OA10206A - Nouveau procédé de préparation des polynucléostices produits ainsi obtenus et préparations pharmaceutiques en contenant - Google Patents
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Description
010206
La présente invention concerne un procédéamélioré d'obtention des polynucléotides (homo etcopolynucléotides) et des complexes de ces corps ·l'invention concerne également les nouveaux produitsaméliorés obtenus selon ce procédé. Différentspolynucléotides ont déjà été préparés avec les techniquesconnues à ce jour mais, jusqu'ici, les produits que l'onobtenait étaient généralement pyrogènes ou plus ou moinstoxiques à cause de la présence d'impuretés ou de composésapparaissant lors des différentes étapes menant auxproduits recherchés. Ces polynucléotides sont des adjuvantsde différents traitements thérapeutiques et plus particu-lièrement du traitement du cancer, du traitement decertaines maladies bactériennes et virales et aussi pourles vaccins. L'invention concerne enfin des compositionspharmaceutiques contenant ces polynucléotides améliorés àtitre d'ingrédient actif. Généralement, les polynucléotides sont obtenuspa.r la réaction d'une polynucléotide-phosphosrylase sur lenucléotide monomère approprié. Les différents monomèrespossibles, tels que l'ADP, le CDP, le GDP, l'IDP et l'UDP,sont obtenus par des techniques bien connues. Lapolynucléocide-phosphorylase est aussi obtenue par destechniques bien connues, en partant d'une culture debactéries, puis en utilisant un lysat des bactériesobtenues dans ladite culture, suivi de 1'extraction de lapolynucléotide-phosphorylase obtenue par la lyse,, à partird'un milieu complexe où peuvent se trouver différentsenzymes, telles que les kinases, les phosphatases, les - 2 - 010206 nucléases, les diestérases, etc..., composés qui induisentdes réactions venant en concurrence avec celle depolymérisation du nucléotide monomère choisi ou du mélangede nucléotides monomères par la polynuclétotide-phospho- 5 rylase. Le. présence de ces différents enzymes entraîne des réactions parallèles indésirables et une dégradationpartielle du ou des monomère(s) à polymériser ainsi que dupolymère recueilli.
Pour ces raisons, la plupart des polynuciéo- 10 tides ainsi obtenus sont défectueux soit du fait de Leurtoxicité ou de leurs caractéristiques pyrogènes soit àcause des deux à la fois. Bien qu'il soit, possible deprépa.rer une polynucléotide-phosphorvlase suffisammentpure, à une petite échelle, à des fins d'analyse ou pour 15 une expérimentation scientifique limitée, on n'obtient pasfacilement les mêmes résultats avec des techniquesindustrielles, à un coût acceptable
Selon l'invention, on a déterminé qu'il était,possible d'obtenir, dans des conditions industrielles 20 acceptables, des homopolymères ou copolymères ou descomplexes de polynucléotides ou des analogues très prochesde ceux-ci, substantiellement purs, en utilisant, commeagent de polymérisation - au lien des préparations depolynucléotide-phosphorylase telles qu'on les obtenait 25 suivant les différentes méthodes énoncées plus haut - unenzyme hautement purifié dépourvu des contaminants quiprovoquaient des réactions indésirables. Des analogues trèsproches des nucléotides peuvent comprendre, par exemple,des dérivés nydroxy-6 alcoyle de 1'ADP ou les dérivés 3C haio-5 ou OH-5 ou méthyle-5 de l'UDP.
Plus particulièrement, on a découvert que, après avoir cultivé une souche de bactéries et après l'avoir lysée, le milieu obtenu devait être filtré - 3 - 010206 successivement à travers trois colonnes, la premièrecontenant une résine échangeuse d'ions comme le DEAESephacel® ou un équivalent, la seconde contenant une résinehydrophobique comme le phényle Sepharose® ou un équivalentet la troisième contenant un tamis moléculaire comme leSephcicryl® S300 ou le Sephadex ® 2 00 ou tout autre équi-valent.
Le produit recueilli à la sortie de latroisième colonne comprend, essentiellement mais pasexclusivement, de la polynucléotide-phosphorylase avec destraces de substances dépourvues d'effet sur l'opération depolymérisation qui suivra.
Si on veut obtenir un homopolymère, lapolynucléotide-phosphorylase obtenue sera utilisée pour lapolymérisation du monomère choisi en présence des agentsheibituels.
Si on veut obtenir un copolymère, le monomèrechoisi est remplacé par un mélange des monomères choisis,dans les proportions adéquates.
Si on veut obtenir un complexe, cette mêmepolymérisation est effectuée pour chacun des monomèresappropriés et les homopolymères en résultant sont mélangés,dans des proportions adéquates, en présence de NaCl puisprécipités dans l'éthanol.
Selon une caractéristique importante del'invention, la polymérisation du monomère choisi ou dumélange choisi de monomères est réalisée dans desconditions différentes de celles que l'on emploie 010 2 0 6 4 habituellement. Plus précisément, les concentrationsutilisées sont bien supérieures aux chiffres habituels(environ 50 fois), la polymérisation est réalisée sousaddition contrôlée de MgCl2, avec des valeurs pH contrôléescomprises entre 8,0 et 8,3 et pendant des durées dépassantles indications habituelles.
Les polymères ou copolymères en résultantprésentent une variation du poids moléculaire guicorrespond à des complexes dotés de poids moléculairesallant de 250 000 à 1 500 000 avec un taux depolymérisation homogène et un rendement de polymérisationallant jusqu'à 90-95 %. L'invention sera mieux comprise à la lecture deIci description de préparation suivante, comportant cinqétapes, à partir de la culture d'une souche bactérienne(ici des bactéries E. Coli, mais d'autres bactéries peuventconvenir) pour aboutir à un complexe de Poly A / Poly u
Etape 1 : Culture de bactéries E. Coli B 1/5
La culture est conservée dans des éprouvettes àtempérature ambiante.
Le milieu de culture contient, par litre, 10 gde NaCl, 10 g de Trypticase et 5 g d'extrait, de levure.Après stérilisation pendant 45mn à. 1.10 “C, on ajoute unesolution de glucose à 2 g par litre, stérilisée séparément.Des cultures préliminaires sont réalisées avec 10 ml, puison prépare 200 ml de milieu pour 10 litres de culture.
On agite à 470 tours/mn avec 8 litres d’air par minute. Le temps de doublement à ,)6Cû est de 3 0mn et les bactéries sont récoltées à une densité optique de e à 010206 - 5 - à 600 nm. On en obtient environ 8 g par litre de culture.Le pH de la fermentation est mainte-nu entre 6,5 et 6, H enajoutant du NH4OH 2N. Si la culture n'est pas utiliséeimmédiatement, elle doit être stockée à - 20 "C,
Etape 2 : Lyse des bactéries
Tampon A Tris-HCl 5 x ΙΟ-2 M, pH 7,9 (à 25‘C), contenantde l'EDTA 2 X 10“3 M, du NaCl 0,23 5 M(13,63 g/1) et 5 % de glycérol.
Tampon B Tris-HCl 10”2 M, pH 7,9, contenant de l'EDTA10-4 M, du NaCl 0,2 M et 5 % de glycérol.
Pour 165 g de bactéries (20 1 de culture).
Juste avant l'utilisation, on ajoute 0,4 mJ dedithiothréitol (DTT) 0,1 M (15,4 mç/ml) à 400 ml du tamponA, à température ambiante, suivis de 28 μΐ demercaptoéthanol, 45 mg de lysozyme et 14 mg de flurorure. dephénylméthyle sulfonyle (PMSF) dissous dans 4 ml d'éthanol.Les bactéries gélées (165 g) sont dispersées au mixer dansce milieu (température finale =î 10 °C) et on laisse lasuspension se réchauffer jusqu’à 15'C (environ 20 minutes)en mélangeant de temps à autre, puis; on ajoute, en agitant,272 mg de désoxycholate de sodium, puis 4 mg dedésoxyribonucléase (DNAase). On laisse reposer le mélangede. lyse pendant 20 mn en agitant de temps en temps et onmaintient sa température à 20’C. On lui ajoute 400 ml detampon B et 0,4 ml de DTT 0,1 M en agitant et, enfin, lasuspension est centrifugée à 16 000 g (10 000 tours/mn dansune centrifugeuse Sorvall) pendant 1 heure à 5°C. DNAase 50 679 unités Dornase/mg.
Lysozyme 25 000 unités/mg. - 6 - 010206
Le surnageant (~ 900 ml) , recueilli après lacentrifugation, est dilué dans ce l'eau distillée pourobtenir 1 litre et les protéines sont précipitées enajoutant 280 g de sulfate d'ammonium (saturation à 45 %) ,sous agitation, à 4°C puis le mélange est laissé au repos à4‘C pendant 2 heures. Les protéines sont recueillies parcentrifugation à 16 000 g pendant 3 0 minutes à 5 "Cl Leprécipité (les surnageants sont éliminés) est dissous dans150 ml de Tris-HCl 10_2M, pH 7,8 et la solution estcentrifugée pendant 20 minutes à 16 000 g pour éliminer lescorps insolubles. Les surnageants sont dialysés à 4reprises en changeant chaque fois Les 2 1 de Tris-HCl5 x LO-2 M, pH 7,8, à 4°C, durant 18 heures ; la solutionest ensuite centrifugée pendant 1 heure à 16 000 g pouréliminer les corps insolubles. 300 ml, pH 7,8, conductibilité < 7,0 mS.
Etape_3 : Purification de la polynucléotide-phosphorylase E. Coli B 1/5 (PNPase) 1. Les surnagants obtenus ci-dessus sont passés sur une colonne de 280 ml de DEAE Sephacel (40 x 30 cm)équilibrés dans du Tris-HCl 0,1 M, pH 7,4 à 4 C puis lacolonne est éluée avec un gradient allant de 1 litre deTris-HCl 0,1 M, pH 7,4, à 1 litre de Tris-HCl 0,1. M dans duNaCl 0,4 M, pH 7,4, pour donner 10 ml de fractions. Un picde l'activité diestérase est élué, suivi par un deuxièmepic de l'activité polynucléotide-phosphorylase localise enfractions de 105 à 125 élué au NaCl 0,21 M et au Tris-HCl0,1 M.
Volume 210 ml : 107 unités/ml, cotai : 22 470. 010206 - 7 - 2. Cette solution est ajustée à 0,5 M dans du sulfate d'ammonium en en ajoutant 28 g sous agitation, suisla solution est passée sur une colonne de phényle Sepharose(19 x 2 cm), équilibrée dans du (NH4)2SO, 0,5 M et du
Tris-HCl 0,05 M, pH 7,4. La colonne est lavée avec environ20 ml de (NH4)2SO4 0,5 M dans du Tris-HCl 0,1 M, pH 7,4 puis éluée avec un gradient inversé partant de 2 50 ml deTris-HCl 0,4 M, pH 7,8 dans du (NH4)2SO4 0,1 m jusqu'à duTris-HCl 3 x 10-3 M, ph 7,8 à 4°C. On recueille environ10 ml de fractions- Les fractions actives sont groupées,
Volume : 55 ml = 355 unirés/ml, total : 19 525. 3, On ajoute du sulfate d'ammonium (20 g) sousagitation (saturation à 55 %) pour précipiter les protéineset le précipité est conservé à 4’C pendant 1 heure puiscentrifugé pendant 15 minutes à 16 000 g. Le résidu estdissous dans un minimum de NaCl 0,1 M, du Tris-HCl 0,05 M,pH 7,4 (environ 10 ml) et la solution est versée sur unecolonne de 350 ml de Sephacryl S300 (50 x 3 cm), équilibréedans du NaCl 0,1 M, du Tris-HCl 0,05 M, pH 7,4 et l'enzymeest élué avec le même tampon (10 ml de fractions! environ) .Les fractions actives sont groupées.
Volume : 60 ml, 312 unités/ml, total : 18 750. 540 unités- 5280. L'enzyme est précipitée par addition de 26 g de(NH4)2SO4 (saturation à 65 %) et la suspension est stockée à- 30’C.
Etape 4 : Préparation des polymères 100 g d'ADP Na2 (ou 100 g d'UDP Na,) sont - ε - 010206 dissous dans environ 600 ml d'eau et ajoutés à 200 ml de Tri-HCl ML, pH 8,3250 ml d'acétate d’ammonium M. 20 ml d'EDTA 0,1 M. , pH 8,0100 ml de MgClz M. dans un flacon de 2 1.avec de l'eau et leambiante, avec du NH4OHcouche de toluène. Lesdoivent être dépourvusfer3+ ou le cuivre2+·
Le volume est complété jusqu'à 2 1pH ajusté à 8,6, à température5N. La surface est recouverte d'unenucléosides diphosphat.es utilisésde métaux contaminants tels que le
On ajoute, à une partie aliquote du mélangeci-dessus (80 ml), 200 unités d'enzyme et 2 ml d'uneprépêiraticn précédente de poly A (ou de poly U) commeamorç:age, puis la solution est incubée à 3 7 “C pendant 2heures et transférée sur la souche principale qui étaitconservée à 37°C. Après 4 heures, on ajoute de nouveau300 unités d'enzyme et l'incubation continue. Au bout de 24heures, le pH tombe à environ 3,3 et il est ensuitemaintenu à 8,0 - 8,3 par addition de MK40H 5N.
Le total des unités d'enzyme, est de 300,c'est-à-dire 5 unités par g. Si la polymérisations’effectue à moins de 25 % par 24 heures, on peut ajouter,aux moments opportuns, plus d'enzyme pour auçrmenter le tauxde polymérisation.
Des quantités supplémentaires de 25 ml de MgCl2M. sont ajoutées, en agitant fermement, à environ 30 %,55 % et 75 % de polymérisation (un total de 175 mmoles deMg for 200 nmoles d'ADP ou d'UDP), le pt étant maintenu à8,0 - 8,3 (mesuré à 37"C); La polymérisation atteint 80 -90 % après trois ou quatre jours. 9 010206 L’additon progressive de MgCl? maintient la proportion d'ADP libre (UDP) par rapport au Mg à environ 2, aux niveaux de polymérisation mentionnés ci-dessus. A la fin de l'incubation, le mélange estcentrifugé pour éliminer le phosphate double de magnésiumet d'ammonium précipité, le précipité étant lavé dans unpeu d'eau et les surnageants combinés utilisés pourpréparer le complexe poly A / poly J.
Les conditions optimales de polymérisation sontles suivantes : pH compris entre 8,0 et 8,3 avec additionprogressive de MgCl2 et suffisament d'enzyme pour avoir untaux de polymérisation d'environ 3 0 % par jour. Un pHd'incubation plus élevé (de 8,3 à 8,6) donne un moins grandnombre de polymères. L'addition de la totalité du Mg, audébut de l'incubation, donne des polymères de plus peitetaille.
Etape 5 : préparation du complexe Poly A / Pcly u
La quantité totale de nucléotide contenue dansles solutions est déterminée par hydrolyse du mélanged'incubation dans du NaOH 0,1 N à 100 “C pendant 5 minutesen utilisant une dilution de 1 000 pour le poly A et de 500pour le Poly U (par exemple 10 μΐ de poly A ou 2 0 μΐ depoly U dans 10 ml de NaOH O,1N ou, plus précisément, parune dilution intermédiaire de 100 μΐ de A et de 2 00 μΐ deU).. On mesure l'absorption à 260 nm et la molarité estestimée en utilisant les valeurs suivantes : <5260 nitl x 10”3 pour les solutions molaires. - 10 ~ ρΗ 7,0
NaOH 0,1 N (hydrolyse)
Ap 15,3 15,3 Poly A 9,8 15.3 UP 10,0 7,7 5 Poly U 9,5 7 , '7
Les concentrations du polymère sont détarm:néesà partir du nombre total de nucléotide et du pourcentage depolymérisation. Les volumes, pour un taux stoichiométriqruecle A/U = 1:1, sont ensuite calculés. Dans un flacon de 10 1 10 contenant le poly U, on ajoute 2 00 ml d'une solution deNaCl à 25 % suivi de la solution de poly A, puis lessolutions sont soigneusement mélangées (concentrationfinale de. NaCl ~ 0,18 M.) et laissées au repos, à 4’C, pendant au moins 3 heures. 15 Un volume égal d'éthanol est alors ajouté, sous agitation, de façon à précipiter le poly A / poly U, puisle mélange est laissé au repos pendant 1 heure, à 4‘C, Lecomplexe est recueilli par centrifugation dans une machineSorvall 3 B (bacs de 1 litre) à 5 000 tours/mn, pendant 3 20 minutes ; le complexe est alors lavé dans une solution de2 1 d'éthanol à 55 %. Le résidu e:st dissous dans environ4 1 d’eau pure, puis centrifugé pour éliminer toute tracede phosphate double de magnésium et d’ammonium. Auxsurnageants ainsi préparés, on ajoute .200 ml d'une solution 25 de NaCl à 25 % ; la solution ainsi obtenue est laissée aurepos, à 4’C, pendant au moins trois heures. additionrecueillid'éthanold'éthanolsolution
Le complexe est de nouveau précipité pard'un volume égal d'éthanol, sous agitation,par centrifugation, lavé dans une solutionà 55 % (environ 2 1) , puis dans une solutionà 75 % et enfin, à deux reprises, dans unel'éthanol à 96 %. Le complexe est ensuite séché sous vide. - il -
Rendement : environ 110 - 120 g
Il est nécessaire, pour la précipitation ducomplexe dans la solution d'éthanol à 50 %, que le NaC.l(entre 0,15 M et 0,02 M) soit présent. Pour le lavage, ondoit utiliser une solution d'éthanol à au moins 55 % (lecomplexe précipité étant dissous dans une solutiond'éthanol à 50 %) .
TOXICITE
On a recherché la DL50 chez la souris et le rat,par voies IP et IV.
On n'a relevé aucun cas mortel aux dosesmaximum administrées IV, que ce soit chez la souris ou lerat.
On n'a relevé aucun cas mortel, chez le rat, enadministration IP mais on a déterminé une DL5(I d'environ3g/kg, chez la souris, en administration IP.
La recherche d'un effet pyrogène s'est avéréetotalement négative.
PHARMACOLOGIE
Etant donné que les polymères et lescopolymères, selon l'invention, sont généralement connus -bien qu'ils n'aient jamais été obtenus, de façonindustrielle, sous une forme suffisament pure - diversesexpérimentations pharmacologiques ont été réalisées, depuisdes années, sur des échantillons de produits spécialementpurifiés à cette occasion qui n'étaient pas réellement - 12 - 010206 susceptibles d'être obtenus dans des conditionscommercialement raisonnables.
On peut apprécier tout l’intérêt de l'inventionen prenant connaissance de la bibliographie existante et, 5 par exemple, des articles suivants :: MODULATION OF THE IMMUNE SYSTEM BY SYNTHETICFOLYNUCLEOTIDES - A.G. JOHNSON - Springer Sesniiï,Immunopathol. , 2, pp 149-168 <1979),, . REGULATION OF THE IMMUNE SYSTEM BY SYNTHETIC POLYNUCLEO-10 TIDES - I. Characteristics of Adjuvant Action on Antibody
Synthesis - J.R. SCHIDTKE et A.G. JOHNSON - J. Immunol.,106, pp 1191-1.200 (1971)
. CHANGES IN LYMPHOCYTE SUBPOPULATIONS IN MICE RECEIVING ASINGLE INJECTION OF POLY A - POLY U - M. DONNER, D, VALLIER 15 et. F. LACOUR - Ann. Immunol. (Inst. Pasteur; 12 8C, pp1039-1052 (1977),
. SPECTRUM AND MODE OF ACTION OF POLY A - POLY U IN THESTIMULATION OF IMMUNE RESPONSES - V. BRAUN, M. ISHIZUKA,U. YAJIMA, D. WEBB et R. WINCHURCH dans : BEERS R.F., BRAUN 20 W. , "Biological effects of polyr.ucleotides" New-York :Springle-Verlag, pp 139-156 (1971), . REDUCED INCIDENCE OF SPONTANEOUS MAMMARY TUMORS IN C3H/HeMICE AFTER TREATMENT WITH POLYADENYLATE-POLYURIDYLATE - F. LACOUR, G. DELAGE et C. CHIANALE - Science, 187, pp 2.5 256-257 (1975),
. POLY A - POLY U AS AN ADJUNCT TO SURGERY IN THE TREATMENT OF SPONTANEOUS MURINE MAMMARY ADENOCARCINOMA - F. LACOUR, J, LACOUR et A. SPIRA - Recent Résulté in Cancer Research, vol. 47, pp 352-356, - 13 - 0 î Ο2οβ . POLYADENYLIC-POLYURIDYLIC ACID : BIOLOGICAL RESPONSE-MODIFYING ACTIVITIES IN MICE. IN VIVO ORGAN DISTRIBUTIONAND PHARMACOKINETICS IN RABBITS - F. LACOUR - J. Biol.Resp.. Modif. , 4, pp 490-494 (1985), 5 . A PHASE I CLINICAL TOLERANCE STUDY OF POLYADENYLIC- POLYURIDYLIC ACID IN CANCER PATIENTS - J.P. DUCRET, P. CAILLE, H. SANCHO-GARNIER, J.L. AMIEL, M. MICHELSON,R. G. HOVANESSIAN, J.K. YOUN et F. LACOUR - J. Biol. Resp.Modif., 4, pp 129-133 (1985).
10 PRESENTATION ET POSOLOGIE
En thérapeutique humaine, les compositionsselon 1'invention seront administrées IV sous la formed"une solution isotonique contenant de 0,01 a 0,1 g deprincipe actif. Il est prévu une injection hebdomadairependant 6 semaines. 15
Claims (1)
- 010206 KEVENDICATIONS 1°) - Un procédé de préparation de polymères de nucléotidescomprenant 1'enchaînement d'étapes suivant : - effectuer la lyse d'une culture d'une souchebactérienne suivie du passage successif du milieu résultant 5 à travers trois colonnes : . la première contenant une résine échangeused'ions, . la seconde contenant une résine hydrophobiqueet 13 .la troisième contenant un tamis moléculaire, lequel traitement conduit à une solution de pol/nucléotidephosphorylase substantiellement pure eu égard auxsubstances qui pourraient gêner la réaction depolymérisation ultérieure, 15 - traitement du nucléotide sélectionné par la polynucléotide-phosphorylase ainsi obtenue dans desconditions de polymérisation habituelles en présence deMgCl2 ajouté progessivement de façon à contrôler le degréde polymérisation, 20 - séparation et lavage du polymère ainsi obtenu, éventuellement en effectuant la polymérisation d'unsecond nucléotide choisi, dans les mêmes conditions quedécrit ci-dessus, et, dans ce cas, mélange, dans l'eau, desquantités adéquates de chacun des polymères choisis en 25 présence de NaCl et finalement précipitation du complexerésultant par addition d'éthanol, 2°) - Procédé de préparation selon la revendication i dans - 15 - 010206 lequel la première colonne contient une résine échangeuse d'ions telle que le DEAE Sephacel® ou tout autre équivalent. 3") - Un procédé de préparation selon la revendication 1 5 dans lequel la seconde colonne contient une résine hydrophobique telle que la phényl Sepharose® ou tout autreéquivalent. 4°) -Un procédé de préparation selon la revendication ldans lequel la troisième colonne contient un tamis 10 moléculaire tel que le Sepharyl® S300, le Sephadex® 2 00 outout autre équivalent. 5°) - Un polymère ou copolymère de nucléotides tel qu'ilest obtenu selon le procédé des revendictions l à 4. 6") -Un copolymère selon la revendication 5 dans lequel 15 les nucléotides de départ sont de l'acide adénylique et del'acide uridylique. 7°) - Le copolymère de la revendication 6 dans lequel lesproportions d'acide polyadénylique et d'acidepolyuridylique sont d'environ 50 pour 50 en moles. 20 8°) - Une composition thérapeutique dans laquelle un des composants actifs est une quantité suffisante d'un polymèreou un copolymère selon les revendications 5 à 7.
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