PL152711B1 - Prolonged release of biologically active somatotropins - Google Patents

Description

RZECZPOSPOLITA OPIS PATENTOWY 152 711 POLSKA

Patent dodatkowy do patentu nr--Zgłoszono: 85 10 03 (P. 255622)

Int. Cl.5 A23K 1/165 A61K 37/36

Pierwszeństwo: 84 10 04 Stany Zjednoczone Ameryki

URZĄD

PATENTOWY

RP

Zgłoszenie ogłoszono: 86 12 30

Opis patentowy opublikowano: 1991 08 30 cmuiu

Q G f L H

Twórca wynalazku —

Uprawniony z patentu: Monsanto Company,

St. Louis (Stany Zjednoczone Ameryki)

Środek zwiększający produkcję żywności do stosowania w rolnictwie

Przedmiotem wynalazku jest środek zwiększający produkcję żywności do stosowania w rolnictwie. Jakkolwiek w przypadku pewnych polipeptydów biologicznie czynnych (bioaktywnych) przedłużone działanie można uzyskać przy pozajelitowym podaniu nawet niewielkich ich dawek, w przypadku innych polipeptydów ich stężenie w surowicy musi być dość wysokie i/lub ich okres półtrwania w surowicy jest krótki, tak więc konieczne jest stosowanie ich w dużych dawkach (np. co najmniej około 100 mg) dla użyskania żądanego efektu biologicznego w przedłużonym okresie czasu np. tygodniowym lub dłuższym. Przykładem takich polipeptydów są somatotropiny (hormony wzrostu).

Aby zapobiec niepożądanie szybkiemu uwalnianiu się polipeptydów do krwioobiegu zwierzęcia pewne polipeptydy podawane są pozajelitowo w ciekłych nośnikach, które mogą ewentualnie zawierać środki opóźniające hydratację (środki przeciwhydratacyjne), względnie polipeptydy podaje się w postaci zasocjowanej z metalami lub związkami metali, co jeszcze bardziej zmniejsza ich rozpuszczalność w płynach ustrojowych. Aby zapobiec konieczności podawania niepożądanie dużych ilości takiego nośnika, korzystne jest stosowanie znacznego stężenia polipeptydu w nośniku. Jednakże roztwory większości polipeptydów bioaktywnych o znacznych stężeniach są bardzo lepkie, co w efekcie utrudnia ich wstrzykiwanie lub podawanie w inny sposób. Ponadto wiele powszechnie stosowanych środków przeciwhydratacyjnych powoduje jeszcze większy wzrost lepkości i może przyczynić się do pogorszenia zdolności do wstrzykiwania takich kompozycji. Z tych i innych względów zazwyczaj bardzo trudno jest uzyskać odpowiednie środki na tyle szybko· uwalniające substancję czynną, by zapewnić pożądany efekt biologiczny u zwierzęcia, na tyle wolno uwalniające substancję czynną, by znacznie przedłużyć to działanie, zawierające dawkę umożliwiającą uwalnianie substancji czynnej z odpowiednią szybkością w ciągu przedłużonego okresu czasu oraz o na tyle małej objętości i lepkości, aby można je było dogodnie podawać.

Ponieważ każdy polipeptyd jest inny, np. z uwagi na jego trójwymiarową strukturę i oddziaływanie z innymi substancjami, nie jest możliwe przewidywanie lub teoretyczne uzasadnianie łat2

152 711 wości osiągania przedłużonego skutecznego działania. W przypadku wielu jeszcze polipeptydów istnieje konieczność opracowania takich środków o przedłużonym działaniu, jeśli pragnie się wykorzystać aktywność biologiczną polipeptydu w użyteczny i opłacalny sposób.

Od dawna poszukuje się sposobów uzyskiwania przedłużonego działania substancji bioaktywnych dla zmniejszenia częstotliwości ich podawania i/lub zmniejszania do minimum występowania wstrząsu u zwierząt poddawanych ich stosowaniu. Przedłużone działanie osiągnięto dla wielu takich substancji różnymi sposobami. Jeden ze sposobów polega na stosowaniu roztworów olejowych, które można wstrzykiwać domięśniowo, podskórnie lub w inny sposób. W pewnych przypadkach substancje o mniejszej rozpuszczalności w oleju podaje się w formie zawiesin w oleju.

Tak np. w opisie patentowym St.Zjedn.Ameryki nr 2 491 537 ujawniono przedłużone do 24 godzin uwalnianie penicyliny zdyspergowanej w oleju (np. oleju roślinnym) żelowanym pektyną, związkiem celulozy lub białkiem, takim jak żelatyna. W opisie tym zasugerowano również możliwość uzyskania przedłużonego uwalniania w przypadku insuliny i hormonów sterydowych. W opisie patentowym St.Zjedn.Ameryki nr 2 507 193 ujawniono w próbie na królikach uwalnianie penicyliny prokainowej w dawce 300 000jednostek/cm³, zdyspergowanej w oleju arachidowym zżelowanym za pomocą 5% monostearynianu glinowego (A1MS), nawet w ciągu 11 dni. W opisie patentowym St.Zjedn.Ameryki nr 3 016 330 ujawniono powlekaną A1MS penicylinę zdyspergowaną w oleju sezamowym. Chien w Journal of Parenteral Science and Technology 35 (3), 109 (1981) opisuje przedłużone uwalnianie do organizmu żywego penicyliny prokainowej G zdyspergowanej w oleju roślinnym zżelowanym za pomocą 2% A1MS, stwierdzając, że stosowanie większej ilości niż 2% A1MS powoduje nieznaczne jedynie wydłużenie działania penicyliny w skutecznych stężeniach, oraz że zawiesiny zawierające więcej niż 2% A1MS mają zbyt dużą lepkość, aby mogły być stosowane w praktyce.

Stosowane są również zawiesiny w oleju pewnych leczniczych substancji o małej masie cząsteczkowej (MW), innych niż penicylina. Tak np. w opisie patentowym St.Zjedn.Ameryki nr 3 676 557 ujawniono kompozycje o przedłużonym działaniu zawierające do 50% soli normorfinonów z kwasem 4,4'-metylenobis/3-hydroksy-2-naftoesowym) zdyspergowanych w oleju zżelowanym za pomocą A1MS. W opisie patentowym St.Zjedn. Ameryki nr 4 016 273 ujawniono środki o przedłużonym działaniu zawierające do 40% soli oksazepin z kwasem 4,4'-metylenobis/3hydroksy-2-naftoesowym) w olejach żelowanych za pomocą stearynianów glinowych.

Opisano również układy do przedłużonego uwalniania pewnych bioaktywnych polipeptydów. Tak np. w opisie patentowym St.Zjedn.Ameryki nr 2 964 448 ujawniono zawiesiny zawierające około 2% relaksyny w oleju roślinnym żelowanym za pomocą A1MS. W opisie tym stwierdzono, że zawiesina taka wykazuje relaksację porównywalną z relaksacją oleju bez środka żelującego (np. w ciągu 5-7 dni). Jeszcze bardziej wydłużone działanie, np. do 23 dni, można osiągnąć przez obróbkę cieplną zawiesiny zawierającej A1MS.

W opisie patentowym St.Zjedn. Ameryki nr 3 869 549 ujawniono środki o przedłużonym działaniu do wstrzykiwania, zawierające „bardzo małe dawki, np. „ułamki miligrama peptydu. Jakkolwiek wspomniano tam również o hormonach wzrostu, konkretne przykłady dotyczą rozpuszczalnych w wodzie preparatów kortykotropiny (ACTH), aktywnych w ciągu 7-8 dni. W szczególności w opisie tym ujawniono kompozycje zawierające sole addycyjne z kwasami analogów ACTH, zdyspergowane w oleju arachidowym żelowanym za pomocą dwustearynianu glinu (AIDS) lub zaadsorbowane na AIDS, a następnie rozproszone w takim oleju. W każdym jednak przypadku kompozycje do wstrzykiwania zawierają zaledwie 0,03-0,1% analogu, a stosunek wagowy peptydu do soli glinowej jest nie większy niż 0,5.

W opisie patentowym St.Zjedn. Ameryki nr 4 256 737 ujawniono kompozycje o przedłużonym działaniu zawierające analogi hormonu LH-RH. Kompozycje takie zawierają sole hormonu, w tym również sole z metalami wielowartościowymi, np. sole cynkowe, w oleju roślinnym żelowanym za pomocą soli glinowych kwasów tłuszczowych. Analogi LH-RH podaje się w preparatach do wstrzykiwania o stężeniu 0,01-1%.

Opisano również zawiesiny wodne soli metalicznych lub kompleksów polipeptydów o przedłużonym działaniu po podaniu pozajelitowym. Tak np. w opisie patentowym St.Zjedn. Ameryki nr 3 852 422 ujawniono długotrwale działające zawiesiny produktu strącania rozpuszczalnych

152 711 w wodzie gonadotropin za pomocą wodorotlenku glinowego lub cynkowego. Ponieważ cynk występuje w insulinie trzustkowej, zbadano również przedłużone uwalnianie insuliny z zawiesin wodnych w wyniku oddziaływania insuliny z różnymi metalami, np. z cynkiem, niklem, kobaltem i kadmem, jak to ujawniono w w opisach patentowych St.Zjedn.Ameryki nr nr 2 143 590,2 174 862, 2882203, 2920014 i 3 102077.

Somatotropiny są występującymi w przyrodzie hormonami polipeptydowymi, wytwarzanymi przez przysadkę mózgową zwierząt. Somatotropiny zawierają około 190 reszt aminokwasowych, przy czym liczba tych reszt może się zmieniać w zależności od gatunku zwierzęcia. Różne somatotropiny wykazują pewien stopień homologiczności, jednak są różne u różnych gatunków zwierząt.

Znane jest podawanie somatotropin zwierzętom hodowlanym w celu zwiększenia produkcji żywności, czyli zwiększenia mleczności zwierząt, ich rozrostu i polepszenia wykorzystania pasz, a także zwiększenia stosunku mięsa chudego do tłuszczu u zwierząt rzeźnych. Rodzaj i stopień reakcji organizmu zwierzęcia na podaną somatotropinę zmieniają się w zależności od stadium rozwoju zwierzęcia. W celu uzyskania właściwego zwiększenia produkcji żywności należy zapewnić podwyższony poziom somatotropiny w krwioobiegu zwierzęcia w przedłużonym okresie czasu. Można to uzyskać przez wielokrotne wstrzykiwanie somatotropiny, np. codzienne wstrzykiwanie jej roztworu w solance. Zabieg taki jest niewygodny, ze względu na pracochłonność i czasochłonność. Istnieje zatem zapotrzebowanie na opracowanie takiego preparatu somatotropiny, który eliminowałby te wady.

Celem wynalazku było opracowanie środków umożliwiających przedłużone uwalnianie biologicznie czynnego polipeptydu, to jest somatotropiny do organizmu zwierzęcia, który to środek zawierałby składniki tolerowane przez ten organizm. Środek taki powinien zapewniać wystarczająco szybkie uwalnianie na to, by uzyskać pożądany efekt biologiczny w organiźmie zwierzęcia. Jednocześnie uwalnianie z owego środka powinno być na tyle powolne, aby pożądany efekt biologiczny utrzymywał się przez korzystnie przedłużony okres czasu. Środek uwalniający polipeptyd winien zawierać odpowiednią dawkę tak, by w tym przedłużonym okresie czasu utrzymywała się żądana szybkość uwalniania .

Celem wynalazku było także opracowanie środka o na tyle małej objętości, by można go było podawać pozajelitowo, co jest szczególnie ważne w przypadku konieczności podawania dużych dawek polipeptydu. '

Środek uwalniający polipeptyd powinien mieć tak dobrane składniki i ich proporcje, by jego lepkość była dość niska, co pozwala na łatwe jego wstrzykiwanie lub podawanie inną drogą. Cecha ta ma duże znaczenie zwłaszcza w przypadku konieczności wstrzykiwania stosunkowo dużej dawki polipeptydu.

Celem wynalazku było także opracowanie pewnych wariantów środka, zgodnie z którymi dobór składników i ich proporcji byłby taki, aby lepkość środka była na tyle duża by w organiźmie zwierzęcia mogły tworzyć się zasoby (depot) polipeptydu, sprzyjające dłuższemu uwalnianiu. W wielu przypadkach warunek ten trudno jest zrealizować, wziąwszy pod uwagę wspomniany wyżej wymóg niskiej lepkości.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że wyżej wymienione wymogi spełniają pewne zasadniczo niewodne środki zawierające stosunkowo dużą ilość biologicznie czynnej somatotropiny.

Tak więc przedmiotem wynalazku jest środek zwiększający produkcję żywności do stosowania w rolnictwie, zasadniczo zawierający somatotropinę jako substancję czynną, a cechą tego środka jest to, że zawiera somatotropinę świńską lub bydlęcą o cząstkach, których średnica nie przewyższa 15 mikrometrów, w ilości 10-42% wagowych oraz, jako fazę ciągłą środka, tolerowany przez organizm olej roślinny w ilości 58-90% wagowych w przeliczeniu na masę środka.

Sposób wytwarzania środka polega na tym, że bardzo drobne cząstki somatotropiny świńskiej lub bydlęcej dysperguje się w ilości 10-42% wagowych w oleju roślinnym, użytym w ilości 58-90% wagowych, w przeliczeniu na masę środka, po czym dyspersję miele się do uzyskania cząstek somatotropiny o średniej średnicy nie większej niż 15/tm.

Stosowane tu określenie „somatotropina“ oznacza polipeptyd o aktywności biologicznej i budowie chemicznej zasadniczo zbliżonej do somatotropiny wytwarzanej przez gruczoł przysadkowy zwierzęcia. Do takich somatotropin należą somatotropiny naturalne wytwarzane przez przysadkowe komórki somatotropowe, a także somatotropiny wytworzone w wyniku ekspresji

152 711 przez genetycznie transformowane drobnoustroje takie jak E.coli, inne bakterie i grzyby. Takie alternatywnie otrzymane somatotropiny mogą mieć sekwencję aminokwasów identyczną z sekwencją somatotropiny naturalnej, albo też mogą być jej analogami zawierającymi jeden lub więcej wariantów sekwencji aminokwasów, co może zapewnić zwiększoną aktywność biologiczną lub pewne inne zalety. Do polipeptydów szczególnie użytecznych w środkach według wynalazku należy somatotropina bydlęca lub świńska, np. somatotropiny bydlęce i świńskie uzyskane w wyniku ekspresji drobnoustrojowej, prolaktyny bydlęce, świńskie i z innych zwierząt, czynniki uwalniające hormon wzrostu, laktogeny łożyska, insulino-podobne czynniki wzrostu, itp. Polipeptydy te zawierają ewentualnie grupę metioniny przy końcowym atomie azotu, np. metioninę powstającą w wyniku translacji drobnoustrojowej sygnału startowego ATG w genie kodującym polipeptyd. W pewnych jednak przypadkach może okazać się pożądane, aby takie grupy metioninowe w polipeptydzie były w nie więcej niż 20% (korzystnie w nie więcej niż 10%) grupami formylometioninowymi, aby zmniejszyć ewentualną tendencję występowania u zwierzęcia reakcji obronnej przeciw obcym ciałom, w wyniku której mogłaby nastąpić degradacja polipeptydu.

Zgodnie z wariantem środka według wynalazku, somatotropina w tym środku może być zasocjowana z nietoksycznym metalem. Środki takie mogą także ewentualnie zawierać środek przeciwhydratacyjny, jeszcze bardziej przedłużający uwalnianie się polipeptydu. Stwierdzono, że zwłaszcza w przypadku gdy polipeptyd musi być podawany we względnie dużych dawkach i/lub gdy lepkość środka jest duża, na ogół korzystny jest wysoki stosunek polipeptydu do środka przeciwhydratacyjnego. Stwierdzono również, że możliwe do opracowania są środki o dużej zawartości polipeptydu (ewentualnie zawierające środek przeciwhydratacyjny) i o takiej lepkości, że po wstrzyknięciu wykazują one tendencję do tworzenia długo utrzymujących się zasobów, z których polipeptyd uwalnia się w przedłużony sposób ze skuteczną szybkością.

O ile nie zaznaczono inaczej, wszystkie procenty w niniejszym opisie i zastrzeżeniach patentowych są procentami wagowymi, a wszystkie wartości temperatury podane są w stopniach Celsjusza.

W znaczeniu użytym w opisie i w zastrzeżeniach patentowych określenie „zasadniczo niewodny“ oznacza zasadniczo brak wody (bezwodność) lub obecność wody w tak małym stężeniu, że nie przyspiesza to w sposób niedopuszczalny uwalniania się polipeptydu w organiźmie zwierzęcia. Jakkolwiek taka zawartość wody zmienia się dla każdego środka według wynalazku, najczęściej jest ona mniejsza od około 2%, a jeszcze częściej mniejsza od około 1%.

Określenie „nietoksyczny dotyczy składników środka według wynalazku, które są względnie bezpieczne i/lub nieszkodliwe, gdy stosuje się je w odpowiednich ilościach i w odpowiednich warunkach przy pozajelitowym podawaniu takich środków.

Określenie somatotropina „biologicznie czynna lub „bioaktywna oznacza somatotropinę, która po odpowiednim podaniu pozajelitowym zwierzęciu, wywiera dający się zaobserwować wpływ ma procesy biologiczne zachodzące w organiźmie tego zwierzęcia. Somatotropina może naśladować, uzupełniać lub hamować naturalnie przebiegający proces biologiczny. Jakkolwiek istnieje wielka różnorodność takich efektów i procesów, przykładowo wymienić można stymulację wzrostu, laktacji, znoszenia jaj lub wydawania potomstwa i/lub skuteczności karmienia zwierząt rzeźnych. Inne przykłady obejmują produkcję wełny, futer lub innych niespożywczych produktów zwierzęcych. Jakkolwiek w środkach według wynalazku somatotropina może występować w formie aktywnej przed podaniem zwierzęciu, omawiane określenie dotyczy również somatotropin, które ujawniają swoją bioaktywność dopiero po takim podaniu.

W wielu przypadkach w środku według wynalazku somatotropina jest podawana w formie niezwiązanej chemicznie. Zgodnie z innymi wariantami korzystnie stosuje się somatotropinę w postaci (np. chemicznie związanej z inną substancją), w której wykazuje ona znacznie mniejszą rozpuszczalność w uwodnionych płynach, np. w organiźmie zwierzęcym, niż polipeptyd niezwiązany. Tak np. polipeptyd może być w znacznym stopniu, np. całkowicie, zasocjowany chemicznie z nietoksycznym metalem, albo też mieć postać estru, amidu lub innego związku, zapewniającą żądaną bioaktywność i nie wywołującą niepożądanych skutków ubocznych. W przypadku chemicznego zasocjowania z metalem, metal ten może występować w formie bezpośredniej, (jak np. w soli lub kompleksie metalu z polipeptydem) albo też w formie soli lub kompleksu metalu z jednym lub kilkoma innymi anionami.

152 711

Jakkolwiek w pewnych środkach według wynalazku z powodzeniem można stosować metale jednowartościowe, np. sód lub potas, w wielu innych przypadkach korzystnie stosuje się metale wielowartościowe. Do takich metali wielowartościowych należą np. cynk, żelazo, wapń, bizmut, bar, magnez, mangan, glin, miedź, kobalt, nikiel, kadm, itp. W pewnych wysoce korzystnych wariantach takie polipeptydy zasocjowane z metalami są produktami reakcji takich metali, np. w formie jonowej, z rozpuszczonymi polipeptydami. Stosunek metalu do polipeptydu może zmieniać się w zależności od liczby centrów aktywnych w polipeptydzie, poprzez które to centra może nastąpić zasocjowanie z metalem w czasie wytwarzania połączenia. Tak np. metal może być zasocjowany z pewną liczbą reszt lub ze wszystkimi resztami ujemnie naładowanych aminokwasów polipeptydu np. resztami asparaginowymi lub glutaminowymi, względnie z jego końcowymi grupami karboksylowymi. Część lub całość metalu może być zasocjowana w formie soli polipeptydu, zaokludowana w pofałdowaniach, kryształach lub formach bezpostaciowych polipeptydu, albo też zasocjowana w formie mostków kationowych między co najmniej dwiema cząsteczkami polipeptydu.

Gdy metal jest wielowartościowy, jego wartościowość może być w pewnych przypadkach częściowo tylko wykorzystana na chemiczne zasocjowanie polipeptydu, np. ze względu na zjawisko zawady przestrzennej. W takich przypadkach reszta wartościowości metalu może być wykorzystana na chemiczne zasocjowanie innych anionów. W wielu korzystnych wariantach metal nie jest w znacznym stopniu zasocjowany chemicznie z innymi anionami, które tworzą z tym metalem sole o małej rozpuszczalności w wodzie. Jeśli metal jest częściowo zasocjowany chemicznie z innymi anionami, aniony takie, organiczne lub nieorganiczne, są często korzystnie wybrane z grupy anionów tworzących z tym metalem sole rozpuszczalne w wodzie, obejmującej np. anion bromkowy, chlorkowy, jodkowy, siarczanowy lub octanowy w przypadku, gdy metalem jest cynk. Najkorzystniejsze są zazwyczaj aniony jednowartościowe, np. anion chlorkowy.

Nowymi i korzystnymi postaciami polipeptydu są somatotropiny zasocjowane z cynkiem. W pewnych przypadkach mogą one zawierać do około 5% lub nawet więcej cynku, w stosunku do wagi somatotropiny. Jednak w celu zmniejszenia do minimum możliwości wystąpienia niepożądanej reakcji w miejscu wstrzykiwania preparatu zwierzęciu, korzystnie może się okazać, aby zawierał on nie więcej niż około 2%, a w pewnych przypadkach nie więcej niż około 1% cynku. W wielu korzystnych rozwiązaniach polipeptydy takie zawierają co najmniej około 0,3%, a zazwyczaj co najmniej około 0,5% cynku, jakkolwiek w pewnych przypadkach mogą okazać się odpowiednie mniejsze stężenia cynku.

Do innych soli polipeptydów, które mogą być zawarte w środku według wynalazku należą (a) sole addycyjne z kwasami, wytworzone z kwasami nieorganicznymi, takimi jak kwas solny, kwas bromowodorowy, kwas siarkowy, kwas fosforowy lub kwas nitrowy, albo z kwasami organicznymi, takimi jak kwas octowy, kwas szczawiowy, kwas winowy, kwas bursztynowy, kwas maleinowy, kwas fumarowy, kwas glikonowy, kwas cytrynowy, kwas jabłkowy, kwas askorbinowy, kwas benzoesowy, kwas taninowy, kwas 4,4'-metylenobis/3-hydroksy-2-naftoesowy/, kwas alginowy, kwas poliglutaminowy, kwas naftalenosulfonowy, kwas naftalenodwusulfonowy, lub kwas poligalaturonowy, (b) sole z wielowartościowymi kationami organicznymi, np. z N'dwubenzyloetylenodwuaminą lub etylenodwuaminą oraz (c) połączenia dwóch lub więcej wyżej wspomnianych typów soli, np. taninian cynkowy.

Korzystnymi solami są sole cynku, żelaza, wapnia, magnezu, manganu, sodu i potasu oraz ich mieszaniny. Najkorzystniejszymi solami są sole cynku, sodu lub potasu. Okazało się, że sole takie przy podawaniu w biologicznie tolerowanym oleju, w proporcjach stosowanych przy wytwarzaniu środka według wynalazku, oddziaływują z olejem, tworząc w efekcie matrycę lub inną strukturę, która nieoczekiwanie wydłuża uwalnianie polipeptydu w skutecznych dawkach. Takie nieoczekiwane zjawisko zaobserwowano zarówno przy podawaniu podskórnym, jak i domięśniowym. Wydaje się, że przyczynia się ono w znacznym stopniu do zwiększenia efektywności wielu środków według wynalazku.

W wielu korzystnych wariantach środka polipeptydy podawane w środkach według wynalazku są jedynie nieznacznie rozpuszczalne w wodzie, to znaczy co najmniej 100 części wody o temperaturze pokojowej jest niezbędne do rozpuszczenia 1 części polipeptydu. W wielu korzystnych wariantach środka polipeptydy nie rozpuszczają się w znacznym stopniu także w oleju

152 711 tolerowanym w organiźmie, stosowanym w takich środkach tak, że np. ich rozpuszczalność w temperaturze pokojowej nie przewyższa około 2%, a jeszcze korzystniej nie przekracza około 1%. W wielu przypadkach, np. w środkach zawierających różne somatotropiny, polipeptyd jest zarówno nieco rozpuszczalny w wodzie, jak i zasadniczo nierozpuszczalny w oleju.

Jak to stwierdzono wyżej, każdy ze środków według wynalazku zawiera jako ciągłą fazę tolerowany w organiźmie olej, tzn. olej nie wykazujący niedopuszczalnego niekorzystnego działania na polipeptyd, zwierzę lub, w przypadku zwierząt, z których produkty stanowią ogniwo w łańcuchu żywieniowym, na konsumentów tych produktów. Korzystnie oleje takie wykazują małą kwasowość i nie są zjełczałe. Stosowane tu określenie „olej“ oznacza olej tłuszczowy lub tłuszcz ciekły w temperaturze ciała zwierzęcia, tak więc olej taki powinien topić się lub przynajmniej zaczynać się topić w temperaturze poniżej około 40°C, a korzystnie poniżej około 35°C. Oleje ciekłe w temperaturze około 25°C mogą ułatwiać wstrzykiwanie lub podawanie w inny sposób pewnych środków według wynalazku. W pewnych przypadkach oleje wielonienasycone (np. częściowo uwodornione) mogą okazać się korzystne ze względu na większą tolerancję biologiczną przez zwierzę lub z innych powodów.

Zgodnie z korzystnym wariantem olej tolerowany w organiźmie składa się zasadniczo z trójglicerydów, to jest długołańcuchowych (zasadniczo o 8-24 atomach węgla, korzystnie o 12-18 atomach węgla) estrów kwasów tłuszczowych z gliceryną lub mieszanin trójglicerydów i takich kwasów tłuszczowych, korzystnie jednak zawierających niewielką ilość, np. mniej niż około 10%, wolnych kwasów tłuszczowych. W pewnych wariantach zamiast gliceryny zastosować można inne związki trójhydroksylowe lub polihydroksylowe. Do szczególnie korzystnych olejów należą oleje roślinne, takie jak olej z oliwek, olej z nasion sezamowych, olej arachidowy, olej słonecznikowy, olej sojowy, olej z nasion bawełny, olej kukurydziany, olej szafranowy, olej palmowy, olej rzepakowy i mieszaniny takich olejów. W wielu zastosowaniach szczególnie korzystny jest olej sezamowy i olej arachidowy. Stosować można również oleje pochodzenia zwierzęcego lub mineralnego albo oleje syntetyczne, w tym również estry długołańcuchowych kwasów tłuszczowych z gliceryną lub glikolem propylenowym, pod warunkiem, że są one w wystarczającym stopniu tolerowane w organizmie.

W wielu wariantach środka według wynalazku olej taki stanowi główną wagowo część środka. Faza ciągła, którą tworzy tolerowany w organiźmie olej zawiera w większości przypadków korzystnie silnie rozdrobnione odrębne cząstki polipeptydu, które są w niej stosunkowo równomiernie rozproszone, np. w formie zawiesiny. Górna granica zawartości polipeptydu występuje wówczas, gdy olej przestaje występować w formie fazy ciągłej, gdyż ilość oleju jest niewystarczająca do pełnego otoczenia zasadniczo całej ilości polipeptydu w środku.

Zaskakujące i nieoczekiwane rezultaty uzyskano przy wprowadzaniu dużych ilości polipeptydu do środka, nawet jeśli w wyniku tego działania następował znaczny wzrost lepkości. Stwierdzono również przy takich dużych zawartościach występowanie oddziaływań między polipeptydem i olejem, w wielu przypadkach sprzyjających przedłużonemu uwalnianiu się polipeptydu z długo utrzymujących się zasobów. Takie oddziaływania ulegają często wzmocnieniu, gdy polipeptyd jest zasocjowany z metalem.

Tak więc środki według wynalazku zawierają korzystnie stosunkowo duże stężenie somatotropiny, wynoszące co najmniej około 10%, a korzystnie co najmniej około 15%. Stopień napełnienia wynoszący około 20% lub nawet więcej, np. co najmniej około 30%, nawet do około 42% lub więcej, można stosować z powodzeniem, zwłaszcza wówczas, gdy somatotropina jest w formie zasocjowanej z wielowartościowym metalem, takim jak cynk. Środki takie mogą powodować przedłużone uwalnianie się somatotropiny (oznaczanej np. w krwioobiegu bydła lub innych zwierząt) nawet w okresie do 30 lub więcej dni.

Zasadniczo nie wodne środki zawierające znaczne stężenie polipeptydu, rzędu około 10% nie zostały dotychczas nigdzie ujawnione. Znane preparaty olejowe zawierają bardzo małe stężenia polipeptydów, to jest nie więcej niż około 2%, jak to wynika z opisów patentowych St.Zjedn.Ameryki nr nr 2 964 448, 3 869 549 i 4 256 737.

Środki według wynalazku mogą zawierać obok tolerowanego w organiźmie oleju „środek przeciwhydratacyjny. Określenie oznacza tu substancję, która opóźnia hydratację danego środka według wynalazku, albo zawartego w nim polipeptydu i/lub tolerowanego w organiźmie oleju,

152 711

Ί zmniejszając i/lub stabilizując w ten sposób szybkość uwalniania polipeptydu ze środka po podaniu go zwierzęciu. Znanych jest wiele nietoksycznych środków przeciwhydratacyjnych. Przykładowo mogą być to środki „żelujące, które po rozpuszczeniu i w pewnych przypadkach po ogrzaniu w celu rozpuszczenia się w oleju, nadają masie oleju większą lepkosprężystość, a więc i większą stabilność strukturalną, zmniejszając w ten sposób penetrowanie oleju przez płyny zawierające wodę, np. płyny ustrojowe.

Dokładny mechanizm działania takich środków przeciwhydratacyjnych w środkach według wynalazku nie jest w pełni znany. Stwierdzono jednak, że pewne znane środki „żelujące zapewniają pożądane działania przeciwhydratyzujące nawet wówczas, gdy olej zawierający taki środek nie został ogrzany w celu wzmocnienia jego działania żelującego, lub gdy tworzenie się raz powstałego żelu zostało zasadniczo wyeliminowane, np. w wyniku działania sił ścinających. Także liczne środki przeciwhydratacyjne, które nie wykazują w zasadzie zdolności do żelowania oleju nadają się do stosowania w środkach według wynalazku. Przykładowym takim związkiem jest stearynian magnezowy.

Przykładowo do środków przeciwhydratacyjnych należą różne sole kwasów organicznych, np. kwasów tłuszczowych zawierających od około 8, korzystnie co najmniej od około 10, do około 22, korzystnie do około 20 atomów węgla, np. sole glinowe, cynkowe, magnezowe lub wapniowe kwasu laurynowego, kwasu palmitynowego, kwasu stearynowego, itp. Mogą być to sole jedno-, dwu- lub trój-podstawione, w zależności od wartościowości metalu i stopnia utlenienia metalu przez kwas. Szczególnie użyteczne są sole glinowe takich kwasów tłuszczowych. Do najkorzystniejszych środków przeciwhydratacyjnych należy jednostearynian i dwustearynian glinowy. Do innych użytecznych środków przeciwhydratacyjnych należy trójstearynian glinowy, jedno- i dwustearynian magnezowy, a także odpowiednie palmityniany, lauryniany, itp. W wielu wariantach stężenie takiego środka przeciwhydratacyjnego w stosunku do masy oleju i tego środka wynosi korzystnie od około 1 % do około 10%, a zazwyczaj od około 2% do około 5%, choć w pewnych przypadkach bardziej odpowiednie mogą być inne stężenia.

W zasadzie zarówno polipeptydy, jak i środki przeciwhydratacyjne przyczyniają się do wzrostu lepkości środka według wynalazku. W przypadku wielu polipeptydów, zwłaszcza tych o względnie dużej MW i/lub złożonej strukturze drugorzędowej lub trzeciorzędowej, występują problemy, które, jak stwierdzono, można obejść przez stosowanie względnie wysokiego stosunku polipeptydu do środka przeciwhydratacyjnego. Według wynalazku stosunek ten w zasadzie wynosi co najmniej około 1, zazwyczaj co najmniej około 3, jeszcze częściej co najmniej około 4, a najczęściej co najmniej około 6. Jakkolwiek zazwyczaj ma to mniejsze znaczenie z punktu widzenia lepkości środka, stosunek ten może być nie większy od około 40, a jeszcze częściej nie większy od około 20.

Przy takich proporcjach stwierdzono, że nawet przy większych wartościach lepkości środka, w sposób oczywisty związanych ze względnie dużymi stężeniami polipeptydu, uzyskuje się korzystne długotrwałe i skuteczne uwalnianie się polipeptydu. Jeszcze bardziej nieoczekiwany jest fakt, że w przypadku pewnych takich środków szybkość uwalniania się rzeczywiście zwiększa się, gdy wzrasta stopień napełniania polipeptydem, a więc i lepkość środka.

Środki według wynalazku można stosować do przedłużonego uwalniania polipeptydu u zwierząt, a zwłaszcza u ssaków. Użytecznymi polipeptydami podawanymi takim zwierzętom są np. hormony ptasie stosowane w przypadku kurcząt, indyków, itp., hormony ssaków stosowane w przypadku trzody chlewnej, bydła, owiec, kóz itp., oraz hormony rybne do stosowania w przypadku ryb, itp. Szczególnie użytecznymi polipeptydami są hormony pobudzające wzrost i hormony zwiększające laktację. Do hormonów takich należą somatotropiny użyteczne przy zwiększaniu stosunku mięsa chudego do tłuszczu, skuteczności karmienia i produkcji mleka u różnych gatunków ssaków obejmujących bydło, np. krowy mleczne, owce, kozy i trzodę chlewną.

Obserwacje wstrzykiwań środków według wynalazku wykazują, że znaczna ilość polipeptydu uwalnia się w pewnych przypadkach bezpośrednio po wstrzyknięciu. Zjawisko to określane jest jako „rozprysk i uważa się, że jest ono spowodowane wzrostem pola powierzchni spowodowanym przez wstrzykiwanie lub podawanie innym sposobem. Czasami taki umiarkowany „rozprysk może być pożądany, np. wówczas, gdy pragnie się uaktywnić żądane działanie biologiczne. Cechą charakterystyczną użyteczną przy ustalaniu składu środka według wynalazku jest zależność między

152 711 początkowym poziomem rozpryskowym oznaczanym przez pomiar stężenia polipeptydu w surowicy badanego zwierzęcia wkrótce po podaniu i poziomem osiąganym w wyniku przedłużonego uwalniania, oznaczanym przez pomiar stężenia polipeptydu w surowicy zwierzęcia po upływie pewnego okresu czasu. W przypadku niniejszego wynalazku przyjęto, że poziom rozpryskowy oznacza stężenie polipeptydu w surowicy w 24 godziny po wstrzyknięciu, a poziom po przedłużonym uwalnianiu oznacza stężenie polipeptydu w surowicy w 14 dni po wstrzyknięciu. Na podstawie tych stężeń wylicza się stosunek „rozprysku do uwalniania przedłużonego. Uważa się, że ogólnie korzystny stosunek wynosi od około 1,2 do około 6, np. od około 1,5 do około 3.

Inną cechą charakterystyczną użyteczną przy ocenie i ustalaniu składu środka według wynalazku jest „wstrzykiwalność będąca miarą łatwości, z jaką środek przepływa przez igłę do zastrzyków. Jeśli cząstki polipeptydu są zbyt duże lub lepkość środka jest zbyt wysoka, może okazać się, że dla wyciśnięcia tego środka przez igłę trzeba wywierać bardzo duże ciśnienie. „Wstrzykiwalność oznacza się mierząc czas, w jakim określona objętość środka według wynalazku przepływa przez igłę do zastrzyków nr 18 o średnicy wewnętrznej 0,838 mm i długości 4 cm, pod ciśnieniem 1193kPa przyłożonym do środka w strzykawce wyposażonej w tę igłę. „Wstrzykiwalność środków według wynalazku powinna wynosić co najmniej 0,03 cm³/sekundę. Korzystnie taka wstrzykiwalność jest większa i wynosi np. co najmniej około 0,1 cm3/sekundę, a jeszcze korzystniej co najmniej około 0,3 cm3/sekundę.

Środki według wynalazku można wytwarzać przez dodanie polipeptydu do samego oleju lub do oleju, w którym został zdyspergowany lub rozpuszczony środek przeciwhydratacyjny. Często dogodne jest rozpuszczenie środka przeciwhydratacyjnego w celu uzyskania zżelowanego oleju. Gdy środki według wynalazku wytwarza się sposobem obejmującym jako etap początkowy wytwarzanie zżelowanego oleju, środek żelujący, taki jak sól glinowa kwasu tłuszczowego, dodawać można w formie proszku do odpowiedniej ilości poddawanego mieszaniu oleju, uzyskując w ten sposób zawiesinę proszku. Poddawaną mieszaniu zawiesinę można dogodnie ogrzać do temperatury co najmniej równej temperaturze topnienia soli kwasu tłuszczowego (np. co najmniej do temperatury 155°C w przypadku A1MS), w której to temperaturze następuje rozpuszczanie soli w oleju. Stosować można ogrzewanie do niższej temperatury, jeśli środek żelujący lub inny środek przeciwhydratacyjny wykazuje odpowiednią rozpuszczalność. Dokładne i ciągłe mieszanie zapobiega zbrylaniu się soli kwasu tłuszczowego i pomaga utrzymać stan zawiesiny. Ogrzewanie i mieszanie należy zazwyczaj kontynuować aż do całkowitego rozpuszczenia zdyspergowanej soli. Często pożądane jest utrzymywanie mieszania nawet dłużej, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie.

Roztwór olejowy soli kwasu tłuszczowego można następnie schłodzić, np. do temperatury pokojowej, uzyskując w ten sposób żel o względnie trwałej strukturze. Żel należy utrzymywać pod zmniejszonym ciśnieniem lub w eksykatorze, aby wyeliminować jego zetknięcie się z wodą, która mogłaby niekorzystnie wpłynąć na strukturę żelu.

Polipeptyd można następnie dodać do oleju w dowolnej temperaturze, np. w temperaturze pokojowej, w której nie wystąpią w nim niedopuszczalne niekorzystne zmiany, np. denaturacja. Tak np. somatotropinę bydlęcą można dodać do takiego oleju w temperaturze około 4-125°C bez obawy o niekorzystny wpływ na jej aktywność biologiczną. Takie dodawanie polipeptydu przeprowadza się korzystnie pod zmniejszonym ciśnieniem, aby nie dopuścić do zanieczyszczenia oleju przez wodę lub pęcherzyki powietrza. Korzystnie silnie rozdrobniony polipeptyd dodaje się powoli do oleju poddawanego intensywnemu mieszaniu ścinającemu, aby uzyskać jednorodne rozproszenie cząstek polipeptydu. Często pożądane jest zmniejszenie wielkości cząstek polipeptydu, co można osiągnąć np. przez zastosowanie młyna kulowego, w którym zawiesinę polipeptydu miesza się z odpowiednią ilością kul ze stali nierdzewnej o średnicach np. 0,3-0,6 cm. Można to dogodnie przeprowadzić równocześnie z wytwarzaniem zawiesiny w dolnej części zbiornika, a którym przeprowadza się intensywne mieszanie ścinające. Jest to szczególnie korzystne w odniesieniu do silnie naładowanych polipeptydów, w przypadku których istnieją trudności w rozdrobnieniu w takim stopniu, aby uzyskać cząstki o objętościowo średniej średnicy nie większej niż około 15μηι (tzn. 50% objętości cząstek ma średnice nie większe niż około 15μιη). Stwierdzono, że zastosowanie polipeptydów o małej wielkości cząstek, np. o średniej średnicy cząstek nie większej od około ΙΟμιη, korzystnie nie większej od około 5μπι, wywiera korzystny wpływ na poprawę wstrzykiwał152 711 ności środków według wynalazku. Dzięki zastosowaniu młyna kulowego wielkość cząstek polipeptydu można dogodnie zmniejszyć tak, aby uzyskać korzystne średnie średnice cząstek nie przewyższające około 5μηι. Środek można następnie odfiltrować z młyna kulowego, korzystnie pod zmniejszonym ciśnieniem.

Jak to stwierdzono wyżej, środki według wynalazku są szczególnie użyteczne do podawania pozajelitowego, np. do wstrzykiwania dootrzewnowego, a zazwyczaj jeszcze korzystniej do wstrzykiwania podskórnego lub domięśniowego. Okresem przedłużonego uwalniania jest okres czasu, w którym polipeptyd dostarczany jest z szybkością zapewniającą osiągnięcie pożądanego działania biologicznego, czego oznaką jest zazwyczaj stężenie polipeptydu w strumieniu krążącej krwi zwierzęcia. W zależności od konkretnego polipeptydu i działania biologicznego okres przedłużonego uwalniania wynosi korzystnie co najmniej około 7 dni.

W innych przypadkach może on wynosić co najmniej około 15 dni, albo jeszcze korzystniej w przypadku wielu zastosowań co najmniej około 30 dni lub nawet co najmniej około 60 lub więcej dni. Stwierdzono, np., że środki według wynalazku, zawierające somatotropinę bydlęcą zasocjowaną z cynkiem, wstrzykiwane krowom mlecznym w dawce 2,5 cm³ zapewniają w ciągu co najmniej około 7 dni średnie stężenie somatotropiny bydlęcej wynoszące co najmniej około 12ng/cm3, bardzo korzystna z punktu widzenia wzrostu mleczności i/lub zwiększenia efektywności przemiany karmy w mleko u bydła.

W celu uzyskania skutecznej dawki somatotropiny bydlęcej do podawania krowom mlecznym, np. w celu zwiększenia ich mleczności, niezbędne jest zastosowanie środka zawierającego co najmniej około 300 mg somatotropiny zasocjowanej z cynkiem, aby zapewnić taki zwiększony poziom aktywnej somatotropiny bydlęcej w surowicy w ciągu co najmniej około 15 dni. Środki według wynalazku wykazują istotną cenną cechę, gdyż zawierają somatotropinę zasocjowaną z cynkiem korzystnie w na tyle dużym stężeniu, wynoszącym np. co najmniej około 15%, aby umożliwić zastosowanie dogodnie niewielkiej objętości środka, to jest około 10 cm3 lub mniej, np. około 1-3 cm3, dla ułatwienia podawania.

Do środka można oczywiście wprowadzać również inne substancje, pod warunkiem, że nie będą one w sposób niedopuszczalny hamowały żądanego wydłużonego uwalniania polipeptydu w skutecznych dawkach. Tak np. może okazać się korzystne dodawanie do środka według wynalazku środków przeciwzapaleniowych lub innych, zmniejszających, zapobiegających lub przeciwdziałających efektom związanym z reakcją na obce ciała, np. środków przeciwalergicznych. Do dodatków takich należeć mogą sterydowe i/lub niesterydowe środki przeciwzapaleniowe, których zawartość w środku według wynalazku jest korzystnie na tyle niewielka, by zapobiec występowaniu jakichkolwiek efektów ogólnoustrojowych, ale wystarczające do skutecznego zmniejszenia zapalenia miejscowego.

Jak podano uprzednio, polipeptydy zasocjowane z metalami wielowartościowymi wytwarzać można przez reakcję rozpuszczonego polipeptydu z jonami nietoksycznego metalu, np. cynku. Ogólnie polipeptyd zasocjowany z metalem wytwarza się przez dodanie metalu, ewentualnie w formie jego soli o małej rozpuszczalności w wodzie, ale zazwyczaj korzystnie w formie soli rozpuszczalnej w wodzie, np. chlorku cynkowego, do buforowanego roztworu polipeptydu w celu wytrącenia polipeptydu zasocjowanego z metalem.

Roztwory zawierają często substancje organiczne zwiększające rozpuszczalność, takie jak mocznik, guanidyna itp., aby ułatwić rozpuszczenie polipeptydu, zwłaszcza takiego, który jest tylko nieznacznie rozpuszczalny w wodzie. W wielu przypadkach stężenie środka zwiększającego rozpuszczalność i/lub pH roztworu może mieć decydujący wpływ na utrzymanie bioaktywnej konformacji polipeptydu.

Zazwyczaj wartość pH roztworu ma również decydujący wpływ na wydzielenie uzyskanego polipeptydu zasocjowanego z metalem, na ogół w formie osadu. Istnieć może krytyczny zakres pH w zależności np. od właściwości izoelektrycznych polipeptydu. Korzystnie utrzymuje się niską temperaturę, np. zasadniczo nie wyższą od temperatury zbliżonej do pokojowej, aby zapobiec denaturacji.

W zależności od czystości stosowanego polipeptydu może okazać się pożądane stosowanie zabiegu usuwania czynników gorączkotwórczych (pirogenów) i/lub sterylizacji. Jeśli występują pirogeny, np. endotoksyny, można je usunąć przez zetknięcie roztworu polipeptydu z żywicą

152 711 jonowy tu lenną. Większość pirogenów zostanie wówczas związana z dodatnio naładowanymi centrami występującymi np. w kationicie. Pewne pirogeny mogą wiązać się z centrami naładowanymi ujemnie. W związku z tym, w celu zapewnienia skutecznego usunięcia pirogenów, stosuje się mieszane złoże perełek jonitu. Roztwór polipeptydu można sterylizować w celu usunięcia niesterylnych obcy ch ciał, takich jak bakterie lub luźne zanieczyszczenia z wcześniejszych etapów przeróbki, na drodze filtracji przez bardzo drobny filtr, np. o oczkach 0,2 μτη,

Odpirogenizowany i wysterylizowany roztwór polipeptydu łączy się następnie z roztworem nietoksycznego metalu w celu wytrącenia polipeptydu zasocjowanego z metalem, zazwyczaj korzystnie w formie zawiesiny. Szybkość dodawania metalu wpływa na wielkość cząstek otrzymywanego polipeptydu zasocjowanego z metalem, Dodawanie metalu można regulować przez odpowiednie stężenie metalu w dodawanym roztworze, szybkość przepływu objętościowego i/lub szybkość dyspergowania.

Zawiesinę polipeptydu zasocjowanego z metalem można zazwyczaj rozcieńczyć, aby zmniejszyć tendencję do wzrostu wielkości cząstek np. w wyniku zbrylania się. Polipeptyd zasocjowany z metalem można następnie oddzielić na drodze wielokrotnego wirowania i przemywania w celu usunięcia nadmiaru metalu i anionów, a następnie przez suszenie sublimacyjne.

Polipeptydy zasocjowane z metalem jednowartościowym np. z sodem lub potasem, można wytwarzać przez suszenie sublimacyjne roztworu polipeptydu i jonów metalu.

Przykładowo w konkretnym wariancie somatotropinę bydlęcą można rozpuścić w jednym z wielu roztworów buforowych. Korzystnie rozpuszcza się ją w wodnym roztworze mocznika buforowanym za pomocą trój/hydroksymetylo/aminometanu (TRIS) lub innego odpowiedniego środka buforującego. Żądane górne graniczne stężenie mocznika wynosi zazwyczaj około 6m. W pewnych przypadkach korzystniejsze jest około 4,5 m stężenie mocznika. Stosować można również roztwory mocznika o mniejszym stężeniu, np. roztwory 3m, a nawet 2m lub zaledwie 1 m, ale powoduje to zmniejszenie rozpuszczalności somatotropiny.

Wartość pH buforowanego roztworu mocznika wynosi korzystnie około 7-10,5. W tych granicach wartości pH stopień odzysku somatotropiny wytrącającej się z roztworu wynosi zazwyczaj co najmniej około 60%. Zasadniczo większy stopień odzysku, np. co najmniej 90%, uzyskać można przy pH około 9-9,5.

Temperatura roztworu w czasie wytrącania powinna być na tyle niska, aby zapobiec oligomeryzacji somatotropiny. Zasadniczo pożądane jest, aby temperatura ta była niższa od około 10°C, jeszcze korzystniej niższa od około 5°C.

W celu uzyskania polipeptydu zasocjowanego z metalem jednowartościowym roztwór odpirogenizowany i wysterylizowany, jak to opisano powyżej, poddaje się diafiltracji lub dializie w celu wymiany mocznika z roztworem wodorowęglanu metalu, np. 25-milimolowego roztworu wodorowęglanu sodowego o pH 9,5, względnie innej odpowiedniej soli. Wielokrotne wymiany z roztworem wodorowęglanu przeprowadza się korzystnie w celu zapewnienia całkowitej wymiany mocznika. Roztwór poddaje się następnie diafiltracji z wodą w celu usunięcia nadmiaru wodorowęglanu sodowego, o czym świadczy początek wytrącania się MBS. Po wydzieleniu somatotropiny sodowej metodą suszenia sublimacyjnego uzyskuje się sól sodową somatotropiny w postaci proszku.

W celu uzyskania zasocjowanego z metalem wielowartościowym roztwór, odpirogenizowany i wysterylizowany, jak to opisano powyżej łączy się z solą wielowartościowego metalu, np. cynku. Stwierdzono, że dzięki zastosowaniu 1 m roztworu chlorku cynkowego uzyskuje się w zadawalającym stopniu wytrącenie somatotropiny cynkowej z roztworu somatotropiny o 4,5-molowym stężeniu mocznika, choć oczywiście stosować można roztwory o mniejszym lub większym stężeniu chlorku. Roztwór chlorku cynkowego dodaje się korzystnie powoli, np. przez wkraplanie, do mieszanego roztworu somatotropiny. W miarę dodawania roztworu chlorku cynkowego roztwór somatotropiny przyjmuje najpierw zabarwienie białawe, a następnie perlisto-białe, gdy dodana zostanie stechiometryczna ilość ZnCk. Tak np. po dodaniu 4 cm3 lm chlorku cynkowego do 400 cm3 roztworu o pH 9,5, zawierającego około 20 mg somatotropiny w 1 cm3 oraz 0,09 m TRIS w 4,5 m moczniku, uzyskuje się jednorodną zawiesinę somatotropiny cynkowej o zabarwieniu perlisto-białym. Zwiększoną ilość chlorku cynkowego (np. do około 10 cm3 lm roztworu ZnCb) dodać można w celu zapewnienia całkowitego strącenia.

152 711

Zawiesinę często korzystnie rozcieńcza się następnie, aby zmniejszyć tendencję do wzrostu wielkości cząstek wytrąconego produktu. Stwierdzono, że rozcieńczenie wodą w ilości do około 3,5 objętości, do uzyskania około lm stężenia mocznika, jest wystarczające do powstrzymania cząstek somatotropiny cynkowej przed zbrylaniem się. W wyniku oddzielania metodą diafiltracji lub wielokrotnego wirowania i przemywania, w celu usunięcia mocznika, TRIS oraz jonów cynkowych i chlorkowych, a następnie suszenia sublimacyjnego, uzyskuje się proszek o wielkości cząstek zasadniczo poniżej 10-20μιη.

Gdy stosuje się somatotropinę bydlęcą, cząstki zawierają zazwyczaj od około 0,3-1% cynku, czyli około 1-4 cząsteczek cynku na 1 cząsteczkę somatotropiny. Gdy szybkość dodawania cynku zwiększa się, stwierdza się również większą zawartość cynku w wytrąconym produkcie, np. do około 4-5%. Taka zwiększona zawartość może być spowodowana dodatkowym wiązaniem cynku przez aktywne centra kwasowe somatotropiny, np. dodatkowe reszty kwasu asparaginowego i/lub glutaminowego albo też reszty histydynowe, względnie przez końcowe grupy karboksylowe polipeptydu. Ogólnie można stwierdzić, że wytrącanie z zastosowaniem zasadniczo minimalnej ilości cynku uważa się za korzystne.

Wynalazek ilustrują poniższe przykady.

Przykład I. W przykładzie tym przedstawiono wytwarzanie środka według wynalazku, zawierającego somatotropinę zasocjowaną z cynkiem (ZnMBS).

Do trójszyjnej kolby okrągłodennej wprowadzono 5% roztwór środka przeciwhydratacyjnego A1MS w oleju sezamowym (gatunek Fisher NF). Kolbę umieszczono w łaźni olejowej o temperaturze 155°C i zawartość jej mieszano w celu możliwie jak najszybszego zdyspergowania A1MS. Mieszanie kontynuowano w ciągu 20 minut, przy czym A1MS rozpuścił się całkowicie w oleju. Kolbę wyjęto z łaźni, wytworzono w niej podciśnienie i pozostawiono do ostygnięcia do temperatury 25°C. W czasie chłodzenia roztwór przekształcił się w gęsty żel. Schłodzony żel wprowadzono do młyna kulowego wyposażonego w mieszadło intensywnie ścinające, zawierającego złoże kul ze stali nierdzewnej o średnicach 0,32, 0,48 i 0,64 cm. W młynie wytworzono podciśnienie, po czym proszek ZnMBS, otrzymany sposobem opisanym w przykładzie I, wprowadzono powoli za pomocą podajnika ślimakowego, aż do uzyskania środka zawierającego 40% ZnMBS (stosunek wagowy ZnMBS do A1MS równy 13,3). Mieszanie kontynuowano w ciągu 6 godzin, przy czym objętościowo średnia średnica cząstek ZnMBS zmniejszyła się z 20 μ do 5μ. Uzyskaną zasadniczo niewodną zawiesinę ZnMBS w zżelowanym oleju oddzielono od kul stalowych przez filtrację.

Przykład II. W przykładzie tym przedstawiono skuteczne zastosowanie środka według wynalazku do przedłużonego uwalniania polipeptydu, to jest somatotropiny bydlęcej, w celu zwiększenia wytwarzania mleka przez krowy mleczne.

Sposobem opisanym w przykładzie I przygotowano zasadniczo niewodny środek przez rozpuszczenie 5% A1MS w oleju sezamowym ogrzanym do temperatury 155°C. Olej schłodzono uzyskując żel. ZnMBS zdysperowano i zmielono w oleju do uzyskania środka zawierającego 32% ZnMBS w oleju stanowiącym fazę ciągłą (stosunek wagowy ZnMBS do A1MS 9,4). Strzykawki wyposażone w igły nr 18, o długości 3,8 cm, napełniono środkiem w ilości 2,54 g (2,5 cm³), co odpowiadało dawce 805 mg ZnMBS. Wstrzykiwalność kompozycji wynosiła 0,36 cm³/s. Przygotowano również ślepe próby w formie kompozycji 5% A1MS w oleju sezamowym bez polipeptydu. Do identycznych strzykawek wprowadzono po 2,4 g takiej kompozycji.

Środki wstrzyknięto 23 krowom rasy Holstein w drugim lub trzecim trymestrze ich drugiego (lub kolejnego) mleczenia. Krowy te podzielono na 4 przypadkowe grupy po 5 lub 6 zwierząt. Dwie grupy otrzymały zastrzyki domięśniowe (IM) w obszarze zadu, jedna grupa zastrzyki ze środka zawierającego ZnMBS, a druga (grupa kontrolna) z kompozycji stanowiącej ślepą próbę. Podobnie dwie pozostałe grupy otrzymały zastrzyki podskórne (SQ) w obszarze nadłopatkowym, z kompozycji zawierającej ZnMBS lub stanowiącej ślepą próbę.

Przeciętny udój mleka obliczony metodą sumaryczną najmniejszych kwadratów (kowariantnie wyrównany w celu uwzględnienia różnic w udoju przed podaniem kompozycji) podano w tabeli 1, w której udój mleka wyrażono w kg mleka/dzień. Jak wynika z tabeli 1, jednorazowe wstrzyknięcie Im lub SQ środka według wynalazku zapewnia szybki i długotrwały wzrost udoju mleka przy bardzo wysokim poziomie istotności statystycznej.

152 711

Tabela 1

Sumaryczny skorygowany średni dzienny udój mleka (MP) w kg/dzień

Dawka	Droga podania	7 dni	14 dni	21 dni	30 dni
MP	% Ctrl	MP	% Ctrl	MP	% Ctrl	MP % Ctrl
Kontrolna	IM	23,3	—	22,4	. —	22,0	—	22,1 —
ZnMBS	IM	26,6	16,2	26,0	17,1	24,9	13,7	22,9 9,6
Kontrolna	SQ	22,5	—	21,1	—	21,8	—	20,6 —
ZnMBS	SQ	25,1	9,6	24,8	11,7	24,0	9,6	22,1 5,7
Łącznie IM i SQ (1) Kontrolna		22,9		22,2		21,9		22,9 —
(2) ZnMBS		25,9	13,1	25,4	14,4	24,4	11,4	22,6 8,7
Czułość oznaczenia					Poziomy istotności
(2) względem (1)		0,0001	0,0001	0,0004	0,0187

% Ctrl - procentowy wzrost w stosunku do średniego udoju kontrolnego

Poddano również analizie próbki krwi w celu oznaczenia w nich zawartości somatotropiny bydlęcej, która nawet bez podawania jej w formie środka według wynalazku, występuje w sposób naturalny w krwioobiegu bydła. Typowe wyniki analizy radioimmunologicznej (,,RIA“) przedstawiono w tabeli 2, w której stężenie somatotropiny bydlęcej w surowicy krwi wyrażono w ng/cm³.

Tabela 2

Średnie stężenie somatotropiny bydlęcej w osoczu krwi (ng/cm3)

Dni po wstrzyknięciu	Domięśniowo	Podskórnie
Kontrolna	ZnMBS	Kontrolna	ZnMBS
0	6,7	5,9	5,1	5,7
1	6.5	8,4	4,6	8,7
2	7,8	9,0	4,3	11,1
3	7,1	9,1	4,0	10,1
4	7,5	10,1	4,5	9,8
5	8,1	12,0	3,1	11,2
6	8,1	18,2	3,9	11,9
7	8,0	21,2	3,6	12,9
9	7,9	21,3	6,6	16,5
11	6,8	18,2	5,2	16,6
13	7,6	16,7	5,2	17,5
15	7,0	16,2	5,4	15,7
17	5,6	12,9	4,1	11,7
19	5,4	13,8	4,4	12,0
21	6,0	11,2	4,3	10,0
23	5,7	10,6	5,3	9,5
25	5,6	9,8	4,4	9,0
27	5,8	8,4	4,9	8,5
29	3,5	6,8	1,1	7,4
31	3,8	5,9	2,5	6,75

152 711 13

Przykład III. W przykładzie tym przedstawiono skuteczność środków wytwarzanych sposobem według wynalazku w uwalnianiu polipeptydu (MBS) u zwierząt, przy zastosowaniu różnych składników tych środków.

Przygotowano kompozycje ZnMBS w zasadniczo taki sam sposób, jak w przykładzie I, wykorzystując połączenie następujących składników:

Olej biologicznie tolerowany: olej sezamowy lub arachidowy.

Środek przeciwhydratacyjny: A1MS w ilości 3% lub 5%, w stosunku do oleju i A1MS.

Obciążenie polipeptydem: ZnMBS w ilości 20%, 30.% lub 40% w stosunku do całości kompozycji.

A1MS zdyspergowano w oleju. Zawiesinę po ogrzaniu i wygrzewaniu w temperaturze 155°C w ciągu 15 minut pozostawiono do schłodzenia do temperatury 25°C, uzyskując zżelowany olej. Dodano ZnMBS i przeprowadzono dyspergowanie w mieszalniku o intensywnym ścinaniu (Polytron Homogenizer), uzyskując zawiesinę ZnMBS w zżelowanym oleju. Zawiesiną napełniono strzykawki tuberkulinowe wyposażone w igły nr 18.

Kompozycje zestawione w tabeli 3 wstrzyknięto podskórnie w grzbietowy obszar nadłopatkowy 16 grupom po 8 samic szczura Sprague-Dawley z przytłumioną reakcją immunologiczną (IFS-D).

Tabela 3

Skład wstrzykniętych kompozycji

Grupa	Objętość dawki //litry	Wstrzykiwane środki
Olej	A1MS, %/a/	ZnMBS, %	stosunek wagowy ZnMBS/AlMS
1	200	sezamowy	3	nie	—
2	200	sezamowy	3	20	8,3
3	130	sezamowy	3	30	14,3
4	100	sezamowy	3	40	22,2
5	200	sezamowy	5	nie	—
6	200	sezamowy	5	20	5,0
7	130	sezamowy	5	30	8,6
8	100	sezamowy	5	40	13,3
9	200	arachidowy	3	nie	—
10	200	arachidowy	3	20	8,3
11	130	arachidowy	3	30	14,3
12	100	arachidowy	3	40	22,2
13	200	arachidowy	5	nie	—
14	200	arachidowy	5	20	5,0
15	130	arachidowy	5	30	8,6
16	100	arachidowy	5	40	13,3

/a/ w stosunku do wagi w oleju +AIMS

Próbki krwi analizowano metodą RIA w celu oznaczenia somatotropiny bydlęcej. Wyniki analizy podano w tabeli 4 w ng/cm3 surowicy krwi. W tabeli 4 podano również poziomy w surowicy dla próbek krwi pobranych przed wstrzyknięciem w dniu 0 (dzień wstrzykiwania). Pewne pomiary wielkości odniesienia w przypadku szczurów w przykładach V-VI dają wyższe wyniki niż pewne pomiary wielkości odniesienia i uwalniania polipeptydów w przypadku krów podane w przykładzie II. Jest to częściowo spowodowane różnicami międzygatunkowymi w normalnych poziomach somatotropiny, a częściowo tym, że analiza RIA w przykładzie I była wykonywana dokładniej.

152 711

Tabela 4

Średnie stężenie somatotropiny bydlęcej w surowicy krwi (ng/cm³)

Grupa	Dni po wstrzyknięciu
0	1	3	7	11	14	21	28	35
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
2	9	765	440	304	138	83	21	18	22
3	10	494	309	237	141	113	60	31	15 ·
4	6	381	245	239	169	136	49	35	62
6	11	255	91	146	119	86	49	40	48
7	6	338	194	181	203	141	83	44	53
8	6	468	258	151	134	149	103	48	35
10	6	735	470	255	152	94	32	25	19
11	6	582	391	221	166	134	47	30	32
12	11	753	361	224	171	146	72	41	52
14	7	383	178	143	95	77	41	34	29
15	8	479	246	183	197	215	106	67	70
16	7	413	281	146	142	135	66	39	49

Średnie stężenie w przypadku grup kontrolnych 15,9 i 13 wahały się między 5 i 12 ng/cm³ w każdym z wyżej podanych dni.

Przykład IV. W przykładzie tym przedstawiono skuteczność środków według wynalazku w przedłużonym uwalnianiu polipeptydu (MBS), z zastosowaniem innych soli glinowych z kwasami tłuszczowymi jako środków przeciwhydratacyjnych. W środkach tych stosowano jednolaurynian glinowy (A1ML) i jednopalmitynian glinowy (A1MP) jako środki przeciwhydratacyjne w oleju sezamowym lub oleju arachidowym. W przykładzie tym zżelowane oleje zawierające 3% A1ML lub A1MP otrzymano zasadniczo tak, jak w przykładzie I. ZnMBS dyspergowano w zżelowanych olejach w takie ilości, by stanowił on 30% całej kompozycji (stosunek wagowy ZnMBS do A1ML lub A1MP 14,3). Każdy środek wstrzykiwano grupie 8 samic szczurów IFS-D w dawkach podanych w tabeli 5.

Tabela 5

Grupa	Objętość dawki (//litry)	Wstrzykiwane środki
Olej	Środek przeciwhydratacyjny
17	130	sezamowy	A1ML
18	130	sezamowy	A1MP
19	130	arachidowy	A1ML
20	130	arachidowy	A1MP

Wyniki analizy próbek krwi pobranych od szczurów w podanych dniach po wstrzyknięciu, w formie stężeń somatotropiny bydlęcej, przedstawiono w tabeli 6, przy czym wyniki uzyskane w dniu 0 stanowią w analizie stan odniesienia.

152 711

T a b e1a 6

Średnie stężenie somatotropiny bydlęcej w surowicy krwi (ng/cm³)

Dni po wstrzyknięciu

	0	1	3	7	14	21
17	9	431	143	172	49	30
18	10·	632	229	277	58	33
19	11	421	162	198	32	28
20	9	492	164	210	17	35

Przykład V. W przykładzie tym przedstawiono skuteczność środków według wynalazku w przedłużonym uwalnianiu polipeptydu (MBS) z zastosowaniem oleju oliwkowego lub kukurydzianego.

W przykładzie tym zżelowane oleje otrzymano zasadniczo w taki sam sposób, jak w przykładzie I, stosując 3% A1MS, w stosunku do oleju + A1MS. Zawiesiny 30% i 40% ZnMBS wstrzyknięto dwóm grupom po 8 szczurów IFS-D, w dawkach podanych w tabeli 7.

Tabela 7

-Grupa	Objętość dawki (//litry)	Olej	Wstrzykiwane środki ZnMBS %	Stosunek wagowy ZnMBS/AlMS
21	100	oliwkowy	40	22,2
22	130	kukurydziany	30	14,3

Wyniki analizy próbek krwi pobranych od szczurów w podanych dniach po wstrzyknięciu, w formie stężeń somatotropiny bydlęcej, przedstawiono w tabeli .8, przy czym wyniki uzyskane w dniu 0 stanowią w analizie stan odniesienia.

Tabela 8

Średnie stężenie somatotropiny bydlęcej w surowicy krwi (ng/cm³)

Grupa	Dni po wstrzyknięciu
0	1	4	11	14	25
21	7	996	314	174	98	36
22	7	1314	444	158	98	35

Przykład VI. W przykładzie tym przedstawiono środki według wynalazku, zawierające . około 10% polipeptydów, MBS i ZnMBS, w oleju arachidowym. Przykład ten ilustruje ponadto, że przedłużone działanie polipeptydu można wzmocnić przez zastosowanie polipeptydu zasocjowanego z metalem oraz przez użycie środka przeciwhydratacyjnego. Środki o składach podanych w tabeli 9 do wstrzykiwania otrzymano zasadniczo tak, jak w przykładzie I.

Tabela 9

Wstrzykiwane środki

Grupa	Polipeptyd	Obciążenie polipeptydem %	Olej	A1MS'* %
30	MBS	10	arachidowy	—
31	ZnMBS	10	arachidowy	—
32	MBS	10	arachidowy	1
33	ZNMBS	10	arachidowy	1

/a/ w stosunku do wagi oleju + A1MS

152 711

Każdy środek wstrzykiwano podskórnie grupie 8 szczurów IFS-D w dawce 300)Lflitrów. Wyniki analizy próbek krwi pobranych w podanych dniach po wstrzyknięciu w postaci stężeń w surowicy krwi przedstawiono w tabeli 10, przy czym odczyt dla dnia 0 stanowi w analizie stan odniesienia.

Tabela 10

Średnie stężenie somatotropiny bydlęcej w surowicy krwi (ng/cm³)

(Tri i na	Dni po wstrzyknięciu
	0	1	3	5	7	11	14
30	14	1350	375	145	75	50	20
31	15	1800	310	240	200	40	20
32	12	1200	250	123	64	35	21
33	18	620	350	330	280	175	125

Porównanie wyników dla grup 30 i 31 wykazuje wydłużenie uwalniania MBS o co najmniej 7 dni dzięki zastosowaniu zasocjowanego metalu wielowartościowego. Porównanie wyników dla grup 32 i 33 wskazuje na wydłużenie okresu uwalniania MBS dzięki zastosowaniu środka przeciwhydratacyjnego, gdy MBS jest zasocjowany z takim metalem wielowartościowym.

Przykład VII. W przykładzie tym przedstawiono wytwarzanie środków zawierających 10% somatotropiny bydlęcej bez dodatku środka przeciwhydratacyjnego, w każdym z następujących olejów: olej sezamowy, olej arachidowy, olej kukurydziany, olej z oliwek, olej szafranowy, olej z nasion bawełny, olej palmowy, olej rzepakowy i olej sojowy. Oddzielne objętości każdego z olejów utrzymywano w każdej z następujących temperatur: 4°C, 25°C, 50°C, 75°C, 100°C i 125°C. ZnMBS dyspergowano i mielono w każdym oleju jak w przykładzie I, do uzyskania jego stężenia 10%. Mielenie kontynuowano aż do uzyskania średniej średnicy cząstek somatotropiny nie większej niż 15μιη. Każdy środek wykazywał wstrzykiwalność ponad 0,1 cm3/s.

Przykład VIII. W przykładzie tym przedstawiono wytwarzanie środków jak w przykładzie VII, ale z tą różnicą, że przed dodaniem somatotropiny w każdym oleju dyspergowano A1MS w ilości 5% w stosunku do wagi oleju + A1MS. Środki te wykazywały wstrzykiwalność ponad 0,1 cm3/s.

Przykład IX. W przykładzie tym przedstawiono wytwarzanie środków jak w przykładzieVII, ale z tą różnicą, że dodawanie somatotropiny kontynuowano aż do uzyskania stężenia somatotropiny bydlęcej 40%. Dyspergowanie i mielenie kontynuowano aż do uzyskania średniej średnicy cząstek somatotropiny nie większej niż 15μιη. Środki takie wykazują wstrzykiwalność ponad 0,03cm3/s.

Przykład X. W przykładzie tym przedstawiono wytwarzanie środków jak w przykładzie IX, ale z tą różnicą, że przed dodaniem somatotropiny w każdym oleju dyspergowano A1MS do uzyskania jego stężenia 5% w stosunku do oleju + A1MS. Środki te wykazywały wstrzykiwalność ponad 0,03 cm3/s.

Przykład XI. W przykładzie tym przedstawiono wytwarzanie środków zawierających po 10% somatotropiny bydlęcej w każdym z następujących olejów: olej sezamowy, olej kukurydziany, olej z oliwek, olej szafranowy, olej z nasion bawełny, olej rzepakowy i olej sojowy. Każdy olej ogrzano do temperatury 160°C i mieszano w celu ułatwienia rozpuszczenia się A1MS. Po rozpuszczeniu 1% A1MS każdy olej schłodzono do temperatury 25°C. ZnMBS zdyspergowano i mielono w schłodzonym oleju, jak w przykładzie I, aż do uzyskania jego stężenia wynoszącego 10% i zmniejszenia się średniej średnicy cząstek do wielkości nie większej niż 15μπι. Każdy z takich środków wykazywał wstrzykiwalność ponad 0,1 cm3/s.

Przykład XII. W przykładzie tym przedstawiono wytwarzanie środków jak w przykładzie XI, z tą różnicą, że dodawanie somatotropiny kontynuowano aż do uzyskania w każdym środku stężenia somatotropiny 40%. Środki mielono jak w przykładzie I, aż do uzyskania średniej

152 711 17 średnicy cząstek somatotropiny nie przewyższającej 15μιη. Każdy środek wykazywał wstrzykiwalność ponad 0,03 cm³/s.

Przykład XIII. W przykładzie tym przedstawiono wytwarzanie środków zawierających 10%/ somatotropiny bydlęcej w następujących olejach zawierających rozpuszczony A1MS, o stężeniu 5% w stosunku do oleju + A1MS: olej sezamowy, olej arachidowy, olej kukurydziany, olej szafranowy, olej z nasion bawełny, olej palmowy, olej rzepakowy i olej sojowy. Każdy z olejów ogrzano do temperatury 160°C i mieszano w celu ułatwienia rozpuszczenia się A1MS. Po rozpuszczeniu A1MS każdy olej schłodzono do temperatury 25°C. Z kolei zdyspergowano ZnMBS i prowadzono mielenie w schłodzonym oleju jak w przykładzie I, aż do uzyskania stężenia 10%. Mielenie dyspersji kontynuowano aż do uzyskania średniej średnicy cząstek somatotropiny nie większej niż 15μηι. Każdy ze środków wykazywał wstrzykiwalność ponad 0,1 cm³/s.

Przykład XIV. W przykładzie tym przedstawiono wytwarzanie środków zawierających 42% somatotropiny bydlęcej przez kontynuowanie dodawania somatotropiny do środków z przykładu XIII, aż do uzyskania środków zawierających 42% somatotropiny. Przy zachowaniu oleju jako fazy ciągłej somatotropinę dyspergowano i mielono jak w przykładzie I, aż do uzyskania jej cząstek o średniej średnicy nie większej niż 15μηι. Każdy ze środków wykazywał wstrzykiwalność powyżej 0,03 cm3/s.

Przykład XV. W przykładzie tym przedstawiono wytwarzanie środków zawierających 20% somatotropiny bydlęcej w olejach zbliżonych do stosowanych w przykładzie VIII, ale w których stosuje się następujące środki przeciwhydratacyjne zamiast A1MS: dwustearynian lub trójstearynian glinowy, jednopalmitynian, dwupalmitynian lub trójpalmitynian glinowy, jednolaurynian, dwulaurynian lub trójlaurynian glinowy, jednostearynian, dwustearynian, jednolaurynian, dwulaurynian, jednopalmitynian lub dwupalmitynian magnezowy oraz jednostearynian, dwustearynian, jednolaurynian, dwulaurynian, jednopalmitynian lub dwupalmitynian wapniowy. Środek przeciwhydratacyjny dodawano do oleju przed wprowadzeniem somatotropiny. ZnMBS dodawano jak w przykładzie I, aż do uzyskania jego stężenia 20%. Dyspergowanie i mielenie kontynuo wano aż do uzyskania somatotropiny o średniej średnicy cząstek nie większej niż około 15μιη. Każdy środek wykazywał wstrzykiwalność ponad 0,03 cm³/s.

Przykład XVI. W przykładzie tym przedstawiono wytwarzanie środków zawierających inne stężenia somatotropiny bydlęcej w olejach. Stosowano oleje tego samego rodzaju, co w przykładzie XV, lecz że dodawanie somatotropiny kontynuowano aż do uzyskania jej stężenia 25%, 30% lub 35%. Dyspergowanie i mielenie kontynuowano aż do uzyskania somatotropiny o średniej średnicy cząstek nie większej niż 15μπι. Każdy ze środków wykazywał wstrzykiwalność większą niż 0,03 cm³/s.

Przykład XVII. Wyniki zasadniczo takie same, jak w przykładach VII-XVI uzyskuje się przy stosowaniu somatotropiny bydlęcej w formie chemicznie niezwiązanej lub w formie chemicznie zasocjowanej z kationami sodowymi lub potasowymi.

Przykład XVIII. Wyniki zasadniczo takie same jak w przykładach VII-XVII uzyskuje się, jeśli zastosuje się inne somatotropiny bydlęce, np. takie, które zawierają następujące sekwencje aminokwasów:

NH2-met-phe/l/-pro/2/...val/126/...phe/190-COOH; NH2-ala-phe/l/-pro/2/...val/126/... phe/190-COOH; NH2-ala-phe/l/-pro/2/...jeu/126/...phe/190-COOH; NH2-phe/l/-pro/2/... leu/126/...phe/190-COOH; NH2-ρhe/l/-pro/2/...aal/126/...phe/190-COOH; NH2-met-asp-gluphe/l/-pro/2/...jeu/166/...ph//100-COOH; NH2-met-asp--lu-phe/l/-pro/2/...val/126/... phe/190-COOH; NH2-met/4//...jeu/126/...phe/190-COOH; NH2-met/4/...val/126/... phe/190-COOH.

Przykład XIX. Gdy somatotropinę świńską zastąpi się somatotropiną bydlęcą stosowaną w przykładach VII-XVII, uzyska si zasadniczo takie same wyniki ze względu na podobieństwo między somatotropiną bydlęcą i świńską.

152 711

Claims (4)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Środek zwiększający produkcję żywności do stosowania w rolnictwie, zawierający somatotropinę jako substancję czynną, znamienny tym, że zawiera somatotropinę świńską lub bydlęcą o cząstkach, których średnia średnica nie przekracza 15 mikrometrów, w ilości 10-42% wagowych oraz, jako fazę ciągłą środka, tolerowany przez organizm olej roślinny w ilości 58-90% wagowych w przeliczeniu na masę środka.
2. 2. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że olej zawiera dodatkowo środek przeciwhydratacyjny typu soli glinowych, magnezowych lub wapniowych kwasów tłuszczowych, w ilości 1-5% wagowych w przeliczeniu na masę mieszaniny oleju i środka przeciwhydratacyjnego.
3. 3. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że korzystnie zawiera co najmniej 15% wagowych somatotropiny bydlęcej.
4. 4. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera somatotropinę głównie w postaci soli cynkowej.

   Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 100 egz.

   Cena 3000 zł