NO821585L - Fremgangsmaate ved fjerning av formylgruppen fra n-formylpeptider og estere derav - Google Patents

Description

'Foreliggende oppfinnelse vedrører peptider og mer spesielt fjerning av formylgruppen fra peptider eller N-formyl-;

estere derav ved hjelp av hydrasin eller derivater av hydrasin under spesielle pH-forbindelser.

i Det er kjent fra den kjemiske litteratur at aminogruppen-

til aminosyrer kan blokkeres ved hjelp av formylresten for å beskytte aminogruppen under peptidsyntesenés forløp. Det

er åpenbart nødvendig ved slutten av fremstillingen å fri- i gjøre aminogruppene ved å fjerne formylgruppen. Skjønt det i første prosesstrinnet, dvs. formuleringen, er lett å.utføre, er ikke resultatene man får i det påfølgende deformylerings-sluttrinnet like tilfredsstillende ved hjelp av konvensjo-nelle metoder. Selv om deformyleringsbetingelsene som anven-des faktisk er meget enkle, er de oppnådde resultater også utilfredsstillende.på grunn av forandringer i peptidmolekylet som er mer eller mindre omfattende, - forandringer som også innbefatter peptidbindingen. Dette opptrer når man ope-rerer under de vanlige deformyleringsforbindelser, dvs. i en løsning av vann og alkohol med alkoholer som inneholder 1-5 karbonatomer i nærvær av. sterke syrer så som saltsyre, svovelsyre, salpetersyre, p-toluensulfonsyre eller trifluor-eddiksyre.

'Forandringene i den foran nevnte kjemiske struktur er ennu klarere når substratet ist.edet for et formylert peptid består av et peptid som er formylert og forestret, fordi det i tillegg til de ovenfor.nevnte vanskeligheter ofte forekommer også hydrolyse av estergrupper i større og mindre grad og produktet blir tilsvarende diketopiperasin.

En omfattende bibliografi om deformylering av peptider er

å finne i: Zehra, A., Ber. 23, 3625 (1890); Hillmann-Elies, A., Naturforsch., 6B, 340 (1951); Waley, S.G., Chem. Ind. 1953, 107; Boissonnas, R.A., Heiv. Chim. Acta 36, 875 (1953);

Sheehan, J.C., J. Am, Chem. Soc. 80, 1154 (1958); andre detaljerte beskrivelser finnes i klassisk littertaur om peptider så som J. Greenstein; Chem. of Am.Acid, II,

1244, 46,47). De samme forfattere har undersøkt deformylering

utført i et surt medium. |

i

I I

I

Under senere undersøkelse har man operert med forskjellige i betingelser og.har oppnådd bedre resultater ved å bruke j I II andre substanser som deformyleringsmidlér så som acetyl-| klorid eller hydroksylamin eller hydrazin. Imidlertid har i disse forfattere angitt at sistnevnte ikke er egnet for de- i formylering av estere fordi den fører til dannelsen av dé j tilsvarende hydrasinderivater. (Lefrancier, Bull. Soc. | : Chim. France 1965, 3668; Geiger, GB-PS 1 182 450). j

I-Andre forskere har deformylert peptider eller estere av . ;

peptider ved oksydasjon med t^C^(Losse, Am.Chem. 1960, 636, 140) eller ved hjelp av hydrogenolyse (Losse, J. Prakt. , Chem. 1964, 24, 118).

Betydningen av N-deformylering av peptider eller deres N-formylerte estere er klar også ut fra et industrielt syns-punkt. Et eksempel på en substans av industriell viktighet med en peptidstruktur og med tydelig søtningsegenskaper er a-L-aspartyl-L-fenylalaninmetylester som er kjent som "aspartam".

Denne forbindelse er fremstilt på mange forskjellige måter ved å anvende nesten alle de klassiske metoder som brukes for fremstilling av peptider, og spesielt ved å blokkere aminogruppen til aspartinsyre etterfulgt av aktivering av dens a-karboksygruppe i form av en aktiv ester eller anhydrid, etterfulgt.av en kondensasjonsreaksjon med fenylalaninmetylester og fjerning av gruppen som blokkerer aminogruppen i det erholdte forestrede peptid.

De industrielle fremstillingsprosesser for a-L-aspartyl-L-fenalalaninmetylester har støtt på betydelige praktiske vanskeligheter med hensyn til hvilken synteserute som. skal velges og også fordi flere synteseveier innbefatter bruk av toksiske forbindelser så som fosgén eller substanser som er vanskelig å anvende så som karbobenzoksyklorid. En annen vanskelighet er at veiene fører til det ønskede produkt i j

meget lave utbytter. j I

Den industrielle prosess som synes å være relativt lett for

å utføre fremstilling av aspartam innbefatter kondensasjon

av anhydrid av N-formyl-L-aspartinsyre med L-fenylalaninmetylester og den etterfølgende N-deformylaring av N-formyl-;

a-L-aspartyl-L-fenylalaninmetylester som derved oppnås. N- ! deformyleringen utføres i nærvær av et spesifikt løsnings-middel og sterke- uorganiske syrer, ifølge Takemoto, tysk<1>Off.sch. 2.635.948 eller med hydrdksylamin ifølge Takemoto, tysk Off.sch. 2.554.421 eller ved å oppvarme i nærvær av vann ifølge Takemoto, Japansk Kokai 76 39.602 eller med saltsyre

i metanol ifølge tysk Off.sch. 2.256.055. Fremgangsmåten som er beskrevet i disse publikasjoner medfører flere ulemper,

og i alminnelighet under deformyleringsréaksjonen av

andre N-formulerte peptider eller.de respektive estere. . Fremfor alt ligger en ulempe i lave utbytter som oppnås i slutt-trinnene av syntesen og det faktum at mellomproduktene er .temmelig dyre. Dertil følges de, lave utbytter av betydelige forurensninger i sluttproduktene som åpenbart må renses videre under betydelig tilleggsproduksjonskostnader.

Man har nå overraskende funnet at fjerningen av N-formylresten i peptider eller deres respektive estere kan utføres på en enkel måte med overraskende og betydelig forbedrede utbytter ved å utføre fjerningen av formylgruppen i nærvær av hydrasin eller hydrasindérivater i pH-området mellom 1-3,5. pH-området er avgjørende for reaksjonen.

Et formål ved foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe

en fremgangsmåte for. fjerning av formyIgruppen i N-formylerte peptider eller deres respektive estere, og spesielt for fjerning av denne gruppe i metylestere av N-formyl-a-L-aspartyl-L-penylalanin ved hjelp av hydrasin eller hydrasindérivater med formel I:

I

hvori R er en alkylrest med 1-5 karbonatomer som kan være mettet eller umettet, rettkjedede eller forgrenet eller en cykloalkylrest eller en arylrest, hvilken gruppe også kan være substituert med andre funksjonelle grupper eller enj ! aminogruppe, idet reaksjonen utføres ved en pH mellom 1 og

I fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse må pH være mellom 1 og 3,5. Hvis man utfører, reaksjonen ved - syrer i fravær av hydrasin eller-hydrasinderivater finner man at hvis reaksjonen er utført ved en pH lavere enn 1,

o 1 ■ er formylutgangsmaterialet etter 1 t ved 60 C fullstendig forsvunnet og et lite utbytte, ca^15%, dannes av et deformylert produkt. Ved hjelp av TLC (tynnskjikt-kromatografi) finner man en betydelig, mengde av et produkt som er funnet å være diketopiperasin (se under).

Hvis.man på den andre side utfører, reaksjonen ved en pH høyere enn 3,5, forløper deformyleringen i en meget liten, nesten ubetydelig utstrekning, selv når reaksjonen utføres over et meget langt tidsrom. pH-området som reaksjonen nødvendigvis.må utføres under, må derfor holdes konstant under reaks jons.forløpet, fordi, når basen frigjøres, har pH

en tendens til å øke. Denne kontroll kan utføres ved å. gradvis tilsette reaksjonsblandingen en løsning av en uorganisk syre så som f .eks', en løsning av 10% saltsyre eller svovelsyre, eller ogsa paratoluensulfonsyre. Det er også mulig å bruke egnede pufferløsninger.

Det er allerede omtalt i det foregående at andre forfattere har rapportert at hydrasin ikke er egnet for deformylering av N-formylerte peptidestere på grunn av den mulige dannelse av de tilsvarende hydrasider (P. Lefrancier et al, Bull.Soc. Chim.Franee 1965 3668)..

Det er imidlertid overraskende funnet at denne ulempe kan minimaliseres hvis man utfører reaksjonen i henhold til i foreliggende oppfinnelse i pH-området mellom 1 og 3,5. ' ; Med hensyn til de eksperimentelle betingelser kan hydrasin- .: mengden varieres mellom 1 og 3 mol for hvert mol av peptideti eller de tilsvarende estere som skal deformuleres, mens løsningsmidlet er metanol eller en blanding av metanol og

•i • vann eller andre løsningsmidler, idet struktur og mengde, av selve løsningsmidlene er av liten betydning. I ethvert

tilfelle'er det nødvendig for å utføre prossessen tilfredsstillende forut nevnt og i begynnelsen justere blandingens pH til mellom 1 og 3,5 og opprettholde dette pH-området under reaksjbnsforløpet som kan være méd en temperatur, mellom 20 og 100°C, idet reaksjonstiden kan variere avhengig av temperaturen. Syren som brukes kan være en sterk mineralsyre så som saltsyre eller svovelsyre eller salpetersyre eller' den kan være paratoluensulfonsyre.

Det er. funnet at N-deformyleringen opptrer med forbedrede utbytter hvis reaksjonen utføres i nærvær av substanser med

hvori R har den ovenfor beskrevne betydning. Selve reaksjonen forløper lett under betingelser med minimale forandringer og med meget gode. utbytter som varierer mellom 75% og 90%

og også høyere, avhengig av den forbindelse som brukes.

Det er funnet at aktiviteten til forbindelsen med formel.

som deformuleringsmidler, er spesielt høyere i tilfellet acetylhydrasin, som er den enkleste forbindelse, benzoylhydrasin, trimetylaminoacetylhydrasldklorid, sistnevnte kalles gjerne "Girad T",. som.er mer kompleks og som inne-

holder ytterligere funksjonelle grupper og semikarbasid.

i Med hensyn til eksperimentelle betingelser er mengden av; !

i. deformyleringssubstanser mellom 1 og 5 mol i forhold til I et mol av peptider eller estere som deformuleres; men det i er mulig også å bruke større mengder av reaktanten, men uten: særlig økonomisk fordel.

Løsningsmidlet er fortrinnsvis metanol eller en blanding' av metanol og vann i tilfelle peptider, men i tilfelle pep-tide estere er det fortrinnsvis den samme alkohol som danner -esteren i peptidet. Også her er løsningsmidlets struktur ikke så viktig, slik at det også er mulig å bruke en annen alkohol med et karbonantall varierende mellom 2 og 5 eller andre løsningsmidler som er løslige i vann, så som dioksan, aceton, acetonitril og dimetylformamid. Det er også mulig å bruke andre løsningsmidler, som ikke er løslige i vann som hydrokarboner, klorerte hydrokarboner, etere, ketoner, estere eller blandinger av disse løsningsmidler. Alle disse løsningsmidler brukes i nærvær eller fravær av vann, og derfor kan i noe tilfelle en enkel fase foreligge og i andre tilfeller tofaser. Reaksjonstemperaturen er ikke avgjørende fordi temperaturen bare innvirker på reaksjonstiden. Nærmere bestemt kan temperaturen variere mellom 20 og 150°C avhengig av det anvendte løsningsmiddel og.reaksjonstiden kan variere mellom 30 min. og 30 t, avhengig av temperaturen. Eksemplene som. følger illustrerer i detalj fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse under forskjellige eksperimentelle betingelser uten imidlertid å begrense oppfinnelsens omfang. Reaksjonsforløpet er i allminnelighet godt kontrollert ved hjelp av. TLC (tynnsjiktskromatografi) som i tillegg klart . viser de små forandringer i kjemisk struktur som oppstår under reaksjonsforløpet. Det er faktisk mulig å klart vise at det i tillegg til det deformulerte produkt bare foreligger små mengder av et "diketopiperasin". Denne forbindelse, spesielt 2-benzyl-3,6-diketo -5-piperazinyleddiksyre er normalt tilstede i aspartam handelsvare i en mengde på 2%

og Food and Drug Administration, kapitel 21, Code of Federal

Regulations, del 121, 1258, foreskriver en maksimumsgrense j på 2% for denne forbindelse i .aspartam. I.renhetsprøvene av aspartam som oppnås ifølge fremgangsmåten ved foreliggende

i i oppfinnelse, hvilke prøver ble utført ved hjelp av HPLC i J (høytrykksvæske kromatografi) har den ovenfor nevnte sub- j stans, det substituerte diketopiperazin aldri vært funnet i i. mer enn 0,6-0,7%. Lignende forbedring med hensyn til handels-varene ble oppnådd når det gjaldt en annen forurensning som normalt finnes i aspartam, dvs. a-aspartyl-fenylalanin, som ;

foreligger i handelsprøver av aspartam i en mengde på ca'. 1%, mens- i produktet som erholdtes ifølge, foreliggende oppfinnelse overskrides aldri 0,3%. Den kvantitative bestemmelse.,

av reaksjonsproduktet ble utført med GLC (gass-væske- • kromatograf i) ..'

EKSEMPLER

Eksempel 1

N-formyl-a-L-aspartyl—L-fenylalanin metylester, 3,2 g

(10 mmol) oppløses i 32 ml metanol. Man tilsetter 3,2 ml vann og deretter justeres pH til 2 med 0,5 ml 3% saltsyre. Løsningen oppvarmes til 70°C og denne temperaturen holdes

i'10 t mens pH kontinuerlig justeres ved. hjelp av 3% saltsyre, slik at pH holdes i området 1,5-3,0.

KontrollTLC (løsnin<g->: metyletylketon/acetylsyre/pyridin/

vann, 32-4-2-6)

Ninhydrinindikator:

Eksempel 2

3,2 g (10 mmol) N-formyl-a-L-aspartyl-L-fenylalanin'metylester, oppløses i 32 ml metanol. Separat fremstilles en. løsning av 1,5 g hydrasirtmonohydrat (30 mmol) oppløst i 5 ml vann og pH justeres til 1,5 med 15% saltsyre. Denne løsning settes til den første løsning og pH justeres til 1,5 med-15% saltsyre. Løsningen oppvarmes til 70°C og denne temperaturOpprettholdes i 7,5 t mens pH alltid holdes mellom 1,5 og 3,5 ved' tilsetning av 15% saltsyre.

Analyse GLC: a-L-aspartyl-L-fenylalanin metylester:

2 g (utbytte: 70%)

i Eksempel 3<1>

3,2 g (10 mmol) N-formyl-ct-L-aspartyl-L-fenylalanin metylester oppløses i 32 ml metanol. Deretter tilsettes 3,2 ral vann og 3,3 g acetylhydrasin (30 mmol). pH justeres til 2,5 med en 10% saltsyreløsning. Blandingen oppvarmes til j 54°C og holdes 8 timer på denne temperatur mens pH holdes mellom 1,5 og 3,5.

. Kontroll TLC (løsning: metyletylketon/eddiksyre/pyridin/ vann 32-4-2-6) Ninhydrin indikator:

■ Eksempel 4

3,2 g N-formyl-a-L-aspartyl-L-fenylalanin metylester blir oppløst i 32- ml metanol. Deretter tilsettes 3,2 ml vann og 5 g "Girard T" reagens, 30 mml og pH blir justert til

2,5 med 10% saltsyreløsning. Blandingen oppvarmes til 70°C

pg holdes ved denne temperatur i 7 timer ved pH på 1,5-3,5. Kontroll TLC (løsning: metyletylketon/eddiksyre/pyridin/

vann 32-4-2-6)

Ninhydrin indikator:

Eksempel 5

3,2 g (10 mmol) N-formyl-a-L—aspartyl-L-fenylalanin metyl- ;

ester oppløses i 32 ml metanol og tilsettes 3,2 mmol \

vann og 3,33 g. semikarbazid hydroklorjd'som utgjør 30 mml.'' | pH ér 2 og det er ikke nødvendig å korrigere denne. Blandingen blir oppvarmet til 70°C og holdes på denne temperatur i 8 timer ved pH på 1,5-3,5.. !

Analyse GLC: a-L-asparty1-L-fenylalanin metylester

■2,4 g (utbytte: 83%).

Eksempel 6

,3,2 g N-formyl-a-L-aspartyl-L-fenylalanin metylester (10 mmol) oppløses, i 32 ml metanol. Det tilsettes 3,2 ml vann og 4 g benzoylhydrasin (30 mmol). pH justeres til 1,5-3,5. Løs-ningen oppvarmes til 70°C og holdes ved denne temperatur i

.4 timer, mens pH holdes i det. foreskrevne område. Materialet inndampes under .vakuum ved en -temperatur under 40°C; 10 ml vann tilsettes og pH justeres til det isoelektriske punkt (pH = 5,2), avkjøles til 0°C og vakuumfilteres.

Produktet er 2,5 g aspartam som er analytisk rent. (Utbytte: 85,4%) .

Eksempel 7

12.825 kj N-formyl-a-L-aspartyl-L-fenylalanin metylester oppløses i 30 1 dikloretan hvortil settes 10 1 iseddikksyre, 10 1 metanol og 14 kg acetylhydrasin. Temperaturen økes til

64°C og pH justeres til 2,2-2,3 ved tilsetning av en løsning av konsentrert saltsyre. Løsningen oppvarmes ved 64°C,

mens pH stadig holdes i området 2,2-2,3. Under disse be-, tingelser er deformyleringsreaksjonen fullstendig etter 5 t. Sluttvolumet er 80 1. Reaksjonsløsningen brukes til ved analyse (HPLC, høytrykksvæskekromatografi) å bestemme inn-holdet av a-L-aspartyl-L-fenylalanin metylester. Verdien er 132 mg/ml.

Analysebetingelsene er følgende: Kolonne: RPg 10fim, kolonnens temperatur er 45°C, strøm- ningshastigheten er 2 ml/min. med UV ved 215 hm som indikator.

i Eluent: Fosfatpuffer med pH 7,5, 0,01 ■m/acetonitril

likrosolv = 9/1

Retensjonstiden for a-L-aspartyl-L-fenylalanin metylester: 5,2 min.

Utbytte av a-L-aspartyl-L-fenylalanin metylester er 10,55

kg (90%) .

Dikloretan og metanol fordampes under vakuum, 50 1 vann tilsettes og pH justeres til 5,2 som er det isoelektriske punkt,for utfelling av aspartam. Etter kjøling med saltvann til - 5°C i 10 t sentrifugeres aspartam og vaskes. Etter tørking ved 45°C i en luftstrøm, får man 9 kg aspartam med

de følgende kvalitative data. '

Styrke (HPLC): 99,3 tørt

Substituert diketcpiparasin (2-benzyl-3,6-diketo-5-piperasiny1-eddikksyré): 0,5%

N-L-a-as<p>art<y>l-L-fen<y>lalanin (demetylert aspartam: 0,1%.)'

Moderluten som inneholder ca. 1,5 kg aspartam tilbakeføres under den'etterfølgende opparbeiding hvilket muliggjør en nesten fullstendig kvantitativ gjenvinning av produktet aspartam.

To handelsprøver av forskjellig opprinnelse hadde de følgende analytiske data.

Vareprøve "A" Titrervæske (HPLC) 98,4%; "diketopiperasin,

0,7%; demetylert aspartam 2,1%; .

Vareprøve "B": Titrervæske (HPLC) 97,0%: "diketopiperasin",

2,4 7%, demetylert aspartam 0,45%.

På det endelige produkt var analysebetingelser for HPLC som j følger:!

Kolonne: Likrosorb RP^g/10 pm, lengde 25 cm, inrivendig

diameter 4 mm.

Eluent: Fosfat puffer pH 4 i metanol:

60/40 pr. styrke aspartam; 75-25 for bestemmelse av urenheter; 2 ml/min.

Indikator: UV ved 210 nm.

Retensjonstid: Aspartam: 12,8 min. (3,6 min. i styrkebestemmelsen) •

Substituert diketopiperasin: 5,1 min.

Demetylert aspartam: 3,3 min.

Claims (9)

1. <!>1. Fremgangsmåte ved fjerning av formylgruppen i en forbindelse som er et N-formulert peptid eller en ester; av et N-formulert peptid, karakterisert ved at man omsetter denne forbindelse med hydrasin eller et.sub-! stituert hydrasin med formel I:

   ■ hvor R er en mettet eller umettet, rettkjedet eller forgrenet., substituert eller usubstituert alkylgruppe med 1-5 karbonatomer, eller substituert eller usubstituert cykloalkyl eller substituert eller usubstituert aryl eller en aminogruppe med en pH mellom 1 og. 3,5, mens pH holdes konstant under reaksjonen og det N-deformylerte peptid isoleres fra reaksjonsblandingen.
2. 2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at pH holdes konstant på 1 - 3,5. under reaksjonen ved tilsetning av en uorganisk syre eller en puffer.
3. 3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakter i-, sertvedat hydrasinet eller forbindelsen med formel I brukes i forholdet 1-5 mol per mol av peptidet eller esteren av N-formylert peptid.
4. 4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at forbindelsen med formel I velges fra gruppen acetylhydrasid, benzoylhydrasid, "Girard T" og semikarbasid.
5. 5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at temperaturen under reaksjonen holdes .mellom 20 og 15 0°C. - '
6. 6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved . at reaksjonen utføres i et løsningsmiddel inneholdende en alkohol med 1-5 karbonatomer.
7. 7. ' Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at alkoholen tilsettes vann.
8. 8. Fremgangsmåte ifølge krav 6 eller 7, karakterisert ved at man velger løsnings-midlet fra gruppen ketoner, dimetylformamid,.dimetylsulfok-syd, acetonitril, alifatisk estere, hydrokarboner, klorerte hydrokarboner og blandinger derav.
9. 9. Fremgangsmåte ifølge, krav 1, karakterisert ved at man som forbindelse velger N-formyl-a-L-fenylalanin metylester og nevnte N-deformylerte forbindel-, se er aspartam.