Opis patentowy opublikowano: 89 09 30 145565 Int. CL4 A61K 39/108 A61K 35/22 TVórcy wynalazku: Llubinko Stojkovic, Rodmila Rwie, Vera Spasojevic Ujprawniony z patentu: Solco Basel AG, Bazylea (Szwajcaria) SPOSÓB WYWARZANIA SZCZEPIONKI DO KURACYJNEGO I PROFILAKTYCZNEGO TRAKTOWANIA ZAKAZEN DRÓG MOCZOWYCH U LUDZI Frzedmiotem wynalazku Jest sposób wytwarzania szczepionki do kuracyjnego i profilak¬ tycznego traktowania zakazen dróg moczowych u ludzi.Szczepionki przeciw róznym schorzeniom u ludzi albo u zwierzat znane sa i stosowane od dawna, ffe przyklad, zgodnie ze szwajcarskim opisem patentowym nr 158 980, odrebna szcze¬ pionke mieszana dla chorej osoby mozna wytwarzac w ten sposób, ze pobiera sie wystepujace przy danym ognisku choroby zarazki , np. z migdalków, z pochwy, z plwocin albo z kalu, hoduje je bez wyboru i dezaktywuje. Wedlug francuskiego opisu patentowego nr 2 03^ 7^3, mozna antygen najrózniejszego pochodzenia czynic nierozpuszczalnym w wodzie, traktujac odpowiedni ciekly wyciag taninianem glinowym. Otrzymany produkt wykazuje zwolniona zdolnosc absorpcji, totez dzialanie jego jest przedluzone.Szczepionka sporzadzona na podstawie enteropatogenicznych szczepów z rodzaju Escheri- chia coli wedlug opisu patentu europejskiego nr 28 172, wedlug opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr k 338 298 lub wedlug publikacji Unlisted Drugs (30, /1978/), 123 - C3.etrax KB8 moze sluzyc do biernego uodporniania swiezo urodzonych zwierzat rzeznych.Szczepionke te podaje si.e domiesniowo lub podskórnie na krótko przed miotem matce zwierze¬ cia i chroni w ten sposób cieleta, prosieta itp. po urodzeniu przed biegunka powodowana przez bakterie Coli.Proponowano równiez i dla ludzi szczepionki na podstawie bakterii Coli. Vfedlug wylo¬ zonego opisu patentowego RFN 1 931 195, pobiera sie mikroorganizmy z plwocin osób cierpia¬ cych na zakazenie dróg oddechowych, zabija te mikroorganizmy i przerabia na szczepionke majaca postac aerozolu. Podaje sie Ja przez wdychanie i moze sluzyc jako lek uodporniajacy drogi oddechowe. Szczepionka ta zawiera oprócz wielu innych rodzajów i szczepów bakterii równiez bakterie Escherichia coli.2 145 565 Inna znana szczepionka, znana z francuskiego opisu patentowego nr 2 397 839, sklada sie z zabitych lub oslabionych zarodków pewnej liczby rodzajów bakterii, lacznie z 11 róznymi szczepami Escherichia coli. Rdaje sie ja doustnie i ma ona sluzyc do uodporniania przewodu zoladkowo-Jelitowego, a zwlaszcza zwalczac niezyt tego przewodu lub chronic przed niezytem. Szczepionka ta zawiera oprócz tego metionine, sole zelaza, witaminy, bakterie mlekowe i inne* Dotychczas nie opracowano jednak zadnej szczepionki przeznaczonej scisle przeciwko infekcjom dróg moczowych i opartej zwlaszcza na Escherichia coli.Rjwodem braku takiej szczepionki jest bardzo duza liczba serologicznych typów Escherichia coli. Mianowicie, bakterie te maja bardzo zlozona strukture antygenowa, o 3 glównych grupach antygenowych. Dotychczas poznano okolo 160 typów antygenowych 0f ponad 60 typów K i ponad 60 typów H. Kombinacje tych typów daja okolo 10000 serologicznie róz¬ niacych sie szczepów Escherichia coli. Jrzy takiej liczbie szczepów, opracowanie szcze¬ pionki skutecznej ogólnie przeciw zakazeniom dróg moczowych na podstawie mozliwej w pewnej mierze do przyjecia liczbie szczepów Escherichia coli, z góry wydaje sie niemozliwe.Aby szczepionka taka mogla byc uznana za ogólnie skuteczna przeciw zakazeniom dróg moczowych, powinna ona faktycznie zapewniac uodpornienie przeciwko zapaleniu pecherza, zapaleniu stercza, zapaleniu miedniczek nerkowych i zapaleniu nerek, bez wzgledu na bakte¬ riologiczne pochodzenie schorzenia. Jest Jednak rzecza oczywista, ze im szerszy jest zakres uodporniajacego dzialania szczepionki, tym wieksza jest tez mozliwosc przerzucania sie takiego dzialania i na inne uklady wlasciwe cialu osoby przyjmujacej taka szczepionke.Jak wiadomo, bakterie Coli maja fimbrie (wloski, wlókna), które powoduja przyczep¬ nosc tych bakterii jelitowych do blony sluzowej jelit. Bez wspóldzialania fimbrii bakterie Coli bylyby splukiwane z jelita, co powodowaloby powazne naruszenie równowagi fizjologicz¬ nej pomiedzy bakteriami Coli i innymi bakteriami w jelicie. Mozna przeto bylo obawiac sie, ±e szczepionka na podstawie bakterii Coli bedzie powodowac wytwarzanie w organizmie prze¬ ciwcial, które beda mogly reagowac ze zwyklymi ukladami majacymi fimbrie, w tym równiez z bakteriami Coli Jelita, co powodowaloby wspomniane wyzej, powazne zaburzenia flory jelitoweJ# Nieoczekiwanie stwierdzono jednak, ze z malej liczby szczepów Escherichia coli i ma¬ lej liczby pewnych innych rodzajów bakterii, które wyizolowano z moczu ludzi cierpiacych na zakazenie dróg moczowych, mozna wytwarzac szczepionke skuteczna przeciwko takim szcze¬ gólnym zakazeniom oraz dzialajaca ogólnie, a nie wywierajaca praktycznie zadnego wplywu szkodliwego na flore jelitowa.Nawa szczepionke wytwarza sie w postaci zawiesiny w jalowym, izotonicznym roztworze sposobem polegajacym wedlug wynalazku ma tym, ze nastepujace uropatogenne szczepy bakterii, a mianowicie Escherichia coli DSM 3229-DSM 3234, KLebsiella pneumoniae DSM 3235, froteus mirabilis DSM 3238, Iroteus morganii DSM 3237 i Streptococcus faecalis DSM 3236, które wyodrebniono w znany sposób z moczu ludzi cierpiacych na zakazenie dróg moczowych, hoduje sie kazdy osobno na odpowiedniej pozywce i po zakonczeniu hodowli oddziela sie kazdy z wy¬ tworzonych materialów biologicznych i inaktywuje go droga ogrzewania zawiesiny do tempera¬ tury 55-60°C w ciagu okoli 1 godziny, lub droga traktowania formaldehydem lub droga na¬ swietlania promieniami- £ , po czym otrzymane i zinaktywowane bakterie z poszczególnych szczepów miesza sie ze soba w takiej ilosci i rozciencza jalowym roztworem izotonicznym tak, aby w 1 ml znajdowalo sie okolo 50-500 milionów zarodków kazdego szczepu i zadaje kolo¬ idalnym fosforanem glinowym do uzyskania stezenia 1,5-10 mg AlPO^ na 1 ml zawiesiny.Sposób wedlug wynalazku prowadzi sie w nizej opisany sposób.Najpierw pobiera sie od osób cierpiacych na zakazenie dróg moczowych srednie próbki moczu, przeszczepia je na agar MacConkey, poddaje hodowli na plytkach agarowych w tempe¬ raturze 37°Cw ciagu 16-18 godzin, nastepnie wyosobnia wytworzone kolonie i identyfikuje je przez okreslenie ich wlasciwosci biochemicznych i biologicznych.145 565 3 Identyfikacja Streptococcus faecalis (enterokok).Charakterystyczne male kolonie barwi sie metoda Grama i poddaje nastepujacym próbom; Kataliza (w obecnosci ogrzanej krwi) + hemoliza -/yS wzrost w temperaturze45°C + wzrost przy wartosci pH =9,6 + wzrost w 6,5# roztworze NaCl + wzrost na 4096zólci + wykrywanie polisacharyd-antygenD + W celu zidentyfikowania szczepów Ef coli, Rroteus oraz Klebsiella stosuje sie nastepujace kryteria: E.Zdolnosc do ruchów czynnych Wzrost w srodowisku KCN Cytrynian Jako zródlo wegla Weglowodanowy gaz z glukozy fó/as z laktozy Kwas z sacharozy Kwas z maltozy Kwas z mannitu R*as z trechalozy i-k-us z ksylozy Jfydroliza zelatyny Indol Ureaza _ n , Rroteus C0-L1 aorganll + ? + - + + + "7737 - ' + + + * M) _+_(d] : + + + Rroteus Klebsiella mirabilis pneumoniac ? + + + + + + + + + + + i i i i : i ii ; i ii i + i i i-i- i i :iii i i i ii i i i i iiii i s iii : i i i iii i i i i ii: 1 1 1 1 i i i 1 1 1 + + fkSz TSJ (agar trzycukrowo- zelazowy) . .- - + Lizyndohydrokarboksylaza + - + Zidentyfikowane w ten sposób kolonie pozostawia sie do dalszego wzrastania na plyt¬ kach agarowych, w temperaturze 37° C w ciagu 24 godzin, po czym wytwarza sie ich zawiesine w fizjologicznym roztworze soli kuchennej, bada ich czystosc stosujac barwienie metoda Grama i wymraza do sucha. Otrzymane pojedyncze szczepy charakteryzuje sie i zaopatruje oznaczeniami Jak podano nizej w tabelach* Fermentowanie weglowodanów (+ oznacza kwas) Weglowodan laktoza ^ sacharoza mannit maltoza 455 + 0 + + UB 525 + 0 + + UB Szczep 560 UB + 0 + + Escherichia 616 UB + + + + coli 654 + + + + UB 719 UB + + + + malibioza + ? + + + +4 1*5 565 c.d. tablicy ::::::x~:~n::n:":::::::n:::::::::::5:::::::::::^~:::::::::5::::~:~::^ rafinoza 0 O 0 0 0 O ramnoza + ± + + + + trehaloza + + + + + + salicyna O 0 0 O O + ryboza ? + + + + + amygdalina 0 0 0 0 O + galaktoza ++++++ sorbit + ? + + + + arabinoza ? + + + + + glukoza + + + + + + mannoza ++++++ fruktoza + + + + + + adonit (rybit) 0 0 0 0 0 0 inozyt 0 0 0 0 0 0 dulcyt 0 0 0 0 0 0 cellobioza 0 0 0 0 0 + ksyloza + +_ + + + + Wlasciwosci biochemiczne Szczep Escherichia coli Iróba 445 UB 525 UB 560 UB 616 UB 645 UB 719 UB mocznik 0 0 0 0 0 0 hemoliza na plytkach aga¬ rowych z krwia 0 0 0 0 0 + hydroliza zelatyny 0 0 0 0 0 0 cytrynian 0 0 0 0 0 0 indol + + + + + + ^S 0 0 0 0 0 0 zdolnosc do ruchów czynnych + + + + + + W tabeli tej znak + oznacza wynik dodatni w ciagu 24 godzin, a znak 0 oznacza wynik ujemny po uplywie 72 godzin.145 565 Fermentowanie weglowodanów (+ oznacza kwas) Weglowodan laktoza sacharoza mannit maltoza malibioza rafinoza ramnoza trehaloza salicyna ryboza amygdalina galaktoza sorbit arabinoza glukoza mannoza fruktoza adonit (rybit) inozyt dulcyt cellobiosa ksyloza KL( pn< KI _——..___. ?bsiella ^umoniac 16 B 0 + + + 0 0 + + + 0 + + + 0 0 0 + Froteus mirabilis 63 B 0 0 0 0 0 0 0 + 0 + 0 + 0 0 + 0 0 0 0 0 0 + Proteus morgonii 58 B 0 0 0 0 0 0 0 0 0 + 0 + 0 0 ? + 0 0 0 0 0 Wlasciwosci chemiczne Iróba mocznik hemoliza na plytkach agarowych z krwia KLebsiella pneumaniac KL 16B Iroteus mirabilis 63 B Proteus morganii 58 B hydroliza zelatyny cytrynian indol zdolnosc do ruchów czynnych 0 0 ? 0 0 o o ? o o + o W tabeli tej znak + oznacza wynik dodatni w ciagu 24 godzin a znak 0 oznacza wynik ujemny po uplywie 72 godzin*145 565 Fermentowanie weglowodanów (+ oznacza kwas) Weglowodan laktoza sacharoza mannit maltoza melibioza rafinoza ramnoza trehaloza salicyna ryboza amygdalina galaktoza sorbit arabinoza glukoza mannoza fruktoza adonit (rybit) inozyt dulcyt cellobioza ksyloza — __.•___•—•_•»._•—•_.Streptococcus faecalic 676 ? + + 4- 0 0 + + + 0 + 0 0 0 + 0 —•——' —••• Wlasciwosci biochemiczne Próba Streptococcus faecalis 676 mocznik rodzaj hemolizy hydroliza zelatyny redukcja mleczka laksumowego indol eskulina nie hemolizuje 0 + 0 + Wzrost na pozywce Uo% zólc 6,596 roztwór chlorku sodowego wartosc pH = 9,6 + + +145 565 Odpornosc na dzialanie temperatury temperatura 60°C w ciagu 30 minut W tabeli tej znak plus oznacza wynik dodatni, a znak p wynik ujemny.Morfologiczne wlasciwosci wyosobnionych i wyzej opisanych szczepów mozna zestawic nastepujaco: Eschericha coli.Gram - ujemne preciki, 1,1-1,5 x 2,0 - 5,0 jam, (forma zywa) ruchliwe dzieki wiciowatym biczom.R*oteus mirabilis i P.morganii.Gram - ujemne preciki, 0,4 - 0,6 x 0,1 - 3,0 um, bez otoczki, ruchliwe dzieki wiciowatym biczom (nie wszystkie).Klebsiella pneumaniac.Gram - ujemne, nieruchliwe preciki, 0,5 - 15 x 0,6 - 6,0yum Streptococcus faecalis.Ora.m - ujemne ziarenkowce jajowate, 0,5 - 1,0 urn, nieruchliwe.Szczepy Escherichia coli badano równiez odnosnie ich wlasciwosci serologicznych i w tym celu poddano Je na nosniku próbie aglutynacji za pomoca, wielowartosciowych surowic OK A, B, C, D i E. Dalsze serologiczne typowanie, to jest okreslanie antygenów 0, K i H, pro¬ wadzono metoda Difco Laboratories. Detroit, St. Zjedn. Am. 1976. Tb identyfikowanie dalo nizej zestawione wyniki.Szczep Oznaczenie Typ serologiczny Escherichiasoli Ec 455 UB 0,6 : K 13 : H 1 Escherichiacoli Ec 525 UB 0,1 : K 1 : H 7 Escherichiacoli Ec 560 UB 0,4, : K 3 : H 5 Escherichiacoli Ec 616 UB 0,75 : : H 5 Escherichiacoli Ec 654 UB postac R Escherichiacoli Ec 719 UB nie daje sie typowac hemolitycznie Wspomniane i opisane wyzej szczepy w liczbie 10 zdeponowano 8 sierpnia 1984 roku w Centraalbureau voor Schimmekultures Casterstraat 1, 3740 AG Baarm, Holandia pod oznacze¬ niami od CBS 516.84 do CBS 525.84, a w dniu 5 grudnia 1984 roku przeniesiono do Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Grisebachstrasse 8, 3400 GStingen, Rep. Fed. Niemiec, gdzie otrzymaly ona zneczenia wejsciowe od DSM 3229 do DSM 3238.W celu wytwarzania szczepionek, szczepy te hoduje sie pojedynczo na stalych lub cieklych podlozach, a korzystnie na podlozu stalym, np. takim jak agar odzywczy (NUtrient Agar Difco), majacym nastepujacy sklad: wyciag miesny (Difco Beef Extract) 3 g/litr Bacto -Rspton 5 g/litr chloreksodowy 5 g/litr .Bacto -Agar 15 g/litr Srodowisko to wyjalawia sie w ciagu 15 minut w temperaturze 121°C. Wykazuje ono wartosc pH okolo 7f2.Irzy wytwarzaniu na duza skale stosuje sie butle Roux, a w skali laboratoryjnej plytki Itetriego. Szczepi sie materialem posiewowym, którego kilka mililitrów rozdziela sie równomiernie na calej powierzchni. Butle Roux zamyka sie zatyczkami bawelnianymi i sro-8 1^5 565 dowisko z zaszczepiona powierzchnia umieszcza u dolu. Zaszczepione kultury poddaje sie hodowli w temperaturze 37°C w ciagu 24 godzin, Fbrost bakteryjny zalewa sie niezbedna iloscia, zalezna od gestosci porostu kultury w naczyniu, buforu fosforanowego z roztworem soli kuchennej (PBS) i lekko kolyszac, aby nie uszkodzic powierzchni agaru, przykrywa caly porost, Z kazdej butli lub z kazdej plytki Fetriego robi sie jeden wymaz, barwi metoda Gramma i bada czystosc. Butle lub plytki Fetriego, które wydaja sie zanieczyszczone, odrzuca sie. Zawiesiny z jednego szczepu i jednego zbioru zasypuje sie razem przez wyjalowiona gaze nylonowa, Inaktywacje, tak jak hodowle, prowadzi sie dla pojedynczego szczepu, Mazna w tym celu stosowac utrzymywanie w temperaturze okolo 55-6o°C w ciagu okolo 1 godziny, albo inakty- wowac za pomoca aldehydu mrówkowego lub przez naswietlanie promieniami w • Ze wzgledu na latwosc korzystnie stosuje sie inaktywowanie przez ogrzewanie, Irodukty uzyskane droga hodowli inaktywuje sie w kapieli wodnej w temperaturze 60°C w ciagu 1 godziny, po czym dodaje sie fenol (koncowe stezenie 0,35#)« Fróbke zawiesiny pobiera siew celu sprawdzenia jalowosci i zidentyfikowania, po czym zapas stezonego produktu przechowuje sie w lodówce. Ody próba jalowosci po 3 dniach nie wykaze zadnych zanieczyszczen, proces wytwarzania szczepionki prowadzi sie dalej, ale próbe jalowosci prowadzi sie dalej w ciagu 14 dni i jezeli wykaze ona wzrost jakichkolwiek organizmów, to dany produkt usuwa sie, Zinaktywowane zawiesiny w naczyniach magazynowych, pochodzace od jednego szczepu, poddaje sie odwirowywaniu w ochlodzonej wirówce przy 3000 obrotów/minute w ciagu 1 godziny (wirówka Sorvall 4 C R, wirnik napedowy 2000), powodujac usuniecie pozostalej cieczy, po czym z osadu bakteryjnego wytwarza sie zawiesine w roztworze soli kuchennej, zawierajacym 0,01# tiomersalu. Gestosc koncentratów zapasowych oznacza sie metoda zmetniania i zawiesiny opisuje sie i przechowuje w temperaturze 4°C (? 2°C), Korzystnie stezone zawiesiny 10 szczepów E,coli, froteus mirabilis, Rroteus morganii, Klebsiella pneumaniac i Streptococcus faecalis miesza sie tak, aby 1 mililitr zawieral: E,coli, 6 szczepów, z kazdego 2,5 x 10 , razem 1,5 x 10 zarodków, Froteus mirabilis, 1 szczep, 7,5 x 10 zarodków, Froteus morganii, 1 szczep, 7,5 x 10 zarodków, o Klebsiella pneumaniac, 1 szczep, 3 x 10 zarodków, Streptococcus faecalis, 1 szczep, 5 x 10 zarodków razem 2 x 10 zarodków/1 ml.Ostateczne stezenie uzyskuje sie mieszajac ze soba poszczególne, przechowywane zawie¬ siny. Opisane stezenie osiaga sie przez rozcienczenie 0,15 m roztworem soli buforowanym fosforanem i zawierajacym 0,01% mertiolanu (Thiomersal), po czym produkt utrzymuje sie w po¬ kojowej temperaturze w ciagu 24 godzin i nastepnie przechowuje w temperaturze 4°C (? 2°C), ftniewaz dodaje sie zel fosforanu glinowego, przeto stezenie powinno byc odpowiednio wyzsze. Zel fosforanu glinowego wytwarza sie w ten sposób, ze 854 g siarczanu glinowo-pota- sowego, 12 t^O rozpuszcza sie w 6 litrach wody i przesacza, 685 g fosforanu trójsodowego, 12 l^O rozpuszcza sie w 6 litrach wody. Roztwór zawierajacy glin przechowuje sie w tempera¬ turze 37 C, gdyz w temperaturze pokojowej staje sie on latwo roztworem przesyconym, Oba roztwory wlewa sie równomiernie do 21 litrów wody, odwirowuje osad, ponownie miesza z 13 li¬ trami wody i powtórnie odwirowuje, Z otrzymanego osadu wytwarza sie zawiesine, odprowadza jej objetosc do 8,1 litra, dodaje 5 m teOH do uzyskania wartosci pH = 6,0 i utrzymuje w autoklawie w temperaturze 121°C w ciagu 1 godziny. Ta ilosc wystarcza do wytworzenia 66 litrów szczepionki, zawierajacej 3 mg Al PO^ lub 0,66 mg Al mg w 1 mililitrze, Zaadsorbowana koncowa szczepionke, po sprawdzeniu jej wartosci pH, która powinna wynosic 6,2 - 7,0, umieszcza sie w odpornych na dzialanie wysokiej temperatury ampulkach o pojemnosci 1 ml, przy czym w ampulce umieszcza sie 0,5 ml szczepionki jako pojedyncza dawke#145 565 9 Ifelezy zwracac uwage na to, aby podczas napelniania ampulek szczepionka byla wstrzasana.Laczna liczba zinaktywowanych mikroorganizmów w 1 dawce, to Jest w 0,5 ml, wynosi okolo 1 x 10 • Ostatecznie bada sie szczepionke odnosnie Jej Jalowosci, metoda podana w Euro- paische Riarmahopóe (wydanie 2, dodatek 1970), odnosnie toksycznosci, ugodnie z przepisem Swiatowej Organizacji Zdrowia (przyrost ciezaru ciala myszy) i odnosnie nieprawidlowej toksycznosci, zgodnie z Farmakopea Europejska.Szczepionke mozna zgodnie z wynalazkiem przygotowywac nie tylko w postaci cieklej, Jak opisano wyzej, ale takze w postaci zliofilizowaneJ# W tym celu, zinaktywowana zawie¬ sine otrzymana wyzej opisanym sposobem, rozciencza sie tak, aby w 0,5 ml zawierala 1 x 109 zinaktywowanych bakterii o wyzej podanym skladzie. Do*rozcienczenia stosuje sie *]% roztwór ludzkiej albuminy lub srodka zastepujacego plazme, o nazwie Ifeemaccel (Behringwarte AG, 3500 Jferburg, RFN) z 0,0196 tiomersalu w 0,85 n roztworze chlorku sodowego. Buteleczki o pojemnosci 2 ml napelnia sie w sterylnych warunkach 0,5 ml opisanej wyzej, rozcienczonej zawiesiny, zamraza w temperaturze okolo -45°c, po czym suszy pod zmniejszonym cisnieniem w aparacie do liofilizowania. Temperatura suszenia nie powinna byc wyzsza niz 36°C. Caly proces liofilizacji trwa 24 godziny i nastepnie buteleczki zamyka sie w atmosferze azotu gumowymi korkami z aluminiowymi nakrywkami.Do wprowadzania fosforanu glinowego i równoczesnie Jako rozpuszczalnik przed poda¬ niem takiej szczepionki stosuje sie wodny zel fosforanu glinowego o stezeniu Al PO^ wyno¬ szacym 2 mg/ml. Zel ten przygotowuje sie w sposób opisany wyzej i przed wprowadzeniem do ampulek rozciencza sie go roztworem soli kuchennej tak (okolo dwunastokrotnie), aby uzyskac koncowe stezenie 2 mg/ml, W ampulkach o pojemnosci 1 ml umieszcza sie 0*5 ml szczepionki.W celu zbadania trwalosci szczepionki wytwarzanej sposobem wedlug wynalazku okresla¬ no Jej zdolnosc do wytwarzania przeciwcial u myszy dwukrotnie, a mianowicie bezposrednio po wytworzeniu szczepionki, 3 grudnia 1981 roku oraz po uplywie 2 lat, to jest 7 grudnia 1983 roku.Uodpornianie myszy, 5 grup po 10 myszy (samce, szczep NMRS, ciezar ciala 16-20 g) uodporniono przez podanie im dootrzewnowo szczepionki, wstrzykujac 2 dawki po 0,5 ml szczepionki w odstepie 2 tygodni. 20 myszom z tego samego chowu, i o takim samym ciezarze ciala, stanowiacym grupe porównawcza, wstrzykniete tylko po 0,5 ml zelu fosforanu glino¬ wego. R) uplywie 2 tygodni od podania drugiej porcji szczepionki pobrano aseptycznie krew i zebrano w odpowiednie grupy. R skrzepnieciu odwirowano surowice z kazdej grupy i prze¬ chowywano w temperaturze -22°C do badania serologicznego.Przygotowanie antygenów (aglutynogeny). Do wytwarzania antygenów stosowano 9 homo¬ logicznych szczepów bakterii zawartych w szczepionce. Szczep EC 654 nie dawal sie agluty- nowac (postac R), totez nie mógl byc stosowany jako aglutynogen. Liofilizowanie kultury szczepów bakterii zmieszano z 9 ml pozywki (ekstrakt cielecy firmy Difco), wytwarzajac - zawiesine i prowadzono hodowle w temperaturze 37°C w ciagu 24 godzin. Druga subkulture stosowano do wytwarzania antygenów. 600 ml pozywki (ekstrakt cielecy) szczepiono kulture posiewowa (kazdy szczep oddzielnie) i prowadzono hodowle w ciagu 36 godzin w temperaturze 37°C. Nastepnie dodawano formaliny az do koncowego stezenia 0,1 #, po czym kontynuowano proces hodowlany w temperaturze 37°C w ciagu 7 dni. W kazdej kulturze sprawdzano nastepnie brak zywych bakterii i badano sterylnosc. Zinaktywowana zawiesine bakterii odwirowywano w chlodzonej wirówce (Sorval) w ciagu 1 godziny, przy 3000 obrotów/minute i z osadu wytwa¬ rzano ponownie zawiesine w roztworze soli kuchennej z buforem fosforanowym (wartosc pH s 7,2) tak, aby uzyskac stezenie okolo 20 x 10^ bakterii w ml. Do próby aglutynacji stosowano okolo 2 x 10 bakterii/ml jako aglutynogen.Iróba aglutynacji. Surowice mysie rozcienczano w 1:2 stopniach rozcienczania fizjo¬ logicznym roztworem soli kuchennej, buforowanym fosforanem i majacym wartosc pH = 7,2. ft 0,3 ml rozcienczonej surowicy mieszano w rurkach fehna z taka sama objetoscia antygenu.Jedna rurka, nie zawierajaca dodatku surowicy,, sluzyla jako sprawdzian antygenu. Fb 18 go¬ dzinach w temperaturze 37°C i dalszych 24 godzinach w temperaturze 4°C ustalono wyniki reakcji. Za miano kazdej surowicy przyjmowano najwyzsze rozcienczenie, przy którym mozna10 145 565 bylo jeszcze stwierdzic widoczna aglutynacje bakterii. We wszystkich próbach stosowano równoczesnie surowice ujemne i dodatnie dla kontroli. Dla mian aglutynowych mysich surowic znaleziono nastepujace geometryczne wartosci srednie.Antygen Miano (wartosci odwrotne) próba 1981 rok próba 1983 rok E. coli 455 UB E. coli 525 UB E. coli 560 UB E. coli 616 UB E, coli 719 UB Klebsiella pneumoniac 16 B froteus morganii 58 B Strepcoccus faecalis 676 1015,5 905,1 1015,5 905,1 1280 201,6 160,0 113,1 71,3 905,1 1015,5 905,1 800,3 1280 201,6 142,5 113,1 71,3 Z wyników tych widac, ze szczepionka przechowywana w temperaturze 4 C zachowuje w pelni skutecznosc co najmniej w ciagu 2 lat.Stosowanie szczepionki wytwarzanej sposobem wedlug wynalazku jest wskazane zwlaszcza w przypadkach zapalenia pecherza moczowego, zapalenia gruczolu krokowego, zapalenia pecherza i miedniczek nerkowych i zapalenia odmiedniczkowego, Rejentom nie wykazujacym ostrego stanu goraczkowego (przeciwwskazanie) szczepionke te podaje sie w odstepach 1 do 2 tygodni, lacznie 3 wstrzykiwania domiesniowego po 0,5 ml szczepionki, Frzy wystapieniu silnej reakcji po wstrzyknieciu nalezy to traktowanie przerwac, Eb uplywie 1 roku nalezy w celu odswiezenia powtórzyc wstrzykiwanie, stosujac równiez dawke 0,5 ml.Szczepionke wytworzona sposobem wedlug wynalazku wstrzykiwano w róznych szpitalach 383 pacjentom, u których stwierdzono na podstawie objawów, potwierdzonych bakteriologicznie, zakazenia dróg moczowych i pacjentów tych obserwowano dalej w ciagu 1 roku. Wynik wykazaly, ze podanie szczepionki powoduje trwajace co najmniej 1 rok zwiekszenie odpornosci dróg mo¬ czowych, dajace daleko posunieta ochrone przed nawrotem zakazenia. Wyniki badan klinicznych podano ponizej.Liczba nawrotów/ponownyeh zakazen w czasie obserwowania w ciagu 1-12 miesiecy. 0 I Badajacy Poczatek ob- 1-2 miesiecy serwacji U/BS 62/62 6/62 10096 9,396 Li/SH 118/118 12/113 10096 10,696 Ru/H, DE 203/203 15/183 10096 8,296 Razem szczepionych 383/383 33/358 10096 9,296 fróba porównawcza 198/198 26/148 10096 17,696 VI 7-12 miesiecy . 2/115 1,796 3/194 1,596 5/309 1,6* 18/146 12,3*145 565 11 Szczepionka wytwarzana sposobem wedlug wynalazku Jest znoszona dobrze i nie stwierdzono zadnych powaznych dzialan ubocznych* feze ona tyc tez bez problemów stosowana podczas ciazy, czego dowodem jest ponad 100 takich przypadków stosowania* Istotne cechy szczepionki wytwarzanej sposobem wedlug wynalazku oraz ustalone na podstawie badan farmakologicznych i klinicznych korzysci, jakie daje stosowanie tej szczepionki, zestawiono ponizej* Ilosciowy sklad 10 róznych szczepów zestawiono na podstawie czestotliwosci wyste¬ powania czynników powodujacych zakazenia dróg moczowych, a mianowicie: 75% szczepów stano¬ wia szczepy E*coli (równomierne wystepujace), a 25% stanowia szczepy ft^oteus mirabilis, Rroteus morganii* Klebsiella pneumaniac i Streptococcus faecalis* Tfe chorobotwórcze dla ukladu moczowego szczepy sa tak zinaktywowane, ze zawieraja antygeny dajace ochrone, np# antygeny strzepkowe i antygeny 0* Szczepy wybrane Jako antygeny, badane w próbie z ochrona myszy, wykazuja takze skrzyzowana ochrone przed hete- rologicznymi szczepami tego samego rodzaju czynnika chorobotwórczego* Jak wykazala próba z przyrostem ciezaru ciala myszy, zinaktywowane antygeny, za¬ warte w szczepionce wytworzonej sposobem wedlug wynalazku, po przechowywaniu w chlodni w ciagu co najmniej 6 miesiecy staja sie wyraznie mniej toksyczne. Szczepionka ta, podana zwierzetom (myszom, królikom), a takze ludziom, wywoluje z nich wzrost odpornosci, chroni myszy przed smiertelnym zakazeniem i szczury przed sztucznie wywolanym zapaleniem odmied- niczkowynu Ilosciowy i jakosciowy sklad szczepionki odpowiada takiej ilosci antygenu, która powoduje dobre uodpornienie, a nie wywoluje u pacjentów ciezkich, a nawet zadnych dzialan ubocznych. Szczepionka ta podana pacjentom powoduje takze wydzielanie sie Immunoglobuliny A w moczu pacjentów* Uzdrawia ona pacjentów cierpiacych na zakazenia dróg moczowych, a przy nawrotach choroby chroni co najmniej w ciagu 12 miesiecy przed ponownym zakazeniem* Sfeczepionka wytwarzana sposobem wedlug wynalazku moze byc ciekla lub liofilizowana i w tym drugim przypadku do ponownego Jej rozpuszczenia przed podaniem Jako rozpuszczalnik stosuje sie zel fosforanu glinowego* PL PL PL