OA11442A - Conjugués d'érythropoïetine. - Google Patents

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OA11442A OA1200000197A OA1200000197A OA11442A OA 11442 A OA11442 A OA 11442A OA 1200000197 A OA1200000197 A OA 1200000197A OA 1200000197 A OA1200000197 A OA 1200000197A OA 11442 A OA11442 A OA 11442A
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Description

1 011442 10
CONJUGUES D1 ERYTHROPOÏETINE 15
ARRIERE PLAN DE L'INVENTION L'érythropoïèse est la production d'hématies quis'effectue pour s'opposer à la destruction descellules. L'érythropoïèse est un mécanisme 20 physiologique régulé qui permet de disposer d'un nombresuffisant d'hématies pour oxygéner convenablement lestissus. L'érythropoïèse humaine (hEPO) est produitedans le rein et est le facteur plasmatique humoral quistimule la production d'érythrocytes (Carnot, P et 25 Deflandre, C (1906), C.R. Acad. Sci. 143:432, Erslev,AJ (1953 Blood 8 : 349 ; Reissmann, KR (1950) Blood 5 :372 ; Jacobson, LO, Goldwasser, E. Freid, W et Plzak LF(1957) Nature 179: 6331-4). L'EPO stimule la divisionet la différenciation des progéniteurs érythroïdes 30 spécialisés dans la moelle osseuse et exerce sonactivité biologique en se liant aux récepteurs sur lesprécurseurs d'érythroïdes (Krantz, BS (1991) Blood77:419).
On a produit l'érythropoïétine par biosynthèse en 35 utilisant la technologie de 1'ADN recombinant (Egrie, 2 011442 J.C. Strickland, TW, Lane, J. et al. (1986) Immunobiol.72: 213-224) et elle est le produit d'un gène d'EPOhumain cloné inséré dans et exprimé dans les cellulestissulaires ovariennes du hamster chinois (CHO). La 5 structure primaire de la forme prédominante, pleinementtraitée de hEPO est présentée dans SEQ ID N°l. Il y adeux ponts disulfure entre Cys7-Cys161 et Cys29-Cys33. Lepoids moléculaire de la chaîne polypeptidique d'EPOsans les fractions sucres est de 18 236 Da. Dans la 10 molécule d'EPO intacte, environ 40 % du poids moléculaire sont représentés par les groupeshydrocarbonés qui glycosylent la protéine aux sites de glycosylation sur la protéine (Sasaki, H. Bothner, B. Dell, A et Fukuda, M (1987 ), J. Biol. Chem. 262: 12059). Comme l'érythropoïétine humaine est essentielle dans la formation des hématies, l'hormone est utiledans le traitement des maladies sanguines caractériséespar une production faible ou défectueuse 20 d'érythrocytes. Cliniquement, l'EPO est utilisée dansle traitement de l'anémie chez les malades atteints dedéficience rénale chronique (CRF) (Eschbach, JW, Egri,JC, Downing, MR et al. (1987) NEJM 316: 73-78 ;
Eschbach, JW Abdulhadi, MH, Browne, JK et al. (1989) 25 Ann. Intern. Med. 111:992 ; Egrie, JC, Eschbach, JW,McGuire, T, Adamson, JW (1988) Kidney Intl. 33: 262 ;Lim. VS, Degowin, RL, Zavala, D. et al. (1989) Ann.Intern. Med. 110: 108-114) et chez les malades atteintsde SIDA et de cancer qui subissent une chimiothérapie 30 (Danna, RP, Rudnick, SA, Abels, RI dans MB, Garnick,dir. publ. Erythropoietin dans Clinical Applications-AnInternational Perspective. New York, NY : Marcel Dekker1990: p. 301-324). Cependant, la biodisponibilité de lathérapeutique protéique commercialement disponible 35 comme la thérapeutique à EPO est limitée par la courte 3 011442 demi-vie plasmatique de ces protéines et leursensibilité à la dégradation par une protéase. Cesinconvénients les empêchent d'atteindre une efficacitéclinique maximale.
5 RESUME DE L'INVENTION L'invention fournit un conjugué d'érythropoïétine,ledit conjugué comprenant une glycoprotéined'érythropoïétine ayant au moins un groupe amino libreet ayant l'activité biologique in vivo consistant à 10 faire déclencher par les cellules de moelle osseuse uneaugmentation de la production de réticulocytes etd'érythrocytes, et choisis dans le groupe constitué parl'érythropoïétine humaine et ses analogues qui ont laséquence de l'érythropoïétine humaine modifiée par 15 l'addition de 1 à 6 sites de glycosylation ou leréarrangement d'au moins un site de glycosylation ;ladite glycoprotéine étant liée de façon covalente à"n" groupes poly(éthylène glycol) de formule CO- (CH2) x— (OCH2CH2) m_OR, le -CO (c'est-à-dire carbonyle) 20 de chaque groupe poly(éthylène glycol) formant uneliaison amide avec l'un desdits groupes amino ; où Rest un alkyle inférieur ; x vaut 2 ou 3 ; m vautd'environ 450 à environ 900 ; n vaut de 1 à 3 et n etm sont choisis de manière que le poids moléculaire du 25 conjugué diminué de celui de la glycoprotéine del'érythropoïétine est compris entre 20 kDaltons et 100kDaltons. L'invention fournit en outre des compositionscontenant des conjugués ici décrits dans lesquels lepourcentage de conjugués dans la composition dans 30 lesquels n vaut 1 est d'au moins 90 %.
Par comparaison avec l'EPO non modifiée (c'est-à- dire l'EPO sans PEG attaché) et les conjugués PEG-EPOclassiques, les présents conjugués ont une demi-vie decirculation et un temps de séjour dans le plasma 35 accrus, une baisse de la clairance et une activité 4 011442 clinique in vivo accrues. Les conjugués de l'inventionont les mêmes utilisations que l'EPO. En particulierles conjugués de l'invention sont utiles pour traiterles malades en stimulant da division et la 5 différenciation des précurseurs d'érythroïdesspécialisés dans la moelle osseuse de la même manièreque l'on utilise l'EPO pour traiter les malades. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTIONL'invention fournit des conjugués, lesdits 10 conjugués comprenant une glycoprotéine d'érythropoïétine ayant au moins un groupe amino libreet ayant l'activité biologique in vivo consistant àdéclencher, sous l'action des cellules de moelleosseuse, l'augmentation de la production de 15 réticulocytes et d'érythrocytes, et choisie dans legroupe constitué par l'érythropoïétine humaine et sesanalogues qui ont la séquence de l'érythropoïétinehumaine modifiée par addition de 1 à 6 sites deglycosylation ou une transposition d'au moins un site 20 de glycosylation ; ladite glycoprotéine étant liée defaçon covalente à "n" groupes poly(éthylène glycol) deformule -CO- (CH2) x- (OCH2CH2)m-OR, le -CO (carbonyle) dechaque groupe poly(éthylène glycol) formant une liaisonamide avec l'un desdits groupes amino ; où R est un 25 alkyle inférieur ; x vaut 2 ou 3 ; m vaut d'environ 450à environ 900 ; n vaut de 1 à 3 ; et n et m sontchoisis de manière que le poids moléculaire du conjuguédiminué de celui de la glycoprotéine d'érythropoïétineest compris entre 20 kD à 100 kD. 30 On a trouvé que les conjugués de l'invention peuvent être utilisés de la même manière que l'EPO nonmodifiée. Cependant, les conjugués de l'inventionprésentent une diminution de la demi-vie de circulationet du temps de séjour plasmatique, une baisse de la 35 clairance, et une augmentation de l'activité clinique 5 011442 in vivo. Etant donné ces propriétés améliorées, lesconjugués de l'invention peuvent être améliorés unefois par semaine au lieu de trois fois par semaine pourl'EPO non modifiée. On s'attend à ce qu'une baisse de 5 la fréquence d'administration aboutisse à unecoopération accrue chez le malade, menant à un meilleursuccès dans le traitement ainsi qu'à une améliorationdans la qualité de vie des malades. Par comparaisonavec les conjugués classiques d'EPO liés au 10 poly(éthylène glycol) on a trouvé que les conjuguésayant les poids moléculaire et la structure de lieurdes conjugués de l'invention présentent uneamélioration de leur puissance, de leur stabilité, deleur AUC, de leur demi-vie de circulation et de leur 15 profil économique.
Les conjugués selon l'invention peuvent êtreadministrés en une quantité thérapeutiquement efficaceà des malades de la même manière que l'on administrel'EPO. La quantité thérapeutiquement efficace est la 20 quantité de conjugué nécessaire pour l'activitébiologique in vivo consistant à faire déclencher parles cellules de moelle osseuse l'augmentation de laproduction de réticulocytes et d'érythrocytes. Laquantité exacte de conjugué est une question de 25 préférence par rapport à des facteurs tels que le type exact de maladie traitée, l'état du malade traité, ainsi que les autres ingrédients de la composition. Ainsi, on peut administre'r de 0,01 à 10 pg par kg de poids corporel, de préférence de 0,1 à 1 pg/kg de poids30 corporel, par exemple une fois par semaine.
Les compositions pharmaceutiques contenant leconjugué peuvent être formulées à une concentrationefficace pour l'administration par divers moyens à unmalade humain subissant des maladies sanguines 35 caractérisées par une baisse ou une défectuosité dans 6 011442 la production des érythrocytes. Les quantitésthérapeutiquement efficaces moyennes du conjuguépeuvent varier, et en particulier doivent être fondéessur les recommandations et la prescription d'un médecin 5 qualifié.
Les produits glycoprotéiques d'érythropoïétineobtenus selon l'invention peuvent être préparés dansdes compositions pharmaceutiques appropriées pourl'injection avec un support ou véhicule 10 pharmaceutiquement acceptable par des procédés connusdes spécialistes. Ainsi, des compositions appropriéesont été décrites dans les documents WO97/09996,W097/40850, WO98/58660 et W099/07401. Parmi les supports pharmaceutiquement acceptables préférés pour 15 formuler les produits de l'invention, il faut citer lasérum albumine humaine, les protéines plasmatiqueshumaines, etc. Les composés de l'invention peuvent êtreformulés dans un tampon phosphate de sodium/potassium10 mM à pH 7 contenant un agent de tonicité, par 20 exemple le chlorure de sodium 132 mM. Facultativement,la composition pharmaceutique peut contenir un agent deconservation. La composition pharmaceutique peutcontenir différentes quantités d'érythropoïétine, parexemple 10 à 1000 pg/ml, par exemple 50 pg ou 400 pg. 25 Le terme d'"érythropoïétine" ou EPO se réfère à une glycoprotéine ayant la séquence d'acides aminésexposée dans (SEQ ID NO:1) ou (SEQ ID N0:2) ou uneséquence d'acides aminés qui y est sensiblementhomologue, dont les propriétés biologiques concernent 30 la stimulation de la production d'érythrocytes et lastimulation de la division et de la différenciation deprécurseurs d'érythrocytes spécialisés dans la moelleosseuse. Tels qu'utilisés ici, ces termes comprennentde telles protéines modifiées délibérément, par exemple 35 par une mutagenèse dirigée ou accidentellement par des 7 011442 mutations. Ces termes incluent également les analoguesayant de 1 à 6 sites additionnels de glycosylation, lesanalogues ayant au moins un acide aminé additionnel àl'extrémité carboxy-terminale de la glycoprotéine, 5 l'acide aminé additionnel incluant au moins un site deglycosylation, et les analogues ayant une séquenced'acide aminés qui incluent une transposition d'aumoins un site pour la glycosylation. Ces termescomprennent l'érythropoïétine humaine tant naturelle 10 que produite par voie recombinante.
Les conjugués d'érythropoïétine de l'invention peuvent être représentés par la formule I : P- [NHCO- (CH2) x- (OCH2CH2) m-OR] n (I) 15 20 25 30 dans laquelle x, m, n et R sont tels que ci-dessus.Dans la formule i, P est le résidu d'une glycoprotéined'érythropoïétine ici décrite (c'est-à-dire sans le oules groupes amino qui forment une liaison amide avec le carbonyle1'activitédéclencher représentébiologiquepar les dans la formule I) , ayantin vivo consistant à fairecellules de moelle osseuse l'augmentation de la production des réticulocytes etdes érythrocytes.
Dans un mode de réalisation préféré del'invention, R est un méthyle. De préférence, m vautd'environ 650 à environ 750 et n vaut de préférence 1.
Dans le mode de réalisation le plus préféré del'invention, R est un méthyle, n vaut d'environ 650 àenviron 750 et n vaut 1, c'est-à-dire le conjugué telque défini ci-dessus répondant à la formule
[CH3O (CH2CH2O) mCH2CH2CH2CO-NH] n-P 8 011442 dans laquelle m vaut de 650 à 750, n vaut 1 et P esttel que défini ci-dessus. De préférence, m a unemoyenne d'environ 680.
De préférence, la glycoprotéine des conjugués5 définis ci-dessus est une érythropoïétine humaine.L'érythropoïétine humaine et les protéines analoguestelles que définies ci-dessus peuvent être expriméespar une activation génique endogène. Les glycoprotéinesd'érythropoïétine humaine sont celles de SEQ ID N0:l et 10 de SEQ ID NO:2, de préférence celles de SEQ ID NO:1.
En outre, P peut être choisi dans le groupeconstitué par les résidus d'érythropoïétine humaine etleurs analogues ayant de 1 à 6 sites de glycosylationadditionnels. Comme il est exposé en détail ci-dessous, 15 la préparation et la purification de ΓΕΡΟ sont bienconnus des spécialistes. L'EPO désigne la protéinenaturelle ou recombinante, de préférence humaine,obtenue à partir de n’importe quelle source classiquecomme les tissus, la synthèse des protéines, la culture 20 cellulaire avec des cellules naturelles ourecombinantes. Ceci comprend toute protéine ayantl'activité d'EPO, comme les mutéines ou des protéinesmodifiées d'une autre manière. On peut préparer l'EPOrecombinante par expression dans des lignées 25 cellulaires CHO, BHK ou HeLa, par la technologique del'ADN recombinant ou par une activation géniqueendogène. L'expression de protéines, y compris l'EPO,par activation génique endogène est bien connue desspécialistes et est décrite, par exemple, dans les 30 brevets américains N° 5 733 761, 5 641 670 et 5 733 746et les publications de brevets internationaux N° WO93/09222, WO 94/12650, WO 95/31560, WO 90/11354, WO91/06667 et WO 91/09955, la teneur de chacun de cesdocuments étant ici incorporée à titre de référence. 35 Les espèces d'EPO préférées pour la préparation des 9 011442 ayant la sequence d'acides aminesSEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2, de:nce d'acides aminés de SEQ ID NO:1.le réalisation, P peut être le résiduglycoprotéine ayant de 1 à 6la glycosylation. La glycosylation avec un ou plusieurs groupess'effectue en des endroits de la proteine, lainfracellulaire etglycosylation estoligosaccharides liés à produits glycoprotéiques d'érythropoïétine sont lesespèces d'EPO humaines. De préférence, l'espèce d'EPOest l'EPO humaine représentée dans5 préférence la séqueDans un mode c d'un analogue deadditionnels pourd'une protéine, 10 oligosaccharides, spécifiques le long d'une ossature polypeptidique, etaffecte grandement les propriétés physiques de laprotéine comme la stabilitésécrétion, la localisation15 l'activité biologique. Lagénéralement de deux types. Les l'oxygène sont attachés à des résidus sérine outhréonine et les oligosaccharides liés à l'azote sontattachés à des résidus asparagine. Un type20 d'oligosaccharide que l'on trouve tant sur lesoligosaccharides liés à l'azote que sur ceux qui sontliés à l'oxygène est l'acide N-acétyl neuraminique(acide sialique), qui est une famille de sucres aminéscontenant 9 atomes de carbone ou plus. L'acide sialique25 est généralement le résidu terminal sur lesoligosaccharides liés à l'azote comme sur ceux qui sontliés à 1'oxydène et, étant donné qu'ils portent unecharge négative, ils confèrent des propriétés acides àla glycoprotéine. L'érythropoéïétine humaine, ayant 16530 acides aminés, contient trois chaînes oligosaccharidiques liées à l'azote et une chaîne liéeà l'oxygène qui constitue environ 40 % du poids moléculaire total de la glycoprotéine. La glycosylationliée à l'azote s'effectue aux résidus asparagine35 localisés dans les positions 24, 38 et 83, et la 10 011442 ίο 15 20 25 30 localisation liée à l'oxygène s'effectue en un résidusérine localisé en la position 126. Les chaînesoligosaccharidiques sont modifiées par des résidusacides sialiques terminaux. L'élimination enzymatiquede tous les résidus acide sialique de l'érythropoiétineglycosylée aboutit à une perte d'activité in vivo, maisnon d'activité in vitro car la sialylation del'érythropoïétine empêche sa liaison, et sa clairanceultérieure, par la protéine de liaison hépatique.
Les glycoprotéines de l'invention comprennent desanalogues d'érythropoïétine humaine comportant une ouplusieurs modifications de la séquence d'acides aminésde l'érythropoïétine humaine aboutissant à uneaugmentation du nombre de sites de fixation de l'acidesialique. On peut engendrer ces analogues de glycoprotéine par une mutagenèse dirigée ayant desadditions, des délétions et/ou des substitutions derésidus acides aminés qui augmentent ou modifient lessites qui sont disponibles pour la glycosylationengendre les analogues de glycoprotéine ayant niveaux d'acide sialique supérieurs à ceux que l'ontrouve dans l'érythropoïétine humaine en ajoutant des sites de glycosylation qui ne perturbent pas la ou tertiaire requise pour
Les glycoprotéines de l'invention incluent également des analogues ayant desniveaux accrus de fixation d'hydrates de carbone en unsite de glycosylation qui comporte généralement lasubstitution d'un ou plusieurs acides aminés àproximité étroite d'un site de liaison à l'azote ou à1'invention
On des conformation secondairel'activité biologique. 1'oxygène.
Les glycoprotéines de comprennent généralement les analogues ayant un ouplusieurs acides aminés s'étendant à partir del'extrémité carboxy-terminale de l'érythropoïétine etfournissant au moins un site hydrate de carbone 35 11 011442 additionnel. Les glycoprotéines de l'invention incluentégalement des analogues ayant une séquence d'acidesaminés incluant une transposition d'au moins un sitepour la glycosylation. Une telle transposition de site 5 de glycosylation implique la délétion d'un ou plusieurssites de glycosylation dans l'érythropoïétine humaineet l'addition d'un ou plusieurs sites de glycosylationque l'on ne trouve pas dans la nature. L'augmentationdu nombre de chaînes hydrocarbonées sur 10 l'érythropoïétine, et par conséquent du nombre d'acidessialiques par molécule d'érythropoïétine, peut conférerdes propriétés avantageuses comme une augmentation dela solubilité, une augmentation de la résistance à laprotéolyse, une réduction de l'immunogénicité, un 15 accroissement de la durée de vie dans le sérum et uneaugmentation de l'activité biologique. Des analoguesd'érythropoïétine comportant des sites de glycosylationadditionnels sont décrits plus en détail dans lademande de brevet européen N° 640 619, d'Elliot, 20 publiée le 1er mars 1995.
Dans un mode de réalisation préféré, les glycoprotéines de l'invention comprennent une séquenced'acides aminés incluant au moins un site additionnelpour la glycosylation comme, sans s'y limiter, les 25 érythropoïétines comprenant la séquence del'érythropoïétine humaine modifiée par une modificationchoisie parmi les suivantes :
Asn30Thr32 ; 30 Asn51Thr53 ;
Asn57Thr59 ;
Asn69 ;
Asn69Thr71 ;
Val87Asn88Thr90 ; 35 Ser87Asn88Thr90 ; 12 011442
Ser87Asn88Gly89Thr90 ;
Ser87Asn88Thr90Thr92 ;
Ser87Asn88Thr90Ala162 ;
Asn69Thr71Ser87Asn88Thr90 ; 5 Asn30Thr32Val87Asn88Thr90 ;
Asn89Ile90Thr91 ;
Ser87Asn89Ile90Thr91 ;
Asn136Thr138 ;
Asn138Thr140 ; 10 Thr125 ; etPro124Thr125.
La notation utilisée pour la modification de laséquence d'acides aminés signifie que la ou les 15 positions de la protéine non modifiée correspondante(par exemple hEPO de SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO: 2)indiquée par le ou les nombres en indices hauts estchangé en le ou les indices aminés précédentsimmédiatement le ou les nombres mis en indices hauts 20 respectifs.
La glycoprotéine peut également être un analogueayant au moins un indice aminé additionnel àl’extrémité carboxy-terminale de la glycoprotéine,l'acide aminé additionnel incluant au moins un site de 25 glycosylation, c'est-à-dire que le conjugué tel quedéfini ci-dessus se réfère également à un composé danslequel la glycoprotéine comporte une séquencecomprenant la séquence de l'érythropoïétine humaine etune seconde séquence à l'extrémité carboxy-terminale de 30 la séquence d'érythropoïétine humaine, la secondeséquence contenant au moins un site de glycosylation.L'acide aminé additionnel peut comprendre un fragmentpeptidique dérivé de l'extrémité carboxy-terminal de lagonadotropine chorionique humaine. De préférence, la 35 glycoprotéine est un analogue choisi dans le groupe 13 011442 constitué par (a) l'érythropoïétine humaine ayant laséquence d'acides aminés Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro
Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gin (SEQ ID BO:3), s'étendant à 5 partir de 1’ ' extrémité carboxy-terminale ; (b) l'analogue dans (a) comprenant en outre Ser87 Asn88 Thr90EPO ; et (c) l'analogue en (a) comprenant en outreAsn30 Thr32 Val87 Asn88 Thr90 EPO.
La glycoprotéine peut également être un analogue 10 ayant une séquence d'acides aminés qui inclut unetransposition d'au moins un site pour la glycosylation.La transposition peut comprendre une délétion de l'unquelconque des sites hydrates de carbone lié à l'azotedans l'érythropoïétine humaine et une addition d'un 15 site hydrate de carbone lié à l'azote en position 88 dela séquence d'acides aminés de l'érythropoïétinehumaine. De préférence, la glycoprotéine est unanalogue choisi dans le groupe constitué par Gin24 Ser87Asn88 Thr90 EPO ; Gin38 Ser87 Asn88 Thr90 EPO ; et Gin83 20 Ser87 Asn88 Thr90 EPO.
Tel qu'utilisé ici, le terme "alkyle inférieur" désigne un groupe alkyle linéaire ou ramifié ayant de 1à 6 atomes de carbone. Comme exemple de groupes alkyleinférieur, on peut citer méthyle, éthyle et isopropyle. 25 Selon l'invention, R représente n'importe quel alkyleinférieur. On préfère les conjugués dans lesquels R estun méthyle.
Le symbole "m" représente le nombre de résidusoxyde d'éthylène (OCH2CH2) dans le groupe poly (oxyde 30 d'éthylène). Une seule sous-unité PEG d'oxyded'éthylène a un poids moléculaire d'environ 44 daltons.Ainsi, le poids moléculaire du conjugué (excluant lepoids moléculaire de l'EPO) dépend du nombre "m". Dansles conjugués de l'invention, "m" est d'environ 450 à 35 environ 900 (ce qui correspond à un poids moléculaire à 14 011442 environ 20 kDa à environ 40 kDa), de préférence àenviron 60 à environ 750 (ce qui correspond à un poidsmoléculaire d'environ 30 kDa). Le nombre m est choiside manière que le conjugué de l'invention résultant ait 5 une activité physiologique comparable à celle de l'EPOnon modifiée, laquelle activité peut représenter lamême activité, une activité supérieure ou une fractionde l'activité correspondante de l'EPO non modifiée. Unpoids moléculaire "d'environ" un certain nombre 10 signifie qu'il est dans un intervalle raisonnable parrapport à ce nombre, déterminé par des techniquesd'analyse classiques. Le nombre "m" est choisi demanière que le poids moléculaire de chaque groupepoly(éthylène glycol) lié de façon covalente à la 15 glycoprotéine érythropoïétine soit d'environ 20 kDa àenviron 40 kDa, et soit de préférence d'environ 30kDa.
Dans les conjugués de l'invention, le nombre "n"est le nombre de groupes polyéthylène glycol liés defaçon covalente à des groupes amino libres (y compris 20 les groupes ε-amino d'un acide aminé lysine et/ou legroupe amino terminal) d'une protéine d'érythropoïétinevia une ou plusieurs liaisons amides. Un conjugué del'invention peut avoir 1, 2 ou 3 molécules de PEG pargroupe d'EPO. "n" est un nombre entier compris entre 1 25 èt 3, de préférence "n" vaut 1 ou 2 ou de préférence"n" vaut 1.
On peut préparer le composé de formule I à partirdu matériau polymérique connu 15 011442 ο
RO(CH2CH2O)m(CH2)xCO
(II) 10 dans lequel R et m sont tels que décrits ci-dessus, encomposant le composé de formule II avec laglycoprotéine d'érythropoïétine. Les composés deformule I dans lesquels x vaut 3 sont les esters succinimidyliques d'acide alpha-alcoxy inférieur 15 butyrique de poly(éthylène glycol) (alcoxy inférieur-PEG-SPA) . Les composés de formule II dans laquelle xvaut 2 sont les esters succinimidyliques d'acide alpha-alcoxy inférieur propionique de poly(éthylèneglycol)(alcoxy inférieur-PEG-SPA). On peut utiliser 20 n'importe quel procédé classique pour faire réagir unester activé avec une amine afin de former un amide. Laréaction décrite ci-dessus, l'ester succinimidyliquedonné en exemple est un groupe sortant causant laformation d'un amide. L'utilisation d'esters 25 succinimidyliques comme les composés de formule II pourproduire des conjugués avec les protéines est décritedans le brevet américain N° 5 672 662 publié le 30 septembre 1997 (Harris et al.). L'EPO humaine contient neuf groupes amino libres, 30 le groupe amino terminal auquel s'ajoute les groupes ε-amino de 8 résidus lysine. Lorsqu'on combine le réactifde pégylation avec un composé SBA de formule II, on atrouvé qu'à un pH de 7,5 un rapport protéine:PEG de 1:3et une température réactionnelle comprise entre 20 et 35 25°C, on produit un mélange de mono-, di- et de traces 16
011442 d'espèces tripégylées. Lorsque le réacteur de pégylation est un composé S PA de formule II, dans des conditions similaires sauf que le rapport protéine: PEG est de 1:2, on produit principalement l'espèce5 monopégylée. On peut administrer l'EPO pégylée sous laforme d'un mélange, ou bien sous la forme d'espècespégylées différentes séparées par chromatographieéchangeuse de cations. En manipulant les conditions dela réaction (par exemple le rapport des réactifs, le 10 pH, la température, la concentration de protéine, ladurée de réaction, etc), on peut faire varier lesquantités relatives des différentes espèces pégylées. L'érythropoïétine humaine (EPO) est uneglycoprotéine humaine qui stimule la formation 15 d'érythrocytes. Sa préparation et son applicationthérapeutiques sont décrites en détail par exemple dansles brevets américains N° 5 547 933 et 5 621 080, EP-B0 148 605, Huang, S.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1984) 2708-2712, EP-B 0 205 564', EP-B 0 209 539 et EP- 20 B 0 411 678 ainsi que Lai P.H. et al., J. Biol. Chem.261 (1986) 3116-3121 et Sasaki H. et al., J. Biol.
Chem. 262 (1987) 10259-12076. L'érythropoïétine pour utilisations thérapeutiques peut être produite par unmoyen recombinant (EP-B 0 148 605, EP-B 0 209 539 et 25 Egrie, J.C., Strickland, T.W. Lane, J. et al. (1986)Iramunobiol 72:213-224).
Des procédés pour l'expression et la préparationde l'érythropoïétine dans un milieu dépourvu de sérumsont décrits par exemple dans le document XO 96/35718, 30 de Burg, publié le 14 novembre 1996, et dans lapublication de brevet européen '513 738, de Koch, publiée le 12 juin 1992. Outre les publications mentionnées ci-dessus, il est connu que l'on réaliser
une fermentation sans sérum de cellules CHO 35 recombinantes qui contiennent un gène EPO. Ces procédés 17 011442 sont décrits par exemple dans les documents EP-A 0 513738, EP-A 0 267 678 et sous une forme générale par
Kawamoto, T. et al. Analytical Biochem. 130 (1983) 445-453, EP-A 0 248 656, Kowar, J. et Eranek, F. Methods in 5 Enzymology 421 (1986) 277-292, Bavister, B. Expcology 271 (1981) 42-51n EP-A 0 481 791 EP-A 0 307 247, EP-A 0343 635, WO 88/00967.
Dans le document EP-A 0 267 678, il est décrit unechromatographie échangeuse d'ions sur S-Sepharose, une 10 HPLC (chromatographie en phase liquide hauteperformance) à phases inversées préparative sur unecolonne en C8 et une chromatographie de filtration surgel pour la purification de l'EPO produit dans uneculture dépourvue de sérum après dialyse. A ce propos, 15 on peut remplacer l'étape de chromatographie parfiltration sur gel par une chromatographie d'échanged'ions, sur débit rapide de S-Sepharose. Il estégalement proposé de réaliser une chromatographiecolorante sur colonne de bleu tris-acrylique avant la 20 chromatographie échangeuse d'ions.
Un procédé de purification d'EPO recombinante est décrit par Nobuo, I. et al., J. Biochem. 107(1990) 352-359. Dans ce procédé, on traite cependant l'EPO avecune solution de Tween® 20, de fluorure de phénylméthyl 25 sulfonyle, d'éthyl maléimide, le pepstatine A, desulfate de cuivre et d'acide oxamique avant les étapesde purification. Certaines publications, y compris ledocument WO 96/35718, de Burg, publiée le 14 novembre1996, décrit un procédé de préparation 30 d'érythropoïétine dans un procédé de fermentation sanssérum (EPOsf).
On peut déterminer l'activité spécifique de.l'EPOou de conjugués d'EPO selon l'invention par diversessais connus des spécialistes. L'activité biologique 35 des protéines d'EPO purifiées de l'invention est telle 18 011442 que l'administration de la protéine EPO par injection àdes malades humains aboutit à une augmentation de laproduction de réticulocytes et d'hématies par lescellules de moelle osseuse, par comparaison avec un 5 groupe témoin de sujets n'ayant pas reçu d'injection.On peut tester l'activité biologique des protéinesd'EPO, ou de certains de leurs fragments, obtenus etpurifiés selon l'invention en ayant recours à desprocédés selon Annable, et al., Bull. Wld. Hlth. Org. 10 (1972) 47:99-112 et Pharm. Europa Spec. Issue
Erythropoietin BRP Bio 1997(2). Un autre essaibiologique pour déterminer l'activité de la protéined'EPO, l'essai de la souris normocythémique, est décritdans l'exemple 4. 15 L'invention fournit une composition constituée de conjugués tels que décrits ci-dessus. Une compositioncontenant au moins 90 % de conjugués mono-PEG, c'est-à-dire dans lesquels n vaut 1 peut être préparée comme onle voit dans l'exemple 5. Généralement les composés 20 monoPEG de glycoprotéines d'érythropoïétine sontsouhaitables, car ils tendent à avoir une activité plusélevée que les conjugués di-PEG. On peut réguler lepourcentage de conjugués mono-PEG ainsi que le rapportd'espèces mono-PEG et d'espèces di-PEG en mettant 25 ensemble des fractions plus larges autour du picd'élution pour diminuer le pourcentage de mono-PEG, oudes fractions plus étroites pour augmenter lepourcentage de mono-PEG dans la composition. Environ 90% de conjugués mono-PEG est un bon équilibre de 30 rendement et d'activité. On peut souhaiter quelquesfois des compositions dans lesquelles, par exemple, aumoins 92 % et au moins 96 % des conjugués sont des espèces mono-PEG (n = 1). Dans un mode de réalisationde l'invention, le pourcentage de conjugués dans 35 lesquels n vaut 1 est de 90 % à 96 %. 19 011442 L'invention se réfère également aux compositionspharmaceutiques correspondantes comprenant un conjuguéou une composition telle que décrite ci-dessus et unexcipient pharmaceutiquement acceptable.
Les conjugués et compositions de l'invention sontparticulièrement utiles pour la préparation demédicaments pour le traitement ou la prophylaxie desmaladies corrélées à l'anémie chez les malades atteintsde déficience rénale chronique (CRL), de SIDA, et pourle traitement des malades cancéreux qui subissent unechimiothérapie.
Un mode de réalisation additionnel de l'inventionse réfère à un procédé de traitement prophylactiqueet/ou thérapeutique de maladies faisant intervenir uneanémie chez des malades atteints de déficience rénalechronique (CRF), de SIDA et des malades cancéreuxsubissant une chimiothérapie, comprenant Γ'étaped'administration à un malade d'une composition telleque décrite ci-dessus.
En outre, l'invention concerne un procédé depréparation de composés tels que décrits ci-dessus, ceprocédé comprenant la condensation du composé deformule II
RO(CH2CH2O)m(CH2)xCOON (il) avec une glycoprotéine d'érythropoïétine et où r, m etx sont tels que définis ci-dessus. L'invention se réfère également aux composés telsque définis ci-dessus pour le traitement de maladiesqui sont associées à l'anémie chez les malades atteints 20 011442 de déficience rénale chronique (CRF), de SIDA, et lesmalades cancéreux subissant une chimiothérapie. L'invention sera mieux comprise en se référant auxexemples suivants qui précisent mais ne limitent pas 5 l'invention ici décrite.
EXEMPLES
Exemple 1 : Fermentation et purification de 1ΈΡΟ humaine 10 a) Préparation et fermentation de l'inoculum
On prélève un flacon de la bande cellulaire de travail, provenant d'une lignée cellulaire CHOproductrice d'EPO (ATCC CRL 8695, décrite dans ledocument EPO 411 678 (Genetics Institute)) dans la 15 phase gazeuse de la cuve de stockage à azote liquide.On transfère les cellules dans des ballons decentrifugation en verre et on cultive dans un milieutamponné au carbonate acide dans un incubateur de CO2modifié. Les milieux dépourvus de sérum typiques 20 utilisés pour la préparation et la fermentation del'inoculum sont décrits dans le demande de breveteuropéen N° 513 738 de Koch publiée le 12 juin 1992, oule document WO 96/35718 de Burg publiée le 15 novembre1996, et ils contiennent par exemple comme milieu de 25 DMEM/F12 (par exemple JRH Biosciences/HazletonBiologics, Denver, Etats-Unis, commande N° 57-736)ainsi que du carbonate acide de sodium, de laL+glutamine, du D+glucose, de l'insuline recombinante,du sélénite de sodium, du diamino butane, de 30 1'hydrocortisone, du sulfate de fer (II), de l'asparagine, de l'acide aspartique, de la sérine et unstabilisateur des cellules de mammifère comme par exemple l'alcool polyvinylique, la méthyl cellulose, lepolydextrane, le polyéthylène glycol, le Pluronic F68, 21 011442 un dilatateur plasmatique polygéline (HEMACCEL®) ou dela polyvinyl pyrrolidone (document WO 96/35718).
On vérifie au microscope l'absence dans lescellules de microorganismes contaminants, et on 5 détermine des densités cellulaires. Ces tests sonteffectués à chaque étape de division.
Après la période de croissance, initiale, on diluela culture cellulaire avec du milieu frais à la densitécellulaire de départ, et elle connaît un autre cycle de 10 croissance. On répète ce procédé jusqu'à obtention d'unvolume de culture d'environ 2 litres par ballon decentrifugation en verre. Après environ 12 doublements,on obtient de 1 à 5 litres de cette culture que l'onemploie alors comme inoculum pour le fermenteur 15 d'inoculum de 10 litres.
Au bout de 3 à 5 jours, on peut utiliser la culture dans le fermenteur de 10 litres comme inoculumpour le fermenteur à inoculum de 100 litres. Au bout de3 à 5 jours additionnels de culture, on peut utiliser 20 la culture dans le fermenteur de 100 litres pour lefermenteur de production de 1000 litres, b) Récolte et séparation des cellules
On utilise un procédé de réalimentationdiscontinu, c'est-à-dire que lorsqu'on atteint la 25 densité cellulaire désirée, on récolte environ 80 % dela cellule. On complète la cellule restante avec dumilieu de culture frais et on cultive jusqu'à larécolte suivante. Un tour de production consiste en unmaximum de 10 récoltes successives : 9 récoltes 30 partielles et une récolte globale à la fin de lafermentation. La récolte s'effectue tous les trois àquatre jours.
On transfère le volume de récolte déterminé dansun récipient refroidi. On retire les cellules par 35 centrifugation ou filtration et on les jette. On filtre 22 011442 en ligne le surnageant de l'étape de centrifugationcontenant l'EPO et on le recueille dans un secondrécipient refroidi. On traite séparément chaque récolteau cours de la purification. 5 Un procédé typique pour la purification de la protéine EPO est décrit dans le document WO 96/35718,de Burg, publié le 14 novembre 1987. Le procédé depurification est expliqué ci-dessous. a) Chromatographie sur bleu de Sepharose 10 Le bleu de Sepharose (Pharmacia) consiste en perles de Sepharose à la surface desquelles le colorantbleu Cibacron est lié de façon covalente. Etant donnéque l'EPO se lie plus fortement au bleu de Sepharoseque la plupart des impuretés non protéiques, certaines 15 impuretés protéiques et le PVA, on peut enrichir le PVOdans cette étape. On procède à l'élution de la colonnede Sepharose bleu en augmentant la concentration de selainsi que le pH.
On remplit la colonne avec. de 80 à 100 litres de 20 bleu de Sepharose, on la régénère avec NaOH et onl'équilibre avec un tampon d'équilibrage (chlorure desodium/calcium et acétate de sodium). On charge lesurnageant du fermenteur acidifié et filtré. Après lafin du chargement, on lave la colonne tout d'abord la 25 colonne avec un tampon . semblable au tampond'équilibrage contenant une concentration plus élevéede chlorure de sodium, et ensuite avec un tampon debase Tris. On élue le produit avec un tampon de baseTris et on le recueille en une seule fraction selon le 30 profil d'élution directeur. b) Chromatographie sur butyl Toyopearl
Le butyl Toyopearl 650C (Toso Haas) est unematrice à base de polystyrène à laquelle des résidusbutyle aliphatiques sont couplés de façon covalente. 35 Etant donné que l'EPO se lie plus fortement à ce gel 23 011442 ίο 15 20 25 30 que la plupart des impuretés et le PVA, il faut l'élueravec un tampon contenant de 1'isopropanol.
On remplit la colonne avec de 30 à 40 litres debutyl Toyopearl 650 C, on régénère avec NaOH, on laveavec un tampon de base Tris· et on équilibre avec untampon de base Tris contenant de 1'isopropanol.
On ajuste l'éluat de bleu de Sepharose à laconcentration d'isopropanol dans le tampond'équilibrage de la colonne et on charge sur lacolonne. On lave ensuite la colonne avec un tampon concentration accrue d'équilibrage avec uned'isopropanol. On élue le produit avec un tampond'élution (tampon de base Tris à haute teneur enisopropanol) et on recueille en une seule fractionselon le profil d'élution directeur. c) Chromatographie sur Ultrogel d'hydroxyapatite L'Ultrogel d'hydroxyapatite (Biosepra) consiste enhydroxyapatite qui est incorporée dans une matriced'agarose pour améliorer ses propriétés mécaniques.L'EPO a une affinité à 1 ' hydroxyapatite et peut doncêtre élevé à de plus faibles concentrations dephosphate que les impuretés protéiques.
On remplit la colonne avec de 30 à 40 litresd'Ultrogel d'hydroxyapatite et on la régénère avec untampon phosphate de potassium/chlorure de calcium etNaOH suivi par un tampon de base Tris. On l'équilibrealors avec un tampon de base Tris contenant un faiblequantité, d'isopropanol et de chlorure de sodium.
On charge 1 ' EPO contenant l'éluat de lachromatographie sur butyl Toyopearl dans la colonne.Ensuite, on lave la colonne avec un tampond'équilibrage et un tampon de base Tris sansisopropanol ni chlorure de sodium. On élue le produitavec un tampon de base Tris contenant un faibleconcentration de phosphate de potassium et on le 35 24 011442 recueille en une seule fraction selon le profild'élution directeur. d) HPLC à phases inversées sur Vydac C4
Le matériau de RP-HPLC Vydac C4 (Vydac) consiste 5 en particules de gel de silice dont les surfacesportent des chaînes alkyle en C4. La séparation de11EPO d'avec les impuretés protéiques se fonde sur desdifférences de forces d'interactions hydrophobes. Onprocède à l'élution avec un gradient d'acétonitrile 10 dans l'acide trifluoroacétique dilué.
On conduit l'HPLC préparative en utilisant une colonne d'acier inoxydable (remplie de 2,8 à 3,2 litres(gel de silice Vydac C4) . On acidifie l'éluatd'Ultrogel d'hydroxyapatite en ajoutant de l'acide 15 trifluoroacétique et on l'introduit dans la colonne deVydac C4. Pour le lavage et l'élution, on utilise ungradient d'acétonitrile dans l'acide trifluoroacétiquedilué. On recueille les fractions et on les neutraliseimmédiatement avec un tampon phosphaté. On rassemble 20 les fractions d'EPO qui sont dans les limites de l'IPC. e) Chromatographie sur DEAE Sepharose
Le matériau DEAE Sepharose (Pharmacia) consiste engroupes diéthyl aminoéthyle (DEAE) qui sont liés defaçon covalente à la surface de perles de Sepharose. La 25 liaison de l'EPO aux groupes DEAE se fait par lamédiation d'interactions ioniques. L'acétonitrile etl'acide trifluoroacétique passent à travers la colonnesans être retenus. Après que ces substances aient étéenlevées par lavage, on retire les traces d'impuretés 30 en lavant la colonne avec un tampon d'acétate à unfaible pH. Ensuite, on lave la colonne avec un tamponphosphaté neutre et on élue l'EPO avec un tampon deforce ionique croissante.
On remplit la colonne de DEAE Sepharose à 35 écoulement rapide. On ajuste le volume de colonne pour 25 011442
assurer une charge d'EPO comprise entre 3 et 10 mg/mld'EPO/ml de gel. On lave la colonne avec de l'eau et untampon d'équilibrage (phosphate de sodium/potassium).On introduit la fraction rassemblée de l'éluat d'HPLC 5 et on lave la colonne avec un tampon d'équilibrage. Onlave ensuite la colonne avec un tampon de lavage(tampon d'acétate de sodium) puis on lave avec untampon d'équilibrage. Ensuite, on dilue 1ΈΡ0 de lacolonne avec un tampon d'élution (chlorure de sodium, 10 phosphate de sodium/potassium) , et on le recueille enune seule fraction selon le profil d'élution directeur.
On ajuste l'éluat de la colonne de DEAE Sepharoseà la conductivité spécifiée. On filtre de façon stérilela substance médicamenteuse résultante dans des flacons 15 de Teflon et on la conserve à -70°C.
EXEMPLE 2 : Pégylation de 1'EPO avec mPEG-SBA L'EPO purifié selon les produits dépourvus desérum de l'exemple 1 (EPOsf) est homogène comme on ledétermine par des procédés d'analyse et comme on le 20 voit dans le schéma d'isoformes typiques constitué de 8isoformes. Il a une activité biologique spécifique de190 000 Ul/mg comme on le détermine par le dosage de lasouris normocythémique. Le réactif de pégylationutilisé est un méthoxy-PEG-SBA, qui est un composé de 25 formule II dans laquelle R est un méthyle ; x vaut 3 ;m vaut de 650 à 750 (moyenne environ 680, correspondantà un poids moléculaire moyen d'environ 30 kDa). Réaction de pégylation A 100 mg d'EPOsf (9,71 ml d'une réserve de 10,3 30 mg/ml d'EPOsf, 5,48 pmole, on ajoute 10 ml de tampon dephosphate de potassium 0,1 M, pH 7,5, contenant 506 mgde méthoxy-PEG-SBA à 30 kDa (16,5 pmole)(commercialisépar Shearwater Polymers, Inc. Huntsville, Alabama,Etats-U) et on mélange pendant 2 heures à la 35 température ambiante (20 à 23°C). La concentration 26 011442 finale de protéine est de 5 mg/ml et le rapportprotéine : réactif PEG est de 1:3. Au bout de 2 heures,on arrête la réaction en ajustant le pH à 4,5 avec del'acide acétique glacial et on conserve à -20°C jusqu'à 5 ce que l'ensemble soit prêt pour la purification.Purification 1. Mélange conjugué : On introduit environ 28 ml de SP-SEHAROSE FF (résine échangeuse de cations sulfopropyle)dans une colonne de verre AMICON (2,2 x 7,5 cm) et on 10 équilibre avec un tampon d'acétate 20 mM, pH 4,5 à undébit de 150 ml/heure. On dilue 5 fois avec un tampond'équilibrage 6 ml du mélange réactionnel contenant 30mg de protéine et on l'applique dans la colonne. Onenlève pak lavage les matériaux non adsorbés et on élue 15 de la colonne le mélange PEG-conjugué adsorbé avec NaCl0,175 M dans le tampon d'équilibrage. On élue l'EPOsfnon modifié restant encore dans la colonne avec NaCl750 mM. On rééquilibre la colonne dans le tampon dedépart. On analyse les échantillons par SDS-PAGE et on 20 détermine leur degré de pégylation. On trouve quel'éluat de NaCl 0,175 M contient des espècesmonopégylées ainsi que des espèces dipégylées et destraces d'espèces tripégylées, tandis que l'éluat deNaCl 750 mM contient de l'EPOsf non modifié. 25 2. EPOsf di-PEG et mono-PEG: On dilue quatre fois avec le tampon le mélange de conjugués purifiés élués àpartir de la colonne dans l'étape suivante et onl'applique à nouveau dans la colonne puis on le lave:comme il est dit. On élue séparément de la colonne le 30 di-PEG-EPOsf et le mono-PEG-EPOsf avec NaCl 0,1 M etNaCl 0,175 M, respectivement. On procède à l'élutionavec Nacl 750 mM pour éluer tout EPOsf non modifiééventuellement restant.
On peut également diluer cinq fois le mélange 35 réactionnel avec le tampon d'acétate et l'appliquer sur 27 011442 la colonne de SP-Sepharose (environ 0,5 mg de protéinepar ml de gel). On lave la colonne et on élue le mono-PEG-EPOsf, le di-PEG-EPOsf et l'EPOsf non modifiéadsorbés comme il est dit dans la section précédente. 5 Résultats
On synthétise le PEG EPOsf en conjuguantchimiquement une molécule de PEG linéaire ayant unpoids moléculaire moyen en nombre de 34 kDa. Le PEG-EPOsf dérive de la réaction entre les groupes amino 10 primaires d'EPOsf et le dérivé ester succinimidyliqued'un acide PEG butyrique à 30 kDa aboutissant à uneliaison amide.
Les résultats sont résumés au tableau 1. Lemélange conjugué purifié se compose de mono- et de di- 15 PEG EPOsf et est dépourvu d'EPOsf non modifié, comme onle détermine par une analyse SDS-PAGE. Le mélangeconjugué représente 23,4 mg, soit 78 %, du produit dedépart. La séparation par chromatographie échangeuse decations du mono- d'avec le di-PEG-EPOsf indique que le 20 rapport du mono- au di-PEG dans le mélange conjugué estd'environ 1:1. Après la fin de la réaction, le rapportdes composants individuels de mono:di non modifié estde 40:38:20 (%). Le rendement global est presque quantitatif. 25
Tableau 1. Résumé des résultats de la pégylationd'EPOsf
Echantillon Protéine (mg) Rendement (%) Mélange de rxn 30 100 Mono- 12,0 40 di- 11,4 38 Non mod. 6, 0 20 Mélange de conjugués 23,4 78 28 011442
EXEMPLE 3 : Pégylation d'EPO avec mPEG-SPA
On fait réagir une fraction différente de l'EPOsfdiffusée dans l'exemple 2 avec 30 kDa de méthoxy-PEG-SPA (Shearwaters Polymers, Inc., Huntsville, Alabama, 5 Etats-Unis). On conduit la réaction avec un rapportprotéine : réactif de 1:2, et les techniques depurification sont conformes à l'exemple 2. On produitprincipalement l'espèce monopégylée. EXEMPLE 4 : Activité in vivo de 1 ' EPO pégylé déterminée10 par le dosage chez la souris normocythémique
Le dosage chez la souris normocythémique est connuchez le spécialiste (Pharm. Europa Spec. IssueErythropoietin BRP Bio 1997(2)) et un procédé dans lamonographie de l'érythropoïétine du BRP de la 15 Pharmacopée européenne. On dilue les échantillons avecSAB-STP. On administre par voie sous-cutanée à dessouris normales en bonne santé âgées de 7 à 15 semaines0,2 ml de la fraction d'EPO contenant l'EPO non pégyléou l'EPO tri-, di- ou monopégylée de l'exemple 2 ou 3. 20 Pendant une période de 6 jours, on prélève le sang enponctionnant la veine caudale et on le dilue de manièrequ'un μΐ de sang soit présent dans 1 ml d'une solutionde coloration à l'orange d'acridine à 0,15 pmole. Ladurée de coloration est de 3 à 10 minutes. On effectue 25 les décomptes de réticulocytes par microfluorométriedans un cytomètre à flux par analyse de 1 ' histogrammede fluorescence rouge. On donne les décomptes deréticulocytes en termes de chiffres absolus (pour:30 000 cellules sanguines analysées). Pour les données 30 présentées, chaque groupe consiste en 5 souris parjour, et l'on ne saigne chaque souris qu'une fois.
Dans des expériences séparées, on administre à dessouris une seule dose d'EPO non modifié (25 ng d'EPO),le mélange PEG(SBA)-EPO de l'exemple 2 (10 ng de 35 conjugué), les EPO mono- et dipégylés de l'exemple 2 29 011442 (10 ng de conjugué), le PEG(SPA)-EPO de l'exemple 3 (10ng de conjugué) , et une solution tampon. Ces résultatssont représentés au tableau 2. Ces résultats montrentl'activité supérieure et la demi-vie prolongée de 5 l'espèce EPO pégylée indiquée par des quantitéssignificativement accrues de réticulocytes et par ledéplacement du décompte maximum de réticulocytes enutilisant la même dose par souris (10 ng), parcomparaison avec une dose de 25 ng pour 1ΈΡ0 non 10 modifiée. TABLEAU 2 EPO (non modifié ) 30 kDa de SPA PEG Mono 30 K SBA Di 30 K SBA Mélange conju- gué PEG-EPO SBA Tampon témoin 72 h 1000 1393 1411 994 1328 857 96 h 500 1406 1501 926 1338 697 120 h «200 1100 1182 791 944 701 144 h «0 535 607 665 660 708 15 20 EXEMPLE 5 : Préparation de mono-PEG-EPO prédominantRéaction de pégylation
En commençant avec 100 mg (5,48 pmole) d'EPOsfdans un tampon de phosphate de potassium 100 mM à pH5,5 préparé selon l'exemple 1, on ajoute 329 mg (10,96pmole) de réactif PEG-SBA à 30 kDa dissous dans 3 mld'HCl 1 N. On ajoute suffisamment de tampon dephosphate de potassium 100 mM à pH 7,5 pour compléterle volume de la réaction à 20 ml. La concentrationfinale de protéines est de 5 mg/ml et le rapportprotéine : réactif de PEG est de 1:2. On malaxe lemélange réactionnel pendant 2 heures à la températureambiante (20-22°C). Au bout de 2 heures, on arrête la 25 30 011442 réaction en ajustant le pH à 4,5 avec de l'acideacétique glacial et on conserve à l'état congelé à-20°C jusqu'à ce qu'elle soit prête pour lapurification. 5 Purification
On dilue le mélange réactionnel de l'étapeprécédente à 1:5 avec de l'acétate de sodium 10 mM, pH7,5, et on l'applique à 300 ml de SP-Sepharose FF(résine échangeuse de cations sulfopropyle) versé dans 10 une colonne de 4,2 x 19 cm. On équilibre au préalablela colonne avec le même tampon. On suit les effluentsde la colonne à 200 nm avec un moniteur Gilson UV et onenregistre avec un appareil Kipp et Zonen. On lave lacolonne avec 300 ml ou un volume de lit de tampon 15 d'équilibrage pour enlever l'excès de réactifs, desous-produits de réaction et de PEG-EPO oligomères.Ensuite, on lave avec 2 volumes de NaCl 100 mM pourretirer le di-PEG-EPO. On élue alors le mono-PEG-EPOavec 200 ml de NaCl. Au cours de l'élution du mono-PEG- 20 EPO, on jette les 50 premiers ml du pic protéique et onrecueille le mono-PEG-EPO sous la forme d’une fractionde 150 ml. On élue l'EPOsf non modifié restant sur lacolonne avec NaCl 750 mM. Tous les tampons d'élutionsont préparés dans le tampon d'équilibrage. On analyse 25 tous les échantillons élus par SDS-PAGE et parchromatographie d'exclusion de taille (SEC) hauteperformance. On concentre alors la masse de mono-PEGEPO obtenue à partir de la fraction de 150 ml, qui n'apas d'EPOsf non modifié détectable, à environ 4,5 à 7,5 30 mg/ml et on effectue une diafiltration dans le tamponde stockage, phosphate de potassium 10 mM, NaCl 100 mM,pH 7,5. On effectue une concentration/diafiltrationavec un système Millipore Labscale™ TFF équipé d'unemembrane Millipore Pellicon XL Biomax 50 d'un seuil de 35 50 kDa à la température ambiante. On filtre de façon 31 011442 stérile le mono-PEG-EPO concentré et on le concentrecongelé à -20°C.
On pégyle environ 75 % d'EPOsf. Après purification, le rendement total est d'environ 30 % de 5 mono-PEG-EPO sans EPOsf non modifié détectable, etd'environ 25 % de di-PEG-EPO. Les oligomères et 1'EPOsfnon pégylé représentent la protéine restante. La massede mono-PEG-EPO obtenue à partir de la fraction de 150ml contient environ 90 % de mono-PEG-EPO et environ 10 10 % de di-PEG-EPO. 32 011442
LISTES DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES (i) TITULAIRE : (A) NOM : F. Hoffmann-La Roche . (B) RUE : 124 Grenzacherstrasse (C) VILLE : Bâle (E) PAYS : Suisse 10 15 (F) CODE POSTAL (ZIP) : CH-4070 (G) TELEPHONE : (61) 688 11 11 (H) TELEFAX : (61) 688 13 95 (I) TELEX : 962 292 hlr ch (ii) TITRE DE L'INVENTION : Conjugués d'érythropoïétine (iii) NOMBRE DE SEQUENCES : 3 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR : (A) TYPE DE SUPPORT : Disquette
(B) ORDINATEUR : Compatible IBM PC
(C) SYSTEME D'EXPLOITATION : WORD (D) LOGICIEL : Patentln Release 2.0 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 165
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1
Al a 1 Pro Pro Arg Leu5 Ile Cys Asp Ser Arg Val10 Leu Glu Arg Tyr 15 Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 33 011442
Gly Ala Gin 115 Lys Glu Ala Ile Ser 120 Pro Pro Asp Ala Ala 125 Ser Ala Ala Pro Leu 130 Arg Thr Ile Thr Ala 135 Asp Thr Phe Arg Lys 140 Leu Phe Arg Val Tyr 145 Ser Asn Phe Leu Arg 150 Gly Lys Leu Lys Leu 155 Tyr Thr Gly Glu Ala 160 Cys Arg Thr Gly Asp 165 <210> 2 <211> 166
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Arg Leu 5 Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Ala 1 Pro Pro 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gin Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165
<210> 3<211> 28<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg 1 5 10 15 Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gin 20 25

Claims (29)

  1. 34 011442 REVENDICATIONS
    1. Conjugué, ledit conjugué comprenant une glycoprotéine d'érythropoïétine ayant au moins ungroupe amino libre et ayant l'activité biologique invivo consistant à déclencher, sous l'action descellules de moelle osseuse, l'augmentation de la 10 production de réticulocytes et d'érythrocytes, etchoisie dans le groupe constitué par l'érythropoïétinehumaine et ses analogues qui ont la séquence del'érythropoïétine humaine modifiée par addition de 1 à6 sites de glycosylation ou une transposition d'au 15 moins un site de glycosylation ; ladite glycoprotéineétant liée de façon covalente à "n" groupespoly(éthylène glycol) de formule -CO- (CH2) x- (OCH2CH2) m-OR 20 le -CO de chaque groupe poly(éthylène glycol) formantune liaison amide avec l'un desdits groupes amino ; oùR est un alkyle inférieur ; x vaut 2 ou 3 ; 25 m vaut d'environ 450 à environ 900 ;n vaut de 1 à 3 ; et n et m sont choisis de manière que le poids moléculairedu conjugué diminué de celui de la glycoprotéineérythropoïétine soit compris entre 20 kD et 100 kD.
  2. 2. Conjugué de la revendication 1 de formule : P- [NHCO- (CH2) x- (OCH2CH2) m-0R) n (I) dans laquelle x, m, n et R sont tels que définis dans 35 la revendication 1 et P est le résidu d'une 35 011442 glycoprotéine sans le ou les groupes n amino quiforment une ou plusieurs liaison(s) amide avec le oules groupe(s) polyéthylène glycol.
  3. 3. Conjugué de l'une quelconque des revendications 5 précédentes, dans lequel R est un méthyle.
  4. 4. Conjugué de l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel m vaut d'environ 650 à environ750.
  5. 5. Conjugué selon l'une quelconque des revendications 10 précédentes, dans lequel n vaut 1.
  6. 6. Conjugué selon l'une quelconque des revendicationsprécédentes, dans lequel R est un méthyle, m vautd'environ 650 à environ 750 et n vaut 1.
  7. 7. Conjugué de l'une quelconque des revendications 15 précédentes ayant la formule [CH3O (CH2CH2O) mCH2CH2CH2CO-NH] n-P dans laquelle m vaut de 650 à 750, n vaut 1 et P est 20 tel que défini dans la revendication 1.
  8. 8. Conjugué de l'une quelconque des revendicationsprécédentes, dans lequel la glycoprotéine est uneérythropoïétine humaine.
  9. 9. Conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 25 à 7, dans lequel la glycoprotéine d'érythropoïétine humaine est exprimée par activation de gènes endogènes.
  10. 10. Conjugué selon l'une quelconque des revendications1 à 9, dans lequel la glycoprotéine a la séquence SEQID NO:1.
  11. 11. Conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel la glycoprotéine a la séquence del'érythropoïétine humaine modifiée par addition de 1 à6 sites de glycosylation.
  12. 12. Conjugué selon l'une quelconque des revendications 35 là 11, dans lequel la glycoprotéine a la séquence 36 011442 d'érythropoïétine humaine modifiée par une modificationchoisie dans un groupe comprenant : Asn30Thr32 ; 5 Asn51Thr53 ; Asn57Thr59 ; Asn69 ; Asn69Thr71 ; Val87Asn88Thr90 ; 10 Ser87Asn88Thr90 ; Ser87Asn88Gly89Thr90 ; Ser87Asn88Thr90Thr92 ; Ser87Asn88Thr90Ala162 ; Asn69Thr71Ser87Asn88Thr90 ; 15 Asn30Thr32Val87Asn88Thr90 ; Asn89Ile90Thr91 ; Ser87Asn89Ile90Thr91 ; Asn136Thr138 ; Asn138Thr140 ; 20 Thr125 ; etPro124Thr125.
  13. 13. Conjugué selon l'une quelconque des revendicationsl à 12, dans lequel la glycoprotéine a la séquence 25 comprenant la séquence d'érythropoïétine humaine et uneseconde séquence à la terminaison carboxy de laséquence d'érythropoïétine humaine, dans laquelle laseconde séquence contient au moins un site deglycosylation.
  14. 14. Conjugué de la revendication 13, dans lequel les secondes séquences comprennent une séquence dérivée dela séquence carboxy terminale de gonadotropinechorionique humaine. 37 011442 10 15 20 25 30
  15. 15. Conjugué de la revendication 13, dans lequel laglycoprotéine a la séquence choisie dans le groupecomprenant : (a) La séquence d'érythropoïétine humaine et laséquence SEQ ID NO: 3 à la terminaison carboxy de laséquence d'érythropoïétine humaine ; (b) la séquence de (a) modifiée par Ser87 Asn88 Thr90 ;et (c) la séquence en (a) modifiée par Asn30 Thr32 Val87Asn88 Thr90.
  16. 16. Conjugué selon l'une quelconque des revendications1 à 7, dans lequel la glycoprotéine a la séquence del'érythropoïétine humaine modifiée par unetransposition d'au moins un site de glycosylation.
  17. 17. Conjugué de la revendication 16, dans lequel leréarrangement comprend une délétion de l'un quelconquedes sites de glycosylation à liaison N dansl'érythropoïétine humaine et l'addition d'un site deglycosylation liés à l'azote en position 88 de laséquence d'érythropoïétine humaine.
  18. 18. Conjugué de la revendication 17, dans lequel laglycoprotéine a la séquence de l'érythropoïétinehumaine modifiée par une modification choisie dans legroupe comprenant : Gin24 Ser87 Gin38 Ser87 Gin83 Ser87 Asn88 Thr90Asn88 Thr90Asn88 Thr90 et
  19. 19. Composition comprenant des conjugués, chacundesdits conjugués comprenant une glycoprotéined'érythropoïétine ayant au moins un groupe amino libreet ayant l'activité biologique in vivo consistant àfaire déclencher par les cellules de moelle osseuse uneaugmentation de la production de réticulocytes etd'érythrocytes, et choisis dans le groupe constitué par 35 38 011442 l'érythropoïétine humaine et ses analogues qui ont laséquence de l'érythropoïétine humaine modifiée parl'addition de 1 à 6 sites de glycosylation ou unetransposition d'au moins un site de glycosylation ; 5 ladite glycoprotéine étant liée de façon covalente à"n" groupes poly(éthylène glycol) de formule CO-(CH2)X-(OCH2CH2) m-OR, le -CO (c'est-à-dire carbonyle) de chaquegroupe poly(éthylène glycol) formant une liaison amideavec l'un desdits groupes amino ; où R est un alkyle 10 inférieur ; x vaut 2 ou 3 ; m vaut environ 450 àenviron 900 ; n vaut de 1 à 3 et n et m sont choisisde manière que le poids moléculaire de chaque conjuguédiminué de celui de la glycoprotéine érythropoïétinesoit compris entre 20 kDaltons et 100 kDaltons ; le 15 pourcentage de conjugués dans lesquels n vaut 1 estd'au moins 90 %.
  20. 20. Composition comprenant des conjugués tels quedéfinis dans l'une quelconque des revendications 1 à18, dans laquelle le pourcentage de conjugués dans 20 lesquels n vaut 1 est d'au moins 90 %.
  21. 21. Composition selon les revendications 19 ou 20 danslaquelle le pourcentage de conjugués dans lesquels nvaut 1 est d'au moins 92 %.
  22. 22. Composition de la revendication 21, dans laquelle 25 le pourcentage de conjugués dans lesquels n vaut 1 est d'au moins 96 %.
  23. 23. Composition de la revendication 19 ou 20, danslaquelle le pourcentage de conjugués dans lesquels nvaut 1 est compris entre 90 % et 96 %.
  24. 24. Composition pharmaceutique comprenant un conjugué ou une composition selon l'une quelconque desrevendications 1 à 23 et un excipientpharmaceutiquement acceptable.
  25. 25. Utilisation d'un conjugué ou d'une composition 35 selon l'une quelconque des revendications 1 à 23, pour 39 011442 La préparation de médicaments pour le traitement ou la prophylaxie desmaladies liées à une anémie chez les malades souffrant d’insuffisance rénalechronique (CRF), du SIDA et pour le traitement des cancéreux en cours dechimiothérapie.
  26. 26. Procédé de préparation de composés selon Time quelconque des revendications 1 à 23 qui comprend la condensation du composé de formule Π RO(CH,CH2O) (CHJCOON
    (Π) 10 avec une glycoprotéine d’érythropoïétine et dans laquelle R, m et x sont tels quedéfinis dans l’une quelconque des revendications 1 à 6.
  27. 27. Composés selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, préparés par leprocédé de la revendication 27.
  28. 28. Composés selon l’une quelconque des revendications 1 à 23 pour le15 traitement des maladies associées à une anémie pour les patients souffrant d’insuffisance rénale chronique (CRF), du SIDA, et de cancers traités parchimiothérapie.
  29. 29. Nouveaux composés, procédés et méthodes utilisés ainsi qu’utilisation de telscomposé substantiellement décrits ci-dessus.
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