JPH11225794A - インドキシル−アミノ酸エステルまたはインドキシル−ペプチドエステルの安定化方法およびトリプシンの酵素活性測定方法並びにトリプシン酵素活性測定用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 トリプシンの基質となり得るＮα−Ｚ−リジ
ニルオキシ−インドールの緩衝液中での分解を防止す
る。 【解決手段】 Ｎα−Ｚ−リジニルオキシ−インドール
と、グリシルグリシンおよびマンガンの少なくとも一方
とを緩衝液中で共存させる。グリシルグリシンの濃度
は、５ｍｍｏｌ／リットル以上が好ましく、マンガンの
濃度は１〜１０００ｍｍｏｌ／リットルが好ましく、緩
衝液のｐＨはｐＨ７〜８．５が好ましい。この緩衝液中
でトリプシンの酵素反応を生起させると、Ｎα−Ｚ−リ
ジニルオキシ−インドールが分解してインジゴが生成し
青色に着色する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明が属する技術分野】本発明は、トリプシン基質と
して使用できる新規インドキシル−アミノ酸エステルま
たはインドキシル−ペプチドエステルの安定化方法およ
びそれを用いたトリプシンの酵素活性測定方法並びにト
リプシン酵素活性測定用試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】トリプシンの基質としては、カゼインや
牛血清アルブミン等の天然タンパク質の他、合成基質が
使用されている。通常、合成基質には、酵素反応により
分解すると発色するような発色物質が導入されているた
め、酵素反応の検出に便利である。このような合成基質
としては、例えば、Ｎα−ベンゾイル−アルギニン−ｐ
−ニトロアニリド（ＢＡＰＮＡ）が汎用されており、こ
のＢＮＰＮＡは酵素反応により黄色に着色する。

【０００３】他方、臨床検査や生化学検査等の分野にお
いて、トリプシンの酵素反応を利用する場合、検体を多
量に処理する必要から、基質や緩衝剤等の試薬を濾紙や
親水性フィルムに予め含浸させ乾燥させた試験フィルム
が使用されている。なお、試験フィルムは、試験紙、試
験片、検体分析用具などとも呼ばれている。

【０００４】しかしながら、ＢＮＰＮＡを用いてトリプ
シンの酵素反応を試験フィルムで行う場合、ＢＡＰＮＡ
の分解により生じる黄色が肉眼で判別しにくいという問
題があった。

【０００５】また、特公昭５９−３４７５号公報には、
分解すると青色に発色するタンパク質分解酵素用の基質
が記載されているが、トリプシンの基質として使用でき
る基質については明確な開示がない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】前記問題に対し、本出
願人は、試験フィルム等に使用された場合、トリプシン
により分解されて肉眼で明確に判別し得る色素を生じる
新規インドキシル−アミノ酸エステルを別途出願した。
しかし、この新規エステル化合物は、精製の際や、トリ
プシンの酵素活性の最適ｐＨ領域である弱アルカリ領域
（約ｐＨ７．５〜８．５）において、徐々に分解した
り、沈殿したりして不安定である。したがって、この新
規エステル化合物をトリプシンの基質として使用する場
合、特に長時間の測定を行う場合や、これを用いて試験
フィルム等を作成する場合に、その安定性を向上させる
技術が必要となる。したがって、本発明の目的は、前記
新規インドキシル−アミノ酸エステルまたはインドキシ
ル−ペプチドエステルの安定化方法およびそれを用いた
トリプシンの酵素活性測定方法並びにトリプシン酵素活
性測定用試薬を提供することである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
に、本発明のインドキシル−アミノ酸エステルまたはイ
ンドキシル−ペプチドエステルの安定化方法は、下記の
式（１）で表されるインドキシル−アミノ酸エステルま
たはインドキシル−ペプチドエステルと、グリシルグリ
シンおよびマンガンの少なくとも一方の物質とを共存さ
せるという方法である。

【化７】

【０００８】このように、グリシルグリシンおよびマン
ガンの少なくとも一方の物質と共存させることにより、
弱アルカリ領域のｐＨであっても、前記式（１）で表わ
されるエステル化合物の分解や沈殿を防止することがで
きる。

【０００９】本発明の安定化方法において、その他の物
質を共存させてもよい。この物質としては、例えば、界
面活性剤、防腐剤、水溶性高分子があげられる。

【００１０】本発明の安定化方法において、前記式
（１）で表わされるインドキシル−アミノ酸エステルま
たはインドキシル−ペプチドエステルと、グリシルグリ
シンおよびマンガンの少なくとも一方の物質とを液体中
で共存させることが好ましい。この場合、グリシルグリ
シンの濃度は、５ｍｍｏｌ／リットル以上が好ましく、
特に好ましくは３０〜１０００ｍｍｏｌ／リットルであ
り、マンガンの濃度は、１〜１０００ｍｍｏｌ／リット
ルが好ましく、特に好ましくは５〜１００ｍｍｏｌ／リ
ットルである。また、前記液体は、ｐＨ７〜８．５の緩
衝液であることが好ましい。なお、液体中ではマンガン
はイオンとして存在する。また、マンガンを共存させる
手段としては、マンガンそのものを用いてもよいが、液
体中においては、ＭｎＣｌ₂ 、ＭｎＳＯ₄ 、Ｍｎ（ＮＯ
₃）₂などのように液体中で解離し、マンガンイオンとな
るような化合物を用いてもよい。

【００１１】なお、本発明の安定化方法において、前記
式（１）で表わされるインドキシル−アミノ酸エステル
またはインドキシル−ペプチドエステルと、グリシルグ
リシンおよびマンガンの少なくとも一方の物質との共存
状態は、乾燥状態の共存であってもよい。このような乾
燥状態としては、例えば、試験フィルム等においての共
存状態がある。なお、このような乾燥状態であっても、
血液等の液状検体を適用した場合は、液体中での共存状
態となり、この場合において、グリシルグリシン濃度、
マンガン濃度、ｐＨ等の条件は前述のとおりである。

【００１２】本発明の安定化方法において、前記式
（１）のＢ¹ が、アセチル基またはベンジルオキシカル
ボニル基（Ｚ基）であることが好ましい。

【００１３】本発明の安定化方法において、前記式
（１）で表わされるインドキシル−アミノ酸エステルま
たはインドキシル−ペプチドエステルは、下記の式
（２）で表されるインドキシル−アミノ酸エステルまた
はインドキシル−ペプチドエステルであることが好まし
い。

【化８】

【００１４】前記式（２）において、Ｂ¹ は、アセチル
基またはＺ基であることが好ましい。

【００１５】つぎに、本発明のトリプシンの酵素活性測
定方法は、グリシルグリシンおよびマンガンの少なくと
も一方の物質の存在下、前記式（１）で表わされるイン
ドキシル−アミノ酸エステルまたはインドキシル−ペプ
チドエステルを基質としてトリプシンの酵素反応を生起
させ、前記基質の分解により生じた発色物質を測定する
方法である。ここで、発色物質とは、前記基質の分解に
より生じた物質（例えば、インドキシルそのもの）、前
記基質の分解により生じた物質の自己酸化物（例えば、
インジゴ）、または前記基質の分解により生じた物質と
他の物質（例えば、ジアゾニウム塩）との反応物等をい
う。

【００１６】本発明の測定方法において、前記安定化方
法と同様に、その他の物質を共存させてもよい。

【００１７】本発明の測定方法において、前記トリプシ
ンの酵素反応は、液体中で生起させることが好ましい。
この場合、グリシルグリシンの濃度は、５ｍｍｏｌ／リ
ットル以上が好ましく、特に好ましくは３０〜１０００
ｍｍｏｌ／リットルであり、マンガンの濃度は、１〜１
０００ｍｍｏｌ／リットルが好ましく、特に好ましくは
５〜１００ｍｍｏｌ／リットルである。また、前記液体
は、ｐＨ７〜８．５の緩衝液であることが好ましい。

【００１８】なお、前記安定化方法と同様に、本発明の
トリプシンの測定方法において、前記トリプシンの酵素
反応は、乾燥状態で生起させてもよい。このような乾燥
状態としては、例えば、試験フィルム等においての酵素
反応がある。なお、このような乾燥状態であっても、血
液等の液状検体を適用した場合は、液体中での共存状態
となり、この場合において、グリシルグリシン濃度、マ
ンガン濃度、ｐＨ等の条件は前述のとおりである。

【００１９】本発明の測定方法において、前記式（１）
のＢ¹ が、アセチル基またはＺ基であることが好まし
い。

【００２０】本発明の測定方法において、前記式（１）
で表わされるインドキシル−アミノ酸エステルまたはイ
ンドキシル−ペプチドエステルは、前記式（２）で表さ
れるインドキシル−アミノ酸エステルまたはインドキシ
ル−ペプチドエステルであることが好ましい。この場
合、前記式（２）のＢ¹ は、アセチル基またはＺ基であ
ることが好ましい。

【００２１】つぎに、本発明のトリプシン酵素活性測定
用試薬は、前記式（１）で表わされるインドキシル−ア
ミノ酸エステルまたはインドキシル−ペプチドエステル
と、グリシルグリシンおよびマンガンの少なくとも一方
の物質とを共存させている試薬である。

【００２２】本発明の測定用試薬において、前記インド
キシル−アミノ酸エステルまたはインドキシル−ペプチ
ドエステルと、グリシルグリシンおよびマンガンの少な
くとも一方の物質とが液体中で共存していることが好ま
しい。この場合、グリシルグリシンの濃度は、３０〜１
０００ｍｍｏｌ／リットルであることが好ましく、マン
ガンの濃度は、５〜１００ｍｍｏｌ／リットルであるこ
とが好ましい。また、前記液体は、ｐＨ７〜８．５の緩
衝液であることが好ましい。

【００２３】なお、前記安定化方法と同様に、本発明の
トリプシン測定用試薬において、前記式インドキシル−
アミノ酸エステルまたはインドキシル−ペプチドエステ
ルと、グリシルグリシンおよびマンガンの少なくとも一
方の物質との共存状態は、乾燥状態の共存であってもよ
い。このような乾燥状態としては、例えば、試験フィル
ム等においての共存状態がある。なお、このような乾燥
状態であっても、血液等の液状検体を適用した場合は、
液体中での共存状態となり、この場合において、グリシ
ルグリシン濃度、マンガン濃度、ｐＨ等の条件は前述の
とおりである。

【００２４】本発明の測定用試薬において、前記式
（１）のＢ¹ は、アセチル基またはＺ基であることが好
ましい。

【００２５】本発明の測定用試薬において、前記式
（１）で表わされるインドキシル−アミノ酸エステルま
たはインドキシル−ペプチドエステルは、前記式（２）
で表されるインドキシル−アミノ酸エステルまたはイン
ドキシル−ペプチドエステルであることが好ましい。こ
の場合、前記式（２）のＢ¹ は、アセチル基またはＺ基
であることが好ましい。

【００２６】

【発明の実施の形態】最初に、本発明にかかるインドキ
シル−アミノ酸エステルまたはインドキシル−ペプチド
エステルについて説明する。このインドキシル−アミノ
酸エステルまたはインドキシル−ペプチドエステルは、
例えば、下記の式（３）で表される化合物と下記の式
（４）で表される化合物とをエステル結合させた後、ｔ
−ブトキシカルボニル基（以下「Ｂｏｃ」という）を除
去することにより製造できる。

【００２７】

【化９】

【００２８】

【化１０】

【００２９】前記式（１）および前記式（３）におい
て、Ｒ¹ 、Ｒ² 、Ｒ³ およびＲ⁴ の定義におけるハロゲ
ン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素
原子、ヨウ素原子があげられ、このなかでも、塩素原
子、臭素原子が好ましい。

【００３０】前記式（１）および前記式（３）におい
て、Ｒ¹ 、Ｒ² 、Ｒ³ およびＲ⁴ の定義における「低級
アルコキシ基」と、Ｒ¹ 、Ｒ² 、Ｒ³ 、Ｒ⁴ およびＸの
定義における「低級アルキル基」とは、それぞれ炭素原
子数が１〜５、好ましくは１〜３のものであり、好まし
い具体例としては、メトキシ基およびメチル基である。

【００３１】前記式（１）および前記式（３）におい
て、Ｒ¹ 、Ｒ² 、Ｒ³ およびＲ⁴ の定義における「アル
アルコキシ基」と、Ｒ¹ 、Ｒ² 、Ｒ³ 、Ｒ⁴ およびＸの
定義における「アルアルキル基」とは、例えば、オキシ
−低級−アルキル基若しくは低級アルキル基で置換され
たフェニル基およびナフチル基を表し、この際のアルキ
ル基は、炭素原子数１〜５、好ましくは１〜３のもので
ある。具体的には、ベンジルオキシ基およびベンジル基
が好ましい。

【００３２】前記式（１）および前記式（３）におい
て、Ｒ¹ 、Ｒ² 、Ｒ³ およびＲ⁴ の定義における「低級
アシルアミノ基」としては、例えば、炭素原子数１〜
５、好ましくは１〜３の低級脂肪族カルボン酸のアミド
基があげられ、アセチルアミノ基が好ましい。

【００３３】前記式（１）および前記式（３）におい
て、Ｘの定義における「アシル基」としては、例えば、
炭素原子数１〜５、好ましくは１〜３の脂肪族カルボン
酸基、または芳香族カルボン酸基があげられ、例えば、
安息香酸またはナフトエ酸基があげられる。好ましい具
体例としては、アセチル基またはベンゾイル基である。

【００３４】前記式（１）および前記式（３）におい
て、Ｒ¹ 、Ｒ² 、Ｒ³ 、Ｒ⁴ およびＸの定義における
「アリール基」としては、フェニル基またはナフチル基
が好ましい。

【００３５】前記式（１）および前記式（４）におい
て、Ａ¹ およびＡ² の定義におけるリジン残基またはア
ルギニン残基としては、Ｌ−αリジン残基またはＬ−α
アルギニン残基であることが好ましい。

【００３６】前記式（１）および前記式（４）におい
て、Ｂ¹ の定義におけるポリペプチドを構成するアミノ
酸としては、Ｌ−αアミノ酸が好ましい。また、前記定
義における保護基としては、例えば、Ｚ基、Ｂｏｃ、ア
シル基、オキシカルボニル基、チオカルボニル基、スル
ホニル基、スルフェニル基、ビニル基、シクロヘキセル
基、ホスホリル基、カルボモバイル基等があげられる。

【００３７】つぎに、本発明のインドキシル−アミノ酸
エステルまたはペプチドエステルの製造方法の例につい
て、図１のスキームおよび図２のスキームに基づき説明
する。

【００３８】図１のスキームは、３−（Ｎα−Ｚ−リジ
ニルオキシ）−インドールの合成についてのスキームで
ある。

【００３９】（１） ３−ハイドロキシインドールの合
成 窒素雰囲気下、濃度が０．８７〜４３．８ｇ／リットル
すなわち１０〜５００ｍｍｏｌ／リットルとなるように
インドキシルアセチルエステルをメタノールに溶解す
る。この溶液に水酸化ナトリウム溶液（濃度２〜３０重
量％）を添加し、窒素雰囲気下で１０〜１２０分間攪拌
する。その後、この溶液に、クエン酸水溶液（濃度１０
〜４０重量％）を添加したのち、１／２〜１／２０の体
積まで減圧濃縮する。その後、析出物質を濾過により採
取し、これを減圧乾燥する。これにより、微緑黄色粉末
として、３−ハイドロキシインドールが得られる。この
時の回収率は、４０〜８０％である。

【００４０】（２） ３−（Ｎα−Ｚ−Ｎε−Ｂｏｃ−
リジニルオキシ）−インドールの合成 窒素雰囲気下、Ｎα−Ｚ−Ｎε−Ｂｏｃ−リジンを１０
〜２００ｇ／リットルすなわち７．９〜１５８ｍｍｏｌ
／リットルの濃度で乾燥テトラヒドロフランに溶解す
る。これに、氷冷下で、カルボニルジイミダゾル（２．
５〜５０ｇ、１５〜３００ｍｍｏｌ）を添加し、１〜１
０時間攪拌する。これに、前記（１）で得られた３−ハ
イドロキシインドール（１〜３０ｇ、７．５〜２２６ｍ
ｍｏｌ）を添加後、氷冷下で１〜８時間攪拌後、さら
に、室温で約一晩攪拌する。得られた反応液を濃縮乾固
し、油状残渣を酢酸エチルに溶解する。この酢酸エチル
溶液を、炭酸水素ナトリウム溶液およびクエン酸溶液で
洗浄後、濃縮乾固する。得られた粗生成物を、例えば、
シリカゲルクロマトグラフィー等で一次精製を行う。こ
の一次精製物に対し、例えば、ゲル濾過により二次精製
を行う。この結果、微赤褐色粉末として、３−（Ｎα−
Ｚ−Ｎε−Ｂｏｃ−リジニルオキシ）−インドールが得
られる。この時の回収率は、３０〜６０％である。

【００４１】（３） ３−（Ｎα−Ｚ−リジニルオキ
シ）−インドールの合成 前記（２）で得られた３−（Ｎα−Ｚ−Ｎε−Ｂｏｃ−
リジニルオキシ）−インドールを濃度１０〜３００ｇ／
リットルすなわち２０〜６００ｍｍｏｌ／リットルで乾
燥ジオキサンに溶解する。この溶液に、６Ｍ塩化水素含
有ジオキサン（２０〜６０重量％）を添加し、室温で
０．５〜１０時間攪拌する。そして、前記反応液を濃縮
乾固し、油状物質を回収する、この油状物質を、例え
ば、シリカゲルクロマトグラフィーにより一次精製す
る。この一次精製物に対し、例えば、ゲル濾過により二
次精製を行う。この結果、微黄褐色粉末として、３−
（Ｎα−Ｚ−リジニルオキシ）−インドールが得られ
る。この時の回収率は、１５〜５０％である。

【００４２】つぎに、図２のスキームは、Ｎα−アセチ
ル−リジニルオキシ−インドールの合成についてのスキ
ームである。

【００４３】（１） Ｎε−ベンジリジン−リジンの合
成 リジン・モノハイドロクロライドを１８〜３６５ｇ／リ
ットルすなわち０．１〜２．０ｍｏｌ／リットルの濃度
で約１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に溶解し、攪拌しな
がら、メタノール・ドライアイス浴で−１０〜０℃程度
に冷却する。充分に冷却した後、この溶液に、ベンザア
ルデヒド（２０〜７５重量％）を添加する。そして、−
１０〜−３℃で０．５〜６時間撹拌すると、白色固体が
析出する。析出した固体を濾過して採取し、氷浴で冷却
しながらエタノール（５０〜１０００ｍｌ）に１〜１０
時間浸析後、濾過して採取し、デシケーターで減圧乾燥
することにより、Ｎε−ベンジリジン−リジンを、回収
率４０〜８０％で得ることができる。

【００４４】（２） Ｎα−アセチル−リジンの合成 前記（１）で得られたＮε−ベンジリジン−リジン（１
０〜１００ｇ、４３〜４３０ｍｍｏｌ）を約１Ｎの水酸
化ナトリウム水溶液（４０〜５００ｍｌ）に溶解し、氷
浴で冷却する。そして、この溶液に、撹拌しながら、ア
セチルクロライド（５〜５０ｇ、６４〜６４０ｍｌ）と
約１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液（１００〜８０００ｍ
ｌ）とを交互に滴下し、ｐＨをｐＨ８〜９程度の範囲に
保持する。途中、白色固体が析出し懸濁液となる。滴下
終了後、冷却下で、０．５〜３時間撹拌し、さらに室温
で０．５〜１０時間撹拌する。この溶液に、約１Ｎの塩
化水素水溶液（３０〜３０００ｍｌ）を加え、５０〜７
０℃で１０〜６０分加熱撹拌する。冷却後、エーテル
（１０〜１０００ｍｌ）で水層を３回洗浄する。この水
層を分離して水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６〜７程度
に調製し、エバポレータ等により濃縮することで、粗Ｎ
α−アセチル−リジン（淡黄色オイル状物）を得ること
ができる。

【００４５】（３） Ｎα−アセチル−Ｎε−Ｂｏｃ−
リジンの合成 前記（２）で得られたＮα−アセチル−リジンを、超純
水（１００〜２０００ｍｌ）とアセトン（１００〜２０
００ｍｌ）の混合液に均一になるように溶解し、これに
トリエチルアミン（１０〜１５０ｇ、１００〜１５００
ｍｍｏｌ）を添加し２０〜１００分間氷冷する。これ
に、（Ｂｏｃ）₂ Ｏ（１０〜２００ｇ、４６〜９２０ｍ
ｍｏｌ）を加え氷冷下で０．５〜５時間撹拌後、室温で
一夜程度撹拌すると、淡黄色懸濁溶液が得られる。この
懸濁溶液のアセトンを濃縮し、水層を１０％クエン酸水
溶液でｐＨ３に調整すると、白色オイル状物が析出す
る。これを酢酸エチル（１〜１０リットル）で抽出し、
さらに硫酸マグネシウムで乾燥した後、濃縮すると、粗
Ｎα−アセチル−Ｎε−Ｂｏｃ−リジンが得られる。こ
れを、例えば、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで
精製する。そして、Ｎα−アセチル−Ｎε−Ｂｏｃ−リ
ジンを含む画分を集め濃縮後、減圧乾燥することによ
り、回収率１０〜６０％でＮα−アセチル−Ｎε−Ｂｏ
ｃ−リジンを得ることができる。

【００４６】（４） Ｎα−アセチル−Ｎε−Ｂｏｃ−
リジニルオキシ−インドールの合成 窒素雰囲気下、前記（３）で得られたＮα−アセチル−
Ｎε−Ｂｏｃ−リジン（１０〜２００ｇ、３５〜６９０
ｍｍｏｌ）を乾燥Ｌ−５，６，７，８−テトラヒドロ葉
酸（ｄｒｙ ＴＨＦ）（１００〜２０００ｍｌ）に溶解
する。１０〜９０分間氷浴で冷却後、この溶液に、カル
ボニルジイミダゾール（ＣＤＩ、５〜５０ｇ、３１〜３
１０ｍｍｏｌ）を添加し、充分に脱気を行い−５〜０℃
で０．３〜３時間撹拌する。この溶液に３−ハイドロキ
シインドール（５〜１００ｇ、３７．５〜７５０ｍｍｏ
ｌ）を加え再度脱気を行い、−５〜０℃で０．５〜３時
間、さらに室温で一夜程度撹拌を続ける。この反応溶液
を濃縮後、酢酸エチル（約１リットル）に溶解し、約４
％炭酸水素ナトリウム水溶液（約１ットル）、約１０％
クエン酸水溶液（約１リットル）および超純水（約１リ
ットル）の混合液で洗浄する。そして、酢酸エチル層を
分取し、硫酸マグネシウムで乾燥後、濃縮すると、粗Ｎ
α−アセチル−Ｎε−Ｂｏｃ−リジニルオキシ−インド
ールが得られる。これを、シリカゲルカラムクロマトグ
ラフィー等で一次精製し、さらにゲル濾過等で二次精製
する。得られるＮα−アセチル−Ｎε−Ｂｏｃ−リジニ
ルオキシ−インドールの回収率は、２０〜５５％であ
る。

【００４７】（５） Ｎα−アセチル−リジニルオキシ
−インドールの合成 Ｎα−アセチル−リジニルオキシ−インドールは、前記
Ｎα−アセチル−Ｎε−ＢＯＣ−リジニルオキシ−イン
ドールのＢｏｃ基を除去することにより得られる。Ｂｏ
ｃ基は、例えば、下記のＡ法、Ｂ法またはＣ法により除
去できる。

【００４８】（Ａ法）前記（４）で得られたＮα−アセ
チル−Ｎε−Ｂｏｃ−リジニルオキシ−インドール
（０．１〜２０ｇ、０．３５〜７０ｍｍｏｌ）を乾燥ジ
オキサン（１〜２００ｍｌ）に懸濁させ、この懸濁液に
ＨＣＯＯＨ（０．５〜２００ｍｌ、１３〜５２００ｍｍ
ｏｌ）を添加して約４０℃〜５０℃で２〜８時間程度加
熱する。この反応液を濃縮し、エーテルで洗浄する。そ
して、エーテルをデカンテーションで除去して残渣を減
圧乾燥することにより、Ｎα−アセチル−リジニルオキ
シ−インドールが得られる。

【００４９】（Ｂ法）前記（４）で得られたＮα−アセ
チル−Ｎε−Ｂｏｃ−リジニルオキシ−インドール
（０．１〜２０ｇ、０．３５〜７０ｍｍｏｌ）にＨＣＯ
ＯＨ（０．５〜２００ｍｌ、１３〜５３００ｍｍｏｌ）
を添加し、室温で約３時間撹拌する。この反応溶液を濃
縮し、エーテルで洗浄後、エーテルをデカンテーション
で除き、残渣を減圧乾燥すると、Ｎα−アセチル−リジ
ニルオキシ−インドールが得られる。

【００５０】（Ｃ法）前記（４）で得られたＮα−アセ
チル−Ｎε−Ｂｏｃ−リジニルオキシ−インドール
（０．１〜２０ｍｇ、０．３５〜７０ｍｍｏｌ）にＨＣ
ＯＯＨ（０．５〜２００ｍｌ、１３〜５３００ｍｍｏ
ｌ）を添加し、氷浴で冷却しながら約４時間撹拌後、約
５℃で一夜程度撹拌して反応させると、Ｎα−アセチル
−リジニルオキシ−インドールが得られる。

【００５１】つぎに、リジニルオキシ−インドールの製
造方法の例について説明する。リジニルオキシ−インド
ールは、前述の、図２のスキームに示すＮα−アセチル
−リジニルオキシ−インドールの合成法において、Ｎα
−アセチル−Ｎε−ＢＯＣ−リジニルオキシ−インドー
ルの合成後、Ｂｏｃ基およびアセチル基を除去すればよ
い。以下に、この除去方法を３通り（Ｄ法、Ｅ法、Ｆ
法）示す。

【００５２】（Ｄ法）前記（４）で得られたＮα−アセ
チル−Ｎε−Ｂｏｃ−リジニルオキシ−インドール
（０．１〜２０ｇ、０．３５〜７０ｍｍｏｌ）を、乾燥
ジオキサン（１〜２００ｍｌ）に溶解し、攪拌する。こ
の溶液に、約６．６Ｍ ＨＣｌ／ジオキサン（約０．７
ｍｌ、最終濃度約２Ｍ）を添加し、室温で約１時間攪拌
して反応させる。この反応液を濃縮し、得られた残渣を
エーテルで洗浄後、濾過で採取し、減圧乾燥する。乾燥
後の残渣をエタノールに溶解し、活性炭処理を行い濃縮
する。この濃縮物に、ＣＨＣｌ₃ を濁るまで添加した
後、超音波を照射し、析出した沈殿を濾過で採取し、減
圧乾燥すると、リジニルオキシ−インドールが得られ
る。

【００５３】（Ｅ法）前記（４）で得られたＮα−アセ
チル−Ｎε−Ｂｏｃ−リジニルオキシ−インドール
（０．１〜２０ｇ、０．３５〜７０ｍｍｏｌ）を、乾燥
ジオキサン（１〜４００ｍｌ）に溶解し、攪拌する。こ
の溶液に、約０．４Ｍ ＨＣｌ／ジオキサン（約１３ｍ
ｌ、最終濃度約０．２Ｍ）を添加し、室温で約４．５時
間攪拌して反応させた後、約５℃で一夜程静置し、沈殿
を析出させる。この沈殿物を濾過で採取し、これをメタ
ノールに溶解した後、濃縮する。濃縮物をエタノールで
固化し、濾過で採取する。採取した固形物を、減圧乾燥
すると、リジニルオキシ−インドールが得られる。

【００５４】（Ｆ法）前記（４）で得られたＮα−アセ
チル−Ｎε−Ｂｏｃ−リジニルオキシ−インドールに、
これの１００倍程度の過剰なＨＣＯＯＨを加え、約８０
℃で約３分間加熱して反応させると、リジニルオキシ−
インドールが得られる。

【００５５】つぎに、本発明にかかるインドキシル−ア
ミノ酸エステルまたはインドキシル−ペプチドエステル
の具体例を、その発色の形態別に、下記に示す。これら
のエステル化合物は、その材料を適宜選択すること以外
は、前述の製造方法に準じて合成することができる。た
だし、ここで留意する点は、リジンまたはアルギニンの
εアミノ基をＢｏｃで予め保護した状態で反応させたの
ち、前記Ｂｏｃを除去することである。

【００５６】（発色前：黒色、発色後：淡トルキース色
〜青色） ３−［Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−リジニ
ルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−リジニ
ルオキシ］−４−メチル−インドール ３−［Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−リジニ
ルオキシ］−５−メチル−インドール ３−［Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−リジニ
ルオキシ］−６−メチル−インドール ３−［Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−リジニ
ルオキシ］−７−メチル−インドール ３−［Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−リジニ
ルオキシ］−４，７−ジメチル−インドール ３−［Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−リジニ
ルオキシ］−４−クロル−インドール ３−［Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−リジニ
ルオキシ］−５−ブロム−インドール ３−［Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−リジニ
ルオキシ］−６−クロル−インドール

【００５７】（発色前：無色、発色後：紫色） ３−［Ｎ−（トルオール−４′−スルホニル）−Ｌ−リ
ジニルオキシ］−４−クロム−５−ブロム−インドール ３−［Ｎ−（トルオール−４′−スルホニル）−Ｌ−リ
ジニルオキシ］−４，５，７−トリクロル−インドール ３−［Ｎ−（トルオール−４′−スルホニル）−Ｌ−リ
ジニルオキシ］−４−クロル−５−ブロム−７−メチル
−インドール ３−［Ｎ−（トルオール−４′−スルホニル）−Ｌ−リ
ジニルオキシ］−５−ヒドロキシ−インドール ３−［Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−リジニ
ルオキシ］−５−メトキシ−インドール ３−［Ｎ−（トルオール−４′−スルホニル）−Ｌ−リ
ジニルオキシ］−５−ベンジルオキシ−インドール ３−［Ｎ−（トルオール−４′−スルホニル）−Ｌ−リ
ジニルオキシ］−４−カルボキシ−インドール ３−［Ｎ−（トルオール−４′−スルホニル）−Ｌ−リ
ジニルオキシ］−４−ベンジルオキシカルボニル−イン
ドール ３−［Ｎ−（トルオール−４′−スルホニル）−Ｌ−リ
ジニルオキシ］−５−（カルボキシ−メトキシ）−イン
ドール ３−［Ｎ−（トルオール−４′−スルホニル）−Ｌ−リ
ジニルオキシ］−５−（ベンジルオキシカルボニル−メ
トキシ）−インドール ３−［Ｎ−（トルオール−４′−スルホニル）−Ｌ−リ
ジニルオキシ］−６−ニトロ−インドール ３−［Ｎ−（トルオール−４′−スルホニル）−Ｌ−リ
ジニルオキシ］−６−アセチルアミノ−インドール ３−［Ｎ−（トルオール−４′−スルホニル）−Ｌ−リ
ジニルオキシ］−ベンゾ［ｇ］−インドール

【００５８】（発色前：無色、発色後：緑色） １−メチル−３−［Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）
−Ｌ−リジニルオキシ］−インドール

【００５９】（発色前：無色、発色後：緑色） １−ベンジル−３−［Ｎ−（トルオール−４′−スルホ
ニル）−Ｌ−リジニルオキシ］−インドール １−フェニル−３−［Ｎ−（トルオール−４′−スルホ
ニル）−Ｌ−リジニルオキシ］−インドール

【００６０】（発色前：無色、発色後：青緑色） １−アセチル−３−［Ｎ−（トルオール−４′−スルホ
ニル）−Ｌ−リジニルオキシ］−インドール

【００６１】（発色前：無色、発色後：赤色） １−ベンゾイル−３−［Ｎ−（トルオール−４′−スル
ホニル）−Ｌ−リジニルオキシ］−インドール

【００６２】（発色前：無色、発色後：紫色） ３−［Ｎ−（トルオール−２′−スルホニル）−Ｌ−リ
ジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（トルオール−３′−スルホニル）−Ｌ−リ
ジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（トルオール−４′−スルホニル）−Ｌ−リ
ジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（トルオール−４′−スルホニル）−Ｄ−リ
ジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−ホルミル−Ｌ−リジニルオキシ］−インドー
ル ３−［Ｎ−サクシニル−Ｌ−リジニルオキシ］−インド
ール ３−［Ｎ−ベンゾイル−Ｄ・Ｌ−リジニルオキシ］−イ
ンドール ３−［Ｎ−フタロイル−Ｌ−リジニルオキシ］−インド
ール ３−［Ｎ−（エトキシカルボニル）−Ｌ−リジニルオキ
シ］−インドール ３−［Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｌ
−リジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（３′、６′−ジオキサ−ｎ−ヘプチルオキ
シカルボニル）−Ｌ−リジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（シクロヘキシルオキシカルボニル）−Ｌ−
リジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（フェニルオキシカルボニル）−Ｌ−リジニ
ルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（４′−メチル−ベンジルオキシカルボニ
ル）−Ｌ−リジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（４′−メトキシ−ベンジルオキシカルボニ
ル）−Ｌ−リジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（４′−ニトロ−ベンジルオキシカルボニ
ル）−Ｌ−リジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（Ｎ′−＜ピペリジノ＞−オキシカルボニ
ル）−Ｌ−リジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（フリル−＜２′＞−メトキシカルボニル）
−Ｌ−リジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（チエニル−＜２′＞−メトキシカルボニ
ル）−Ｌ−リジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（ベンジルチオカルボニル）−Ｌ−リジニル
オキシ］−インドール３−［Ｎ−（メタンスルホニル）
−Ｌ−リジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（ベンジルスルホニル）−Ｌ−リジニルオキ
シ］−インドール ３−［Ｎ−（ベンゾールスルホニル）−Ｌ−リジニルオ
キシ］−インドール ３−［Ｎ−（４′−ブロム−ベンゾールスルホニル）−
Ｌ−リジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（４′−ニトロ−ベンゾールスルホニル）−
Ｌ−リジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（４′−ジメチルアミノ−ベンゾールスルホ
ニル）−Ｌ−リジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（４′−アセチルアミノ−ベンゾールスルホ
ニル）−Ｌ−リジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（４′−ｎ−ブチル−ベンゾールスルホニ
ル）−Ｌ−リジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（４′−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンゾールスル
ホニル）−Ｌ−リジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（４′−ｎ−オクチル−ベンゾールスルホニ
ル）−Ｌ−リジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（４′−ヒドロキシ−ベンゾールスルホニ
ル）−Ｌ−リジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（４′−メトキシ−ベンゾールスルホニル）
−Ｌ−リジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（４′−ベンジルオキシ−ベンゾールスルホ
ニル）−Ｌ−リジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（４′−＜２′′−ヒドロキシ−エトキシ＞
−ベンゾールスルホニル）−Ｌ−リジニルオキシ］−イ
ンドール ３−［Ｎ−（４′−＜３′′−オキサ−５′′−ヒドロ
キシ−ｎ−ベンチルオキシ＞−ベンゾールスルホニル）
−Ｌ−リジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（４′−＜３′′・６′′−ジ−オキサ−ｎ
−ヘプチルオキシ＞−ベンゾールスルホニル）−Ｌ−リ
ジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（４′−＜２′′−ヒドロキシ−エチル＞−
ベンゾールスルホニル）−Ｌ−リジニルオキシ］−イン
ドール ３−［Ｎ−（４′−＜２′′−｛４′′′−ニトロ−ベ
ンジルオキシ｝−エチル＞−ベンゾール−スルホニル）
−Ｌ−リジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（４′−＜２′′−クロル−エチル＞−ベン
ゾールスルホニル）−Ｌ−リジニルオキシ］−インドー
ル ３−［Ｎ−（４′−アセチル−ベンゾールスルホニル）
−Ｌ−リジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（４′−シアノ−ベンゾールスルホニル）−
Ｌ−リジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（４′−カルボキシ−ベンゾールスルホニ
ル）−Ｌ−リジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（４′−メトキシカルボニル−ベンゾールス
ルホニル）−Ｌ−リジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（４′−ベンジルオキシカルボニル−ベンゾ
ールスルホニル）−Ｌ−リジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（４′−カルバモイル−ベンゾールスルホニ
ル）−Ｌ−リジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（４′−＜ジメチル−カルバモイル＞−ベン
ゾールスルホニル）−Ｌ−リジニルオキシ］−インドー
ル ３−［Ｎ−（４′−カルボキシメチル−ベンゾールスル
ホニル）−Ｌ−リジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（４′−カルボキシメトキシ−ベンゾールス
ルホニル）−Ｌ−リジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（４′−カルボキシメチルアミノ−ベンゾー
ルスルホニル）−Ｌ−リジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（４′−＜ベンジルオキシカルボニル−メチ
ルアミノ＞−ベンゾールスルホニル）−Ｌ−リジニルオ
キシ］−インドール ３−［Ｎ−（４′−フルオル−ベンゾールスルホニル）
−Ｌ−リジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（４′−フルオルスルホニル−ベンゾールス
ルホニル）−Ｌ−リジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（４′−スルファモイル−ベンゾールスルホ
ニル）−Ｌ−リジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−メチル−Ｎ−（トルオール−４′−スルホニ
ル）−Ｌ−リジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−アセチル−Ｎ−（トルオール−４′−スルホ
ニル）−Ｌ−リジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（２′・４′・６′−トリメチル−ベンゾー
ルスルホニル）−Ｌ−リジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（ビフェニル−４′−スルホニル）−Ｌ−リ
ジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（ナフタリン−２′−スルホニル）−Ｌ−リ
ジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（４′−アセチルアミノ−ナフタリン−１′
−スルホニル）−Ｌ−リジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（５′−ジメチルアミノ−ナフタリン−１′
−スルホニル）−Ｌ−リジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（キノリン−８′−スルホニル）−Ｌ−リジ
ニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（ピリジン−３′−スルホニル）−Ｌ−リジ
ニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（２′−ニトロ−ベンゾールスルフェニル）
−Ｌ−リジニルオキシ］−インドール

【００６３】（発色前：黄色、発色後：緑色） ３−［Ｎ−（１′−メチル−２′−ベンゾイル−ビニ
ル）−Ｌ−リジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（５′・５′−ジメチル−３′−オキソ−シ
クロヘキセン−１′−イル）−Ｌ−リジニルオキシ］−
インドール ３−［Ｎ−（ジフェニルカルバモイル−Ｌ−リジニルオ
キシ］−インドール ３−［Ｎ−（ジ−＜４′−ニトロベンジル＞−ホスホリ
ル）−Ｌ−リジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（ジ−＜４′−ブロムベンジル＞−ホスホリ
ル）−Ｌ−リジニルオキシ］−インドール ３−［Ｎ−（トルオール−４′−スルホニル）−Ｌ−リ
ジニルオキシ］−５−ベンジル−インドール ３−［Ｎ−（トルオール−４′−スルホニル）−Ｌ−リ
ジニルオキシ］−５−フェニル−インドール ３−［Ｎ−（トルオール−４′−スルホニル）−Ｌ−リ
ジニルオキシ］−５−メトキシ−インドール

【００６４】つぎに、本発明にかかるインドキシル−ア
ミノ酸エステルまたはインドキシル−ペプチドエステル
とトリプシンとの反応例を、下記の反応式（５）に示
す。この反応式では、３−（Ｎα−Ｚ−リジニルオキ
シ）−インドールとトリプシンとの反応を示したもので
ある。下記の反応式（５）に示すように、前記エステル
化合物は、トリプシンによりエステル結合の分解を受け
て、インドキシルが遊離する。なお、このトリプシンの
酵素反応の条件は、特に制限するものではなく、通常の
条件を適用できる。すなわち、酵素反応の条件は、ｐＨ
６〜９、温度１５〜４０℃、トリプシン濃度０．００１
〜１ｇ／リットル、基質濃度０．００１〜１０ｇ／リッ
トルである。また、酵素反応促進剤として、カルシウム
を添加することが好ましい。カルシウムの添加割合は、
通常、０．３ｍｍｏｌ／リットルの範囲である。

【００６５】

【化１１】

【００６６】つぎに、前記遊離したインドキシルの発色
反応例を下記の反応式（６）および（７）に示す。

【００６７】

【化１２】

【００６８】

【化１３】

【００６９】前記の反応式（６）には、インドキシル
と、塩化亜鉛複合塩の一種である２−メトキシ−４−モ
ルフォリノベンゼンジアゾニウムクロライドとの反応を
示している。これらが反応することにより、赤褐色の発
色物質が生成する。

【００７０】また、前記反応式（７）には、空気酸化に
よるインドキシル相互の重合反応を示している。この反
応により青色色素であるインジゴが生成する。

【００７１】つぎに、本発明の安定化方法は、前記イン
ドキシル−アミノ酸エステルまたはインドキシル−ペプ
チドエステルと、グリシルグリシンおよびマンガンの少
なくとも一方の物質と共存させる。なお、液中で共存さ
せる場合の好適条件は、前述のとおりである。

【００７２】また、本発明の安定化方法を適用した試験
フィルム等は、例えば、以下のようにして製造できる。

【００７３】前記インドキシル−アミノ酸エステルまた
はインドキシル−ペプチドエステル、グリシルグリシン
およびマンガンの少なくとも一方の物質、および必要に
応じその他の成分を所定濃度で溶解した溶液を準備す
る。前記その他に成分としては、例えば、界面活性剤、
水溶性高分子等があげられる。また、溶媒としては緩衝
液が好ましい。この溶液に、吸水性担体を含浸させ、そ
の後乾燥させることにより、試験フィルムが得られる。
前記吸水性担体としては、例えば、濾紙、セルロース、
合成繊維フリース等があげられる。

【００７４】この試験フィルムは、そのままで使用して
もよいし、プラスチック板等の支持板上に張り付けて使
用してもよいし、支持板上に前記試験フィルムを張り付
け、この上に網状物をさらに張り付けた状態で使用して
もよい。

【００７５】その他の試験フィルムの製造方法として
は、例えば、つぎの製造方法がある。まず、ポリアクリ
ル酸またはポリビニルエステル等の膜形成物質の溶液ま
た懸濁液に、前記インドキシル−アミノ酸エステルまた
はインドキシル−ペプチドエステル、グリシルグリシン
およびマンガンの少なくとも一方の物質、緩衝剤、湿潤
剤、前記その他の添加物を所定濃度で添加し均一に混合
した塗布液を調製する。そして、この塗布液を、プラス
チック板等の支持板上に塗布した後乾燥させて膜を形成
することによっても、試験フィルムを作製することがで
きる。この試験フィルムも、前述と同様に、そのままで
使用してもよいし、プラスチック板等の支持板上に張り
付けて使用してもよいし、支持板上に前記試験フィルム
を張り付け、この上に網状物をさらに張り付けた状態で
使用してもよい。

【００７６】このような試験フィルムは、トリプシンの
反応により青色等に発色するため、肉眼で明確に識別す
ることができる。また、この試験フィルムでのトリプシ
ンの反応は、肉眼による識別の他に、分光光度計または
反射率計等の光学的測定装置を用いて識別することもで
きる。

【００７７】つぎに、本発明の安定化方法により、前記
新規エステル化合物を粉末状または錠剤の形態で使用す
ることも可能である。例えば、前記インドキシル−アミ
ノ酸エステルまたはインドキシル−ペプチドエステル、
グリシルグリシンおよびマンガンの少なくとも一方の物
質、および必要に応じ前記その他の成分を所定濃度で溶
解した溶液を準備する。この溶液を、減圧乾燥、凍結乾
燥等の手段により、水分を除去すれば粉末状となる。そ
して、この粉末状の物質を、緩衝剤、酸化剤、湿潤剤、
賦型剤およびその他の成分とともに、常法で賦型すれ
ば、錠剤が得られる。

【００７８】このように、本発明の安定化方法の適用に
より、分解等を防止して前記新規エステル化合物を試験
フィルム、粉末状または錠剤等に加工することが可能と
なる。

【００７９】

【実施例】つぎに、実施例について比較例と併せて説明
する。

【００８０】まず、図１のスキームに示す前述の方法に
従い、３−（Ｎα−Ｚ−リジニルオキシ）−インドール
を合成した。なお、特に示さない限り、試薬は工業用グ
レードのものを使用した。また、薄層クロマトグラフィ
ー（ＴＬＣ）は、Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０Ｆ₂₅₄（Ｍ
ｅｒｃｋ社製）を使用した。¹Ｈ−ＮＭＲはＡＣ−２０
０Ｐ（Ｂｒｕｋｅｒ社製）を、質量分析（ＦＡＢ−Ｍ
Ｓ）はＪＥＯＬ ＪＭＳ−ＡＸ ５０５Ｗ（日本電子社
製）をそれぞれ使用した。

【００８１】（１） ３−ハイドロキシインドールの合
成 インドキシルアセチルエステル（１７．５ｇ，１００ｍ
ｍｏｌ，東京化成社製）を、窒素雰囲気下、メタノール
（５００ｍｌ）に溶解した。この溶液に、水酸化ナトリ
ウム水溶液（水酸化ナトリウム（和光純薬社製）１４ｇ
を水１５０ｍｌに溶解）を添加し、窒素雰囲気下室温で
３０分間撹拌した。さらに、この溶液に、クエン酸水溶
液（クエン酸（和光純薬社製）３８ｇを水１５０ｍｌに
溶解）を添加後、１／３体積まで減圧濃縮した。析出物
を濾過して採取し、減圧乾燥し、微緑黄色粉末状の３−
ハイドロキシインドールを得た。このときの収量は、１
０．３ｇであり、回収率は７８％であった。

【００８２】（２） ３−（Ｎα−Ｚ−Ｎε−Ｂｏｃ−
リジニルオキシ）−インドールの合成 窒素雰囲気下、Ｎα−Ｚ−Ｎε−Ｂｏｃ− リジン（２
６．９ｇ，７０．７ｍｍｏｌ，Ｂａｃｈｅｍ社製）を乾
燥テトラヒドロフラン（３００ｍｌ）に溶解した。これ
に、氷冷下で、カルボニルジイミダゾル（１２．５ｇ，
７７ｍｍｏｌ，東京化成社製）を添加し、１時間撹拌し
た。さらに、この溶液に前記３−ハイドロキシインドー
ル（９．４ｇ，７０．７ｍｍｏｌ）を添加後、氷冷下で
２時間攪拌し、さらに室温で一夜撹拌した。得られた反
応混合物を濃縮乾固し、油状残渣を酢酸エチルに溶解し
た。この酢酸エチル溶液を、４％炭酸水素ナトリウム水
溶液および１０％クエン酸水溶液で洗浄後、濃縮乾固し
た。得られた粗生成物についてシリカゲルクロマトグラ
フィーにより一次精製を行った。この条件を下記に示
す。

【００８３】（シリカゲルクロマトグラフィーの条件） シリカゲル：Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０（Ｍｅｒｃｋ社
製） 溶離液：クロロホルム／メタノール＝２４／１（ｖ／
ｖ）

【００８４】つぎに、得られた一次精製品をゲルろ過に
より二次精製した。この条件を下記に示す。この精製に
より、微赤褐色粉末状の３−（Ｎα−Ｚ−Ｎε−Ｂｏｃ
−リジニルオキシ）−インドールを１９．５ｇ（回収率
５６％）を得た。

【００８５】（ゲルろ過の条件） 坦体：Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ２０（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ社製） 溶離液：メタノール

【００８６】（３） ３−（Ｎα−Ｚ−Ｎε−リジニル
オキシ）−インドールの合成 前記（２）で得られた３−（Ｎα−Ｚ−Ｎε−Ｂｏｃ−
リジニルオキシ）−インドール（１９．５ｇ，３９ｍｍ
ｏｌ）を乾燥ジオキサン（１３０ｍｌ）に溶解した。こ
の溶液に、６Ｍ塩化水素含有ジオキサン（６５ｍｌ）を
添加し、室温で１．５時間撹拌した。この反応混合物を
濃縮乾固し、油状物を得た。この油状物（粗生成物）に
ついてシリカゲルクロマトグラフィーにより一次精製を
行った。この条件を下記に示す。

【００８７】（シリカゲルクロマトグラフィーの条件） シリカゲル：Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０（Ｍｅｒｃｋ社
製） 溶離液：クロロホルム／メタノール＝９／１（ｖ／ｖ）

【００８８】つぎに、前記一次精製品をゲルろ過により
精製した。このゲルろ過の条件を下記に示す。これによ
り、微黄褐色粉末７．８ｇ（回収率４６％）を得た。

【００８９】（ゲルろ過の条件） 坦体：Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ２０（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ社製） 溶離液：メタノール

【００９０】得られた微黄褐色粉末について、ＴＬＣ、
ＦＡＢ−ＭＳおよび¹Ｈ−ＮＭＲでその構造を調べたと
ころ、３−（Ｎα−Ｚ−Ｎε−リジニルオキシ）−イン
ドールであることを確認した。これらのデーターを下記
に示す。

【００９１】ＴＬＣ：Ｒ_f＝０．２８ 展開溶媒：クロロホルム／メタノール／酢酸＝５０／１
０／２（ｖ／ｖ／ｖ）

【００９２】ＦＡＢ−ＭＳ：３９６（Ｍ−Ｃｌ）

【００９３】¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）：δ１．５
３−１．９１（６Ｈ，多重線，−ＣＨ ₂）、２．７９
（２Ｈ，三重線，β−ＣＨ₂）、４．２７−４．３９
（１Ｈ，多重線，ＣＨ）、５．１１（２Ｈ，一重線，ベ
ンジル）、６．９７−７．４０（１０Ｈ，多重線，芳香
環）

【００９４】（実施例１、比較例１）実施例１および比
較例１は、緩衝剤の種類が前記３−（Ｎα−Ｚ−Ｎε−
リジニルオキシ）−インドール（以下「Ｚ−Ｌｙｓ−Ｉ
ｎｄ」という）の安定性におよぼす影響を調べた例であ
る。すなわち、まず、Ｚ−Ｌｙｓ−Ｉｎｄを、ジメチル
スルホキシド（ＤＭＳＯ）に１０．６ｇ／リットルの濃
度で溶解させた。この溶液に対し、下記の表１に示すよ
うに、精製水と緩衝液を添加して混合し、前記Ｚ−Ｌｙ
ｓ−Ｉｎｄ安定性を評価した。この安定性の評価は、室
温で１０分間放置したときの前記混合液の着色を目視観
察することにより行った。下記の表１において、無色お
よび薄黄色はＺ−Ｌｙｓ−Ｉｎｄの分解が抑制され安定
性が優れていることを示し、薄青色、青色、濃青色、青
色沈殿生成の順に安定性が悪くなって分解していること
を示す。以下の表でも同様である。また、緩衝液は、実
施例１ではグリシルグリシン緩衝液を使用し、比較例１
（Ａ，Ｂ，Ｃ）ではトリス塩酸緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ）を、比較例１（Ｄ，Ｅ）はビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）
緩衝液をそれぞれ使用した。前記緩衝液の濃度は、全て
０．１０ｍｏｌ／リットルであり、そのｐＨは、下記の
表１に示すとおりである。また、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよ
びＢｉｃｉｎｅの正式名称を下記に示す。

【００９５】 Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ： Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔ
ｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ Ｂｉｃｉｎｅ： Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙ
ｅｔｈｙｌ）ｇｌｙｃｉｎｅ

【００９６】 （表１） 単位：ｍｌ 実施例 比較例１ １ Ａ Ｂ Ｃ Ｄ Ｅ Z−Lys−Ind溶液 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 精製水 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10ク゛リシルク゛リシン 緩衝液 2.0 （ｐＨ８．５）トリス 塩酸緩衝液１ 2.0 （ｐＨ７．５）トリス 塩酸緩衝液２ 2.0 （ｐＨ８．０）トリス 塩酸緩衝液３ 2.0 （ｐＨ８．５）ヒ゛シン 緩衝液１ 2.0 （ｐＨ８．０）ヒ゛シン 緩衝液２ 2.0（ｐＨ８．５） 安定性 薄黄色 薄青色 青色 濃青色 青色 青色

【００９７】前記表１に示すように、グリシルグリシン
を用いた実施例１では、ｐＨがアルカリ領域であっても
Ｚ−Ｌｙｓ−Ｉｎｄの安定性が良かった。これに対し、
比較例１（Ａ，Ｂ，Ｃ）では、ｐＨが高くなるに従いＺ
−Ｌｙｓ−Ｉｎｄの分解がすすみ、比較例１（Ｄ，Ｅ）
でもＺ−Ｌｙｓ−Ｉｎｄの分解が確認された。

【００９８】（実施例２、比較例２）実施例２および比
較例２は、２種類の緩衝剤を用いた緩衝液中のＺ−Ｌｙ
ｓ−Ｉｎｄの安定性を調べた例である。すなわち、ま
ず、Ｚ−Ｌｙｓ−Ｉｎｄを、ＤＭＳＯに２０．１ｇ／リ
ットルの濃度で溶解させた。この溶液に対し、下記の表
２に示すように、精製水と緩衝液を添加して混合し、前
記Ｚ−Ｌｙｓ−Ｉｎｄ安定性を評価した。この安定性の
評価は、室温で３時間および９時間放置したときの前記
混合液の着色を目視観察することにより行った。なお、
使用した緩衝剤は、グリシルグリシン、ＡＤＡ、ＨＥＰ
ＥＳ、ＴＥＳ、ＭＥＳである。グリシルグリシン以外の
緩衝剤の正式名称は下記に示すとおりである。また、前
記各緩衝剤の濃度は、それぞれ１ｍｏｌ／リットル
（注：緩衝剤を２種類使用した場合の緩衝剤合計濃度は
２ｍｏｌ／リットルとなる）であり、前記緩衝液のｐＨ
は全てｐＨ７．５である。

【００９９】 ＡＤＡ： Ｎ−（２−Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）ｉｍｉｎｏ
ｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ＨＥＰＥＳ： ２−［４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈ
ｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓ
ｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ ＴＥＳ：Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）
ｍｅｔｈｙｌ−２−ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆ
ｏｎｉｃ ａｃｉｄ ＭＥＳ：２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌ
ｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ

【０１００】 （表２） 単位：ｍｌ 実施例 比較例２ ２ Ａ Ｂ Ｃ Z−Lys−Ind溶液 0.01 0.01 0.01 0.01 精製水 0.20 0.20 0.20 0.20ク゛リシルク゛リシン ＋ADA緩衝液 0.75 HEPES＋ADA緩衝液 0.75 TES＋ADA緩衝液 0.75TES＋MES緩衝液 0.75 安定性 ３時間後 薄黄色 薄青色 青色＊ 薄青色 ９時間後 薄黄色 薄青色＊ 青色＊ 薄青色＊ ＊：青色沈殿生成

【０１０１】前記表２に示すように、実施例２では、３
時間および９時間放置しても、Ｚ−Ｌｙｓ−Ｉｎｄの安
定性が良かった。これに対し、比較例２（Ａ，Ｂ，Ｃ）
では、３時間放置でＺ−Ｌｙｓ−Ｉｎｄの分解が認めら
れ、９時間放置後では沈殿が生じた。

【０１０２】（実施例３、比較例３）実施例３および比
較例３は、１種類の緩衝剤を用いた緩衝液または２種類
の緩衝剤を用いた緩衝液中のＺ−Ｌｙｓ−Ｉｎｄの安定
性を調べた例である。すなわち、まず、Ｚ−Ｌｙｓ−Ｉ
ｎｄを、ＤＭＳＯに４２．２ｇ／リットルの濃度で溶解
させた。この溶液に対し、下記の表３に示すように、精
製水と緩衝液を添加して混合し、前記Ｚ−Ｌｙｓ−Ｉｎ
ｄ安定性を評価した。この安定性の評価は、室温で１０
分間、３時間、１９時間および９０時間放置したときの
前記混合液の着色を目視観察することにより行った。な
お、使用した緩衝剤は、グリシルグリシン、ＡＤＡ、Ｍ
ＥＳ、４−メチルイミダゾル、トリエタノールアミンお
よびリン酸ナトリウムカリウムである。前記各緩衝剤の
緩衝液中の濃度は、それぞれ１ｍｏｌ／リットル（注：
緩衝剤を２種類使用した場合の緩衝剤合計濃度は２ｍｏ
ｌ／リットルとなる）であり、ｐＨは全てｐＨ７．５で
ある。

【０１０３】 （表３） 単位：ｍｌ 実施例３ 比較例３ Ａ Ｂ Ａ Ｂ Ｃ Z−Lys−Ind溶液 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 精製水 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20ク゛リシルク゛リシン 緩衝液 0.79ク゛リシルク゛リシン ＋MES緩衝液 0.79リン 酸ナトリウムカリウム緩衝液 0.79 4−メチルイミタ゛ソ゛ル緩衝液 0.79トリエタノールアミン緩衝液 0.79 安定性 １０分後 薄黄色 薄黄色 薄黄色 青色 青色 ３時間後 薄黄色 薄黄色 青色＊ １９時間後 薄黄緑色 薄茶色 ９０時間後 赤茶色 ＊：青色沈殿生成

【０１０４】前記表３に示すように、実施例３（Ａ）で
は、１９時間放置後であっても、Ｚ−Ｌｙｓ−Ｉｎｄの
安定性に優れ、実施例３（Ｂ）では９０時間放置後であ
っても安定性に優れていた。これに対し、比較例３
（Ａ）では、３時間後に青色沈殿が生成し、また比較例
３（Ｂ，Ｃ）では１０分後にＺ−Ｌｙｓ−Ｉｎｄの分解
が認められた。

【０１０５】（実施例４、比較例４）この実施例および
比較例では、マンガンの存在がＺ−Ｌｙｓ−Ｉｎｄの安
定性に及ぼす影響を調べた。すなわち、まず、Ｚ−Ｌｙ
ｓ−Ｉｎｄを、ＤＭＳＯに１０．６ｇ／リットルの濃度
で溶解させた。この溶液に対し、下記の表４に示すよう
に、精製水、マンガン溶液、緩衝液を添加して混合し、
前記Ｚ−Ｌｙｓ−Ｉｎｄ安定性を評価した。この安定性
の評価は、室温で１０分間および１９時間時間放置した
ときの前記混合液の着色を目視観察することにより行っ
た。前記マンガン溶液は、ＭｎＣｌ₂ を精製水に０．１
０ｍｏｌ／リットルの濃度で溶解して調製した。また、
緩衝液は、グリシルグリシン緩衝液（濃度：０．１ｍｏ
ｌ／リットル、ｐＨ８）およびビシン緩衝液（濃度：
０．１ｍｏｌ／リットル、ｐＨ８）である。

【０１０６】 （表４） 単位：ｍｌ 実施例４ 比較例 Ａ Ｂ Ｃ ４ Z−Lys−Ind溶液 0.1 0.1 0.1 0.1 精製水 2.0 1.5 0.2 0.2 マンガン溶液 0 0.5 2.0 0ク゛リシルク゛リシン 緩衝液 2.0 2.0ビシン緩衝液 2.0 2.0 安定性 ２０分後 薄黄色 薄黄色 薄青色 青色 １９時間後 薄黄色 青色＊ ＊：青色沈殿生成

【０１０７】前記表４に示すように、マンガンのみ使用
した実施例４（Ｃ）は、グリシルグリシンのみ使用した
実施例４（Ａ）と同様に、Ｚ−Ｌｙｓ−Ｉｎｄの安定性
に優れていた。また、マンガンとグリシルグリシンを併
用した実施例４（Ｂ）では、１９時間放置後であっても
Ｚ−Ｌｙｓ−Ｉｎｄの安定性に優れていた。これに対
し、マンガンおよびグリシルグリシンを使用しない比較
例４では、２０分後にＺ−Ｌｙｓ−Ｉｎｄの分解が確認
された。

【０１０８】（実施例５、比較例５）この実施例および
比較例では、マンガンの存在がＺ−Ｌｙｓ−Ｉｎｄの安
定性に及ぼす影響を調べた。すなわち、まず、Ｚ−Ｌｙ
ｓ−Ｉｎｄを、ＤＭＳＯに２０．１ｇ／リットルの濃度
で溶解させた。この溶液に対し、下記の表４に示すよう
に、精製水、マンガン溶液、緩衝液を添加して混合し、
前記Ｚ−Ｌｙｓ−Ｉｎｄ安定性を評価した。この安定性
の評価は、室温で３時間後および９０時間時間放置した
ときの前記混合液の着色を目視観察することにより行っ
た。前記マンガン溶液は、ＭｎＣｌ₂ を精製水に０．４
０ｍｏｌ／リットルの濃度で溶解して調製した。また、
緩衝液は、グリシルグリシンとＡＤＡの混合緩衝液（グ
リシルグリシン濃度：０．１ｍｏｌ／リットル、ＡＤＡ
濃度：０．１ｍｏｌ／リットル、ｐＨ７．５）およびＴ
ＥＳとＭＥＳの混合緩衝液（ＴＥＳ濃度：０．１ｍｏｌ
／リットル、ＭＥＳ濃度：０．１ｍｏｌ／リットル、ｐ
Ｈ７．５）である。

【０１０９】 （表５） 単位：ｍｌ 実施例５ 比較例 Ａ Ｂ Ｃ ５ Z−Lys−Ind溶液 0.01 0.01 0.01 0.01 精製水 0.20 0.08 0.08 0.20 マンガン溶液 0.12 0.12ク゛リシルク゛リシン ＋ADA緩衝液 0.75 0.75TES＋MES緩衝液 0.75 0.75 安定性 ３時間後 薄黄色 薄黄色 薄黄色 薄青色 ９０時間後 薄黄色 薄黄色 薄赤色 薄青色＊ ＊：青色沈殿生成

【０１１０】前記表５に示すように、マンガンのみ使用
した実施例５（Ｃ）は、グリシルグリシンのみ使用した
実施例５（Ａ）と同様に、Ｚ−Ｌｙｓ−Ｉｎｄの安定性
に優れていた。また、マンガンとグリシルグリシンを併
用した実施例５（Ｂ）では、９０時間放置後であっても
Ｚ−Ｌｙｓ−Ｉｎｄの安定性に優れていた。これに対
し、マンガンおよびグリシルグリシンを使用しない比較
例５では、３時間後にＺ−Ｌｙｓ−Ｉｎｄの分解が確認
され、９０時間放置後では青色沈殿が生成した。

【０１１１】（実施例６）この実施例は、Ｚ−Ｌｙｓ−
Ｉｎｄを基質としてトリプシンの酵素反応および尿中ト
リプシンインヒビター（ＵＴＩ）の活性を測定した例で
ある。以下に試薬および測定操作を示す。

【０１１２】（トリプシン溶液）トリプシン（Ｔ−７４
１８、シグマ社製）５０ｍｇを、ＨＣｌ溶液（濃度１．
０ｍｏｌ／ｌ）に溶解して調製した。前記ＨＣｌ溶液
は、ＣａＣｌ₂ を９０ｍｏｌ／リットルの濃度で含む。

【０１１３】（基質溶液）Ｚ−Ｌｙｓ−Ｉｎｄ２０ｍｇ
を精製水１０ｍｌに溶解して調製した。

【０１１４】（緩衝液） グリシルグリシン緩衝液：濃度０．１０ｍｏｌ／リット
ル、ｐＨ７．５

【０１１５】（ＵＴＩ溶液）ＵＴＩ（ウリナスタチン
社、持田製薬社製）を精製水で溶解して２００Ｕ／ｍｌ
の濃度に調整した。

【０１１６】（測定操作）下記の表６に示す組成の酵素
反応液（Ａ，Ｂ，Ｃ）を調製し、この反応液の着色を下
記の測定条件で測定した。この結果を下記の表７に示
す。

【０１１７】 （表６） 単位：ｍｌ 酵素反応液 Ａ Ｂ Ｃ 緩衝液 2.4 2.4 2.4 トリプシン溶液 0 0.10 0.10 ＵＴＩ溶液 0 0 0.10 精製水 0.30 0.20 0.10 基質溶液 0.30 0.30 0.30

【０１１８】（測定条件） 測定機器：分光光度計（日本分光社製、Ｖ−５５０型） 測定波長：６５０ｎｍ 計測時間：４０秒後、６０秒後

【０１１９】 （表７） 単位：吸光度 酵素反応液 Ａ Ｂ Ｃ ４０秒後 ０．００８ ０．１５７ ０．１０３ ６０秒後 ０．００９ ０．３８０ ０．２４２ △６０秒−４０秒 ０．００１ ０．２２３ ０．１３９

【０１２０】前記表７に示すように、トリプシンおよび
ＵＴＩが含まれていない酵素反応液Ａでは、４０秒後お
よび６０秒後においてもほとんど着色がなかった。しか
し、トリプシンを含有する酵素反応液Ｂでは、４０秒後
および６０秒後と時間が経過するに従い、着色が強まっ
た。また、トリプシンに加えＵＴＩを含有する酵素反応
液Ｃでは、時間の経過とともに着色が強まったが、酵素
反応液Ｂに比べて着色程度は低く、ＵＴＩのトリプシン
阻害活性が確認できた。これらの結果から、本発明の安
定化方法により、前記新規エステル化合物の分解による
着色の影響を受けることなく、トリプシンの酵素活性を
測定することができるといえる。

【０１２１】（実施例７、比較例６）実施例７では、実
施例６の酵素反応液Ａを用いた。比較例６では、緩衝液
をＴＥＳ（濃度：０．１０ｍｏｌ／リットル、ｐＨ７．
５）に変えた実施例６の酵素反応液Ａを用いた。そし
て、計測時間を、６０秒後、３００秒後、６００秒後、
９００秒後、１２００秒後とした以外は、実施例６と同
様にして酵素反応液の着色を測定した。この結果を下記
の表８に示す。なお、酵素反応液Ａは、トリプシンを含
まないから、反応液が着色するということは、Ｚ−Ｌｙ
ｓ−Ｉｎｄが分解したことを意味する。

【０１２２】

【０１２３】前記表８に示すように、実施例７では、着
色は認められなかった。これに対し、比較例６では、経
時的な着色が認められた。

【０１２４】（実施例８）この実施例は、本発明の安定
化方法により試験フィルムを作製した例である。すなわ
ち、まず、濾紙（２ＭＭＣＨＲ、ワットマン社製）を１
０×１０ｃｍの大きさに切断した。他方、グリシルグリ
シン緩衝液（１ｍｏｌ／リットル、ｐＨ７．５）に、Ｚ
−Ｌｙｓ−Ｉｎｄを４ｍｇ／リットルの濃度で溶解させ
た。この溶液に、前記濾紙を浸し、その後、前記濾紙を
温度４０℃湿度２０％の条件で乾燥させて、試験フィル
ムを作製した。

【０１２５】この試験フィルムを用いてトリプシンの酵
素反応の測定を行った。すなわち、前記試験フィルムを
７ｍｍ×５ｍｍの大きさに切断し、これにトリプシン
（Ｔ−８２５３、シグマ社製）溶液（濃度１００ｍｇ／
リットル）を１０μｌ点着し、２５℃で反応させた。そ
の結果、前記試験フィルムは、鮮やかな青色に呈色し
た。

【０１２６】（実施例９）この実施例も、実施例８と同
様に、本発明の安定化方法により試験フィルムを作製し
た例である。すなわち、まず、濾紙（２ＭＭＣＨＲ、ワ
ットマン社製）を１０×１０ｃｍの大きさに切断した。
他方、ＴＥＳ緩衝液（０．１ｍｏｌ／リットル、ｐＨ
７．５）に、Ｚ−Ｌｙｓ−Ｉｎｄを４ｍｇ／リットルの
濃度で溶解させ、さらにマンガンを０．０４ｍｏｌ／リ
ットルの濃度で溶解させた。この溶液に、前記濾紙を浸
し、その後、前記濾紙を温度４０℃湿度２０％の条件で
乾燥させて、試験フィルムを作製した。

【０１２７】この試験フィルムを用いてトリプシンの酵
素反応の測定を行った。すなわち、前記試験フィルムを
７ｍｍ×５ｍｍの大きさに切断し、これにトリプシン
（Ｔ−８２５３、シグマ社製）溶液（濃度１００ｍｇ／
リットル）を１０μｌ点着し、２５℃で反応させた。そ
の結果、前記試験フィルムは、鮮やかな青色に呈色し
た。

【０１２８】

【発明の効果】以上のように、本発明の安定化方法は、
前記式（１）で表わされる新規エステル化合物の分解等
を防止できる方法である。このエステル化合物は、トリ
プシンの基質として使用することができ、しかも肉眼で
充分に判別可能な色素を生成できる。したがって、本発
明の安定化方法を適用することにより、有用な前記エス
テル化合物のトリプシンの基質等としての性能をさらに
発揮させることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明にかかるインドキシル−アミノ酸エステ
ルまたはインドキシル−ペプチドエステルの製造方法の
一例を示すスキームである。

【図２】本発明にかかるインドキシル−アミノ酸エステ
ルまたはインドキシル−ペプチドエステルの製造方法の
その他の例を示すスキームである。

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の式（１）で表されるインドキシル
   −アミノ酸エステルまたはインドキシル−ペプチドエス
   テルと、グリシルグリシンおよびマンガンの少なくとも
   一方の物質とを共存させるインドキシル−アミノ酸エス
   テルまたはインドキシル−ペプチドエステルの安定化方
   法。 【化１】
2. 【請求項２】 インドキシル−アミノ酸エステルまたは
   インドキシル−ペプチドエステルと、グリシルグリシン
   およびマンガンの少なくとも一方の物質とを液体中で共
   存させる請求項１記載の安定化方法。
3. 【請求項３】 グリシルグリシンの濃度が、３０ｍｍｏ
   ｌ／リットル以上である請求項２記載の安定化方法。
4. 【請求項４】 マンガンの濃度が、５〜１００ｍｍｏｌ
   ／リットルである請求項２または３記載の安定化方法。
5. 【請求項５】 液体が、ｐＨ７〜８．５の緩衝液である
   請求項２〜４のいずれか一項に記載の安定化方法。
6. 【請求項６】 式（１）のＢ¹ が、アセチル基またはベ
   ンジルオキシカルボニル基である請求項１〜５のいずれ
   か一項に記載の安定化方法。
7. 【請求項７】 インドキシル−アミノ酸エステルまたは
   インドキシル−ペプチドエステルが、下記の式（２）で
   表されるインドキシル−アミノ酸エステルまたはインド
   キシル−ペプチドエステルである請求項１〜６のいずれ
   か一項に記載の安定化方法。 【化２】
8. 【請求項８】 式（２）のＢ¹ がアセチル基またはベン
   ジルオキシカルボニル基である請求項７記載の安定化方
   法。
9. 【請求項９】 グリシルグリシンおよびマンガンの少な
   くとも一方の物質の存在下、下記の式（１）で表わされ
   るインドキシル−アミノ酸エステルまたはインドキシル
   −ペプチドエステルを基質としてトリプシンの酵素反応
   を生起させ、前記基質の分解により生じた発色物質を測
   定するトリプシンの酵素活性測定方法。 【化３】
10. 【請求項１０】 液体中でトリプシンの酵素反応を生起
    させる請求項９記載の測定方法。
11. 【請求項１１】 グリシルグリシンの濃度が、３０ｍｍ
    ｏｌ／リットル以上である請求項９または１０記載の測
    定方法。
12. 【請求項１２】 マンガンの濃度が、５〜１００ｍｍｏ
    ｌ／リットルである請求項９〜１１のいずれか一項に記
    載の測定方法。
13. 【請求項１３】 液体が、ｐＨ７〜８．５の緩衝液であ
    る請求項９〜１２のいずれか一項に記載の測定方法。
14. 【請求項１４】 前記式（１）のＢ¹ が、アセチル基ま
    たはベンジルオキシカルボニル基である請求項９〜１３
    のいずれか一項に記載の測定方法。
15. 【請求項１５】 インドキシル−アミノ酸エステルまた
    はインドキシル−ペプチドエステルが、下記の式（２）
    で表されるインドキシル−アミノ酸エステルまたはイン
    ドキシル−ペプチドエステルである請求項９〜１４のい
    ずれか一項に記載の測定方法。 【化４】
16. 【請求項１６】 式（２）のＢ¹ が、アセチル基または
    ベンジルオキシカルボニル基である請求項１５記載の測
    定方法。
17. 【請求項１７】 下記の式（１）で表わされるインドキ
    シル−アミノ酸エステルまたはインドキシル−ペプチド
    エステルと、グリシルグリシンおよびマンガンの少なく
    とも一方の物質とを共存させたトリプシン酵素活性測定
    用試薬 【化５】
18. 【請求項１８】 インドキシル−アミノ酸エステルまた
    はインドキシル−ペプチドエステルと、グリシルグリシ
    ンおよびマンガンの少なくとも一方の物質とが液体中で
    共存している請求項１７記載の測定用試薬。
19. 【請求項１９】 グリシルグリシンの濃度が、３０ｍｍ
    ｏｌ／リットル以上である請求項１８記載の測定用試
    薬。
20. 【請求項２０】 マンガンの濃度が、５〜１００ｍｍｏ
    ｌ／リットルである請求項１８または１９に記載の測定
    用試薬。
21. 【請求項２１】 液体が、ｐＨ７〜８．５の緩衝液であ
    る請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の測定用試
    薬。
22. 【請求項２２】 試験フィルムにおいて、インドキシル
    −アミノ酸エステルまたはインドキシル−ペプチドエス
    テルと、グリシルグリシンおよびマンガンの少なくとも
    一方の物質とが乾燥状態で共存している請求項１７記載
    の測定用試薬。
23. 【請求項２３】 式（１）のＢ¹ が、アセチル基または
    ベンジルオキシカルボニル基である請求項１７〜２２の
    いずれか一項に記載の測定用試薬。
24. 【請求項２４】 インドキシル−アミノ酸エステルまた
    はインドキシル−ペプチドエステルが、下記の式（２）
    で表されるインドキシル−アミノ酸エステルまたはイン
    ドキシル−ペプチドエステルである請求項１７〜２３の
    いずれか一項に記載の測定用試薬。 【化６】
25. 【請求項２５】 式（２）のＢ¹ が、アセチル基または
    ベンジルオキシカルボニル基である請求項２４記載の測
    定用試薬。