Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych latwo rozszczepialnych substratów enzyma¬ tycznych, odpowiednich do ilosciowego oznaczania proteza zawierajacych w centrum aktywnym reszte seryny i proteaz zawierajacych grupe ,-SH, albo do badania procesów, w których proteazy zawierajace w centrum aktywnym reszte seryny powstaja, sa hamowane lub niszczone, albo przy oznaczaniu czyn¬ ników wplywajacych na przebieg tych procesów lub bioracych w nich udzial.Ostatnia opisano szereg syntetycznych substratów peptydowych. Wiekszosc z nich posiada lancuch trójpeptydowy, w którym albo grupa aminowa N- -koncowego aminokwasu jest zabezpieczona grupa acylowa, albo grupa ta jest wolna lecz posiada kon¬ figuracje D. C-koncowy aminokwas jest zabezpie¬ czony grupa ehromogenna lub fluorogenna, odszcze- piana w czasie reakcji enzymu z. substratem. Tak utworzona uwolniona grupe chromoforowa 'lub fluoryzujaca mozna oznaczac ilosciowo spektrofo- tometrycznie lub fluorymetrycznie.Aktywnosc enzymatyczna mozna okreslic przez pomiar ilosci odszczepionego produktu, uwolnione¬ go w jednostce czasu.Rola krótkiego lancucha peptydowego ma duze znaczenie dla powinowactwa substratu do enzymu.W tym aspekcie wydaje sie byc istotnym to, aby N-koncowy aminokwas albo posiadal konfiguracje L z acylowana grupa aminowa, albo konfiguracje D przy wolnej grupie aminowej. 10 15 20 25 30 Stwierdzono, ze substraty, w których N-konco- wym aminokwasem jest kwas piroglutarninowy, bardzo latwo ulegaja rozszczepieniu przez szereg proteaz zawierajacych w centrum aktywnym reszte seryny. Kwasu piroglutaminowego, którego grupa a-aiminowa nie jest wolna lecz zacylowana przez zamkniecie pierscienia, przez co tworzy sie laktam kwasu glutaminowego, dotychczas nie uzywano w syntezie peptydów, przeznaczonych do uzycia jako substraty do ilosciowgo oznaczania enzymów.Nowe chromogenne substraty, lub ich sole, wy¬ twarzane sposobem wedlug wynalazku, przedstawia nastepujacy wzór ogólny Ri — p-Glu — A± — A2 -NH — R2, w którym'Ri oznacza atom wodoru lub grupe zabezpieczajaca, korzystnie t-butyloksykarbo- nylowa lub benzyloksykarbonylowa, Ai oznacza Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Pro, Pip, Phe lub Tyr, A2 oznacza Arg lub Lys, R2 oznacza odszczepialna przez proteazy ewentualnie podstawiona weglowo¬ dorowa reszte aromatyczna, która w ugrupowaniu -NH-R2 tworzy po odszczepieniu dajaca sie fizyko¬ chemicznie, ilosciowo oznaczac, korzystnie chromo¬ genna lub fluorogenna grupe NH2R2 zwlaszcza taka lak grupa p-nitroanilidowa, P-naftyloamiriowa, 4- -metoksy-P-naftyloaminowa lub 7-amino-4-metylo- kumaryny.W syntezie nowych substratów, wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku mozna uzywac grup za¬ bezpieczajacych i metod sprzegania znanych w che¬ mii peptydów. 116 682116 682 Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze sprzega sie kolejno aminokwasy lub fragmenty pe- ptydowe w znany sposób, przy czym grupe o wzo¬ rze -NHR2, w której R2 ma wyzej podane znaczenie ewentualnie wprowadza sie do reszty arginyiowej lub lizynylowej przed sprzegnieciem tej reszty z fragmentem dwupeptydowym lub grupe o wzorze -NHR2 przylacza sie do wczesniej wytworzonego trójpeptydu i ewentualnie usuwa sie N-koncowa grupe zabezpieczajaca.Tak wiec zasada, na której opiera sie syntetza, jest stopniowe, kolejne vsprzeganie aminokwasów z C-fconcowa reszta arginylowa lub lizynylowa, która uprzednio podstawia sie dajaca sie oznaczac grupa -HN-R2, przy czym wówczas grupa ta pelni funkcje grupy zabezpieczajacej reszte karboksylo¬ wa, albo grupe -NH-R2 przylacza sie do zabezpie¬ czonej pochodnej trójpeptydowej, podstawiona gru¬ pa -NHR2.Niezaleznie od tego, który sposób syntezy wy¬ biera sie, produkty posrednie i koncowe oczyszcza sie przez rekrystalizacje i/lub chromatograficznie metoda saczenia zelowego.Wynalazek objasniaja nastepujace przyklady.Do chromatografii cienkowarstwowej eluatów _ i produktów uzywa sie plytek szklanych pokrytych zelem krzemionkowym F24 (Merck). Uzywa sie na¬ stepujacych ukladów rozpuszczalników. A: n-buta- nol:HOAc:woda 3:2:1 (w stosunku objetosciowym), Pi; chloroform: MeOH 9:1 (w stosunku objetoscio¬ wym).Po przeprowadzeniu rozdzialu chromatograficz¬ nego, plytki oglada sie najpierw w swietle UV (254 mm), a nastepnie spryskuje sie roztworem nin- hydryny i poddaje dzialaniu dwukarboksydyny i chloru. Wartosci R* ustala sie na podstawie Wy¬ ników uzyskanych na pojedynczych chromatogra- mach.W dalszej czesci opisu uzyto nastepujacych skró¬ tów. Podane ponizej skróty odnosza sie do reszt aminokwasowych. Wolne aminokwasy lub peptydy przedstawione sa przez umieszczenie H- przy gru¬ pie aminowej i -OH przy grupie karboksylowej.Grupa aminokwasowa znajduje sie zawsze po lewej stronie, a karboksylowa po prawej.Jesli tego nie zaznaczono inaczej, wszystkie aminokwasy, z wyjatkiem Gly, maja konfiguracje L.Ala .Arg Gly Ile Leu Lys p-Glu Phe Pip Pro Ser Thr Tyr Val HOAc Bz = alanina = arginina = glicyna = izoleucyna = leucyna = lizyna . = kwas piroglutaminówy = fenyloalanina = kwas pipekolinowy = prolina = seryna — treonina = tyrozyna = walina := kwas octowy = benzoil 10 15 BOC = butoksykarbonylo Cbo = karbobenzoksy DCCI = dwucykloheksylokarbodwuifnid PC13 = trójchlorek fosforu DMF = dwumetyloformamid Et3N = trój etyloaimina HOBT= hydroksybenzotriazdl DCHA= dwucykloheksyloamina DCU =* dwucykloheksylomocznik EtOH = etanol MeOH= metanol EtOAc= octan etylu OpNP = p-nitrofenoksy pNA = p-nitroanilid TFA = kwas trójfluorooctowy , (J^NA = (3-naftyloamid 4-MeO-0-NA = 4-metoksy-|3-naftyloamid 7-A-4-M-C = 7-amino-4-metylokumaryna Wynalazek objasniaja podane przyklady, w któ¬ rych uzyty skrót TLC oznacza chromatografie cien¬ kowarstwowa, litera p lub znak < umieszczony przed kwasem glutaminowym, jak np. p-Glu lub < Glu oznacza kwas piro-glutaminowy, a skrót G- -15 oznacza zywice jonowymienna Sephadex G-15.Przyklad I. Wytwarzanie p-Glu-Gly-Arg-pNa- •HC1 (masa czasteczkowa 493,9) (zwiazek I). la. Wytwarzanie Cbo-Gly-Arg(N02)pNA (masa czasteczkowa 530,5) (zwiazek IA).Do 35 g, 0,074 molar Cbo-Arg-(N02)npNA dodaje sie 175 ml stezonego HOAc i 105 ml 5,6 M roztworu HBr w HOAc. Proces prowadzi sie przy mieszaniu przez 30 minut. Po uplywie tego czasu roztwór staje sie przezroczysty. Mieszanine wlewa sie przy ener¬ gicznym mieszaniu do okolo 2 litrów bezwodnego eteru. Utworzony osad odsacza sie, przemywa bez¬ wodnym eterem i suszy pod zmniejszonym cisnie¬ niem nad NaOH.Otrzymany bromowodorek H-Arg(N02)-pNA roz¬ puszcza sie w 150 ml bezwodnego, przedestylowa- inego DMF i zobojetnia w niskiej temperaturze (—1'0°C) za pomoca Et»N az do wykazania slabo za¬ sadowego odczynu zwilzonym papierkiem wskazni¬ kowym, umieszczonym nad mieszanina reakcyjna.Zazwyczaj zobojetnieniu ulega okolo 1,5"Równowaz¬ nika HBr. Utworzony Et^NHBf odsacza sie'.. ""';."" Do mieszaniny reakcyjnej dodaje sie w niskiej temperaturze 26,8 g, 0,81 mola, 1,1 równowaznika, Cbo-Gly-OpNP, a po uplywie 30 minut dodaje sie ponownie 5,2 ml, 0,5 równowaznika, EtaN. Miesza¬ nine reakcyjna pozostawia sie na noc w tempera¬ turze pokojowej, a nastepnie odparowuje .pod zmniejszonym cisnieniem," otrzymujac oleista pozo¬ stalosc, która rozciera sie z 2% wodnym roztworem NaHC03, po czym rozpuszcza w goracym MeOH.Podczas oziebiania, przy mieszaniu roztworu, na¬ stepuje krystalizacja. Otrzymane krysztaly odsacza sie i przemywa zimnym MeOH. Metoda TLC wy¬ kazuje' sie obecnosc nieznacznej ilosci zanieczy¬ szczen. Produkt poddaje sie rekrystalizacji z tego samego rozpuszczalnika, otrzymujac 34 g krysztalów o barwie bialej, nie wykazujacych obecnosci zanie¬ czyszczen w badaniu metoda TLC.Wydajnosc = 86%, Rf ^0,20 (Pi), [a]** -35,4° " «5 (c 0,3 MeOH). 25 30 35 40 45 50 55 60116 682 5 6 Ib. Wytwarzanie Cbo-p-Glu-OH (masa czastecz¬ kowa 263,3) (zwiazek Ib').Do 56,3 g, 0,20 mola, Cbo-Glu-OH rozpuszczonego w 400 ml EtOAc dodaje sie 49,4 g, 0,24 mola, DCCI rozpuszczonego w 60 ml EtOAc, umieszcza sie w laz¬ ni z lodem, poddaje sie mieszaniu przez 2i godziny.Wytworzony DCU odsacza sie i pozostaly roztwór odparowuje do sucha. Otrzymany jako produkt bez¬ wodnik Cbo-Glu poddaje sie krystalizacji z EtOAc i eteru naftowego. Bezwodnik ten rozpuszcza sie w mieszaninie 120 ml dioksanu i 260 ml eteru, a na¬ stepnie dodaje sie 48 ml DCHA rozpuszczonej w ete¬ rze, do objetosci 100 ml. Po pewnym czasie wytraca sie Cbo-p-Glu-DCHA.Mieszanine miesza sie przez, w przyblizeniu, 1 go¬ dzine, a nastepnie utworzona sól DCHA odsacza sie i przemywa eterem i EtOAc, po czym zawiesza sie EtOAc i wytrzasa z roztworem wodnym 25 g, 0,18 mola, KHS04. Tak wytworzony Cbo-p-Glu-OH prze¬ mieszcza sie do fazy EtOAc. Faze te przemywa sie 10% roztworem wodnym NaCl i suszy Na2S04 (istnie¬ je przy tym niebezpieczenstwo wytracenia sie pro¬ duktu).Faze EtOAc odparowuje sie do malej objetosci i w celu wytracenia krysztalów dodaje eter nafto¬ wy. Wytraca sie ciezki osad krystaliczny. Otrzymu¬ je sie 36,9 g zwiazku I b', nie wykazujacego zanie¬ czyszczen w badaniu metoda TLC.Wydajnosc = 80%, Rf = 0,45 (A), [a] ™ -30,3° (c 1,0 MeOH).Ib. Wytwarzanie Cbo-p-Glu-Gly-Arg(N02)pNA (masa czasteczkowa 641,6) (zwiazek Ib). 10,25 g, 18,3 milimola, H-Gly-Arg(NO*)pNA-HBr otrzymanego przez usuniecie grupy zabezpieczajacej z Cbo-Gly-Arg(N02)pNA za pomoca HBr, w sposób jak wyzej opisano w punlkcie la, rozpuszcza sie w 35 ml bezwodnego DMF i zobojetnia w niskiej temperaturze (—10°C) za -pomoca Et3N az do wy¬ kazania slabo zasadowego odczynu zwilzonym pa¬ pierkiem wskaznikowym. Utworzony Et3NHBr od¬ sacza sie. Do mieszaniny reakcyjnej dodaje sie 2,47 g, 18,3 milimola, HOBT i 5,26 g, 20 milimoli, Cbo-p-Glu-OH (Ib'), a nastepnie, w nisikiej tempe¬ raturze, dodaje sie 4,53 g, 22 milimola, DCCI roz¬ puszczonego w malej ilosci DMF.Mieszanine reakcyjna pozostawia sie na noc w temperaturze pokojowej, po czym odparowuje sie, otrzymujac oleista pozostalosc, która rozciera sie z 2% wodnym roztworem NaHCOa, a nastepnie z czy¬ sta woda. Otrzymane cialo stale rozpuszcza sie w malej ilosci wody. Podczas oziebiania, przy miesza¬ niu roztworu, nastepuje 'krystalizacja. Otrzymane krysztaly odsacza sie, otrzymujac po ostroznym wy¬ suszeniu pod zmniejszonym cisnieniem 8,90 g zwiaz¬ ku Ib, nie wykazujacego zanieczyszczen w badaniu metoda TLC.Wydajnosc = 76%, Rf * 0,06 (Pi), [a]2* -21,5° (c 0,8 DMF).I. Wytwarzanie p-Glu-Gly-Arg-p-NA«HCl. Z 0,8 g, 1,25 milimdla,. zwiazku Ib usuwa sie grupe zabez¬ pieczajaca w ciagu 1 godziny w temperaturze 0°C za pomoca 30 ml HF w obecnosci 0,6 ml anizolu. Po odparowaniu pod zmniejszonym cisnieniem, otrzy¬ many zwiazek rozpuszcza sie w okolo 30 ml 2% HOAc i przemywa mala iloscia eteru.Faze wodna poddaje sie rozdzialowi chromatogra¬ ficznemu na kolumnie wypelnionej Sephadex G-15 (Pharmacia Fine Chemicals) w 2% HOAc, uzywajac do elucji tego samego roztworu. Frakcje zawiera- 5 jaca czysty -octan zwiazku I liofilizuje sie, a nastep¬ nie poddaje rozdzialowi na kolumnie wypelnionej wymieniaczem jonowym QAE-25 (Pharmacia Fine Chemicals) w formie chlorku, w ukladzie EtOH: wo¬ da (1:1), uzywajac do elucji tego samego ukladu. 10 Frakcje, zawierajaca czysty chlorowodorek zwiaz¬ ku, I, liofilizuje sie, otrzymujac 485 mg produktu.Wydajnosc = 78%, Rf = 0,29 (A), przy czyim w ba¬ daniu metoda TLC otrzymuje sie tylko jedna plame [a] ^-54,1° (C 1,0 50% HOAc(H20). 15 Przyklady II—XIII sa opisane w tabeli I za¬ mieszczonej w dalszej czesci opisu. Sposób prowa¬ dzenia procesu jest w zasadzie taki sam, jak opiscf- no w przykladzie I, róznia sie jednak dane fizyczne, wydajnosc, metody sprzegania i oczyszczania, jak to 20 uwidoczniono we wspomnianej tablicy 1.Przyklad XIV. p-Glu-Gly-Arg-4-MeO-P-Na- •HOl (masa czasteczkowa 534,0) (zwiazek XIV).Otrzymywanie zwiazku XIV a. p-Glu-Gly-Arg- -OH-HC1 (masa czasteczkowa 378,8). 25 Do roztworu 250 mg, 0,50 milimola, p-Glu-Gly- -Arg^pNA\HCl (S-2444) w 100 ml 0,1 M wodnego roztworu NaHCOs dodaje sie 400 ftl roztworu tryp- syny (Novo), otrzymanego przez rozpuszczenie tryp- syny w 1 ml HOl do stezenia 2,0 mg/ml. Uwalnianie 30 pNA sledzi sie za pomoca pomiarów spektofotome- trycznych przy dlugosci fali 405 nm. Proces uwal¬ niania konczy sie po okolo 45 minutach, przy czym roztwór zakwasza sie za pomoca HO/c do pH okolo 4. 35 Nastepnie odparowuje sie roztwór do sucha, po¬ zostalosc rozpuszcza w MeOH i poddaje rozdzialowi chromatograficznemu na kolumnie wypelnionej LH- -20 (Pharmacia Fine Chemicals) w MeOH, uzywajac do elucji tego samego rozpuszczalnika. Frakcje, za- 40 wierajaca czysty kwas XIV a odparowuje sie, po¬ zostalosc rozpuszcza w wodzie i liofilizuje, otrzymu¬ jac 167 mg produktu.Wydajnosc = 98%, Rf = 0,08 (A), przy czym zwia¬ zek XIV a nie wykazuje zanieczyszczen w badaniu 45 metoda TLC.Otrzymywanie zwiazku XIV. Do roztworu 105 mg, 0,60 mola, 4-MeO-P-NA-HOl w 2,25 ml bezwodnej pirydyny, umieszczonego w lazni z lodem, dodaje sie w warunkach uniemozliwiajacych zawilgocenie 50 roztwór 27 \i\, (0,25 milimola), PCI3 w 450 |a1 bezwod¬ nej pirydyny.Mieszanine reakcyjna pozostawia sie na okolo 45 minut w temperaturze pokojowej, a nastepnie do¬ daje sie cala ilosc zwiazku XIV a, otrzymanego, jak 55 opisano w poprzedniej czesci opisu. Po zakonczeniu reakcji, co nastepuje po okolo 1 godzinie, mieszani¬ ne reakcyjna odparowuje sie pod zmniejszonym cis¬ nieniem, otrzymujac oleista pozostalosc o barwie ciemnoczerwonej. Pozostalosc te rozpuszcza sie w 80 malej ilosci ukladu EtOH : woda, (1:1) i nanosi na kolumne wypelniona QAE-2!5 (Pharmacia Fine Che¬ micals) w formie chlorku, w ukladzie EtOH : woda (1:1), uzywajac do elucji tego samego ukladu.Frakcje, zawierajaca prawie czysty chlorowodo- 65 rek zwiazku XIV, odparowuje sie, rozpuszcza po-116 682 Tabela 1 Zwiazek Przyklad nr Rf (uklad) [aj.Rozpusz¬ czalnik Wydajnosc % 6 78 86 76 84 .53 < Glu-Gly-Arg-pNA N02 Cbo- Cbo- N02 < Glu-Ser-Arg-pNA OBzl N02 Boc-- Cbo- CBzl NQ2 < Glu-Thr-Arg-pNa OBzl N02 Boc- Cbo- OBzl NQ2 < Glu-Val-Arg-pNA N02 Cbo- Cbo- N02 < Glu-Ala-Arg-pNA N02 Cbo- Cbo- N02 < Glu-Pro-Arg-pNA NQ2 Cbo- Cbo- N02 < Glu-Phe-Arg-pNA NQ2 Cbo- Cbo- NQ2 D < Glu-Gly-Arg-pNA NQ2 Cbo- Cbo-D- N02 D < Glu-Pro-Arg-pNA NQ2 Cbo- Cbo-D- NQ2 < Glu-Phe-Lys-pNA £-Cbo Boc Cbo- e-Cbo < Glu-Leu-Lys-pNA £-Cbo Boc— I la Ib 0,29 A 0,20 Pi 0,06 Pt II Ha Ilb 0,29 A - 0,19 Pt 0,15 Pi III Ilia Illb 0,32 A 0,18 Pi 0,16 Pi IV IVa IVb 0,33 A 0,38 Pi 0,08 Pt V Va Vb VI Via Vlb VII VIIa VIIb 0,25 A 0,25 Pi 0,-05 Pi 0,38 A 0,45 Pi 0,69 A .VIII VIIIa VIIIb IX IXa IXb X Xa Xb XI XIa 0,36 A 0,29 Pi 0,03 Pi 0,27 A 0,20 Pi 0,0*6 Pi 0,35 A 0,45 Pi 0,10 Pi 0,33 A 0,55 Pi 0,40 Pi 0,31 A 0,49 Pi -54,1 -35,4 -,21,5 -58,2 -24,9 -18,5 -55,7 -25,4 -25,2 -66,5 - 5,4 -21,5 -0,68 + 2,4 -30,9 -S5r,6 -33,0 -66,3 -22,8 + 5,5 - 7,4 -41,8 -35,4 - 5,7" -99,0 -3'3,0 -37,7 -28,7 + 3,4 - 8,8 -61,7 - 4,5 50% HOAc MeOH DMF 50% HOAc 95% EtOH DMF 50% HOAc 95% EtOH DMF 50% HOAc DMF DM'F 50% HOAc DM'F DM*F MeOH DMF DMF 50% HOAc DMF DMF 50% HOAc MeOH DMF 50% HOAc DMF DMF 50% HOAc DMF DMF 50% HOAc DMF. 72 85 65 56 86 38 58 85 48 73 82 63 94 55 53 86 72 56 82 66 69 77 76 85 85116 682 IG cd. tabeli 1 1 e-Cbo Cbo Cbo-p-Glu-Gly-Arg-pNA H < Glu-Pro-Arg-|3-NA "N02 Cbo — N02 Cbo * < Glu-Gly-Arg-4-MeO-|3- -NA < Glu-Gly-Arg-7-A-4-M-C 2 XIb XII XIIa XIII XIIIa XIIIb XIV XIVa XV 3 0,4* Pi 0,32 A 0,22 A 0,24 A 0,52 Pi 0,36 Pi 0,24 A 0,08 A 0,25 A 4 -27,2 -45,7 — 106) -44,9 -46,5 -45,7 -51,5 5 DMF 50% HOAc MeOH DMF DMF 50% HOAc 50% HOAc 6 57 52; 100 57 82 54 36 88 32 nownie w malej ilosci ukladu EtOH : woda (1:1) i powtarza proces rozdzialu. Otrzymany tak chloro¬ wodorek zwiazku XIV jest czysty i po odparowaniu calej ilosci alkoholu podaje sie go liofilizacji, otrzy¬ mujac 85 mg produktu.Wydajnosc = 36%, Rf = 0,24 (A), przy czym w ba¬ daniu metoda TCL otrzymuje sie tylko jedna pla¬ me, [a] J2-45,7° (c 0,0 50% HOAc (H20).Przyklad XV. Otrzymywanie ,p-Glu-Gly-Arg- -7-A-4-M-C (XV) o wzorze podanym na rysunku (masa czasteczkowa 536,0).Proces prowadzi sie w sposób analogiczny do opi¬ sanego w przykladzie XIV, z tym wyjatkiem, ze uzywa sie 88 mg, 0,50 milimola, 7-A-4-M-C- jako aminy, zamiast 4-MeO-[3-NA*HCl, otrzymuja 84 mg zwiazku XV.Wydajnosc = 32%, Rf = 0,25 (A), przy czym w ba¬ daniu metoda TLC otrzymuje sie tylko jedna pla- mS [a]D5-51»5° & l 50% HOAc (R20).W tabeli 1A podano metody sprzegania, oczyszcza¬ nia itp. stosowane w wyzej opisanych przykladach.Tabela 1A cd. tabeli 1A ! Zwiazek 1 I la Ib II Ila - Ilb III Ilia Illb IV IVa IVb Stosowane odczynniki 2 HF, anizol, G-15,2% HOAc OpNP, kryst. MeOH HOBT, DCCI, kryst. MeOH HF, anizol, G-15,2% HOAc HOBT, DCCI, kryst. eter i HOBT, DCCI, kryst. EtOH+H20 HF, anizol, G-15,2% HOAc HOBT, DCCI, kryst. EtOAc HOBT, DCCI, kryst. EtOAc + eter naftowy HF, anizol, G-15,2% HOAc OpNP, kryst. DMF, MeOH + eter HOBT, DCCI, kryst. EtOH+ H20 30 as 45 50 55 60 65 1 1 V Va Vb VI Via VIb VII VIIa« VIIb 1 VIII VIIIa VIIIb IX IXa 1 IXb X Xa Xb XI XIa XIb XII | XIIa 1 XIII XIIIa | XIIIb XIV XIVa XV % 2 HF, anizol, G-15,2% HOAc OpNP, 'kryst. DMF, MeOH -heter HOBT, DCCI, kryst. aceton+MeOH HF, anizol, QAE-:2l5,95% MeOH OpNP, kryst. EtOAc f eter HOBT, DCCI, kryst. DMF+EtOAc HF, anizol, G-15,2% HOAc OpNP, kryst. MeOH FH^O HOBT, DCCI, kryst. aceton + +MeOH+H20 HF, anizol, G-15,2% HOAc" OpNP, kryst. MeOH HOBT, DCCI, kryst. MeOH+H20 HF, anizol, G-15,2% HOAc OpNP, kryst. EtOAc +eter i HOBT, DCCI, kryst MeOH+H20 HBr/HOAc, QAE-25, 50% EtOH OpNP, krist. MeOH +H20 HOBT, DCCI, kryst. Me0H + H2O HBr/HOAc, QAE-25, 50% EtOH OpNP,''krist. MeOH+H20 HOBT, DCCI, kryst. aceton+MeOH HOBT, DCCI, kryst. 50% EtOH HF, anizol, G-15 2i% HOAc HF, anizol, G-15,10% HOAc OpNP, kryst. EtOAc+ EtOEt HOBT, DCCI, krist. CHC13 4-MeO-(3-NA+PCl8 (pirydyna) + +kwas zgodnie z: p-NA-pochodna + +trypsyna 7-A-4-M-C+PCl3 (pirydyna)+kwas W tabeli 2 uzyto nastepujacych skrótów: S-2'251 = = H-D-Val-Leu-Lys-pNA, S-2160 = Bz-Phe-Val- -Arg-pNa, S-22:22 = Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA (wszy-11 116 682 12 1:2000. Przy dlugosci fali 405 nm absorpcja tych substratów prawie calkowicie zanika.Uwolniony z substratu, w wyniku enzymatycz¬ nej hydrolizy, p-nitroanilid wykazuje maksimum 5 absorpcji przy dlugosci fali 380 nm z molowym wspólczynnikiem ekstynkcji 13200, który przy dlu¬ gosci fali 40'5 nm obniza sie tylko do.9620. Ilosc two¬ rzonego p-nitroanilidu mozna latwo Sledzic za po¬ moca pomiarów spektrofotometrycznych przy dlu- 10 gosci fali 450 nm. Ilosc p-nitroanilidu jest propor¬ cjonalna do szybkosci hydrolizy enzymatycznej, któ¬ ra jest z kolei determinowana przez ilosc aktyw¬ nego enzymu.W celu okreslenia ilosci utworzonej fluoryzacji- 13 * aminy, naswietla sie próbka, stosujac fale o dlugo¬ sci odpowiadajacej swiatlu wzbudzajacemu, to jest dkolo 350 nm w przypadku |3^naftyloaminy i 4-me- toksy-(3-naftyloaminy oraz 380 nm w przypadku 7- -amino-4i-metylokumaryny. Ilosc produktu rozszcze- 20 pienia ustala sie przez pomiary dotyczace swiatla emitowanego, to jest przy dlugosci fali okolo 420 nm w przypadku J3-naftyloaminy i 4-metoksy-P-naftylo- aminy oraz 440 nm w przypadku 7-amino-4-metylo- . kuimaryny. 25 W tabeli 2 przedstawione sa dane odnoszace sie do szybkosci reakcji róznych enzymów z syntetycz¬ nymi substratami. Szybkosc reakcji jest w przypad¬ ku kazdego enzymu- odnoszona do substratu porów¬ nawczego (szybkosc reakcji = 100). Niektóre z po- 30 równawczych substratów sa znane i dostepne w han¬ dlu.Z danych umieszczonych w tabeli 2 wynika, ze nowe substraty wytworzone sposobem wedlug wy¬ nalazku sa uzyteczne, gdyz hydrolizowane sa przez 35 rózne enzymy szybciej, niz substraty dotychczas dostepne. stkie wymienione zwiazki pochodza z Kabi Diagno- stica, Sztoikholm, Szwecja).Pli = plazmina, Try = trypsyna, FXa — czynnik krzepniecia Xa, UK = urokinaza, TA = tkankowy aktywator plazminogenu.Wrazliwosc substratów porównawczych na oma¬ wiane enzymy przedstawiono w nizej podanej tabli¬ cy 3, w której podana wartosc AQD oznacza róz¬ nice optycznej gestosci (przy spektrofotometrycz¬ nym oznaczaniu aktywnosci enzymu).Tabela 2 Wzgledna szybkosc reakcji ["V. Enzym Substrat ^\^ Substrat po¬ równawczy (= 100) I II V "vr" VII X XI XII Fli S- -2251- 10 100 140 3f0 440 450 230 15 Try S- -2:160 330 360 370 250 240 40 60 340 FXa S- ^212122 7 5 2 15 10 0 0 260 UK I 100 65 65 50 8 0 0 - 15 TA I 100 130 150 170 40 10 10 120 | Tabela 3 Enzym Plazmina Trypsyna : FXa Urokinaza " Tkankowy aktywator plazminoge¬ nu Substrat S-2251 S-2160 S-2222 I I Aktywnosc en¬ zymu w stezeniu 4.10-9 mol/(^QD/min) 0,040 0,150 0,200 0,040. 0,040 Oznaczenie proteaz za pomoca substratów posia¬ dajacych grupe odszczepialna, która mozna ozna¬ czyc fizykochemicznie.Uzywa sie substratów wytworzonych w sposób opisany w poszczególnych przykladach do oznacza¬ nia róznych enzymów nizej opisanymi sposobami.Zasada oznaczenia jest oparta na tym, ze widmo UV produktu rozszczepienia, powstajacego w wyni¬ ku hydrolizy enzymatycznej, rózni sie znacznie od widma substratu. Tak wiec wszystkie substraty za¬ wierajace grupe p-nitroanilidowa, wytworzone spo¬ sobem wedlug wynalazku, wykazuja maksimum ab- sporcji prz^ dlugosci fali 310 nm z molowym, wspólczynnikiem ekstynkcji wynoszacym okolo •* Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowych, latwo rozszcze¬ pialnych substratów enzymatycznych do ilosciowe¬ go oznaczania proteaz, o wzorze ogólnym Ri-p-Glu- -A1-A2-NH-R2, w którym Ri oznacza atom wodoru lub grupe zabezpieczajaca, korzystnie t-butyloksy- karbonylowa lub benzyloksykarbonylowa, At ozna¬ cza Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Pro, Pip, Phe lub Tyr, A2 oznacza Arg lub Lys, R2 oznacza od¬ szczepialna przez proteazy ewentualnie podstawiona weglowodorowa reszte aromatyczna, która w ugru¬ powaniu -NHR2 tworzy po odszczepieniu dajaca sie fizykochemicznie, ilosciowo oznaczac, korzystnie chromogenna^ lub fluorogenna.grupe NH2R2 zwlasz¬ cza taka ja/k grupa p-nitroanilidowa, (3-naftyloami- nowa, 4-metoksy-P-naftyloaminow lub 7-amrno-4- -metylokumaryny, znamienny tym, ze sprzega sie kolejno aminokwasy lub fragmenty peptydowe w znany sposób, przy czym grupe o wzorze -NH-R2, w której R2 ma wyzej podane znaczenie ewentual¬ nie wprowadza sie do reszty arginyjowej lub lizy- nylowej przed sprzegnieciem tej reszty z fragmen¬ tem dwupeptydowym lub grupe o wzorze -NHR2 przylacza sie do wczesniej wytworzonego trójpep- tydu i ewentualnie usuwa sie N-koncowa grupe za¬ bezpieczajaca. 45 50 55 S-2251 0,040 S-2160 0,150 S-2222 0,200 I 0,040.I : 0,040116 682 CK p. Glu-Gly-Arg-HN-Q PL PL PL PL PL PL PL PL