PL133476B1 - Method of obtaining pure antigen hba from human serum - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania czystego antygenu HBs z surowicy ludz¬ kiej. Antygen IIBs jest bialkiem wirusowym, które pojawia sie we krwi ludzi chorujacych na wirusowe zapalenie watroby typu B, lub jest stale obecny we krwi u nosicieli wirusa hepa- titls B. Antygen HBs po oczyszczeniu go z pozostalych bialek surowicy stanowi szczepionke przeciw wirusowemu zapaleniu watroby typu B, która po podaniu czlowiekowi lub zwierzeciu powoduje wytworzenie w jego organizmie przeciwcial anty - HBs. Przeciwciala te zabezpie¬ czaja organizm przed zakazeniem pelna, to jest aktywna zakaznie czastka wirusa hepa- titis B.Znany jest sposób otrzymywania antygenu HBs przez kilkakrotne ultrawirowanie odpowied¬ nio spreparowanej surowicy w gradientach gestosci uzyskanych z sacharozy lub chlorku cezu.Metoda ta jednak nie uzyskuje sie antygenu HBs w pelni wolnego od bialek surowicy. Metoda ultrawlrowania jest bardzo pracochlonna oraz wymaga stosowania duzej ilosci kosztownej aparatury i dlatego jest stosowana tylko do otrzymywania niewielkich ilosci antygenu do celów badawczych. Jest to wiec metoda laboratoryjna, a nie produkcyjna.Znane sa ponadto inne sposoby otrzymywania antygenu HBs, w których stosuje sie sacze¬ nie na kolumnach wypelnionych zelem, chromatografie powinowactwa i elektroforeze. Zaden z tych sposobów nie pozwala na uzyskanie calkowicie oczyszczonych preparatów antygenu, a ponadto maja one charakter laboratoryjny i sa malo wydajne.Sposób otrzymywania czystego antygenu HBs z surowicy ludzkiej polega wedlug wynalazku na tym, ze pozbawiony lipidów i czesciowo bialek surowicy ludzkiej material wyjsciowy,za¬ wierajacy nie wiecej niz 1/3 poczatkowej ilosci tych bialek, poddaje sie trawieniu pepsy¬ na w ilosci 0,01 - 0,50 mg pepsyny/mg bialka, korzystnie 0,05 mg pepsyny/mg bialka, od¬ sacza sie na filtrach molekularnych przepuszczajacych czasteczki do 100 000 Daltonów, w srodowisku buforowanym fosforanami do wartosci pH 7,1 - 7,3, oraz inaktywuje sie zakaz- 3 nosó formaldehydem. Korzystnie stosuje sie 1 g formaldehydu na 2000 cm szczepionki przez* okres 96 godzin.2 133 476 Sposób wedlug wynalazku w odróznieniu od znanych sposobów daje antygen llBs calkowicie uwolniony od bialek surowicy. Antygen ten zastosowany jako szczepionka zabezpiecza czlo¬ wieka przed zakazeniem wirusem hepatitis B i nie powoduje niekorzystnych skutków ubocz¬ nych u szczepionego* Ponadto, sposób wedlug wynalazku moze byc zastosowany do seryjnej produkcji szczepionki z surowicy zawierajacej bialko wirusa hepatitis B.Sposób wedlug wynalazku ilustruje nizej podany przyklad.Przyklad, W pierwszym etapie przeprowadza si<^ delipidacje surowicy ludzkiej, W tym celu do 1000 ml surowicy uzyskanej od nosicieli antygenu HBs majacej miano okreslo¬ ne metoda immunoelektroosmoprecypitacji /IEOP/ co najmniej 1:16 dodaje sie 1000 ml 0,1 M MnCl2 • 4H2°* Po dodaDiu chlorku manganu, surowice miesza sie w mieszalniku elek¬ tromagnetycznym w temperaturze lazni lodowej w czasie 1 godziny. Nastepnie material od¬ wirowuje sie przez 30 minut z predkoscia 6000 obr./ciin. Po odwirowaniu odrzuca sie osad nie zawierajacy antygenu HBs, Uzyskany po odwirowaniu supernatant doprowadza si^ do pH 5f6 przy uzyciu 0,1N IIC1 i dodaje sie glikol polietylenowy - 6000 /PEG 6000/ w ilosci 75 g na 1000 ml roztworu.Nastepnie miesza sie przez czas okolo 12 godzin w temperaturze 4 C w mieszalniku elektro¬ magnetycznym. Po wyjeciu z mieszalnika, material odwirowuje sie w wirówce przez 30 minut z predkoscia 6000 obr,/min. Nie zawierajacy antygenu supernatant odrzuca sie a do dalsze¬ go przetwarzania pobiera sie osad otrzymany po odwirowaniu. Osad ten rozpuszcza sie w 200 ml 0,9ft NaCl i uzupelnia sie dejonizowana woda do objetoscia jaka mial material przed wirowaniem. Po dodaniu NaCl pojawia sie ponownie osad w roztworze, Roztwór ten poddaje sie ponownie odwirowaniu przez 30 minut z predkoscia 6000 obr,/min. Po odwirowaniu zbiera sie supernatant zawierajacy antygen llBs, a odrzuca sie nie zawierajacy go osad. Przez do¬ danie wody dejonizowanej zwieksza sie objetosc supernatantu do 10000 ml. Niewielkie ilos¬ ci osadu jaki powstaje po rozcienczeniu usuwa sie przez odwirowanie w czasie 30 minut przy predkosci 6000, obr,/min, W dalszym etapie procesu otrzymywania antygenu wykorzystuje sie supernatant uzyskany po odwirowaniu.Przygotowany w etapie delipidacji material poddaje sie teraz trawieniu enzymem, M tym celu 10000 ml materialu podgrzewa sie do temperatury okolo 37°C i nastawia sie jego pH na wartosc 2,5 przez dodanie IN HC1, Do tak przygotowanego materialu dodaje sie pepsyne Sigma dwukrotnie krystalizowana, w ilosci okolo 0,05 mg na mg bialka roztworu. Zawartosc bialka w roztworze oznaczano uietoda spektrofotometryczna. Po czasie okolo 1 godziny przerywa sie trawienie pepsyna przez doprowadzenie pH roztworu do wartosci 4,6 za pomoca IN NaOH, Po zakonczeniu trawienia roztwór odwirowywuje sie przez 30 minut z predkoscia 6000 obr./mln.W pozostalym po odwirowaniu osadzie nie wykrywa sie antygenu llBs, który w calosci przecho¬ dzi do supernatantu.Trawienie pepsyna powoduje degradacje bialek surowicy ludzkiej na jednostki polipepty- dowe o wielkosci nie przekraczajacej 30 000 Daltonów, Trawieniu nie ulega jednak bialko antygenu HBs, Obecnie nastepuje etap oczyszczenia materialu ze strawionych pepsyna bialek osocza przez odsaczenie molekularne na filtrach przepuszczajacych czastki do wielkosci 100 000 Daltonów, Mozna do tego celu uzyc zamknietego ukladu filtrujacego produkcji firmy Arnieon Company, w ktrórym filtrowany material przepompowywany jest wielokrotnie przez strefe fil¬ trowania, gdzie odprowadzone zostaja z roztworu przez filtry molekularne czastki o wiel¬ kosci mniejszej od wielkosci filtrowania, W sposobie wedlug wynalazku stosuje sie filtr typu H 1 x 100 przepuszczajacy czastki do wielkosci 100 000 Daltonów, Pelny cykl filtro¬ wania obejmuje 9-krotne przepompowanie materialu w objetosci 60 litrów pod cisnieniem 61 782 Pa, Przed wprowadzeniem do ukladu filtrujacego material rozciencza sie do powyz¬ szej objetosci za pomoca buforowanej fosforanami do pH 7,2, dejonizowanej, apirogennej wody. Wode taka mozna wytworzyc w aparacie firmy Elga - Wielka Brytania,133476 3 W czasie filtrowania nastepuje calkowite wyplukanie bialek surowicy strawionych po¬ przednio pepsyna* Uzyskany z ukladu filtrujacego material, zawierajacy oczyszczony anty¬ gen HBs, umieszcza sie w porcjach po 10 000 ml w chlodni na czas 96 godzin po dodaniu 3 formaldehydu w ilosci i g na 2000 cm szczepionki. Fo wyjeciu z chlodni usuwa sie z mate¬ rialu formaldehyd przez oddlalizowanie. Nastepnie przeprowadza sie adsorpcje antygenów HBs na wodorotlenku glinu, który dodaje sie w ilosci 1 mg na i rai roztworu. Otrzymana w ten sposób gotowa szczepionke rozdziela sie do ampulek.Szczepionka otrzymana opisanym wyzej sposobem przy analizie na zawartosc bialek suro¬ wicy ludzkiej metoda podwójnej dyfuzji w agarze nie daje linii precypitacyjnych przy 30- krotnym zageszczeniu z surowica anty-ludzkie bialka. Szczepionka ta nie zawiera takze za¬ kaznych czastek wirusa hepatitis ii.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób otrzymywania czystego antygenu HBs z surowicy ludzkiej, znamienny tym, ze pozbawiony lipidów i czesciowo bialek surowicy material wyjsciowy, zawierajacy nie wiecej niz 1/3 poczatkowej ilosci tych bialek, poddaje sie trawieniu pepsyna w ilosci 0,01 - 0,50 mg pepsyny/mg bialka, odsacza sie na filtrach molekularnych przepuszczajacych czasteczki do 100 000 Daltonów w srodowisku buforowanym fosforanami o wartosci pil 7,1 - 7,3 oraz inaktywuje sie zakaznosc formaldehydem. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny t y m, ze material wyjsciowy poddaje sie trawieniu pepsyna w ilosci 0,05 .mg pepsyny/rag bialka. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny t y ni, ze oczyszczony z bialek suro¬ wicy antygen inaktywuje sie formaldehydem w ilosci 1 g formaldehydu na 2000 cm szcze¬ pionki przez okres 96 godzin* PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Claims (1)

1.