda demasiado grande de afinidade. Pode ser referida a sequência 5'-AAAAAAGGGAATAAGGG-3' (SEQ ID N° 39) presente no gene da β-lactamase de E. coli. Neste caso, a timina interrompendo a sequência de polipurina pode ser reconhecida por uma guanina da terceira cadeia, formando assim um tripleto G*TA que é estável quando flanqueado por dois tripletos T*AT (Kiessling et al. , Biochemistry, 31: 2829-2834 (1992)) .

De acordo com uma forma de realização particular, os oligonucleótidos utilizados podem compreender a sequência (CCT)n, a sequência (CT)n ou a sequência (CTT)n, em que n é um número inteiro entre 1 e 15 inclusivamente. É especialmente vantajoso utilizar sequências do tipo (CT)n ou (CTT)n. Os oligonucleótidos podem também combinar unidades (CCT), (CT) ou (CTT).

Os oligonucleótidos utilizados podem ser naturais (compostos por bases naturais não modificadas) ou quimicamente modificados. Em particular, o oligonucleótido pode possuir vantajosamente determinadas modificações químicas que permitem a sua resistência ou a sua protecção contra nucleases ou ser aumentada a sua afinidade para a sequência especifica,

Como um representante da molécula de ADN da presente invenção, pode ser reivindicado mais particularmente o plasmídeo pXL2774 e os seus derivados. Para os objectivos da invenção, o termo derivado é entendido como referindo-se a qualquer construção derivada de pXL2774 e contendo um ou mais genes de 17 interesse além do gene da luciferase. Pode ser também feita referência aos plasmídeos pXL3029, pXL3030 e ao plasmídeo pXL3179 ou NV1FGF contendo uma cassete de expressão de um gene terapêutico. Na forma de realização mais preferida, a invenção refere-se a um pCOR compreendendo o gene FGFa ou FGF-1 como descrito na patente US 4686113 da Requerente que é designado como pXL 3179 ou NV1FGF. A presente invenção refere-se também ao desenvolvimento de um processo da construção de células hospedeiras especificas, que são particularmente eficazes para a produção destas moléculas de ADN terapêuticas.

Um outro objectivo da presente invenção, refere-se ao processo de produção de uma molécula de ADN circular, caracterizada por ser cultivada uma célula hospedeira contendo, pelo menos, uma molécula de ADN como definida acima e uma proteína que pode ou não ser expressa in situ, a qual condiciona a funcionalidade da origem de replicação da referida molécula de ADN que é específica e que é exógena para a referida célula hospedeira, sob condições que permitem a selecção de células hospedeiras transformadas pelas referidas moléculas de ADN.

De um modo mais preferido, a proteína que condiciona a funcionalidade da origem de replicação da molécula de ADN é expressa in situ a partir de um gene correspondente. 0 gene codificando para a proteína iniciadora da replicação pode ser contido por um replicão subsidiário que é compatível com os derivados da origem de replicação condicional utilizada ou que pode ser introduzida no genoma da células hospedeiras por recombinação, através de um transposão, um bacteriófago ou qualquer outro vector. No caso particular em que o gene que 18 expressa a proteína é colocado num replicão subsidiário, este último contém também uma região promotora da transcrição funcional na célula, assim como uma região que está localizada na extremidade 3' e que especifica um sinal de terminação da transcrição. No que respeita à região promotora, esta pode ser uma região promotora que é responsável naturalmente pela expressão do gene em consideração quando este último tem capacidade de funcionamento na célula. Esta pode ser também um caso de regiões de origem diferente (responsável pela expressão de outras proteínas) ou mesmo de origem sintética. Em particular, esta pode ser um caso de sequências promotoras para genes procariotas ou de bacteriófago. Por exemplo, esta pode ser um caso de sequências promotoras obtidas a partir do genoma celular.

Como genes codificando para a proteína iniciadora da replicação, pode ser feita utilização de genes do tipo selvagem ou de alelos transformados que permitam obter um número aumentado de cópias dos plasmídeos (ou derivados) específicos para a proteína iniciadora, o que condiciona a funcionalidade da origem de replicação utilizada na molécula de ADN.

Esses mutantes foram descritos, em particular, para os plasmídeos R6K (Inuzuka e Wada, 1985; Greener et ai., (1990), Rtsl (Terawaki e Itoh, 1985, Terawaki et ai., 1990; Zeng et ai., 1990), F (Seelke et ai., 1982; Helsberg et ai., 1985; Kawasaki et ai., 1991), RK2 (Durland et ai., 1990; Haugan et ai., 1992, 1995), pSClOl (Xia et ai., 1991; Goebel et ai., 1991; Fang et ai., 1993) .

No caso particular em que a molécula de ADN utilizada possui uma origem de replicação derivada do plasmídeo R6K, a 19 proteína iniciadora é um derivado da proteína Π deste mesmo plasmídeo. É particularmente vantajoso expressar uma forma mutada desta proteína que tem capacidade de aumentar significativamente o número de cópias iniciais. Para fazer isto, o gene incorporado na célula hospedeira é, de um modo preferido, representado pela totalidade ou por parte da sequência representada na SEQ ID N° 2 ou um dos seus derivados e, de um modo mais preferido, pelo gene pirllô. A mutação associada corresponde à substituição de uma prolina por uma leucina. De acordo com uma forma de realização particular da invenção, este gene pirll6 é directamente incorporado no genoma da célula hospedeira.

Vantajosamente, um dos genes da célula hospedeira especifica, o qual é essencial sob as condições de cultura seleccionadas, contém um codão específico que é reconhecível pelo ARNt supressor seleccionado na molécula de ADN. De acordo com um modo preferido da invenção, este é um codão TAG âmbar. Neste caso particular, a célula pode crescer, em condições de cultura para as quais o produto do gene contendo o codão TAG é essencial, apenas se estiver presente na célula hospedeira o plasmídeo permitindo a expressão de sup. As condições de cultura constituem assim a pressão de selecção da molécula de ADN.

De um modo preferido, o gene contendo o codão âmbar é um gene envolvido na biossintese de um aminoácido arginina. Este gene argE codifica para uma N-acetilornitinase (Meinnel et al., 1992) e neste caso contém um codão TAG correspondente a uma mutação pontual Gln-53 (CAG) -> TAG; a pressão para a selecção do plasmídeo contendo o gene sup então é proporcionada por cultura em meio mínimo M9 (Maniatis et al., 1989) . No entanto, este pode ser também, por exemplo, um gene da biossintese de uma 20 vitamina ou de uma base de ácido nucleico ou, alternativamente, um gene que permite que seja utilizada uma fonte especifica de azoto ou de carbono ou qualquer outro gene cuja funcionalidade seja essencial para a viabilidade celular nas condições de cultura seleccionadas. A célula hospedeira é, de um modo preferido, seleccionada de estirpes de E. coli e, de um modo mais preferido, é representada pela estirpe E. coli XAC-1.

De acordo com uma forma de realização específica da invenção, a célula hospedeira utilizada no processo reivindicado, é uma célula da estirpe XAC-1 de E. coli, contendo o gene pirll6 no seu genoma e transformada pelo plasmídeo pXL2774 ou um dos seus derivados.

De acordo com uma variante vantajosa da invenção, a célula hospedeira utilizada no processo reivindicado é uma célula procariota em que estão inactivados o gene endAl ou um gene homólogo. 0 gene endA codifica para a endonuclease I de E. coli. Esta enzima periplasmática tem uma actividade não-específica de quebra do ADN de cadeia dupla (Lehman, I. R., G. G. Roussos e E. A. Pratt (1962) J. Biol. Chem. 237: 819-828; Wright M. (1971) J. Bacteriol. 107: 87-94). Um estudo realizado em várias estirpes de Escherichia coli (de tipo selvagem ou endA) mostrou que a degradação de ADN plasmidico incubado em extractos destas estirpes bacterianas existia nas estirpes endA+ mas não nos mutantes endA. (Wnendt S. (1994) BioTechniques 17: 270-272). Foi estudada a qualidade do ADN plasmidico isolado a partir de estirpes endA+ ou de mutantes endA pela empresa Promega utilizando o seu sistema de purificação (Shoenfeld, T., J. 21

Mendez, D. Storts, E. Portman, B. t Patterson, J. Frederiksen e C. Smith. 1995. Effects of bacterial strains containing the endAl genotype in DNA quality isolated with Wizard plasmid purification systems. Promega Notes 53) . A sua conclusão é a seguinte: a qualidade de ADN preparado a partir de mutantes endA é, globalmente, melhor do que a do ADN preparado nas estirpes endA+ testadas. A qualidade das preparações de ADN plasmídico é assim afectada por qualquer contaminação com esta endonuclease (degradação do ADN a relativamente longo prazo). A eliminação ou a mutação do gene endA podem ser perspectivadas sem dificuldade, na medida em que os mutantes que já não têm esta actividade endonuclease se comportam globalmente como bactérias de tipo selvagem (Diirwald, H. e H. Hoffmann-Berling (1968) J. Mol. Biol. 34: 331-346). 0 gene endAl pode ser inactivado por mutação, eliminação total ou parcial, interrupção, etc. A inactivação do gene endA da estirpe de E. coli seleccionada para produzir os plasmídeos pCOR pode ser realizada mais particularmente transferindo a eliminação AendA::TcR descrita por Cherepanov e Wackernagel (Cherepanov, P. P. e W. Wackernagel. 1995, utilizando o bacteriófago PI. Gene disruption in Escherichia coli: TcR e KmR cassetes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene 158:9-14) ou permutando o alelo tipo de selvagem presente no genoma da bactéria de interesse por um alelo mutado ou eliminado de endA, por recombinação homóloga. A utilização deste tipo de estirpe no 22 contexto da presente invenção permite melhorar vantajosamente a qualidade do ADN produzido. A invenção refere-se também a qualquer célula recombinante contendo uma molécula de ADN como definido acima. Esta pode ser uma célula de várias origens, do tipo eucariota, procariota, etc.

De acordo com outra forma de realização da invenção, a célula hospedeira E. coli XAC-1, utilizada no processo reivindicado, é designada TEX1 e compreende um gene traD ou um seu gene homólogo, inactivado para abolir a transferência de F'. 0 traD está na extremidade 5' de um dos operões tra e codifica uma proteína membranar com 81,7 kDa que está directamente envolvida na transferência de ADN e no metabolismo do ADN (Frost et al., Microbiology Reviews, 1994, 58: 162-210). os mutantes traD não transferem ADN (Panicker et al., J. Bacteriol., 1985, 162:584-590). O gene traD epissómico pode ser inactivado por mutação, eliminação total ou parcial ou interrupção utilizando métodos bem conhecidos dos especialistas na técnica (Ver o Exemplo 9) . No Exemplo 1 é descrito um método para inactivar este gene e a estirpe de E. coli XAC-1 pirllô endA~ traD~ resultante obtida assim é designada TEX1 (Soubrier et al. , Gene therapy, 1999, 6: 1482-1488) .

De acordo com uma forma de realização da invenção, a célula hospedeira utilizada no processo reivindicado é uma célula da estirpe XAC-1F. coli, contendo a mutação pirllô combinada com a mutação pir42. As mutações pirll6 e pir42 afectam domínios diferentes da proteína pi. A mutação pirllô afecta a região de controlo do número de cópias, enquanto a mutação pir42 afecta o motivo fecho de leucina putativo, como apresentado na Figura 11. 23

As sequências nucleotídicas e de aminoácidos do gene pir contendo as mutações pirll6 e pir42 estão estabelecidas, respectivamente, na Figura 12 e nas SEQ ID N° : 21 e 22. A mutação pir42 compreende uma transição C para T na posição 124 do codão de iniciação metionina e resulta assim na substituição da prolina na posição 42 por uma leucina. A mutação pir42 foi descrita por Miron et ai. (Proc Natl Acad Sei USA, 1994. 91(14): p. 6438-42; EMBO J, 1992. 11(3): p. 1205-16) e foi foi descrita como aumentando o número de cópias de um plasmídeo "ori gama R6K-KmR-pir42" em 2,5 vezes em comparação com o mesmo plasmídeo contendo o gene pir de tipo selvagem. No entanto a mutação pir42 nunca foi utilizada ou descrita em combinação com a mutação pirllô e enquanto outras mutações de aumento de cópias tais como cop21 no gene pir combinado com o pirllô não apresentam um aumento do número de cópias do plasmídeo, a combinação das mutações pirll6 e pir42 numa estirpe XAC-1 endA~ traD~ de E. coli apresentou surpreendentemente um aumento significativo do número de cópias do plasmídeo. A requerente apresentou assim resultados inesperados desta combinação em termos do número de cópias dos plasmídeos produzido em estirpes hospedeiras de E. coli compreenderam o gene pirllô e pir42 mutado em comparação com estirpes contendo pirllô apenas ou numa célula hospedeira compreendendo a mutação pirllô combinada com outra mutação do gene pir, tal como a mutação cop21 (Inuzuka et ai., FEBS Lett., 1988. 228(1): p. 7-11). Por exemplo, E. coli TEX1pír42 (=XAC-1 endA~ traD~ pirllô pir42) apresenta um aumento de 2-5 vezes no número de plasmídeos, em comparação com uma estirpe pirllô ou de estirpes compreendendo as mutações pirllô e cop21 combinadas (Ver o Exemplo 11). Em outras formas de realização, o gene pir compreende, pelo menos, uma mutação, a qual, por exemplo, pode ocorrer na região de controlo de número de cópias, no motivo semelhante a um fecho de leucina, na região de ligação ao ADN ou em uma ou mais destas regiões ou uma outra região da proteína pi codificada pelo gene pir. A célula hospedeira procariota, de acordo com a presente invenção, compreende também uma ou mais mutações no mesmo ou num domínio diferente da proteína pi, codificada pela cópia do gene pir, tal como o domínio de ligação ao ADN e/ou a região de controlo de número de cópias e/ou o motivo fecho de leucina. A célula hospedeira recombinante procariota pode compreender o gene pir heterólogo, está num plasmídeo ou no genoma da célula hospedeira.

Essas mutações podem ser rastreadas utilizando o método de rastreio baseado na fluorescência de acordo com um aspecto da presente invenção como aqui descrito abaixo. Como mostrado no

Exemplo 13, foram rastreadas células hospedeiras compreendendo, pelo menos, uma mutação no gene pir, a mutação pirll6 e uma mutação no dominio de ligação ao ADN, utilizando o método de rastreio baseado na fluorescência de acordo com a presente invenção. São testadas células hospedeiras compreendendo mutações presentes no dominio de ligação ao ADN além de pirllô, i. e., tal como por exemplo na construção 100B, em que a tirosina (K) na posição 292 é substituída por uma metionina (M), na construção 114C, em que um ácido glutâmico (E) na posição 130 é substituído por uma valina (V) ou na construção 201C, em que um ácido aspártico (D) na posição 117 é substituído por uma glicina (G) (Fig. 26) para a sua capacidade para produzir o plasmídeo de elevado número de cópias utilizando o método de rastreio baseado na fluorescência.

De acordo com outra forma de realização da presente invenção, a célula hospedeira utilizada no processo reivindicado 25 é uma célula hospedeira procariota em que foram inactivados o gene recA ou um gene homólogo. De um modo preferido, a célula hospedeira de acordo com presente invenção é a estirpe XAC-1 de E. coli compreendendo as mutações pirllè, pir42, endA , traD , recA~. Essa estirpe é designada TEX2 pir42. 0 recA pode ser inactivado por métodos bem conhecidos dos especialistas na técnica. 0 recA codifica uma proteína de recombinação principal e as mutações neste gene reduzem a frequência da alteração mediada por recombinação em plasmídeos e a recombinação intramolecular que pode originar a multimerização de plasmídeos. Como descrito no Exemplo 12, um gene recA eliminado contendo 3 codões de terminação da tradução (um em cada grelha de leitura) na sua extremidade 5' pode ser obtido por PCR. 0 gene inactivado resultante foi então introduzido por substituição génica no genoma de TEX1 (Exemplo 12.1).

Estas células são obtidas por qualquer técnica conhecida pelos especialistas na técnica, que permita a introdução de referido plasmídeo numa célula determinada. Essa técnica pode ser, em particular, transformação, electroporação, conjugação, fusão de protoplastos ou qualquer outra técnica conhecida pelos especialistas na técnica. A estirpe XAC-1pirllô foi depositada sob as condições do Tratado de Budapeste na Collection Nationale De Cultures de Micro-organismes (CNCM), Institut Pasteur, 28, rua Dr. Roux, 75724 Paris Cedex 15, França, no dia 10 de Outubro de 2003 sob o n° de acesso 1-3108. A estirpe TEX2pir42 foi depositada sob as condições do Tratado de Budapeste na Collection Nationale De Cultures de Micro-organismes (CNCM), Institut Pasteur, 28, rua Dr. Roux, 26 75724 Paris Cedex 15, França, no dia 10 de Outubro de 2003 sob o n° de acesso 1-3109.

As moléculas de ADN de acordo com a invenção podem ser utilizadas em qualquer aplicação em vacinação ou em terapia génica e celular para transferir um gene para uma determinada célula, tecido ou organismo ou para a produção de proteínas recombinantes in vitro.

Em particular estas podem ser utilizadas para administração directa in vivo ou para modificação de células in vitro ou ex vivo, com o objectivo de as implantar num doente.

Neste aspecto, outro objectivo da presente invenção refere-se a qualquer composição farmacêutica compreendendo, pelo menos, uma molécula de ADN como definida acima. Esta molécula pode ou não ser aí associada com um vector de transfecção químico e/ou bioquímico. Isto pode envolver, em particular, catiões (fosfato de cálcio, DEAE-dextrano, etc.) ou lipossomas. Os vectores sintéticos associados podem ser polímeros ou lípidos catiónicos. Os exemplos desses vectores que podem ser referidos são DOGS (Transfectam™) ou DOTMA (lipofectin™) .

As composições farmacêuticas de acordo com a invenção podem ser formuladas para objectivos de administrações tópicas, orais, parentéricas, intranasais, intravenosas, intramusculares, subcutâneas, intra-oculares ou transdérmicas. O plasmídeo reivindicado é, de um modo preferido, utilizado numa forma injectável ou em aplicação. Pode ser misturado com qualquer veículo que seja farmaceuticamente aceitável para uma formulação injectável, em particular, para uma injecção directa no local a ser tratado. Isto pode envolver, em particular, soluções 27 estéreis, isotónicas ou composições secas, em particular, composições liofilizadas que pela adição, dependendo do caso, de água esterilizada ou de soro fisiológico, permitem a preparação de soluções injectáveis. Isto pode envolver, em particular, tampões Tris ou PBS diluídos em glicose ou em cloreto de sódio. É vantajosa uma injecção directa na região afectada do doente, uma vez que esta permite que o efeito terapêutico seja concentrado ao nível dos tecidos afectados. As doses utilizadas podem ser adaptadas em função de vários parâmetros e, em particular, em função do gene, vector, modo de administração utilizada, patologia em questão ou a duração pretendida do tratamento.

As moléculas de ADN da invenção podem conter um ou mais genes de interesse, i. e. um ou mais ácidos nucleicos (ADN sintético ou semi-sintético, ADNg, ADNc, etc.) cuja transcrição e, possivelmente, cuja tradução na célula alvo produza produtos de interesse terapêutico, de vacina, agronómico ou veterinário.

De entre os genes de interesse terapêutico que podem ser referidos mais particularmente encontram-se os genes codificantes de enzimas, derivados de sangue, hormonas e linfocinas: interleucinas, interferões, TNF, etc. (documento FR 92/03120), factores de crescimento, neurotransmissores ou os seus precursores ou enzimas sintéticas e factores tróficos (BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, VEGF-B, VEGF-C etc.; apolipoproteínas: ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc. (documento FR 93/05125), distrofina ou uma minidistrofina (documento FR 91/11947), genes supressores de tumores: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc. (documento FR 93/04745), genes codificantes de factores envolvidos na coagulação: factores VII, VIII, IX, etc., genes suicidas: timidina-cinase, desaminase da 28 citosina, etc.; ou alternativamente a totalidade ou parte de uma imunoglobulina natural ou artificial (Fab, ScFv, etc.), um ligando de ARN (documento WO 91/19813), etc. 0 gene terapêutico pode ser também uma sequência ou um gene anti-sentido, cuja expressão na célula alvo possibilita o controlo da expressão de genes ou da transcrição de ARNm celulares. Essas sequências, por exemplo, podem ser transcritas, na célula alvo, em ARN que são complementares ao ARNm celular e assim bloquearem a sua tradução em proteina, de acordo com a técnica descrita na patente EP 140308. Uma inserção de interesse que pode ser contida pelo pCOR da invenção é um ARNi, o qual tem capacidade de interferir com a tradução de um gene alvo (Wilson et al. , Curr Opin Mol Ther. Agosto de 2003; 5(4):389-96) e assim regular a expressão desse gene. O gene de interesse pode ser também um gene de vacina, i. e. uma gene codificando para um péptido antigénico, capaz de produzir uma resposta imunitária no homem ou em animais, com o objectivo de produzir vacinas. Estes péptidos antigénicos podem ser, em particular, péptidos antigénicos específicos do vírus de Epstein-Barr, vírus HIV, vírus da hepatite B (documento EP 185573) ou vírus da pseudo-raiva ou péptidos antigénicos alternativamente específicos de tumores (documento EP 259212) .

Geralmente, nas moléculas de ADN da invenção, o gene de interesse terapêutico, de vacina, agronómico ou veterinário contém também uma região promotora para a transcrição funcional no organismo ou célula alvo, assim como uma região localizada na extremidade 3' que especifica um sinal de terminação da transcrição e um local de poliadenilação. No que respeita à região promotora, esta pode ser uma região promotora responsável 29 naturalmente pela expressão do gene em questão, quando esta região tem capacidade de funcionamento na célula ou no organismo em questão. As regiões promotoras podem ser também regiões de origem diferente (responsáveis pela expressão de outras proteínas) ou mesmo de origem sintética. Em particular, estas podem ser sequências promotoras de genes eucariotas ou virais. Por exemplo, estas podem ser sequências promotoras obtidas a partir do genoma da célula alvo. De entre os promotores eucariotas que podem ser utilizados, encontra-se qualquer promotor ou sequência derivada que estimule ou suprima a transcrição de um gene de uma forma específica ou não-específica, induzível ou não-induzível, forte ou fraca. Os promotores eucariotas podem ser, em particular, promotores ubíquos (promotores dos genes para HPRT, PGK, a-actina, tubulina, etc.), promotores de filamento intermediários (promotores dos genes para GFAP, desmina, vimentina, neurofilamentos, queratina, etc.), promotores de genes terapêuticos (por exemplo os promotores dos genes de MDR, CFTR, factor VIII, ApoAI, etc.) promotores específicos para um tecido (promotores dos genes da cinase do piruvato, vilina, proteína intestinal de ligação dos ácidos gordos, α-actina do músculo liso, etc.) ou alternativamente os promotores que respondem a um estímulo (receptor da hormona esteróide, receptor do ácido retinóico, etc.). De um modo semelhante, estes podem ser sequências promotoras obtidas do genoma de um vírus, tais como, por exemplo, os promotores dos genes dos adenovírus EIA e MLP, o promotor precoce de CMV ou, alternativamente, o promotor LTR de RSV, etc. Além disso, estas regiões promotoras podem ser modificadas pela adição de sequências de activação ou reguladoras ou sequências que permitem a expressão específica para um tecido ou expressão que é predominantemente específica para tecido. 30

Além disso, o gene de interesse pode também conter uma sequência sinal que direcciona o produto sintetizado para as vias secretoras da célula alvo. Esta sequência sinal pode ser a sequência sinal natural do produto sintetizado, mas esta pode ser também qualquer outra sequência sinal funcional ou uma sequência sinal artificial. A sequência sinal preferida utilizada de acordo com a presente invenção é o péptido sinal de secreção do interferão humano como descrito Taniguchi et al. (Gene, 1980, 233(4763):541-5)

Dependendo do gene de interesse, as moléculas de ADN da invenção podem ser utilizadas no tratamento ou na prevenção de várias patologias, incluindo doenças genéticas (distrofia, fibrose quística, etc.), doenças neurodegenerativas (doença de Alzheimer, doença de Parkinson, ALS, etc.), cancros, patologias associadas com distúrbios da coagulação ou com dislipoproteinemias, patologias associadas com infecções virais (hepatite, SIDA, etc.) ou nos campos agronómicos e veterinários, etc.

De acordo com uma forma de realização preferida, as moléculas de ADN da presente invenção são utilizadas para tratar patologias graves de isquemia dos membros, tais como, por exemplo, doença oclusiva arterial periférica e claudicação intermitente.

Além disso, a presente invenção refere-se também à utilização de moléculas de ADN com replicação condicional para a produção de proteínas recombinantes. Podem ser utilizadas bactérias para produzir proteínas de várias origens, eucariotas ou procariota. De entre as bactérias, E. coli constitui o organismo escolhido para expressar genes heterólogos devido à 31 sua facilidade da manipulação, ao grande número de sistemas de expressão disponíveis e às grandes quantidades de proteínas que podem ser obtidas. É entendido que o sistema da invenção pode ser utilizado em outros organismos, sendo o tropismo determinado pela natureza da origem de replicação, como indicado acima. Para esta utilização, a sequência de ácidos nucleicos de interesse compreende uma região codificante sob o controlo de sinais de expressão que são adequados para o hospedeiro seleccionado, em particular, um hospedeiro procariota. Estes podem ser, por exemplo, promotores Plac, Ptrp, PT7, Ptrc, Ptac, PL, PBad ou PR, a sequência de Shine-Dalgarno, etc. (este consunto constitui a cassete de expressão). A sequência de ácido nucleico de interesse pode ser qualquer sequência codificando para uma proteína que tem valor nos campos farmacêutico, agro-alimentar, químico ou agroquimico. Este pode ser um gene estrutural, uma sequência de ADN complementar, uma sequência sintética ou semi-sintética, etc. A cassete de expressão pode ser introduzida no vector de replicação condicional que é o objectivo da invenção, constituindo assim um vector de replicação condicional que permite a expressão de proteínas de interesse em E. coli. Este vector tem várias vantagens: ausência de utilização de antibiótico para o seleccionar na bactéria (custo reduzido, ausência de necessidade de um estudo no que respeita à presença de antibiótico ou de produtos derivados potencialmente tóxicos no produto terminado), praticamente nenhuma probabilidade de disseminação do plasmídeo na natureza (origem de replicação condicional), possibilidade de fermentação num meio completamente definido. Os exemplos proporcionados demonstram as propriedades vantajosas destes vectores condicionais para a produção de proteínas recombinantes. 32

Como descrito acima, a molécula de ADN de acordo com presente invenção compreende uma origem de replicação ORI γ derivada de R6K em que o gene pir é removido e introduzido no genoma de uma célula hospedeira específica que é utilizada para a produção das moléculas de ADN em grande escala. Existe sempre uma necessidade de produzir quantidades crescentes de plasmídeo para ensaios clínicos e/ou utilização em terapia génica baseada em ADN. As células hospedeiras de produção foram concebidas para conter o gene pir possuindo, pelo menos, uma mutação, tais como a mutação pirll6 e/ou pir42. A utilização dessas estirpes hospedeiras mutadas resulta num aumento do número de cópias de plasmídeo e aumenta assim, significativamente, o rendimento da produção. Do mesmo modo, a conformação dos plasmídeos assim produzidos, é muito satisfatória.

De acordo com um aspecto particular, é proporcionado um novo método de rastreio baseado na fluorescência do mutante com um número aumentado de cópias. Este método de rastreio baseado na fluorescência à muito superior ao método de rastreio convencional baseado no nível da resistência ao antibiótico nas bactérias, o qual não pode ser utilizado quando o número basal de cópias de plasmídeo é já muito elevado tal como o obtido utilizando o mutante pirll6, e. g. , aproximadamente 400 cópias de plasmídeo por célula. O método de rastreio baseado na fluorescência de acordo com a presente invenção utiliza de um modo preferido o gene cobA como gene repórter de fluorescência vermelha de um número de aumentado de cópias. O gene cobA que é um gene de Pseudomonas denitrificans (Crouzet et al., J. Bacteriol. 1999, 172: 5968-79) codifica a metiltransferase uro III, uma enzima da via da vitamina B12 que adiciona dois grupos metilo à molécula do urogénio III. Wildt et al. {Nature Biotechnology, vol. 17, 1999, pp 1175) descrevem a 33 utilização de cobA como um gene repórter da transcrição fluorescente para células de E. coli, levedura e mamífero. Por exemplo, esse gene repórter fluorescente foi utilizado para a selecção de plasmídeos recombinantes contendo estirpes de E. coli que acumulam compostos porfirinóides fluorescentes devido à sobreexpressão do gene cobA codificando a metiltransferase de uro III. Quando iluminadas com luz UV, as células fluorescem com uma cor vermelha brilhante (BioTechniques, 1995, vol 19, n° . 7, p. 760). A requerente verificou surpreendentemente uma correlação próxima entre o número de cópias do plasmídeo contendo o gene cobA e o nível de fluorescência de cor de rosa até vermelho. O método de rastreio baseado na fluorescência de mutantes com um número aumentado de cópias de acordo com a presente invenção é assim útil para o rastreio de vários mutantes que podem ser então avaliados no genoma da célula hospedeira de produção, tal como E. coli ou mutantes de quaisquer genes tal como no gene pir, os quais são inseridos no genoma da células hospedeiras de produção ou contidos num plasmídeo.

Além da correlação com o número de cópias de plasmídeos, o método de rastreio baseado na fluorescência da presente invenção é facilmente e rapidamente realizado dado que requer apenas o plaqueamento e cultura das células hospedeiras transformadas de um dia para o outro e exposição a luz UV, para revelar a intensidade da fluorescência produzida, assim deduzindo directamente o número de cópias de plasmídeos na célula hospedeira. 34

Assim, a presente invenção proporciona um método para detectar uma mutação num plasmideo com um número aumentado de cópias compreendendo: (a) introdução de, pelo menos, uma mutação numa sequência alvo; (b) transformação da sequência alvo transformada numa célula hospedeira compreendendo um plasmideo, em que o plasmideo compreende uma sequência nucleotidica codificando metiltransferase de uroIII e o número de cópias do plasmideo é afectado pela sequência alvo; (c) cultura da célula hospedeira sob condições em que a sequência nucleotidica seja expressa para produzir uma cultura de células hospedeiras; (d) exposição da cultura de células hospedeiras a luz UV; e (e) detecção da fluorescência produzida pela cultura de células hospedeiras.

De acordo com presente invenção, o método compreende ainda a comparação da fluorescência detectada em (e) com a fluorescência produzida por uma cultura de células hospedeiras compreendendo uma sequência alvo não-mutada.

De um modo preferido, o gene da metiltransf erase de uroIII é codificado pelo gene cobA de Pseudomonas denitrificans. A mutação pode estar presente num plasmideo compreendendo um gene pir heterólogo compreendendo, pelo menos, uma mutação. 0 35 plasmídeo pode compreender, pelo menos, uma mutação em outras regiões de pir, tais como na região de controlo de cópias e/ou no domínio de ligação ao ADN e/ou no motivo de fecho de leucina e/ou em outra região do gene pir. Do mesmo modo, o plasmídeo pode compreender, pelo menos, uma mutação na região de controlo de número de cópias do gene pir heteróloga e no motivo semelhante a um fecho de leucina. 0 plasmídeo pode compreender ainda uma mutação na região de ligação ao ADN do gene pir. Além disso, o plasmídeo pode compreender uma ou mais mutações na mesmsa ou numa região diferente do gene pir codificando para a região de controlo de cópias e/ou a região de ligação ao ADN e/ou ao a motivo semelhante a um fecho de leucina ou outra região da proteína Π.

Dentro da limitação, a célula hospedeira recombinante procariota, acordo com a presente invenção, compreende a mutação pirllô e uma segunda mutação na região de ligação ao ADN, tais como pir292, pir!30 ou pir!17 (Fig. 26).

Essa estirpe hospedeira de produção mutada pode ser produzida vantajosamente utilizando uma ferramenta plasmídica universal tal como o minicirculo. A tecnologia de minicirculo é descrita inter alia nas patentes US 6143530 e 6492164 da

Requerente ou no pedido PCT WO 96/26270.

Os minicírculos são moléculas de ADN recombinantes que não contêm qualquer origem de replicação e assim representam um excelente vector suicídia para substituição génica do genoma de qualquer microrganismo. Em particular, o gene ou os genes de interesse são flanqueados pelas duas sequências permitindo a recombinação específica para um local, posicionada na orientação directa no minicirculo. A posição na orientação directa, indica 36 que as duas sequências seguem a mesma polaridade 5'-3' no minicirculo de ADN recombinante. As construções genéticas em minicirculo são geralmente moléculas de ADN circular em cadeia dupla destituídas de origem de replicação, mas podem estar também na forma linear e conter o gene ou os genes de interesse flanqueados pelas duas sequências, permitindo a recombinação especifica para um local, posicionada na orientação directa. De acordo com esta forma de realização particular da invenção, o minicirculo pode ser utilizado para transformar qualquer microrganismo competente com o objectivo da substituição génica dentro do seu genoma (Figura 31). 0 minicirculo para substituição génica é produzido a partir de um plasmídeo parental compreendendo pelo menos: a) uma origem de replicação e um gene marcador de selecção, b) duas sequências permitindo a recombinação específica para um local, posicionadas na orientação directa e, c) um ou mais genes de interesse, colocados entre as sequências b) referidas. 0 sistema de recombinação específico, presente nas construções genéticas, pode ser de origens diferentes. Em particular, as sequências especificas e as recombinases utilizadas podem pertencer a classes estruturais diferentes e, em particular, à família da integrase do bacteriófago λ ou à família da resolvase do transposão Tn3. De entre as recombinases pertencentes à família da integrase de bacteriófago λ, podem ser referidas, em particular, a integrase dos fagos lambda (Landy et al. , Science 197: 1147, 1977), P22 e Φ80 (Leong et al. , J. 37

Biol. Chem. 260: 4468, 1985), HPl de Haemophilus influenza (Hauser et al. , J. Biol. Chem. 267 6859, 1992), a integrase Cre do fago Pl, a integrase do plasmídeo pSAM2 (documento EP 350341) ou alternativamente a recombinase FLP do plasmídeo 2μ. Os minicírculos são assim preparados por recombinação através de um sistema específico para um local da família das integrases do bacteriófago λ, as moléculas de ADN de acordo com a invenção compreendem geralmente, além disso, uma sequência resultante da recombinação entre duas sequências att de ligação do bacteriófago ou plasmídeo correspondente.

De entre as recombinases pertencentes à família do transposão Tn3, pode ser referida, em particular, a resolvase do transposão Tn3 ou dos transposões Tn21 e Tn522 (Stark et ai., Trends Genet, 8, 432-439, 1992); a invertase Gin do bacteriófago mu ou, alternativamente, a resolvase de plasmídeos, tal como a do fragmento par de RP4 (Albert et ai., Mol. Microbiol. 12: 131, 1994) . Quando os minicírculos são preparados por recombinação através de um sistema específico para um local da família do transposão Tn3, estes compreendem geralmente, além do gene de interesse que se destina a ser inserido num genoma de um microrganismo, uma sequência resultante da recombinação entre duas sequências de reconhecimento da resolvase do transposão em questão. Podem ser também derivadas da região loxP do fago Pl sequências que permitem a recombinação específica para um local, que são constituídas essencialmente por duas sequências de repetição capazes de se recombinarem especificamente entre si na presença de uma proteína, designada Cre (Sternberg et al., J. Mol. Biol. 150: 467, 1971). 0 plasmídeo utilizado para produzir o minicírculo compreende assim uma origem de replicação bacteriana e um gene marcador de selecção; (b) as sequências de repetição do bacteriófago Pl (região loxP) ; e (c), um ou mais 38 genes de interesse que que se pretenda inserir num genoma de um microrganismo, colocados entre as referidas sequências (b).

Os minicirculos podem compreender sequências permitindo a recombinação especifica para um local são derivadas de um bacteriófago, tais como as sequências de ligação (sequências attP e attB) de um bacteriófago ou as sequências derivadas dessas sequências de ligação. Estas sequências têm capacidade de se recombinarem especificamente entre si na presença de uma recombinase designada como uma integrase com ou sem excisionase. 0 termo "sequências derivadas dessas sequências de ligação" inclui as sequências obtidas por modificação ou modificações das sequências de ligação dos bacteriófagos que conservam a capacidade para se recombinarem especificamente na presença da recombinase adequada. Assim, essas sequências podem ser fragmentos reduzidos destas sequências ou, alternativamente, fragmentos acrescidos pela adição de outras sequências (locais de restrição e semelhantes). Estes podem ser também variantes obtidas por mutação ou mutações, em particular, por mutação ou mutações pontuais. Os termos sequências attP e attB de um bacteriófago ou de um plasmídeo designam, de acordo com a invenção, as sequências do sistema de recombinação especifico do referido bacteriófago ou plasmídeo, ou seja, a sequência attP presente no referido fago ou plasmídeo e a sequência attB cromossómica correspondente. São bem conhecidas na técnica, sequências de ligação e incluem, inter alia, as sequências de ligação dos fagos À, P22, Φ80, PI e HP1 de Haemophilus influenzae ou, alternativamente, do plasmídeo pSAM2 ou o plasmídeo 2μ.

Os minicirculos são facilmente produzidos a partir do plasmídeo parental descrito acima. 0 método para a produção do 39 minicírculo consiste na colocação da cultura em contacto com células que estão transformadas com o plasmídeo parental com a integrase, com ou sem a excisionase, para induzir a recombinação especifica para um local. A cultura e a integrasse, com ou sem a excisionase, são colocadas em contacto por transfecção ou por infecção com um plasmídeo ou um fago contendo o gene para a referida integrase e quando aplicável o gene da excisionase. Alternativamente, por exemplo, é induzida a expressão dos genes codificantes para a referida integrase e quando aplicável a excisionase, presente na célula hospedeira. Como referido abaixo, estes genes podem estar presentes na célula hospedeira na forma integrada no genoma, num plasmídeo replicativo ou, alternativamente, no plasmídeo da invenção, na porção não-terapêutica.

Para permitir a produção dos minicírculos de acordo com a invenção por recombinação específica para um local in vivo, a integrase com/sem excisionase utilizada é introduzida ou induzidas em células ou no meio de cultura num momento particular. Com esta finalidade, podem ser utilizados métodos diferentes. De acordo com um primeiro método, é utilizada uma célula hospedeira contendo, por exemplo, o gene da recombinase, i. e., o gene da integrase com ou sem o gene da excisionase, numa forma permitindo a sua expressão regulada. 0 gene da integrase com ou sem o gene da excisionase pode ser, por exemplo, introduzido sob o controlo de um promotor ou de um sistema de promotores induzíveis ou, alternativamente, num sistema sensível à temperatura.

Em particular o gene da integrase pode estar presente num fago sensível à temperatura, latente durante a fase de 40 crescimento e induzido a uma temperatura adequada (por exemplo, fago lisogénico λ Xis” cl857) .

Alternativamente, o gene pode estar sob o controlo de um promotor regulado, por exemplo, o promotor placUV5, a célula hospedeira é designada E. coli G6191.

De um modo preferido, a integrase com ou sem o gene da excisionase pode estar sob o controlo de um promotor regulado, por exemplo o promotor PBad do operão araBAD (arabinose), que é regulado pela arabinose (Guzman et al. , J. Bacteriol, 1995, 4121-4130; documento US 5028530). Particularmente, a utilização do promotor PBad permite a expressão suficiente da excisionase e da integrase na presença de arabinose, como o agente indutor e assim uma recombinação de mais de 90% dos plasmideos que estão presentes em elevado número de cópias nas bactérias, enquanto na ausência de arabinose, o promotor é inibido significativamente. A cassete para a expressão da integrase com/sem excisionase pode ser contida por um plasmídeo, um fago ou mesmo pelo plasmídeo da invenção na região não-terapêutica. Esta pode estar integrada no genoma da célula hospedeira ou ser mantida na forma replicativa. Essas células hospedeiras são, em particular, E. coli G6264 e E. coli G6289. De acordo com outro método, a cassete da expressão do(s) gene(s) está contida num plasmídeo ou num fago utilizado para transfectar ou infectar a cultura celular após a fase de crescimento. Neste caso, não é necessário que o gene esteja numa forma que permita a sua expressão regulada. Em particular, pode ser utilizado qualquer promotor constitutivo. O ADN pode também ser levado ao contacto com a integrase e quando aplicável com a excisionase in vitro, numa preparação de plasmídeo, por incubação directa com a proteína. 41 0 minicírculo produzido assim compreende consequentemente uma cassete de expressão contendo um ou mais genes de interesse a serem inseridos no microrganismo visado, não tem uma origem de replicação e compreende uma sequência attR resultante da recombinação especifica para um local entre uma sequência attB e uma attP ou uma sequência attL resultando de recombinação especifica para um local entre uma sequência attB e uma attP. 0 minicírculo pode ser consequentemente utilizado como vector suicida universal para a substituição génica em qualquer microrganismo. De facto, o minicírculo contendo um gene da substituição flanqueado por sequências homólogas e um gene de resistência a um antibiótico vai-se integrar facilmente num local visado do genoma de qualquer microrganismo por recombinação homóloga como representado na Figura 31. Um segundo evento da excisão que pode ser desencadeado por uma segunda pressão de selecção pode então seleccionar eficientemente apenas os microrganismos contendo o novo gene inserido dentro do seu genoma. A presente invenção refere-se consequentemente também a um método de engenharia genética de um microrganismo. Este novo método pode utilizado para conceber qualquer microrganismo independentememnte da sua origem. De facto, o minicírculo não contém qualquer origem de replicação e consequentemente pode ser utilizado universalmente para a substituição génica em qualquer tipo de microrganismos. Este método representa uma alternativa vantajosa à utilização do bacteriófago M13 para substituição génica por recombinação homóloga dupla num microrganismo.

De acordo com uma forma de realização particular da presente invenção, o minicírculo compreende um primeiro marcador seleccionável tal como um gene de resistência a um antibiótico, 42 permitindo a selecção para o primeiro evento de recombinação. 0 segundo marcador seleccionável preferido é o gene III ou o gene eliminado funcional III'. 0 gene III ou a sua variante funcional tem capacidade de conferir sensibilidade ao desoxicolato como descrito em Boecke et al. (Mol. Gen. Genet. , 186, 185-92, 1982) e consequentemente permite a contra-selecção do segundo evento de recombinação (Fig. 31) . 0 método consiste assim na introdução do minicirculo no microrganismo por qualquer método de transformação bem conhecido na técnica e, de um modo preferido, por electroporação, selecção do evento da integração do minicirculo numa cultura suplementada com um antibiótico ou sob outra pressão de selecção e seleccionar um segundo evento de excisão por tratamento com desoxicolato ou com outra pressão de selecção adequada. A presente invenção irá ser descrita mais detalhadamente com o auxílio dos exemplos que se seguem, os quais devem ser considerados como ilustrações não limitativas.

Breve descrição dos desenhos:

Figura 1: Organizaçao funcional da região de R6K envolvida na replicação.

Figura 2: Organização dos domínios funcionais da proteína Π do plasmídeo R6k.

Figura 3: Representação do protocolo para introduzir o gene pir no genoma de E. coli XAC1. 43

Figura 4: esquema de construção dos vectores pXL2666, 2730 e 2754. produção num produção num

Figura 5: Co Figura 6: fermentador de 2 Figura 7: fermentador de de struçao de pXL2 Crescimento e Crescimento e 800 L. 74. cinética da cinética de

Figura 8: Construção de pXL3056.

Figura 9: Visualização da proteína aFGF produzida por E. coli XAC-1pirllõ (pXL3056+PT7pol23) após indução. Os extractos de célula totais desnaturados são depositados em gel de poliacrilamida-SDS a 12,5%. M: marcador de massa molecular (Biorad, Low range) . Cada banda é identificada por uma seta e uma figura que indica a sua massa em kDaltons. 1: XAC-1pirllô (pXL3056+pUC4K) não induzido; 2: XAC-1pirll6 (pXL3056+pUC4K) induzido a 42 °C; 3: XAC-1pirll6 (pXL3056+PT7pol23) clone 1, não induzido; 4: XAC-1pirllô (pXL3056+PT7pol23) clone 1, induzido a 42 °C; 5: XAC-1pirllê (pXL3056+PT7pol23) clone 2, não induzido; 6: XAC-1pirllô (pXL3056+PT7pol23) clone 2, induzido a 42 °C; tl: 1 pg de aFGF purificado; t4: 4 pg de aFGF purificado.

Figura 10: Representações esquemáticas dos vectores pXL3029, pXL3030 e pXL3179 ou NV1FGF.

Figura 11: Representação esquemática dos domínios funcionais das proteínas iniciadoras R6K n. 44

Figura 12: Sequências nucleotidicas e de aminoácidos do gene pir compreendendo as mutações pirll6 e pir42.

Figura 13: Construção do vector suicida pirll6pir42 para recombinação homóloga.

Figura 14: representação esquemática dos produtos de PCR obtidos amplificando a região uidA::pirll6 +/-pir42.

Figura 15: Electroforese em gel de agarose mostrando a topologia do plasmídeo pCOR pXL3179 produzido em TEX1 ou TEX1pir42.

Figura 16: Representação esquemática do plasmídeo suicida pXL3749 contendo o gene pir-116cop21.

Figura 17: Electroforese em gel de agarose mostrando o número de cópias de plasmídeo de pXL2979 quando produzido na célula hospedeira E. coli TEX1cop21 (linhas 1-4), na célula hospedeira E. coli XAC1pir (linhas 5-8), em E. coli TEX1 (linhas 9-12) .

Figura 18: Representação da estratégia de clonagem para a construção do vector suicida recA.

Figura 19: Representação esquemática dos produtos de PCR obtidos amplificando regiões da estirpe TEX2de E. coli.

Figura 20: Electroforese em gel de agarose mostrando a topologia de pCOR pXL3179 produzido em E. coli TEX2pir42 (linha B), em E. coli TEX1pír42 (linha C), em E. coli TEX1 (linha D). 45

Figura 21: Análise do plasmídeo pXL3179 produzido por fermentação em E. coli TEX2pir42.

Figura 22: Ensaio baseado na fluorescência mostrando que a fluorescência aumenta com o número de cópias de plasmídeo.

Figura 23: Diagrama de plasmídeos rastreados no ensaio baseado na fluorescência.

Figura 24: Diagrama do plasmídeo pXL3830.

Figura 25: placa de agar demonstrando o rastreio baseado na fluorescência de mutantes com número aumentado de cópias produzidos por mutagénese aleatória.

Figura 26: Avaliação de mutantes com número aumentado de cópias identificados pelo método de rastreio baseado na fluorescência.

Figura 27: Diagrama da estratégia para avaliar mutantes pir!16 inseridos no genoma bacteriano.

Figura 28: Avaliação do número de cópias de pXL3179 em diferente estirpes mutantes pirll6* de E. coli.

Figura 29: Construção de um plasmídeo utilizado para produzir vectores minicírculo para recombinação homóloga em E. coli.

Figura 30: Construção de um vector minicírculo utilizado para produzir estirpes mutantes pirllô* de E. coli. 46

Figura 31: Diagrama de substituição génica por recombinação homóloga utilizando um vector minicirculo.

Figura 32: Demontração de clones recombinantes duplos cultivados em meio contendo desoxicolato de sódio.

Figuras 33A e B: Resultados da PCR controlo em recombinantes duplos.

I - MATERIAIS E MÉTODOS A) Materiais 1) Meios de cultura

Foram utilizados meios LB, 2XTY e SOC completos e meio M9 mínimo (Maniatis et al., 1989) . Os meios de agar foram obtidos pela adição de 15 g de agar Difco. Além disso, se necessário, estes meios foram suplementados com antibióticos (ampicilina ou canamicina) nas concentrações respectivas de 100 mg/L e 50 mg/L. Os substratos cromogénicos X-Gal e X-Gluc foram utilizados numa concentração de 40 mg/L. 2) Estirpes de E. coli, plasmideos e bacteriófagos

As estirpes de E. coli, plasmideos e bacteriófagos utilizadas são identificadas respectivamente nos exemplos abaixo. 47 B) Métodos

1) Manipulação do ADN 0 isolamento de ADN bacteriano (plasmidico e genómico) e ADN fágico (forma replicativa de M13), a digestão com endonucleases de restrição, a ligação dos fragmentos de ADN, electroforese em gel de agarose (em tampão TBE) e outras técnicas convencionais, foram realizadas de acordo com as recomendações dos fabricantes, para a utilização de enzimas ou de acordo com os processos descritos em "Molecular Cloning: a Laboratory Manual" (Maniatis et al., 1989).

Os marcadores de tamanho de ADN utilizados durante as electroforeses, são como se seguem: marcador de 1 kb (BRL) para os fragmentos lineares e o marcador de ADN super-enrolado (Stratagene) para os plasmídeos não digeridos. A sequenciação foi realizada de acordo com a técnica de Sanger (Sanger et ai., 1977) adaptada ao método automatizado utilizando didesoxinucleótidos fluorescentes e polimerase de ADN Taq (PRISM Ready Reaction DyeDideoxy Terminator Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems).

Os oligodeoxinucleótidos utilizados (designados por "seq+no.", ver abaixo) foram sintetizados no "Applied Biosystems 394 DNA/RNA Synthesizer" pelo método das fosforamidites, utilizando grupos protectores de α-cianoetilo (Sinha et al., 1984) . Após a síntese, os grupos de protecção são removidos por tratamento com amónia. Duas precipitações com butanol permitem que o oligonucleótido seja purificado e concentrado (Sawadogo et al., 1991) . 48

Sequências dos oligonucleótidos utilizados na amplificaçao por PCR: SEQ ID N° 3 5'-GACCAGTATTATTATCTTAATGAG-3' SEQ ID N° 4 5'-GTATTTAATGAAACCGTACCTCCC-3' SEQ ID N° 5 5'-CTCTTTTAATTGTCGATAAGCAAG-3' SEQ ID N° 6 5'-GCGACGTCACCGAGGCTGTAGCCG-3'

As reacções de PCR (Saiki et al., 1985) foram realizadas nas condições seguintes, num volume total de 100 pL. A mistura de reacção compreende 150 ng de ADN genómico da estirpe a ser estudada, 1 pg de cada dos dois iniciadores oligonucleotidicos (24-meros), 10 pL de tampão de PCR 10 x, cuja composição é como se segue "KC1 500 mM, gelatina a 0,1%, MgCl2 20 mM, Tris-HCl 100 mM pH 7,5" e 2,5 unidades de polimerase de ADN Taq (Amplitaq Perkin-Elmer). As condições de PCR, no equipamento Perkin-Elmer Cetus DNA Thermal Cycler são como se seguem: 2 min a 91 °C, 30 ciclos sucessivos de desnaturação (1 min a 91 °C), hibridação (2 min a 42 °C) e alongamento (3 min a 72 °C) e finalmente 5 min a 72 °C. Os produtos assim obtidos, que são ou não digeridos com uma enzima de restrição, são analisados por electroforese em gel de agarose.

Foi realizada uma análise das várias espécies de plasmídeos por topoisomerases de ADN de acordo com o processo seguinte: as enzimas, purificadas no laboratório, são incubadas durante 1 hora a 37 °C. As misturas de reacção (volume total: 40 pL) têm a composição seguinte: 150 ng de plasmídeo, 300 ng de topoisomerase I de ADN ou 150 ng de girase de ADN de E. coli ou 160 ng de topoisomerase IV de ADN de S. aureus e 20 pL de tampão específico para cada enzima. A composição destes tampões é indicada abaixo: 49 para a topoisomerase I de ADN:

Tris-HCl 50 mM pH 7,7, KC1 40 mM, DTT 1 mM, BSA 100 pg/inL, MgCl2 3 mM, EDTA 1 mM; para a topoisomerase IV de ADN:

Tris-HCl 60 mM pH 7,7, MgCl2 6 mM, DTT 10 mM, BSA 100 pg/mL, ATP 1,5 mM, glutamato de potássio 350 mM; para a girase de ADN:

Tris-HCl 50 mM pH 7,7, MgCl2 5 mM, ATP 1,5 mM, DTT 5 mM, BSA 100 pg/mL, KC1 20 mM. 50 3) Transfecçao celular mediada por um lipofectante catiónico

As células utilizadas são fibroblastos NIH 3T3 de murganho inoculadas no dia anterior em placas de 24 poços, numa densidade de 50000 células por poço. 0 meio de cultura utilizado é o meio DMEM, contendo glicose 4,5 g/L e suplementado com soro de vitelo fetal a 10% e soluções de glutamina 200 mM e antibióticos (estreptomicina 5,103 μ/mL, penicilina 5,103pg/mL) (Gibco) a 1%. É misturado ADN plasmidico (1 pg em 25 pL de NaCl a 9%), numa base volume-volume, com uma suspensão de lipofectante. São testadas quatro proporções "cargas de lipofectante/cargas de ADN": 0, 3, 6 e 9. Estas proporções são calculadas considerando que 1 pg de ADN plasmidico contém 3,1 nmol de cargas negativas e que o lipofectante contém 3 cargas positivas por molécula. Após um tempo de contacto de 10 minutos para permitir a formação do complexo de ADN/lípido, são introduzidos 50 pL da mistura ADN-lipofectante nas células em meio de cultura isento de soro (500 pL) . As células foram pré-lavadas duas vezes com este mesmo meio. É assim evitada a inibição da transfecção pelo soro. Após incubação (2 horas a 37 °C numa incubadora de CCq) , é adicionado soro de vitelo fetal a 10% ao meio. As células são então reincubadas durante 24 horas. 4) Medição da actividade luciferase de células eucariotas

Isto é realizado 24 horas após a transfecção. A luciferase catalisa a oxidação de luciferina na presença de ATP, Mg2+ e O2, com produção concominate de um fotão. A quantidade total de luz emitida, medida por um luminómetero, é proporcional à actividade da luciferase da amostra. Os reagentes utilizados são fornecidos 51 por Promega (sistema de ensaio da luciferase) e utilizados de acordo com o processo recomendado. Após a lise das células, a fracção insolúvel de cada extracto é eliminada por centrifugação. 0 ensaio é realizado em 5 pL do sobrenadante que pode ou não ser diluído em tampão de lise celular. 5) Medição da concentração de proteína nos extractos celulares

Isto é realizado de acordo com o método BCA (Pierce) utilizando ácido bicinconínico (Wiechelman et al., 1988) . A gama de padrões de BSA é preparada em tampão de lise (ver III-B-4) . As amostras a serem ensaiadas e as da gama são pré-tratadas, numa base de volume-volume, com iodoacetamida 0,1 M/tampão Tris 0,1 M, pH 8,2, durante 1 hora a 37 °C. Este tratamento permite prevenir a interferência, durante o ensaio, do agente redutor (DTT) presente no tampão de lise. O resultado de ensaio é lido a 56 2 nm. EXEMPLO 1: Construção das estirpes hospedeiras XAC-1 pir e pir!16 por recombinação homóloga A estirpe utilizada foi a estirpe XAC-1 de E. coli (Normanly et al., 1980). 0 gene argE desta estirpe inclui vantajosamente uma mutação da glutamina-53 (CAG) para codão âmbar (TAG) (Meinnel et ai., 1992). O gene argE pertence ao operão divergente argECBH e codifica para uma enzima da biossíntese da arginina, N-acetilornitinase. XAC-1 não pode, por esse motivo, sintetizar arginina e, consequentemente, crescer em meio mínimo. Este auxotrofia irá ser aliviada se a estirpe 52 contiver um plasmídeo que permita a expressão de um ARNt supressor. Irá ser assim possível seleccionar bactérias contendo esse plasmídeo, por cultura em meio mínimo. De forma a permitir aí a replicação de plasmídeos derivados de R6K, foi necessário introduzir o gene pir no genoma de XAC-1, por recombinação homóloga. 0 gene pir (de tipo selvagem ou mutado) é introduzido em lugar de uidA por permuta entre o gene uidA de tipo selvagem e uma cópia interrompida pelo gene pir (ou pirllô). 0 gene uidA codifica para a β-glucuronidase, a enzima da hidrólise de β-glucurónidos. Este gene pode ser inactivado sem qualquer problema uma vez que não é essencial para o crescimento em meios sintéticos convencionais, em que não são utilizados β-glucurónidos. Além disso, a actividade β-glucuronidásica pode ser controlada através de um substrato cromogénico, X-Gluc, cuja hidrólise liberta um pigmento azul. 1) Construção de um vector suicida contendo a cassete "KmR-uidA:: pir (ou pir!16)

Os requerentes utilizaram uma estratégia envolvendo um hospedeiro bacteriano único e minimizando as modificações do genoma da estirpe de interesse. Foi utilizado o fago M13mpl0 (Messing e Vieira; 1982) como um vector suicida (Blum et ai., 1989) . Uma mutação âmbar no gene II, a qual é essencial para a replicação, reduz o espectro de hospedeiros deste M13 para as estirpes, tal como TG1 (supE) que produzem um ARNt supressor âmbar; esta não será, por esse motivo, capaz de replicar em estirpes E. coli sup+, tal como XAC-1.

Foram purificadas cassetes BamHI com 3,8 kb, contendo o gene de resistência à canamicina de Tn5 e __uidA: :pir ou pirllô, 53 respectivamente a partir de M13wm34 e 33 (Metcalf et al., 1994). Estas foram clonadas em M13mpl0 linearizado com BamHI. Os clones recombinantes foram seleccionados por plaqueamento em meio de agar LB suplementado com canamicina, após electroporação das misturas de ligação em TG1. A conformidade dos clones obtidos foi mostrada analisando o perfil de restrição e por sequenciação da região correspondente à mutação pirll6. 2) Introdução dos genes pir ou pirllô no genoma de E. colí XAC-1 por recombinação homóloga

Na Figura 3 são apresentados a estratégia adoptada e os vários eventos envolvidos. a) Primeiro evento de recombinaçao

Foi transformada a estirpe XAC-1 por electroporação com 10, 100 ou 2000 ng de cada RF (mplO-_uidA::pir ou pirllô) . Um terço de cada mistura de expressão foi plaqueada em placas de LB contendo canamicina e incubada de um dia para o outro a 37 °C. Os fagos mplO-_uidA::pir ou pirllô não podem replicar na estirpe XAC-1 (sup+). Por esse motivo, o marcador de resistência à canamicina ("KmR"), apenas pode ser mantido por integração no genoma da bactéria através de uma recombinação homóloga com a cópia do tipo selvagem do gene uidA. Na Tabela 1 são apresentados os resultados das electroporações de XAC-1. A eficiência de transformação obtida foi de 4,109 transformantes por pg de pUC4K. 54 CONSTRUÇÃO Número de colónias obtidas com as quantidades de ADN transformado 10 ng 100 ng 2000 ng Ml3mpl0-_uidA: :pir 1 41 146 Ml3mpl0uidÃ;;pir116 0 16 124 TABELA 1

Nas condições de teste, o número de integrantes aumentou de uma forma não linear com a quantidade de ADN. Considerando a eficiência de transformação e o tamanho dos RF (11,7 kpb), foi possivel ter uma ideia aproximada do nível de recombinação. Considerando o ponto a 100 ng, foi obtida uma frequência de recombinação de cerca de IO-6. b) Segundo evento de recombinação O segundo evento de recombinação irá ser então seleccionado pela resistência das estirpes ao desoxicolato ("DocR").

Para realizar isto, foram cultivados cinco integrantes de cada construção em meio 2XTY suplementado com desoxicolato de sódio a 0,2%. Apareceram duas populações distintas. Alguns clones originaram um turvação bastante visível após cerca de 8 horas a 37 °C (dois clones para a construção pir e três para a construção pirllô). Outros clones originaram uma cultura densa apenas após uma noite a 37 °C. Estes foram praticamente todos sensíveis à canamicina ("Km"), como esperado. Para cada um dos electroporantes estudados, os descendentes 50 Kms foram riscados em meio LB suplementado com X-Gluc. Após 48 horas a 37 °C, os clones UidA+ eram azuis pálidos enquanto os que tinham sofrido uma substituição alélica (caso N° . 1, Figura 3) permaneceram 55 brancos neste meio (UidA~) . A tabela 2 resume a análise fenotipica dos recombinantes duplos obtidos. De 18 a 30% dos recombinantes duplos sofreram uma substituição alélica. Número de Kms Percentagem de UidA Estirpe entre os DocR entre os Kms XAC-1 pir-2 50/50 18 XAC-1 pir-3 50/50 24 XAC-1 pir-4 50/50 34 XAC-1 pirl16-1 50/50 32 XAC pirl16-4 35/50 30 TABELA 2 3) Verificação da natureza de carácter Pir+ das estirpes obtidos por recombinação

Para assegurar o carácter Pir+ das estirpes obtidas por recombinação dupla, a requerente transformou três clones de cada construção com pBW30 (Metcalf et al., 1994). O facto dos transformantes terem sido obtidos para todas as estirpes de teste permitiu mostrar a funcionalidade dos genes pir e pirllê, que estavam integrados no genoma de XAC-1. Não foi obtido qualquer transformante com a estirpe parental XAC-1, sob as mesmas condições. A requerente prosseguiu o estuddo de dois clones XAC-lpir (B e C) e dois clones XAC-1pirllô (E e D). 56

4) Verificação das estirpes obtidas por recombinação, por amplificaçao por PCR

Para confirmar a substituição alélica, os requerentes verificaram as regiões genómicas de ambos os lados do local uídA por amplificação por PCR. Cada par de oligonucleótidos consistiu de um oligonucleótido correspondente a uma região interna de pír e num segundo oligonucleótido correspondente a uma região, próxima do uidA cromossómico, mas não dentro do fragmento que serviu para a recombinação. A sequência deste último oligonucleótido foi determinada utilizando a sequência ECOUIDAA de Genbank (número de acesso: Ml 46 41) . A requerente foi assim capaz de verificar a posição exacta do gene pir no genoma bacteriano. A natureza dos fragmentos amplificados, cujo tamanho está de acordo com o que poderia ser esperado, foi confirmada por digestão com MluI. EXEMPLO 2: Construção de vectores plasmídicos derivados de R6K contendo o marcador de selecção sup Phe

Foram construídos vectores contendo ori γ a partir de R6K e do gene de resistência à canamicina (pXL2666). A observação de multímeros pXL2666 na estirpe BW19610 (pirll6) 5 (Metcalf et al., 1993) levou a requerente a estudar o efeito do fragmento cer de ColEl neste fenómeno. Depois, a requerente introduziu a cassete de expressão do ARNt supressor da fenilalanina (sup Phe) no vector ori Y~KmR-cer (pXL2730). Este vector, pXL2760, serve como base para a construção de vectores que podem ser utilizados em terapia génica. 57 1) Construção e análise de vectores contendo ori γ proveniente de R6K e o gene de resistência à canamicina a) Construções

No primeiro plasmideo construído, pXL2666, o gene de resistência à canamicina era proveniente de pUC4K (Vieira e Messing; 1982) e a origem de replicação, contida num fragmento EcoRI-BamHI com 417 pb, era proveniente do vector suicida pUT-T7pol (Herrero et al., 1990) (Figura 4). A transferência de pXL2666 para as estirpes BW19094 e 19610 (Metcalf et al., 1994) permitiu mostrar que a quantidade d3 plasmideo está de facto aumentada numa estirpe pirllô, em comparação com o mesmo plasmideo numa estirpe pir. No entanto, a análise electroforética dos plasmídeos não digeridos mostrou que este aumento está associado com o aparecimento de algumas formas multiméricas. Este fenómeno está provavelmente bastante associado com a recombinação intermolecular entre cópias múltiplas do plasmideo. Assim, a requerente construiu pXL2730 por clonagem do fragmento cer do plasmideo de E. coli natural, ColEl que tinha revelado permitir a resolução de dimeros de plasmideo, em cis (Summers e Sherrat, 1984), para pXL2666. 0 fragmento utilizado corresponde a um fragmento Hpall com 382 pb proveniente de ColEl (Leung et al., 1985) . Este contém um local

de recombinação intermolecular especifico; de forma a funcionar, este envolve apenas proteínas do hospedeiro incluindo as recombinases XerC e XerD e os factores acessórios ArgR e PepA (Stirling et al., 1988, 1989; Colloms et al., 1990) . Para assegurar que os efeitos observados são de facto devidos ao fragmento cer, a requerente construiu também o plasmideo de controlo pXL2754, em que o fragmento cer tem uma eliminação de 165 pb. Esta eliminação revelou abolir a acçao de cer na 58 resolução dos multímeros (Leung et al., 1985). Na Figura 4 são apresentados vários passos de clonagem que originam a construção destes plasmídeos. b) Análise quantitativa e qualitativa das espécies de plasmídeos (i) análise por electroforese em gel de agarose A análise de electroforética dos diferentes plasmídeos construídos permitiu a demonstração de várias espécies de plasmídeos, os quais são variáveis de acordo com as estirpes utilizadas. 0 tamanho dos plasmídeos não digeridos foi avaliado em comparação com um marcador de ADN super-enrolado. Na estirpe pir (BW19094), os plasmídeos pXL2666, 2754 e 2730 estavam quase inteiramente na forma monomérica. As bandas acima de cada banda principal correspondem a vários topoisómeros ligeiramente menos super-enrolados, como confirmado pelo perfil observado após a acção da girase de ADN sobre pXL2730.

No caso da estirpe pirllô (BW19610), os perfis foram diferentes: com os plasmídeos pXL2666 e 2754 foram observadas espécies diferentes variando de monómeros a multímeros (2, 3 ou 4 unidades), sendo a forma principal o dímero. Após digestão com FcoRI, apenas foi encontrado ADN plasmídico linear; estas espécies de plasmídeo correspondem a multímeros de plasmídeo ou a vários topoisómeros. No entanto, uma vez que o tamanho das formas determinadas de acordo com o marcador de ADN super-enrolado foi um produto completo do plasmídeo monomérico, é altamente provável que estas sejam multímeros. A formação de multímeros foi muito provavelmente atribuível à mutação pirllô, 59 embora as duas estirpes BW19094 e BW19610 não sejam estritamente isogénicas (BW19610 é recA) . 0 perfil obtido com pXL2730 foi diferente: embora as formas multiméricas fossem ainda visíveis, a forma principal é a forma monomérica. 0 fragmento cer pode facilitar assim a resolução dos multímeros de plasmídeos que a requerente construiu, independentemente de recA, em BW19610.

(ii) análise após tratamento com topoisomerases de ADN

Para refutar a teoria de que as formas observadas nas estirpes contendo o alelo pirll6 são topoisómeros específicos, cada preparação de plasmídeo foi submetida à acção de topoisomerases de ADN. As actividades das várias enzimas sob as condições experimentais foram como se segue: relaxamento do ADN para a topoisomerase I de ADN de E. coli, superenrolamento negativo do ADN relaxado para a girase de ADN de E. coli e desemaranhamento do ADN entrelaçado e relaxamento do ADN super-enrolado pela topoisomerase IV de ADN de S. aureus. A acção da topoisomerase IV de ADN permitiu mostrar que as formas de plasmídeo de elevado peso molecular não resultaram do emaranhamento de várias moléculas de plasmídeo; neste caso, estas teriam sido então convertidas na espécie monomérica. A funcionalidade da enzima foi, naturalmente, verificada numa preparação de ADN de cinetoplasto, composto por moléculas de ADN emaranhadas (não mostrado). A actividade de relaxamento foi também visível uma vez que são obtidas espécies que migram menos do que os controlos não tratados. A acção da girase de ADN permitiu converter os topoisómeros ligeiramente relaxados na espécie mais super-enrolada extraída da bactéria (principalmente monómero ou dimero). Além disso, esta permitiu verificar que os ADN preparados estavam principalmente na forma super-enrolada. 60

As amostras tratadas permitiram assim que os resultados acima fossem confirmados no que respeita à espécie principal para cada construção. A topoisomerase de ADN I relaxou de facto o ADN, mas apenas parcialmente. Isto pode ser devido aos plasmídeos estudados conterem apenas algumas regiões de cadeia simples, às quais esta enzima se liga de um modo preferido (Roca, 1995) . 2) Introdução do marcador de selecção sup Phe em pXL2730 A requerente utilizou a cassete de expressão do gene de ARNt supressor sintético (Phe) (Kleina et al., 1990). Esta introduziu uma fenilalanina na cadeia polipeptídica crescente em resposta a um codão de TAG. Além disso, esta permitiu a produção de uma proteína ArgE em XAC-1 que foi suficientemente activa para permitir um bom crescimento em meio deficiente em arginina. 0 sup Phe foi expresso constitutivamente no plasmídeo pCT-2-F (Normanly et al. , 1986) a partir de um promotor sintético derivado da sequência promotora, Plpp, do gene lpp de E. coli. A jusante deste gene, a transcrição foi terminada pelo terminador sintético, Trmcr do operão rrnC de E. coli (Normanly et al., 1986). Na Figura 5 estão indicados os vários passos de clonagem.

Foram realizadas várias subclonagens em XAC-1. A funcionalidade da cassete de expressão do ARNt supressor foi assim verificada utilizando a actividade α-galactosidase desta estirpe, que existe apenas se ocorrer supressão do codão âmbar do gene lacZun8am· 0 passo final consiste na introdução da cassete de expressão sup Phe em pXL2730. Os resultados obtidos com o fragmento cer (B-l-b) levaram a requerente a seleccionar este plasmídeo e não pXL2666. A requerente conservou o gene de resistência à canamicina para facilitar a clonagem subsequente, 61 em particular, de forma a ter disponível um rastreio adicional durante a clonagem final (perda de KmR) . EXEMPLO 3: Validação do vector plasmídico para aplicações em terapia génica por transfecção de fibroblastos de murganho 1) Construção do vector repórter pXL2774

Para testar a validade do sistema para terapia génica para produzir ADN plasmídico, a requerente introduziu um gene de repórter, a qual pode ser utilizado em células eucariotas, em pXL2760. A requerente utilizou o gene luc que codifica para a luciferase de Photinus pyralis, uma vez que o teste de medição da bioluminescência é muito sensível e linear ao longo de uma ampla gama e o ruído de fundo devido à actividade endógena das células eucariotas é muito baixo. 0 gene luc foi controlado por sequências intensificadoras do promotor de um gene precoce de citomegalovírus humano (promotor de CMV) que permitiu um nível elevado de expressão. Estava presente uma região não traduzida na extremidade 3' de luc, originária do vírus SV40, que continha o sinal de poliadenilação (poli(A)+). Após a clonagem intermediária que permitiu que o número de locais de restrição disponíveis fossem aumentados, a cassete "promotor do CMV-Iuc-poli(A)+" foi introduzida no vector mínimo ori γ-cer-sup Phe (pXL2760) em lugar do marcador KmR. 0 plasmideo resultante foi denominado pXL2774. A figura 6 mostra os vários passos de clonagem. As misturas de ligação foram transformadas para o interior de XAC-1pírll6 por electroporação. A incubação permitindo às bactérias expressarem marcadores de selecção foi realizada em meio rico (meio SOC); foi assim necessário lavar as células duas vezes com meio M9 antes do plaqueamento. Isto 62 possibilitou a remoção do meio residual, que teria resultado num ruido de fundo da cultura em meio mínimo. 0 meio seleccionado para plaquear as células electroporadas foi o meio mínimo M9, que permite seleccionar bactérias expressando um ARNt supressor e assim a presença dos plasmídeos da requerente. Ά adição de X-Gal permitiu, através da coloração azul, visualizar a expressão do ARNt supressor. As placas foram analisadas após cerca de 20 horas a 37 °C. A ausência de colónias no controlo isento de ADN assegura aos requerentes que a selecção foi correcta, mesmo com inoculações densas. Todos os clones examinados por restrição (8) continham de facto um plasmídeo, correspondedo ao perfil esperado. O plasmídeo construído assim, pXL2774, foi preparado a partir de um clone cultivado num litro de meio M9 liquido (cerca de 18 horas a 37 °C) , através de uma de técnica envolvendo, inter alia, um passo de permuta iónica (kit Promega, MegaPreps) . A quantidade de ADN reunido foi 2 mg. 2) Análise do vector repórter pXL2774 transfectado em células de mamífero.

Foi avaliada a capacidade de pXL2774 para transfectar células eucariotas e permitir a expressão da luciferase por transfecção em fibroblastos de murganho NIH 3T3. O vector seleccionado como referência foi o plasmídeo pXL2622 (i. e., o plasmídeo pGL2 de Promega cujo promotor SV40 foi substituído pelo promotor CMV), que contém a mesma cassete de expressão da luciferase que pXL2774, mas num replicão diferente. Este é um derivado de ColEl de 6,2 kb que contém o gene de resistência à ampicilina. Este plasmídeo serviu como um controlo. Na Tabela 3 63 estão indicadas as actividades da luciferase (expressas como RLU ou unidades de luminescência relativa).

Os melhores resultados foram obtidos com uma proporção "cargas de lipofectante/cargas de ADN" de 6; nestas condições, pXL2622 e 2774 parecem ser equivalentes. TABELA 3 PXL2622 PXL2774 Proporções RLU/pg de Média Coeficiente RLU/pg de Média Coeficiente de carga proteínas de variação proteínas de variação e por poço (%) e por poço (%) 0, 0 não 0, 0 não 0 0, 0 detectável 0, 0 detectável 0, 0 0, 0 9,9 106 3,3 106 3 6,2 106 7,6 106 22 2,9 106 2,9 106 13 β,β 106 2,4 106 1,2 107 9,4 106 6 1,5 107 1,5 107 19 9,9 106 1,0 107 7 1,9 107 1,1 107 9,5 106 1,1 107 9 7,5 106 1,0 107 26 8,3 106 6,4 106 13 1,4 107 8,5 106 EXEMPLO 4: Verificação da natureza de vector suicida dos plasmídeos pCOR em E. coli A natureza não-replicativa dos plasmídeos do tipo pCOR derivados de R6K foi verificada por uma experiência de electroporação de plasmídeos pUC4K (ori ColEI-KmR, (Vieira e Messing, 1982)) e pXL2730 (ori gama de R6K-KmR, ver o Exemplo 2) 64 em E. coli JM109 (Yanisch-Perron et al., 1985). 0 electroporador utilizado foi o Biorad Gene Pulser e foram preparadas células JM109 electrocompetentes e utilizadas de acordo com o processo do fabricante (Manual de instruções de electro-transformação bacteriana e controlador de pulso, número de catálogo 165-2098).

As células electrotransformadas foram plaqueadas em meio LB suplementado com canamicina (50 mg/L) e incubadas de um dia para o outro a 37 °C. Os resultados obtidos são apresentados abaixo.

Resultados

Plasmideo Quantidade transformada (ng) Número de transformantes Eficácia (número de transformantes/ng de plasmideo) pUC4K 0,01 » 2000 > 2105 pXL2 73 0 5 0 0

Estes resultados mostram que se verificou um minimo de 5 logs da diferença entre a eficácia da transformação de um derivado de ColEI (pUC4K) e o de um derivado de R6K (pXL2730) numa estirpe que não expressa o gene pir. Numa estirpe pir+, tal como XAC-lpirll6, a eficácia de electrotransformação de plasmideos derivados de R6K normalmente atinge ou excede os 108 transformantes/pg de plasmideo. 65 EXEMPLO 5: Produção de ADN plasmídico por cultura de elevada densidade da estirpe XAC-lpirll6 (pXL2774) de E. coli: processo de fermentação 5.1. Estirpes:

Produção de um plasmídeo mínimo, pXL2774, em E. coli XAC-1pirllô (Exemplo 1); este plasmídeo compreende os elementos seguintes: ori R6K-cer-tRNAamsupPhe e uma cassete de expressão do gene repórter luc sob o controlo do promotor CMV (Exemplo 3) . Foi desenvolvido um processo de produtividade elevada para a produção de plasmídeos deste tipo. 5.2. Meios e condições de cultura: a) Meio de crescimento: A composição do meio definido utilizado nas culturas de inoculo (g/L) : Na2HP04 6, KH2P04 3, NaCl 0,5, NH4C1 1, NH4H2P04 3, glicose 5, MgS04-7H20 0,24, CaCl2-2H20 0,015, tiamina HC1 0,010

Composição do meio complexo utilizado para as culturas descontínuas alimentadas (g/L): KH2P04 8, K2HP04 6,3, Na2HP04 1,7, (NH4)2S04 0,74, NH4C1 0,12, extracto de levedura 3, glicose 2,

MgS04-7H20 2,4 g/L, CaCl2-2H20 0, 015, tiamina 0,010, solução de sais (Fe, Mn, Co, Zn, Mo, Cu, B, Al). A composição do meio definido para as culturas em meio cultura de descontínua alimentada é idêntico ao meio complexo, mas o extracto de levedura é substituído por NH4C1 2,5 g/L. 66 b) Condições da cultura descontínua alimentada:

Foram realizados estudos em fermentadores de 2 litros (Setric França) contendo 1 L de meio para definir as condições óptimas para cultivar e produzir o ADN plasmídico. 0 fermentador foi inoculado com 80 mL de uma cultura de inoculo que atingiu o início da fase estacionária do crescimento.

Durante a fermentação, o pH foi controlado e ajustado automaticamente entre 6,9 e 7,0 com amónia aquosa a 10% (p/v); a temperatura foi mantida a 37 °C; a arejamento foi regulado para 75 L/h ((1,1 vvm) a uma pressão de 0,2 bar e o oxigénio dissolvido foi ajustado para (40% da saturação do ar por retroacção sobre a velocidade de agitação e, se necessário, por enriquecimento com oxigénio puro.

Todos os parâmetros (pH, temperatura, agitação, DO, O2 e CO2 nos gases do efluente) foram recolhidos e calculados em linha através de um interface HP3852 ligado a um Hewlett-Packard 9000. A composição base do meio de alimentação foi como se segue: fonte de carbono a 50%, sulfato de magnésio a 0,7%, tiamina a 0,02%; para o meio complexo, foi adicionado extracto de levedura a uma concentração, de um modo preferido, entre 5 e 10%.

Para adaptar as condições de cultura a fermentadores de 800 litros, foram realizadas sequências de produção constituídas por duas culturas de inoculo sucessivas, numa escala laboratorial: inoculo I num frasco cónico agitado e inoculo II num fermentador de 2 litros (cultura descontínua), seguido por cultura de produção descontínua alimentada, num fermentador de 7 litros. 67 5.3. Resultados

Foram estudadas várias condições de cultura em meio complexo, em meio definido e em várias velocidades de crescimento. Em todos os casos, após a cultura descontínua inicial da estirpe bacteriana e o consumo da fonte de carbono, foi adicionado o meio de alimentação ao fermentador através de uma bomba peristáltica ligada a um perfil de adição pré-programado. Este perfil foi deduzido de experiências anteriores em que a velocidade de alimentação tinha sido controlada pelo nível de oxigénio dissolvido ou por uma velocidade de crescimento constante.

Além disso, para extrapolar sem dificuldade as condições de fermentação em 2 litros para um fermentador de 800 L sem sobreoxigenação do meio, a carência de oxigénio máxima no final da cultura foi estabelecida em 2,5-3 mM/min. Para isto, a velocidade de crescimento do microrganismo foi reduzida, se necessário, variando a velocidade de alimentação da carga complementar.

Como verificado na Tabela 4, foram obtidos resultados muito bons no meio complexo e no meio definido, à escala laboratorial e à escala do fermentador de 800 litros; além disso, o crescimento do ADN plasmídico e a cinética de produção são totalmente comparáveis (ver as figuras 6 e 7). 68

Tabela 4:

Meio complexo Meio definido fermentador de 2 ou 7 L fermentador de 800 L fermentador de 2 L Duração de fermentação (horas) 40 39 48 ph-L 0, 130 0,132 0, 124 DO (600 nm) 114 100 94 x g/L 44 37 30 ADN plasmidico (mg/L meio) 115 100 100 ADN plasmidico (mg/gX) 2,6 2,7 3,3 X = biomassa (peso das células secas)

Dos resultados globais resulta que: a alteração da escala do fermentador de 2 litros para 800 litros pode ser realizada sem qualquer problema, - o oxigénio consumido está significativamente correlacionado com a biomassa produzida (1,08 g 02/g de biomassa produzida), - o plasmídeo foi estável durante, pelo menos, 50 gerações sem pressão de selecção, 69 pode ser obtida uma biomassa abundante, superior a 40 g de células secas/litro, em meio complexo, a produção de ADN plasmidico atinge 100 mg de ADN super-enrolado/L de meio, - verificou-se uma correlação muito boa entre a produção de ADN e a biomassa: a produção pode ser estimada (1 mg de ADN plasmídico/unidade de DO ou alternativamente (2,7 mg de ADN plasmídico/g de biomassa, independentemente da duração da fermentação, - a utilização de um meio definido permite também a obtenção de uma biomassa abundante (30 g de células secas/L) e elevada produção de ADN plasmidico (100 mg/L), sem qualquer perda de produtividade. EXEMPLO 6: Transferência de pXL2774 para células animais, in vitro e in vivo 6.1. Transferência de pXL2774 para células animais in vitro

Foi testada a capacidade do plasmídeo mínimo pXL2774 para transfectar várias linhas celulares in vitro, em células tanto de origem humana como de origem murina. Foi utilizado o plasmídeo pXL2784 como controlo. Este contém a mesma cassete de expressão eucariota (promotor CMV-luciferase-poliA) como pXL2774, mas este é um derivado do ColEl de 6,4 kb que compreende o gene para conferir resistência à canamicina em E. coli. 70

As células testadas sao as seguintes: Células Tipo ref. Atcc/ ref. literatura 3LL Carcinoma pulmomar de murganho NIH 3T3 Fibroblastos de embrião de murganho CCL92 293 Células renais de embrião humano transformadas com adenovírus do tipo 5 CRL1573 HeLa Carcinoma humano do colo do útero CCL2 Caco-2 Adenocarcinoma do cólon humano HTB37 H46 0 Carcinoma de pulmão humano sem pequenas células HTB177 ECV 304 Células endoteliais do cordão Takahashi umbilical humano et al., 1990

As condições de transfecçao foram como se segue: D-l: Inoculação das células numa densidade de 100000 células por 2 cm2 poço (placas de 24 poços) em meio DMEM (Meio de Eagle modificado de Dulbecco) suplementado com soro de vitelo fetal a 10% (FCS). D-3: Transfecção das células, com 10 pL de uma solução de transfecção contendo: 0,5 pg de ADN, NaCl 150 mM, glicose a 5% e 3 nmol de lipofectante RPR120 535 por pg de ADN, em 250 pL de meio de cultura, que foi ou não foi suplementado com FCS a 10%. Após a incubação durante 2 horas, o meio foi substituído por 500 pL de meio DMEM suplementado com FCS a 10%. D-4: Renovação do meio de cultura 71 D-5: Lavagem das células com PBS, seguida por lise com 100 pL de tampão de lise Promega (Promega Cell lise Buffer E153A). O ensaio da actividade da luciferase foi realizado num luminómetro Lumat LB 9501 (Berthold) em 10 pL de lisado, com uma duração de integração de 10 segundos. O reagente utilizado foi o de Promega (Promega Luciferase Assay Substrate). Os resultados, ordenados nas tabelas seguintes 5-8, são expressos em RLU (Unidades relativas de luz) para 10 pL de lisado (média da medição em 4 poços). São também proporcionados os coeficientes da variação (CV). São apresentados abaixo os resultados de transfecções na ausência de soro.

TIPOS DE CÉLULAS NIH 3T3 3LL 293 pXL2774 37763380 559270 1884200 RLU 16 25 73 CV pXL2784 113764 1723546 RLU 24 101 CV

TIPOS DE CÉLULAS

HeLa CaCo2 H460 ECV304 pXL2 7 7 4 11000000 15 1108422 14 1459501 5 36450 23 pXL2 7 8 4 557930 87 93610 40 7563 11 168795 40 72 São apresentados abaixo os resultados de transfecções na presença de soro (10%):

TIPOS DE CÉLULAS NIH 3T3 3LL 293 pXL2774 50612590 566377 992500 12 18 59 PXL2784 12693780 436704 2300000 38 12 47

TIPOS DE CÉLULAS

HeLa H46 0 ECV304 pXL2774 9490000 857385 18021 25 16 30 PXL2784 1508480 433023 32074 23 27 47

Estes resultados revelam a capacidade de pXL2774 para transfectar eficazmente, in vitro, vários tipos de células de origem murina e humana. A expressão do gene repórter luc permitiu mostrar que a sua eficácia de transfecção é, pelo menos, tão boa quanto a de um plasmídeo "convencional", derivado de ColEl, que contém a mesma cassete de expressão de luciferase. 73 6.2. Transferência de pXL2774 para animais (murganhos), in vivo a) Modelo 1: ADN nu em músculo tibial cranial de murganho

Foi injectado ADN plasmidico nu, dissolvido em "glicose a 5%, NaCl 150 mM" no músculo tibial cranial de murganhos 0F1. Os músculos foram removidos 7 dias após a injecção, cortados em pedaços, homogeneizados em 750 pL de tampão de lise (Promega Cell lise Buffer E153A) e depois centrifugados a 20000 χ g durante 10 minutos. O ensaio da actividade da luciferase foi realizado em 10 pL de sobrenadante após adição de 50 pL de reagente (Promega Luciferase Assay Substrate). A leitura foi realizada num luminómetero Lumat LB9501 (Berthold) com uma duração de integração de 10 segundos.

Os resultados são apresentados na tabela abaixo.

Plasmídeo PXL2784 PXL2774 PXL2784 PXL2774 Número de músculos: 8 8 10 10 Volume injectado (il) : 30 30 33 33 pg de ADN/músculo 19 13,5 10 6,25 RLU (para 10 pL) Média 80922 471733 35329 30569 Desvio padrão 104573 402602 37041 35774

Estes resultados mostram que um plasmídeo de replicação condicional, tal como pXL2774, foi de facto capaz de transfectar células musculares de murganho in vivo e realizando isto com uma eficácia comparável ou mesmo superior à de um plasmídeo 74 "convencional" derivado de ColEl, o qual contém a mesma cassete de expressão do gene da luciferase. b) Modelo 2: modelo de tumor 3T3 HER2 0 modelo é como se segue:

Murganhos do tipo Swiss/nus adultos do sexo feminino

Tumores experimentais induzidos após injecção de células 107 3T3 HER2 subcutaneamente no flanco. A mistura de transfecção foi injectada 7 dias após a injecção das células.

Soluções injectadas: O ADN foi inicialmente dissolvido no tampão. Após adição de todos os produtos, a mistura continha, além de ADN, NaCl (150 mM) e D-glicose a 5% em água ou tampão HEPES 5 mM.

Dois dias após a injecção, o tecido tumoral foi removido, pesado e depois cortado em pedaços e homogeneizado em 750 il de tampão de lise (Promega Cell lise Buffer E153 A). Após centrifugação (20000 χ g durante 10 minutos), foram removidos 10 pL do sobrenadante e foi avaliada a actividade da luciferase. Esta actividade foi determinada por medição da emissão luminosa total obtida após mistura com 50 pL de reagente (Promega Luciferase Assay Substrate) num luminómetero Lumat LB 9501 (Berthold) com uma duração de integração de 10 segundos. 75 A actividade resultante foi expressa em RLU (Unidades de relativas luz) estimadas na totalidade do sobrenadante da lise do tumor.

Resultados

Tampão Plasmídeo Resultados RLU/tumor + /n H20 ou HEPES referência pg/tumor [ADN] final na sol. inj . média desvio padrão HEPES PXL2784 10 0,5 pg/pL 744150 682434 6/6 PXL2774 10 0,5 pg/pL 1016380 1322500 5/6 H20 PXL2784 24 0,6 pg/pL 2906073 1745857 8/8 PXL2774 16,8 0,4 pg/pL 4292043 4995187 6/6 H20 PXL2784 7,5 0,3 pg/pL 702554 552207 6/7 PXL2774 5 0,2 pg/pL 3413430 4000875 6/6

Estes resultados mostram que um plasmídeo de replicação condicional, tal como pXL2774, foi de facto capaz de transfectar células de tumor de murganho in vivo e realizando isto com uma eficácia, pelo menos, comparável à de um plasmídeo "convencional", derivado de ColEl, que contém a mesma cassete de expressão do gene da luciferase.

Estas várias experiências demonstram que os plasmideos de replicação condicional e mais particularmente pXL2774, apresentaram de facto, características de transfecção de célula animais que são essenciais para utilização em terapia génica. Mais precisamente, foi demonstrado o seguinte: 1) a capacidade de pXL2774 para transfectar eficientemente, in vitro, vários tipos de célula da origem humana ou murina; 76 2) a capacidade de pXL2774 para transfectar, in vivo, músculo de murganho; 3) a capacidade de pXL2774 para transfectar, in vivo, células tumorais implantadas em murganhos.

As experiências de electrotransformação, fermentação e transfecção permitiram assim validar plasmídeos de replicação condicional como vectores que podem ser utilizados em terapia génica demonstrando: i) que estes não replicaram de um modo detectável numa estirpe E. coli que não expressa o gene pir (origem de replicação condicional) ii) que estes podem ser produzidos numa escala compatível com a produção industrial, num meio definido que não contém antibióticos; iii) que estes plasmídeos podem transfectar células de mamífero, in vitro e especialmente in vivo. EXEMPLO 7: Produção in vitro de proteínas recombinantes 7.1. Construção do vector de expressão

Para mostrar a praticabilidade dessa abordagem, a requerente construiu um vector de expressão de acordo com os critérios descritos acima (Exemplos 2 e 3) . Este vector, pXL3056, contém: 77 1) a parte bacteriana que compreende a origem de replicação condicional (ori gama), o fragmento cer de ColEl e o gene que assegura a selecção em bactérias (sup) 2) a cassete de expressão, baseada no sistema descrito por Studier (Studier et ai., 1990), compreendendo o promotor do gene 10 do bacteriófago T7, o operador lacO, o gene codificando para aFGF 154 (factor de Crescimento de Fibroblastos acidico, forma contendo 154 aminoácidos) (Jaye et ai., 1986) e o terminador TF do bacteriófago T7. Esta cassete de expressão é idêntica a uma presente no plasmídeo pXL2434, o qual é descrito no pedido WO 96/08572.

Na Figura 8 é apresentada a construção de pXL3056. O fragmento EcoRI-BglII do pXL2434 (1,1 kb) contendo a cassete de expressão aFGF foi clonado no vector de replicação condicional pXL2979 (fragmento purificado com 1,1 kb) nos locais BglII e EcoRI para produzir pXL3056. pXL2979 resulta da ligação de 3 fragmentos: i) o fragmento AccI-Xbal de pXL2 73 0 (0, 8 kb, que proporciona ori gama e cer), ii) o fragmento Narl-Sall de pXL2755 (0,18 kb que proporciona o gene sup de Phe), iii) o fragmento Sall-Spel de pXL2660 (1,5 kb, que proporciona o gene de resistência à canamicina). pXL2660 resulta da clonagem do fragmento PstI com 1,2 kb de pUC4K (Vieira e Messing, 1982) em pMTL22 (Chambers et ai., 1988) linearizado com PstI. 78 7.2. Produção da estirpe de expressão 0 plasmídeo pXL3056 foi introduzido por transformação na estirpe XAC-1pirll6. A estirpe resultante foi então transformada com o plasmídeo PT7pol23 (Mertens et al. , 1995), a 30 °C. Para expressar o gene de interesse sob o controlo do promotor T7, a bactéria deve conter no seu genoma, num plasmídeo ou num bacteriófago, uma cassete que permita a expressão da polimerase de ARN do bacteriófago T7. No exemplo descrito, a requerente utilizou o plasmídeo pT7pol23, que é compatível com derivados de R6K tais como pXL3056 e que permitiram a expressão induzível pela temperatura da polimerase de ARN do bacterióf ago T7. No entanto, pode também ser perspectivado lisogenizar a estirpe XAC-1pirllô com lambda DE3 (Studier et al., 1990) para conservar apenas um plasmídeo e induzir a produção de polimerase de ARN de T7 por IPTG e não pela temperatura.

7.3. Expressão de aFGF A estirpe de XAC-1pirllô (pXL3056+PT7pol23) foi cultivada a 30 °C em meio mínimo M9 suplementado com casaminoácidos a 0,2% (DIFCO) e canamicina (25 pg/mL), até uma densidade óptica de 0,6-1,0 a 600 nm. Metade da cultura foi então colocada a 42 °C (indução da polimerase de ARN de T7), enquanto a outra metade permaneceu a 30 °C (controlo negativo). A mesma experiência foi realizada com a estirpe XAC-1pirllô (pXL3056+pUC4K) que constitui um controlo da expressão de aFGF na ausência de polimerase de ARN de T7.

Os resultados obtidos são apresentados na Figura 9. Estes mostram que a produção de aFGF foi comparável ou superior à 79 observada com BL21(DE3)(pXL2434) (documento WO 96/08572) que mostra claramente o potencial de plasmídeos de replicação condicional para a expressão de proteínas recombinantes ín vitro, especialmente em E. coli. EXEMPLO 8: Construção de um vector pCOR que expressa uma proteína p53 de tipo selvagem ou híbrida ou a proteína humana FGF1

Este exemplo descreve a construção de vectores com replicação condicional de acordo com a invenção contendo uma ácido nucleico codificando para uma proteína p53. Estes vectores podem ser utilizados para restaurar uma actividade do tipo p53 em células deficientes (mutadas, eliminadas), tal como, em particular, células tumorais. A cassete de expressão eucariota contém os elementos seguintes : 1) promotor imediato "precoce" de CMV (posições-522 a +72) seguido pela sequência líder do gene da timidina-cinase de tipo I do vírus herpes simplex (posição -60 a +1 do gene, referente à sequência no artigo de McKnight, S. f L· (1980) Nucleic Acids

Res. 8:5949-5964); 2a) um ácido nucleico que codifica para a proteína p53 do tipo selvagem ou para uma variante da p53, como descrito na pedido PCT/FR96/01111 (variante de V325K = V325 com uma sequência de Kozak com ATG); 80 2b) um ácido nucleico que codifica para o FGFa humano ou FGF-1 como descrito em Jaye M. (Sciences 1986; 233 (4763) :451,

Patente US N° 4686113 e Patente Europeia N° 259475; 2c) um ácido nucleico que codifica para um gene de fusão entre o sinal de secreção do interferão do fibroblastos humanos (Taniguchi et al.) e a forma truncada que ocorre naturalmente do FGF-1 humano do aminoácido 21 ao 154 como descrito por Jaye et al. e no documento US 5849538. 3) a sequência de poliadenilação poliA de SV40.

Estes elementos foram colocados no vector pCOR pXL2988 na forma de um fragmento Ascl-Xbal entre os locais BssHII e Spel. 0 pXL2988 é idêntico a pXL2979 (Exemplo 7.1.), além da presença de um elemento adicional, uma sequência capaz de formar um ADN em hélice tripla composto por 17 cópias do trinucleótido GAA, colocado ao longo da origem gama de replicação.

Os plasmideos resultantes foram denominados pXL3029, PXL3030, pXL3179 ou NV1FGF (Figura 10). A funcionalidade destas construções foi verificada in vitro em células p53-SAOS2 em cultura por medição da actividade activadora da transcrição de p53 ou p53superWT ou por medição da secreção de FGF1 por exemplo por experiências de ELISA que são bem conhecidas na técnica. 81 EXEMPLO 9: Construção de TEX 1 (XAC1 pir!16, endA , traD ) A E. coli XAC-1pirll6 contém um epissoma F', uma molécula de ADN de circular com aproximadamente 100 kb, contendo proB+ laci373lacZuii8m. Muitas estirpes laboratoriais do sexo masculino de E. coli contém uma mutação traD36 no seu epissoma, mas não foi descrita para XAC-1 qualquer mutação afectando a capacidade de transferência de F'. 0 gene traD localiza-se na extremidade 5' de um dos operões tra (transferência) e codifica uma proteína membranar directamente envolvida em transferência de ADN e no metabolismo de ADN (Frost et al., BBRC, 1994, 58:162-210). Foi substituído um fragmento central de traD com 2 kb, compreendendo 92% do gene, por o elemento ómega com 2 kb (número de acesso do Genbank M60473) de ρΗΡ45Ω (Prentki e Krisch, 1984, Gene, 29:303-313) por recombinação homóloga em XAC-1pirll6 endA~. O elemento ómega contém o gene de resistência a um antibiótico aadA flanqueado por repetições invertidas curtas. O gene aadA codifica a adeniltransferase do aminoglicósido-3 e confere resistência à estreptomicina e espectinomicina ("SpR"). O fragmento ómega foi utilizado porque este termina prematuramente a síntese de ARN e de proteína originando a inactivação da totalidade de operão traD. Este nova estirpe pCOR XAC-1pirllô endA- traD::SpR foi designada TEX1. A transferência de quaisquer plasmídeos residentes, por pCOR ou pUC, foi indetectável quando o dador foi TEX1. A nova estirpe hospedeira de pCOR TEX1 foi avaliada em experiências de fermentação. Foram utilizados meios complexos contendo extracto de levedura para a fermentação descontínua alimentada com XAC-1pirll6. A estabilidade de pCOR (mais de 50 gerações) permite utilizar meios não-selectivos. Sob estas condições, XAC-1pirll6 produziu peso seco das células superior a 82 40 g/L e foi obtido pCOR pXL2774 100 mg/L a partir de f ermentadores de 2 litros. O número de cópias de pCOR foi estimado em 400-500 cópias por célula e a velocidade de síntese de ADN plasmídico foi constante ao longo da fermentação. Estes resultados foram extrapolados para um fermentador de 800 litros adequado para a produção. Foi também realizada fermentação na ausência de extracto de levedura ou qualquer matéria-prima da origem animal. Foram obtidos resultados semelhantes (peso seco das células de 30 g/L e ADN plasmídico 100 mg/L) utilizando um meio definido em culturas de 2 litros sem perda de produtividade. EXEMPLO_10 :_Construção_de_estirpes_hospedeiras XA.C-lpirll6pir42 por recombinação homóloga 1) Construção de um vector suicida contendo a cassete "KmR-uidA:pírll 6; pir42" A cassete KmR-uidA::pirll6 proveniente de M13wm33 como descrito no Exemplo 1 (Metcalf W. et al. Gene, 1994, 138 (1-2): p. 1-7), foi modificada por mutagénese dirigida para um local utilizando PCR (kit de mutagénese dirigida para um local QuickChange, Stratagene, La Jolla, CA) para introduzir a mutação pir42 no gene pir!16. Na Figura 13 são descritos os diferentes passos de clonagem/mutagénese

Os oligonucleótidos utilizados na mutagénese continham a mutação pir42 juntamente com uma mutação silenciosa que criou um local Ciai para indicar facilmente o processamento de pir42 por análise de restrição quando necessário. 83

Os oligonucleótidos sentido e anti-sentido utilizados sao como se segue:

Oligonucleótido sentido número 11076 (SEQ ID N° 7) 5’-G TAT ATG GCG CTT GCT ÇTÇ ATC GAT AGC AAA GAA CC-35 pir42 Clal

Oligonucleótido de anti-sentido número 11077 (SEQ ID N° 8) 5’-GG TTC TTT GCT ATC GAT GAG AGC AAG CGC CAT ATA C-3’

Clal pir42 A técnica utilizada para substituir pirllô por pirll6pir42 no genoma de E. coli TEX1 hospedeira de pCOR foi baseada na de

Blum et al. (J. Bacteriol. 1989, 171, pp 538-46). O bacteriófago recombinante pXL3723 mostrado na Figura 13 é um vector suicida em todas as estirpes de E. coli não-supressoras, porque este tem uma mutação anti-sentido no gene II codificando a nicase M13 que previne a replicação do genoma virai.

Foi realizada uma recombinação dupla como descrita para a construção de XAC-1pirll6 (Exemplo 1, ponto 2) . Os clones que sofreram eventos de recombinação homóloga dupla foram rastreados por PCR para testar para a presença da mutação pir42 no genoma de TEX1. O ADN genómico isolado a partir de candidatos de recombinação dupla foi utilizado como molde para PCR. Em segundo lugar, foi realizada sequenciação sobre cada um dos fragmentos amplificados únicos, tendo sido todos do tamanho esperado. Os fragmentos de PCR são mostrados na Figura 14.

Os iniciadores PCR foram os seguinte: 84

Iniciador 11088 (SEQ ID N° 9):5'-GAGATCGCTGATGGTATCGG-3'

Iniciador 11089 (SEQ ID N° 10): 5'-TCTACACCACGCCGAACACC-3'

Esta análise mostrou que um em seis recombinantes duplos testados tinha sofrido permutação alélica. Esta nova estirpe, denominada TEXlpír42, foi ainda avaliada para a sua capacidade para replicar plasmideos pCOR em comparação com a estirpe parental TEX1. 2) Avaliação de TEX1pir42

Foram transformados paralelamente plasmideos de pCOR em TEX1 e TEXlpir42 e foram cultivados de um dia para o outro em 2 mL de meio selectivo M9. Depois, o ADN plasmídico foi extraído com o kit miniprep Wizard SV plus (Promega) para avaliar o número relativo de cópias de plasmídeo e a topologia dos plasmideos pCOR em ambas as estirpes.

Foi obtido um aumento de 2 vezes no número de cópias de um modo reproduzível em TEXlpi_r42 transformado com o plasmídeo pCOR pXL3516 (2,56 kb) . Para caracterizar adicionalmente TEXlpir42, foram avaliados o número de cópias e a topologia dos plasmideos pCOR tais como pXL3179 e pXL2774 por análise de electroforese em gel de agarose após purificação em pequena escala de ADN plasmídico (4 a 6 clones/estirpe). O número de cópias foi avaliado em plasmideos linearizados com a enzima de restrição EcoRI. Foi realizado um teste de topologia em plasmideos não-digeridos, na ausência de brometo de etídio. O gel de agarose resultante é apresentado na Figura 15 e mostra claramente um 85 número mais elevado de cópias de plasmídeo quando o plasmídeo pXL3179 foi produzido em TEX1pir42, do que quando foi produzido na estirpe TEX1. A figura 15 mostra também a topologia do plasmídeo pXL3179 e mostra que um aumento no número de cópias o plasmídeo, que estavam essencialmente na forma de monómeros, com poucos plasmideos na forma de multimeros. Os resultados obtidos com estes plasmideos pCOR estão também resumidos na Tabela 5. Foi calculado o número relativo de cópias em comparação com o mesmo plasmídeo em TEX1. Foi observado um aumento de 2-3 vezes no número de cópias de plasmídeo com os plasmideos pXL3179 e 2774 produzidod em TEXlpír42. TABELA 5: Replicação e número de cópias de plasmideos pCOR produzidos em TEXlpir-42 PLASMIDEOS TAMANHO (kb) NÚMERO RELATIVO DE CÓPIAS* pXL3179 2,4 X3 pXL2774 4,5 X2 *o número de cópias foi comparado com o mesmo plasmídeo em TEX1 . EXEMPLO 11: Experiências comparativas: construção de TEX1cop21 (xAC-lendA-traD-pirll6cop21) 1) Construção de TEX1cop21 A estirpe TEX1 cop2_Z foi construída de um modo semelhante ao descrito no Exemplo 10 para TEXlpi_r42. Os oligonucleótidos 86 seguintes utilizados para introduzir cop21 no gene pirll6 por mutagénese dirigida foram como se segue:

Oligonucleótidos sentido: 11153 (SEQ ID N° 11) 5‘-CG CAA TTG TTA ACG TCÇ AGC TTA CGC TTA AGT AGC C-3 ’ cop21

Oligonucleótido anti-sentido: 11154 (SEQ ID N° 12) 5 ’-G GCT ACT ΪΑΑ GCG TAA GCT GGA CGT TAA CAA TTG CG-3; A mutação cop21 foi introduzida como um codão TCC de serina em lugar do codão TCA de serina para eliminar um local de restrição HindIII próximo da mutação. 0 molde utilizado para a mutagénese dirigida foi pXL3395 (ver a Figura 13). 0 plasmídeo resultante denominado PXL3432 foi utilizado para construir o vector suicida M13 de um modo semelhante ao que é mostrado para pir42 na Figura 13. 0 vector suicida pXL3749 é mostrado na Figura 16. E. coli clones obtidos após a recombinação homóloga com pXL3749 foram rastreados por PCR e restrição subsequente com HindIII e sequenciação para monitorizar as mutações cop21 e pirll6. Um clone em seis recombinantes duplos testados tinha sofrido substituição génica. A estirpe resultante foi denominada TEX1cop21. 87 2) Avaliação de TEX1cop21 TEX1cop21 foi transformado com vários plasmídeos pCOR, incluindo pXL2979, um vector pCOR KmR com 2,5 kb (Ver o Exemplo 7.1) e ensaiado para o número de cópias aumentado por electroforese em gel. Essa experiência com pXL2979 é mostrada na Figura 17. 0 ADN plasmídico proveniente de quatro clones independentes de cada estirpe preparado com o kit miniprep Promega foi linearizado com EcoRI, submetido a electroforese em de gel de agarose e depois corado com brometo de etidio. Cada amostra representou uma quantidade semelhante de bactérias, como medida pela densidade óptica a 600 nm. A electroforese em gel de agarose obtida para o plasmídeo pCOR pXL2979 produzido em E. coli TEX1 cop21, XAClpir e TEXl é apresentada na Figura 17. Esta mostra claramente que não se verificou qualquer aumento no número de cópias de plasmídeo quando os plasmídeos são produzidos na estirpe TEXlcop21, em comparação com TEXl. EXEMPLO 12: Construção de TEX2pir42 {'XA.C-lpirll6pir42 recA )

Foi inicialmentemente construído, um derivado recA de TEXl. Foi então introduzida a mutação pir42 na estirpe resultante denominada TEX2 para produzir TEX2pi_r42. 1) Construção de E. coli TEX2, um derivado recA- de TEXl

Foi obtido por PCR um gene recA eliminado contendo 3 codões de terminação da tradução (um em cada grelha de leitura) na sua extremidade 5'. Este gene recA eliminado foi introduzido por substituição génica (Blum et al., J. Bacteriol., 1989, 171, pp 88 538-46) no genoma de TEX1. Na Figura 18 é mostrada a construção do vector suicida para recombinação homóloga.

Na Tabela 6 seguinte são mostrados os iniciadores de PCR utilizados para a amplificação de fragmentos recA: TABELA 6 iniciadores Sequências de ADN seq 10930 SEQ ID N° 13 5'CCCTCTAGATCGATAGCCATTTTTACTCCTG 3' seq 10931 SEQ ID N° 14 5'CGGGATCCTGATTATGCCGTGTCTATTAG 3' seq 10932 SEQ ID N° 15 5'CCCAAGCTTCTTCGTTAGTTTCTGCTACGCCTTCGC 3' seq 10933 SEQ ID N° 16 5'GGTCTAGAACGTGAAAGTGGTGAAGAACAAAATCG 3'

Os locais de restrição adicionados à sequência recA estão sublinhados.

Para manter o fenótipo RecA+ necessário para ocorrer recombinação homóloga, foi proporcionada a função recA a E. coli TEX1 com um plasmídeo contendo um gene recA heterólogo que pode complementar mutantes recA de E. coli, tais como por exemplo, o gene recA da bactéria Agrobacterium radiobacter e um gene de resistência a antibiótico, tal como o gene de resistência à ampicilina. Após a substituição génica, o plasmídeo foi eliminado da estirpe recombinante pela diluição de cultura em meio não-selectivo (LB) . A ausência do plasmídeo foi rastreada para a perda da resistência ao antibiótico. 89 A estirpe resultante foi denominada TEX2. A substituição génica foi monitorizada por PCR na Figura 19. Os iniciadores de PCR são descritos na Tabela 7 seguinte. TABELA 7

Iniciadores 11355-11354 Iniciadores 11355-11354 recA de tipo selvagem 1117 pb 1089 pb recA eliminado 404 pb 376 pb 0 primeiro iniciador foi baseado na sequência do gene recA. 0 segundo foi baseado numa sequência próxima mas fora da da região de homologia presente no vector suicida pXL3457 (imediatamente 5' ou 3' de recA) para assegurar que a amplificação pode apenas ocorrer num fragmento genómico. A sequência de ambos os oligonucleótidos foi seleccionada de acordo com a sequência de E. coli que compreende o locus recA (Genbank ECAE000354).

Os fragmentos de PCR obtidos a partir de uma estirpe eliminada de recA eram mais curtos em comparação com os obtidos com uma estirpe de tipo selvagem, como apresentado na Tabela 8 seguinte. 90

TABELA 8: iniciadores de PCR para a amplicaçao de recA

iniciadores sequência 5' -> 3’ seq 11352 - SEQ ID N° 17 GCGACCCTTGTGTATCAAAC seq 11353 - SEQ ID N° 18 GGTATTACCCGGCATGACAG seq 11355 - SEQ ID N° 19 GTGGTGGAAATGGCGATAGG seq 11354 - SEQ ID N° 20 GCGATTTTGTTCTTCACCAC 0 perfil de PCR obtido foi como esperado e revelou a presença de um gene recA truncado no genoma de TEX2. Foi verificado o fenótipo recA- (sensibilidade à luz UV) , assim como as caracteristicas fenotipicas de TEX2. As caracteristicas fenotipicas de TEX2 foram iguais às da estirpe TEX1, i. e., ara-, RifR, NalR, SpR, UidA-, Arg-, Kms Amps) , como esperado. B) Construção de E. coli TEX2pir42

Foi construída uma estirpe TEX2pir42 por recombinação homóloga dupla, de acordo com a estratégia descrita no Exemplo 10, com a excepção da recombinação em TEX2 ter sido realizada na presença de um plasmídeo contendo um gene recA heterólogo capaz de complementar os mutantes recA de E. coli, de forma a manter um fenótipo recA+ necessário para a recombinação homóloga. A substituição génica foi monitorizada por análise de restrição do produto PCR digerido com Ciai (ver a Figura 14) . Tinha ocorrido substituição génica em dois dos quatro clones recombinantes duplos estudados. 91 C) Avaliação de E. coli TEX2pir42 1) Avaliação da produção de plasmídeo à escala laboratorial: 0 TEX2pir42 foi transformado com o plasmídeo pCOR pXL3179 (2,4 kb). A produção de pXL3179 em TEX2pir42 foi estudada intensivamente à escala laboratorial, em termos da reproduzibilidade da melhoria do número de cópias de plasmídeo, condições de cultura, assim como da estabilidade (número de gerações). Todos os estudos mostraram consistentemente um aumento de 2 a 5 vezes do número de cópias de plasmídeo em comparação com a produção de pXL3179 em TEX1 nas mesmas condições. 0 número de cópias de plasmídeo foi avaliado adicionalmente em relação à produção de pXL3179 em TEX2pir42 e TEX1pir42 e TEX1 como experiências comparativas. Nesta experiência, os plasmídeos foram extraídos a partir de biomassa bacteriana idêntica, baseada na DO a 600 nm e analisados por electroforese em gel de agarose. O gel foi corado com brometo de etídio após a electroforese. A electroforese em gel de agarose, que é apresentada na Figura 20, mostra claramente que os plasmídeos são produzidos em TEX2pir42 num número elevado de cópias e mostra vantajosamente que os multímeros de plasmídeo são reduzidos quando produzidos em TEX2pir42 em lugar de TEXlpir42. 2) Avaliação em fermentadores:

Estes resultados foram confirmados numa escala maior em fermentadores de 7 litros, como descrito abaixo. 92 a) Composição dos meios de fermentação A composição do meio utilizado para as culturas de inoculo foi: Na2HP04 6 g/L, KH2P04 3 g/L, NaCl 0,5 g/L, NH4C1 1 g/L, NH4H2P04 3 g/L, glicose 5 g/L, MgS04,7H20 0,24 g/L, CaCl2,2H20 0,015 g/L, tiamina HC1 0,010 g/L. A composição do meio utilizado para a cultura de descontinua alimentada foi como se segue: KH2P04 8 g/L, K2HP04 6,3 g/L, Na2HP04 1,7 g/L, NH4C1 2,5 g/L, glicose 10 g/L, MgS04,7H20 2,6g/L, tiamina 0,011g/L, anti-espuma Biospumex36 0,1 mL/L, mistura de sais (ver a tabela 9) 2,5 mL/L. TABELA 9: Composição de mistura de sais

Solução de mistura de Sais (g/100 mL) Concentração final em meio descontínuo alimentado FeS04, 7H20 1 , 6 40 CaCl2, 2H20 1,6 40 MnS04, H20 0,4 10 CoCl2, 6H20 0,16 4 ZnS04, 7H20 OO O O 2 Mo04Na2, 2H20 0,072 1,8 CuCl2, 2H20 0,04 1 H3BO3 0,02 LO O AICI3, 6H20 0,04 1 93 A composição do meio de alimentação foi como se segue: glicose a 50%, magnésio a 0,7%, tiamina-HCl a 0,02%, antiespuma Biospumex36 a 1%. b) Parâmetros de fermentação

Foi inoculado um fermentador de 7 litros contendo 3 litros de meio alimentado descontinuamente com cultura de inoculo a 1,2%. 0 inoculo foi preparado como se segue: foram inoculados 0,25 mL de uma suspensão de células congeladas da estirpe TEX2pir42 (pXL3179) de E. coli em 250 mL de meio de inoculo num frasco de 2 litros.

Os frascos foram incubados durante 24 horas a 37 °C a 220 rpm. Após 24 horas, foram medidos diferentes parâmetros: glicose residual: 0 g/L, ODsoonm foi de 2,7 e o pH de 6,24. Durante a fermentação, o pH foi controlado e ajustado automaticamente entre 6,9 e 7 com NH3. A temperatura foi mantida a 37 °C e o oxigénio dissolvido foi ajustado para 45% p02 por retroacção sobre a velocidade agitação.

Após a cultura descontinua inicial da estirpe bacteriana durante cerca de 17 horas e o consumo da fonte de carbono (glicose), foi adicionado meio de alimentação. A glicose e os ácidos, tais como lactato e acetato, foram mantidos a uma concentração próxima de 0. 94 c) Resultados

Os resultados finais são apresentados na Tabela 10, em comparação com a produção num fermentador de 100 litros com E. coli TEX1 (pXL3179) em condições optimizadas.

No que respeita a XAC-1pirllê, não se verificou qualquer diferença entre os fermentadores de 7 litros e 800 litros no que respeita ao número de cópias de plasmídeo pXL3179 produzido em TEX1.

Os plasmideos pXL3179 produzidos num fermentador de 7 litros utilizando E. coli TEX2pir42 foram comparados com a produção de pXL3179 num fermentador de 100 litros com E. coli TEX1, em condições optimizadas. Foi demonstrado que no que respeita a XAC-1pirllô (Ver o Exemplo 5.3), verifica-se uma velocidade de produção de plasmídeo estável em TEX1 em fermentadores de 7 litros, 100 litros ou 800 litros.

Tabela 10: Características da fermentação das estirpes TEX1 e TEX2pir42 contendo pXL3179.

Referência Duração da fermentação (h) DO final (600 nm) Peso Seco das células Concentração de ADN (mg/L) Número de cópias estimado (cópias/ bactéria) TEXl (pXL31 79) OpGen 090 43,00 104 33,1 96 616-627 TEX2p±r42 (pXL31 79) Op 13 2 8 S 5 48,47 72 27, 1 205 1896-1904 95

Estavam presentes 3 vezes mais cópias do plasmídeo pXL3179 por bactéria em TEX2pir42 em comparação com TEX1.

Foram extraídos plasmídeos correspondente a diferentes instantes da fermentação a partir de biomassa bacteriana idêntica, baseada na DO a 600 nm e foram analisados por electroforese em gel de agarose. A figura 21 mostra claramente um aumento do número de cópias de plasmídeo com a duração da fermentação. Do mesmo modo, a Figura 21 mostra a topologia do plasmídeo pXL3179 produzido em Opl328S5 TEX2pir42 que estava quase exclusivamente numa forma monomérica.

Em, conclusão, a estirpe hospedeira TEX2pir42 de E. coli de acordo com presente invenção proporcionou uma melhoria do número de cópias de plasmídeo inesperadamente elevada de plasmídeos pCOR, tais como pXL3179, de 2 a 5 vezes em TEX2pir42 em comparação com TEX1, numa escala laboratorial e em fermentadores. Além disso, enquanto o número de cópias de plasmídeo foi muito melhorado, os plasmídeos produzidos assim apresentam uma topologia monomérica, não apenas à escala laboratorial, mas também a uma escala maior (fermentador de 7 litros) compatível com a produção industrial. EXEMPLO 13: Novos Mutantes com Numero de Cópias Aumentado de pirllô Identificados por um Novo Método de Rastreio Baseado em Fluorescência

Os requerentes mutagenizaram o gene pirlló para aumentar o número de cópias do plasmídeo pCOR em células hospedeiras bacterianas, que codifica a versão mutada do gene pir com um número aumentado de cópias. Até ao momento todas as mutações 96 aumentando o número de cópias de plasmídeos derivados de R6K, tais como as formas de realização de pCOR, foram encontradas dentro do gene pir.

Após mutagénese aleatória por PCR, foram introduzidos genes pirllô mutados num vector pCOR contendo o gene repórter cobA, que é descrito abaixo. Após rastreio baseado na fluorescência, foram avaliados o número de cópias e a topologia do plasmídeo mutante seleccionado. A requerente obteve três mutantes diferentes do gene pirllô que aumentam o número de cópias do plasmídeo. Estas novas mutações não foram descritas anteriormente.

Um método de rastreio convencional de mutantes com número aumentado de cópias é baseado na resistência a um antibiótico. Neste método, o nível da resistência de uma bactéria hospedeira a um antibiótico é uma função do número de cópias de um gene de resistência a um antibiótico localizado num plasmídeo dentro da célula. À medida que o número de cópias do plasmídeo e consequentemente o gene de resistência a um antibiótico, aumenta, o nível da resistência a um antibiótico aumenta também. Este método, no entanto, não foi aplicável a plasmídeos derivados de R6K em células hospedeiras contendo a mutação pirllô devido a um número base demasiado elevado de cópias do plasmídeo (cerca de 400 cópias/célula) nestas células. Consequentemente foi desenvolvido um novo método de rastreio baseado na fluorescência para identificar as mutações com número aumentado de cópias de do gene pirllô.

Para este novo método, foi introduzido o gene de cobA num vector pCOR para proporcionar um meio simples de monitorizar a melhoria no número de cópias do plasmídeo. O gene cobA foi 97 obtido de Pseudomonas denitrificans (Crouzet et al., J. Bacteríol, 172:5968-79 (1990)). Este codifica para metiltransferase de uroIII, uma enzima da via da vitamina B12 que adiciona dois grupos metilo à molécula do urogénio III. Quando sobre-expresso em E. coli, cobA origina a acumulação de produtos vermelhos que são fluorescentes sob luz UV próxima. Quando expostas a UV, as colónias bacterianas que sobre-expressam este gene têm uma aparência entre cor de rosa e vermelho. Os requerentes testaram este gene para determinar se este pode servir como gene de repórter para o número de cópias de plasmídeo no sistema pCOR.

Foi construído um plasmídeo de controlo (pXL3767) compreendendo cobA eliminado do seu próprio promotor (Fig. 22) para avaliar a relação entre o número de cópias de plasmídeo e o nível de fluorescência de bactérias transformadas expostas a luz UV. Este plasmídeo foi transformado em três estirpes hospedeiras diferentes (XAClpir, XAClpirll6 e TEX1pír42). Estas estirpes foram seleccionadss com base em experiências anteriores mostrando que o número médio de cópias de um plasmídeo pCOR em XAClpir é 1, este é aproximadamente cinco a dez vezes mais elevado em TEX1 e 15 a 30 vezes mais elevado em TEXlpir42.

As colónias recombinantes foram riscadas em meio mínimo M9 e expostas à luz UV num transiluminador como mostrado na Figura 22. A requerente observou que a intensidade da fluorescência das colónias estava correlacionada positivamente com o número de cópias de plasmídeo, com XAClpirll6 apresentando mais fluorescência do que XACpir e TEX1pir42 apresentando mais fluorescência do que XAClpirllô. 98

Os resultados mostrados na Fig. 22 demonstram que este método de ensaio baseado na fluorescência discrimina, facilmente entre os números de cópias de plasmídeo testados, especialmente entre o número de cópias de plasmídeo encontrado nas estirpes TEX1 e TEXlpir42. Ou seja, a intensidade da fluorescência vermelha observada neste ensaio aumenta com o número de cópias do plasmídeo pCOR-cobA.

Tendo demonstrado uma correlação positiva entre a fluorescência e o número de cópias de cobA, a requerente construiu um plasmídeo em que foram introduzidos genes pirll6 mutagenizados para rastreio. Foram construídos e testados quatro plasmídeos com combinações diferentes de módulos constitutivos, como mostrado na Fig. 23. Um destes plasmídeos revelou um nível de fluorescência significativamente diferente quando transformado nas estirpes isogénicas pirll6 e pirll6pír42. Este plasmídeo, pXL3830, é mostrado na Fig. 24.

Foram utilizados plasmídeos de controlo durante as experiências de avaliação e rastreio. Primeiro, foi utilizado um plasmídeo de controlo do nível de base, pXL3830, contendo pirll6 de "tipo selvagem" para estabelecer um nivel de fluorescência de base. Depois, foi utilizado pXL3795, contendo a mutação dupla pir!16-pir42 que aumenta o número de cópias do plasmídeo de 4 a 6 em comparação com pXL3830, como um controlo positivo.

Foi realizada mutagénese aleatória no gene pir!16 utilizando o kit Diversify PCR random mutagenesis (BD Biosciences Clontech, Paio Alto, CA, EUA). Foi utilizada a condição 1 que introduziu uma média de 2 mutações por 1000 pares de bases. Uma experiência preliminar realizada utilizando a "condição 1" mostrou que a velocidade de mutação foi, de facto, 99 de cerca de 2 mutações no gene pirll6, por sequenciação de 12 mutantes. 0 gene pirll6 foi amplificado como um fragmento de EcoRI-SstI com os oligonucleótidos C8832 (5-CTTAACGGCTGACATGGGAATTC-3') (SEQ ID N° 23) e C8833 (5' -CGATGGGCGAGCTCCACCG-3 ' ) (SEQ ID N° 24). Após digestão com EcoRI e Sstlf o fragmento mutagenizado contendo pirll6 foi clonado em pXL3830 em lugar do gene pirll6 de "tipo selvagem".

Os plasmideos contendo pirll6 mutagenizado ("pirll6*") foram transformados na estirpe XAC-1 de E. coli, o parental do hospedeiro pCOR XAClpirllô. Os transformantes foram rastreados para a fluorescência aumentada sob luz UV e comparados com controlos XAC1 (pXL3830) e XAC1 (pXL3795). Uma placa em duplicado não foi exposta a UV para minimizar mutações secundárias. Na Fig. 25 é mostrada uma placa representativa de rastreio sob luz UV. 0 diagrama de fluxo seguinte resume os resultados da experiência de rastreio.

Mutagénese aleatótia em pir (proteína pi) num plasmideo pCOR contendo o gene repórter cobA

I foram testados 2200 clones

I 24 candidatos 4 16 confirmados e avaliados para número de cópias do plasmídeo/topologia/sequenciação e pir* (gel) 4

Foram seleccionados os três melhores para estudos adicionais 100 A avaliação dos três mutantes seleccionados está resumida na Fig. 26. Cada mutante apresentou um aumento no número de cópias em comparação com o plasmídeo pirllô. No caso dos mutantes 114C e 100B, o plasmídeo estava essencialmente na forma de monomérica. Isto pode ser uma vantagem em comparação com um plasmídeo pirll6pir42 que tem um número de cópias aumentado e um elevado conteúdo de multímeros, como o mutante 201C.

Foi sequenciado o gene pirllô* de cada mutante. Cada clone contém uma mutação única não-isocodificante na ORF pirllô. Todas as três mutações afectam o terminal C da proteína de pi, que está envolvido na ligação ao ADN. Nenhuma destas mutações foi descrita anteriormente.

Uma vez detectado por rastreio num sistema plasmídico, estas mutações foram avaliadas num sistema de produção, i. e., em que gene pirllô* é introduzido no genoma de uma estirpe hospedeiro E. coli pCOR. A estratégia desta avaliação está resumida na Fig. 27.

Para esta avaliação, o plasmídeo pXL3179 plasmídeo foi transformado para o interior de cada uma das três estirpes de E. coli contendo as mutações identificadas na Fig. 26 e avaliado para o número de cópias de plasmídeo e topologia. Na Fig. 28 são apresentados os resultados destas experiências. Foi observado que o número de cópias de plasmídeo foi significativamente aumentado em relação a XAClpirllô apenas para o mutante 201C. 101 EXEMPLO 14: Minicirculo com o gene M13 III como uma ferramenta de integração por recombinação homóloga em E. coli 1. Vectores suicidas A substituição génica por recombinação homóloga dupla em E. coli requer a utilização de um vector suicida. Estes vectores são construídos e produzidos num hospedeiro com capacidade para a sua replicação e utilizados subsequentemente para recombinação no cromossoma de um hospedeiro incapaz de os replicar. 0 bacteriófago M13 é uma ferramenta genética muito útil que pode ser utilizada em mutantes rep (Metcalf, W., W. Jiang, et al. , Gene 138:1-7 (1994)) ou em estirpes de E. coli não-supressoras quando são utilizados M13 mp8 a 11 (Blum, P. et al., J Bacteriol., 171:538-46 (1989)). São frequentemente encontradas algumas limitações em termos de construção, tamanho da inserção e instabilidade. Os plasmídeos contendo a origem de replicação de ADN gama R6K são vectores suicidas bem conhecidos (Miller, V. e J. Mekalanos, J Bacteriol., 170:2575-83 (1988)), mas estes não são úteis para modificar estirpes de E. coli expressando a proteína pi, que permite a replicação desses plasmídeos.

Foi concebido um vector suicida universal com um novo marcador contra-seleccionável e utilizado para construir estirpes de E. coli em que os mutantes do gene pirllô (pirllô*) são inseridos num genoma bacteriano por recombinação homóloga. A estratégia aqui apresentada é demonstrada para o mutante 114C, mas foi também utilizada para produzir estirpes contendo outros mutantes pirllô*. 102 2. Marcador contra-seleccionável

Podem ser utilizados marcadores diferentes para seleccionar para bactérias tendo sofrido um segundo evento de recombinação. Este evento leva à perda deste marcador e em alguns casos à substituição génica após recombinação entre o cromossoma e um vector suicida. Por exemplo, o gene SacB de Bacillus é letal quando as bactérias expressando o gene são plaqueadas num meio contendo sacarose (Ried, J. L. e A. Collmer, Gene 57:239-46 (1987)) . Como outro exemplo, o gene de resistência à tetraciclina confere a sensibilidade ao ácido fusárico (Bochner, B. R., et al., J Bacteriol. 143 (2):926-3 (1980)). A infecção pelo bacteriófago M13 confere sensibilidade ao detergente desoxicolato (Blum, P., et al., J Bacteriol. 171:538-46 (1989)).

Devido a uma falta da eficiência em algumas estirpes de E. coli, foi desenvolvido um método de selecção positivo de recombinantes duplos. Foi avaliado o gene III do bacteriófago M13 como um marcador contra-seleccionável. Este gene codifica um componente virião menor responsável pela infectividade das partículas. Quando sobreexpresso a partir do plasmídeo multicópia pBR322, o gene III confere sensibilidade ao desoxicolato nas células devido à inserção da proteína do gene III na membrana das bactérias (Boeke, J. D. et al., Mol Gen Genet 186:185-92 (1982)). Nenhuma referência indicou se este gene poderá ser utilizado como um marcador contra-seleccionável eficiente, quando presente como uma cópia única no genoma do E. coli. Por isso, os requerentes testaram esta hipótese com um vector suicida em minicírculo. 103 3. Amplificação por PCR da versão eliminada do gene III de

Ml 3

Foi seleccionada uma versão eliminada do gene III (gene III') que é ainda capaz de conferir sensibilidade ao desoxicolato (Boeke, J. D., P. Model, et al. , Mol Gen Genet 186:185-92 (1982)) par a reduzir o tamanho do vector minicirculo a ser construído. Este foi amplificado por PCR a partir de M13mpl8 juntamente com o seu próprio promotor (Yanisch-Perron, C., J. Vieira, et al. , Gene 33:103-19 (1985)) como um fragmento

BglII-Xhol (ver a Figura 29).

Os oligonucleótidos foram como se segue: C19519 : 5’-GGCAGATCTTAAACCGATACAATTAAAGG-3’ (SEQ ID N2:25)

BeiΠ

Cl9520: 5’- CCGCTCGAGTTACGATTGGCCTTGATATTCACAAAC-3 (SEQ ID Na :26)

Xhol O fragmento amplificado foi clonado por clonagem T-A em pGEMT-easy (Promega Corporation, Madison, WI, EUA) para produzir pXL4230 (Fig. 29) . Foi verificado que a sequência nucleotídica da inserção concordava com o descrito no GenBank sob o acesso n° VB0018. O pXL4230 confere sensibilidade ao desoxicolato quando transformado na estirpe DH10B de E. coli (Invitrogen) , indicando que este funciona como esperado. 104 4. Vector suicida baseado em minicirculo

Como este não contém qualquer origem de replicação, um plasmideo em minicirculo pode ser utilizado como um vector suicida universal. Com esta finalidade, deve ser adicionado um marcador seleccionável tal como o gene de resistência à canamicina para seleccionar para um primeiro evento de recombinação homólogo. Foi adicionado o gene III' ao vector minicirculo para contra-seleccionar para bactérias que não sofreram um segundo evento de recombinação. Na Fig. 29 é mostrada a construção do plasmideo utilizado para produzir minicirculo da recombinação. 0 minicirculo é produzido a partir de um plasmideo, tal como pXL4235, após a indução da integrase do bacteriófago lambda, que recombina no plasmideo entre attP e attB (Darquet, A. M et al. , Gene Ther 4(12):1341-9 (1997)). Esta recombinase é expressa sob o controlo de Pbad de uma forma dependente da arabinose na estirpe G6264 de E. coli, que é descrita no pedido U.S. N° 09/981803. O minicirculo resultante contém attL, uma sequência formadora de TH (hélice tripla) para purificação, o marcador seleccionável Tn903 gene de resistência canamicina, o gene III' marcador contra-seleccionável e o fragmento de interesse da recombinação homóloga, clonado no local de clonagem múltipla de pXL4235 (Fig. 29).

Como um exemplo, na Fig. 30 são descritas as construções utilizadas para produzir estirpes de E. coli expressando uma mutação com número aumentado de cópias de pirll6. Estas estirpes podem ser utilizadas para produzir plasmídeos pCOR (Soubrier, F. et al. , Gene Ther 6:1482-1488 (1999)). Uma vez que não existe qualquer homologia entre pir e o genoma bacteriano, as 105 sequências pirllô* foram inseridas no gene uidA cromossómico de E. coli, que codifica a β-D-glucuronidase. Este gene proporciona uma semelhança de sequência suficiente com o genoma de E. coli para ocorrer recombinação homóloga. 0 protocolo para a purificação do minicirculo e recombinação ocorreu como se segue. 0 plasmídeo pal4256 (Fig. 30) foi transformado na estirpe G6264 de E. coli para produzir G6656. Foram inoculados 0,5 mL de uma cultura, de um dia para o outro, de G6656 em cinquenta mL de meio LB suplementado com ampicilina (100 mg/L) com e incubados a 37 °C, com agitação a 200 rpm até à densidade óptica a 600 nm atingir 0,7. A produção do minicirculo foi induzida por adição de 250 pL de uma solução estéril de arabinose a 10% ao meio. Após 30 minutos a 37 °C, 200 rpm, foi extraído o ADN plasmidico total, utilizando o sistema Wizard Plus Midipreps DNA Purification (Promega Corporation, Madison WI, EUA) .

Foram aplicadas seis pg de preparação de ADN plasmidico num gel de agarose preparativo a 0,8%. Foi utilizado um marcador de ADN super-enrolado (Promega Corporation, Madison WI, EUA) como um marcador de peso molecular. Após electrof orese, de um dia para o outro, a 50 V, a construção em minicirculo super-enrolado (5,1 kb) foi extraída e purificada a partir do gel, utilizando um kit de purificação em gel SV (Promega Corporation, Madison WI, EUA) . 106 5. Recombinação dupla homóloga com o minicírculo 4256 (vector suicida em minicírculo uidA::pir!16*)

Os passos de recombinação para construir as estirpes e a fenótipos correspondentes estão descritos na Fig. 31.

Para o primeiro evento de recombinação (integração), foram submetidos a electroporação na estirpe XAC1 de E. coli 0,2, 1 e 5 pL do minicírculo 4256 purificado (Normanly, J et al., Proc Natl Acad Sei USA 83:6548-52 (1986)) que é a estirpe parental para hospedeiros de pCOR. Foram obtidas colónias resistentes à canamicina em Agar LB suplementado com canamicina (50 mg/L) após a incubação, de um dia para o outro, a 37 °C.

Foram riscadas 50 colónias KmR em paralelo em Agar LB suplementado com canamicina ou ampicilina para avaliar o número de colónias contendo potencialmente pXL4256 contaminante não recombinado. Apenas 4 colónias em 50 eram resistentes à canamicina e ampicilina e foi revelado por análise de restrição do plasmídeo que continham pXL4256 não recombinado. Isto indicou que 46 colónias de 50 obtidas por electroporação eram de facto integrantes do minicírculo 4256.

Para o segundo evento de recombinação (excisão), todos os integrantes 46 KmR foram isolados em placas de Agar LB recentemente preparadas contendo desoxicolato de sódio a 1,5% ("Doc"; Sigma) e incubadas a 37 °C, de um dia para o outro.

Foram obtidas apenas algumas colónias resistentes ao desoxicolato (DocR) (1 a 15) para cada integrante, como mostrado na Fig. 32. Este resultado foi compatível com a selecção de um evento relativamente raro, tal como um segundo evento de recombinação. Foram transferidas em paralelo 100 colónias DocR 107 obtidas a partir de 15 integrantes para Agar LB com Doc a 1,5% e Agar LB mais canamicina para rastreio de recombinantes duplos DocR e Kms. 86% das colónias rastreadas foram Kms, indicando que estas tinham perdido o vector suicida.

Para o rastreio para a substituição alélica, foi amplificado o local uidA cromossómico por PCR. Se tiver ocorrido substituição alélica, o tamanho de fragmento de PCR esperado é 1,3 kb. 0 tamanho de fragmento correspondente ao locus uidA do tipo selvagem, i. e., sem uma mutação pirllô* integrada é 0,85 kb. Os resultados apresentados no painel A da Fig. 33, indicam que ocorreu substituição alélica em 30% dos recombinantes duplos. Isto foi confirmado pela análise fenotipica dado que estes clones são também UidA- (beta

glucuronidase-) e originam colónias brancas em agar LB suplementado com Xgluc.

Foi verificada a integridade do genoma bacteriano na região próxima do local da recombinação homóloga por PCR em dois recombinantes independentes. O primeiro iniciador (seq6113 ou seq6115) foi baseado na sequência do gene pir e o segundo (seq6112 ou seq6116) tinha uma sequência baseada numa sequência próxima mas fora da região de homologia (imediatamente a 5' ou 3' de uidA). Foi utilizado ADN de XAC1 como um controlo negativo, enquanto foram utilizados XAClpirll6 ou TEX1 (Soubrier, F. et al., Gene Ther 6:1482-1488 (1999)) como controlos positivos.

Os oligonucleótidos utilizados como iniciadores de PCR foram os seguintes:

Seql1088: 5'-GAGATCGCTGATGGTATCGG-3' (SEQ ID N° 27) 108

Seqll089: Seq6112: Seq6113: Seq6115: Seq6116: 5'-TCTACACCACGCCGAACACC-3' (SEQ ID N° 28) 5'-GACCAGTATTATTATCTTAATGAG-3' (SEQ ID N° 29) 5'-GTATTTAATGAAACCGTACCTCCC-3' (SEQ ID N° 30) 5'-CTCTTTTAATTGTCGATAAGCAAG-3' (SEQ ID N° 31) 5 '-GCGACGTCACCGAGGCTGTAGCCG-3' (SEQ ID N° 32) O tamanho esperado do produto PCR é 0,83 kb utilizando os iniciadores seq6112 e seq6113 e 0,88 kb utilizando os iniciadores seq6114 e seq6115. Os resultados são apresentados no painel B da Figura 33. Os dois recombinantes duplos obtidos com o vector suicida em minicírculo apresentaram o perfil de PCR esperado. Isto demonstra que a recombinação homóloga dupla pode ser facilmente realizada em E. coli utilizando plasmideos em minicirculo como vector suicida e o gene M13 III' como um marcador contra-seleccionável. Esta técnica de substituição génica pode ser realizada directamente universalmente na coantituição genética de qualquer microrganismo. 109

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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> CENTELION Soubrier, Fabienne <120> Molécula de ADN circular com origem de replicação condicional, método para a sua preparação e a sua utilização em terapia génica 113 <130> 8888.0132-01 <150> US 10/268948 <151> 2002-10-11 <160> 39 <170> Patentln versão 3.1

<210> 1 <211> 389 <212> ADN <213> Escherichia coli < 4 0 0 > 1 tgtcagccgt taagtgttcc tgtgtcactg aaaattgctt tgagaggctc taagggcttc 60 tcagtgcgtt acatccctgg cttgttgtcc acaaccgtta aaccttaaaa gctttaaaag 120 ccttatatat tctttttttt cttataaaac ttaaaacctt agaggctatt taagttgctg 180 atttatatta attttattgt tcaaacatga gagcttagta cgtgaaacat gagagcttag 240 tacgttagcc atgagagctt agtacgttag ccatgagggt ttagttcgtt aaacatgaga 300 gcttagtacg ttaaacatga gagcttagta cgtgaaacat gagagcttag tacgtactat 360 caacaggttg aactgctgat cttcagatc 389

<210> 2 <211> 960 <212> ADN <213> Escherichia coli 114 <400> 2 tatacagaat gatgaggttt ttttatgaga ctcaaggtca tgatggacgt gaacaaaaaa 60 acgaaaattc gccaccgaaa cgagctaaat cacaccctgg ctcaacttcc tttgcccgca 120 aagcgagtga tgtatatggc gcttgctccc attgatagca aagaacctct tgaacgaggg 180 cgagttttca aaattagggc tgaagacctt gcagcgctcg ccaaaatcac cccatcgctt 240 gcttatcgac aattaaaaga gggtggtaaa ttacttggtg ccagcaaaat ttcgctaaga B00 ggggatgata tcattgcttt agctaaagag cttaacctgc cctttactgc taaaaactcc 360 cctgaagagt tagatcttaa cattattgag tggatagctt attcaaatga tgaaggatac 420 ttgtctttaa aattcaccag aaccatagaa ccatatatct ctagccttat tgggaaaaaa 480 aataaattca caacgcaatt gttaacggca agcttacgct taagtagcca gtattcatct 540 tctctttatc aacttatcag gaagcattac tctaatttta agaagaaaaa ttattttatt 600 atttccgttg atgagttaaa ggaagagtta acagcttata cttttgataa agatggaaat 660 attgagtaca aataccctga ctttcctatt tttaaaaggg atgtgttaaa taaagccatt 720 gctgaaatta aaaagaaaac agaaatatcg tttgttggct tcactgttca tgaaaaagaa 780 ggaagaaaaa ttagtaagct gaagttcgaa tttgtcgttg atgaagatga attttctggc 840 gataaagatg atgaagcttt ttttatgaat ttatctgaag ctgatgcagc ttttctcaag 900 gtatttaatg aaaccgtacc tcccaaaaaa gctaaggggt gatatatggc taaaatttac 960

<210> 3 <211> 24 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 3 gaccagtatt attatcttaa tgag 24

<210> 4 <211> 24 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 4 gtatttaatg aaaccgtacc tccc 24 115

<210> 5 <211> 24 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 5 <210> 6 <211> 24 <212> ADN <213> Escheri chia coli <400> 6 gcgacgtcac cgag< getgta gccg <210> 7 <211> 36 <212> ADN <213> Escheri chia coli <400> 7 qtatatggcg cttqctctca tcgatagcaa agaacc 36

<210> 8 <211> 36 <212> ADN <213> Escherichia coli 116 <4Ο0> 8 36 ggttctttgc tatcgatgag agcaagcgcc atatac <210> 9 <211> 20 <212> ADN <213> Escherichia coli <40 0> 9 gagategetg atggtatcgg <210> 10 <211> 20 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 10 tctacaccac gccgaacacc <210> 11 <211> 36 <212> ADN <213> Escherichia coli <40 0> 11 cgcaattgtt aacgtccagc ttacgcttaa <210> 12 <211> 36 <212> ADN <213> Escherichia coli 20 20 36 117 <4 Ο 0> 12 ggctacttaa gcgtaagctg gacgttaaca attgeg 36 <210> 13 <211> 31 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 13 ccctctagat cgatagccat ttttactcct g 31 <210> 14 <211> 29 <212> ADN <213> Escherichia coli <40 0> 14 cgggatcctg attatgccgt gtctattag 29 <210> 15 <211> 36 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 15 cccaagcttc ttcgttagtt tctgctacgc cttcgc 36 <210> 16 <211> 35 <212> ADN <213> Escherichia coli 118 <4 Ο 0> 16 ggtctagaac gtgaaagtgg tgaagaacaa aatcg 35 <210> 17 <211> 20 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 17 gcgacccttg tgtatcaaac 20 <210> 18 <211> 20 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 18 ggtattaccc ggcatgacag 20 <210> 19 <211> 20 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 19 gtggtggaaa tggcgatagg 20 <210> 20 <211> 20 <212> ADN <213> Escherichia coli 119 <4Ο0> 20 gcgattttgt tcttcaccac 20

<210> 21 <211> 918 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 21 atgagactca aggtcatgat ggacgtgaac aaaaaaacga aaattcgcca ccgaaacgag 60 ctaaatcaca ccctggctca acttcctttg cccgcaaagc gagtgatgta tatggcgctt 120 gctctcatcg atagcaaaga acctcttgaa cgagggcgag ttttcaaaat tagggctgaa 180 gaccttgcag cgctcgccaa aatcacccca tcgcttgctt atcgacaatt aaaagagggt 240 ggtaaattac ttggtgccag caaaatttcg ctaagagggg atgatatcat tgctttagct 300 aaagagctta acctgctctt tactgctaaa aactcccctg aagagttaga tcttaacatt 360 attgagtgga tagcttattc aaatgatgaa ggatacttgt ctttaaaatt caccagaacc 420 atagaaccat atatctctag ccttattggg aaaaaaaata aattcacaac gcaattgtta 480 acggcaagct tacgcttaag tagccagtat tcatcttctc tttatcaact tatcaggaag 540 cattactcta attttaagaa gaaaaattat tttattattt ccgttgatga gttaaaggaa 600 gagttaatag cttatacttt tgataaagat ggaaatattg agtacaaata ccctgacttt 660 cctattttta aaagggatgt gttaaataaa gccattgctg aaattaaaaa gaaaacagaa 720 atatcgtttg ttggcttcac tgttcatgaa aaagaaggaa gaaaaattag taagctgaag 780 ttcgaatttg tcgttgatga agatgaattt tctggcgata aagatgatga agcttttttt 840 atgaatttat ctgaagctga tgcagctttt ctcaaggtat ttgatgaaac cgtacctccc 900 aaaaaagcta aggggtga 918

<210> 22 <211> 305 <212> PRT <213> Escherichia coli 120 <400> 22

Met 1 Arg Leu Lys Vai 5 Met Met ASP vai Asn 10 Lys Lys Thr Lys ile 15 Arg H1S Arg Asn Glu Leu Asn His Thr Leu Ala Gin Leu Pro Leu Pro Al 3 20 25 30 Lys Arg Vai Met Tyr Met Ala Leu Ala Leu Ile Asp Ser Lys Glu Pro 35 40 45 Leu Glu Arg Gly Arg vai Phe Lys ile Arg Ala Glu Asp Leu Ala Al a 50 55 60 Leu Ala Lys ile Thr pro ser Leu Ala Tyr Arg Gin Leu Lys Glu Gly 65 70 75 80Υ Gly Lys Leu Leu Gly Ala ser Lys He Ser Leu Arg Gly Asp Asp He 85 90 95 Ile Ala Leu Ala Lys Glu Leu Asn Leu Leu Phe Thr Ala Lys Asn Ser 100 105 110 Pro Glu Glu Leu Asp Leu Asn ile Ile Glu Trp Ile Ala Tyr Ser Asn 115 120 125 Asp Glu Gly Tyr Leu Ser Leu Lys Phe Thr Arg Thr Ile Glu Pro Tyr 130 135 140 He Ser Ser Leu ile Gly Lys Lys Asn Lys Phe Thr Thr Gin Leu Leu 145 150 155 160 Thr Ala Ser Leu Arg Leu ser ser Gin Tyr ser Ser ser Leu Tyr Gin 165 170 175 Leu Ile Arg Lys His Tyr ser Asn Phe Lys Lys Lys Asn Tyr phe Ile 180 185 190 Ile Ser vai Asp Glu Leu Lys Glu Glu Leu ile Ala Tyr Thr Phe Asp 195 200 205 Lys Asp Gly Asn Ile Glu Tyr Lys Tyr Pro ASP phe pro ile Phe Lys 210 215 220 Arg Asp Vai Leu Asn Lys Ala ile Ala Glu ile Lys Lys Lys Thr Glu 225 230 235 240 Ile ser Phe Vai Gly Phe Thr vai His Glu Lys Glu Gly Arg Lys Ile 245 250 255 Ser Lys Leu Lys Phe Glu Phe vai vai ASp Glu Asp Glu Phe Ser ciy 260 265 270 121

Leu ser Glu Ala Asp Ala 285

Asp Lys Asp Asp Glu Ala Phe Phe Met Asn 275 280

Ala Phe Leu Lys vai Phe Asp Glu Thr vai 290 295

Pro Pro Lys Lys Ala Lys 300

<210> 23 <211> 23 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 23 cttaacggct gacatgggaa ttc 23

<210> 24 <211> 19 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 24 cgatgggcga gctccaccg 19

<210> 25 <211> 29 <212> ADN <213> Bacteriófago M13mpl8 <400> 25 ggcagatctt aaaccgatac aattaaagg 29 122 <210> 26 <211> 36 <212> ADN <213> Bacteriófago M13mpl8 <400> 26 ccgctcgagt tacgattgge cttgatattc acaaac 36 <210> 27 <211> 20 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 27 gagatcgctg atggtatcgg 20 <210> 28 <211> 20 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 28 tctacaccac gecgaacacc 20 <210> 29 <211> 24 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 29 gaccagtatt attatcttaa tgag 24 123 24 <210> 30 <211> 24 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 30 gtatttaatg aaaccgtacc tccc <210> 31 <211> 24 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 31 ctcttttaat tgtcgataag caag <210> 32 <211> 24 <212> ADN <213> Escherichia coli <40 0> 32 gcgacgtcac cgaggctgta gccg <210> 33 <211> 12 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 33 agaaaaaaag ga 24 24 12 124 <210> 34 <211> 12 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 34 <210> 35 <211> 14 <212> ADN <213> Escherichia coli <40 0> 35 aagaaaaaaa agaa 14 <210> 36 <211> 14 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 36 ttcttttttt tctt 14

<210> 37 <211> 12 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 37 tctttttttc ct 12 125 <210> 38 <211> 14 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 38 ttcttttttt tctt <210> 39 <211> 17 <212> ADN <213> Escherichia coli <40 0> 39 aaaaaaggga ataaggg 17

Lisboa, 11 de Novembro de 2011 126

Claims

REIVINDICAÇÕES Células hospedeira procariota recombinante compreendendo um gene pir heterólogo codificando uma proteína pi e uma molécula de ADN extracromossómica compreendendo um gene terapêutico heterólogo e uma origem de replicação condicional, cuja funcionalidade na célula hospedeira recombinante procariota requer a proteína pi, em que o gene pir heterólogo compreende, pelo menos, uma mutação, além da mutação pir116, sendo a referida mutação adicional seleccionada do grupo consistindo no resíduo 130 da proteína pi sendo uma valina, do resíduo 292 da proteína pi sendo uma metionina ou do resíduo 117 da proteína pi sendo uma glicina. Célula hospedeira recombinante procariota de qualquer das reivindicações anteriores, em que o gene pir heterólogo se encontra num plasmídeo. Célula hospedeira recombinante procariota da reivindicação 1, em que o gene pir heterólogo se encontra no genoma da célula hospedeira. Célula hospedeira recombinante procariota de qualquer das reivindicações anteriores, em que a origem de replicação condicional é de um plasmídeo bacteriano ou de um bacteriófago. Célula hospedeira recombinante procariota da reivindicação 4, em que a origem de replicação condicional é de R2K, R6K, RI, pSClOl, Rtsl, F, RSFIOIO, Pl, P4, lambda, Phi82 ou Phi80.
6. Célula hospedeira recombinante procariota da reivindicação 5, em que a origem de replicação condicional é do plasmídeo bacteriano R6K.
7. Célula hospedeira recombinante procariota da reivindicação 6, em que a origem de replicação compreende a SEQ ID N° 1.
8. Célula hospedeira recombinante procariota de qualquer das reivindicações 4-7, em que o plasmídeo compreende ainda um gene de selecção que não confere resistência a um antibiótico.
9. Célula hospedeira recombinante procariota da reivindicação 8, em que o gene de selecção codifica um ARN de transferência supressor para codões específicos.
10. Célula hospedeira recombinante procariótica da reivindicação 8, em que o gene de selecção é um supressor de um ARN de transferência âmbar e a célula hospedeira compreende ainda um gene compreendendo uma mutação âmbar.
11. Célula hospedeira procariota recombinante de qualquer das reivindicações anteriores, em que a referida célula hospedeira é deficiente para o gene endA.
12. Célula hospedeira procariota recombinante de qualquer das reivindicações anteriores, em que a referida célula hospedeira é deficiente para o gene traD. 2
13. Célula hospedeira procariota recombinante de qualquer das reivindicações anteriores, em que a referida célula hospedeira compreende ainda um gene recA mutado.
14. Método para produzir um plasmídeo compreendendo um gene terapêutico heterólogo e uma origem de replicação condicional cuja funcionalidade numa célula hospedeira procariota requer uma proteina iniciadora da replicação exógena à célula hospedeira, compreendendo: a) cultivar a célula hospedeira recombinante procariota de qualquer das reivindicações anteriores em condições em que o plasmideo seja produzido; e b) isolar o plasmideo. Lisboa, 11 de Novembro de 2011 3