NL8201821A

NL8201821A - Werkwijze voor het verwijderen van de formylgroep van n-formylpeptiden en esters daarvan.

Info

Publication number: NL8201821A
Application number: NL8201821A
Authority: NL
Original assignee: Pierrel Spa
Priority date: 1981-05-13
Filing date: 1982-05-03
Publication date: 1982-12-01
Also published as: IT1194795B; DE3216512C2; ES511760A0; PT74892B; CH648566A5; CA1244406A; GB2098220A; GR75497B; NO821585L; NZ200583A; ES8302633A1; JPS5810546A; SE8202787L; FR2505829A1; IT8121674A0; FR2505829B1; DK208082A; IT8121674A1; JPS616080B2; GB2098220B

Description

«. ft • c TO 3328

Werkwijze voor het verwijderen van de formylgroep van If-formylpeptiden en esters daarvan.

De uitvinding betreft peptiden en meer in het bijzonder de verwijdering van de formylgroep van peptiden of hun N-formyl-esters met behulp van hydrazine of bydrazinederivaten onder specifieke pH-voor-waarden.

5 Het is in de chemische literatuur bekend, dat de aminogroep van aminozuren kan worden geblokkeerd met behulp van een formylrest om de aminogroep tijdens de peptidesynthesen te beschermen. Aan het eind van de werkwijze is het natuurlijk nodig de aminogroep weer vrij te stellen door een verwijdering van de formylgroep. Terwijl de eerste 10 trap van deze werkwijze, de fonnylering, gemakkelijk kan worden uitgevoerd, zijn de resultaten bij de laatste trap, de deformylering met behulp van gebruikelijke methoden, niet even bevredigend. Hoewel de voorwaarden die gewoonlijk bij de deformylering worden toegepast meestal vrij eenvoudig zijn, zijn de verkregen resultaten vaak teleur-15 stellend omdat veranderingen in het peptidemolecuul, die vaak niet te verwaarlozen zijn, kunnen optreden, welke veranderingen soms zelfs de peptidebindingen betreffen. Dit gebeurt, wanneer men onder de gebruikelijke deformyleringsvoorwaarden werkt, d.w.z. in een oplossing van water en alcohol, welke alcohol gewoonlijk 1-5 koolstofatomen telt, 20 en bij aanwezigheid van sterke zuren, zoals zoutzuur, zwavelzuur, salpeterzuur, p-tolueensulfonzuur of trifluorazijnzuur.

De boven aangeduide veranderingen in de chemische structuur zijn zelfs nog duidelijker, wanneer in plaats van een geformyleerd peptide een geformyleerd en veresterd peptide wordt behandeld, omdat bo-25 ven en behalve de boven weergegeven moeilijkheden vaak ook een hydrolyse van de estergroep optreedt en wel in een mate die beslist niet te verwaarlozen is, waarna het produkt het overeenkomstige diketopipera-zine is.

Een uitgebreide bibliografie over de deformylering van peptiden 30 wordt gevonden in: Zehra, A., Ber. 23, 3625 (1890); Hillmann-Elies, A., 8201821 -2- \ - ί 1 \

Eaturforseh., 6 B, 3^0 (1951); Waley, S.G., Cheat. Ind., 1953, 107; Boissonnas, R.A., Helv. Chim. Acta, 36, 875 (1953); Sheehan, J.C., J. Am. Chem. Soc. 80, 115^ (1958); verdere gedetailleerde heschrijvingen worden gevonden in de klassieke literatuur omtrent peptiden, zoals 5 J.Greenstein: Chem. of Am. Acids, II, 12½, U6, U7 . Dezelfde auteurs hebben deformyleringen in een zuur milieu onderzocht.

Meer recent hebben andere onderzoekers gewerkt onder andere voorwaarden en betere resultaten verkregen onder toepassing van andere deforrayleringsmiddelen, zoals acetylchloride of hydroxylamine dan wel 10 hydrazine. Deze auteurs hebben echter aangegeven dat dit laatste ongeschikt is voor een deformylering van esters, omdat het leidt tot de vorming van de overeenkomstige hydrazinederivaten. (Lefrancier, Buil. Soc. Chim. Prance 1965, 3668; en Brits octrooischrift Ι.Ι82Λ50.)

Verdere onderzoekers hebben peptiden of esters van peptiden 15 gedeformyleerd door een oxydatie met ÏÏ^Og-(Losse, Am. Chem. i960, 636, lUO) of door een hydrogenolyse (Losse, J. Prakt. Chem. I96U, 2k, 118).

Het belang van een N-deformylering van peptiden of hun ïï-geformy-leerde esters is ook duidelijk van technisch standpunt gezien. Een voorbeeld van een stof met technisch belang met een peptidestructuur 20 en duidelijke zoetmakende eigenschappen is oC-L-aspartyl-L-f enylalanine-methylester, meer békend als "aspartam".

Deze stof is volgens diverse methoden bereid door toepassing van nagenoeg alle klassieke methoden die gebruikt worden voor het bereiden van peptiden, en speciaal door een blokkade van de aminogroep 25 van asparaginezuur gevolgd door een activering van zijn öC-carboxyl-groep in de vorm van een actieve ester of anhydride, gevolgd door een reactie of een condensatie met fenylalaninemethylester en een verwijdering van de groep die de aminogroep in het verkregen veresterde peptide blokkeert.

30 De technische bereidingsmethoden voor de bereiding van o^-L-as- partyl-L-fenylalaninemethylester zijn op ernstige praktische moeilijkheden gestuit bij een selectie van het toe te passen procédé, alsmede het feit dat bij diverse methoden giftige stoffen tepas komen, zoals fosgeen of stoffen die moeilijk zijn te hanteren, zoals carbobenzoxy-35 chloride. Een verdere moeilijkheid is dat de methoden het gewenste pro- 8201821 • * · Λ r * - 3 - dükt in uitgesproken lage opbrengsten opleveren»

Het technische procédé dat aspartam relatief gemakkelijk lijkt op te leveren omvat een condensatie van het anhydride van N-foirayl-L- asparaginezuur met L-fenylalaninemethylester en een daaropvolgende H- 5 deformylering van N-formyl-c^-L-aspartyl-L-fenylalaninemethylester.

Deze N-deformylering wordt uitgevoerd bij aanwezigheid van een specifiek oplosmiddel en sterke anorganische zuren (Duits Offenlegungsschrift 2.635*9^8) of met hydrozylamine (Duits Offenlegungsschrift 2.55^.^21} of door verhitting bij aanwezigheid van water (Japans Kokai 76.39*602) 10 of met zoutzuur in methanol volgens Duits Offenlegungsschrift 2.256.055*

De in deze publikaties weergegeven methoden hebben diverse nadelen, die - over het algemeen bij de reactie van de deformylering wanandere N-ge-. '*; optreden --- alleen bij formyleerde peptiden /dan wel/de-r&pectieve esters » Vooral bestaat dit nadeel in de lage opbrengsten die bij de laatste trappen van de synthe-.· 15 se worden bereikt en het feit dat de tussennrodukten vrij duur zijn. Bovendien gaan lage opbrengsten gepaard met veel onzuiverheden in de eindprodukten, welke dus verder moeten worden gezuiverd, hetgeen de produktiekosten verhoogt.

Er werd nu verrassenderwijze gevonden, dat de verwijdering van 20 de U-formylgroep bij peptiden of hun esters op een eenvoudige wijze kan worden uitgevoerd en met verrassend verbeterde opbrengsten, door de formylgroep bij aanwezigheid van hydrazine of hydrazinederivaten bij een pH tussen 1 en 3»5 te verwijderen. Dit ρΞ-traject is doorslaggevend voor het effect.

25 De uitvinding betreft dus een werkwijze voor het verwijderen van de fornylgroep van N-geformyleerde peptiden, of hun esters en' in het bijzonder 'hóórdeverwijdering van deze groep van de methylester van JT-for-myl-nc-L-aspartyl-L-fenylalanine met behulp van hydrazine of hydrazinederivaten met de formule 30 H - C - UH - M0 0 waarbij R een alkylgroep met 1-5 koolstof atomen voorstelt, die verzadigd of onverzadigd, recht of vertakt^dan wel een cycloalkylgroep of een arylgroep is, welke groep ook kan zijn gesubstitueerd door andere 35 functionele groepen of een aminogroep, indisn deze reactie wordt uitge- 8201821 • - k - voerd tij een pH tussen 1 en 3,5*

Bij de onderhavige werkwijze moet de pH dus tussen 1 en 3,5 zijn gelegen. Indien men de reactie uitvoert met zuren bij afwezigheid van hydrazine of hydrazinederivaten, dan blijkt dat bij uitvoering van 5 de reactie bij een pH beneden t na 1 uur bij 60°C het fornylesteruit-gangsmateriaal weliswaar volledig is verdwenen, maar slechts een gerin- ï - » ge opbrengst van ca. 15# aan gedeformyleerd produkt wordt verkregen.

Met behulp van DLC (dunnelaagchromatografie) kan worden aangetoond, dat een hoog percentage van het produkt de vorm heeft van een diketo-10 piperazine.'

Indien men anderzijds de reactie bij een pH boven 3,5 uitvoert, treedt weinig deforraylering op» zelfs wanneer de reactie een lange*tijd duurt. Het pH-traject waarbinnen de reactie moet worden uitgevoerd, moet dus tijdens het verloop van de reactie worden gehandhaafd omdat 15 wanneer een base vrijkomt de pH de neiging heeft op te lopen. Deze pH-regeling kan worden uitgevoerd door geleidelijk aan het reactiemengsel een oplossing van een anorganisch zuur, b.v. een 10#’s zoutzuur, zwavelzuur of p-tolueensulfonzuur-qplossing toe te voegen.

Het is ook mogelijk met passend gebufferde oplossingen te werken. 20 Hierboven is reeds gezegd dat andere onderzoekers hebben vermeld dat hydrazine ongeschikt is voor een deformylering van N-geformyleerde peptide-esters vanwege de mogelijke vorming van overeenkomstige hydra-ziden (zie Lefrancier). Er werd nu evenwel verrassenderwijze gevonden, dat dit nadeel minimaal is wanneer men de onderhavige reactie bij een 25 pH tussen 1 en 3,5 uitvoert. Afhankelijk van de experimentele voorwaarden kan de hoeveelheid hydrazine variëren van 1-3 mol op. elk mol peptide of peptide-ester, terwijl het oplosmiddel methanol, een mengsel van methanol en water of andere oplosmiddelen is, waarbij de structuur en de hoeveelheid van deze oplosmiddelen zelf van ondergeschikt belang 30 is. In ieder geval moet voor een bevredigende uitvoering van de reactie de pH aanvankelijk tussen 1 en 3,5 worden gekozen en deze pH gedurende de gehele reactie worden gehandhaafd, waarbij liefst een temperatuur van 20 - 100°C wordt aangehouden, welke temperatuur afhankelijk van de duur van de reactie kan wisselen. Het toegepaste zuur kan een sterk 35 anorganisch zuur zijn, zoals zoutzuur, zwavelzuur of salpeterzuur maar 8201821 -5-.

9 j p-tolueensulfonzuur ka5^?orden gebruikt.

Gevonden is dat de N-deformylering met verbeterde opbrengsten verloopt^indien de reactie wordt uitgevoerd bij aanwezigheid van een • verbinding met de formule 5 n B - C - NH - HHg waarin R de boven weergegeven betekenis bezit. De reactie zelf verloopt onder zeer geringe veranderingen en met goede opbrengsten tussen 75 en 90% en zelfs hoger, afhankelijk van de gebruikte stof, zeer vlot. Waar- ' 10 genomen is, dat de activiteit van de verbinding met de formule r 0 - R - C - HH - HHg ah defoimyleringsmiddel duidelijk hoger is lij acetylhydrazine, hetgeen de eenvoudigste stof is, benzoylhydrazine, trimethylaminoacetylhydrazi-15 dechloride, gewoonlijk aangeduid als "Girard T", dat meer complex is - en verdere functionele groepen bevat, alsmede semicarbazide.

In verband, met de experimentele voorwaarden ligt de' hoeveelheid defomyleringsmiddel tussen 1 en 5 ntol op 1 mol peptide of ester daarvan; het is mogelijk grotere hoeveelheden reagens te gebruiken, maar 20 dit heeft geen verdere voordelen.

Het oplosmiddel is liefst methanol of mengsel van methanol en water bij de peptiden, maar bij de peptide-esters is dit -bij voorkeur dezelfde alcohol als waarmee de ester van het peptide is gevormd. Zelfs hier is de structuur van het oplosmiddel niet doorslaggevend, zodat het 25 ook mogelijk. is een andere alcohol te gebruiken met een aantal koolstof-atomen tussen 2 en 5. dan wel andere onlosmiddelen^ die in water oplos-. baar zijn, zoals dioxan, aceton, acetonitrile en dimethylformamide.

Het is ook mogelijk andere oplosmiddelen toe te passen, die niet in water oplosbaar zijn, zoals koolwaterstoffen, gechloreerde koolwater- 30 stoffen, ethers, ketonen, esters of mengsels van deze oplosmiddelen.

Al deze oplosmiddelen kunnen worden toegepast bij aanwezigheid of afwezigheid van water en in sommige gevallen is dus een enkele fase aanwezig terwijl in andere gevallen ook twee fasen kunnen optreden. De reactie-temperatuur is niet doorslaggevend omdat de temperatuur alleen de reac-35 tieduur beïnvloedt. Liefst zal de temperatuur zijn gelegen tussen 20 en 8201821 * - \ \ _ - \ - 6 - 150°C, afhankelijk van het gebruikte oplosmiddel waarbij de reactieduur kan variëren van 30 minuten tot 30 uren afhankelijk van deze temperatuur* De volgende -voobeSden lichten de onderhavige werkwijze onder verschillende experimentele voorwaarden nader toe zonder de uitvinding 5 daartoe -te beperken. Het verloop van de reactie is over het algemeen zeer goed met dunnelaagchrcmatografie te volgen, waarbij bovendien de geringe· wijzigingen in de chemische structuur die tijdens het verloop van de reactie optre^ëh» duidelijk wordt. In feite is het mogelijk duidelijk waar te nemen dat naast het gedeformyleerde produkt slechts ge-10 ringe hoeveelheden'diketopiperazine" worden gevormd. Deze verbinding, met name het 2-benzyl-3,6-'diketo-5-piperazinylazijnzuur is in handels-aspartam gewoonlijk in 'een hoeveelheid van 2$ aanwezig en de Food and Drug Administration schrijft dan ook een maximale grens van 2$ voor deze stof in aspartam voor. Bij de proeven op de zuiverheid van aspartam, 15 verkregen volgens de uitvinding, welke proeven met hogedrukvloeistof- chromatografie zijn uitgevoerd, is deze verontreiniging, het gesubstitueerde diketopiperazine, nooit in hoeveelheden boven 0,6 - 0,7$ gevonden.

f

Een overeenkomstige verbetering in verband met commerciële preparaten is bereikt bij een verdere gewoonlijk in aspartam gevonden onzuiverheid 20 t.w. c^-aspartyl-fenylalanine, dat in handelsmonsters van aspartam gewoonlijk in een hoeveelheid van ca. 1$ aanwezig is, terwijl dit in het ' onderhavige produkt nooit meer dan 0,3$ is. De kwantitatieve beoordeling van het reactieprodukt is uitgevoerd met gas-vloeistof-chromatogra-fie.

25 Voorbeeld I

3,2 g (IQ mmol) N-fonnyl--L-aspartyl-L-fenylalaninemethyl- . 3 3 ester werd opgelost m 32 cm methanol. Toegevoegd werd 3,2 cm water

O

waarna de pH met 0,5 cm 3 $’s zoutzuur op 2 werd gebracht. De oplossing werd vervolgens op 70°C verwarmd en deze temperatuur 10 uren ge-30 handhaafd .terwijl de pH continu met 3$’s zoutzuur zo werd geregeld, dat*deze pH binnen het traject 1,5 - 3,0 bleef.

DLC-controle {elueermiddel: methylethylketon/azijnzuur/pyridine/water, 32-4-2-6).

Ninhydrine-indicator: 35 een grote vlek Rf 0,35 (aspartam)' 8201821 » * - 7 - een vlek Rf 0,1 (gedeformyleerd en gedemethyleerd peptide) een niet geïdentificeerde vlek Rf 0,9 GLC-analyse: oC-L-aspartyl-L-f enylalaninemethylest er: 1,91 g 5 (opbrengst 65%)·

Voorbeeld II

3,2. g H-formyl-oC-L-aspartyl-L-fenylalaninemethylester werd op- !

O

gelost in 32 cm methanol. Gescheiden hiervan werd een oplossing van 1.5 g hydrazinemonohydraat (30 mmol) in 5 cnr water opgelost en de pH 10 mét 15%'s zoutzuur op 1,5 gebracht. Deze oplossing werd aan de eerste oplossing toegevoegd en de pH met 15#’s zoutzuur op 1,5 gebracht. Deze oplossing werd op 70° C -verwarmd en deze temperatuur 7,5 uren gehandhaafd, terwijl de pH steeds tussen 1,5 en 3,5 werd gehouden door een toevoeging van 15%'s zoutzuur.

15 ' GLC-analyse: oC-L-aspartyl-L-fenylalaninemethylester: 2 g (opbrengst 70#)·

Voorbeeld III

3.2 g I-fonnyl-oC-L-aspartyl-L-fenylalaninemethylester werd op- 3 · 3 gelost in 32 cm methanol. Toegevoegd werd 3,2 cnr water en 2,2 g ace-20 tylhydrazine (30 mmol). De pH werd hierna met 10#’s zoutzuur op 2,5 gebracht en het mengsel 6 uren op 70°C verwarmd» waarbij de pH tussen 1.5 en 3,5 werd gehouden.

* / DLC-controle (elueermiddel: methylethylketon/azijnzuur/pyridine/water 32-4-2-6) 25 ïïinhydrine-indicator: 1 vlek Rf 0,35 (aspartam) 1 zeer zwakke vlek Rf 0,1 (gedeformyleerd en gedemethyleerd pep tide) GLC-analyse: c£-L-aspartyl-L-fenylalanine-methylester 2,65 g 30 (opbrengst 90%).

Voorbeeld IV

3.2 g IT-foniQrl-<3C-L-aspartyl-L-fenylalaninemethylester werd op- 3 3 gelost m 32 cm methanol waarna 3,2 cm water en 5 g Girard T reagens werden toegevoegd.(30 mmol). De pH werd vervolgens met 10#ls zoutzuur 35 op 2,5 gebracht waarna het mengsel op 70°C werd verwarmd en deze tempe- 8201821 - 8 - \

V

'Λ ratuur 7 uren werd gehandhaafd, waarbij de pH tussen 1,5 en 3,5 werd gehouden DLC-controle (elueermiddel: methylethylketon/azijnzuur/pyridine/water / ; 32-1μ-2-β)· 5 Hinhydrine-indi cator: 1 vlek Ef = 0,35 (aspartam) t · 1 zwakke vlek Ef = 0 ,l( gedefornyleerd en gedemethyleerd pep- ·-·.. tide) GLC-analyse: οζ-L-aspartyl-L-fenylalaninemèthylester 2,2g 10 (opbrengst 76%).

Voorbeeld Y

3.2 g (10 mmol) N-formyl-oC-L-aspartyl-L-fenylalaninemethyl- 3 ester werd opgelost in 32 cm methanol en 3,2 mmol water alsmede 3,33 g semicarbazidehydrochloride (30 mmol) toegevoegd. De pE was 2 en men 15 behoefde deze pH niet verder te corrigeren. Het mengsel werd op 70°C gebracht en deze temperatuur 8 uren gehandhaafd, waarbij de pH tussen 1,5 en 3,5 werd gehouden.

GLC-analyse: °C-L-aspartyl-L-fenylalaninemethylester: 2,k g (opbrengst 83$).

20 Voorbeeld VI

3.2 g H-fornyl-oC-L-aspartyl-L-fenylalaninemethylester werd op- q q gelost in 32 cm*3 methanol. Toegevoegd werden 3,2 cur water en k g ben-zoylhydrazide (30 mmol). De pH werd op 1,5 - 3,5 gebracht, de oplossing op 70°C verwarmd en deze temperatuur 4 uren gehandhaafd, waarbij 25 de pH binnen het weergegeven traject werd gehouden. Het materiaal werd ónder vacuum bij een temperatuur beneden k0°C drooggedampt, 10 cm^ water toegevoegd, de pH op het isoëlektrisch ptint van 5,2 gebracht, op 0°C afgekoeld en onder afzuigen gefiltreerd. Verkregen werd 2,5 g aspartam dat analytisch zuiver was (opbrengst 85,k$).

30 Voorbeeld Vil 12,825 kg H-formyl-dÉ-L-aspartyl-L-fenylalaninemethylester werd opgelost in 30 dm dichloorethaan waaraan 10 dm ijsazijn, 10 dm methanol en ik kg acetylhydrazine waren toegevoegd. De temperatuur werd op 6k°C gebracht en de pH met geconcentreerd zoutzuur op 2,2 - 2,3 ge-35 bracht. De oplossing werd op 6k°C verwarmd terwijl de pH continu tussen 8201821 « , -9-- 2.2 en 2,3 werd gehouden. Onder deze voorwaarden verliep de deformyle—

, O

ringsreactie volledig in 5 uren. Het. uiteindelijke volume was 80 dm .

De reaetieoplossing werd met hogedrukvloeistofchromatografie geanaly-seerd. Gehalte aan οζ -L-aspartyl-L-fenylalaninemethyles t er: 132 mg/cm. 5 De analytische, voorwaarden luiden als volgt:

Kolom: ' RPg 10 micron, temperatuur van de kolom k5°C, doorstroomsnelheid 2 cm^/min.met UV van 215 nm als indicator.

Elueermiddel: fosfaatbuffer met pH 7,5, 0,01 M/acetonitrile 10 ’ lichrosolv * 9/1

De retentietijd voor oC-L-aspartyl-L-fenylalaninemèthy lester bedroeg 5.2 min.

Opbrengst aan ^C-L-aspartyl-L-fenylalaninemethylester: 10,55 hg of 90#. Dichloorethaan en methanol werden onder vacuum verdreven, 50 dm 15 water toegevoegd en de pH op 5,2 gebracht, het isoëlektrisch punt voor het neerslaan van aspartam. Ha koelen met pekel gedurende 10 uren op -5°C werd het neergeslagen aspartam afgecentrifugeerd en goed gewassen. Ha drogen bij k5°C in een luchtstroom werd 9 hg aspartam met de volgende cijfers verhregen: 20 titel (hogedrukvloeistofchromatografisch): 99,3 droog gesubstitueerd diketopiperazine (2-benzyl-3,6-diketo-5-*piperazinyl-azijnzuur): 0,5# N-L-o<-aspartyl-L-fenylalanine (gedemethyleerd aspartam): 0,1#.

De moederloog met daarin nog 1,5 hg aspartam werd bij een volgen-25 de charge opnieuw gébruikt, waardoor het aspartam praktisch kwantitatief wordt gewonnen.

Twee handelsmonsters van verschillende herkomst vertoonden de volgende analytische cijfers: monster "A" titer (HPLC) 98,k#; diketopiperazine 0,7#, gedemethy-30 leerd aspartam 2,1# monster "B" titer (HPLC) 97,0#; diketopiperazine 2,7k#; gedemethyleerd aspartam 0,k5#.

Bij het eindprodukt waren de analytische voorwaarden van de HPLC als volgt: 35 kolom: lichrosorb EP^, 10 micron, lengte 25 cm, inwendige 820 1 82 1 .......... · .............

- 10 - i- m .....

* diameter ^ mm elueermiddel: fosfaatbuff er met pH U in methanol: 60/U0 per titer aspart am; 75 - 25 voor de bepaling van onzuiverheden

O

doorstroomsnelheid: 2 cnr/min . 5 . indicator: UV van 210 nm.

retentietijd:· ’· · aspart am: 12,8 minuten (3,6 minuten bij de bepaling van de ti ter) gesubstitueerd diketopiperazine: 5,1 minuten 10 gedemethyleerd aspart am: 3,3 minuten.

0.

8201821

Claims

5 R - C - NH - NH0 IT 0 waarin R een al of niet verzadigde, rechte of vertakte, gesubstitueerde of ongesubstitueerde alkylgroep met 1 - 5 koolstof atomen, een gesubstitueerde of ongesubstitueerde cycloalkyl- of gesubstitueerde of onge-10 substitueerde aryl^dan wel een aminogroep voorstelt en wel bij, een pH tussen 1 en 3,5» waarbij de pH tijdens de reactie constant wordt gehouden, en men het gevormde W-gedeformyleerde peptide uit het reactiemeng-'sel wint.
2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de pH con-15 stant op 1 - 3,5 wordt gehouden door tijdens de reactie een anorganisch zuur of een buffer toe te voegen.
3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het hydrazine of hydrazide wordt toegepast in een hoeveelheid van 1 - 5 mol per mol peptide of peptide-ester.
20 Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat als hydrazi— de acetylhydrazide, benzoylhydrazide, Girard T of een semicarbazide wordt toegepast.
5. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de temperatuur tijdens de reactie tussen 20 en 150°C wordt gehouden 25 6. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de reactie wordt uitgevoerd in een oplosmiddel in de vorm van een alcohol met 1-5 koolstofatomen.
7. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat aan deze alcohol water wordt toegevoegd.
8. Werkwijze volgens conclusie 6 of 7, met het kenmerk, dat het op losmiddel wordt gevormd door een keton, dimethylformamide, dimethyl-sulf oxyde, acetonitrile, alifatische esters, koolwaterstoffen, gechlo- 8201821 --------- - 12 - .·* -¾¾¾ ' ->* - * a 'ïd reerde koolwaterstoffen, en mengsels daarvan, i 9· Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij genoemde verbinding N-i Ί myl-öC-L-aspartyl-L-fenylalaninemethylester, en genoemde IT-gedeformy- ,;C;| leerde verbinding aspartam is. · * r*i 1 A . - - i ·· ï * . 4 V;i ·"·? 5 j . -J -i • A - ·; :«i! 5|1 Ifj S2 0 1 82 1