RS49928B - Derivati eritropoetina - Google Patents

Derivati eritropoetina

Info

Publication number
RS49928B
RS49928B YUP-407/00A YUP40700A RS49928B RS 49928 B RS49928 B RS 49928B YU P40700 A YUP40700 A YU P40700A RS 49928 B RS49928 B RS 49928B
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
glycoprotein
sequence
erythropoietin
conjugate
group
Prior art date
Application number
YUP-407/00A
Other languages
English (en)
Inventor
Pascal Sebastian Bailon
Original Assignee
F.Hoffmann-La Roche Ag.,
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27495518&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS49928(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by F.Hoffmann-La Roche Ag., filed Critical F.Hoffmann-La Roche Ag.,
Publication of YU40700A publication Critical patent/YU40700A/sh
Publication of RS49928B publication Critical patent/RS49928B/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C07K17/08—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Konjugat, naznačen time što obuhvata eritropoetin glikoprotein koji ima najmanje jednu slobodnu amino grupu i ispoljava in viva biološku aktivnost uzrokovanja povećane produkcije retikulocita i eritrocita u ćelijama koštane srži i izabran je iz grupe koja se sastoji od humanog eritropoetina i humanog eritropoetina modifikovanog adicijom od 1 do 6 mesta glikozilacije ili rearanžmanom najmanje jednog mesta glikozilacije; pri čemu je navedeni glikoprotein kovalentno vezan za"n" poli(etilen glikol) grupe formule-CO-(CH2)X-(OCH2CH2)m –OR s tim da -CO svake poli(etilen glikol) grupe formira amidnu vezu sa jednom od navedenih amino grupa; gde R je C1-C6-alkil x je 2 ili 3; m je od 450 do 900; n je od 1 do 3; I n i m su izabrani tako da molekulska težina konjugata bez eritropoetin glikoproteina iznosi od 20 kilodaltona do 100 kilodaltona. Prijava ima 5 nezavisnih i 19 zavisnih zahteva.

Description

OSNOVA PREDMENTOG PRONALASKA
Eritropoeza predstavlja proces nastanka crvenih krvnih zrnaca, koji se dešava kako bi se kompenzovao gubitak ovih ćelija usleđ destrukcije. Eritropoeza je kontrolisani fiziološki mehanizam koji obezbeđuje dovoljan broj eritrocita za adekvatnu oksigenaciju tkiva. Prirodni humani eritropoetin (hEPO), koji nastaje u bubrezima je humoralni faktor plazme koji stimuliše produkciju crvenih krvnih zrnaca (Carnot P. i Deflandre C (1906) C.R. Acad Sci. 143: 432, Erslev AJ (1953Blood8:349; Reissmann, KR (1950) Blood 5:372; Jacobson, LO, Goldwasser, E., Freid, W. i Plzak, LF. (1957) Nature 179: 6331-4). Prirodni EPO stimuliše deobu i diferencijaciju predodređenih eritroidnih progenitorskih ćelija u koštanoj srži i ostvaruje svoju fiziološku aktivnost vezujući se za receptore na eritroidnim prekursorima (Krantz, BS. (1991) Blood 77: 419).
Eritropoetin je proizveden biosintetički, primenom tehnologije rekombinantne DNK (Egrie, JC, Strickland, TW, Lane J. i sar. (1986) Immunobiol. 72: 213-224) i to je proizvod kloniranog humanog EPO gena ugrađenog i eksprimiranog ćelijama ovarijalnog tkiva kineskog hrčka (CHO ćelije). Primarna struktura preovladavajuće, potpuno obrađene forme hEPO ilustrovana je u SEQ ID NO:l. Postoje dva disulfidna mosta između Cys<7->Cys'<61>i Cys<2>9-Cys3<3>. Molekulska težina polipeptidnog lanca EPO, bez ugljeno-hidratnog dela, iznosi 18 236 D. U intaktnom EPO molekulu, oko 40% molekulske težine otpada na ugljeno-hidratne grupe koje glikolizuju protein na mestima glikolizacije (Sasaki, H, Bothner, B, Dell, A. i Fukuda, M. (1987) J. Biol. Chem. 262: 12059).
S obzirom daje eritropoetin neophodan za formiranje crvenih krvnih ćelija, ovaj hormon se može primeniti u terapiji poremećaja krvi koji se odlikuju smanjenom ili defektnom produkcijom eritrocita. Klinički, EPO se primenjuje u terapiji anemija kod pacijenata koji boluju od hronične renalne insuficijencije (CRF)
(Eschbach, JW, Egri, JC, Dovvning, MR i sar. (1987) NEJM 316: 73-78; Eschbach, JW, Abdulhadi, MH, Browne, JK, i sar. (1989) Ann. Intern. Med. 111: 992; Egrie, JC, Eschbach, JW, McGuire, T, Adamson, JW (1988) Kidney Intl. 33: 262; Lim, VS, Degowin, RL, Zavala, D i sar. (1989) Ann. Intern. Med. 110: 108-114), kao i kod pacijenata od AIDS i kancera koji primaju hemoterapiju (Danna, RP, Rudnick, SA, Abels, RI, U: MB Garnick , ur. Erythropoietin in Clinical Applications - An International Perspective. New York, NY: Marcel Dekker; 1990: str. 301-324). Ipak, biološka dostupnost komercijalnih proteinskih terapeutika kao što je EPO ograničena je njihovim kratkim polu-životom u plazmi i usled podložnosti degradaciji proteazama. Ove mane onemogućavaju im da postignu maksimalnu kliničku potenciju.
SAŽETAK PREDMETNOG PRONALASKA
Predmetni pronalazak obezbeđuje konjugat eritropoetina, koji konjugat sadrži eritropoetin glikoprotein sa najmanje jednom slobodnom amino-grupom i koji ispoljavain vivobiološku aktivnost koja uzrokuje povećanje produkcije retikulocita i eritrocita u ćelijama koštane srži, pri čemu je konjugat izabran iz grupe koja se sastoji od humanog eritropoetina i njegovih analoga, koji poseduju sekvencu humanog eritropoetina modifikovanog adicijom od jednog do šest mesta glikolizacije ili rearanžmanom najmanje jednog mesta glikolizacije; pri čemu je glikoprotein kovalentno vezan za "n" poli(etilen glikol) grupe formule CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR, u kojoj -CO (tj. karbonil) svake poli(etilen glikol) grupe formira amidnu vezu sa jednom od navedenih amino-grupa; gde je R niži alkil; x je 2 ili 3; m je od oko 450 do 900; nje od 1 do 3; a n i m se biraju tako da molekulska težina konjugata bez glikoprotein eritropoetina iznosi od 20 kilodaltona do 100 kilodaltona. Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje kompozicije koje sadrže ovde opisane konjugate u kojima je procentni sastav konjugata u kompoziciji u kojoj je n jednako 1 najmanje 90 procenata.
U poređenju sa nemodifikovanim EPO (tj. EPO bez vezanog PEG) i konvencionalnim PEG-EPO konjugatima, predmetni konjugati imaju povećani polu-život u cirkulaciji i vreme zadržavanja u plazmi, smanjeni klirens i povećanu kliničku aktivnostin vivo.Konjugati iz predmetnog pronalaska imaju istu primenu kao EPO. Konkretno, konjugati iz predmetnog pronalaska se primenjuju u tretmanu pacijenata, stimulisanjem deoba i diferencijacije predodređenih eritroidnih progenitroskih ćelija u koštanoj srži, na isti način kao što se EPO primenjuje u tretmanu pacijenata.
DETALJAN OPIS PREDMETNOG PRONALSKA
Predmetni pronalazak obezbeđuje konjugate, koji konjugati sadrže eritropoetin glikoprotein sa najmanje jednom slobodnom amino grupom i sa biološkom aktivnošćuin vivokoja uzrokuje povećanu produkciju retikulocita i eritrocita u ćelijama koštane srži, a izabrani su iz grupe koja se sastoji od humanog eritropoetina i njegovih analoga koji poseduju sekvencu humanog eritropoetina modifikovanu adicijom od 1 do 6 mesta glikolizacije ili rearanžiranjem najmanje jednog mesta glikolizacije; pri čemu je pomenuti glikoprotein kovalentno vezan za "n" poliCetilen glikol) grupe formule - CO-(CH2),-(OCH2CH2)«-OR, pri čemu je - CO (tj. karbonil) svake poli(etilen glikol) grupe formira amidnu vezu sa jednom od amino grupa; gde je R niži alkil; x je 2 do 3; m je od oko 450 do 900; nje od 1 do 3; a n i m su izabrani tako da molekulska težina konjugata bez eritropoetin glikoproteina iznosi od 20 do 100 kilodaltona.
Uočeno je da se konjugati iz predmetnog pronalaska mogu primeniti na isti način kao nemodifikovani EPO. Ipak, konjugati predmetnog pronalaska imaju povećani polu-život u cirkulaciji i vreme zadržavanja u plazmi, smanjeni klirens i povećanu kliničku aktivnostin vivo.Zbog ovih boljih svojstava, konjugati iz predmetnog pronalaska mogu se primenjivati jednom nedeljno, umesto tri puta nedeljno, kao što je to slučaj sa nemodifikovanim EPO. Očekuje se da smanjena učestalost primene rezultira povećanom saradnjom pacijenata, što uslovljava bolji rezultat tretmana, kao i poboljšanje kvaliteta života pacijenata. Upoređivanjem sa konvencionalnim EPO vezanim za poli(etilen glikol), utvrđeno je da konjugati sa molekulskom težinom i veznom strukturom konjugata iz predmetnog pronalaska imaju povećanu potenciju, stabilnost, AUC, polu-život u cirkulaciji i ekonomičnost.
Konjugati u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu se dati pacijentima u terapeutski efektivnoj količini na isti način kako se primenjuje EPO. Terapeutski efektivna količina je količina konjugata neophodna zain vivobiološku aktivnost koja uzrokuje povećane produkcije retikulocita i eritrocita u ćelijama koštane srži. Tačna količina konjugata je stvar izbora i zavisi od faktora kao što su precizan tip stanja koje se tretira, stanje pacijenta koji se tretira, kao i drugi sastojci kompozicije. Na primer, može se primeniti 0.01 do 10 p.g po kilogramu telesne težine, poželjno 0.1 do 1 |Ag po kilogramu telesne težine, na primer jednom nedeljno.
Farmaceutske kompozicije koje sadrže konjugate mogu se formulisati u jačini koja je efikasna za različite načine primene pacijentima koji boluju od poremećaja krvi koji se karakterišu niskom ili defektnom produkcijom eritrocita. Prosečne terapeutski efektivne količine konjugata mogu varirati i trebalo bi da budu zasnovane na preporuci ili receptu kvalifikovanog lekara.
Proizvodi eritropoetin glikoproteini pripremljeni u skladu sa ovim pronalaskom mogu se pripremiti u obliku farmaceutskih kompozicija pogodnih za injekciju sa farmaceutski pogodnim nosačem, primenom metoda poznatih u nauci. Na primer, odgovarajuće kompozicije opisane su u WO97/09996, WO97/40850, WO98/58660 i WO99/07401. Među poželjnim farmaceutski prihvatljivim nosačima za formulisanje proizvoda iz predmetnog pronalaska su humani serum albumin, humani proteini plazme, itd. Jedinjenja iz predmetnog pronalaska mogu se pripremiti u 10 mM natrij um/kalij um fosfatnom puferu na pH 7, koji sadrži tonični agens, na primer, 132 mM natrijum hlorid. Po izboru, farmaceutske kompozicije mogu sadržati konzervans. Farmaceutske kompozicije mogu sadržati različite količine eritropoetina, na primer, 10 - 1000 ug/ml, na primer, 50 ug ili 400 ug.
Termin "eritropoetin" ili "EPO" odnosi se na glikoprotein sa amino kiselinskom sekvencom publikovanom u (SEQ ID NO:l) ili (SEQ ID NO: 2) ili amino kiselinskom sekvencom koja je njima suštinski homologa, čija se biološka svojstva odnose na stimulaciju produkcije eritrocita i na stimulaciju deobe i diferencijacije predodređenih eritroiđnih progenitora u koštanoj srži. Kao što je ovde primenjeno, ovi termini uključuju namerno mođifikovane proteine, na primer, mutagenezom usmerenom prema određenom mestu na proteinu (engl. site-đirected mutagenesis) ili mođifikovane slučajnim mutacijama. Ovi termini takođe obuhvataju analoge koji sadrže od 1 do 6 dodatnih mesta glikolizacije, analoge sa najmanje jednom dodatnom amino-kiselinom na karboksi kraju glikoproteina, pri čemu dodatna amino kiselina sadrži najmanje jedno mesto glikolizacije, i analoge sa amino kiselinskom sekvencom koja sadrži rearanžman najmanje jednog mesta glikolizacije. Ovi termini obuhvataju kako prirodni, tako i rekombinantno proizvedeni humani eritropoetin.
Konjugati eritropoetina iz predmetnog pronalaska mogu se predstaviti Formulom 1:
u kojoj su x, m, n i R kao Što je gore opisano. U Formuli I, P je ostatak glikoproteina eritropoetina već opisanog (tj. bez amino grupe ili amino grupa koje formiraju amidnu vezu sa karbonilom pokazanim u Formuli I), koji ispoljavain vivobiološku aktivnost, koja uzrokuje povećanu produkciju retikulocita i eritrocita u ćelijama koštane srži.
U poželjnom obliku izvođenja predmetnog pronalaska R je metil grupa. Poželjno je da je m od oko 650 do oko 750, a n je poželjno 1.
U najpoželjnijem obliku izvođenja predmetnog pronalaska, R je metil grupa, m je od oko 650 do oko 750, a nje 1, tj konjugat, kao što je već opisan ima formulu
[CH3O(CH2CH20)mCH2CH2CH2C0-NH]n-P
gde je m od oko 650 do 750, nje 1, a P je kao Što je gore opisano. Poželjno je da je prosečna vrednost m oko 680.
Poželjno je daje prethodno đefinisani glikoprotein konjugata, humani eritropoetin. Humani eritropoetin i njegovi analozi, kao što je to ovde opisano, mogu biti eksprimirani aktivacijom endogenog gena. Poželjni humani eritropoetin glikoproteini su oni sa SEQ ID NO:l i SEQ ID NO:2, najpoželjniji sa sekvencom
SEQ ID NO:l.
Dalje, P se može izabrati iz grupe koja se sastoji od ostataka humanog eritropoetina i njegovih analoga, a koji sadrže od 1 do 6 dodatnih mesta za glikolizaciju. Kao što će to kasnije biti detaljno opisano, priprema i prečišćavanje EPO su poznati u nauci. Pod EPO se misli na prirodni ili rekombinovani protein, poželjno humani, dobijen iz bilo kog konvencionalnog izvora, kao što su tkiva, proteinskom sintezom, u ćelijskoj kulturi sa prirodnim ili rekombinovanim ćelijama. Obuhvaćeni su svi proteini koji poseduju aktivnost EPO, kao što su muteini, ili na drugi način modiflkovani proteini. Rekombinantni EPO može se proizvesti ekspresijom u CHO-, BHK- ili HeLa ćelijskim linijama, tehnologijom rekombinantne DNK ili aktivacijom endogenog gena. Ekspresija proteina, uključujući i EPO, aktivacijom endogenog gena, dobro je poznata u nauci i opisana je na primer, u U.S. patentima br. 5,733,761, 5,641,670 i 5,733,746 i u međunarodnim patentnim publikacijama br. WO93/09222, WO94/12650, WO95/31560, WO90/11354, WO91/06667 i W091/09955, pri čemu je sadržaj svakog od navedenih patenata inkorporiran u sadržaj predmetnog pronalaska putem referenci. Poželjna EPO vrsta za pripremu glikoproteina eritropoetinskih proizvoda je humana EPO vrsta. Još poželjnije, EPO vrsta je humani EPO sa amino kiselinskom sekvencom predstavljenom u SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2, poželjnije amino kiselinska sekvenca SEQ ID NO:l.
U jednom obliku izvođenja, P može biti ostatak glikoproteinskog analoga koji sadrži od 1 do 6 dodatnih mesta za glikolizaciju. Glikolizacija proteina, sa jednom ili više oligosaharidnih grupa, odigrava se na specifičnim mestima duž polipeptidnog kostura i u velikoj meri utiče na fizička svojstva proteina, kao što su stabilnost proteina, sekrecija, subcelularna lokalizacija i biološka aktivnost. Obično postoje dva tipa glikolizacije. O-vezani oligosaharidi su prikačeni za serinske ili treoninske ostatke i N-vezani oligosaharidi, koji su vezani za ostatke asparagina. Jedan tip oligosaharida, nađen u formi i O-vezanih i N-vezanih oligosaharida, je N-acetilneuraminska kiselina (sijalinska kiselina), koja predstavlja familiju amino šećera sa 9 ili više ugljenikovih atoma. Sijalinska kiselina najčešće je terminalni ostatak i kod N-vezanih i kod O-vezanih oligosaharida, i s obzirom da nosi negativno naelektrisanje, ona uslovljava acidna svojstva glikoproteina. Humani eritropoetin, sa 165 amino kiselina, sadrži tri N-vezana ijedan O-vezani oligosaharidni lanac, koji čine oko 40% ukupne molekulske težine glikoproteina. N-vezana glikolizacija dešava se na ostatku asparagina koji se nalazi na pozicijama 24, 38 i 83, dok se O-vezana glikolizacija dešava na ostatku serina na poziciji 126. Oligosaharidni lanci su modifikovani terminalnim ostacima sijalinske kiseline. Enzimatsko uklanjanje svih ostataka sijalinske kiseline sa glikolizovanog eritropoetina rezultira gubitkomin vivoaktivnosti, ali nein vitroaktivnosti, jer sijalizacija eritropoetina sprečava njegovo vezivanje za hepatički vezujući protein, pa samim tim i njegov klirens.
Glikoproteini iz predmetnog pronalaska obuhvataju analoge humanog eritropoetina, sa jednom ili više promena u amino kiselinskoj sekvenci humanog eritropoetina, koje rezultiraju povećanjem broja mesta za vezivanje sijalinske kiseline. Ovi glikoproteinski analozi mogu se proizvesti usmerenom mutagenezom, adicijama, delecijama ili substitucijama amino kiselina, koje povećavaju broj ili menjaju mesta dostupna za glikolizaciju. Analozi glikoproteina koji sadrže nivo sijalinske kiseline veći od onog u humanom eritropoetinu proizvode se dodavanjem mesta za glikolizacije koja ne remete sekundarnu ili tercijarnu konformaciju potrebnu za biološku aktivnost. Glikoproteini iz predmetnog pronalaska takođe obuhvataju analoge koji pokazuju veći nivo ugljenohidratnih veza na mestu za glikolizaciju, koje obično uključuju substituciju jedne ili više amino kiselina u neposrednoj blizini N-veznih ili O-veznih mesta. Glikoproteini iz predmetnog pronalaska takođe obuhvataju analoge sa jednom ili više amino kiselina koje se pružaju iza karboksi kraja eritropoetina i koje sadrže najmanje jedno dodatno mesto glikolizacije. Glikoproteini iz predmetnog pronalaska takođe obuhvataju analoge sa amino kiselinskom sekvencom koja sadrži rearanžman najmanje jednog mesta za glikolizaciju. Ovakvi rearanžmani mesta za glikolizaciju uključuju delecije jednog ili više mesta za glikolizaciju u humanom eritropoetinu i adiciju jednog ili više mesta za glikolizaciju kojih nema u prirodnom proteinu. Povećavanje broja ugljeno-hidratnih lanaca na eritropoetinu. a time i broja molekula sijalinske kiseline po molekulu eritropoetina može pojačati korisna svojstva, kao što su povećana solubilnost, veća otpornost na proteolizu, smanjena imunogenost, povećan polu-život u serumu i povećana biološka aktivnost. Analozi eritropoetina sa dodatnim mestima glikolizacije opisani su detaljnije u evropskoj patentnoj prijavi 640 619, Elliot, publikovanoj 1. marta 1995. g.
U poželjnom obliku izvođenja, glikoproteini iz predmetnog pronalaska sadrže amino kiselinsku sekvencu koja obuhvata najmanje jedno dodatno mesto za glikolizaciju, kao što su, ali ne samo oni, eritropoetini koji sadrže sekvencu humanog eritropoetina sa modifikacijama izabranim između sledećih: Asn<30>Thr<32>;
Asn<51>Thr<53>;
Asn<57>Thr<59>:
Asn<69>;
Asn<69>Thr<71>;
Ser<68>Asn<69T>hr<7>,;
Val<87>As<n88>Thr<90>;
Ser<87>Asn<88>Thr<90>;
Ser<87>Asn<88>Gly<89>Thr<90>;
Ser<87>Asn<88>Thr90Thr<92>;
Ser<87>Asn<88>Thr90Ala<162>;
Asn<69>Thr<71>Ser<87>Asn<88>Thr<90>;
Asn<3>°Thr<32>Val<87>Asn<88>Thr<90>;
Asn<89>Il<e90>Thr<91>;
Ser<87>Asn<89>Ile<90>Thr<9>,;
Asn<136>Thr<m;>
Asn<138>Thr140;
Thr'<25>; i
Pro,<24>Thr125.
Oznake ovde korišćene za modifikacije amino kiselinske sekvence znače da su pozicije odgovarajućeg nemodifikovanog proteina (na primer, hEPO sa SEQ ID NO:l ili SEQ ID NO:2), označene brojem u superskriptu, promenjene u amino kiselinu koja neposredno prethodi odgovarajućem broju u superskriptu.
Glikoprotein može takođe biti analog sa najmanje jednom dodatnom amino kiselinom na karboksi kraju glikoproteina, gde amino kiselina sadrži najmanje jedno mesto za glikolizaciju, tj, konjugat kao stoje gore opisano, se takođe odnosi na jedinjenja gde glikoprotein ima sekvencu koja sadrži sekvencu humanog eritropoetina i drugu sekvencu na karboksi kraju sekvence humanog eritropoetina, gde druga sekvenca sadrži najmanje jedno mesto za glikolizaciju. Dodatne amino kiseline mogu sadržati peptidni fragment nastao od karboksi terminusa humanog horinskog gonadotropina. Poželjno je daje glikoprotein izabran iz grupe koja se sastoji od( a)humanog eritropoetina koji poseduje amino kiselinsku sekvencu Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro lle Leu Pro Gln (SEQ ID NO:3), koja se pruža iza karboksi kraja; (b) analoga (a) koji dodatno sadrži Ser Asn Thr EPO; i (c) analoga (a) koji dodatno sadrži Asn<30>Thr<32>Val<87>Asn88Thr<90>EPO.
Glikoprotein može takođe biti analog, sa amino kiselinskom sekvencom koja uključuje rearanžman najmanje jednog mesta za glikolizaciju. Rearanžman može sadržati deleciju jednog od N-vezanih ugljeno-hidratnih mesta u humanom eritropoetinu i adiciju N-veznog ugljeno-hidratnog mesta na poziciji 88 amino-kiselinske sekvence humanog eritropoetina. Poželjno je daje glikoprotein analog izabran iz grupe koja se sastoji od Gln<24>Ser<87>Asn<88>Thr<90>EPO; Gln<38>Ser87Asn<88>Thr9<0>EPO; i Gln83Ser87 Asn<88>Thr<90>EPO.
Termin "niži alkil" ovde je primenjen u značenju linearne ili razgranate alkil grupe koja sadrži od jedan do šest ugljenikovih atoma. Primeri nižih alkil grupa obuhvataju metil, etil i izopropil grupu. U skladu sa predmetnim pronalaskom, R je bilo koji niži alkil. Poželjni su konjugati u kojima je R metil grupa.
Simbol "m" predstavlja broj etilen oksidnih ostataka (OCH2CH2) na poli(etilen oksid) grupi. Jedinična PEG subjedinica ima molekulsku težinu od oko 44 daltona. Stoga, molekulska težina konjugata (bez molekulske težine EPO) zavisi od broja "m". Kod konjugata iz ovog pronalaska "m" je od oko 450 do oko 900 (što odgovara molekulskoj težini od oko 20 do oko 40 kDa), poželjno od oko 650 do oko 750 (što odgovara molekulskoj težini od oko 30 kDa). Broj m se bira tako da rezultujući konjugat iz ovog pronalaska ima fiziološku aktivnost približnu kao i nemodifikovani EPO, pri čemu ta aktivnost može biti jednaka, veća ili frakcija aktivnosti nemodifikovanog EPO. Molekulska težina od "oko" nekog broja znači da je ona unutar razumnog opsega oko tog broja, određeno konvencionalnim analitičkim tehnikama. Broj "m" se bira tako da molekulska težina svake poli(etilen glikol) grupe, kovalentno vezane za glikoprotein eritropoetin, iznosi oko 20 kDa do oko 40 kDa, a poželjno je daje oko 30 kDa.
Kod konjugata iz predmetnog pronalaska, broj "n" predstavlja broj polietilen glikol grupa, kovalentno vezanih amidnim vezama za slobodne amino grupe na proteinu eritropoetinu (uključujući e-amino grupe amino kiseline lizin i/ili amino-terminalnu amino grupu). Konjugat iz ovog pronalaska može imati jednu, dve ili tri PEG grupe po molekulu EPO. Broj "n" je ceo broj u opsegu od 1 do 3, a poželjno je daje "n" 1 ili 2, najpoželjnije je daje "n" jednako 1.
Jedinjenje formule I može se dobiti iz poznatog polimernog materijala:
u kojem su R i m kao što su gore opisani, kondenzovanjem jedinjenja Formule II sa glikoproteinom eritropoetinom. Jedinjenja sa Formulom II u kojima jex jednako3, su alfa-niži alkoksili, sukcinimidil estri buterne kiseline poli(etilen glikola) (niži alkoksi-PEG-SBA). Jedinjenja Formule II u kojima je * jednako 2, su alfa-niži alkoksili, sukcinimidil estri propionske kiseline poli(etilen glikola) (niži alkoksil-PEG-SPA). Može se primeniti bilo koja od konvencionalnih metoda reakcije
aktiviranog estra sa aminom kako bi se formirao amid. U gore opisanoj reakciji, sukcinimidil estar je grupa koja odlazi, kako bi se formirao amid. Primena sukcinimidil estra kao jedinjenja iz Formule II u cilju dobijanja konjugata sa proteinima, opisana je u U.S. patentu br. 5,672,662, objavljenom 30 septembra 1997.
(Harris et al.).
Humani EPO sadrži devet slobodnih amino grupa, amino-terminalnu amino grupu i s-amino grupe 8 ostataka lizina. Kada se reagens za pegilaciju (nastanak PEGkonjugata, prim. prev.)kombinuje sa SBA jedinjenjem Formule II, uočeno je da na pH 7.5, odnos protein : PEG iznosi 1:3, i da na temperaturi reakcije 20-25°C, nastaje smeša mono-, di-, i u tragovima, tri-pegilovanih molekulskih vrsta. Kada je reagens za pegilaciju SPA jedinjenja Formule II, pod sličnim uslovima osim kada je odnos protein:PEG 1:2, prevashodno nastaju mono-pegilovane molekulske vrste. Pegilovani EPO može se primeniti kao kompozicija, ili u formi različitih pegilovanih vrsta razdvojenih katjon-izmenjivačkom hromatografijom. Menjanjem uslova reakcije (na primer, odnosa reagenasa, pH, temperature, koncentracije proteina, trajanja reakcije, itd.) menjaće se relativna količina različitih pegilovanih molekulskih vrsta.
Humani eritropoetin (EPO) je humani glikoprotein koji stimuliše formiranje eritrocita. Njegova priprema i terapeutska primena opisane su detaljno, na primer, u U.S. patentu br. 5,547,933 i 5,621,080, EP-B 0 148 605, Huang, S.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 2708-2712, EP-B 0 205 564, EP-B 0 209 539 i EP-B 0 411 678, kao i kod Lai, P.H. et al. J. Biol. Chem. 261 (1986) 3116-3121; Sasaki, H. et al. ./.Biol. Chem.262 (1987) 12059-12076. Eritropoetin za terapeutske primene može se proizvesti rekombinantnim sredstvima (EP-B 0 148 605, EP-B 0 209 539 i Egrie, J.C., Strickland, T.W., Lane, J. et al. (1986) Immunobiol. 72: 213-224).
Postupci za ekspresiju i pripremu eritropoetina u medijumu bez seruma opisani su, na primer, u W096/35718, Burg, objavljenom 14. novembra 1996., i u evropskoj patentnoj publikaciji br. 513 738, Koch, objavljenoj 12. juna 1992. Osim navedenih publikacija, poznato je daje moguće sprovesti fermentaciju rekombinovanih CHO ćelija koje sadrže EPO gen, bez prisustva seruma. Ove metode su opisane na primer, u EP-A 0 513 738, EP-A 0 267 678 i uopšteno od strane Kavvamoto T. et al. Analvtical Biochem. 130 (1983) 445-453, EP-A 0 248 656, Kowar, J. i Franek, F. Methods in Enzymology 421 (1986) 277-292, Bavister, B., Expcology 271 (1981) 45-51, EP-A 0 481 791, EP-A 0 307 247, EP-A 0 343 635, WO88/00967.
U EP-A 0 267 678 opisane su jon-izmenjivačka hromatografija na S-sefarozi, preparativna HPLC reverzne faze na Cg koloni i gel filtrirajuća hromatografija, kao metode za prečišćavanje EPO, proizvedenog u kulturi bez prisustva seruma, nakon dijalize. U ovom kontekstu, faza gel filtrirajuće hromatografije može se zameniti jon-izmenjivačkom hromatografijom na S-sefarozi pod brzim protokom. Takođe je predloženo, da se bojena hromatografija na Trisakril plavoj koloni obavi pre jon-izmenjivačke hromatografije.
Postupak za prečišćavanje rekombinantnog EPO opisan je kod Nobuo, I. et al. J. Biochem. 107 (1990) 352-359. U ovom postupku EPO se tretira rastvorom Tween® 20, fenilmetilsulfonil fluoridom, etilmaleimidom, pepstatinom A, bakar sulfatom i oksaminskom kiselinom, pre faze prečišćavanja. Publikacije, uključujući W096/35718, za Burg, objavljena 14. novembra 1996., opisuju postupak za pripremu eritropoetina u fermentacionom procesu bez prisustva seruma (EPOsf).
Specifična aktivnost EPO ili EPO konjugata u skladu sa predmetnim pronalaskom može se odrediti različitim testovima poznatim u nauci. Biološka aktivnost prečišćenih EPO proteina iz ovog pronalaska je takva da injektiranje EPO proteina kod pacijenata rezultira povećanom produkcijom retikulocita i eritrocita u ćelijama koštane srži, u poređenju sa netretiranim ili kontrolnim grupama ispitanika. Biološka aktivnost EPO proteina , ili njihovih fragmenata, dobijenih i prečišćenih u skladu sa ovim pronalaskom, može se testirati postupcima u skladu sa Annable, et al., Buli. Wld. Hlth. Org. 47 (1972) 99-112 i Pharm Europa Spec Issue Erythropoietin BRP Bio 1997 (2). Drugi biološki test za određivanje aktivnosti EPO proteina, test normocitemičnog miša, opisan je u Primeru 4.
Pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja se sastoji od konjugata, kao stoje to opisano. Kompozicija koja sadrži najmanje devedeset procenata mono-PEG konjugata, tj. u kojoj je n jednako 1, priprema se kao u Primeru 5. Najčešće su poželjni mono-PEG konjugati eritropoetin glikoproteina, jer ispoljavaju veću aktivnost od di-PEG konjugata. Procenat mono-PEG konjugata, kao i relativan odnos mono- i di-PEG molekulskih vrsta može se kontrolisati prikupljanjem Širih frakcija oko elucionog vrha, kako bi se smanjio procenat mono-PEG, ili prikupljanjem užih frakcija, kako bi se povećao procenat mono-PEG u kompoziciji. Sadržaj mono-PEG konjugata od oko 90 procenata omogućava dobru ravnotežu prinosa i aktivnosti. U nekim slučajevima mogu biti poželjne kompozicije koje sadrže najmanje devedesetdva procenta ili najmanje devedesetšest procenta mono-PEG molekulskih vrsta (n jednako 1). U jednom obliku izvođenja ovog pronalaska procenat konjugata u kojima je n jedanko 1, iznosi od devedeset do devedesetšest procenata.
Pronalazak se takođe odnosi na odgovarajuće farmaceutske kompozicije koje sadrže konjugat ili kompozicije kakve su već opisane i farmaceutski prihvatljive inertne nosače.
Konjugati i kompozicije iz predmetnog pronalaska mogu se naročito primeniti za pripremu medikamenata za tretiranje ili profilaksu bolesti vezanih sa anemijom kod pacijenata sa hroničnom renalnom insuficijencijom (CRF), AIDS ili za tretiranje pacijenata na hemoterapiji koji boluju od kancera.
Dodatni oblik izvođenja ovog pronalaska odnosi se na postupak za profilaktički i/ili terapeutski tretman poremećaja vezanih za anemiju u hroničnoj renalnoj insuficijenciji (CRF), AIDS-u, kao i pacijenata bolesnih od kancera, koji primaju hemoterapiju, pri čemu postupak sadrži fazu primene opisanih kompozicija pacijentima.
Dalje, pronalazak se odnosi na postupak pripreme opisanih jedinjenja, pri Čemu se postupak sastoji od kondenzovanja jedinjenja Formule II sa eritropoetin glikoproteinom, gde su R, m i x, kao što je to opisano. Pronalazak se takođe odnosi na gore opisana jedinjenja za terapiju bolesti vezanih za anemiju kod pacijenta koji boluju od hronične renalne insuficijencije, AIDS-a i tumora, a koji primaju hemoterapiju.
Pronalazak će biti jasnije objašnjen narednim primerima koji ilustruju ali ničim ne ograničavaju ovde opisani pronalazak.
PRIMERI
PRIMER 1: Fermentacija i prečišćavanje humanog EPO
a) Priprema inokuluma i fermentacija
Jedna vajla radne ćelijske banke (Working Cell Bank), koja potiče od
CHO ćelijske linije koja proizvodi EPO (može se koristiti ATCC CRL8695, opisana u EP 411 678 (Genetic Institute)) uzeta je iz gasovite faze rezervoara sa tečnim azotom. Ćelije su prenete u staklene rotacione flaskove i kultivisane u medijumu puferisanom karbonantnom kiselinom, u CO2inkubatoru na kontrolisanoj vlažnosti. Tipični medijumi bez seruma primenjeni za pripremu inokuluma i fermentaciju, opisani su u evropskoj patentnoj prijavi 513 738, Koch, publikovanoj 12. juna 1992., ili u W096/35718s Burg, objavljenom 14. novembra 1996., na primer, sadrži kao medijum DMEM/F12 (na primer, JRH Biosciences/Hazleton Biologics, Denver, US, order No. 57-736) i uz to, natrij um hidrogenkarbonat, L-glutamin, D-glukozu, rekombinantni insulin, natrij um selenit, diaminobutan, hiđrokortizon, gvožde (II) sulfat, asparagin, aspartatnu kiselinu, serin i stabilizator sisarskih ćelija, kao što je polivinil alkohol, metil celulozu, polidekstran, polieilen glikol, Pluronic F68, plazmin ekspander poligelin (HEMACCEL®) ili polivinil pirolidon (W096/35718).
Kulture su mikroskopski proverene na prisustvo kontaminirajućih mikroorganizama, i određene su ćelijske gustine. Ovi testovi obavljeni su tokom svake od faza razdvajanja.
Nakon perioda inicijalnog rasta, ćelijske kulture su razblažene svežim medijumom do početne ćelijske gustine i puštene su da prođu kroz još jedan ćelijski ciklus. Ovaj postupak ponovljan je sve dok nije dobijena zapremina kulture od oko 2 1 po staklenom rotacionom flasku. Nakon otprilike 12 udvajanja, dobijeno je oko 1 do 5 litara kulture koja je zatim korišćena kao tnokulum za 10 I fermentator inokuluma.
Nakon 3-5 dana, kulture u 10 1 fermentatoru mogu se koristiti kao inokulum za 100 1 frementator inokuluma.
Nakon sledećih 3-5 dana kultivacije, kulture u 100 1 fermentatoru mogu se koristiti kao inokulum za 1000 1 proizvodni fermentator.
b) Prikupljanje ćelija i njihova separacija
Primenjen je tzv. "batch refeed" postupak, tj, kada je postignuta željena
ćelijska gustina, prikupljeno je oko 80 % kulture. Ostatak kulture se napuni svežim medijumom i kultiviše se do narednog prikupljanja. Jedan ciklus produkcije sastoji se od najviše 10 uzastopnih prikupljanja: 9 delimičnih prikupljanja i 1 totalnog prikupljanja na kraju fermentacije. Prikupljanje se vrši svaka 3-4 dana.
Prikupljena zapremina se meri i prebacuje u rashlađeni sud. Ćelije se uklanjaju centrifugiranjem ili filtracijom i odbacaju se. Supernatant dobijen centrifugiranjem sadrži EPO i on se filtrira i prikuplja u drugi rashlađeni sud. Svaki pul se zasebno prečišćava.
Tipičan proces prečišćavanja EPO-proteina opisan je u W096/35718, za Burg, objavljenom 14 novembra 1996. Opis postupka prečišćavanja sledi.
a) Hromatografija na plavoj sefarozi
Plava sefaroza (Blue Sepharose, Pharmacia) sastoji se od zrnaca sefaroze za
čiju je površinu kovalentno vezana Cibacron plava boja. S obzirom da se EPO vezuje za plavu sefarozu znatno jače od većine drugih ne-proteinskih kontaminanata, nekih proteinskih nečistoća i PVA, tokom ove faze se frakcija EPO obogaćuje. Ispiranje kolone od plave sefaroze se vrši rastvorima sa rastućim koncentracijama sofi i rastućim pH.
Kolona se puni sa 80 - 100 1 plave sefaroze, regeneriše se sa NaOH i ekvilibrira ekvilibracionim puferom (natrijum/kalcijum hlorid i natrijum acetat). Zakišeljeni i pro filtrirani supernatant iz fermentera se nanosi na kolonu. Nakon toga, kolona se prvo ispira puferom koji je sličan ekvilibracionom puferu, ali koji sadrži veću koncentraciju natrijum hlorida, a zatim nekim Tris puferom. Proizvod se ispira Tris puferom i prikuplja kao jedna frakcija na osnovu dobijenog elucionog profila.
b) Hromatografija na butil-tojo perlicama
Butil-tojo perlice 650 C (Butyl Toyopearl 650 C, Toso Haas) je polistirenski
matriks za koji se kovalentno vezuju alifatični butil-ostaci. S obzirom da se EPO vezuje za ovaj gel jače od većine nečistoća i PVA, EPO se mora isprati puferom koji sadrži izopropanol.
Kolona se pakuje sa 30 - 40 1 butil-tojo perlica 650 C, regeneriše se sa NaOH, ispira Tris puferom i ekvilibriše Tris puferom koji sadrži izopropanol.
Eluat sa plave sefaroze se podešava na koncentraciju izopropanola u koloni ekvilibrisanoj puferom, a zatim se nanosi na kolonu. Kolona se zatim ispira ekvilibracionim puferom koji sadrži veću koncentraciju izopropanola. Proizvod se eluira elucionim puferom (Tris pufer sa visokim sadržajem izopropanola) i prikuplja u jednoj frakciji, saglasno dobijenom elucionom profilu.
c) Hromatografija na hidroksiapatitnom ultrogelu
Hidroksiapatitni ultrogel (Hydroxyapatite Ultrogel, Biosepra) sastoji se od
hidroksiapatita koji je inkorporiran u agarozni matriks kako bi se poboljšala njgova mehanička svojstva. EPO ima nizak afinitet prema hidroksiapatitu, pa se može spirati pri nižim koncentracijama fosfata nego proteinske nečistoće.
Kolona se puni sa 30 - 40 1 hidroksiapatit ultrogela, regeneriše se sa kalijum fosfatnim/kalcijum hloridnim puferom i NaOH, a nakon toga Tris puferom. Zatim se ekvilibriše Tris puferom koji sadrži nisku koncentraciju izopropanola i natrijum hlorida.
Eluat sa hromatografije na butil-tojo perlicama koje sadrže EPO, nanosi se na kolonu. Kolona se zatim ispira ekvilibracionim puferom i Tris puferom koji ne sadrži izopropanol i natrijum hlorid. Proizvod se eluira Tris puferom koji sadrži nisku koncentraciju kalijum fosfata i prikuplja se u jednoj frakciji u skladu sa elucionim profilom.
d) HPLC reverzne faze na Vydac-u C4
Materijal za RP-HPLC, Vydac C4 (Vyđac) sastoji se od zrnaca silika gela, na
čijoj se površini nalaze C4-alkilni lanci. Razdvajanje EPO od proteinskih nečistoća zasniva se na razlici jačine hidrofobnih interakcija. Elucija se vrši acetonitrilnim gradijentom u razblaženoj trifluorosirćetnoj kiselini.
Preparativna HPLC se obavlja primenom kolona napravljenih od nerđajućeg čelika (napunjenih sa 2.8 do 3.2 1 Vydac C4 silika gela). Eluat sa hidroksiapatit ultragela se acidifikuje dodavanjem trifluoro sirćetne kiseline i nanosi se na Vydac C4 kolonu. Za ispiranje i eluciju koristi se acetonitrilni gradijent u razblaženoj trifluoro sirćetnoj kiselini. Frakcije se prikupljaju i odmah neutrališu fosfatnim puferom. Prikupljaju se frakcije EPO koje su unutar IPC granica.
e) Hromatografija na DEAE sefarozi
DEAE sefaroza (Pharmacia) sastoji se od đietilaminoetil (DEAE) grupa
kovalentno vezanih za površinu sefaroznih zrnaca. Vezivanje EPO za DEAE grupe posredovano je jonskim interakcijama. Acetonitril i trifluor sirćetna kiselina prolaze kroz kolonu bez zadržavanja. Nakon ispiranja ovih susptanci, tragovi nečistoća uklanjaju se ispiranjem kolone acetatnim puferom niske pH vrednosti. Kolona se zatim ispira neutralnim fosfatnim puferom, a EPO se eluira puferom sa većom jonskom jačinom.
Kolona se pakuje sa DEAE sefarozom na brzom protoku. Zapremina kolone se podešava kako bi se osiguralo da se EPO nanosi u opsegu od 3 - 10 mg EPO/ml gela. Kolona se ispira vodom i ekvilibracionim puferom (natrijum/kalijum fosfat). Prikupljene i spojene frakcije sa HPLC eluata nanose se na kolonu i kolona se ispira ekvilibracionim puferom. Neposredno nakon toga, EPO se eluira sa kolone elucionim puferom (natrijum hlorid, natrijum/kalijum fosfat) i prikuplja u jednoj frakciji saglasno dobijenom elucionom profilu.
Eluat sa DEAE sefarozne kolone se podešava na određenu provodljivost. Rezultujuća supstanca se sterilno filtrira u teflonske boce i čuva na -70°C.
PRIMER 2: Pegilacija EPO sa mPEG- SBA
Primenom analitičkih metoda utvrđeno je daje EPO, prečišćen u skladu sa postupkom bez prisustva seruma, opisanom u Primeru 1 (EPOsf), homogen i da pokazuje tipičan obrazac izoformi sastojeći se od 8 izoformi. On ispoljava biološku aktivnost od 190,000 IU/mg, što je određeno testom normocitemičnog miša. Agens korišćen za pegilaciju je metoksi-PEG-SBA, a to je jedinjenje Formule II u kojem je R- metil; x je 3; m je od 650 do 750 (prosečno oko 680, što odgovara prosečnoj molekulskoj težini od oko 30 kDa).
Reakcija pegilacije
Jednoj stotini miligrama EPOsf (9.71 ml od 10.3 mg/ml EPOsf Štoka, 5.48 umol) dodato je 10 ml 0.1M rastvora kalijum fosfatnog pufera, pH, 7.5 koji sadrži
506 mg 30 kDa metoksi-PEG-SBA (16.5 umol) (dobijeno od Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, Alabama), i to je mešano 2 sata na sobnoj temperaturi (20 - 23°C). Finalna koncentracija proteina bila je 5 mg/ml, a odnos proteimPEG reagens iznosio je 1:3. Nakon dva sata, reakcija je zaustavljena promenom pH na 4.5, dodavanjem glacijalne sirćetne kiseline i zamrzavanjem na -20°C do prečišćavanja.
Prečišćavanje
1. Smcšakonjugata:Približno 28 ml SP-SEPHAROSE FF (sulfo-propil katjon izmenjivačka smola) spakovana je u AMICON staklene kolone (2.2 x 7.5 cm) i ekvilibrisana 20 mM acetatnim puferom, pH 4.5 na protoku od 150 ml/h. Šest mililitara reakcione smeše koja sadrži 30 mg proteina, razblaženo je 5 puta u ekvilibracionom puferu i naneto je na kolonu. Neadsorbovani materijal ispran je puferom, a adsorbovana smeša PEG konjugata eluirana je sa kolone primenom 0.175 M NaCl u ekvilibracionom puferu. Nemodifikovani EPOsf koji je zaostao na koloni ispran je sa 750 mM NaCl. Kolona je reekvilibrisana u početnom puferu. Uzorci su analizirani SDS-PAGE elektroforezom, i određenje njihov stepen pegilacije. Utvrđeno je da 0.175 M NaCl eluat sadrži mono-, kao i di- I, u tragovima, tri-pegilovane molekulske vrste, dok 750 mM NaCl eluat sadrži
nemodifikovane EPOsf.
2. Di-PEG i mono-PEG-EPOsf: Prečišćena smeša konjugata, eliurana sa kolone u prethodnoj fazi, razblažena je puferom 4 puta, ponovo je naneta na kolonu i isprana kako je opisano. Di-PEG-EPOsf i mono-PEG-EPOsf su posebno eluirani sa kolone primenom 0.1 M NaCl, odnosno 0.175 M NaCl. Eluiranje je izvedeno rastvorom 750 mM NaCl, kako bi se isprao zaostali nemodifikovani EPOsf. S druge strane, reakciona smeša se može razblažiti 5 puta acetatnim puferom i naneti na SP-sefaroznu kolonu (~0.5 mg proteina/ml gela). Kolona se ispira, a adsorbovani mono-PEG-EPOsf, di-PEG-EPOsf i nemodifikovani EPOsf eluiraju se kao što je opisano u prethodnom odeljku.
Rezultati
PEG-EPOsf je sintetisan hemijskom konjugacijom linearnog PEG molekula sa velikim brojem molekula prosečne molekulske težine od 30 kDa. PEG-EPOsf nastao je u reakciji između primarnih amino grupa EPOsf i sukcinimid estarskog derivata PEG-buterne kiseline molekulske težine od 30 kDa, formiranjem amidne veze.
Rezultati su sažeto prikazani u Tabeli 1. Prečišćena smeša konjugata sastoji se od mono- i di-PEG-EPOsf, a oslobođena je prisustva nemodifikovanog EPOsf, što je utvrđeno SDS-PAGE elektroforetskom analizom. Smeša konjugata činila je 23.4 mg ili 78% početnog materijala. Razdvajanje katjon izmenjivačkom hromatografijom mono- i di-PEG-EPOsf, ukazala je da je odnos mono- i di-PEG u smeši konjugata iznosio skoro 1:1. Nakon završetka reakcije odnos individualnih komponenti mono.di: nemodifikovanim iznosio je 40:38:20 (%). Ukupni prinos je bio skoro kvantitativan.
PRIMER 3: Pegilacija EPO sa mPEG- SPA
Različiti alikvoti EPOsf primertjeni u Primeru 2 stavljeni su u reakciju sa metoksi-PEG-SPA od 30 kDa (Shearvvater Polvmers, Inc., Huntsville, Alabama). Reakcija se odvijala pri odnosu protehr.reagens od 1:2, a tehnike prečišćavanja su bile kao u Primeru 2. Dobijene su prevashodno mono-pegilovane molekulske vrste.
PRIMER 4: In vivo aktivnost pegilovanog EPO određena testom
normocitemičnog miša
Biološki test normocitemičnog miša poznata je u nauci (Pharm. Europa Spec. Issue Ervthropoietin BRP Bio 1997 (2)) a metoda u monografiji o eritropoetinu u Ph. Eur. BRP. Uzorci su razblaženi sa BSA-PBS. Normalnim zdravim miševima, starim 7-15 nedelja, dato jes, c.0.2 ml EPO-frakcije koja sadrži nepegilovane EPO ili tri-, di- ili mono-pegilovane EPO iz Primera 2 ili 3. Tokom perioda od 6 dana uzorkovana je krv punkcijom repne vene i razblažena tako daje 1 p.1 krvi prisutan u 1 ml 0.15 u.mol rastvora akridin oranž boje. Vreme bojenja bilo je 3 do 10 minuta. Brojanje retikulocita izvršeno je mikrofluorometrijski u protočnom citometru, analizom histograma crvene fluorescencije. Broj retikulocita predstavljen je u apsolutnim brojevima (na 30 000 analiziranih ćelija). Za predstavljene rezultate, svaka grupa se sastojala od 5 miševa po danu, a životinje su iskrvavljene samo po jedanput.
U posebnom eksperimentu miševi su tretirani jednom dozom nemodifikovanog EPO (25 ng EPO), PEG(SBA-)-EPO smeše iz primera 2 (10 ng konjugata), mono- i di-pegilovanim EPO iz Primera 2 (10 ng konjugata), PEG(SPA-)-EPO iz primera 3(10 ng konjugata) ili rastvorom pufera. Rezultati su prikazani u Tabeli 2. Rezultati pokazuju superiorno veću aktivnost i produženi polu-život pegilovanih EPO vrsta,.na osnovu značajnog povećanja broja retikulocita i promene maksimuma broja retikulocita primenom iste doze po mišu (10 ng) kod pegilovanih, u poredenju sa dozom od 25 ng za nemodifikovani EPO.
PRIMER 5: Priprema predominantno mono- PEG- EPO
Reakcija pegilacije
Količini od 100 mg (5.48 umol) EPOsf rastvorenim u 100 mM kalijum fosfatnom puferu pH 7.5, koji je pripremljen saglasno Primeru 1, dodato je 329 mg (10.96 umol) 30 kDa PEG-SBA reagensa rastvorenog u 3 ml ratsvora 1 mM HC1. Dodata je potrebna količina 100 mM kalijum fosfatnog pufera pH 7.5, kako bi se zapremina reakcione smeše dopunila do 20 ml. Finalna koncentracija proteina bila je 5 mg/ml a relativan odnos proteina prema PEG reagensu bila je 1:2. Reakciona smeša mešana je 2 sata na sobnoj temperaturi (20 - 22°C). Nakon 2 sata, reakcija je zaustavljena promenom pH na 4.5, dodavanjem glacijalne sirćetne kiseline i zamrzavanjem na -20°C, sve do prečišćavanja.
Prečišćavanje
Reakciona smeša iz prethodne faze razblažena je 1:5 sa 10 mM natrijum acetatom«pH 4.5 i nanešena na 300 ml SP-sefarose FF (sulfopropil katjon-izmenjivačka smola) upakovane u kolonu 4.2 x 19 cm. Kolona je prethodno ekvilibrisana istim puferom. Efluenti sa kolone su mereni na 280 nm primenom Gilson UV monitora i snimljeni Kipp & Zonen rikorderom. Kolona je isprana sa 300 ml ekvilibracionog pufera ili 1 zapreminom kolone, kako bi se uklonio višak reagenasa, reakcionih nus-proizvoda i oligomerni PEG-EPO. Nastavljeno je sa ispiranjem sa 2 zapremine kolone rastvorom 100 mM NaCl, kako bi se uklonio di-PEG-EPO. Mono-PEG-EPO je zatim eluiran sa 200 ml NaCl. Tokom elucije mono-PEG-EPO, prvih 50 ml proteinskog vrha je odbačeno, a mono-PEG-EPO je prikupljen kao frakcija od 150 ml. Nemodifikovani EPOsf preostao na koloni ispran je sa 750 mM NaCl. Svi elucioni puferi napravljeni su u ekvilibracionom puferu. Svi eluirani uzorci analizirani su primenom SDS-PAGE i SEC hromatografijom (engl. Siže Exclusion Chromatographv). Mono-PEG-EPO đobijen iz frakcije od 150 ml, u kojem nije bilo nemodifikovanog EPO u detektabilnim količinama, koncentrovan je na oko 4.5 - 7.5 mg/ml i dijafiltriran u puferu za čuvanje, 10 mM kalijum fosfat, 100 mM NaCl, pH 7.5. Koncentrovanje/dijaftltracija obavljena je na Millipore Labscale™ TFF sistemu, podešenom sa 50 kDa isečkom Millipore Pellicon XL Biomax 50 membrane, na ambijentalnoj temperaturi. Koncentrovani mono-PEG-EPO sterilno je profiltriran i čuvan zamrznut na -20°C.
Oko 75% EPOsf je pegilovano. Nakon prečišćavanja, ukupan prinos iznosio je oko 30 % mono-PEG-EPO sa nemerljivim količinama nemodifikovanog EPOsf i oko 25 % di-PEG-EPO. Oligomeri i nepegilovani EPOsf čine ostatak proteina. Mono-PEG-EPO pul, prikupljen iz frakcije od 150 ml, sadržao je oko 90% mono-PEG-EPO i oko 10 %di-PEG-EPO.

Claims (25)

1. Konjugat, naznačen time što obuhvata eritropoetin glikoprotein koji ima najmanj jednu slobodnu amino grupu i ispoljavain vivobiološku aktivnost uzrokovanja povećane produkcije retikulocita i eritrocita u ćelijama koštane srži i izabran je iz grupe koja se sastoji od humanog eritropoetina i humanog eritropoetina modifikovanog adicijom od 1 do 6 mesta glikozilacije ili rearanžmanorn najmanje jednog mesta glikozilacije; pri čemu je navedeni glikoprotein kovalentno vezan za "n" polifetilen glikol) grupe formule s tim da —CO svake poli(etilen glikol) grupe formira amidnu vezu sa jednom od navedenih amino grupa; gde R je Cj-C6-alkil; x je 2 ili 3; m je od 450 do 900; n je od 1 do 3; i n i m su izabrani tako da molekulska težina konjugata bez eritropoetin glikoproteina iznosi od 20 kilodaltona do 100 kilodaltona.
2. Konjugat prema zahtevu 1, formule: naznačen time što su x, m, n i R đeftnisani kao u zahtevu 1, dok je P ostatak glikoproteina bez n amino-grupe (grupa), koje formiraju amidnu vezu(e) sa poli(etilen glikol) grupom (grupama).
3. Konjugat prema btlo kojem od prethodnih zahteva, naznačen time što je R metil grupa.
4. Konjugat prema bilo kojem od prethodnih zahteva, naznačen time što je m od oko 650 do oko 750.
5. Konjugat prema bilo kojem od prethodnih zahteva, naznačen time što je n jednako 1.
6. Konjugat prema bilo kojem od prethodnih zahteva, naznačen time što ima formulu u kojoj je m od 650 do 750, n je 1, a P je kao što je definisano u zahtevu 2.
7. Konjugat prema bilo kojem od prethodnih zahteva, naznačen time što je glikoprotein humani eritropoetin.
8. Konjugat prema bilo kojem od zahteva 1 do 6, naznačen time što se humani eritropoetin glikoprotein eksprimira aktivacijom endogenog gena.
9. Konjugat prema bilo kojem od zahteva 1 do 8, naznačen time što je glikoprotein sa sekvencom SEQ ID NO*. l.
10. Konjugat prema bilo kojem od zahteva 1 do 7, naznačen time što glikoprotein ima sekvencu humanog eritropoetina, modifikovanog adicijom od 1 do 6 mesta glikozilacije.
11. Konjugat prema bilo kojem od zahteva 1 do 10, naznačen time što glikoprotein ima sekvencu humanog eritropoetina izmenjenu modifikacijom izabranom iz grupe koja se sastoji od:
12. Konjugat prema bilo kojem od zahteva 1 do 11, naznačen time što glikoprotein ima sekvencu koja sadrži sekvencu humanog eritropoetina i drugu sekvencu na karboksi kraju sekvence humanog eritropoetina, pri čemu druga sekvenca sadrži najmanje jedno mesto glikozilacije.
13. Konjugat prema zahtevu 12, naznačen time što druga sekvenca sadrži sekvencu nastalu od karboksi terminalne sekvence humanog horionskog gonadotropina.
14. Konjugat prema zahtevu 12, naznačen time što glikoprotein ima sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od: (a) sekvence humanog eritropoetina i sekvence SEQ ID NO:3 na karboksi kraju sekvence humanog eritropoetina; (b) sekvence u (a) mođifikovane sa Ser<8>' Asn<88>Thr<90>; i (c) sekvence u (a) mođifikovane sa Asn30 Thr" Val<87>Asn88Thr<90>.
15. Konjugat prema bilo kojem od zahteva 1 do 6, naznačen time što glikoprotein ima sekvencu humanog eritropoetina, modifikovanu rearanžmanom najmanje jednog mesta glikozilacije.
16. Konjugat prema zahtevu 15, naznačen time Što rearanžman obuhvata deleciju nekog od N-veznih mesta glikozilacije u humanom eritropoetinu i ađiciju N-veznog mesta glikozilacije na poziciji 88 sekvence humanog eritropoetina.
17. Konjugat prema zahtevu 16, naznačen time Što glikoprotein ima sekvencu humanog eritropoetina izmenjenu modifikacijom izabranom iz grupe koja se sastoji od:
18. Kompozicija koja se sastoji od konjugata od kojih svaki od konjugata ispoljavain vivobiološku aktivnost koja uzrokuje povećanje produkcije retikulocita i eritrocita u ćelijama koštane srži, naznačena time što svaki od pomenutih konjugata obuhvata eritropoetin glikoprotein koji ima najmanje jednu slobodnu amino grupu i izabran je iz grupe koja se sastoji od humanog eritropoetina i humanog eritopoetina modifikovanog adicijom 1 do 6 mesta glikozilacije ili rearanžmanom najmanje jednog mesta glikozilacije; pri čemu je glikoprotein u svakom od navedenih konjugata kovalentno vezan za "n" poli(etilen glikol) grupe formule — CO-(CH2)^-(OCH2CH2)w-OR s tim da -CO svake poli(etilen glikol) grupe formira amidnu vezu sa jednom od navedenih amino grupa; gde je R konjugata C^-C^x je 2 ili 3; m je od oko 450 do oko 900; n je od 1 do 3; n i m su izabrani tako da molekulska težina svakog konjugata bez eritropoetin glikoproteina iznosi od 20 kilodaltona do 100 kilodaltona; procentna zastupljenost konjugata u kojima je n 1, iznosi najmanje devedeset procenata.
19. Kompozicija koja obuhvata konjugate kao što su definisani u bilo kojem od zahteva 1 do 17, naznačena time što procenat konjugata u kojima je n 1, iznosi najmanje devedeset procenata.
20. Kompozicija prema zahtevima 18 ili 19, naznačena time što procenat konjugata u kojima je n 1, iznosi najmanje devedesetdva procenta.
21. Kompozicija prema zahtevu 20, naznačena time što procenat konjugata u kojima je n 1, iznosi najmanje devedesetšest procenata.
22. Kompozicija prema zahtevima 18 ili 19, naznačena time što je procenat konjugata u kojima je n 1, od devedeset do devedesetšest procenata.
23. Farmaceutska kompozicija koja se sadrži konjugat ili smešu prema bilo kojem od zahteva 1 do 22 i farmaceutski prihvatljivi nosač.
24. Upotreba konjugata ili kompozicije prema bilo kojem od zahteva 1 do 22 za pripremu medikamenata za tretman ili profilaksu bolesti povezanih sa anemijom kod pacijenata koji boluju od hronične bubrežne insuficijencije (CRF), AIDS-a ili u terapiji pacijenata koji boluju od raka, a koji su podvrgnuti hemoterapiji.
25. Postupak pripreme konjugata prema bilo kojem od zahteva 1 do 22, naznačen time što obuhvata kondenzovanje jedinjenja formule II sa eritropoetin glikoproteinom, pri čemu su R, m i x definisani kao u zahtevima 1 do 5.
YUP-407/00A 1999-07-02 2000-06-28 Derivati eritropoetina RS49928B (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14225499P 1999-07-02 1999-07-02
US15022599P 1999-08-23 1999-08-23
US15154899P 1999-08-31 1999-08-31
US16615199P 1999-11-17 1999-11-17

Publications (2)

Publication Number Publication Date
YU40700A YU40700A (sh) 2003-12-31
RS49928B true RS49928B (sr) 2008-09-29

Family

ID=27495518

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
YUP-407/00A RS49928B (sr) 1999-07-02 2000-06-28 Derivati eritropoetina

Country Status (51)

Country Link
US (2) US6583272B1 (sr)
EP (2) EP1064951B1 (sr)
JP (2) JP3727009B2 (sr)
KR (1) KR100593143B1 (sr)
CN (2) CN1184233C (sr)
AR (2) AR024625A1 (sr)
AT (1) ATE370748T1 (sr)
AU (1) AU736067B2 (sr)
BG (1) BG65449B1 (sr)
BR (2) BR0002276A (sr)
CA (1) CA2310536C (sr)
CO (1) CO5190661A1 (sr)
CY (2) CY1107719T1 (sr)
CZ (1) CZ299516B6 (sr)
DE (3) DE60036053T2 (sr)
DK (1) DK1064951T3 (sr)
DO (1) DOP2000000030A (sr)
EA (1) EA003777B1 (sr)
ES (2) ES2289985T3 (sr)
FR (2) FR2795734B1 (sr)
GB (2) GB2353281B (sr)
GC (1) GC0000197A (sr)
GE (1) GEP20022804B (sr)
GT (1) GT200000109A (sr)
HR (1) HRP20000436B1 (sr)
HU (1) HU226233B1 (sr)
ID (1) ID26447A (sr)
IL (1) IL137056A0 (sr)
IS (1) IS2492B (sr)
IT (1) IT1318606B1 (sr)
LU (1) LU91363I2 (sr)
MA (1) MA26746A1 (sr)
MX (1) MXPA00006547A (sr)
MY (1) MY128500A (sr)
NL (1) NL300289I9 (sr)
NO (2) NO327043B1 (sr)
NZ (1) NZ505454A (sr)
OA (1) OA11442A (sr)
PA (1) PA8497801A1 (sr)
PE (1) PE20010297A1 (sr)
PL (1) PL202758B1 (sr)
PT (1) PT1064951E (sr)
RS (1) RS49928B (sr)
SG (1) SG92717A1 (sr)
SI (1) SI1064951T1 (sr)
SK (1) SK286301B6 (sr)
SV (1) SV2002000120A (sr)
TN (1) TNSN00147A1 (sr)
TR (1) TR200001956A2 (sr)
TW (1) TWI235667B (sr)
UY (1) UY26228A1 (sr)

Families Citing this family (231)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2590912T3 (es) 1997-12-08 2016-11-24 Merck Patent Gmbh Proteínas de fusión heterodiméricas útiles para inmunoterapia dirigida y estimulación general del sistema inmunitario
US20030105294A1 (en) * 1998-02-25 2003-06-05 Stephen Gillies Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins
ES2267263T3 (es) * 1998-04-15 2007-03-01 Emd Lexigen Research Center Corp. Coadministracion de un inhibidor de la angiogenesis para reforzar la respuesta inmunologica por medio de la mediacion de una proteina de fusion de una citoquina con un anticuerpo.
US7304150B1 (en) * 1998-10-23 2007-12-04 Amgen Inc. Methods and compositions for the prevention and treatment of anemia
US7345019B1 (en) * 1999-04-13 2008-03-18 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Modulation of excitable tissue function by peripherally administered erythropoietin
CZ299516B6 (cs) * 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
US7067110B1 (en) 1999-07-21 2006-06-27 Emd Lexigen Research Center Corp. Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
MXPA02001417A (es) * 1999-08-09 2002-08-12 Lexigen Pharm Corp Complejos multiples de citosina-anticuerpo.
US20050202538A1 (en) * 1999-11-12 2005-09-15 Merck Patent Gmbh Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics
CA2391080A1 (en) 1999-11-12 2001-05-25 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Erythropoietin forms with improved properties
HUP0204475A2 (en) * 2000-02-11 2003-04-28 Merck Patent Gmbh Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
US6586398B1 (en) * 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
ME00673B (me) * 2000-05-15 2011-12-20 Hoffmann La Roche Nova farmaceutska smjesa
KR20030064275A (ko) * 2000-06-29 2003-07-31 메르크 파텐트 게엠베하 면역싸이토카인 흡수 증강제와의 조합 치료에 의한항체-싸이토카인 융합 단백질 매개 면역 반응 증강
WO2002032957A1 (en) * 2000-10-16 2002-04-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Peg-modified erythropoietin
EP1345628B1 (en) * 2000-12-20 2011-04-13 F. Hoffmann-La Roche AG Conjugates of erythropoietin (epo) with polyethylene glycol (peg)
AU2002233230B2 (en) * 2000-12-20 2007-02-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Erythropoietin conjugates
US20030072737A1 (en) * 2000-12-29 2003-04-17 Michael Brines Tissue protective cytokines for the protection, restoration, and enhancement of responsive cells, tissues and organs
US7767643B2 (en) 2000-12-29 2010-08-03 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Protection, restoration, and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs
EP1234583A1 (en) * 2001-02-23 2002-08-28 F. Hoffmann-La Roche Ag PEG-conjugates of HGF-NK4
RU2003129528A (ru) * 2001-03-07 2005-04-10 Мерк Патент ГмбХ (DE) Способ экспрессии белков, содержащих в качестве компонента гибридный изотип антитела
DE10112825A1 (de) 2001-03-16 2002-10-02 Fresenius Kabi De Gmbh HESylierung von Wirkstoffen in wässriger Lösung
WO2002079415A2 (en) * 2001-03-30 2002-10-10 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
EP1383785B1 (en) 2001-05-03 2011-03-16 Merck Patent GmbH Recombinant tumor specific antibody and use thereof
US6818613B2 (en) 2001-11-07 2004-11-16 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Aqueous sustained-release formulations of proteins
KR100467751B1 (ko) 2001-12-03 2005-01-24 씨제이 주식회사 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질
DK1454138T3 (da) * 2001-12-04 2012-02-13 Merck Patent Gmbh Immunocytokiner med moduleret selektivitet
DK2298301T3 (en) * 2001-12-06 2018-10-01 Fibrogen Inc MEDICINALS FOR TREATMENT OF ANEMIA ASSOCIATED WITH Kidney Disease
DE10209821A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid
DE10209822A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid
WO2003078959A2 (en) 2002-03-11 2003-09-25 Ortho Mcneil Pharmaceutical, Inc Methods for shp1 mediated neuroprotection
EP1552298A4 (en) * 2002-07-01 2006-11-08 Kenneth S Warren Inst Inc RECOMBINANT TISSUE-PROOFING CYTOKINS AND NUCLEIC ACIDS COORDINATING THEREOF FOR THE PROTECTION, RECOVERY AND IMPROVEMENT OF CELLS, TISSUE AND ORGANS THEREOF
MXPA05000796A (es) 2002-07-24 2005-04-19 Hoffmann La Roche Aditivos de acidos polialquilenglicolicos.
US7459435B2 (en) * 2002-08-29 2008-12-02 Hoffmann-La Roche Inc. Treatment of disturbances of iron distribution
US20050176627A1 (en) * 2002-09-09 2005-08-11 Anthony Cerami Long acting erythropoietins that maintain tissue protective activity of endogenous erythropoietin
DE60332358D1 (de) * 2002-09-09 2010-06-10 Hanall Pharmaceutical Co Ltd Protease-resistente modifizierte interferon alpha polypeptide
BR0314227A (pt) 2002-09-11 2005-10-25 Fresenius Kabi De Gmbh Derivados de amido de hidroxialquila
US7459436B2 (en) * 2002-11-22 2008-12-02 Hoffmann-La Roche Inc. Treatment of disturbances of iron distribution
US7388079B2 (en) * 2002-11-27 2008-06-17 The Regents Of The University Of California Delivery of pharmaceutical agents via the human insulin receptor
WO2004055056A1 (en) * 2002-12-17 2004-07-01 Merck Patent Gmbh Humanized antibody (h14.18) of the mouse 14.18 antibody binding to gd2 and its fusion with il-2
US7553930B2 (en) 2003-01-06 2009-06-30 Xencor, Inc. BAFF variants and methods thereof
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7610156B2 (en) 2003-03-31 2009-10-27 Xencor, Inc. Methods for rational pegylation of proteins
US7587286B2 (en) 2003-03-31 2009-09-08 Xencor, Inc. Methods for rational pegylation of proteins
US7642340B2 (en) 2003-03-31 2010-01-05 Xencor, Inc. PEGylated TNF-α variant proteins
US7279174B2 (en) * 2003-05-08 2007-10-09 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Stent coatings comprising hydrophilic additives
CN1820024B (zh) * 2003-05-12 2011-06-22 阿费麦克斯公司 新的聚(乙二醇)修饰的化合物及其用途
AU2004238868B2 (en) * 2003-05-12 2010-01-21 Affymax, Inc. Peptides that bind to the erythropoietin receptor
US7919118B2 (en) * 2003-05-12 2011-04-05 Affymax, Inc. Spacer moiety for poly (ethylene glycol) modified peptide based compounds
ATE428727T1 (de) 2003-05-12 2009-05-15 Affymax Inc Neue, an den erythropoietinrezeptor bindende peptide
CA2527665A1 (en) * 2003-05-30 2004-12-16 Centocor, Inc. Formation of novel erythropoietin conjugates using transglutaminase
WO2005011587A2 (en) * 2003-07-30 2005-02-10 New Century Pharmaceuticls Chalaropsis lysozyme protein and its method of use in anti-bacterial applications
WO2005014655A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
WO2005032467A2 (en) * 2003-09-29 2005-04-14 Warren Pharmaceuticals, Inc. Tissue protective cytokines for the treatment and prevention of sepsis and the formation of adhesions
EP1675871A2 (en) 2003-10-10 2006-07-05 Xencor Inc. Protein based tnf-alpha variants for the treatment of tnf-alpha related disorders
SI1696947T1 (sl) * 2003-12-19 2014-05-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Uporaba eritropoetina pri zdravljenju motenj porazdelitve železa pri kroničnih vnetnih črevesnih boleznih
EP1548031A1 (en) * 2003-12-22 2005-06-29 Dubai Genetics FZ-LLC Nature-identical erythropoietin
RU2370276C2 (ru) * 2003-12-31 2009-10-20 Мерк Патент Гмбх Fc-ЭРИТРОПОЭТИН СЛИТЫЙ БЕЛОК С УЛУЧШЕННОЙ ФАРМАКОКИНЕТИКОЙ
CA2553528C (en) * 2004-01-21 2012-12-04 Nektar Therapeutics Al, Corporation Method of preparing propionic acid-terminated polymers
ZA200606225B (en) * 2004-02-02 2007-11-28 Ambrx Inc Modified human four helical bundle polypeptides and their uses
JP5191729B2 (ja) 2004-03-11 2013-05-08 フレゼニウス・カビ・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング 還元的アミノ化によって製造される、ヒドロキシアルキルデンプンとタンパク質とのコンジュゲート
US7588745B2 (en) * 2004-04-13 2009-09-15 Si Options, Llc Silicon-containing products
US7253650B2 (en) 2004-05-25 2007-08-07 International Business Machines Corporation Increase productivity at wafer test using probe retest data analysis
JP2008519858A (ja) * 2004-11-11 2008-06-12 アフィーマックス・インコーポレイテッド エリスロポエチンレセプターに結合する新規ペプチド
WO2006062685A2 (en) * 2004-11-11 2006-06-15 Affymax, Inc. Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor
BRPI0606934A2 (pt) 2005-01-25 2017-07-11 Cell Therapeutics Inc Conjugado de proteína biologicamente ativa, composição, molécula de dna quimérica, vetor, célula, e, métodos para preparar conjugado de proteína biologicamente ativa, e para determinar se um dado conjugado de proteína exibe uma meia-vida de plasma modificada comparada com a meia-vida intrínseca do polipeptídeo biologicamente ativo não conjungado
US7714114B2 (en) * 2005-02-16 2010-05-11 Nektar Therapeutics Conjugates of an EPO moiety and a polymer
US7919461B2 (en) 2005-06-03 2011-04-05 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US8324159B2 (en) * 2005-06-03 2012-12-04 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US7550433B2 (en) 2005-06-03 2009-06-23 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US20070072795A1 (en) * 2005-09-28 2007-03-29 Anton Haselbeck Treatment of neurodegenerative disorders
CA2625208A1 (en) * 2005-10-04 2007-04-12 Zymogenetics, Inc. Production and purification of il-29
US8124095B2 (en) * 2005-10-07 2012-02-28 Armagen Technologies, Inc. Fusion proteins for delivery of erythropoietin to the CNS
US8741260B2 (en) * 2005-10-07 2014-06-03 Armagen Technologies, Inc. Fusion proteins for delivery of GDNF to the CNS
US8053569B2 (en) * 2005-10-07 2011-11-08 Armagen Technologies, Inc. Nucleic acids encoding and methods of producing fusion proteins
AU2006304856A1 (en) * 2005-10-21 2007-04-26 Synageva Biopharma Corp. Glycolated and glycosylated poultry derived therapeutic proteins
US20080171696A1 (en) * 2005-10-21 2008-07-17 Avigenics, Inc. Pharmacodynamically enhanced therapeutic proteins
US8841255B2 (en) 2005-12-20 2014-09-23 Duke University Therapeutic agents comprising fusions of vasoactive intestinal peptide and elastic peptides
US20130172274A1 (en) 2005-12-20 2013-07-04 Duke University Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties
EP3222142A1 (en) 2006-02-28 2017-09-27 Kodiak Sciences Inc. Acryloyloxyethylphosphorylcholine containing polymer conjugates and their preparation
JP5553506B2 (ja) 2006-03-22 2014-07-16 中外製薬株式会社 エリスロポエチン溶液製剤
PL2054074T3 (pl) * 2006-08-04 2015-03-31 Prolong Pharmaceuticals Llc Zmodyfikowana erytropoetyna
US8759297B2 (en) * 2006-08-18 2014-06-24 Armagen Technologies, Inc. Genetically encoded multifunctional compositions bidirectionally transported between peripheral blood and the cns
WO2008065372A2 (en) * 2006-11-28 2008-06-05 Nautilus Biotech, S.A. Modified erythropoietin polypeptides and uses thereof for treatment
TW201307390A (zh) * 2007-02-02 2013-02-16 Amgen Inc 海帕西啶（ｈｅｐｃｉｄｉｎ）、海帕西啶拮抗劑及使用方法
WO2008137066A1 (en) * 2007-05-02 2008-11-13 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Use of compacted nucleic acid nanoparticles in non-viral treatments of ocular diseases
CL2008002053A1 (es) * 2007-07-17 2009-05-22 Hoffmann La Roche Metodo para la purificacion de una eritropoyetina monopeguilada (epompeg) que consiste en proporcionar una solucion que contiene eritropoyetina mono, poli y no peguilada y hacerla pasar por dos pasos de cromatografia de intercambio cationico y metodo para producir epo mpeg que incluye metodo de purificacion.
AR067536A1 (es) * 2007-07-17 2009-10-14 Hoffmann La Roche Metodo para obtener una eritropoyetina mono-pegilada en una forma sustancialmente homogenea
AU2008282496B2 (en) 2007-07-27 2013-04-04 Armagen Technologies, Inc. Methods and compositions for increasing alpha-iduronidase activity in the CNS
EP2205280B1 (en) * 2007-09-27 2019-09-04 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations
US8796206B2 (en) 2007-11-15 2014-08-05 Amgen Inc. Aqueous formulation of erythropoiesis stimulating protein stabilised by antioxidants for parenteral administration
US8101706B2 (en) 2008-01-11 2012-01-24 Serina Therapeutics, Inc. Multifunctional forms of polyoxazoline copolymers and drug compositions comprising the same
JP5514736B2 (ja) 2008-01-11 2014-06-04 セリナ・セラピユーテイツクス・インコーポレーテツド ポリオキサゾリン共重合体の多機能形態およびそれを含む薬物組成物
WO2009094551A1 (en) 2008-01-25 2009-07-30 Amgen Inc. Ferroportin antibodies and methods of use
MX344166B (es) 2008-02-08 2016-12-07 Ambrx Inc Leptina-polipeptidos modificados y sus usos.
TWI395593B (zh) 2008-03-06 2013-05-11 Halozyme Inc 可活化的基質降解酵素之活體內暫時性控制
KR20130116386A (ko) 2008-04-14 2013-10-23 할로자임, 아이엔씨 히알루로난 관련 질환 및 상태 치료용 변형된 히알루로니다제 및 그 용도
US9315577B2 (en) 2008-05-01 2016-04-19 Amgen Inc. Anti-hepcidin antibodies and methods of use
CN102131516B (zh) 2008-06-27 2016-03-16 杜克大学 包含弹性蛋白样肽的治疗剂
BR122012024318A2 (pt) 2008-09-26 2019-07-30 Ambrx, Inc. Polipeptídeos modificados de eritropoetina animal e seus usos
JP6018753B2 (ja) 2008-11-13 2016-11-02 ザ・ジェネラル・ホスピタル・コーポレイションＴｈｅ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｂｍｐ−６の調節によって鉄の恒常性を制御するための方法および組成物
EA022752B1 (ru) 2008-12-09 2016-02-29 Галозим, Инк. Длинные растворимые полипептиды рн20 и их использование
CA2748889A1 (en) 2009-03-18 2010-09-23 Armagen Technologies, Inc. Compositions and methods for blood-brain barrier delivery of igg-decoy receptor fusion proteins
CA2768326C (en) 2009-07-30 2019-01-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Moveable chromatography column separator
WO2011024025A1 (en) * 2009-08-28 2011-03-03 Avesthagen Limited An erythropoietin analogue and a method thereof
HUE028832T2 (en) 2009-09-17 2017-01-30 Baxalta Inc Stable co-formulation of hyaluronidase and immunoglobulin, as well as a process for its preparation
EA022396B1 (ru) * 2009-09-23 2015-12-30 Ратиофарм Гмбх Способ очистки рекомбинантного эритропоэтина человека (epo), эритропоэтин, очищенный данным способом, и фармацевтические композиции, содержащие такой эритропоэтин
EP2485761B1 (en) 2009-10-09 2019-02-27 Armagen, Inc. Methods and compositions for increasing iduronate 2-sulfatase activity in the cns
WO2011050333A1 (en) 2009-10-23 2011-04-28 Amgen Inc. Vial adapter and system
WO2011075185A1 (en) 2009-12-18 2011-06-23 Oligasis Targeted drug phosphorylcholine polymer conjugates
SG10201502398RA (en) 2010-04-27 2015-05-28 Scil Technology Gmbh Stable MIA/CD-RAP formulations
SG186094A1 (en) 2010-06-07 2013-01-30 Amgen Inc Drug delivery device
WO2012012300A2 (en) 2010-07-20 2012-01-26 Halozyme, Inc. Adverse side-effects associated with administration of an anti-hyaluronan agent and methods for ameliorating or preventing the side-effects
CN103118708B (zh) 2010-09-14 2015-08-26 霍夫曼-拉罗奇有限公司 用于纯化聚乙二醇化的促红细胞生成素的方法
MX347297B (es) 2011-02-02 2017-04-21 Hoffmann La Roche Soporte para columna de cromatografía.
WO2012109387A1 (en) 2011-02-08 2012-08-16 Halozyme, Inc. Composition and lipid formulation of a hyaluronan-degrading enzyme and the use thereof for treatment of benign prostatic hyperplasia
AU2012236573B2 (en) 2011-03-31 2016-06-02 Amgen Inc. Vial adapter and system
HUE042822T2 (hu) 2011-04-20 2019-07-29 Amgen Inc Automata befecskendezõ szerkezet
US20130011378A1 (en) 2011-06-17 2013-01-10 Tzung-Horng Yang Stable formulations of a hyaluronan-degrading enzyme
PL3045187T3 (pl) 2011-10-14 2019-09-30 Amgen Inc. Wstrzykiwacz i sposób montażu
JP6162707B2 (ja) 2011-10-24 2017-07-12 ハロザイム インコーポレイテッド 抗ヒアルロナン剤治療のためのコンパニオン診断およびその使用方法
AU2012346448B2 (en) 2011-12-02 2017-09-14 Armagen, Inc. Methods and compositions for increasing arylsulfatase A activity in the CNS
WO2013102144A2 (en) 2011-12-30 2013-07-04 Halozyme, Inc. Ph20 polypeptede variants, formulations and uses thereof
CN108686203A (zh) 2012-04-04 2018-10-23 哈洛齐梅公司 使用抗透明质酸剂和肿瘤靶向紫杉烷的组合疗法
CN102816227A (zh) * 2012-08-30 2012-12-12 深圳赛保尔生物药业有限公司 回收促红细胞生成素的方法
WO2014062856A1 (en) 2012-10-16 2014-04-24 Halozyme, Inc. Hypoxia and hyaluronan and markers thereof for diagnosis and monitoring of diseases and conditions and related methods
ES2860954T3 (es) 2012-11-21 2021-10-05 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos
TWI614041B (zh) 2013-03-15 2018-02-11 安美基公司 用於注射器之匣盒
WO2014152006A2 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Intrinsic Lifesciences, Llc Anti-hepcidin antibodies and uses thereof
JP6336564B2 (ja) 2013-03-15 2018-06-06 アムゲン・インコーポレーテッド 薬物カセット、自動注入器、および自動注入器システム
US10646664B2 (en) 2013-03-15 2020-05-12 Amgen Inc. Body contour adaptable autoinjector device
WO2014149357A1 (en) 2013-03-22 2014-09-25 Amgen Inc. Injector and method of assembly
TW201534726A (zh) 2013-07-03 2015-09-16 Halozyme Inc 熱穩定ｐｈ２０玻尿酸酶變異體及其用途
WO2015035342A2 (en) 2013-09-08 2015-03-12 Oligasis Llc Factor viii zwitterionic polymer conjugates
CA3168888A1 (en) 2013-10-24 2015-04-30 Amgen Inc. Drug delivery system with temperature-sensitive control
SG11201602876WA (en) 2013-10-24 2016-05-30 Amgen Inc Injector and method of assembly
US10994112B2 (en) 2014-02-05 2021-05-04 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
AU2015256082C1 (en) 2014-05-07 2020-09-10 Amgen Inc. Autoinjector with shock reducing elements
CN111840696B (zh) 2014-06-03 2022-12-20 安姆根有限公司 可控制药物递送系统和使用方法
US9840553B2 (en) 2014-06-28 2017-12-12 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
PT3186281T (pt) 2014-08-28 2019-07-10 Halozyme Inc Terapia de combinação com uma enzima de degradação de hialuronano e um inibidor de pontos de verificação imunológica
US10323088B2 (en) 2014-09-22 2019-06-18 Intrinsic Lifesciences Llc Humanized anti-hepcidin antibodies and uses thereof
BR112017007765B1 (pt) 2014-10-14 2023-10-03 Halozyme, Inc Composições de adenosina deaminase-2 (ada2), variantes do mesmo e métodos de usar o mesmo
EP3206739B1 (en) 2014-10-14 2021-12-01 Amgen Inc. Drug injection device with visual and audio indicators
KR20210013299A (ko) 2014-10-17 2021-02-03 코디악 사이언시스 인코포레이티드 부티릴콜린에스테라제 양성이온성 중합체 컨쥬게이트
US11357916B2 (en) 2014-12-19 2022-06-14 Amgen Inc. Drug delivery device with live button or user interface field
EP3848072A1 (en) 2014-12-19 2021-07-14 Amgen Inc. Drug delivery device with proximity sensor
US10538589B2 (en) 2015-01-14 2020-01-21 Armagen Inc. Methods and compositions for increasing N-acetylglucosaminidase (NAGLU) activity in the CNS using a fusion antibody comprising an anti-human insulin receptor antibody and NAGLU
JP6484345B2 (ja) 2015-02-17 2019-03-20 アムジエン・インコーポレーテツド 固定及び／または戻りが真空によって支援された薬物送達装置
WO2016138434A1 (en) 2015-02-27 2016-09-01 Amgen Inc. Drug delivery device having a needle guard mechanism with a tunable threshold of resistance to needle guard movement
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
JP7082568B2 (ja) 2015-12-09 2022-06-08 アムジエン・インコーポレーテツド 信号伝達キャップ付き自動注射器
KR20250057128A (ko) 2015-12-30 2025-04-28 코디악 사이언시스 인코포레이티드 항체 및 이의 접합체
US11154661B2 (en) 2016-01-06 2021-10-26 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
DK3429663T3 (da) 2016-03-15 2020-09-28 Amgen Inc Reduktion af sandsynligheden for glasbrud i anordninger til indgivelse af lægemidler
CN105820232B (zh) * 2016-04-08 2019-05-17 昂德生物药业有限公司 单修饰聚乙二醇重组人促红素的制备方法及其制品和应用
WO2017189089A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
US11389588B2 (en) 2016-05-02 2022-07-19 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
AU2017263558B2 (en) 2016-05-13 2022-12-22 Amgen Inc. Vial sleeve assembly
WO2017200989A1 (en) 2016-05-16 2017-11-23 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
US11541176B2 (en) 2016-06-03 2023-01-03 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
EP3478342B1 (en) 2016-07-01 2025-03-12 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
KR102470282B1 (ko) 2016-07-15 2022-11-24 에프. 호프만-라 로슈 아게 Ｐｅｇ화 에리트로포이에틴을 정제하기 위한 방법
WO2018034784A1 (en) 2016-08-17 2018-02-22 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
US20200261643A1 (en) 2016-10-25 2020-08-20 Amgen Inc. On-body injector
AU2018210301A1 (en) 2017-01-17 2019-08-01 Amgen Inc. Injection devices and related methods of use and assembly
WO2018151890A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Amgen Inc. Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly
CA3052204A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
EP3592403B1 (en) 2017-03-06 2025-08-20 Amgen Inc. Drug delivery device with activation prevention feature
US11571511B2 (en) 2017-03-07 2023-02-07 Amgen Inc. Insertion mechanism and method of inserting a needle of a drug delivery device
AU2018230486B2 (en) 2017-03-09 2023-05-11 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
EP3570871B1 (en) 2017-03-20 2020-11-18 H. Hoffnabb-La Roche Ag Method for in vitro glycoengineering of an erythropoiesis stimulating protein
ES3023742T3 (en) 2017-03-28 2025-06-03 Amgen Inc Plunger rod and syringe assembly system
US11590294B2 (en) 2017-06-08 2023-02-28 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
JP7200134B2 (ja) 2017-06-08 2023-01-06 アムジエン・インコーポレーテツド トルク駆動式薬物送達デバイス
CA3177086A1 (en) 2017-06-22 2018-12-27 Catalyst Biosciences, Inc. Modified membrane type serine protease 1 (mtsp-1) polypeptides and methods of use
JP7195276B2 (ja) 2017-06-22 2022-12-23 アムジエン・インコーポレーテツド デバイス起動による衝突／衝撃の低減
WO2018237225A1 (en) 2017-06-23 2018-12-27 Amgen Inc. Electronic drug delivery device comprising a cap activated by a switch assembly
IL270784B2 (en) 2017-07-14 2023-11-01 Amgen Inc Needle insertion-extraction system with a double torsion spring system
JP7649105B2 (ja) 2017-07-21 2025-03-19 アムジエン・インコーポレーテツド 薬物容器のためのガス透過性シーリング部材及び組立方法
US11617837B2 (en) 2017-07-25 2023-04-04 Amgen Inc. Drug delivery device with gear module and related method of assembly
MA49676A (fr) 2017-07-25 2020-06-03 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament doté d'un système d'accès à un récipient et procédé d'assemblage associé
MA49838A (fr) 2017-08-09 2020-06-17 Amgen Inc Systèm de administration de médicaments avec pression hydraulique-pneumatique de chambre
EP3668567B1 (en) 2017-08-18 2026-02-18 Amgen Inc. Wearable injector with sterile adhesive patch
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
WO2019070472A1 (en) 2017-10-04 2019-04-11 Amgen Inc. FLOW ADAPTER FOR MEDICATION DELIVERY DEVICE
ES2971450T3 (es) 2017-10-06 2024-06-05 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos con conjunto de enclavamiento y procedimiento de montaje correspondiente
US11464903B2 (en) 2017-10-09 2022-10-11 Amgen Inc. Drug delivery device with drive assembly and related method of assembly
IL273582B2 (en) 2017-11-03 2024-12-01 Amgen Inc Systems and approaches for sterilizing a drug delivery device
EP3706830B1 (en) 2017-11-06 2024-08-07 Amgen Inc. Drug delivery device with placement and flow sensing
EP3707075A1 (en) 2017-11-06 2020-09-16 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
MA50557A (fr) 2017-11-10 2020-09-16 Amgen Inc Pistons pour dispositifs d'administration de médicament
MX2020005066A (es) 2017-11-16 2020-08-20 Amgen Inc Autoinyector con deteccion de detencion y punto final.
JP7370969B2 (ja) 2017-11-16 2023-10-30 アムジエン・インコーポレーテツド 薬物送達デバイスの扉ラッチ機構
WO2019129876A1 (en) 2017-12-29 2019-07-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Process for providing pegylated protein composition
US20200362002A1 (en) 2017-12-29 2020-11-19 Hoffmann-La Roche Inc. Process for providing pegylated protein composition
WO2019129877A1 (en) 2017-12-29 2019-07-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Process for providing pegylated protein composition
EP3758737A4 (en) 2018-03-02 2022-10-12 Kodiak Sciences Inc. IL-6 ANTIBODIES AND FUSION CONSTRUCTS AND CONJUGATES THEREOF
US20190351031A1 (en) 2018-05-16 2019-11-21 Halozyme, Inc. Methods of selecting subjects for combination cancer therapy with a polymer-conjugated soluble ph20
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
MA53375A (fr) 2018-07-24 2021-06-02 Amgen Inc Dispositifs d'administration pour l'administration de médicaments
WO2020023336A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
CA3103681A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
US12303677B2 (en) 2018-07-24 2025-05-20 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with optional grip portion and related method of preparation
CA3103105A1 (en) 2018-07-31 2020-02-06 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
DK3613486T3 (da) * 2018-08-24 2021-01-04 Uga Biopharma Gmbh Metode og anlæg til rengøring af epo og/eller et epo-derivat
US20210346601A1 (en) 2018-09-24 2021-11-11 Amgen Inc. Interventional dosing systems and methods
CA3110371A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 Amgen Inc. Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
EP3860685A1 (en) 2018-10-02 2021-08-11 Amgen Inc. Injection systems for drug delivery with internal force transmission
US12151089B2 (en) 2018-10-05 2024-11-26 Amgen Inc. Drug delivery device having dose indicator
TW202541859A (zh) 2018-10-15 2025-11-01 美商安進公司 具有阻尼機構之藥物遞送裝置及自動注射器
WO2020081480A1 (en) 2018-10-15 2020-04-23 Amgen Inc. Platform assembly process for drug delivery device
MA54048A (fr) 2018-11-01 2022-02-09 Amgen Inc Dispositifs d'administration de médicament avec rétraction partielle de l'organe d'administration de médicament
EP3873563A1 (en) 2018-11-01 2021-09-08 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
US11613744B2 (en) 2018-12-28 2023-03-28 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Modified urokinase-type plasminogen activator polypeptides and methods of use
CA3123872A1 (en) 2018-12-28 2020-07-02 Catalyst Biosciences, Inc. Modified urokinase-type plasminogen activator polypeptides and methods of use
AU2020263289B2 (en) 2019-04-24 2025-05-22 Amgen Inc. Syringe sterilization verification assemblies and methods
WO2021041067A2 (en) 2019-08-23 2021-03-04 Amgen Inc. Drug delivery device with configurable needle shield engagement components and related methods
CA3157509A1 (en) 2019-10-10 2021-04-15 Kodiak Sciences Inc. Methods of treating an eye disorder
US20230331798A1 (en) 2020-09-22 2023-10-19 Jecho Laboratories, Inc. Glycosylation-modified erythopoietin and use thereof
WO2022159414A1 (en) 2021-01-22 2022-07-28 University Of Rochester Erythropoietin for gastroinfestinal dysfunction
CN117279929A (zh) 2021-05-10 2023-12-22 凯奥目生物科学株式会社 抗体组合物的纯化方法
JP2024523779A (ja) 2021-05-21 2024-07-02 アムジェン インコーポレイテッド 薬物容器用の充填レシピを最適化する方法
WO2023209074A1 (en) 2022-04-28 2023-11-02 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods of restoring erythropoiesis in patients suffering from a sf3b1 mutant myelodysplastic syndrome by correcting coasy mis-splicing
WO2024094457A1 (en) 2022-11-02 2024-05-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for producing glycoprotein compositions
CN116492448A (zh) * 2023-04-12 2023-07-28 深圳赛保尔生物药业有限公司 负载peg-epo及间充质干细胞的组合物、药物及其制备方法
WO2025227129A2 (en) 2024-04-25 2025-10-30 Starrock Pharma Llc Delivery vehicles comprising proglucagon derived polypeptides and anabolic polypeptides and uses thereof
WO2026030152A1 (en) 2024-07-29 2026-02-05 Amgen Inc. System and method for assessing transferability of a fill recipe

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
KR850004274A (ko) * 1983-12-13 1985-07-11 원본미기재 에리트로포이에틴의 제조방법
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
JPS6197229A (ja) 1984-10-18 1986-05-15 Chugai Pharmaceut Co Ltd 安定なエリトロポエチン製剤
US4917888A (en) 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5641663A (en) * 1985-11-06 1997-06-24 Cangene Corporation Expression system for the secretion of bioactive human granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and other heterologous proteins from steptomyces
US4902502A (en) 1989-01-23 1990-02-20 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US5166322A (en) 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
US5674534A (en) * 1992-06-11 1997-10-07 Alkermes, Inc. Composition for sustained release of non-aggregated erythropoietin
NZ250375A (en) 1992-12-09 1995-07-26 Ortho Pharma Corp Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives
US5681811A (en) 1993-05-10 1997-10-28 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized therapeutic agent compositions, delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5359030A (en) * 1993-05-10 1994-10-25 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
CN1057534C (zh) * 1993-08-17 2000-10-18 柯瑞英-艾格公司 促红细胞生成素类似物
US5643575A (en) * 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5919455A (en) * 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5932462A (en) * 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
ES2093593T1 (es) * 1995-05-05 1997-01-01 Hoffmann La Roche Proteinas obesas (ob) recombinantes.
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
US6025324A (en) * 1996-05-15 2000-02-15 Hoffmann-La Roche Inc. Pegylated obese (ob) protein compositions
TW517067B (en) * 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
ES2208798T3 (es) * 1997-09-01 2004-06-16 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Eritropoyetina humana recombinante con un perfil de glicosilacion ventajoso.
EP1135493A2 (en) 1998-11-30 2001-09-26 Eli Lilly And Company Erythropoietic compounds
CZ299516B6 (cs) * 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
JO2291B1 (en) * 1999-07-02 2005-09-12 اف . هوفمان لاروش ايه جي Erythropoietin derivatives
WO2001068141A2 (en) 2000-03-17 2001-09-20 Maxygen Aps Dispersions of polypeptide conjugates
US6586398B1 (en) 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
ME00673B (me) * 2000-05-15 2011-12-20 Hoffmann La Roche Nova farmaceutska smjesa

Also Published As

Publication number Publication date
AU736067B2 (en) 2001-07-26
JP3727009B2 (ja) 2005-12-14
IT1318606B1 (it) 2003-08-27
HUP0002553A3 (en) 2005-11-28
JP2004155787A (ja) 2004-06-03
NL300289I2 (nl) 2010-02-01
SK9872000A3 (en) 2002-06-04
DE60036053T2 (de) 2008-01-03
DOP2000000030A (es) 2002-07-15
ES2191511A1 (es) 2003-09-01
KR100593143B1 (ko) 2006-06-26
GB0016205D0 (en) 2000-08-23
SG92717A1 (en) 2002-11-19
DE122007000064I2 (de) 2010-03-25
YU40700A (sh) 2003-12-31
MA26746A1 (fr) 2004-12-20
CY2007021I1 (el) 2009-11-04
TWI235667B (en) 2005-07-11
GB2393960B (en) 2004-08-04
PE20010297A1 (es) 2001-03-07
CA2310536A1 (en) 2001-01-02
LU91363I2 (fr) 2007-11-12
HK1033328A1 (en) 2001-08-24
FR2795734B1 (fr) 2005-09-30
NO20003372D0 (no) 2000-06-28
EP1839676A2 (en) 2007-10-03
CO5190661A1 (es) 2002-08-29
NL300289I1 (nl) 2007-11-01
HUP0002553A2 (en) 2001-03-28
CN1515590A (zh) 2004-07-28
NO327043B1 (no) 2009-04-06
ES2191511B1 (es) 2005-01-01
GB2393960A (en) 2004-04-14
EA200000607A1 (ru) 2001-02-26
PL341187A1 (en) 2001-01-15
DK1064951T3 (da) 2007-10-08
CY2007021I2 (el) 2009-11-04
ATE370748T1 (de) 2007-09-15
SV2002000120A (es) 2002-01-31
LU91363I9 (sr) 2018-12-31
ID26447A (id) 2001-01-04
GT200000109A (es) 2001-12-21
HRP20000436A2 (en) 2001-06-30
IL137056A0 (en) 2001-06-14
NO20003372L (no) 2001-01-03
TR200001956A2 (tr) 2001-01-22
CA2310536C (en) 2007-09-11
US20030120045A1 (en) 2003-06-26
GB2353281B (en) 2004-06-09
IS2492B (is) 2009-02-15
ITMI20001479A0 (it) 2000-06-30
NO2009010I2 (no) 2014-06-02
UY26228A1 (es) 2000-10-31
TNSN00147A1 (fr) 2005-11-10
GEP20022804B (en) 2002-09-25
MY128500A (en) 2007-02-28
CY1107719T1 (el) 2010-07-28
PT1064951E (pt) 2007-09-10
NZ505454A (en) 2001-12-21
AR055650A2 (es) 2007-08-29
SK286301B6 (en) 2008-07-07
FR07C0051I2 (fr) 2008-05-09
HU0002553D0 (en) 2000-08-28
CZ299516B6 (cs) 2008-08-20
KR20010049676A (ko) 2001-06-15
EP1064951A2 (en) 2001-01-03
GB2393960C (en) 2012-08-29
BG65449B1 (bg) 2008-08-29
GB2353281A (en) 2001-02-21
BRPI0002276B8 (pt) 2021-05-25
EP1839676A3 (en) 2008-09-03
PA8497801A1 (es) 2001-12-14
CN1184233C (zh) 2005-01-12
MXPA00006547A (es) 2004-10-28
EP1064951A3 (en) 2002-03-20
AU4274400A (en) 2001-01-04
AR024625A1 (es) 2002-10-16
ITMI20001479A1 (it) 2001-12-30
DE60036053D1 (de) 2007-10-04
NO2009010I1 (no) 2009-05-25
SI1064951T1 (sl) 2007-12-31
CN1280137A (zh) 2001-01-17
NL300289I9 (nl) 2019-08-21
CN1283664C (zh) 2006-11-08
FR2795734A1 (fr) 2001-01-05
GB0400086D0 (en) 2004-02-04
DE122007000064I1 (de) 2008-01-03
BR0002276A (pt) 2001-12-11
JP2001064300A (ja) 2001-03-13
DE10031839A1 (de) 2001-02-01
EP1064951B1 (en) 2007-08-22
ES2289985T3 (es) 2008-02-16
BG104570A (en) 2001-09-28
HRP20000436B1 (en) 2008-01-31
BRPI0002276B1 (pt) 2019-05-14
HK1068354A1 (en) 2005-04-29
CZ20002386A3 (cs) 2002-04-17
US6583272B1 (en) 2003-06-24
GC0000197A (en) 2006-03-29
OA11442A (fr) 2004-04-28
EA003777B1 (ru) 2003-08-28
IS5554A (is) 2001-01-02
FR07C0051I1 (sr) 2007-12-14
PL202758B1 (pl) 2009-07-31
HU226233B1 (en) 2008-07-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2310536C (en) Erythropoietin derivatives
CA2378533C (en) Erythropoietin conjugates with polyethylenglycol
CN100365117C (zh) 聚乙二醇化和双糖基化的红细胞生成素
EP1311285B2 (en) Liquid pharmaceutical composition containing an erythropoietin derivative