Przedmiotem wynalazku jest srodek do równoczesnego oznaczania liczby trombocytów i leukocytów w krwi calkowitej, za pomoca zwyklego mikroskopu optycznego.Wiadomo, ze oznaczanie liczby trombocytów i leukocytów nalezy do metod stosowanych zwykle w laboratoriach klinicznych. Liczbe trombocytów mozna oznaczac róznymi metodami, takimi jak nizej opisane. Elektroniczne obliczanie czastek za pomoca automatów, opracowa¬ nych dla liczenia trombocytów. Metoda ta jest wprawdzie szybka i prosta, ale do jej stoso¬ wania sa niezbedne bardzo kosztowne przyrzady i nie zawsze mozna nia zastapic liczenie mikroskopowe. Ebwtarzalnosc tej metody jest takze gorsza od powtarzalnosci liczenia mi¬ kroskopowego.Liczenie trombocytów za pomoca mikroskopu z kontrastem fazowym, przy uzyciu roz¬ tworu zawierajacego kokaine lub nowokaine albo innego roztworu umozliwiajacego takie liczenie. Do stosowania tej metody niezbedny jest mikroskop z kontrastem fazowym, a inna istotna wada tej metody jest to, ze jest ona bardzo meczaca, wyczerpujaca i szkodliwa dla oczu osób prowadzacych obliczanie, zwlaszcza jezeli tych obliczen jest wielei Liczenie trombocytów metoda barwienia. Ta metoda jest najprostsza i moze byc pro¬ wadzona za pomoca mikroskopu. W znanych metodach tego typu jako barwnik stosuje sie fiolet krystaliczny (fiolet gencjanowy), bedacy chlorowodorkiem szesciometylo-p-rozaniliny.Metodom tym stawia sie uzasadniony zarzut, ze w porównaniu z metoda oznaczania przy uzyciu kontrastu fazowego daja wyniki znieksztalcone, poniewaz nie wszystkie trombocyty ulegaja dobrze widocznemu zabarwieniu.2 142 043 Obliczanie leukocytów stanowi najszerzej stosowana metode w diagnostyce hematologicznej i Do tego celu ogólnie nadaje sie i daje dobre wyniki roztwór Turka, opisany w farmakopei wegierskiej (Hi« Hg» VI#)t ale roztwór ten nie nadaje sie do okreslania liczby trombocytów, co stanowi powazna wade, poniewaz bardzo czesto konieczne jest wspólne prowadzenie obu tych szeroko stosowanych prób laboratoryjnyehi Do oznaczania liczby trombocytów i leukocytów w calkowitej krwi za pomoca zwyklego mikroskopu swietlnego niezbedny jest roztwór barwnika, który (a) powoduje calkowita hemoli- ze erytrocytów bez zmniejszania liczby trombocytów i leukocytów, (b) utrwala zarówno trom- bocyty jak i leukocyty i (c) zawiera taki barwnik, który wiaze sie silnie z oboma tymi cia¬ lami i w ten sposób utrwala je w zwyklym swietle* Roztwór, który odpowiada dwóm pierwszym z tych wymagan jest wprawdzie znany /Scand* J* Clin# Eivest. 33, 121 (1974)/, ale przy jego uzyciu trzeba obliczanie trombocytów pro¬ wadzic z zastosowaniem mikroskopu z kontrastem fazowymi Wynalazek ma na celu wytworzenie takiego roztworu barwnika, za pomoca którego mozna oznaczac liczbe trombocytówi leukocytów w pelnej krwi przy uzyciu zwyklego mikroskopu optycz¬ nego, z uniknieciem opisanych wyzej wad znanych odczynnikowi Nieoczekiwanie stwierdzono, ze przez polaczenie roztworu hemolizujacego i utrwala¬ jacego z zasadowym barwnikiem o duzym powinowactwie, uzyskuje sie roztwór srodka, który umozliwia wspólne okreslanie liczby trombocytów i leukocytów przy uzyciu zwyklego mikroskopu optycznego• Oba warunki moga byc spelnione w przypadku, gdy roztwór dzialajacy hemolizujaco i utrwalajaco jest zgodny z barwnikiem, tzn* nie tworzy zadnego osadu* Powstawania mikro¬ skopijnych osadów nalezy unikac, gdyz moga one miec charakter trombocytów i tym samym powodowac blad w obliczaniu.Stosowane dotychczas roztwory barwników typu fioletu krezylowego spelniaja te wa¬ runki tylko czesciowo i Roztwory do obliczania zawierajace skladniki barwnika fioletu krezy¬ lowego maja bowiem odczyn slabo zasadowy, totez trombocyty ulegaja tylko blademu zabarwieniu i nie sa uwidocznione jednoznacznie* Wynalazek jest oparty na stwierdzeniu, ze barwniki zwane tiazynowymi nadaja sie do tego celu bardzo dobrze* Cecha barwników tiazynowych jest obecnosc dwóch grup chromoforowyeh* Zwiazki tiazynowe sa w praktyce lekarskiej stosowane w róznych dziedzinach, np. do barwienia bakterii i w histochemii, ale ani fachowa ani patentowa literatura nie daje zadnej wskazówki, ze moga one byc uzyteczne do wytwarzania srodka bedacego przedmiotem wynalazku* Najwazniej¬ szymi przedstawicielami tej grupy zwiazków sa: blekit toluidynowy o wzorze 1, tionina o wzo¬ rze 2 i blekit metylenowy o wzorze 3. srodek wedlug wynalazku zawiera 0,1-5 czesci wagowych acetonu, 0,05-2,0 czesci wa¬ gowych aldehydu mrówkowego i/albo aldehydu glutarowego, 0,001-0,1 czesci wagowych barwnika tiazynowego, korzystnie blekitu toluidynowego, 0,1-2,0 czesci wagowych soli mineralnej, ko¬ rzystnie chlorku sodowego, zas reszte do 100 czesci wagowych stanowi woda* Korzystnie srodek wedlug wynalazku zawiera w stosunku wagowym 0,1-5,0 czesci acetonu, 0,05-2,0 czesci aldehydu mrówkowego, 0,001-0,1 czesci blekitu toluidynowego i 0,1-2 czesci chlorku sodowego? Szczególna zaleta barwników stosowanych zgodnie z wynalazkiem jest to, ze maja one bardzo duze powinowactwo takze i w stosunku do kwasnych makroczasteczek trombocytów i leuko¬ cytów, dzieki czemu uzyskuje sie bardzo silna i wyrazna widocznosc# Najwazniejsza zaleta srodków wedlug wynalazku jest to, ze sa one znacznie bardziej czule od znanych odczynników* Fakt ten potwierdzaja nizej opisane próby*142 043 3 Z próbek o nieznanej liczbie trombocytów i leukocytów ustala sie w 20 kolejno pro¬ wadzonych obliczeniach liczbe trombocytów i leukocytów* Dokladnosc obliczania komórek jest wtedy zadowalajaca, gdy normalne odchylenie jest mniejsze niz 10#* Wyniki takich prób pro¬ wadzonych przy uzyciu srodka wedlug wynalazku oraz przy uzyciu znanych odczynników podano na rysunku w postaci wykresów, na których liczby trombocytów ileukocytów okreslono zgodnie z systemem 31 jako wartosci G/litr, to jest giga(liczba komórek)/litr, co równa sie liczbie komórek pomnozonej przez 109 w 1 litrze.Figura 1 przedstawia wyniki okreslania liczby trombocytów przy uzyciu srodka wedlug wynalazku. Liczba trombocytów jako srednia z 20 pomiarów wynosi: £ = 218,8 G/litr, przy standardowej dewiacji SD = + 5,0, co odpowiada wspólczynnikowi dewiacji, wyrazonej jako standardowa dewiacja w procentach: CV = 2,28?6.Figura 3 przedstawia wyniki okreslania liczby leukocytów przy uzyciu srodka wedlug wynalazku. Liczba leukocytów jako srednia z 20 pomiarów wynosi: x ¦ 5,08 G/litr, przy stan¬ dardowej dewiacji SD = + 0,042, co odpowiada wspólczynnikowi dewiacji: CV » 0,8#* W celach porównawczych obliczono trombocyty przy uzyciu odczynnika TKROKCFIK pro¬ dukcji firmy Godecke, a leukocyty obliczano przy uzyciu odczynnika znanego pod nazwa roztwór Turk'a. Próby prowadzono z krwia pobrana od 41 pacjentów i równolegle liczono trombocyty i leukocyty. Wyniki w ukladzie wspólrzednych kartezjanskich podano odpowiednio na figi 2 i fig. 4. Korelacje pomiedzy obiema metodami oraz standardowe wspólczynniki (a, b) funkcji opisujacej te korelacje, mianowicie y » ax + b, okreslano za pomoca maszyny do liczenia Hewlett-Packard HP-90* Na obu tych wykresach y przedstawia wyniki uzyskane przy liczeniu w roztworze srodka wedlug wynalazku, zas x oznacza wyniki otrzymane przy uzyciu znanych roztworów.Przy liczeniu trombocytów korelacja r wynosila 0,927* Funkcjonalny zwiazek liniowy pomiedzy obiema metodami mozna ujac równaniem: y a 1,05 x - 0,94* w którym y oznacza wynik obliczania trombocytów uzyskany przy uzyciu srodka wedlug wynalazku, zas x oznacza wynik uzyskany przy uzyciu odczynnika THR0MB0FIX w próbie, której wyniki podano na figi 2i :"alezy stwierdzic, ze liczba trombocytów oznaczona przy uzyciu srodka wedlug wynalazku jest c okolo 5% wyzsza od tej, ktdra w tej samej próbce krwi okreslono przy uzyciu THR0MB0FIX * Uwzgled¬ niajac charakter sposobu oznaczania, uzyskanie wyniku zbyt wysokiego nie wchodzi w rachube.Stwierdzona róznice mozna przypisac temu, ze skladnik barwnika stosowanego w srodku wedlug wynalazku ma znacznie wieksze powinowactwo do kwasnych grup makroczasteczek trombocytów, totez obraz wykazuje silniejszy kontrast i moze byc lepiej odczytany* Stosujac srodek wedlug wynalazku mozna wiec uniknac systematycznie zbyt niskich wyników, otrzymywanych przy sto¬ sowaniu znanych roztworów barwników. Nalezy tez nadmienic, ze THR0MB0FIX równiez i przy stosowaniu mikroskopu z kontrastem fazowym daje wyniki zbyt niskie i W obliczeniach leukocytów przy uzyciu srodka wedlug wynalazku i, przy uzyciu roztworu Turk'a korelacja wynosi: r a 0,959 i zwiazek pomiedzy tymi obiema metodami mozna przedsta¬ wic jako funkcje liniowa: y - 0,97x + 0,23. Wskazuje to, ze pomiedzy obiema tymi metodami nie ma znacznej róznicyi Wynalazek zilustrowano ponizej w przykladach, nie ograniczajac tym jego zakresu* Przyklad I* Roztwór do liczenia 200 ml 0,996 roztworu chlorku sodowego w de¬ stylowanej wodzie miesza sie z 5 ml 3596 aldehydu mrówkowego i 770 ml destylowanej wody, pod¬ danej dzialaniu wymieniacza jonów* R silnym wymieszaniu roztworu rozpuszcza sie w nim 100 mg barwnika bedacego blekitem toluidynowynu Otrzymany roztwór przesacza sie przez szklany filtr G-4# Po dodaniu 25 ml acetonu otrzymany roztwór powinien byc klarowny i pozbawiony czastek* Przyklad II* Okreslenie liczby trombocytów i leukocytów w krwi zylnej, po¬ traktowanej srodkiem przeciw krzepnieniu* Celowe jest traktowanie krwi kwasem etylenodwuami- noczteroooctowym jako srodkiem przeciw krzepnieniu, poniewaz w obecnosci tego srodka nie zachodzi nawet minimalne osadzanie sie trombocytów* Po pobraniu krwi z kwasem etylenocwu-4 142 043 aminoczteroocto wym nastawia sie stezenie tego kwasu na 2 mg/ml przez uprzednie wysuszenie macierzystego roztworu wodnego soli dwusodowej kwasu etylenodwuaminoczterooctowego w rurce z sztucznego tworzywa* Krzepnieniu krwi mozna tez zapobiegac stosujac 3,3% roztwór cytry¬ nianu trójsodowego w destylowanej wodzie, przy czym przy pobieraniu krwi do kaniuli z sztucz¬ nego tworzywa bierze sie 9 czesci krwi na 1 czesc cytrynianu. ' Do 25 Jil krwi zylnej, poddanej zabiegowi zapobiegajacemu krzepnieniu, w probówce z sztucznego tworzywa dodaje sie 475 pi opisanego wyzej roztworu do liczenia i mieszanine pozostawia nie mieszajac w temperaturze pokojowej na okres 15 minut* Liczenie trombocytów i leukocytów nalezy przeprowadzic w ciagu 6 godzin* Przed liczeniem roztwór miesza sie po¬ nownie, wkrapla do komory Burker'a i pozostawia do osadzania sie na okres 10 minut• Liczenie trombocytów. Sume obliczonych trombocytów w 10 katach prostych komory 3urker'a mnozy sie przez 2 w przypadku stosowania kwasu etylenodwuaminoczterooctowego, wzglednie przez 2,2 w przypadku stosowania cytrynianu jako srodka zapobiegajacego krzepnie¬ niu i uzyskuje sie liczbe trombocytów w G/litr.Liczenie leukocytów. Liczbe leukocytów znalezionych w 4 kwadratach ograniczonych 3 liniami dzieli sie przez 18 (lub mnozy przez 0,055) w przypadku stosowania cytrynianu, albo dzieli sie przez 20 (lub mnozy przez 0,05) w przypadku stosowania kwasu etylenodwuamino¬ czterooctowego jako srodka zapobiegajacego krzepnieniu i uzyskuje sie liczbe leukocytów w G/litr.Przykl ad III. Okreslenie liczby trombocytów i liczby leukocytów w krwi wlosniezkowej. Nakluwa sie zdezynfekowany koniec palca lub piete, odgarnia pierwsze krople krwi i zasysa pipeta ze strzykawka z sztucznego tworzywa (np. pipeta Finna, Gilsona lub Eppendorfa) 25/al krwi. Krew te poddaje sie kolysaniu w rurce z sztucznego tworzywa, zawie¬ rajacej 25 jal roztworu kwasu etylenodwuaminoczterooctowego i miesza dobrze z tym srodkiem zapobiegajacym krzepnieciu* R dodaniu 450 ^ul roztworu do liczenia i dokladnym wytrzesieniu roztwór pozostawia sie w pokojowej temperaturze na okres co najmniej 15 minut i po ponownym zmieszaniu podaje do komory Burker'a i pozostawia w wilgotnej komorze na okres 10 minut do osadzenia sie.Liczbe trombocytów i liczbe leukocytów okresla sie w sposób podobny do opisanego wyzej w odniesieniu do krwi potraktowanej srodkiem zapobiegajacym krzepnieciu. Przy oblicza¬ niu trombocytów mnozy sie przez wspólczynnik 2, a przy obliczaniu leukocytów trzeba dzielic przez 20i Przyklad IV. Postepuje sie w sposób podany w przykladzie I, ale zamiast aldehydu mrówkowego stosuje sie 80 g 25% aldehydu glutarowego* Zastrzezenie patentowe srodek do równoczesnego oznaczania liczby trombocytów i leukocytów za pomoca zwyklego mikroskopu optycznego, znamienny tym, ze zawiera 0,1-5 czesci wagowych acetonu, 0,05-2,0 czesci wagowych aldehydu mrówkowego i/albo aldehydu glutarowego, 0,001-0,1 czesci wagowych barwnika tiazynowego, korzystnie blekitu toluidynowego, 0,1-2,0 czesci wagowych soli mineralnej, korzystnie chlorku sodowego, zas reszte do 100 czesci wagowych stanowi woda*142 043 ^W (+) CH, W^N Wzór 1 NH2 CH3 Nhi s * m Wzór 2 Cl Cl N ^ Wzór 3 NICH,),1 .':-2 + 3SD 211 -2SD -3 SD x=218,8G/litT SD=±5,0 CV = 2,28% / r=0,927 a=-0,94 b= 1,05 y=1,05x-0,% 160 180 200 220 2U) 260 280 -300 Liczba trombocytów (G/litr) w roztworze Thrombofix Fig.2\U2 0-C x = 5,08 G/litr SD = 0,042 CV = 0,8% Fig. 3 r=0,959 a-0,23 b=0,97 y=0,97x+0,23 ~—i 1— 12 V. 8 10 Liczba trombocytów (G/litr) w roztworze TLirka 16 18 Fig. A PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL