NO821927L - Fremgangsmaate for fremstilling av ren overflate antigen mot hepatitis b, fra plasma fra mennesker - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av rent hepatit B overflateantigen (HBsAg) fra humanplasma. HBsAg er et viralprotein som opptrer i blodet hos folk som lider av infeksiøs hepatit, type B, eller som stadig er tilstede i blodet fra bærere av hepatit B-virus. HBsAg utgjør ved rensing fra det gjenværende plasmaprotein

en vaksine for infeksiøs hepatit B som ved inngivelse til mennesker eller dyr forårsaker fremstilling av HB<1>s antilegemer i pasientens organisme. Nevnte antilegemer beskytter organismen fra full infeksjon forårsaket av infeksiøstaktive partikler av hepatit B-virus.

Det er en kjent fremgangsmåte for fremstilling av rent HBsAg ved flere gangers sentrifugering av egnet prepa-rert plasma i densitetsgradienter, oppnådd fra sakkarose eller caesiumklorid. I fremgangsmåten for separering ved densitetsgradient ved ultrasentrifugering, dvs. ved sentrifugering med høye hastigheter, kan preparater av HBsAg oppnås fritt for gjenværende plasmaproteiner. Ultrasentrifuge-ringsmetoden er en meget tidkrevende metode, den krever tall-rike, kostbare apparaturer som benyttes for å oppnå små mengder av antigen kun for forskningsformål. Således er dette en laboratoriemetode, men ikke en produksjonsprosedyre. I denne metode er det ikke mulig å oppnå en større mengde materiale som er nødvendig for immunisering ved vaksine selv for en relativt liten gruppe personer.

Videre er de t kjent andre met oder for fre mstilling

av HBsAg som består i filtrering på gelpakkede kolonner, ved affinitetskromatografi, og ved elektroforese. Alle kjente metoder tillater ikke å oppnå antigen-preparater som helt er renset, de har alle laboratoriekarakter og er lite produktive.

Ifølge oppfinnelsen består fremgangsmåten for fremstilling av rent HBsAg i at det opprinnelige materiale befris for lipider og partielt fra humanplasmaproteiner, underkastes en fermentering med pepsin i en mengde av 0,01-0,50 mg/mg protein, fortrinnsvis 0,05 mg/mg protein, filtreres av på molekylfilter som tillater å slippe gjennom molekyler på opptil 100 000 Dalton i et fosfatbufret medium, opptil en pH- verdi på 7,1-7,3, mens infeksjonsevnen deretter desaktiveres ved hjelp av formaldehyd, fortrinnsvis i en andel på 1 : 2000 på volumbasis, i 96 timer.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen gir i motsetning til kjente metoder HBsAg som helt er befridd for plasmaproteiner. Nevnte antigen forårsaker når det benyttes som vaksine for infeksiøs hepatit, type B, noen sidevirkninger på pasienter som vaksineres. Videre kan fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen benyttes i større produksjon av vaksine fra plasma som inneholder hepatit B-virusprotein.

Fremstillingen av renset hepatit B overflateantigen ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen skjer som følger.

I den første fase gjennomføres delipidisering av humanplasma. For dette gis 1000 ml plasma oppnådd fra donorer av HBsAg med en titer som bestemt ved immunoelektroosmo-utfelling (IEOP) på minst 1 : 10 en tilsetning på 1000 ml 0,1 mol MnCl2. 4 H20.

Etter tilsetning av manganklorid omrøres dette plasma i en elektromagnetisk rører ved isbadtemperatur i 1 time. Deretter sentrifugeres materialet i 30 minutter med en hastighet på 6000 omdreininger pr. minutt. Etter sentrifugering blir presipitatet som ikke inneholder HBsAg kastet.

Den overstående væske som oppnås etter sentrifugering bringes til en pH-verdi på 5,6 ved bruk av 0,1 1 HCl og poly-etylenglykol 6000 (PEG 6000) tilsettes i en mengde på 75 g pr. 1000 ml materiale. Deretter underkastes materialet om-røring i ca. 12 timer ved en temperatur på 4°C i en elektromagnetisk rører. Materialet blir etterat det er helt ut fra røreren, sentrifugert i 30 minutter med en hastighet på 6000 omdreininger pr. minutt. Overstående væske som ikke inneholder antigen kasseres, og for videre bearbeiding samles sedimentet, oppnådd fra sentrifugeringen.

♦ Dette sediment oppløses i 200 ml 0,9 NaCl,og oppløs-ningen fylles opp med avionisert vann til det volum materialet hadde før sentrifugering. Etter tilsetning av NaCl opptrer det påny bunnfelling i oppløsningen. Denne oppløsning underkastes ytterligere en gang sentrifugering i 30 minutter

med en hastighet på 6000 omdreininger pr. minutt. Etter sentrifugering samles den overstående væske inneholdende HBs-antigen, sedimentet som ikke inneholder dette kasseres. Ved tilsetning av deionisert vann økes volumet av overstående væske til 10 000 ml. En liten mengde sediment som for-blir etter fortynning fjernes ved hjelp av sentrifugering i 30 minutter med en hastighet på 6000 omdreininger pr. minutt. Ved det ytterligere trinn i antigen-fremstillingsprosessen benyttes den overstående væske som oppnås ved sentrifugeringen.

Materialet som fremstilles ved delipidiseringen underkastes nu en fermentering med et enzym. For dette opp-varmes 10 000 ml av materialet til en temperatur på ca. 37°C, mens pH-verdien standardiseres til 2,5 ved hjelp av tilsetning av 1N HC1. Til materialet som fremstilles på denne-måte tilsettes pepsin Sigma som gjentatte ganger er krystallisert,

i mengder på ca. 0,05 mg pr. 1 mg proteinoppløsning. Inn-holdet av proteiner i oppløsningen bestemmes etter den spek-trofotometriske metode. Etter en tid på ca. 1 time avbrytes fermenteringen med pepsin ved standardisering av oppløsningen til en pH-verdi på 4,6 ved hjelp av 1N NaOH. Etter ferdig fermentering sentrifugeres oppløsningen av i 30 minutter med en hastighet på 6000 omdreininger pr. minutt. I sedimentet etter sentrifugeringen påvises intet HBsAg, således at alt er overført til den overstående væske.

Fermenteringen med pepsin forårsaker en nedbrytning

av humanplasmaproteiner til polypeptidenheter med en størrel-se på ikke over 30 000 Dalton. HBsAg-proteinet underkastes imidlertid ikke fermentering.

Nu skjer en rensing av materialet fra plasmaproteiner fermentert med pepsin ved hjelp av molekylfiltrering på filteret som slipper gjennom partikler med størrelse opptil 100 000 Dalton. Til dette kan det benyttes et filtrerings-system med lukket krets, fremstilt av AMICON Company i USA, hvori materialet som skal filtreres mange ganger filtreres gjennom filtreringssonen der partikler kasseres fra oppløs-ningen ved hjelp av molekylfiltere med en størrelse mindre enn filtreringsgrensen. Ifølge oppfinnelsen benyttes det en filtrering gjennom filteret av typen H 1 x 100 som slipper gjennom partikler med størrelse opptil 100 000 Dalton. Den hele filtreringscyklus omfatter ni ganger pumping av materialet i et volum på 80 liter under et trykk på 6,2 atmosfærer. Før materialet tilføres til filtreringssystemet fortynnes

det til det ovenfor spesifiserte volum ved hjelp av et fosfatbufret, deionisert, apyrogent vann. Et slikt vann kan fremstilles i en apparatur fra ELGA Company, Storbritannia.

Under filtreringen skjer det en total utvasking av plasmaproteiner som tidligere er fermentert med pepsin. Materialet som oppnås ved filtreringssystemet inneholdende renset HBsAg, anbringes i andeler på 10 000 ml hver i et kjøleskap i 96 timer etter tilsetning av formaldehyd i mengde nødvendig til å oppnå en konsentrasjon i oppløsningen på ca. 1 : 2000 på volumbasis. Etter fjerning fra kjøleskapet fjernes formaldehyd fra materialet ved hjelp av dedialysering. Deretter gjennomføres adsorpsjon av HBsAg på aluminiumhydroksyd som tilsettes i en mengde av 1 mg pr. 1 ml oppløsning. Den ferdige vaksine som oppnås på denne måte fylles på ampuller.

Vaksinen som oppnås på den ovenfor beskrevne måte viser ved analyse med henblikk på humanplasmaproteiner etter dobbeltdiffusering i agar ingen utfellingslinjer ved 30 gangers fortykning med plasma av anti-humanproteiner. Nevnte vaksine inneholder altså ikke infeksiøse partikler av hepatit E-virus.

Eksemgel^

Fra en donor av HBsAg samles plasma ved hjelp av plasmaforese. Aktiviteten for HBsAg bestemmes ved hjelp av immunoelektroosmoforese med en titer ikke lavere enn 1 : 16. Dette humanplasma underkastes delipidiseringsprosessen ved tilsetning av, til 1 liter plasma, 1 liter 0,1 M MnCl~. 4 H^ O og 150 000 internasjonale enheter heparin i et volum på 30 ml. Dette materiale inkuberes ved en romtemperatur i en elektromagnetisk rører i et tidsrom på 0,5 timer. Etter at denne tid er forbi blir hele materialet sentrifugert på en Beckman J-6-sentrifuge i en rotor JA-10 med en hastighet på

6000 omdreininger pr. minutt i et tidsrom på 30 minutter.

Det oppnådde sediment, HBsAg (-), kasseres og overstående væske samles i en kolbe med en kapasitet på 2 liter.

Til materialet tilsettes det noe 7,5% PEG-oppløsning med en molekylmasse på 6000. pH-verdien bringes til 5,5 ved hjelp av 1N HC1. Materialet anbringes deretter i et kjøle-skap og inkuberes over natt under kontinuerlig omrøring.

Neste dag filtreres materialet av på Beckman J-6-sentrifugen i rotoren JA-10 ved 6000 omdreininger pr. minutt. Den overstående væske med HBsAg (-) kasseres, sedimentet opp-løses i 200 ml 10,9% NaCl og fylles opp med deionisert vann til et volum på 2 liter. Etter 20-30 minutter opptrer rikelig sediment som fjernes ved sentrifugering på Beckman J-6-sentri-fugen i rotoren JA-10 ved 6000 omdreininger pr. minutt i løpet av 30 minutter. Det oppnådde klarede filtrat viser HBsAg-aktivitet ved bruk av immunoelektroosmoforese med en titer på 1 : 8. Volumet av materialet økes deretter til 10 liter ved hjelp av deionisert vann (2 liter + 8 liter deinonisert vann). Etter 30 minutter observeres en avsetning av små mengder av et sediment som kasseres ved sentrifugering på Beckman J-6-sentrifugen i rotoren JA-10 ved 6000 omdreininger pr. minutt i et tidsrom på 30 minutter. Klaret, overstående væske oppnås hvis titer utgjør ca. 1 : 2 ved immunoelektroosmo-utfellingsprøven.

Til 10 liter overstående væske tilsettes 90 g NaCl, hvorved 0,9% NaCl-oppløsning oppnås.

Materialet som fremstilles på denne måte inkuberes ved en temperatur på 37°C i 12 timer. Etter dette tidsrom settes til væsken med en temperatur på 37°C og en pH-verdi på 2,5, pepsin i en mengde på 0,05 ml/ml, dvs. 0,5 g pepsin pr. 10 liter materiale. Pepsinfermenteringen av oppløsningen gjennomføres i 1 time ved 37°C. Etter 1 time stoppes fermenteringen ved å øke pH-verdien til 3,5 ved hjelp av 0,1 N NaOH.

Det gjenværende sediment sentrifugeres på Beckman J-6-sentrifugen. i JA-10-rotoren ved 6000 omdreininger pr. minutt i 20 minutter og kasseres deretter. Den overstående væske underkastes molekylfiltrering i en apparatur DC 30 fra AMICON

Company ved bruk av hule fiberfiltere H 10 x 100.

Ved molekylfiltreringen oppnås materiale i en mengde på 10 liter og hvis titer ved immunoelektroosmo-utfelling av HBsAg utgjør 1 : 2.

Nevnte materiale viser ved 100 gangers fortykkelse ingen utfellingslinjer ved immunodiffusjonsteknikken på agar ved bruk av animal-plasma: anti-IgG, anti-IgM, anti-IgA, antihumanprotein og plasma-antihumanprotein.

Vaksinering av laboratoriedyr slik som marsvin eller kaniner med et 100 ganger fortykket materiale gir ingen immunologisk respons mot kontaminering av preparatet med proteiner fra humanplasma. Det oppnås kun en utfellingslinje med HBsAg-holdig materiale.

Materialet som ble oppnådd på den beskrevne måte er sterkt immunogent, slik det er prøvet ved vaksine på sjim-panser og ca. et dusin frivillige personer.

I materialet er det ikke påvist noe nærvær av HBcAg, HBeAg og DNA-polymerase ved bruk av tredje-generasjonsprøver.

Claims (3)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av ren hepatit B overflateantigen fra humanplasma omfattende fjerning av lipider og en del av plasmaproteinene/ enzymatisk nedbrytning av gjenværende ballastproteiner og en siste isolering av immunologisk aktive antigenpartikler, karakterisert ved at det opprinnelige materiale som er de-lipidisert og partielt deproteinisert for plasmaproteiner underkastes fermentering med pepsin i en mengde på 0,01-0,50 mg/mg, fortrinnsvis 0,05 mg/mg, hvoretter det filtreres på et molekylfilter som slipper gjennom partikler opp til 100 000 Dalton i et fosfatbufret medium med en pH-verdi på 7,1-7,3, og at infeksjonsevnen inaktiveres med formaldehyd.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at utgangsmaterialet underkastes en fermentering med pepsin i en mengde på 0,05 mg/mg protein.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at antigenet som er renset for plasmaproteiner inaktiviseres med henblikk på infeksjonsevnen med formaldehyd i en mengde på 1 : 2000 vol./vol. i et tidsrom på 96 timer.