PL108863B1 - Method of producing maytansinol and derivatives thereof - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania maytansinolu i jego pochodnych, takich jak may- tanacyny i propionianu maytansinolu, wykazujacych wlasciwosci czynników przeciwnowotworowych.Wiadomo jest, ze sposród powyzszych zwiazków wysoka czynnosc przeciwnowotworowa wykazuja maytanacyna i propionian maytansinolu (Kupchan i inni, Journal of the American Chemical Society 97, 5294 (1975). Maytansinol ma jedynie slaba czyn¬ nosc przeciwnowotworowa (patrz powyzszy odnos¬ nik), lecz stanowi uzyteczny zwiazek przejsciowy, z którego latwo mozna otrzymac maytanacyne i propionian maytansinolu oraz inne pochodne.Maytansinol i maytanacyna zostaly otrzymane przez Kupchena i innych z kory Putterlickia ver- rucosa (roslina nalezaca do rodzaju Maytenus), jednak z bardzo niska wydajnoscia (0,025 mg pierw¬ szego i 0,36 mg drugiego zwiazku z kilograma wy¬ suszonej kory). Propionian maytansinolu zostal otrzymany przez chemiczne propionowanie maytan¬ sinolu.W trakcie badania próbek gleby wyodrebniono mikroorganizmy, które w pozywce hodowlanej nie¬ oczekiwanie wytworzyly maytansinol, maytanacyne lub propionian maytansinolu. Sa to mikroorganiz¬ my, nalezace do rodzaju Nocardia.Sposób wytwarzania maytansinolu, maytanacyny lub propionianu maytansinolu wedlug wynalazku polega na tym, ze poddaje sie fermentacji mikro¬ organizm, nalezacy do rodzaju Nocardia, Nocardia 10 1S it 23 10 C 15003 (ATCC 31281, IFO 13726, FERM 3992) w pozywce, zawierajacej zródla przyswajalnego wegla i azotu, i wytworzony w pozywce maytansi¬ nol, maytanacyne lub propionian maytansinolu wyodrebnia sie z pozywki hodowlanej.Wedlug dotychczasowego stanu techniki, powyz¬ sze zwiazki mozna bylo uzyskiwac z roslin, lecz jedynie z nielicznych. Produkcja jest kosztowna i czasochlonna na kazdym z etapów, tj. hodowli, wyrebu, suszenia i proszkowania roslin oraz eks¬ trakcji, wyodrebniania i oczyszczania zwiazków, a przy tym wydajnosc jest niska.W przeciwienstwie do tego, prowadzac proces sposobem wedlug wynalazku porzez hodowle mikroorganizmu, uzyskuje sie pozadane zwiazki z wysoka wydajnoscia.Sposób wedlug wynalazku jest pierwszym przy¬ kladem uzyskiwania maytansinolu i jego pochod¬ nych jako metabolitów mikroorganizmów.Szczep Nocardia C-15003 wyodrebniony zostal z gleby i innych próbek w skriningowych poszuki¬ waniach mikroorganizmów, wytwarzajacych anty¬ biotyki.Mikrobiologiczna charakterystyke szczepu C-15003 okreslono sposobami analogicznymi do zapropono¬ wanych przez Schirlinga i Gottlieba (International Journal of Systematic Bacteriology 16,313-340 (1966).Wyniki obserwacji, prowadzonych w 28°C w ciagu 21 dni sa nastepujace: 1) Charakterystyka morfologiczna 108 863108 .... ¦.'¦ , = 3 ;- ¦. - , ¦ , .. ¦ Grzybnia wegetatywna rozprzestrzenia sie dob¬ rze i rozwija w rozgalezieniach, zarówno na agarze, jak i w pozywce plynnej. Wiele sposród strzepków ma srednice 0,8 do 1,2 jim, a w pewnych przypad¬ kach moga one dzielic sie na fragmenty, przypomi¬ najace bakterie paleczkowe lub na krótkie odga¬ lezienia. Szczep daje dobre wzrosty na róznych pozywkach taksononicznych, z grzybnia powietrzna nalozona na grzybnie wegetatywna, choc czesto przyjmuje postac tworów podobnych do koremii (50—200X200—1000 jim), na których nastepuje dal¬ szy wzrost powietrzny. Grzybnia powietrzna czesto jest 'falista, a czasami napotyka sie konfiguracje proste lub w postaci luznej spirali.Mikroskopowe badania starszych hodowli wyka¬ zuja, ze jedynie w nielicznych przypadkach komór- * ki konidialne wystepuja w lancuchach, natomiast zawiesiny komórkowe, uzyskane z powierzchni ta¬ kich hodowli, wykazuja w badaniach mikroskopo¬ wych wiele tworów w ksztalcie wydluzonej elip¬ soidy (0,8—1,2 ^imX4,8—6,8 \xm) i elipsoidalnych (0,8—1,2 1,0—2,0 pim), przypominajacych artrospory.Obserwacje pod mikroskopem elektronowym wy¬ kazuja, ze powierzchnia powyzszych tworów jest gladka. 2) Skladniki komórek Szczep hodowano na. wstrzasarce, w zmodyfiko-.. wanej pozywce ISP nr 1, w 28°C, w ciagu 66 do 90 godzin. Po zakonczeniu hodowli komórki zbie¬ rano i przemywano. Sposobami B. Beckera i innych [Applied Microbiolojgy 1Z 421 (1964] i sposobem, M. P. Lechevaliera [Journal of Laboratory and Clinical Medicine, 71, 934 (1968)] powyzsze cale ko¬ mórki badano na obecnosc kwasu dwuaminopime- linowego i sklad cukrów. Stwierdzono, ze kwas dw^aminopimelinowy jest w konfiguracji mezo i znaleziono plamy, odpowiadajace galaktozie i arabi- nozie. ¦ .. . 3). Charakterystyka na pozywkach taksomicznyeh Szczep wykazal stosunkowo dobry wzrost na róznych pozywkach, z grzybnia wegetatywna bez¬ barwna do jasnozóltej w poczatkowych fazach ho¬ dowli i jasnozóltawobrazowa do zóltawobrazowej w fazach pózniejszych. W róznych pozywkach tak¬ sonomicznych szczep produkuje rozpuszczalne pig¬ menty, zólte- do zóltawobrazowych. Grzybnia po¬ wietrzna jest proszkowana i zwykle daje umiarko¬ wany wzrost, barwy bialej do zóltej lub jasno- zóltawobrazowej. Charakterystyke szczepu w róz¬ nych pozywkach taksonomicznych przedstawiono w tablicy I.Tablica I Charakterystyka hodowlana szczepu C-15003 na pozywkach taksonomicznych (A) Agar sacharozowo-azotanowy Wzrost (G): bujny, barwa jasnozólta melonowa (3 ia)* do bursztynowej (31C)*, two¬ rza sie ciala podobne do koremii Grzybnia powietrzna (AM): skapa, barwy bialej 863 4 Rozpuszczalny pigment (SP): brak lub jasno- (B) zóltawobrazowy Agar glicerynowo-azotowy: G: AM: SP: umiarkowany, barwy kosci sloniowej (2 ca)*, tworza sie ciala .podobne do ko¬ remii - umiarkowana, barwy bialej brak (C) Agar glukozowo-asparaginowy: G: AM: SP: umiarkowany: barwa jasnej nagietki (3 pa)* do jasnozóltej (2 pa)* skapa, barwy bialej jasnozólty (2 pa)* (D) Agar glicerynowo-asparginowy: G: AM: SP: (E) .Agai (F) G: AM: SP: umiarkowany, barwy kosci sloniowej (2 ca)*, tworza sie ciala podobne do koremii skapa, barwy bialej brak skrobiowy: umiarkowany, barwy kosci sloniowej (2 ca)* do pszenicznej (2 ea)*, tworza sie ciala podobne do koremii obfita, barwy kosci sloniowej (2 ca)* brak .Agar odzywczy: G: AM: SP: (G) Agai G: AM: SP: (H) Agai (I) (J) umiarkowany, barwy kosci sloniowej (2 ca)* do zólcieni kolonialnej (2 ga)*, tworza sie ciala podobne do koremii skapa, barwy bialej brak • z jablezanem wapnia: umiarkowany, barwy kosci sloniowej (2 ca)* do pszenicznej (2 ea)*, tworza sie ciala podobne do koremii umiarkowana, barwy bialej do kosci ' sloniowej (2 ca)* brak • z ekstraktem z drozdzy i z ekstraktem slodowym: G: AM: SP: Agar G: AN: SP: Agai umiarkowany, barwy bursztynowej (3 lc)* do jasnozóltej (3 la)* tworza sie ciala podobne do koremii umiarkowana, barwy bialej do kosci sloniowej (2 ca)* brak z maka owsiana: umiarkowany, barwy kosci sloniowej (2 ca)* do zólcieni kolonialnej (2 ga)*, tworza sie ciala podobne do koremii skapa, barwy bialej do jasnozóltej brak * z peptonem, ekstraktem z drozdzy i ze- lazem: |108863 1 G: AM: | SP: umiarkowany, barwy zólcieni kolonial¬ nej (2 ga)* brak zólcien kolonialna (2 ga)* | (K) Agar tyrozynowy: | G: AM: ' SP: umiarkowany, barwy kosci sloniowej (2 ca)* do jasnozóltej melonowej (3 ca)*, tworza sie ciala podobne do koremii umiarkowana, barwy bialej do kosci sloniowej (2 ca)* wielbladzi (3 ie)* | * Oznaczenie barw wedlug Color Harmony Manual, wyda¬ nie czwarte (Container Corporation of America, 1958) 4) Charakterystyka fizjologiczna Charakterystyke fizjologiczna szczepu przedsta¬ wiono w tablicy II. Zakres temperatury wzrostu: 12—38°C. Dobry wzrost powietrzny na agarze (ISP nr 2) wystepuje w zakresie 20—35°C.Tablica II Fizjologiczna charakterystyka szczepu C-15003 Zakres temperatury dla wzrostu: zakres temperatury dla wzrostu powietrznego: uplynnianie zelatyny: hydroliza skrobi: redukcja azotanów: peptonizacja mleka: koagulacja mleka: rozklad kazeiny: wytwarzanie pigmentów melanoidowych: rozklad tyrozyny:. rozklad ksantyny: rozklad hipoksantyny: tolerancja na lizozym: tolerancja na chlorek sodu: 12 do 38°C i 20 do 35°C dodatnie dodatnia dodatnia dodatnia ujemna dodatni ujemne (agar z peptonem, ekstraktem z drozdzy i zela- lazem) dodatnie (agar tyrozyno¬ wy) dodatni ujemny ujemny dodatnia 2f/o 5) Utylizacja zródel wegla Utylizacje róznych zródel wegla badano, stosu¬ jac pozywke opisana przez Pridhama i Gottlieba [Journal of Bacteriology 56, 107 (1948)] i pozywke podstawowa o tym samym skladzie +0,1% eks¬ traktu z drozdzy. Uzyskane widmo przedstawiono w tablicy III. 15 25 30 35 50 55 6 Tablica III Utylizacja zródel wegla przez szczep C-15003 10 Zródlo wegla D-ksyloza L-arabinoza 1 D-glukoza D-galaktoza D-fruktoza L-ramnoza D-mannoza sacharoza rafinoza i-inozytol D-mannitol gliceryna skrobia rozpuszczalna laktoza maltoza trehaloza kontrola wzrosit + +,+• + + + +•' + + + +' + + + +,+ + h-: + + + H-rf" ++¦ +¦+; | ± + 1 — <— | ++ ¦++; | — * | + ¦+: | — — - *~~ + ++ 1 1 * pozywka podstawowa +0,1% ekstraktu z drozdzy Skala ocen: + + + wzrost obfity, ++wzrost dobry, +' wzrost, ± wzrost slaby, — brak wzrostu ) Dalsza charakteryzacja Komórki zbierano sposobem opisanym w 2), a DNA preparowano sposobem, analogicznym do opisanego przez J. Marmura i innych (Journal of 40 Molecular Biology, 3, 208, 1961). Zawartosc G-C (guanina-cytozyna) w DNA wynosi okolo 71 mol%.Wybarwienie Grama grzybni wegetatywnej szczepu jest dodatnie.Powyzsza charakterystyke szczepu nr C-15003 tó porównano z opisami w dzielach S. A. Waksmana „The Actinomycetes", tom 2 (The Williams and Wilkins Co., 1961) i R. E. Buchanana i N. E. Gib- bonsa „Bergey's Manual of Determinative Bacterio¬ logy", wydanie ósme, 1974 oraz w innej literaturze.Szczep C-15003 nalezy do grupy III rodzaju Nocardia, a z faktu, ze opisana charakterystyka nie odpowiada zadnemu ze szczepów znanych wynika, ze szczep C-15003 jest mikroorganizmem nowego gatunku.Szczep C-15003 zdeponowano w Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (FERM) z numerem 3992 i w In¬ stitute for Fermentation, Osaka (IFC) z numerem IFO 13726 oraz w The American Type Culture 60 Collection (ATCC), Maryland, USA, z numerem 31281.Jako pozywke do hodowli szczepu, wytwarzaja¬ cego maytansinol, maytanacyne lub propionian maytansinolu (szczepu produkcyjnego), mozna sto- 65 sowac jakakolwiek pozywke plynna lub stala, za-7 wierajaca skladniki odzywcze, utylizowane przez szczep. W celu uzyskania wysokiej wydajnosci ko¬ rzystnie jest stosowac pozywke plynna. Pozywka moze zawierac zródla wegla i azotu, asymilowane i metabolizowane przez szczep, skladniki nieorga¬ niczne, sladowe skladniki odzywcze itp. Jako przy¬ klady zródel wegla mozna wymienic glukoze, lak¬ toze, sacharoze, maltoze, dekstryne, skrobie, glice¬ ryne, mannit, sorbit itp., tluszcze i oleje (np. olej sojowy, olej smalcowy, olej kurzy itp.) i inne. Zród¬ lem azotu moze byc np. ekstrakt miesny, suszone drozdze, maka sojowa, namok kukurydziany, pep¬ ton, kazeina, maka z nasienia bawelny, odpadowa melasa, mocznik, sole amonowe (np. siarczan amo¬ nu, chlorek amonu, azotan amonu, octan amonu itp,) i inne. Pozywka moze ponadto zawierac sole sodu, potasu, wapnia, magnezu, zelaza, manganu, cynku, kobaltu, niklu itp., sole kwasu fosforowego, kwasu borowego itp., oraz sole kwasów organicz¬ nych, jak octany i propioniany. Do pozywki mozna równiez dodac róznych aminokwasów, jak np. kwas glutaminowy, kwas asparaginowy, alanina, glicyna, lizyna, metionina itp., peptydów, np. dwu- peptydów, trójpeptydów itp., witamin, np. Bly B2, kwasu nikotynowego, B12, C, E itp., kwasów nuklei¬ nowych, np. puryny, pirymidyny i ich pochodnych itp. W celu doprowadzenia pH do pozadanej war¬ tosci mozna do pozywki dodac nieorganicznych lub organicznych kwasów, zasad, buforów itp. Jako czynniki, przeciwdzialajace pienieniu, mozna sto¬ sowac w pozywce odpowiednie ilosci olejów, tlusz¬ czów, srodków powierzchniowo-czynnych itp.Hodowle mozna prowadzic stacjonarnie, na wstrzasarce, podpowierzchniowo aerobowo i w in¬ nych warunkach. W celu uzyskania wysokiej wy¬ dajnosci korzystnie jest oczywiscie prowadzic ho¬ dowle podpowierzchniowo aerobowo. Warunki ho¬ dowli sa oczywiscie zalezne od wlasciwosci fizycz¬ nych i .skladu pozywki, szczepu, sposobu hodowli i innych czynników, jednak zwykle korzystne jest prowadzic inkubacje w 20 do 35°C, przy poczatko¬ wej wartosci pH=7,0 lub zblizonej. Szczególnie pozadana jest temperatura 23—30°C w przejscio¬ wym etapie hodowli, z poczatkowa wartoscia pH= =6,5—7,5. Czas inkubacji równiez jest zmienny, w zaleznosci od wyzej wymienionych czynników.Zaleca sie prowadzic inkubacje do uzyskania ma¬ ksymalnej wartosci pozadanego miana antybioty¬ ków. W przypadku hodowli na wstrzasarce lub pod- powierzchniowej aerobowej, czas inkubacji wynosi zwykle od okolo 48 do 144 godzin.Aktywnosc antybiotyku oznacza sie stosujac jako organizm testowy Tetraphyrriena pyriformis W.Powyzszy organizm hoduje sie na pozywce testowej m. (20 g proteo^y-peptonu (Difco), 1 g ekstraktu z drozdzy (Difco), 2 g glukozy, 1000 ml wody desty¬ lowanej i 10 ml IM buforu fosforanowego (pH= =7,0) w 28°C, w ciagu 44 do 48 godzin/a aktywnosc antybiotyku oznacza sie metoda seryjnych rozcien- czen, mierzac zmetnienie hodowli oraz technika chromatografii cienkowarstwowej (TLC), dalej opi¬ sanymi.Maytanacyna, propionian maytansinolu lub may- tansinol jest wytwarzany i akumuluje sie w brze- 863 s czce hodowlanej, zarówno pozakomórkowo, jak i ' wewnatrzkomórkowo.Zadna z powyzszych substancji nie wykazuje wy¬ raznej czynnosci antybiotycznej, w zwiazku z czym 5 wykrywa sie je rozwijajac równolegle chromato- gram cienkowarstwowy, z wywolaniem biologicz¬ nym za pomoca szczepu Tetraphymena. Przez sa¬ czenie lub wirowanie brzeczke fermentacyjna roz¬ dziela sie na komórki i ciecz, a ciecz ekstrahuje 10 w stosunku 1:1 octanem etylu. Komórki zalewa sie w stosunku 1:1 70% acetonem w wodzie, miesza sie w ciagu godziny w 20°C i odsacza zawiesine.Z przesaczu odpedza sie aceton, a otrzymany roz¬ twór wodny ekntrahuje octanem etylu. Kazdy 15 z ekstraktów zateza sie do 1/100 objetosci poczatko¬ wej i poddaje chromatografii cienkowarstwowej na plytach z zelem krzemionkowym (Merck, RFN, Kieselgel 60 F254, warstwa grubosci 0,25 mm, wy¬ miary plyty 20X20, uklad rozpuszczalników chloro- 20 form-metanol 9:1). Aktywnosc okresla sie na pod¬ stawie intensywnosci plam, wykrywanych przez napromieniowanie swiatlem nadfioletowym 2537 A.Maytanacyna, propionian maytansinolu i may- tansinol, wytworzone w brzeczce, sa zwiazkami li- 25 pofilowymi i obojetnymi. Dogodnie mozna je od¬ zyskac metodami wyodrebniania i oczyszczania, zwykle stosowanymi do odzyskiwania takich me¬ tabolitów. Przykladowo, mozna zastosowac sposoby, wykorzystujace róznice rozpuszczalnosci antybioty- so ku i zanieczyszczen, frakcjonowanie, wykorzystuja¬ ce róznice w powinowactwie adsorpcyjnym na róz¬ nych adsorbentach, jak wegiel aktywny, makro- porowate zywice niejonowe, zel krzemionkowy, tle¬ nek glinu itp., usuwanie zanieczyszczen za pomoca 35 zywic jonitowych itp., oddzielnie lub w odpowied¬ niej kombinacji lub w powtórzeniach.Poniewaz, jak wspomniano, maytanacyna, pro¬ pionian maytansinolu i maytansinol wystepuja za¬ równo w plynie, jak i w komórkach, antybiotyki 40 wyodrebnia sie i oczyszcza za pomoca adsorbentu, jezeli takowy jest stosowany, badz to bezposrednio badz tez po ekstrakcji rozpuszczalnikiem w przy¬ padku plynu lub po ekstrakcji rozpuszczalnikiem w przypadku komórek. Ekstrakcje rozpuszczalni- 45 kiem mozna przeprowadzic np. z brzeczki hodo¬ wlanej przed oddzieleniem komórek, albo z ko¬ mórek i plynu uzyskanego przez saczenie, wirowa¬ nie lub innymi sposobami. Niezalezna ekstrakcje plynu i komórek mozna korzystnie przeprowadzic 50 nizej opisanym sposobem.Rozpuszczalnikami odpowiednimi do ekstrakcji plynu sa nie mieszajace sie z woda rozpuszczalniki organiczne, jak estry kwasów tluszczowych, np. octanu etylu i octanu amylu, alkohole, np. butanol, 55 chlorowcowane weglowodory, np. chloroform i ke¬ tony, np. keton metyloizobutylowy. Ekstrakcje przeprowadza sie przy odczynie bliskim obojetne¬ mu, korzystnie plyn hodowlany, doprowadzony do pH=7, ekstrahuje sie octanem etylu. Ekstrakt prze- 60 mywa sie woda i zateza pod zmniejszonym cisnie¬ niem. Do koncentratu dodaje sie niepolarnego roz¬ puszczalnika, takich jak eter naftowy lub heksan, uzyskujac surowy produkt I, zawierajacy zwiazek czynny/Poniewaz w chromatografii cienkowarstwo- 65 wej wykrywa sie szereg plam innych poza odpo-108 863 9 10 wiadajacymi maytanacynie, propionianowi maytan¬ sinolu lub maytansinolowi, produkt I poddaje sie procesowi oczyszczania. Uzyteczne sa rutynowe pro¬ cedury, zwlaszcza chromatografia adsorpcyjna na takich t zwykle stosowanych adsorbentach jak zel krzemionkowy, mikroporowate niejonowe zywice adsorpcyjne itp.Najkorzystniejszym adsorbentem do oczyszcza¬ nia surowego produktu I jest zel krzemionkowy.Chromatogram mozna rozwijac poczatkowo eterem naftowym i heksanem, a elucje prowadzic rozpusz¬ czalnikiem polarnym, jak octan etylu, aceton, eta¬ nol lub metanol. W typowym procesie z zastosowa¬ niem jako nosnika zelu krzemionkowego (Merck, RFN, 0,05—0,2 mm) chromatografie kolumnowa pro¬ wadzi sie mieszanina heksanu z octanem etylu o wzrastajacym stezeniu drugiego skladnika. Eluat zbiera sie, bada chromatografia cienkowarstwowa, a frakcje, zawierajace skladniki czynne, laczy i za- teza pod zmniejszonym cisnieniem. Do koncentra¬ tu dodaje sie eteru naftowego lub heksanu, uzys¬ kujac surowy produkt II. Poniewaz produkt ten nadal zawiera zanieczyszczenia, oczyszcza sie go dalej, np. na drugiej kolumnie z zelem krzemionko¬ wym, stosujac inny uklad rozpuszczalników. Sto¬ sowany do tego celu uklad rozwijajacy moze skla¬ dac sie z chlorowcowanego weglowodoru, jak dwu- chlorometan lub chloroform z dodatkiem rozpusz¬ czalnika polarnego, takiego jak alkohol, np. etanol lub metanol, ketonu, np. acetonu lub ketonu me- tyloetylowego itp. W powyzszy sposób wyodrebnia sie maytanacyne, propionian maytansinolu lub may- tansinol. Kolejnosc ukladów rozpuszczalników dla pierwszej i drugiej kolumny mozna odwrócic, a je¬ zeli to jest konieczne, lacznie z powyzszymi ukla¬ dami mozna uzyc innych, zwyklych rozpuszczalni¬ ków organicznych.W przypadku oczyszczania surowego produktu II za pomoca makroporowatej zywicy adsorpcyjnej, elucje maytanacyny, propionianu maytansinolu lub maytansinolu przeprowadza sie mieszanina wody z nizszym alkoholem, nizszym ketonem lub estrem.Nizszym alkoholem moze byc np. metanol, etanol, propanol lub butanol, a nizszym ketonem np. ace¬ ton lub keton metyloetylowy. Estrem moze byc np. octan etylu. W typowej procedurze, surowy pro- 10 15 20 dukt II rozpuszcza sie w 60% wodnym metanolu i adsorbuje na kolumnie z sorbentem Diaion HP-10 (Mitsubishi Kasei K. K.). Kolumne przemywa sie 70% wodnym metanolem, a nastepnie eluuje 90% wodnym metanolem, uzyskujac maytanacyne, pro¬ pionian maytansinolu lub maytansinol.W kazdym z wyzej opisanych procesów frakcje, zawierajace maytancyne, propionian maytansinolu lub maytansinol, laczy sie i odparowuje pod zmniej¬ szonym cisnieniem. Do suchego produktu dodaje, nie 5 do 8 objetosci octanu etylu i pozostawia miesza¬ nine w spoczynku, co powoduje wydzielenie krysz¬ talów maytanacyny, propionianu maytansinolu lub maytansinolu. Mieszanine krysztalów maytancyny i propionianu maytansinolu rozdziela sie na sklad¬ niki, stosujac adsorbent, jak wyzej wspomniane.Frakcjonowana elucje mozna przeprowadzic np. stosujac zel krzemionkowy lub makroporowata nie¬ jonowa zywice i wyzej podane rozpuszczalniki.Jezeli stosuje sie np. zel krzemionkowy, to rozwi¬ janie kolumny prowadzi sie heksanem, octanem ety¬ lu lub mieszanina chloroform-metanol, uzyskujac kolejne propionian maytansinolu i maytanacyne. Po analizie chromatografie cienkowarstwowa frakcje, za¬ wierajace odpowiednie skladniki, zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem, a do koncentratu dodaje octanu etylu. W ten sposób odpowiednie zwiazki uzyskuje sie w postaci krysztalów.Przy stosowaniu jako adsorbentu makroporowa¬ tej zywicy niejonowej, elucje prowadzi sie gra- dientowo, stosujac mieszanine alkoholu, ketonu lub estru z woda, o zmiennym udziale skladników.Przykladowo, elucje gradientowa z zastosowaniem 60% wodnego metanolu i 95% wodnego metanolu z dodatkiem 5% chlorku sodu, uzyskuje sie may¬ tanacyne i propionian maytansinolu w podanej ko¬ lejnosci. Po zebraniu i detekcji z zastosowaniem chromatografii cienkowarstwowej, kazda z grup aktywnych frakcji odparowuje sie pod zmniejszo¬ nym cisnieniem i krystalizuje z octanem etylu.Wydzielone krysztaly zawieraja octan etylu jako rozpuszczalnik krystalizacji, a po suszeniu nad pieciotlenkiem fosforu w 70°C w ciagu 8 godzin 45 wykazuja wlasciwosci fizyczne i chemiczne, przed¬ stawione w tablicy IV. 30 40 Tablica IV 1 Temperatura topnienia °C Skrecalnosc wlasciwa [od]22 Analiza elementarna znaleziono (%) Analiza elementarna obliczono (%) Maytanacyna C30H39CIN2O9 2 235—236 —121±10° (c=0,25, CHCla) C 59,62 H 6,93 N 4,28 Cl 5,74 C 59,85 H 6,48 N 4,61 Cl 5,84 Propionian maytansinolu C81H41C1N209 3 183—190 —127±10° (C = 0,35, CHC18) 59,93 6,82 4,32 5,57i 59,94 6,65 4,51 5,71 Maytansinol C28H37C1N208 4 172,5—174 [ —313±10° (c=0,22, CHC18) 59,28 [ 6,38j 5,02 6,13 59,92; [ 6,60 6,27 f108 863 11 1 * ' Widmo absorbcji w nadfio¬ lecie nm (E) Wimo absorpcji w podczer¬ wieni (cm*1) Widmo masowe (m/e) Kwasny, obojetny lub zasa¬ dowy | Reakcje barwne: i 233 (30330) 240 (prze¬ giecie) 252 (27850) 280 (5680) 288 (5660) 1 1740, 1730, 1670, 1580 545, 485, 470, 450 substancja lipofilowa i obojetna Dragendorffa: dodatnia | Beilsteina: dodatnia 12 $ 233 (30240) 240 (prze¬ giecie 28400) 252 (27650) 280 (5740) 288 (5710) 1740, 1730, 1670, 1760 559, 485, 470, 450 substancja lipofilowa i obojetna Dragendorffa: dodatnia Beilsteina: dodatnia 4 232 (32750) 244 (prze¬ giecie 30850) 252 (31650) 281 (5750) 288 (5700) 175, 1670, 1580 503, 485, 570, 450 substancja lipofilowa i obojetna Dragendorffa: dodatnia Beilsteina: dodatnia Powyzsze dane dotyczace skladu elementarnego, skrecalnosci wlasciwej, widma w nadfiolecie, wid¬ ma w podczerwieni, widma masowego itp. sa w do¬ brej zgodzie z odpowiednimi danymi podanymi dla maytanacyny, propionianu maytansinolu i maytan¬ sinolu, podanymi przez Kupchana i innych (The Journal of American Chemical Society, 97, 5294, 1975).Wynalazek jest ilustrowany ponizszymi przykla¬ dami, nie ograniczajacymi jego zakresu. Jezeli nie zaznaczono inaczej, „czesci" oznaczaja czesci wa¬ gowe, stosunek miedzy „czesciami" a „czesciami objetosciowymi" odpowiada stosunkowi miedzy „gramami" a „mililitrami", a „%" odnosi sie do „wagi/objetosc".Przyklad I. Hodowla produkujacego maytan- sinol, maytancyne i propionian maytansinolu szcze¬ pu Nocardia C-15003 (IFO 13726, FERM 3992, ATCC 31281) na agarze z ekstraktem z drozdzy i ekstra¬ ktem slodowym szczepi sie fermentor o objetosci 200 czesci, zawierajacy 40 czesci objetosciowych po¬ zywki hodowli posiewowej (2% glukozy, 3% skrobi rozpuszczalnej, 1% surowej maki sojowej, 1% na- moku kukurydzianego, 0,5% polipeptonu, 0,3% NaCl, 0,5% CaCoa, pH=7,0). Zaszczepiona pozywke inkubuje sie w 28°C w ciagu 48 godzin, otrzymujac inokulum. 0,5 czesci objetosciowych tak otrzyma¬ nego inokulum przenosi sie do fermentora o po¬ jemnosci 200 czesci objetosciowych, zawierajacego 40 czesci objetosciowych pozywki fermentacyjnej, zlozonej z 5% dekstryny, 3% namoku kukurydzia¬ nego, 0,1% polipeptonu i 0,5% CaCOa (pH=7,0) i w 28°C, w ciagu 90 godzin prowadzi fermentacje, otrzymujac inokulum (hodowle pozioma).Z oznaczenia metoda seryjnych rozcienczen, z zastosowaniem jako organizmu testowego Tetra- phymena pyriformis i propionianu maytansinolu jako standardu miano hodowli wynosi 25/ng/ml.Przyklad II. 10 czesci objetosciowych ino¬ kulum (posiewu), otrzymanego w przykladzie I, przenosi sie do fermentora o objetosci 2000 czesci, zawierajacego 500 czesci objetosciowych pozywki hodowli posiewowej (jak powyzsza) i inkubuje w 28°C w ciagu 48 godzin. 500 czesci objetosciowych otrzymanej hodowli przenosi sie do tanku z nie¬ rdzewnej stali o pojemnosci 50 000 czesci objeto- 20 25 35 sciowych, zawierajacego 30 000 czesci objetoscio¬ wych pozywki hodowli posiewowej i prowadzi fer¬ mentacje w 28°cf, przy napowietrzaniu (30 000 czes¬ ci objetosciowych/minute), mieszaniu (28 obrotów/ minute (1/2DT), pod wewnetrznym cisnieniem (1 kg/ /cm2), uzyskujac hodowle posiewowa. Hodowla ta posiewa sie zbiornik z nierdzewnej stali o obje¬ tosci 200 000 czesci objetosciowych, zawierajacy 100 000 czesci objetosciowych pozywki fermenta¬ cyjnej, podobnej do stosowanej w przykladzie I, stosujac inokulum w objetosci 10% pozywki. Za¬ szczepiona pozywke inkubuje sie w 28°C, przy na¬ powietrzeniu (100 000 czesci objetosciowych/minute), mieszaniu (200 obrotów/minute) 1/2 DT), pod we¬ wnetrznym cisnieniem (1 kg/cm2), w ciagu 90 go¬ dzin. Z oznaczenia sposobem, opisanym w przykla¬ dzie I, miano hodowli wynosi 25 ng/ml. 40 45 90 000 czesci objetosciowych powyzszej hodowli zadaje sie 2000 czesci sorbentu Hyflo-SupercelR (Jones and Manville Products, USA). Po doklad¬ nym wymieszaniu mieszanine saczy sie na filtrze cisnieniowym, uzyskujac 85 000 czesci objetoscio¬ wych przesaczu i 32 000 czesci wilgotnych komórek.Przesacz (85 000 czesci objetosciowych) miesza sie i ekstrahuje 30 000 czesci octanu etylu. Powyzszy zabieg powtarza sie. Ekstrakty laczy sie, dwukrot¬ nie przemywa 30 000 czesci objetosciowych wody, suszy dodatkiem 500 czesci bezwodnego siarczanu sodu i pod zmniejszonym cisnieniem zateza do 200 czesci objetosciowych. Do koncentratu dodaje sie 50 eteru naftowego i odsacza wytracony osad (53 czes¬ ci). Powyzszy surowy produkt I miesza sie z 100 czesciami objetosciowymi octanu etylu i odsacza czesci nierozpuszczone. Przesacz miesza sie z 10 czesciami zelu krzemionkowego (Merck, RFN, 0,05— 55 —0,2 mm) i pod zmniejszonym cisnieniem odpedza octan etylu. Pozostalosc nanosi sie na górna ko¬ lumne z zelem krzemionkowym (400 czesci obje¬ tosciowych). Elucje prowadzi sie 500 czesciami ob¬ jetosciowymi heksanu* 500 czesciami objetosciowy- oo mi mieszaniny heksan-octan etylu (3:1), 500 czes¬ ciami objetosciowymi mieszaniny heksan-octan etylu (1:1), 500 czesciami objetosciowymi miesza¬ niny heksan-octan etylu (3:1), 500 czesciami obje¬ tosciowymi octan etylu, 1000 czesci objetosciowych 65 mieszaniny octan etylumetanol (50:1) i 1000 czes-108 863 13 14 ci objetosciowych mieszaniny octan etylu-metanol (25:1), zbierajac wyciek frakcjami po 100 czesci ob¬ jetosciowych.Z kazdej frakcji 1 czesc objetosciowa odparowuje sie do sucha; a do pozostalosci dodaje 0,1 czesci objetosciowej[ octanu etylu. Wytracona mieszanine nanosi sie na plyte szklana, powleczona warstwa zelu krzemionkowego (Merck, RFN, 60 F^, 0,25 mm, 20X20), w odleglosci 2,5 cm od dolnej krawedzi i na dlugosci okolo 17 cm rozwija ukladem rozpuszczal¬ ników, octan etylu — metanol (19:1). Po rozwinie¬ ciu przeprowadza sie detekcje w swietle nadfiole¬ towym (2537 A).Frakcje czynne nr 25—30 o Rf 0,58—0,63 i frak¬ cje nr 38—40 o Rf 0,25—0,30 zbiera sie i odparowu¬ je pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci po okolo 20 czesci objetosciowych. Do koncentratów dodaje sie po 150 czesci objetosciowych eteru naf¬ towego, otrzymujac 5 czesci surowego produktu II i 2 czesci surowego maytansinolu.W 4G czesciach objetosciowych octanu etylu roz¬ puszcza sie 0,5 czesci wyzej otrzymanego surowego, produktu II, a roztwór dokladnie miesza z 4 czes¬ ciami zelu krzemionkowego (Merck, RFN, 0,05—0,2 mm). Pod zmniejszonym cisnieniem odpedza sie octan etylu. Pozostalosc nanosi sie na góre kolumny z 300 czesciami objetosciowymi zelu krzemionko¬ wego, po czym przemywa kolumne 500 czesciami objetosciowymi chloroformu, a nastepnie eluuje kolejno 500 czesciami objetosciowymi mieszaniny chloroform-metanol (50:1), 500 czesciami objetoscio¬ wymi mieszaniny chloroform-metanol (20:1) i 500 czesciami objetosciowymi mieszaniny chloroform- -metanol (10:1). Wyciek zbiera sie frakcjami po 25 czesci objetosciowych.Po 0,5 czesci objetosciowych kazdej z frakcji od¬ parowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem. Do koncentratu dodaje sie 0,05 czesci objetosciowych octanu etylu, a mieszanine poddaje chromatografii cienkowarstwowej (uklad rozwijajacy: chloroform- -metanol 9:1).Frakcje nr 40 i 41, absorbujace przy 2537 A w strefie o Rf 0,48—0,50, zbiera sie i pod zmniej¬ szonym cisnieniem odparowuje do sucha. Do pozos¬ talosci dodaje sie 0,5 czesci objetosciowej octanu etylu i pozostawia mieszanine w spoczynku, otrzy¬ mujac 0,05 czesci mieszaniny krysztalów maytana- cyny i propionianu maytansinolu. 0,05 czesci powyzszej mieszaniny krysztalów may- tanacyny i propionianu maytansinolu rozpuszcza sie w 5 czesciach objetosciowych metanolu, a do roztworu dodaje sie 04 czesci chlorku sodu i 5 czes¬ ci objetosciowych wody. 200 czesci objetosciowych sorbentu Diaion HP-10 (Mitsubishi Kasei K. K.) upakowuje sie do kolumny i przemywa 600 czes¬ ciami objetosciowymi 50% wodnego metanolu, za¬ wierajacego 5% NaCl. Przez przemyta kolumne przepuszcza sie wyzej sporzadzony roztwór, a na¬ stepnie przeprowadza elucje gradientowa kolumny za pomoca 1500 czesci objetosciowych 60% wodnego metanolu, zawierajacego 5% NaCl i 1500 czesci objetosciowych 95% wodnego metanolu. Wyciek zbiera sie frakcjami po 15 czesci objetosciowych, a kazda z frakcji bada chromatografie cienkowar-6 10 15 stwowa. Frakcje 130—135 zawieraja maytanacyne, a frakcja 138—142 propionian maytansinolu.Kazda grupe frakcji odparowuje sie i rozpuszcza dodatkiem 30 ml wody i 50 ml octanu etylu. Roztwór wstrzasa sie w rozdzielaczu, odrzuca warstwe wo¬ dna, a warstwe octanu etylu dwukrotnie przemywa 30 ml porcjami wódy, suszy nad bezwodnym siar¬ czanem sodu, zateza i pozostawia w spoczynku.W powyzszy sposób z obu grup frakcji otrzymuje sie krysztaly, które odsacza sie i suszy. Otrzymuje sie 0,013 czesci maytanacyny i 0,25 Czesci propionia¬ nu maytansinolu.W 3 czesciach objetosciowych octanu etylu roz¬ puszcza sie 0,2 czesci wyzej otrzymanego surowca maytansinolu, "roztwór dokladnie miesza sie z 0,5 czesciami zelu krzemionkowego (Merck, RFN, 0,05—0,2 mm), po czym pod zmniejszonym cisnie¬ niem odpedza octan etylu. Pozostalosc nanosi sie na góre kolumny z 80 czesciami zelu krzemionko- 20 wego, po czym przemywa kolumne 15Ó czesciami chloroform^, a nastepnie eluuje kolejno 150 czes¬ ciami objetosciowymi mieszaniny chloroform-me¬ tanol (50:1), 150 czesciami objetosciowymi mieszani¬ ny chloroform-metanol (20:1) i 300 czesciami óbje-' 25 tosciowymi mieszaniny chloroform-metanol (10:1).Wyciek zbiera sie frakcjami po 10 czesci objetos¬ ciowych.Po 0,5 czesci objetosciowych kazdej z frakcji od¬ parowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem. Do kon- 30 centratu dodaje sie 0,05 czesci objetosciowych oc¬ tanu etylu, a mieszanine podaje chromatografii cienkowarstwowej (uklad rozwijajacy chloroform- -metanol 9:1).Frakcje nr 50—52 absorbujace przy 2537 A w strefie o Rf 0,33 — 0,38 zbiera sie i pod zmniej¬ szonym cisnieniem odparowuje do sucha. Do po¬ zostalosci dodaje sie 0,5 czesci objetosciowych oc¬ tanu etylu i pozostawia mieszanine w spoczynku, uzyskujac 0,020 czesci krysztalów maytansinolu.Przyklad III. Przy mieszaniu, 32000 czesci komórek, uzyskanych w przykladzie II, ekstrahuje sie 50 000 czesci objetosciowych 70% wodnego ace¬ tonu, w ciagu 3 godzin, a nastepnie odsacza na fil- 45 trze cisnieniowym. Operacje ekstrakcji 50 000 czes¬ ci objetosciowych 70% wodnego acetonu i saczenia i powtarza sie. Przesacz laczy sie i pod zmniejszo¬ nym cisnieniem odpedza z nich aceton. Uzyskany uklad wodny przepuszcza sie przez kolumne z 5000 50 czesci objetosciowych sorbentu Diaion HP-10 (Mitsubishi Kasei K. K.). Kolumne przemywa nie 2000 czesci objetosciowych wody i 50% wodnego metanolu, a nastepnie eluuje 15 000 czesci objetos¬ ciowych 90% wodnego metanolu. Wyciek odparo- 55 wuje sie pod zmniejszonym cisnieniem do 3 000 czesci objetosciowych i wytrzasa z 3000 czesci obje¬ tosciowych wody i 3 000 czesci objetosciowych oc¬ tanu etylu. Powyzsza procedure powtarza sie. Ek- straty organiczne laczy sie, przemywa woda, suszy 60 dodaniem bezwodnego siarczanu sodu i pod zmniej¬ szonym cisnieniem odparowuje do 200 czesci obje¬ tosciowych. Po dodaniu eteru naftowego, odsacza sie wytracony osad (280 czesci). Wyzej otrzymany su- .:.-. .^rowy produkt I oczyszcza sie na kolumnie z zelem krzemionkowym, podobnie jak w przykladzie I, u- 35 40108 863 15 16 zyskujac 1,0 czesci surowego produktu II i 0,5 czesci surowego maytansinolu.Przyklad IV. 1000 czesci objetosciowych ho¬ dowli z przykladu II szczepi sie tank z nierdzewnej stali o objetosci 200 000 czesci, zawierajacy 100 000 czesci objetosciowych pozywki hodowli posiewowej, a szczepiona pozywke inkubuje w 28°C, przy napo¬ wietrzaniu (100 000 czesci objetosciowych/minute) i mieszaniu (200 obrotów/minute), w ciagu 48 go¬ dzin, otrzymujac hodowle posiewowa. Te hodowle posiewowa przenosi sie do tanku z nierdzewnej stali o pojemnosci 2 000 000 czesci objetosciowych, zawierajacego 1000 000 czesci objetosciowych po¬ zywki fermentacyjnej, jak uzyta w przykladzie I, a wiec stosujac posiew w ilosci 10% pozywki pro¬ dukcyjnej. Fermentacje prowgdffi sie w 28(*€ przy napowietrzeniu (1 000 000 czesci objetosciowych/mi¬ nute , mieszaniu (120 obrotów/minute) 1/3 DT7 i cis¬ nieniu wewnetrznym (1 kg/cm2), w ciagu 90 godzin.Otrzymana hodowla ma miano 20iig/ml, przy ozna¬ czeniu sposobem opisanym w przykladzie I. Po 900 000 czesci objetosciowych wyzej otrzymanej ho¬ dowli dodaje sie 900 000 czesci objetosciowyuh ace¬ tonu, miesza w ciagu godziny i dodaje 20 000 czesci Hyflo-Supercel (Jones and Mamrille, USA). Calosc 10 19 29 miesza sie dalej, a nastepnie przesacza przez filtr cisnieniowy. Do 1 700 000 czesci objetosciowych ot¬ rzymanego przesaczu dodaje sie 500 000 czesci obje¬ tosciowych wody i w aparacie Podbielniaka (Pod- bielniak, Inc., USA) ekstrahuje mieszanine 1 000 000 czesci objetosciowych octanu etylu. Ekstrakt prze¬ mywa sie woda, suszy dodaniem bezwodnego siar¬ czanu sodu i zateza pod zmniejszonym cisnieniem.Do koncentratu dodaje sie eteru naftowego, wytra¬ cony osad odsacza i suszy. W powyzszy sponób ot¬ rzymuje sie 680 czesci surowego produktu I. Po oczyszczeniu tego produktu, jak w przykladach II i III, otrzymuje sie 1,1 czesci maytanacyny^ 2,2 czes* ci propionianu maytansinolu i 0,1 czesci maytansi¬ nolu.Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania maytansinolu i jego pochod¬ nych, takich jak maytanacyny i propionianu may¬ tansinolu, znamienny tym, ze prowadzi sie fermen¬ tacje mikroorganizmu Nocardia C-15003 (ATCC 31281, IFO 13728, FERM 3992), w pozywce zawie¬ rajacej zródla asymilowanego wegla i azotu, a wy¬ tworzony w pozywce maytansinol, maytanacyne i/lub propionian maytansinolu wyodrebnia sie.LDA — ZakL 2. Zam. 2557/80. 95 egz.Cena 45 zl PL PL PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania maytansinolu i jego pochod¬ nych, takich jak maytanacyny i propionianu may¬ tansinolu, znamienny tym, ze prowadzi sie fermen¬ tacje mikroorganizmu Nocardia C-15003 (ATCC 31281, IFO 13728, FERM 3992), w pozywce zawie¬ rajacej zródla asymilowanego wegla i azotu, a wy¬ tworzony w pozywce maytansinol, maytanacyne i/lub propionian maytansinolu wyodrebnia sie. LDA — ZakL2. Zam. 2557/80. 95 egz. Cena 45 zl PL PL PL