NO752030L - - Google Patents

Description

Teknikkens stand har beskrevet et stort antall fremgangsmåter

jog materialer til bruk i bestemmelsen av forekomsten av antigener og antistoffer, særlig i menneskelige kroppsvæsker. En primær metode som brukes omfatter radioimmunproving og fremgangsmåten i sine forskjellige former er ytterst nyttig ved noyaktige bestemmelser av forekomsten av et antigen eller et antistoff. Imidlertid må en slik fremgangsmåte utfores i et velutstyrt la-boratorium og er derfor ikke egnet for bruk hverken i et legekontor eller hos en enkelt person som onsker å utfore den nodvendige bestemmelsen.

For å overvinne ulempene ved radioimmunitetsprovingsmetoden, særlig derved at metoden ikke er tilgjengelig for bruk av uovet personale eller i mindre enn fullt utstyrte laboratorier, har forkjellige andre motoder'blitt utviklet, omfattende en kolorimetrisk metode.^Imidlertid krever også de hittil utviklede ko-lorimetriske metodene en stor mengde utstyr da de omfatter, etter dannelse av en kjent mengde av en av komponentene av antigen-antistoffreaksjonsdeltakerne over i en form hvor den kan brukes i bestemmelsesfremgangsmåten og kompleksering av den andre komponenten til en flytende form, hvor bruken av de forskjellige laboratorieteknikker vanligvis krever, om ikke det mest forfinede utstyr, laboratorieutstyr som ikke er tilgjengelig for enhver lege og visselig ikke for en legmann. For eksempel, skjont en koiorimetrisk metode vises i denne typen fremgangsmåte i U.S. patent 3,654,090, Schuurs et al, at etter antigen-komponenten og antistoffkomponenten er dannet og blandet med en væske i hvis nærvær eller fravær en av komponentene skal bestem-mes, er forfinet sentrifugering nodvendig.

Sammenfåtting av oppfinnelsen

Ifolge den foreliggende oppfinnelse er en gjenstand utviklet som er lett å bruke i et legekontor for å bestemme nærvær eller fravær av antigener eller antistoffer i kroppsvæsker og virkelig kan brukes med samme enkelhet av en legmann som onsker å gjore den nodvendige bestemmelsen. Bruken av en slik gjenstand og den enk-le fremgangsmåten knyttet til gjenstanden er ytterst verdifull for rask bestemmelse av forskjellige antigener eller antistoffer I i menneskelige kroppsvæsker som f.eks. en svangerskapstest. Ifolge fremgangsmåten ved foreliggende oppfinnelse er en komponent av antigen-antistoffreaksjonsmedlemmet knyttet til en proveplate ved bruk av et materiale som ikke er partikkelformig og jevnt dispergert på glasset og som ved applikasjon fremkaller en poros overflate. Komponenten blir så knyttet til dette dekke. Den andre komponenten av antigen-antistoffreaksjonsmedlemmet er kovalent knyttet til et materiale som er i stand til å fremkalle en kolorimetrisk reaksjon. I bruk blir den andre komponenten inkubert med en kroppsvæske hvor bestemmelsen skal utfores med hensyn til nærvær av den andre komponenten, og denne komponenten helles på proveplaten. Mangelen på farge er et positivt tegn som indikerer nærvær av komponenten i kroppsvæsken, mens opptre-den av farge er negativt, som indikerer fravær av denne komponenten i kroppsvæsken.

Kort beskrivelse. av tegningene

I de vedlagte tegninger:

Fig. 1 er et blikk ovenfra av proveplaten i foreliggende oppfinnelse, og

Fig. 2 er et tverrsnitt langs linjen 2-2 i fig. 1.

Beskrivelse av de foretrukne utforelser

Det vanskelige punktet i foreliggende oppfinnelse er gjenstanden som skal brukes i bestemmelsesmetoden, den dekkede proveplaten. Utformningen av denne proveplaten vil derfor forst bli beskrevet. Ved utformningen av proveplaten brukes vanligvis en standard glassplate. Imidlertid kan like godt syntetiske plastmaterialer som ikke reagerer med de andre reaktantene under reaksjonsbetin-gelsene brukes som polymétyl akrylat proveplater. Disse proveplatene blir forst dekket med gelatin som inneholder materialet som danner den porose, ikke partikkelformede overflaten. Blant materialene som kan brukes for dannelsen av en slik overflate er krom alum, agar, agarose, og kryssbundet dekstran. Andre materialer som er i stand til å danne en slik overflate som er full-stendig vannuloselig etter applikasjonen, vil være åpenbare for den ovede fagmann. Krom alum er det foretrukne materiale.

i

I

Det innledende sjiktet på testplaten utfores ved å danne en blan-I ding av gelatin, porost overflatedannende materiale, særlig krom alum, og destillert vann. Skjont mengdene av materialet ikke er kritiske, er de vanligvis fra ca. 4 til 10 gram gelatin og fra 0. 3 til 2,0 gram av det partikkeldannende materiale pr. liter vann. Blandingen holdes på en hoyere temperatur på tilnærmet 50 til 60°C i omtrent 10 til 20 minutter, og det gjenblivende uloselige materialet filtreres fra losningen. Platene dyppes 1. den resulterende losningen og lufttorres i flere timer, f.eks. natten over, for å sikre tilstrekkelig herding av de applikerte materialer.

Etter dannelsen av de gelatintrukne platene hvor gelatinen inneholder et materiale som vil danne en poros overflate på platen, bindes komponenten til antigen-antistoffreaksjonsmedlemmet til platen i en ulose,lig form. For applikasjon av den uloselige komponenten dyppes den forut besjiktede platen i en gelatin-poros , overflatedannende materiallosning av nettopp beskrevne type og behandles så med noen få dråper, f.eks. 2 eller 3 av en forbin-delse av komponenten, enten antigen eller antistoff, med en bromcyan-behandlet Sepharose. Sepharose ér en hydrogenbundet polysakkarid type agarose gel.

Den sådan fremstilte platen blir lufttorket og uttorkes så i en time. Den kan brukes oyeblikkelig i fremgangsmåten for foreliggende oppfinnelse eller den kan kjoles inntil bruk om onsket.

Den således fremstilte proveplaten i foreliggende oppfinnelse illustreres i vedlagte tegninger hvor det på den underliggende platen 1 er plassert en proveflekk 2.

En metode for å danne konjugatet av antigen eller antistoffet med den bromcyan-behandlede Sepharosen er å inkubere en mengde på 15 gram av bromcyan-behandlet Sepharose med tilnærmet 15 cc av antigen eller antistoff, den siste i en konsentrasjon på 10 mg/ml lost i 0,1 M natrium bikarbonat bufferlosning som inneholder 0,5 M natrium klorid. Sepharosen og antigen eller antistoffet inkuberes ved 4°C i 20 timer, og konjugatet blir så vas-ket og suspendert i fosfat buffert saltlosning ved en pH på 7,2. jDet vaskede konjugatet blandes med en lik volumdel koksaltlos- j ning for å danne materialet som plasseres på den besjiktede platen. I alminnelighet tilfores tilnærmet 0,2 cc av dette blandede materialet til platene, slik at det dannes et hvitt sjikt for testformål.

Det eneste andre materiale som må fremstilles for å utfore fremgangsmåten ved foreliggende oppfinnelse er et konjugat av den andre komponenten av antigen-antistoffreaksjonen med et materiale som er i stand til å fremkalle en fargereaksjon i lopet av proven. Spesielt kan den andre komponenten av antigen-anti-stcff reaks jonen forbindes med et enzym som vil reagere under fremkalling av en kolorimetrisk bestemmelse. Et foretrukket enzym for slik bruk er peroksidase. Andre brukbare enzymer for dette formål er beta-glukuronidase, beta-D-glukosidase, beta-D-galaktosidase, urease, glukose oksidase pluss peroksidase og galaktose oksidase pluss peroksidase. Slike materialer er beskrevet og en metode for dannelse er gitt f.eks. i det foran-nevnte U.S. patent 3,654,090. Det nettopp refererte konjugatet dannes ved tilsetting av 12 mg av enzymet, særlig peroksidase, til 1 ml av 0,1 M fosfat bufflet losning ved en pH på 6,8 inne-holdende 5 mg av antistoffet. Til denne blandingen settes 0,05 ml av en 1% vandig losning av glutaraldehyd og den nye blandingen inkuberes 2 timer ved romtemperatur og dialyseres så mot fosfat-bufferen og saltlosningen. Antistoff-konjugatet folges så med halvmettet amonium-sulfat for å separere konjugatet fra enhver gjenblivende fri peroksidase. For å gjore det resulterende konjugatet brukbart i fremgangsmåten for foreliggende oppfinnelse, underkastes det påfolgende fortynninger for å sikre et farget endepunkt med et hvert av de forskjellige fargereagensene som kan anvendes i prosessen, særlig som fremsatt i de folgende eksemplene. Konsentrasjonen av dette konjugatet reduseres med det halve ved hver fortynning til et tidspunkt da ingen farge opptrer på proveplaten. Fortynningen anvendt umiddelbart for dette er konsentrasjonen av konjugatet som benyttes i påfolgende prover.

For å benytte fremgangsmåten og gjenstanden i den foreliggende oppfinnelsen, blandes en provelosning av kroppsvæsken som skal testes for nærvær av antigen eller antistoff med komponenten som er koplet til materialet som vil fremkalle en fargereak-

i

I I

sjon, særlig et av de enzymer som det refereres til ovenfor, og I blandingen inkuberes for tilnærmet 2 minutter. Denne blandingen påfores så en av proveplatene og etter en kort kontakttid på 1 til 2 minutter vaskes proveplaten med destillert vann. Et far-gereagens som er aktiverbart av enzymdelene av konjugatet påfores så testplaten. Hvis ingen farge opptrer, indikerer dette nærvær av komponenten i den provede kroppsvæsken idet det indikeres at dette materialet har reagert med komponenten på proveplaten.

Hvis en farge opptrer når reagenset er plassert på proveplaten

i dette siste trinnet, indikerer det fravær av komponenten i den provede kroppsvæsken da det viser en reaksjon av konjugatet med komponenten på proveplaten og derfor kopling med enzymet som fremkaller fargen.

Det brukte fargereagenset- i eksemplene som folger er ett dannet fra 4-klor-l-nafthol. Det dannes ved tilsetting av 0,5 ml av en losning av 4-klor-l-naftholet (0,5 gram lost i 25 ml dietylen-glykol) til 2,5 ml av 1% eddiksyre i vann og 13 ml av dietylen-glykol. Til denne losningen settes 0,2 ml 3% hydrogen peroksid i vann. Nettopp beskrevne fremgangsmåte gir en brukbar 4-klor-l-naf thol fargelosning, men andre fargelosninger dannet ved lignende anordninger vil være åpenbare for fagmannen.

For at fagmannen skal være bedre i stand til å utfore fremgangsmåten ved foreliggende oppfinnelse og bruke gjenstanden, gis de folgende eksempler. Disse eksemplene skulle betraktes som illust-rerende for foreliggende oppfinnelse og på ingen måte begrense dens omfang:

EKSEMPEL I

En testplate ble besjiktet med gelatinlosning som inneholdt krom alum på måten som ovenfor beskrevet og ble tillatt å lufttorke natten over. Platen ble igjen besjiktet i en lignende losning og 3 dråper av et Sepharose-konjugat av bovin serum albumin (BSA) dannet på forhånd beskrevet vis, ble applisert på et sent-ralt punkt på platen. Den resulterende gjenstand ble lufttorket ved romtemperatur.

EKSEMPEL II

En annen gjenstand ble dannet på samme vis som fremsatt i eksempel 1, men ved å bruke 2 dråper av en opplosning av human gamma-globulin (HGG). Denne gjenstanden ble også tillatt å lufttorke ved romtemperatur.

EKSEMPEL III

En tredje proveplate ble fremstilt ved bruk av samme fremgangsmåte som i eksempel 1 med humant korionisk gonadotrof in (HCG)..

EKSEMPEL IV

To dråper av et monospesifikt peroksidase konjugert antiserum rettet mot BSA tilfores en av testplatene dannet ifolge eksempel 1. Den således behandlede proveplaten blir tillatt inkubert ved romtemperatur i 2 minutter og vaskes så med destillert vann. En mengde av 4-klor-l-nafthol-fargereagensen dannet som foran beskrevet (heretter referert til som fargereagensen), appliseres så på den sentrale delen av proveplaten og hva som hadde opprinnelig vært en hvit flekk, utvikler en purpuraktig, blå farge av middels intensitet som indikerer gjennom fargefremkal-ling av peroksidase reaksjonen av antistoffet i peroksidaselos-ningen med antigenet på testplaten.

EKSEMPEL V

En mengde på 0,2 cc av en losning av konjugatet i eksempel IV inkuberes i 2 minutter med 0,2 cc av en kroppsvæske for bestemmelse av nærværet av antigenet for BSA i kroppsvæsken. Tilnærmet 2 dråper av denne blandingen appliseres på en proveplate dannet ifolge eksempel I. Den purpuraktige, blå fargen utviklet seg på disse prbveplatene hvor intet BSA antigen var til stede i kroppsvæsken. I disse kroppsvæskene som hadde antigen for BSA, utviklet ingen farge seg ved applikasjon av far-ger eag en set .

!

EKSEMPEL VI

På en lignende måte som fremsatt i eksempel IV ble et monospesifikt peroksidase konjugat serum rettet mot HGG applisert på en proveplate fremstillet ifolge eksempel II. Etter applikasjonen av fargereagenset utviklet en purpuraktig, blå farge seg.

EKSEMPEL VII

På lignende vis som beskrevet i eksempel V ble en blanding av en human kroppsvæske og konjugatet i eksempel VI dannet for å bestemme nærværet av HGG antigenet i den menneskelige kroppsvæsken. Igjen utviklet det seg ingen farge i de væskene som inneholdt antigenet ved applikasjon av fargereagenset, mens den purpuraktige, blå fargen utviklet seg når den humane kroppsvæsken ikke inneholdt antigenet.

EKSEMPEL VIII

På en lignende måte som beskrevet i eksempel VI ble et monospesifikt peroksidase konjugert antiserum rettet mot HCG applisert på proveplaten fremstilt ifolge eksempel VIII. Etter vask og påfolgende behandling med fargereagenset utviklet det seg en purpuraktig, blå farge i sentrum av proveplaten.

EKSEMPEL IX

På en lignende måte som beskrevet i eksempel V ble en human kroppsvæske blandet med konjugatet fra eksempel VIII og ble applisert på testplaten som var dannet ifolge eksempel III. Igjen indikerte fraværet av farge ved applikasjon av fargereagenset nærværet av antigenet i den humane kroppsvæsken, mens fraværet av farge indikerte nærværet av antigenet i den humane kroppsvæsken .

Eksemplene ovenfor beskrevet var i stand til å påvise antigener i kroppsvæskene ved nivåer på o,l til 1,0 mgm/ml. Imidlertid

var omfindtligheten av testplaten slik at den var i stand til å påvise mengder av antigener langt under dem i det beskrevne om-

I rådet.

I i Mens eksemplene ovenfor beskrevet spesifikt viser antistoffet I påfort proveplaten og antigenet konjugert med enzymet, kan gjenstanden og fremgangsmåten like fullt brukes med disse komponentene ved den motsatte reaksjonen. Lignende oppnås likeverdige resultater når peroksidase blir erstattet med ett av de andre enzymene og et indiserende fargestoff aktiverbart av dette enzymet brukes, som vel kjent i teknikkens stand.

Mens spesifikke utforelser av gjenstanden og fremgangsmåten for foreliggende oppfinnelse er blitt vist og beskrevet, skulle ikke oppfinnelsen betraktes som begrenset til disse spesifikke eksemplene, men bare som begrenset av de anforte kravene.

Claims (16)

1. En gjenstand som brukes for å bestemme tilstedeværelsen av en komponent av antigen-antistoffreaksjonsmedlemmet i en human kroppsvæske, karakterisert ved at denne artik-kelen omfatter:

(a) En proveplate dannet av et materiale som er inert overfor reaktantene under reaksjonsbe-tingelsene; (b) et forste sjikt på denne proveplaten dannet av gelatin og et materiale som ved torking gir en porbs overflate5 (c) et annet gelatin-sjikt og et materiale som etter torking danner en poros overflate; og (d) en liten mengde av et konjugat av bromcyan-behandlet Sepharose og den andre komponenten av antigen-antistoffreaksjonsmedlemmet.

2. Gjenstand ifolge krav 1, karakterisert ved at materialet som danner den porose overflaten er krom alum.

3. Gjenstand ifolge krav 1, karakterisert ved at materialet som danner den porose overflaten er agarose.

4. Gjenstand ifolge krav 1, karakterisert ved at materialet som danner den porose overflaten er agar.

5. Gjenstand ifolge krav 1, karakterisert ved at komponenten som er konjugert med bromcyan-behandlet Sepharose er bovin serum albumin.

6. Gjenstand ifolge krav 1, karakterisert ved at komponenten konjugert med bromcyan-behandlet Sepharose er humant gamma-globulin.

7. Gjenstand ifolge krav 1, karakterisert ved at komponenten konjugert med bromcyan-behandlet Sepharose er human korionisk goadotrofin.

8. Gjenstand ifolge krav 1, karakterisert ved at komponenten knyttet til bromcyan-behandlet Sepharose er antigenet.

9. En fremgangsmåte for å bestemme nærværet av en komponent av et antigen-antistoffreaksjonsmedlem karakterisert ved at det omfatter: (a) Dannelse av en proveplate-gjenstand ifolge krav 1; (b) tilfore nevnte gjenstand en blanding av en human kroppsvæske og et kunjugat dannet av den andre komponenten og et enzym som vil aktivere en fargekomponent; (c) rense nevnte gjenstand med destillert vann; og (d) tilfore et materiale som er aktiverbart av nevnte enzym for å fremkalle en farge.

10. Gjenstand ifolge krav 9, karakterisert ved at materialet som danner den porose overflaten er krom alum.

11. Gjenstand ifolge krav 9, karakterisert ved at materialet som danner den porose overflaten er agarose.

12. Gjenstand ifolge krav 9, karakterisert ved at materialet som danner den porose overflaten er agar.

13. Gjenstand ifolge krav 9, karakterisert ved at komponenten som er konjugert til bromcyan-behandlet Sepharose er bovin serum albumin.

14. Gjenstand ifolge krav 9, karakterisert ved at komponenten som er konjugert til bromcyan-behandlet Sepharose er humant gamma-globulin.

15. Gjenstand ifolge krav 9, karakterisert ved at komponenten som er konjugert til bromcyan-behandlet Sepharose er humant korionisk gonadotrofin.

16. Gjenstand ifolge krav 9, karakterisert ved at komponenten som er knyttet til bromcyan-behandlet Sepharose er antigenet.