DD244914A5 - Verfahren zur herstellung einer weitgehend nicht-waessrigen, polypeptidhaltigen zusammensetzung - Google Patents

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Abstract

Verlaengerte parenterale Freisetzung eines bioaktiven Polypeptids in erwuenschten wirksamen Mengen kann durch Anwendung neuer Zusammensetzungen erzielt werden, in denen das Polypeptid in einem biovertraeglichen Oel in einem ungewoehnlich hohen Anteil von z. B. mindestens etwa 10 Ma.-% vorhanden ist. Offenbart werden ausserdem bestimmte metall-assoziierte Somatotropine, die fuer eine verlaengerte parenterale Freisetzung derartiger Somatotropine von Nutzen sind.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer weitgehend nicht-wäßrigen polypeptidhaltigenZusammensetzung/die Tieren parenteral bei verlängerter Freisetzung verabreicht werden kann.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen .
Obwohl eine längere Wirksamkeit von einigen biologisch aktiven (bioaktiven Polypeptiden durch parenteral Verabreichung von nursehrgeringen Dosismengen erzieltwerden kann, sind andere in ausreichenden Serumkonzentrationen erforderlich und/oder haben eine so kurze Halbwertzeit im Serum, daß eine beträchtliche Dosis (z.B. mindestens etwa 100 mg) verabreicht werden . muß, um die verlangte biologische Wirkung über einen längeren Zeitraum von etwa einer Woche oder länger erzielen zu können. Somatotropine (Wachstumshormone) sind ein Beispiel für derartige Polypeptide. "''"
Zur Verhinderung einer unerwünscht schnellen Freisetzung in den Blutkreislauf eines Tieres wurden bestimmte Polypeptide parenteral in flüssigen Vehikeln, die wahlweise Hydratations-Verzögerungsmittel (Antihydratationsmittel) enthalten können, oder in Assoziation mit Metallen oder Metallverbindungen, die ihre Löslichkeit in Körperflüssigkeiten weiter senken, parenteral verabreicht. Um die Notwendigkeit von unangemessen großen Mengen eines solchen Vehikels zu umgehen, wären erhebliche Konzentrationen des Polypeptids in dem Vehikel ein Vorteil. Die meisten bioaktiven Polypeptide sind jedoch in erheblichen Konzentrationen sehr viskos und lassen sich daher nur schwer in solchen Konzentrationen injizieren oder anderweitig verabreichen. Außerdem erhöhen viele der üblicherweise verwendeten Antihydratationsmittel die Viskosität und können die zweckmäßige Injizierbarkeit solcher Zusammensetzungen verringern. Aus diesen und anderen Gründen war die richtige Kombination von (1) einer so raschen Freisetzung, daß die erwünschte biologische Wirkung im Tier erzielt wurde, (2) eine entsprechend langsame Freisetzung, um die Wirkung ausreichend zu verlängern, (3) eine Dosis, die für die Freisetzung mit der erforderlichen Geschwindigkeit über einen längeren Zeitraum angemessen ist, und (4) ein so kleines Volumen und eine so niedrige Viskosität für eine zweckmäßige Verabreichung normalerweise nur schwer zu erreichen.
Da jedes Polypeptid anders ist, z. B. in seiner dreidimensionalen Struktur und seiner Wechselwirkung mit anderen Substanzen, ist die Möglichkeit, eine verlängerte wirksame Freisetzung bei einer hohen Menge von Polypeptid in einem geeigneten Vehikel zu erreichen, unmöglich theoretisch vorauszusagen oder zu demonstrieren. Doch in vielen Fällen müssen solche Zusammensetzungen mit verlängerter Freisetzung- entwickelt werden, wenn die biologische Wirksamkeit des Polypeptids in einer nützlichen und wirtschaftlichen Weise geschaffen werden soll.
Nach Verfahren zur Erreichung einer langsameren Freisetzung von bioaktiven Substanzen ist lange gesucht worden, um die Häufigkeit der Behandlungen zu reduzieren und/oder das Trauma für das behandelte Tier auf ein Mindestmaß zu verringern. Eine verlängerte Freisetzung konnte bei einer Anzahl solcher Substanzen auf verschiedenen Wegen erzieltwerden. Bei einem System werden Öllösungen angewandt, die intramuskulär, subkutan oder in anderer Form injiziert werden können. In einigen Fällen wurden Substanzen mit einer geringeren Öllöslichkeit in Ölsuspensionen verabreicht.
Beispielsweise wird in der US-PS 2.491.537 von einer Freisetzung bis zu 24 Stunden bei Penicillin gesprochen, das in einem mit Pectin, einer Celluloseverbindung oder einem Protein wie Gelatine gelierten Öl (ζ. Β. pflanzlichen) suspendiert wurde. Darin wird auch eine verlängerte Freisetzung von Insulin und Steroidhormonen erwähnt. In der US-PS 2.507.193 wird eine Freisetzung bei Kaninchen bis zu elf Tagen bei Anwendung von 300000 Einheiten/ml Procainpenicillin, das in mit 5% Aluminiummonostearat (AIMS) geliertem Erdnußöl suspendiert wurde, beschrieben. Die US-PS 3.016.330 betrifft mit AIMS beschichtetes, in Sesamöl suspendiertes Penicillin. Chien unter 35(3) Journal of Parenteral Science and Technology 109 (1981) erläutert längere Bioverfügbarkeit von Penicillin G Procain, das in mit 2% AIMS geliertem Pflanzenöl suspendiert wurde, wobei festgestellt wird, daß mehr als 2% AIMS nur einen begrenzten Vorteil für die Verlängerung von wirksamen Penicillinmengen haben und daß Suspensionen mit mehr als 2% AIMS für den praktischen Gebrauch zu viskos sind.
Ölsuspensionen sind ebenfalls für bestimmte niedrigmolekulare (MW) therapeutische Substanzen außer Penicillin angewandt worden. Zum Beispiel werden in US-PS 3.676.557 langwirkende Formulierungen mit bis zu 50% Pamoatsalzen von Normorphinonen in mit AIMS gelierten Ölsuspensionen dargelegt. In US-PS 4.016.273 werden Formulierungen mit verlängerter Freisetzung mit bis zu 40% Pamoatsalzen von Oxazepinen in mit Aluminiumstearaten gelierten Ölen beschrieben. Systeme für verlängerte Freisetzung von bestimmten bioaktiven Polypeptiden sind gleichfalls vorgeschlagen worden. Zum Beispiel werden in US-PS 2.964.448 Suspensionen von Relaxin (etwa 2%) in einem mit AIMS gelierten Pflanzenöl vorgestellt. Darin wird darauf hingewiesen, daß eine derartige Suspension eine Relaxation, die mit der in Öl ohne Geliermittel vergleichbar ist (z. B. 5 bis 7 Tage), ermöglicht, und es wird eine längere Wirkung (bis zu 23 Tagen) durch Wärmebehandlung der AIMS enthaltenden Suspensionen erläutert.
In US-PS 3.869.549 werden injizierbare Zusammensetzungen mit verlängerter Freisetzung beschrieben, die „extrem geringe Dosen", z. B. „Bruchteile eines Milligramms" eines Peptids enthalten. Obwohl Wachstumshormone erwähnt werden, sind spezifische Beispiele wasserlösliche Corticotropin-(ACTH)-Präparate, die 7 bis 8 Tage wirksam sind. In der US-PS werden vor allem Zusammensetzungen genannt, die Säureadditionssalze von ACTH-Analoga, die in mit Aluminiumdistearat (AIDS) geliertem Erdnußöl suspendiert oder auf anschließend in einem solchen Öl dispergiertem AIDS adsorbiert sind, enthalten. In beiden Fällen ist das Analogon in den injizierbaren Formulierungen dieser US-PS in Konzentrationen von nur 0,03 bis 0,1 % und Masseverhältnissen von Peptid zu dem Aluminiumsalz von höchstens 0,5 vorhanden.
Zusammensetzungen für eine verlängerte Freisetzung von Analoga von LH-RH-Hormonen werden in der US-PS 4.256.737 offenbart. Diese Zusammensetzungen enthalten Salze des Hormons, einschließlich mehrwertige Metall-(z. B. Zink)-Salze, in mit Aluminiumsalzen von Fettsäuren gelierten Pflanzenölen. Die LH-RH-Analoga werden in Konzentrationen von 0,1 bis 1 % in der injizierten Zusammensetzung verabreicht.
In anderen Patenten werden wäßrige Suspensionen von Metallsalzen oder -komplexen von Polypeptiden für eine verlängerte parenteral Freisetzung beschrieben. Zum Beispiel betrifft die US-PS 3.852.422 langzeitig-aktive wäßrige Suspensionen eines Präzipitationsproduktesvon wasserlöslichen Gonadotropinen und Aluminium-oder Zinkhydroxid. Da Zink natürlich in Pankreas-Insulin vorhanden ist, wurde die Verlängerung der Insulinfreisetzung aus wäßrigen Suspensionen infolge der Wechselwirkung zwischen Insulin und verschiedenen Metallen (z. B. Zink, Nickel, Cobalt und Cadmium) untersucht. Siehe US-PS 2.143.590; 2.174.862; 2.882.203; 2.920.014 und 3.102.077.
Ziel der Erfindung
Eine Aufgabe der Erfindung besteht in der Schaffung von Zusammensetzungen, die zur verlängerten Freisetzung eines biologisch aktiven Polypeptids in einem Tier beitragen und die aus Bestandteilen bestehen, die biologisch für das betreffende Tier verträglich sind.
Eine andere Aufgabe ist die Schaffung von solchen Zusammensetzungen, deren Freisetzung so schnell erfolgt, daß die erwünschte biologische Wirkung bei dem Tier erzielt wird.
Eine weitere Aufgabe betrifft solche Zusammensetzungen, deren Freisetzung so langsam erfolgt, daß die erwünschte biologische Wirkung über einen vorteilhaft verlängerten Zeitraum aufrechterhalten bleibt.
Eine weitere Aufgabe besteht in der Schaffung von solchen Zusammensetzungen, die einen ausreichend hohen Anteil (angemessene Dosis) des Polypeptids enthalten, damit die geforderte Freisetzungsrate über einen solchen verlängerten Zeitraum unterstützt wird.
Eine andere Aufgabe besteht in der Schaffung solcher Zusammensetzungen, die ein ausreichend geringes Volumen für die herkömmliche parenterale Verabreichung haben. Das ist besonders dann wichtig, wenn die zu verabreichende Dosis des Polypeptids zwangsläufig groß sein muß.
Eine noch weitere Aufgabe betrifft die Schaffung solcher Zusammensetzungen, die Bestandteile aufweisen und deren Anteile so gewählt sind, daß die Zusammensetzungen eine ausreichend geringe Viskosität für die herkömmliche Injektion oder eine andere Verabreichungsform besitzen. Das ist auch dann wieder äußerst wichtig, wenn die Injektion einer verhältnismäßig großen Dosis des Polypeptids erforderlich ist.
Bei einigen Erfindungsbeispielen besteht eine Aufgabe darin, daß diese Bestandteile und ihre Anteile eine ausreichend hohe Viskosität ergeben, damit die Bildung von Depots in dem Tier, die eine längere Freisetzung begünstigen, unterstützt wird. In vielen Fällen ist das zusammen mit dem oben erwähnten Ziel einer geringen Viskosität nur schwer zu erreichen.
Andere erfindungsgemäße Aufgaben betreffen die Schaffung von Methoden für die Anwendung solcher Zusammensetzungen, bestimmte Formen von Somatotropinen, die von Vorteil in solchen Zusammensetzungen sind, und Verfahren zur Herstellung von solchen Somatotropinen. Diese und andere Aufgaben der Erfindung werden aus der folgenden ausführlichen Beschreibung deutlicher hervorgehen.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Es wurde entdeckt, daß die oben genannten Aufgaben mit weitgehend nicht-wäßrigen Zusammensetzungen realisiert werden können, die einen verhältnismäßig hohen Anteil des bioaktiven Polypeptids enthalten, das in einem bioverträglichen Öl in ausreichender Menge, um eine kontinuierliche Phase der Zusammensetzung zu bilden, dispergiert ist. Bei vielen Ausführungsbeispielen können diese Aufgaben vorteilhafter erfüllt werden, wenn mit einem nicht-toxischen Metall assoziierte Polypeptide verwendet werden. Wahlweise können solche Zusammensetzungen ein Antihydratationsmittel zur weiteren Verlängerung der Freisetzung des Polypeptids enthalten. Es wurde besonders bei Polypeptiden, die in verhältnismäßig großen Mengen verabreicht werden müssen und/oder die die Viskosität der Zusammensetzung beträchtlich erhöhen, gefunden, daß ein verhältnismäßig hohes Verhältnis von Polypeptid zu dem Antihydrationsmittel im allgemeinen vorteilhaft ist. Es wurde gleichfalls entdeckt, daß Zusammensetzungen mit hohen Anteilen von Polypeptid (wahlweise mit einem Antihydratationsmittel) und ausreichender Viskosität geschaffen werden können, so daß die Zusammensetzungen nach der Injektion zur Bildung lang-vorhaltender Depots neigen, aus denen das Polypeptid in langsamer Weise mit einer wirksamen Geschwindigkeit freigesetzt wird.
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In der gesamten Beschreibung werden Prozentanteile der Zusammensetzungen in bezug auf die Masse und Temperaturen in Grad Celsius angegeben, wenn nichts anderes erwähnt wird.
In der Beschreibung und den angefügten Ansprüchen ist unter dem Begriff „weitgehend nicht-wäßrig" im wesentlichen wasserfrei oder Wasser in so geringer Menge enthalten, daß es die Freisetzung des Polypeptids in einem Tier nicht unzulässig beschleunigt, zu verstehen. Obgleich dieser Wasseranteil bei jeder erfindungsgemäßen Zusammensetzung variiert, beträgt er meistens weniger als etwa 2% (im allgemeinen sogarweniger als etwa 1 %) in einer Form, die diese Wirkung auf die Freisetzung des Polypeptids hat.
Der Begriff „nicht-toxisch" bezieht sich hierin auf Bestandteile von erfindungsgemäß hergestellten Zusammensetzungen, die entsprechend sicher und/oder harmlos sind, wenn sie in entsprechenden Mengen und unter entsprechenden Bedingungen bei der parenteralen Verabreichung solcher Zusammensetzungen angewandt werden.
Unter dem Begriff „biologisch aktives" oder „bioaktives" Polypeptid ist hier ein Polypeptid zu verstehen, das nach der entsprechenden parenteralen Verabreichung an ein Tier eine nachweisbare Wirkung auf einen biologischen Prozeß dieses Tieres ausübt. Die Wirkung kann hormonal, ernährend, therapeutisch, prophylaktisch oder anderweitig sein und kann einen natürlich ablaufenden biologischen Prozeß nachahmen, ergänzen oder inhibieren. Obwohl e's eine riesige Vielfalt solcher Wirkungen und Prozesse gibt, können die Stimulierung des Wachstums, der Milchbildung, der Ei- oder Nachkommenschaftsbildung und/oder der Futterausnutzung bei Schlachttieren als Beispiele angeführt werden. Andere Beispiele umfassen die Erzeugung von Wolle, Fellen oder anderen Produkten von Nicht-Schlachttieren. Obgleich Polypeptide mit geringerer relativer Molekülmasse (MW) (z. B. mit mindestens etwa 300) eingesetzt werden können, haben diese Polypeptide im allgemeinen eine erhebliche MW, z. B. mindestens etwa 1 000, gewöhnlich mindestens etwa 4000, in den bevorzugtesten Ausführungsbeispielen mindestens etwa 9000 und in vielen noch bevorzugteren Ausführungsformen mindestens etwa 18000 bis etwa 30000 oder höher. Obwohl das Polypeptid in erfindungsgemäßen Zusammensetzungen vor der Verabreichung an ein Tier in seiner aktiven Form vorhanden sein kann, beinhaltet der Begriff hier auch Polypeptide, die nach einer solchen Verabreichung Bioaktivität entwickeln.
Bei vielen erfindungsgemäßen Ausführungsbeispielen wird das Polypeptid in chemisch nicht-kombinierter Form verabreicht. Viele andere Ausführungsbeispieie werden vorteilhaft ausgeführt, wenn das Polypeptid in einer Form verabreicht wird (z.B. chemisch mit einer anderen Substanz kombiniert), in der es eine wesentlich geringere Löslichkeit in wäßrigen Flüssigkeiten (z.B. der Tierkörperflüssigkeit) besitzt als das unkombinierte Polypeptid. Beispielsweise kann das Polypeptid vorwiegend (z.B. vollständig) chemisch mit einem nicht-toxischen Metall oder in einem Ester, Amid oder anderer (anderen) Form(en) assoziiert sein, die die verlangte Bioaktivität schaffen und keine intolerierbaren Nebenwirkungen erzeugen. Bei der chemischen Assoziation mit einem derartigen Metall kann das Metall als solches (z. B. in einem Metallsalz des Polypeptids oder als Komplex mit diesem) oder in Form eines Salzes oder Komplexes des Metalis mit einem oder mehreren anderen Anion(en) vorhanden sein.
Wenn auch einwertige Metalle (z. B. Natrium oder Kalium) vorteilhaft in einigen erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verwendet werden können, werden mehrwertige Metalle für die Verwendung in vielen anderen Fällen bevorzugt. Beispiele für derartige mehrwertige Metalle sind Zink, Eisen, Calcium, Bismut, Barium, Magnesium, Mangan, Aluminium, Kupfer, Cobalt, Nickel, Cadmium und dergleichen. In bestimmten besonders bevorzugten Ausführungsbeispielen handelt es sich bei derartigen metall-assoziierten Polypeptiden um Reaktionsprodukte dieser Metalle, z. B. in ionischer Form, mit gelösten Polypeptiden. Das Verhältnis von Metall zu Polypeptid kann je nach der Anzahl der aktiven Stellen des Polypeptids, die. sich während des Bildungsprozesses mit einem derartigen Metall assoziieren, variieren. Das Metall kann zum Beispiel mit einigen oder allen negativ-geladenen Aminosäure-(z. B. Asparagin- oder Glutamin-)Resten in dem Polypeptid oder seinem Carboxyterminus assoziiert seinTEin Teil oder das gesamte Metall kann in einem Salz des Polypeptids assoziiert sein, innerhalb Falten, Kristallen oder amorphen Formen des Polypeptids okkludiert sein oder als Kationenbrücke zwischen mindestens zwei ' Polypeptidmolekülen assoziiert sein.
Wenn das Metall mehrwertig ist, kann sein Valenz in einigen Fällen chemisch nur teilweise mit dem Polypeptid, z.B. wegen sterischer Hinderung, assoziiert sein, in solchen Fällen kann die übrige Valenz des Metalls chemisch mit anderen Anionen assoziiert sein. In vielen erwünschten Ausführungsbeispielen ist das Metall chemisch nicht in einem erheblichen Anteil mit anderen Anionen, die mit dem Metall Salze mit geringer Wasserlöslichkeit bilden, assoziiert. Wenn das Metall teilweise chemisch mit anderen Anionen assoziiert ist, dann werden solche anderen Anionen (organische oder anorganische) oftmals möglichst unter denen ausgewählt, die wasserlösliche Salze mit dem betreffenden Metall bilden, z. B. Br", CP, I", SO4 = oder CH3COO-, wenn das Metall Zink ist. Einwertige Anionen, z. B. Cl", werden im allgemeinen am stärksten bevorzugt. Neuartige und bevorzugte erfindungsgemäß hergestellte metall-assoziierte Polypeptide umfassen mit Zink assoziierte Somatotropine. In einigen Fällen können diese bis zu 5% Zink oder mehr in bezug auf die Masse des Somatotropins enthalten. Um die Möglichkeit von unerwünschten Reaktionen der Injektionsstelle bei den Tieren auf ein Mindestmaß zu reduzieren, ist es jedoch erstrebenswert, daß sie nicht mehr als etwa 2%, und in einigen Fällen nicht mehr als etwa 1 %, Zink (gleiche Basis) enthalten. In vielen bevorzugten Ausführungsbeispielen enthalten diese Polypeptide mindestens etwa 0,3% (gewöhnlich mindestens etwa 0,5%) Zink (gleiche Basis), wenn auch geringere Prozentanteile von Zink in einigen Fällen geeignet sein können.
Beispiele für andere erfindungsgemäß hergestellte, nützliche Polypeptidsalze umfassen (a) Säureadditionssalze, die mit anorganischen Säuren, z. B. Chlorwasserstoff-, Bromwasserstoff-, Schwefel-, Phosphor- oder Salpetersäure; oder organischen Säuren, z. B. Essig-, Oxal-, Weinstein-, Succin- Malein-, Fumar-, Glucon-, Zitronen-, Apfel-, Ascorbin-, Benzoe-, Gerb-, Palmitin-, Algin-, Polyglutamin-, Naphthalensufon-, Naphthalendisulfon- oder Polygalacturonsäure, gebildet werden; (b) Salze mit mehrwertigen organischen Kationen, z. B. N'-Dibenzylethylendiamin oder Ethylendiamin; und (c) Kombinationen von zwei oder mehr der oben genannten Salzarten, z. B. Zinkannat.
Bevorzugt werden Salze von Zink, Eisen, Calcium, Magnesium, Mangan, Natrium, Kalium und Mischungen davon. Die am stärksten bevorzugten Salze, vor allem wenn es sich bei dem Polypeptid um ein Somatotropin handelt, sind die von Zink, Natrium oder Kalium. Als sehr vorteilhaft wurde gefunden, daß derartige Salze, wenn sie in einem bioverträglichen Öl in den in erfindungsgemäß hergestellten Zusammensetzungen verwendeten Anteilen verabreicht werden, mit dem Öl eine Wechselwirkung eingehen, die zu einer Matrix oder anderen Struktur führt, die überraschenderweise die Verlängerung der Polypeptidfreisetzung in wirksamen Mengen unterstützt. Diese unerwartete Entdeckung wurde sowohl bei subkutaner als auch intramuskulärer Verabreichung beobachtet, und es hat den Anschein, als ob sie wesentlich zu der Wirksamkeit vieler erfindungsgemäßer Zusammensetzungen beitrage.
Erfindungsgemäß hergestellte Zusammensetzungen sind auch für eine längere Freisetzung von konjugierten oder unkonjugierten Polypeptiden zu gebrauchen. Solche unkonjugierten Polypeptide umfassen Lipoproteine, z.B. Beta-Lipoprotein; Glucoprotein, z.B. Gamma-Globulin; Phosphoproteine, z.B. Casein; Hämoproteine, z.B. Hämoglobin; Flavoproteine, z.B. Succinatdehydrogenase; und Metallproteine, z. B. Ferritin und Alkoholdehydrogenase. Mischungen dieser oder irgendeiner anderen der oben genannten Formen des Polypeptidssind als im Rahmen der hier beschriebenen und beanspruchten Erfindung i
liegend anzusehen. |
In vielen attraktiven Ausführungsbeispielen sind die in erfindungsgemäß hergestellten Zusammensetzungen verabreichten Polypeptide nur schwach wasserlöslich (d.h. mindestens 100 Teile Wasser von Raumtemperatur sind erforderlich, um ein Teil Polypeptid zu lösen). In vielen erwünschten Ausführungsbeispielen sind sie in dem hier verwendeten bioverträglichen Öl nicht j
sehr gut löslich, d.h. bei Raumtemperatur nicht hei einer über etwa 2%, und am besten nicht mehr als etwa 1%, betragenden \
Konzentrationen. In einigen Fällen, z. B. bei Zusammensetzungen, die verschiedene Somatotropine enthalten, ist das Polypeptid sowohl leicht wasserlöslich als auch weitgehend unlöslich in dem Öl.
Wie oben erläutert, enthalten die erfindungsgemäß hergestellten Zusammensetzungen jeweils als eine kontinuierliche Phase davon ein bioverträgliches Öl, z. B. ein Öl, das keine intolerierbaren schädlichen Wirkungen auf das Polypeptid, das Tier oder im Falle von Tieren, deren Produkte in die Nahrungskette gelangen, den Verbraucher derartiger Produkte hat. Vorzugsweise weisen solche Öle eine geringe Azidizität auf und sind weitgehend frei von Ranzidität. Im hier gebrauchten Sinne ist unter der Bezeichnung „Öl" ein Fettöl oder ein Fett zu verstehen, das bei der Körpertemperatur des Tieres flüssig ist. So ein Öl wird somit unter etwa 400C oder vorzugsweise unter etwa 350C, schmelzen oder zu schmelzen beginnen. Öle, die bei etwa 250C flüssig sind, können die Injektion oder eine andere Verabreichungsform einiger erfindungsgemäß hergestellter Zusammensetzungen unterstützen. In einigen Fällen werden polyungesättigte (z.B. teilweise gehärtete) Öle wegen der größeren Bioverträg lieh keit mit dem Tier oder aus anderen Gründen bevorzugt.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist das bioverträgliche Öl hauptsächlich ausTriglyceriden, d.h. langkettigen (im allgemeinen Cs-C24, vorzugsweise C12-C18) Fettsäureestern von Glycerol, oder Mischungen von Trigiyceriden und derartiger Fettsäuren (vorzugsweise in nur geringfügigen Anteilen, z.B. weniger als etwa 10%freie Fettsäure) zusammengesetzt. Bei einigen Ausführungsbeispielen können andere Trihydroxy- oder polyhydroxyverbindungen für das Glycerol substituiert werden. Besonders bevorzugte Öle sind Pflanzenöle wie Oliven-, Sesamsamen-, Erdnuß-, Sonnenblumensamen-, Sojabohnen-, Baumwollsamen-, Mais-, Saflor-, Palm-, Rapssamenöle und Mischungen dieser Öle. Sesam- und Erdnußöle werden für viele Ausführungsbeispiele am meisten bevorzugt. Es können auch Öle tierischen oder mineralischen Ursprungs oder synthetische Öle (einschließlich langkettiger Fettsäureester von Glycerol oder Propylenglycol) verwendet werden, vorausgesetzt, daß sie ausreichend bioverträglich sind.
In den meisten Ausführungsbeispielen bildet ein solches Öl einen überwiegenden Masseanteil solcher Zusammensetzungen. Die kontinuierliche Phase von bioverträglichem Öl weist in den meisten Fällen feinverteiite einzelne Partikel des Polypeptids auf, die verhältnismäßig gleichmäßig darin verteilt sind, z. B. in einer Suspension. Die obere Grenze für die Menge des Polypeptids liegt dort, wo das Öl aufhört, in einer kontinuierlichen Phase zu bestehen, weil dann zu wenig Öl vorhanden ist, um im wesentlichen das gesamte Polypeptid in der Zusammensetzung einhüllen zu können.
Es wurden überraschend und unerwartete Ergebnisse durch die Anwendung hoher Anteile des Polypeptids in solchen Zusammensetzungen erzielt, selbst wenn dadurch die Viskosität erheblich erhöht wurde. Außerdem wurde bei derartig hohen Anteilen eine Wechselwirkung zwischen dem Polypeptid und dem Öl entdeckt, die in vielen Fällen eine längere Freisetzung von Polypeptid aus einem lange vorhaltenden Depot begünstigte. Diese Wechselwirkung wird in vielen Fällen wie oben erläutert begünstigt, wenn das Polypeptid mit einem Metall assoziiert wird.
Daher enthalten erfindungsgemäß hergestellte Zusammensetzungen ein Polypeptid in wünschenswert hohen Beladungsanteilen, zum Beispiel von mindestens 10%. Selbst höhere Anteile von Polypeptid, z.B. mindestens etwa 15%, sind oftmals erwünscht und besonders wirksam, wobei die Somatotropine und anderen Polypeptide im wesentlichen die gleichen Charakteristika haben. Anteile von etwa 20% oder höher, z. B. mindestens etwa 30% oder sogar bis zu etwa 42% oder höher, können sich vorteilhaft in parenteral injizierbaren Zusammensetzungen, die ein Somatotropin (z. B. Rinder) enthalten, erweisen, besonders wenn das Somatropin mit einem mehrwertigen Metall,wie Zink,assoziiert ist. Solche Zusammensetzungen können eine längere Freisetzung des Somatotropins (im Blutkreislauf von Rindern oder anderen Tieren gemessen) über Zeiträume von bis zu 30 Tagen oder langer ermöglichen.
Weitgehend nicht-wäßrige Zusammensetzungen, die Beladungsanteile von Polypeptid in einer Höhe von etwa 10% enthalten, sind nach dem bekannten Stand der Technik noch nicht vorgeschlagen worden. Dem bisherigen Stand der Technik entsprechende Ölpräparate sind auf sehr geringe Anteile von Polypeptiden, d.h. nicht mehr als etwa 2%, beschränkt. (Siehe US-PS 2.964.446; 3.869.549; und 4.256.737).
Erfindungsgemäß ergestellte Zusammensetzungen können außerdem bioverträglichen Öl auch ein „Antihydratationsmittel" enthalten, wobei hier unter dem Begriff eine Substanz zu verstehen ist, die die Hydratation einer bestimmten erfindungsgemäßen Zusammensetzung oder des darin befindlichen Polypeptids und/oder bioverträglichen Öls verzögert und dadurch die Freisetzungsgeschwindigkeit des Polypeptids aus der Zusammensetzung nach der Verabreichung an ein Tier verringert und/oder stabilisiert. Es ist eine große Vielzahl nicht-toxischer Antihydratationsmittel bekannt. Es gibt beispielsweise „Gelier"-Mittel, die dispergiert und in einigen Fällen zu ihrer Auflösung in dem Öl erhitzt, dem Ölkörper eine größere Viskoelastizität (und daher eine höhere Strukturstabilität) verleihen und dadurch die Penetration des Öls durch wäßrige (z. B.
_Körper-)Flüssigkeiten verlangsamen. _
Der genaue Mechanismus dieser Mittel bei der Erfindung ist nicht vollkommen bekannt. So würdeTieobachtet, daß bestimmte bekannte „Gelier"-Mittel den erwünschten Antihydratationseffekt selbst dann erzeugen, wenn das ein solches Mittel enthaltende Öl nicht zur Erhöhung von deren Gelierwirkung erhitzt worden ist, oder wenn die Gelbildung, wenn sie bereits begonnen hatte, im wesentlichen ausgeschaltet worden ist (z. B. durch Scherkräfte). Ebenso sind verschiedene Antihydratationsmittel, die keine nennenswerte Fähigkeit zum Gelieren des Öls haben, für den erfindungsgemäßen Gebrauch geeignet. Magnesiumstearat ist ein Beispiel dafür.
Beispiele für Antihydratationsmittel sind verschiedeneSalze organischer Säuren, zum Beispiel Fettsäuren mit etwa 8 (vorzugsweise mindestens etwa 10) bis etwa 22 (vorzugsweise bis zu etwa 20) Kohlenstoffatomen^. B. Aluminium-, Zink-, Magnesium- oder Caiciumsalze von Laurinsäure, Plemitinsäure, Stearinsäure und dergleichen. Solche Salze können die Abhängigkeit von der Wertigkeit des Metalls und dem Oxydationsgrad des Metalls durch die Säure mono-, di- oder trisubstituiert sein. Besonders brauchbar sind die Aluminiumsalze solcher Fettsäuren. Aluminiummonostearat und -distearat sind besonders bevorzugte Antihydratationsmittel. Andere brauchbare sind Aluminiumtristearat, Calciummono- und -distearat, Magnesiummono- und -distearat und die entsprechenden Plamitate, Laurate und dergleichen. In vielen Ausführungsbeispielen wird die Konzentration eines solchen Antihydratationsmittels, in bezug auf die Masse des Öls plus dieses Mittel, am besten zwischen etwa 1 % und etwa 10% betragen (am besten zwischen etwa 2% und etwa 5%), obwohl auch andere Konzentrationen in einigen Fällen angebracht sein.werden.
Im allgemeinen haben sowohl die Polypeptide als auch die Antihydratationsmittel die Tendenz zur Erhöhung der Viskosität der erfindungsgemäß hergestellten Zusammensetzungen. Bei vielen Polypeptiden, vor allem denen mit einer verhältnismäßig hohen MW und/oder komplizierten sekundären oder tertiären Struktur, schafft das ein Problem, das wie entdeckt wurde, durch die Anwendung eines Masseverhältnisses von Polypeptid zu Antihydratationsmittel, das verhältnismäßig hoch ist, gelöst werden kann. Erfindungsgemäß beträgt dieses Verhältnis im allgemeinen mindestens 1, typischer mindestens etwa 3 und im typischsten Falle mindestens etwa 4 und meistens gewöhnlich mindestens etwa 6. Obwohl dieses Verhältnis hinsichtlich der Zusammensetzungsviskosität normalerweise weniger kritisch ist, ist es doch im allgemeinen nicht größer als etwa 40 und typischer nicht größer als etwa 20.
Bei der Anwendung solcher Anteile wurde entdeckt, daß selbst bei den höheren Viskositäten der Zusammensetzung, die bei verhältnismäßig hohen Polypeptidkonzentrationen üblich sind, eine vorteilhaft lange und wirksame Freisetzung des Poiypeptids' erzielt wird. Noch überraschender ist die Tatsache, daß in einigen dieser Zusammensetzungen die Freisetzungsgeschwindigkeit tatsächlich steigt, wenn der Polypeptidanteil (und somit die Zusammensetzungsviskosität) größer wird. Die erfindungsgemäß hergestellten Zusammensetzungen können für eine verlängerte Freisetzung von Polypeptiden in Tieron, speziell Säugetieren, einschließlich des Menschen und anderer Primaten, angewandt werden. Nützliche Polypeptide zur Behandlung solcher Tiere sind z. B. Vogelhormone zur Behandlung von Hühnern, Truthühnern und dergleichen; Säugetierhormone zur Behandlung von Menschen, Rindern, Schweinen, Schafen, Ziegen und dergleichen, und Wassertierhormone zur Behandlung von Fischen und dergleichen. Besonders brauchbare Polypeptide umfassen wachstumsfördernde Hormone und die Milchbildung steigernde Hormone. Solche Hormone umfassen Somatotropine, die zur Erhöhung des Mager-Fett-Verhältnisses, des Futterwirkungsgrades und der Milchproduktion bei verschiedenen Säugetierarten einschließlich Rindern (z. B. Milchkühen), Schafen, Ziegen und Schweinen von Nutzen sind.
Unter der hier gebrauchten Bezeichnung „Somatotropin" ist ein Polypeptid zu verstehen, das eine biologische Aktivität und chemische Struktur aufweist, die im wesentlichen denen eines in der Hypophyse eines Tieres erzeugten Somatotropins gleichen. Solche Somatotropine umfassen natürlich von somatotropischen Hypophysezellen erzeugte Somatotropine und alternativ Somatotropine, die durch genetisch transformierte Mikroorganismen,wie E.coli, andere Bakterien oder Hefen verwirklicht werden. Solche alternativ erzeugten Somatotropine können dem natürlichen Somatotropin identische Aminosäuresequenzen haben oder sie können Analoga mit einer oder mehreren Variationen in der Aminosäuresequenz sein, die verstärkte biologische Aktivität oder einen anderen Vorteil bieten können. Polypeptide, für die die Erfindung besonders nützlich ist, umfassen Rinderund Schweinesomatotropine, z. B. mikrobiell verwirklichte Rinder- und Schweine- oder andere Tierprolactine, Wachstumshormone freisetzende Faktoren, Placentalactogene, insulinartige Wachstumsfaktoren und dergleichen. Diese Polypeptide haben wahlweise einen Methioninrest am N-Terminus, z. B. ein von einer mikrowellen Translation eines ATG-Startsignals in ein Gen für das Polypeptid stammendes Methionin. In einigen Fällen mag es jedoch empfehlenswert sein, daß solche Methioninreste in dem Polypeptid nicht mehr als etwa 20% (vorzugsweise nicht mehr als etwa 10%) Formyl-Methionin sind, um jede Tendenz der Fremdkörperabwehr des Tieres zum Abbau des Poiypeptids auszuschalten.
Beobachtungen bei Injektionen von erfindungsgemäß hergestellten Zusammensetzungen zeigen, daß eine erhebliche Menge Polypeptid in einigen Fällen anfangs nach der Injektion freigesetzt werden.
Diese Erscheinung wird als „Ausbruch" bezeichnet, von der man annimmt, daß sie auf eine Oberflächenvergrößerung infolge der Injektion oder einer anderen Verabreichungsform zurückzuführen sei. In einigen Fällen mag ein gemäßigter Ausbruch erstrebenswert sein, z. B. um einen wünschenswerten biologischen Effekt zu aktivieren. Ein zur Formulierung von erfindungsgemäß hergestellten Zusammensetzungen nützliches Merkmal ist die Beziehung des anfänglichen Ausbruchsgrades, der durch Messen der Konzentration von Polypeptid im Serum des behandelten Tieres kurz nach der Verabreichung gemessen wird, zu dem verlängerten Freisetzungsgrad, der durch Messen der Konzentration von Polypeptid im Serum des Tieres zu einem späteren Zeitpunkt gemessen wird. Für die hier zur Erörterung stehenden Zwecke ist der Ausbruchsgrad die Konzentration des Polypeptides im Serum 24 Stunden nach der Injektion, und der verlängerte Freisetzungsgrad ist die Konzentration des Poiypeptids im Serum 14 Tage nach der Injektion. Diese Konzentrationen werden zur Berechnung eines „Ausbruch-bisverlängerte-Freisetzung"-Verhältnisses herangezogen, das im allgemeinen als vorteilhaft angesehen wird, wenn es zwischen etwa 1,2 und etwa 6, angenommen zwischen etwa 1,5 und etwa 3, liegt.
Ein anderes nützliches Merkmal zur Beurteilung und Formulierung erfindungsgemäß hergestellter Zusammensetzungen ist die „Einspritzbarkeit", ein Maß dafür, wie gut die Zusammensetzung durch eine Nadel zur subkutanen Injektion fließt. Wenn Partikel des Poiypeptids zu groß sind oder die Zusammensetzung zu viskos ist, dann kann ein außergewöhnlicher Druck erforderlich sein, um die Zusammensetzung durch eine solche Nadel drücken zu können. Für erfindungsgemäße Zwecke wird die „Einspritzbarkeit" dadurch bestimmt, daß die Zeit gemessen wird, die ein Volumen einer erfindungsgemäß hergestellten Zusammensetzung fürden Durchgang durch eine 18er Nadel zur subkutanen Injektion mit einem Innendurchmesser von 0,033 Zoll (0,838 mm) und einer Länge von 4cm braucht, wenn ein Druck von 173psi (1193kPa) auf die Zusammensetzung in einer mit der Nadel ausgestatteten Spritze ausgeübt wird. Die „Einspritzbarkeit" sollte für erfindungsgemäß hergestellte Zusammensetzungen möglichst mindestens 0,03 Milliliter je Sekunde (ml/s) betragen. Vorzugsweise liegt diese Einspritzbarkeit noch höher, z. B. bei mindestens etwa 0,1 ml/soder noch besser bei etwa 0,3 ml/s.
Erfindungsgemäß hergestellte Zusammensetzungen können so hergestellt werden, daß das Polypeptid zu dem Öl alleine oder dem Öl mit einem darin suspendierten oder gelösten Antihydratationsmittel gegeben wird. Oftmals empfiehlt es sich, ein Antihydratationsmittel aufzulösen, um ein geliertes Öl zu schaffen. Wenn die Zusammensetzungen nach einer Verfahrensvariante hergestellt werden, bei dem zu Beginn ein geliertes Öl gebildet wird, kann ein Geliermittel wie ein
Fettsäuresalz von Aluminium in Form eines Pulvers zu einer gerührten Ölmenge gegeben werden, um eine Suspension des Pulvers zu erzielen. Die gerührte Suspension kann auf Wunsch bis zu mindestens dem Schmelzpunkt des Fettsäuresalzes (z.B. mindestens 155°C bei AIMS) erhitzt werden, wobei sich das Salz bei diesem Punkt in dem Öl lösen wird. Geringere Temperaturen können angewandt werden, wenn das Geliermittel oder andere Antihydratationsmittel ausreichend gelöst sind. Gründliches und kontinuierliches Rühren trägt dazu bei, die Agglomeration des Fettsäuresalzes zu verhindern und die Dispersion zu erhalten. Normalerweise sollten Erhitzen und Rühren fortgesetzt werden, bis das suspendierte Salz vollständig gelöst ist. Oftmals empfiehlt es sich, das Rühren einer zusätzliche Zeit lang weiterzuführen, um eine vollständige Auflösung zu sichern. Die Öllösung von Fettsäuresalz kann danach gekühlt werden, z. 8. auf Raumtemperatur, wodurch sich eine ziemlich haltbare Gelstruktur ergeben wird. Das Gel sollte unter Vakuum oder einem Sikkativ aufbewahrt werden, um Verunreinigung mit Wasser zu verhindern, das für die Gelstruktur nachteilig sein kann. Das Poly peptid kann anschließend dem Öl bei jeder Temperatur (z.B. Raumtemperatur), die intolerierbare schädliche Wirkungen (z. B. Denaturierung) verhindert, zugesetzt werden. Beispielsweise wurde Rinder-Somatotropin einem derartigen Öl bei zwischen etwa 4 und etwa 1250C liegenden Temperaturen zugesetzt, ohne daß die biologische Wirksamkeit nachteilig beeinflußt wurde. Diese Zugabe des Polypeptids wird vorzugsweise unter Vakuum ausgeführt, um Verunreinigung durch Wasser oder Luftblasen zu vermeiden. Eine solche Zugabe sollte möglichst als langsames Zugeben von feinverteiltem Polypeptid zu dem Öl erfolgen, wobei Hochleistungs-Schermischen zur gleichmäßigen Dispersion der Polypeptidpartikel angewandt wird. Eine Größenreduzierung der Polypeptidpartikel ist oft wünschenswert und kann z. B. durch Einsatz einer Kugelmühle erreicht werden, in der eine Suspension des Polypeptids mit einer Menge rostfreier Stahlkugel η mit einem Durchmesser von z. B. 0,3 bis 0,6cm vermischt wird. Es ist vorteilhaft, dieses gleichzeitig mit einer solchen Dispersion im unteren Teil eines Gefäßes, in dem das Mischen mit starker Schwerwirkung erfolgt, vorzunehmen. Das ist besonders bei hochgeladenen Polypeptiden vorteilhaft, deren Größe sich nur schwer zu Partikeln mit einem mittleren Partikeldurchmesser in bezug auf das Volumen von nicht mehr als etwa 15 Mikrometer reduzieren läßt, (d. h., daß 50% des Volumens der Partikel einen nichtmehrals 15 Mikrometer betragenden Durchmesserhaben). Die Verwendung von Polypeptiden mitgeringerTeilchengröße (z. B. mit einem solchen mittleren Teilchendurchmesser von höchstens etwa 10, vorzugsweise nicht mehr als etwa Ej1 Mikrometer) hat sich zur Erhöhung der Einspritzbarkeit von erfindungsgemäßen Zusammensetzungen als günstig erwiesen. Durch den Betrieb.einer derartigen Kugelmühle können die Polypeptidpartikel zweckmäßig zu einem solchen bevorzugten mittleren Teilchendurchmesser von nicht mehr als etwa 5 Mikrometer reduziert werden. Anschließend kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung aus der Kugelmühle durch Filtration (am besten unter Vakuum) zurückgewonnen werden. Wie oben erläutert, sind die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen entsprechend nützlich für die parenterale Verabreichung, z. B. durch intraperitoneale oder besser durch subkutane oder intramuskuläre Injektion. Unter der Dauer von verlängerter Freisetzung ist die Zeitperiode zu verstehen, während der das Polypeptid mit der erforderlichen Geschwindigkeit für die beabsichtigte biologische Wirkung abgegeben wird, die im allgemeinen durch die Konzentration des Polypeptids im Blutkreislauf des Tieres angezeigt wird. In Abhängigkeit von dem betreffenden Polypeptid und der biologischen Wirkung beträgt die Periode der verlängerten Freisetzung möglichst mindestens etwa 7 Tage. In anderen Fällen kann sie mindestens etwa 15 Tage betragen, oder für viele Anwendungszwecke noch besser mindestens etwa 30 Tage, oder sogar mindestens etwa 60 Tage oder noch langer. So wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß Zusammensetzungen, die mit Zink assoziiertes Rinder-Somatotropin enthalten, im Serum einer milchgebenden Kuh, der eine 2,5-Milliliter-Dosis davon injiziert wurde, mindestens etwa 7 Tage lang eine durchschnittliche Rinder-Somatotropin-Konzentration von mindestens etwa 12ng/ml ergeben, was zur Steigerung der Milchproduktion und/oder des Wirkungsgrades der Futter-in-Milch-Umwandlung bei Rindern sehr vorteilhaft ist. Um eine wirksame Dosis von Rinder-Somatotropin zur Behandlung von Milchkühen, z. B. zur Steigerung der Milchproduktion, zu schaffen, ist eine Zusammensetzung, die mindestens etwa 300 mg eines zinkassoziierten Somatotropins enthält, zur Bereitstellung eines erhöhten Serumspiegels von aktivem Rinder-Somatotropin für mindestens etwa 15 Tage empfehlenswert. Es ist ein sehr attraktives Merkmal der Erfindung, daß das zinkassoziierte Somatotropin in einer so hohen vorteilhaften Konzentration (z.B. mindestens etwa 15%) vorhanden ist, daß die Anwendung eines zweckmäßigen geringen Volumens der Zusammensetzung (z.B. etwa 10 ml oder weniger, z.B. zwischen etwa 1 und etwa 3 ml) zur leichten Verabreichung erfolgen kann. Andere Stoffe können natürlich der Zusammensetzung zugesetzt werden, vorausgesetzt, daß diese Stoffe nicht die erwünschte verlängerte Freisetzung des Polypeptids in wirksamen Mengen unannehmbar inhibieren. Es kann zum Beispiel günstig sein, wenn einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung ein entzündungshemmendes Mittel oder ein anderes Zusatzmittel zugesetzt wird, um die Einflüsse von Fremdkörper-(z-B. nicht-allergischen)-Reaktionen zu verringern, zu verhindern oder diesen entgegenzuwirken. Solche Zusatzstoffe können steroide und/oder nicht-steroide Entzündungshemmittel sein, die in der Zusammensetzung vorzugsweise in einer so geringen Menge, daß jede systematische Wirkung ausgeschaltet wird, aber auch so ausreichend vorhanden sind, daß sie eine örtliche Entzündung wirksam verringern können.
Herstellung von metall-assoziierten biologisch-aktiven Polypeptiden
Mit mehrwertigen Metallen assoziierte Polypeptide können durch Umsetzung des gelösten Polypeptids mit nicht-toxischen Metall-(z..B. Zink)-Ionen hergestellt werden. Im allgemeinen wird das metall-assoziierte Polypeptid durch Zugabe des Metalls, wahlweise in Form eines Salzes davon mit geringer Wasserlöslichkeit, aber im allgemeinen vorzugsweise als wasserlösliches Salz davon (z. B. Zinkchlorid), zu einer gepufferten Lösung des Polypeptids, um das mit dem Metall assoziierte Polypeptid auszufällen, hergestellt.
Häufig werden organische Solubilisierungsverbindungen, z. B. Harnstoff, Guanidin oder dergleichen zur Unterstützung der Auflösung des Polypeptids vor allem bei Peptiden, die nur schwach wasserlöslich sind, in den Lösungen enthalten sein. In vielen Fällen können die Konzentration der Solubilisierungsverbindung und/oder der pH-Wert der Lösung für die Aufrechterhaltung einer bioaktiven Konformation des Polypeptids kritisch sein.
Außerdem spielt der pH-Wert der Lösung allgemein für die Rückgewinnung des resultirenden metall-assoziierten Polypeptids, im allgemeinen in Form eines Präzipitats, eine kritische Rolle. Es kann kritische Bereiche des pH-Wertes geben, die z. B. von isoelektrischen Eigenschaften des Polypeptids abhängen. Die Temperaturen werden vorzugsweise niedrig gehalten, z. B. im allgemeinen nicht höher als etwa Raumtemperatur, um Denaturierung zu vermeiden.
Je nach der Reinheit des für die Verwendung vorgesehenen Polypeptide kann Depyrogenation und/oder Sterilisation erwünscht sein. Pyrogene (z. B. Endotoxine) können, wenn sie vorhanden sind, durch Zusammenbringen der Polypeptidlösung mit einem Ionenaustauschharz entfernt werden. Die meisten Pyrogene werden sich an positiv geladene Stellen, z.B. an ein Kationenaustauschharz, binden. Einige Pyrogene können sich an negativ geladene Stellen binden. Daher ist ein gemischtes Bett von lonenaustauschharzperlen zu empfehlen, um eine ausreichende Entfernung nicht-steriler Fremdkörper wie Bakterien oder loser Verunreinigungsstoffe von früherer Verarbeitung durch Filtration durch ein feines Filter, z. B. Maschengröße 0,2 Mikrometer, sterilisiert werden.
Die depyrogenierte, sterilisierte Polypeptidlösung wird anschließend mit einer nicht-toxischen Metallösung zur Ausfällung des metall-assoziierten Polypeptids zusammengebracht, wobei gewöhnlich möglichst eine Suspension gebildet-wird. Die Geschwindigkeit der Metallzugabe beeinflußt die Teilchengröße des resultierenden metall-assoziierten Polypeptids. Die Metallzugabe kann durch Einstellung der Metallkonzentration in der zugesetzten Lösung, dervolumetrischen Strömungsgeschwindigkeit und/oder der Dispersionsgeschwindigkeit gesteuert werden.
Normalerweise kann die Suspension von metall-assoziiertem Polypeptid verdünnt werden, um die Neigung zur Vergrößerung der Teilchengröße, z. B. durch Agglomeration, zu verringern. Das metall-assoziierte Polypeptid kann danach durch mehrfaches Zentrifugieren nach Waschen zur Entfernung von überschüssigem Metall und Anionen, worauf Lyophilisierung folgt, zurückgewonnen werden.
Mit einem einwertigen Metall (z. B. Natrium oder Kalium) assoziierte Polypeptide können durch Lyophilfsierung einer Lösung des Polypeptids und des Metallions hergestellt werden.
Herstellung von metali-assoziierten biologisch aktiven Somatotropinen
Nach einer spezifischeren Darstellung des eben beschriebenen Verfahrens kann ein Somatotropin (z.B. Rinder-Somatotropin)in den verschiedensten gepufferten Lösungen gelöst werden. Vorzugsweise wird es in einer wäßrigen, mit Tris(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS) oder einem anderen geeigneten Pufferungsmittel gepufferten Harnstofflösung gelöst. Eine wünschenswerte obere Grenze für die Harnstoffkonzentration liegt gewöhnlich bei etwa 6M; in einigen Fällen wird eine Harnstoffkonzentration von etwa 4,5 M bevorzugt. Geringere Harnstoffkonzentrationen, von angenommen 3 M oder nur 2 M oder sogar 1 M, können angewandt werden, allerdings bei einer geringeren Löslichkeit des Somatotropins. Der pH-Wert der gepufferten Harnstofflösung liegt vorzugsweise zwischen etwa 7 und etwa 10,5. Zwischen diesen pH-Wert-Grenzen betragt die Rückgewinnung von aus der Lösung ausgefälltem Somatotropin im allgemeinen mindestens etwa 60%. Normalerweise kann eine höhere Rückgewinnung (z. B. mindestens 90%) bei einem zwischen etwa 9 und etwa 9,5 liegenden pH-Wert erzielt werden.
Die Temperatur der Lösung sollte während der gesamten Präzipitation so niedrig sein, daß Oligomerisierung des Somatotropins verhindert wird. Im allgemeinen liegen solche Temperaturen möglichst unter etwa 10°C und noch besser unter etwa 5°C. Zur Gewinnung eines einwertigen metall-assoziierten Polypeptids wird die Lösung (depyrogeniert und sterilisiert wie oben beschrieben) durch Diafiltration (oder Dialyse) behandelt, um den Harnstoff gegen eine Lösung des Metallhydrogencarbonats (z. B. eine 25 mM NaHCO3-Lösung, pH-Wert 9,5) oder ein anderes geeignetes Salz auszutauschen. Vorzugsweise werden mehrere Austauschvorgänge mit der Hydrogencarbonatlösung vorgenommen, um einen vollständigen Austausch des Harnstoffs zu garantieren. Die Lösung wird anschließend durch weitere Diafiltration mit Wasser behandelt, um überschüssiges NaHCO3 zu entfernen, was durch den Beginn der Präzipitation von MBS angezeigt wird. Bei der Rückgewinnung von Natrium-Somatotropin durch Lyophilisierung entsteht ein Pulver des Natriumsalzes des Somatotrop.ins.
Um ein mehrwertiges metall-assoziiertes Polypeptid zu gewinnen, wird die Lösung (depyrogeniert und sterilisiert wie oben erläutert) mit einem mehrwertigen (z. B. Zink-) Salz zusammengebracht. Die Verwendung einer 1 M Lösung von Zinkchlorid hat ergeben, daß ein akzeptables ausgefälltes Zink-Somatotropin von 4,5 M Harnstofflösung des Somatotropins erzeugt wird, wenn auch höhere oder niedrigere Konzentrationen des Chlorids angewandt werden können. Die ZnCI2-Lösung wird vorzugsweise langsam zugegeben, z. B. durch Titration, wobei die Somatotropinlösung gerührt wird.
Während der fortgesetzten Zugabe der ZnCI2-Lösung nimmt die Somatotropinlösung zunächst eine gräuliche Farbe an und wird dann perl muttfarben-weiß, wenn die stöchiometrische Menge von ZnCI2 zugesetzt wird. Zum Beispiel wird durch die Zugabe von 4ml 1 M ZnCI2ZU 400 ml einer Lösung mit einem pH-Wert von 9,5, die etwa 20 mg Somatotropin je ml und 0,09MTRIS in 4,5 M Harnstoff enthält, eine einheitliche perlmuttweiße Zink-Somatotropin-Suspension gebildet werden. Weiteres ZnCI2 (z. B. bis zu 10 ml von 1 M ZnCl2-Lösung) kann zur Gewährleistung der vollständigen Präzipitation zugesetzt werden. Die Suspension wird danach häufig am besten verdünnt, um die Tendenz zur Erhöhung der Teilchengröße des Präzipitats zu reduzieren. Eine Verdünnung mit bis zu etwa 3,5 Volumen Wasser zu etwa 1 M Harnstoff hat sich als zufriedenstellend erwiesen, um die Zink-Somatotropin-Partikei vor Agglomeration zu bewahren. Die Rückgewinnung durch Diafiltration (oder mehrmaliges Zentrifugieren und Waschen) zur Entfernung von Harnstoff, TRIS und Zink- und Chlorionen und anschließende Lyophilisierung ergeben ein Pulver, dessen Teilchengrößen im allgemeinen zwischen weniger als 10 und 20 Mikrometer liegen. Wenn es_sich bei dem Somatotropin um Rindersomatotropin handelt, dann enthalten die Partikel im allgemeinen zwischen etwa 0,3 und etwa 1 % Zink (zwischen etwa 1 und 4 Moleküle Zink je Molekül Somatotropin). Wenn die Zinkzugaberate erhöht wird, sind größere Mengen in dem Präzipitat, z. B. bis zu 4 bis 5%zu finden. Solche größeren Mengen können auf zusätzliche Bindung von Zink an aktive Säurestellen am Somatotropin, z. B. an zusätzliche Asparagin-und/oder Glutaminsäurereste oder möglicherweise an Histidinreste oder an den Carboxyterminus des Polypeptids zurückzuführen sein. Es ist nicht beabsichtigt, durch diese Theorie der Zinkbindung den Anwendungsbereich der Erfindung einzuschränken. Im allgemeinen wird eine Präzipitation unter Anwendung einer eigentlichen Mindestmenge von Zink als Vorzug angesehen.
Ausführungsbeispiele
In der folgenden Beschreibung sollen spezifische Ausführungsbeispiele und Aspekte der Erfindung erläutert werden, aber keine Einschränkung für den Geltungsbereich der Erfindung festgelegt werden.
Beispiel 1
In diesem Beispiel wird die Herstellung eines erfindungsgemäßen zink-assoziierten Rinder-Somatotropins erläutert. Methionin-N-terminiertes Rinder-Somatotropin (MBD) wurde nach der Beschreibung von Seeburg, u. a., in „Efficient Bacterial Expression of Bovine and Porcine Growth Hormone" (Wirksame bakterielle Expression von Rinder- und Schweine-Wachstumshormon), 2 (1) DNA 37—45 (1983), hierdurch Bezugnahme enthalten, hergestellt. Das Somatotropin wurde in brauchbarer Form durch Lysierung der Bakterienzellen und anschließende Abtrennung des Somatotropins von Bakterienzellenbruchstücken gewonnen.
Bei einem Verfahren zur Rückgewinnung von MBS wurden die Bakterien durch Behandlung mit so viel 50%iger Schwefelsäure, daß der pH-Wert der Fermentationsbrühe auf 1,7 gesenkt wurde, abgetötet. Die Brühe wurde mit NaOH neutralisiert und zentrifugiert, wodurch eine Zellpaste zurückblieb, die in Harnstoff suspendiert, homogenisiert, auf etwa 40C (diese Temperatur wurde bis zur unten erläuterten MBS-Lyophilisierung beibehalten) gekühlt, zentrifugiert und dreimal gewaschen, in Guanidinhydrochlorid (7M) gelöst, zur Entfernung unlöslicher Stoffe zentrifugiert filtriert, durch eine Säule von SephadexG25 geleitet, in der das Guanidin gegen Harnstoff ausgetauscht wurde, filtriert, und anschließend durch eine lonenaustauschsäule DE52 geleitet. Das Volumen des Ablaufs wurde durch Hohlfaser-Altrafiltration etwa um das 30fache reduziert. Die konzentrierte Lösung wurde durch eine Chromatographiesäule von Sephadex G75, einen weiteren Hohlfaser-Volumenreduktionsschritt geführt und danach dialysiert, um zuerst den Harnstoff gegen NaHCO3-Lösung und anschließend destilliertes Wasser auszutauschen, um das MBS auszufällen. Das Präzipitat wurde lyophilisiert, wodurch ein weißer Feststoff (schwach in Wasser löslich) zurückblieb, derein Polypeptid (MBS) mit der NH2-met-phe(1)-pro(2)....leu(126)...(190)-COOH-Aminosäuresequenz enthielt, die von Seeburg in der oben angeführten Veröffentlichung dargestellt wurde.
Dieses MBS wurde in einer 4,5 M Harnstoff, 0,09 M TRIS-Lösung mit 21,5mg MBS je ml, 40C und pH-Wert 9,5 gelöst. Die MBS-Lösung wurde durch Vermischen mit 0,2 Gramm gemischten anionischen/kationischen lonenaustauschharzperlen (Biorad AG-501X8)je ml sterile MBS-Lösung depyrogeniert. Das Gemisch wurde etwa 10 Minuten lang bei 40C gerührt und danach durch ein 1-Mikrometer-Nylonfilterfiltriert, um die absorbierte Pyrogene enthaltenden Perlen zu entfernen.
Das depyrogenierte MBS wurde durch Hindurchleiten der Lösung durch ein sterilisiertes, gefaltetes Strahlungskapselfilter mit einer Maschenweite von 0,2 Mikrometer, um nicht-sterile Fremdkörper wie Bakterien oder lose Verunreinigungsstoffe von früherer Verarbeitung zu entfernen, sterilisiert.
Das MBS wurde durch die Zugabe von 1 M ZnCI2 in ein Zinksalz (ZnMBS) umgewandelt, wobei die depyrogenierte MBS-Lösung gerührt wurde. Das ausgefällte ZnMBS enthielt annähernd 1 % ZINK. Die ZnMBS-Feststoffe enthaltende Lösung wurde anschließend mit sterilem depyrogeniertem Wasser bis zu einer Harnstoffkonzentration von 1 M verdünnt. ZnMBS wurde durch 30 Minuten Zentrifugieren mit 10000 χ g, wobei die Lösung auf 4°C gehalten wurde, zurückgewonnen. Das ZnMBS wurde in sterilem depyrogeniertem Wasser mit 50 mg Zn MBS/ml unter Anwendung von Hochleistungs-Schermischen suspendiert. ZnMBS wurde wieder durch Zentrifugieren mit 1000Ox g über einen Zeitraum von 30 Minuten zurückgewonnen, erneut in sterilem depyrogeniertem Wasser mit 50mg ZnMBS/ml unter Anwendung von Hochleistungs-Schermischen suspendiert und dann lyophilisiert, um ein weißes lockeres Pulver von sterilem ZnMBS zu erzeugen.
Beispiel 1A
In diesem Beispiel wird eine alternative Herstellung von ZnMBS dargestellt.
Eine depyrogenierte und sterilisierte Lösung von 21 mg MBS je ml in 4,5 M Harnstoff, 0,05 TRIS, von 10°C und einem pH-Wert von 8,8, wurde mit Hilfe einer Verdrängungspumpe durch einen Speicherbehälter rezirkuliert. 1 M ZnCI2 wurde beim Ansaugen der Pumpe zugesetzt, bis die Konzentration der Lösung 0,01 M ZnCI2 betrug, wodurch die Präzipitation von ZnMBS erfolgte. Wasser zum Verdünnen wurde zugegeben, um eine Konzentration von 10mg MBS je ml zu schaffen, wodurch weitere Präzipitation von ZnMBS erfolgte. Die resultierende Suspension von ZnMBS wurde dann bei 250C durch eine Hohlfaser-Diafiltrationsmembran, die Poren für den Durchgang von Molekülen bis 100000.MW hatte, geleitet, bis die Konzentration 40mg MBS je mi erreichte; danach wurde Wasser zugesetzt, um die Membranfiltratgeschwindigkeit auszugleichen, bis im wesentlichen das gesamte Zn, der gesamte Harnstoff und alles TRIS aus der Suspension entfernt war. Die Wasserzugabe wurde abgebrochen, um eine Konzentration von etwa 80 mg MBS je ml zu erzielen. Die konzentrierte Suspension wurde anschließend lyophilisiert, um ein trockenes weißes Pulver von ZnMBS mit im Bereich von 0,5 bis 11 Mikrometer liegenden Teilchengrößen zu gewinnen.
Beispiel 1 B
In diesem Beispiel wird die Herstellung eines natrium-assoziierten Rinder-Somatotropins beschrieben.
Eine depyrogenierte und sterilisierte Lösung von 21,5 mg je ml in 4,5 M Harnstoff, 0,05 TRIS bei4°Cund einem pH-Wert von 9,5 wurde dialysiert, um zuerst Harnstoff gegen NaHCO3-Lösung und dann destilliertes Wasser auszutauschen. Der Wasseraustausch wurde gestoppt, wenn das MBS auszufällen beginnt. Die Lösung wurde anschließend mit einem 0,2-Mikrometer-Filterfiltriert, um ausgefälltes MBS zu entfernen, und lyophilisiert, um ein Natriumsalz (NaMBS) zu erzielen, das in erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verwendet werden kann.
Beispiel 2
In diesem Beispiel wird die Herstellung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung erläutert, die ein zink-assoziiertes Somatotropin enthält.
Ein Volumen Sesamöl (Fisher NF Sorte) wurde in einem Dreihalsrundkolben gegeben. Ein Antihydratationsmittel (AIMS) wurde in einer Menge von 5% in bezug auf AIMS und Sesamöl zugesetzt. Der Kolben wurde in ein Ölbad mit 155"C gestellt und gerührt, um das AIMS so rasch wie möglich zu dispergieren. Das Rühren wurde 20 Minuten lang fortgesetzt, wobei sich das AIMS vollständig in dem Öl löste. Der Kolben wurde aus dem Bad entnommen, unter Vakuum gehalten und zum Abkühlen auf 25°C stehengelassen. Beim Abkühlen verwandelte sich die Lösung in ein dickes Gel. Das gekühlte Gel wurde in eine Kugelmühle mit einem Hochleistungs-Scherrührwerk in einem Bett von rostfreien Stahlkugeln mit einem Durchmesser von Vs, 3/i6und 1AZoII (0,32,0,48 und 0,64cm) gegeben. Es wurde Vakuum an die Mühle angelegt, und ZnMBS-Pulver (hergestellt nach der Beschreibung in Beispiel 1) wurde langsam unter Einsatz eines Schneckenförderers zugesetzt, bis die Zusammensetzung 40% ZnMBS ( Masseverhältnis von ZnMBS zu AIMS 13,3) enthielt. Es wurde weitere 6 Stunden lang gerührt, wobei der mittlere Volumendurchmesser der ZnMBS-Partikel in diesem Zeitraum von 20 Mikrometer auf 5 Mikrometer reduziert wurde. Die resultierende weitgehende nicht-wäßrige gelierte Ölsuspension von ZnMBS wurde durch Filtration von den Stahlkugeln abgetrennt.
Beispiel 3
In diesem Beispiel wird eine wirksame Anwendung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung zur verlängerten Freisetzung eines Polypeptids, z. B. eines Rinder-Somatotropins, zur Steigerung der Milchproduktion bei Milchkühen erläutert. Es wurde eine weitgehend nicht-wäßrige Zusammensetzung im wesentlichen wie in Beispiel 2 durch Auflösen von 5% AIMS in auf 1550C erhitztem Sesamöl hergestellt. Das Öl wurde zur Bildung eines gelierten Öles gekühlt. ZnMBS wurde in dem Öl dispergiert und in dieses eingemahlen, bis die Zusammensetzung 32% ZnMBS in einer kontinuierlichen Phase des Öles (Masseverhältnis von ZnMBS und AIMS 9,4%) enthielt. Mit 18er, 1,5 Zoll (3,8cm) langen Nadeln ausgestattete Spritzen wurden mit 2,54 Gramm (2,5ml) Zusammensetzung gefüllt, um eine 805 mg ZnMBS enthaltende Dosis zur Verfügung zu stellen. Die Zusammensetzung wies eine Einspritzbarkeitvon 0,36ml/s auf. Blindzusammensetzungen von 5% AIMS in Sesamöl ohne das Polypeptid wurden gleichfalls zubereitet und in einer Menge von 2,4 Gramm in identische Spritzen gefüllt. Die Zusammensetzungen wurden 23 Holsteiner-Milchkühen im zweiten oder dritten Vierteljahr ihrer zweiten (oder anschließenden) Milchabsonderung eingespritzt. Die Kühe wurden wahllos zu 4 Gruppen von 5 oder 6 Stück zusammengefaßt. Zwei Gruppen erhielten intramuskuläre (IM) Injektionen in den Glutäalbereich, eine mit derZnMBS-enthaltenden Zusammensetzung und die andere (eine Kontrollgruppe) mit der Blindzusammensetzung. In ähnlicher Form erhielten zwei andere Gruppen subkutane (SQ) Injektionen derZnMBS-haltigen oder der Blindzusammensetzung in den oberen Supraskapularbereich.
Kumulative Mittelwerte nach dem Prinzip der kleinsten Quadrate der durchschnittlichen Milchproduktion (kovariant hinsichtlich Differenzen in den Vorbehandlungs-Milcherträgen eingestellt) sind in Tabelle 1 zu finden, in der die Milchproduktion in Kilogramm Milch je Tag angegeben ist. Wie aus Tabelle 1 hervorgeht, führt eine einmalige IM- oder SQ-Injektion einer zweckmäßig verabreichten erfindungsgemäßen Zusammensetzung zu einer schnellen und anhaltenden Verbesserung der Milchproduktion mit sehr hohen Werten von statistischer Signifikanz.
Tabelle 1
Kumulative angeglichene durchschnittliche tägliche Milchproduktion (MP), kg/Tag
7Tage 14Tage 21 Tage 30Tage
Dosis Weg MP% Ctrl(a) MP% Ctrl MP% Ctrl MP% Ctrl
OI 1
16,2 26,0 17,1 24,9 13,7 22,9 9,6
— 20,6 —
9,6 24,8 11,7 24,0 9,6 22,1 5,7
Kontrolle IM 23,3
ZnMBS IM 26,6
Kontrolle SQ 22,5
ZnMBS SQ - 25,1
Kombiniert IM und SQ
(1) Kontrolle 22,9
(2) ZnMBS 25,9
Unterschied
22,4 — .22,0
26,0 17,1 24,9
21,1 — 21,8
24,8 11,7 24,0
22,2 21,9
25,4 14,4 .. 24,4
Signifikanzwerte
— 20,9 —
13,1 25,4 14,4. 24,4 11,4 22,6 8,1
Signifikanzwerte
(2) vs. (1) .0001 .0001 , .0004 .0187
(a) Ctrl bedeutet protentuale Verbesserung in bezug auf die durchschnittliche Kontrollreaktion
Blutproben wurden auf Rinder-Somatotropin hin analysiert, das ohne erfindungsgemäße Verabreichung normalerweise im Kreislaufsystem von Rindern vorhanden ist. Repräsentative Analysen durch Radioimmunotest („RIA") sind in Tabelle 2 enthalten, worin die Konzentrationen von Rinder-Somatotropin im Blutserum in Nanogramm je Milliliter (ng/ml) angegeben sind.
Tabelle 2 Durchschnittliche Konzentration von Rinder-Somatotropin im Plasma, ng/ml
Intramuskulär Subkutan
Tage nach der Injektion Kontrolle ZnMBS Kontrolle ZnMBS
0 6,7 5,9 5,1 5,7
1 6,5 8,4 4,6 8,7
2 7,8 9,0 4,3 11,1
3 7,1 9,1 . 4,0 10,1
4 v .; 7,5 10,1 4,5 9,3
5 ν . 8,1 12,0 3,1 11,2
6 8,1 18,2 3,9 11,9
7 8,0 21,2 3,6 12,9 9 7,9 21,3 6,6 16,5
11 6,8 18,2 5,2 16,6
13 7,6 16,7 5,2 17,5
15 7,0 16,2 5,4 15,7
17 5,6 12,9 4,1 11,7
19 5,4 13,8 4,4 12,0
21 6,0 11,2 4,3 10,0
23 5,7 10,6 5,3 9,5
Fortsetzung der Tabelle 2
Tage nach der Injektion
Intramuskulär Kontrolle
ZnMBS
Subkutan Kontrolle
ZnMBS
5,6 5,8 3,5 3,8
9,8 8,4 6,8 5,9
9,0 8,5 7,4 6,7
Beispiel 4
In diesem Beispiel wird die Wirksamkeit erfindungsgemäßer Zusammensetzungen zur verlängerten Freisetzung eines Polypeptids (MBS) bei Tieren unter Anwendung von den verschiedensten Stoffen in solchen Zusammensetzungen
beschrieben.
Für dieses Beispiel wurden ZnMBS-Tormulierungen im wesentlichen wie in Beispiel 3 beschrieben unter Verwendung von
Kombinationen derfolgenden Bestandteile formuliert:
Bioverträgliches Öl: Sesamsamen oder Erdnuß · »
Antihydratationsmittel: AIMszu3%oder5% von Öl plusAIMS
Polypeptidanteil: ZnM BS zu 20%, 30% oder 40% der gesamten Zusammensetzung.
Das AIMS wurde in dem Öl dispergiert. Nachdem die Dispersion auf 155°C erhitzt und 15 Minuten lang auf dieser Temperatur
gehalten worden war, wurde sie zum Abkühlen auf 25°C stehengelassen, wobei sich ein geliertes Öl bildete. ZnMBS wurde zugegeben und durch Hochleistungs-Schermischen (Polytron Homogenizer) dispergiert, so daß eine Suspension von ZnMBS in dem gelierten Öl entstand. Die Suspension wurde in subkutane Tuberculin-Stritzen mit 18er Nadeln gefüllt.
Durch subkutane Injektion in den dorsalen Supraskapular-Bereich wurden die in Tabelle 3 genannten Zusammensetzungen an 16 Gruppen von je 8 immun-gehemmte weibliche Sprague-Dawley (IFS-D)-Ratten verabreicht.
Tabelle 3 Dosisvolumen Öl A
Mikroliter Sesam 3
Injizierte Zusammensetzungen 200 Sesam 3
200 Sesam 3
Gruppe 130 Sesam 3
1 100 Sesam 5
2 200 Sesam CJl
3 200 Sesam CJl
4 130 Sesam Ul
5 100 Erdnuß . 3
6 . 200 Erdnuß 3
7 200 Erdnuß 3
8 130 Erdnuß 3
9 100 Erdnuß 5
10 200 Erdnuß 5
11 200 Erdnuß Ul
12 130 Erdnuß CJl
13 100
14
15
16
AIMS,%(al
Masseverhältnis
ZnMBS, % ZnMBS/AIMS
kein —
20 8,3
30 14,3
40 22,2
kein —
20 5,0
30 8,6
40 13,3
kein —
20 8,3
30 14,3
40 22,2
kein —
20 5,0
30 8,6
40 13,3
(a) Auf der Basis von Masse Öl plus AIMS.
Mit Hilfe von RIA wurden Blutproben hinsichtlich Rinder-Somatotropin analysiert. Die Analysen in Tabelle 4 geben ng/ml Blutplasma an. Solche Plasmawerte sind in Tabelle 4 für vor der Injektion am Tage 0 dem Injektionstag) entnommene Blutproben angegeben. Einige Basislinienmessungen bei Ratten in den Beispielen 4 bis 7 sind höher als einige Basislinienwerte und Messungen des freigesetzten Polypeptids bei Kühen in Beispiel 3. Das liegt zum Teil an Unterschieden im normalen Somatotropipspiegel bei den einzelnen Tierarten und teilweise daran, daß die RIA in Beispiel 3 viel genauer war.
Tabelle 4 Durchschnittliche Konzentration von Rinder-Somatotropin im Plasma, ng/ml
^ Tage nach der Injektion
Gruppe 0 1 3 7 11 14 21 28 35
2 9 765 440 304 138 83 21 18 22
3 10 494 309 237 141 113 60 31 15
4 6 381 245 239 . 169 136 49 35 62
6 11 255 91 . 146 119 86 49 49 48
7 6 338 194 181 203 141 83 44 53 .
8 . 6 468 258 151 134 ' 149 103 48 35
10 6 735 470 255 152 94 32 25 19
11 6 582 391 221 166 134 47 30 32
12 11 753 361 224 171 146 72 41 52
14 7 383 178 143 95 77 41 34 29
15 8 479 246 183 197 215 106 67 70
16 7 413 281 146 142 135 66 39 49
(Die durchschnittlichen Konzentrationswerte der Kontrollwerte der Kontrollgruppen 1,5,9 und 13 lagen zwischen 5 und 12 ng/ml an jedem der oben angegebenen Tage).
Beispiel 5
Dieses Beispiel zeigt die Wirksamkeit von erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zur verlängerten Freisetzung eines Polypeptids (MBS) unter Anwendung anderer Fettsäuresalze von Aluminium als Antihydratationsmittel. In diesen Zusammensetzungen wurden Al uminiummonol au rat (AIML) und Aluminiummonoalmitat (AIMP) als Antihydratationsmittel mit Sesam-und Erdnußöleti verwendet.
In diesem Beispiel wurden 3% AIML enthaltende gelierte Öle im wesentlichen wie in Beispiel 4 hergestellt. ZnMBS wurde in den gelierten Ölen in einer Konzentration von 30% der Gesamtzusammensetzung (Masseverhältnis von AIML oder AIMP zu ZnMBS 14,3) suspendiert. Jede Zusammensetzung wurde in den in Tabelle 5 angegebenen Mengen einer Gruppe von 8 IFS-D-Ratten durch Injektion verabreicht.
Tabelle 5 Dosisvolumen,
Injizierte Zusammensetzungen Mikroliter
130
Gruppe 130
17 130
18 130
19
20
Öl Antihydratationsmittel
Sesam AIML
Sesam AIMP
Erdnuß AIML . '
Erdnuß AIMP
Analysen von an den angegebenen Tagen nach der Injektion entnommenen Blutproben der Ratten ergaben die in Tabelle 6 gezeigten Konzentrationen von Rinder-Somatotropin, wobei die Werte am Tage 0 die Basislinie für die Analyse darstellen.
Tabelle 6 Durchschnittliche Rinder-Somatotropin-Konzentrationen im Plasma, ng/ml Tage nach der Injektion
Gruppe 0 1 3 7 14 21
Beispiel 6
In diesem Beispiel wird die Wirksamkeit von erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zur verlängerten Freisetzung eines Polypeptids (MBS) unter Verwendung von Olivenöl oder Maisöl erläutert.
Bei diesem Beispiel wurden gelierte Öle im wesentlichen wie in Beispiel 4 unter Verwendung von 3% AIMS in bezug auf AIMS plus Öl hergestellt. Die Suspensionen von 30% oder 40% ZnMBS wurden zwei Gruppen von je 8 IFS-D-Ratten in den in Tabelle7 angegebenen Dosismengen injiziert.
9 431 143 172 49 30
10 632 229 277 58 33
11 421 162 198 .32 28
9 492. 164 210 17 35
Dosisvolumen Mikroliter Öl ZnMBS, % -13- 244914 • Masseverhältnis ZnMBS/AIMS
100 130 Oliven Mais 40 30 22,2. 14,3
Tabelle / Injizierte Zusammensetzung
Gruppe
21 22
Analysen von an den angegebenen Tagen nach der Injektion entnommenen Blutproben von Ratten ergaben die in Tabelle 8 angeführten Konzentrationen von Rinder-Somatotropin, wobei die Werte am Tage 0 die Basislinie für die Analyse darstellen.
Tabelle8 Durchschnittliche Rinder-Somatotropin-Konzentrationen im Plasma, ng/ml
Gruppe
Tage nach der Injektion
4 11
7 996 314 174 98 36
7 1314 444 158 98 35
21 22
Beispiel 7
In diesem Beispiel werden erfindungsgemäße Zusammensetzungen, die etwa 10% der Polypeptide, MBS und ZnMBS, in Erdnußöl enthalten, erläutert. Dieses Beispiel zeigt außerdem, daß die verlängerte Wirkung des Polypeptids durch die Verwendung des Polypeptids in Assoziation mit einem Metall und durch den Einsatz eines Antihydratationsmittels verstärkt werden kann. Die in Tabelle 9 für die Injektion aufgeführten Zusammensetzungen wurden im wesentlichen wie in Beispiel 4 hergestellt.
Tabelle 9 Polypeptid Polypeptidanteil, % Öl AIMS,%(3)
MBS 10 Erdnuß —
Injizierte Zusammensetzungen ZnMBS 10 Erdnuß —
Gruppe MBS 10 Erdnuß 1
30 ZnMBS 10 Erdnuß 1
31
32
33 I ^\ Λιι-f Hoc D^fic
Jede Zusammensetzung wurde subkutan einer Gruppe von 8 IFS-D-Ratten in einer,Dosis von 300 Mikrolitern injiziert. Analysen von den Ratten an den angegebenen Tagen nach der Injektion entnommenen Blutproben ergaben Plasmakonzentrationen wie in Tabelle 10 angegeben, wobei die Werte am Tage 0 die Basislinie für die Analyse darstellen.
Tabelle 10 Durchschnittliche Rinder-Somatotropin-Konzentrationen im Plasma, ng/ml
0 1 3 Tage nach der Injektion 7 75 11 20
Gruppe 14 1350 375 5 200 50 20
30 15 1800 310 145 64 40 21
31 12 1200 250 240 280 ' 35 125
32 18 620 350 123 174
33 330
Ein Vergleich der Ergebnisse der Gruppen 30 und 31 ergibt eine Verbesserung der verlängerten Freisetzung für mindestens 7 Tage durch die Anwendung eines assoziierten mehrwertigen Metalls. Ein Vergleich der Ergebnisse von Gruppe 32 und 33 ergibt eine Verbesserung der verlängerten Freisetzung von MBS durch die Anwendung eines Antihydratationsmittels, wenn das MBS mit einem derartigen mehrwertigen Metall assoziiert ist.
Beispiel 8
In diesem Beispiel werden erfindungsgemäße Zusammensetzungen beschrieben, die 10% Rinder-Somatotropin ohne Zusatz eines Antihydrationsmittels in jedem derfolgenden Öle enthalten: Sesam, Erdnuß, Mais, Oliven, Saflor, Baumwollsamen, Palm, Rapssamen und Sojabohnen. Einzelne Volumina jedes Öles werden bei jeder derfolgenden Temperaturen gehalten: 40C, 250C, 500C, 75°C, 1000C und 1250C. ZnMBS wird wie in Beispiel 2 in jedem Öl dispergiert und darin eingemahlen, bisseine Konzentration 10% erreicht. Das Mahlen wird fortgesetzt, bis das Somatotropin einen durchschnittlichen Teilchendurchmesser von höchstens 15 Mikrometer aufweist. Jede Zusammensetzung hat eine über 0,1 ml/s liegende Einspritzbarkeit.
Beispiel 9
In diesem Beispiel werden wie in Beispiel 8 hergestellte erfindungsgemäße Zusammensetzungen vorgestellt, nur wurde bei ihnen vor der Zugabe des Somatotropins AIMS in jedem Öl in einer Konzentration von 5% in bezug auf Öl plus AIMS dispergiert. Diese Zusammensetzungen weisen eine Einspritzbarkeitvon über 0,1 ml/s auf.
Beispiel 10
In diesem Beispiel werden wie in Beispiel 8 hergestellte erfindungsgemäße Zusammensetzungen beschrieben, nur wird bei ihnen die Zugabe von Somatotropin so lange fortgesetzt, bis die Zusammensetzungen 40% Rinder-Somatotropin enthalten. Dispergieren und Mahlen werden fortgesetzt, bis das Somatotropin einen durchschnittlichen Teilchendurchmesser von höchstens 15 Mikrometer hat. Diese Zusammensetzungen weisen eine Einspritzbarkeitvon über 0,03 ml/s auf.
Beispiel 11
In diesem Beispiel werden wie in Beispiel 10 hergestellte erfindungsgemäße Zusammensetzungen vorgestellt, nurrwird bei ihnen vor der Zugabe des Somatotropins AlMS in jedem Öl in einer Konzentration von 5% in bezug auf Öl plus AlMS dispergiert. Die Zusammensetzungen haben eine über 0,3ml/s liegende Einspritzbarkeit.
Beispiel 12
in diesem Beispiel werden erfindungsgemäße Zusammensetzungen erläutert, die 10% eines Rinder-Somatotropins in jedem der folgenden Öle enthalten: Sesam, Mais, Oliven, Saflor, Baumwollsamen, Palm, Rapssamen und Sojabohnen. Jedes Öl wird auf 16O0C erhitzt und zur besseren Auflösung von AIMS gerührt. Wenn 1 % AIMS gelöst ist, wird jedes Öl auf 250C abgekühlt. ZnMBS wird wie in Beispiel 2 in dem gekühlten Öl dispergiert und darin eingemahlen, bisseine Konzentration 10% erreicht und sein mittlerer Teilchendurchmesser auf höchstens 15 Mikrometer reduziert ist. Jede Zusammensetzung weist eine über 0,1 ml/s liegende Einspritzbarkeit auf.
Beispiel 13
In diesem Beispiel werden wie in Beispiel 12 hergestellte erfindungsgemäße Zusammensetzungen erläutert, nur daß bei ihnen die Zugabe von Somatotropin fortgesetzt wird, bis jede Zusammensetzung 40% Somatotropin enthäl-t. Die Zusammensetzungen werden wie in Beispiel 2 gemahlen bis das Somatotropin einen mittleren Teilchendurchmesser von höchstens 15 Mikrometer hat. Jede Zusammensetzung weist eine über 0,03 ml/s liegende Einspritzbarkeit auf.
Beispiel 14
In diesem Beispiel werden erfindungsgemäße Zusammensetzungen beschrieben, die 10% eines Rinder-Somatotropins in den folgenden Ölen enthalten, in denen AIMS gelöst ist: Sesam, Erdnuß, Mais, Saflor, Baumwollsamen, Palm, Rapssamen und Sojabohnen. Jedes Öl wird auf 1600C erhitzt und zur besseren Lösung von AIMS gerührt. Wenn das AIMS gelöst ist, wird jedes Öl auf 250C abgekühlt. ZnMBS wird dann in dem gekühlten Öl wie in Beispiel 2 dispergiert und darin eingemahlen, bis seine Konzentration darin 10% beträgt. Die Dispersion wird weiter gemahlen, bis das Somatotropin einen mittleren Teilchendurchmesser von höchstens 15 Mikrometer hat. Jede Zusammensetzung weist eine über 0,1 ml/s liegende Einspritzbarkeit auf.
Beispiel 15
In diesem Beispiel werden erfindungsgemäße Zusammensetzungen, die 42% eines Rinder-Somatotropins enthalten, durch kontinuierliche Zugabe des Somatotropins zu Zusammensetzungen von Beispiel 14, bis jede Zusammensetzung 42% Somatotropin enthält, hergestellt. Während das Öl noch als kontinuierliche Phase aufrechterhalten wird, wird das Somatotropin wie in Beispiel 2 dispergiert und eingemahlen, bis es einen mittleren Teilchendurchmesser von höchstens 15 Mikrometer hat. Jede Zusammensetzung weist eine über 0,03ml/s liegende Einspritzbarkeit auf.
Beispiel 16
In diesem Beispiel werden erfindungsgemäße Zusammensetzungen erläutert, die 20% eines Rinder-Somatotropins in Ölen enthalten, die den in Beispiel 9 verwendeten ähnlich sind, in denen aber eines der folgenden Antihydratationsmittel für das AIMS substituiert ist: Aluminiumdistearat oder -tristearat; Aluminiummono-, di- oder -tripalmitat oder -laurat; Magnesiummono-oder -distearat,-lau rat oder-palmitat; u nd Calcium mono-oder-distearat,-I au rat oder-pa Imitat. Das Antihydratationsmittel wird dem Öl vor der Zugabe des Somatotropins zugesetzt. ZnMBS wird wie in Beispiel 2 zugegeben, bis seine Konzentration 20% beträgt. Dispergieren und Mahlen werden fortgesetzt, bis das Somatotropin einen mittleren Teilchendurchmesser von höchstens 15 Mikrometer hat. Jede Zusammensetzung weist eine über 0,03 ml/s liegende Einspritzbarkeit auf.
Beispiel 17
In diesem Beispiel werden erfindungsgemäße Zusammensetzungen beschrieben, die andere Konzentrationen eines Rinder-Somatotropins in Beispiel 20 ähnlichen Ölen enthalten, indem die Öle der in Beispiel 16 eingesetzten Art entsprachen, nur daß die Zugabe des Somatotropins fortgesetzt wird, bis seine Konzentration 25%, 30% oder 35% erreicht. Dispergieren und Mahlen erfolgen so lange, bis das Somatotropin einen mittleren Teilchendurchmesser von höchstens 15 Mikrometer hat. Jede Zusammensetzung weist ein über 0,03 ml/s liegende Einspritzbarkeit auf.
Beispiel 18 .
Es werden im wesentlichen die gleichen Ergebnisse wie in den Beispielen 8 bis 17 erzielt, wenn das verwendete Somatotropin eine chemisch nicht kombinierte Form aufweist oder chemisch mit Natrium- oder Kaliumkationen assoziiert ist.
Beispiel 19
Es werden im wesentlichen die gleichen Ergebnisse wie in den Beispielen 8 bis 17 erzielt, wenn andere Rinder-Somatotropine verwendet werden, z. B. solche mit den folgenden Aminosäuresequenzen:
NH2-meth-phe(1)-pro(2)...val(126)...phw(190)-COOH
NH2-ala-phe(1)-pro(2)...val(126)...phe(19O)-COOH NH2-ala-phe(1)-pro(2);..leu(126)...phe(190)-COOH
NH2-phe(1)-pro(2)...leu(126)..'.phe(190)-COOH
NH2-phe(1)-pro(2)...val(126)...phe(190)-COOH (
NH2-met-asp-glu-phe(1)-pro(2)...leu(126)...phe(190)-COOH
NH2-met-asp-glu-phe(1)-pro(2)...val(126)...phe(190)-COOH
NH2-met(4)...leu(126)...phe(190)-COOH
NH2-met(4)...val(126)...phe(190)-CÖOH
Beispiele 20 bis 30 '
Wenn ein Schweine-Somatotropin in den Verfahren der Beispiele 8 bis 18 für das Rinder-Somatotropin eingesetzt wird, werden infolge der Ähnlichkeit von Rinder- und Schweine-Somatotropin im wesentlichen die gleichen Ergebnisse erzielt.
Wenn auch spezifische Beispiele der Erfindung beschrieben worden sind, sollte es den Fachleuten klar geworden sein, daß verschiedene IVlodifikationen davon möglich sind, ohne dadurch vom Inhalt und Geltungsbereich der Erfindung abzuweichen.
Daher sollen die folgenden Ansprüche alle derartigen IVlodifikationen in der vollen erfindungsgemäßen Konzeption mit umfassen.

Claims (39)

Erfindungsanspruch:
1 Ma.-% eines nicht-toxischen Antihydratationsmittels enthält, wobei das Polypeptid in der hergestellten Zusammensetzung in einem Masseverhältnis zum Antihydrationsmittel von mindestens etwa 1 vorhanden ist.
1. Verfahren zur Herstellung einer weitgehend nicht-wäßrigen, poiypeptidhaltigen Zusammensetzung, gekennzeichnet dadurch, daß man ein biologisch aktives Peptid und, als eine kontinuierliche Phase der Zusammensetzung, ein bioverträgliches Öl zusammenbringt, derart, daß die Zusammensetzung das Polypeptid in einem Anteil von mindestens 10 Ma.-% enthält. . ' λ '
2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß man ein schwach wasserlösliches Peptid verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 2, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Polypeptid um ein Somatotropin handelt.
4. Verfahren nach Anspruch 2, gekennzeichnet dadurch, daß man ein Polypeptid verwendet, das chemisch mit einem nichttoxischen Metall assoziiert ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß man eine Zusammensetzung herstellt, die etwa 15 Ma.-% eines Rinder-Somatotropins enthält.
6. Verfahren nach Anspruch 1 ; gekennzeichnet dadurch, daß man eine Zusammensetzung herstellt, die mindestens etwa
7. Verfahren nach Anspruch 6, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Antihydratationsmittel vorwiegend um eine C8-C22-Fettsäureverbindung handelt.
. 8. Verfahren nach Anspruch 6, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Polypeptid um ein Somatotropin handelt.
9. Verfahren nach Anspruch 8, gekennzeichnet dadurch, daß man eine Zusammensetzung herstellt, in der das Somatotropin chemisch mit einem nicht-toxischen mehrwertigen Metall assoziiert ist.
10. Verfahren nach Anspruch 9, gekennzeichnet dadurch, daß man eine Zusammensetzung herstellt, die eine Einspritzbarkeit von mindestens etwa 0,03 Milliliter je Sekunde aufweist.
11. Verfahren nach Ansprüche, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Polypeptid um ein Rinder-Somatotropin handelt.
12. Verfahren nach Anspruch 11, gekennzeichnet dadurch, daß das Antihydratationsmittel vorwiegend ein Aluminiumsalz von C8-C22-Fettsäure ist.
13. Verfahren nach Anspruch 11, gekennzeichnet dadurch, daß das Somatotropin vorwiegend in Form eines Zinksalzes verwendet wird.
14. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Polypeptid vorwiegend in Form eines nicht-toxischen Metallsalzes verwendet wird.
15. Verfahren nach Anspruch 14, gekennzeichnet dadurch, daß das verwendete Polypeptid schwach wasserlöslich ist.
16. Verfahren nach Anspruch 15, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem schwach wasserlöslichen Polypeptid um ein Somatotropin handelt.
17. Verfahren nach Anspruch 14, gekennzeichnet dadurch, daß das Salz eines mehrwertigen Metalls verwendet wird.
18. Verfahren nach Anspruch 17, gekennzeichnet dadurch, daß man eine Zusammensetzung herstellt, die mindestens etwa 15 Ma.-% eines Zinksalzes von Somatotropin enthält.
19. Verfahren nach Anspruch 18, gekennzeichnet dadurch, daß das verwendete Somatotropin Rinder-Somatotropin ist.
20. Verfahren nach Anspruch 19, gekennzeichnet dadurch, daß man eine Zusammensetzung herstellt, die bei intramuskulärer oder subkutaner Injektion in eine Milchkuh in einer Dosis 2,5 Millilitern in der Kuh eine durchschnittliche Plasma-Somatotropin-Konzentration von mindestens etwa 12 Nanogramm je Milliliter für mindestens etwa 7 Tage aufrechterhält.
21. Verfahren nach Anspruch 19, gekennzeichnet dadurch, daß das verwendete Salz einen mittleren Volumendurchmesser der Teilchen von höchstens etwa 5 Mikrometer aufweist.
22. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Zusammensetzung pro Einheitsdosis mindestens etwa 300 Milligramm Somatotropin enthält.
23. Verfahren nach Anspruch 15, gekennzeichnet dadurch, daß man eine Zusammensetzung herstellt, die eine C8-O22-Fettsäureverbindung in einer wirksamen Menge zur Verzögerung der Hydratation der Verbindung enthält.
24. Verfahren nach Anspruch 23, gekennzeichnet dadurch, daß die Zusammensetzung mindestens etwa 15 Ma.-% eines Rinder-Somatotropins enthält.
25. Verfahren nach Anspruch 24, gekennzeichnet dadurch, daß das Somatotropin vorwiegend in Form eines Zink-, Natriumoder Kaliumsalzes eingesetzt wird.
26. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß man eine Zusammensetzung herstellt, die etwa 15 und etwa 40 Ma.-% eines chemisch mit Zink assoziierten Rinder-Somatotropins, zwischen etwa 2 und etwa 5Ma.-% eines Aluminium mono-oder distea rats und, als eine kontinuierliche Phase der Zusammensetzung, ein bioverträgliches Pflanzenöl enthält, wobei das Somatotropin einen mittleren Volumendurchmesser der Teilchen von höchstens etwa 5 Mikrometer aufweist und in einem Masseverhältnis in bezug auf das Stearat von mindestens etwa 3 vorhanden ist.
27. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Somatotropin chemisch mit nicht-toxischem mehrwertigem Metall assoziiert ist.
28. Verfahren nach Anspruch 27, gekennzeichnet dadurch, daß das Metall mit dem das Somatotropin assoziiert ist, chemisch nicht in einem erheblichen Anteil mit anderen Anionen, die Salze mit geringer Wasserlöslichkeit mit dem Metall bilden, assoziiert ist.
29. Verfahren nach Anspruch 27, gekennzeichnet dadurch, daß das nicht-toxische Metall vorwiegend Zink ist.
30. Verfahren nach Anspruch 27, gekennzeichnet dadurch, daß das Somatotropin chemisch mit etwa 0,3% bis etwa 2% Zink in bezug auf die Masse des Somatotropins assoziiert ist.
31. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß es die Präzipitation eines Somatotropins aus wäßriger Lösung durch die Zugabe eines wasserlöslichen Salzes eines nicht-toxischen mehrwertigen Metalls zu der Lösung umfaßt.
32. Verfahren nach Anspruch 31, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem bei der Präzipitation verwendeten Metall um Zink handelt.
33. Verfahren nach Anspruch 32, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Somatotropin um Rinder-Somatotropin handelt.
34. Verfahren nach Anspruch 33, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Salz um Zinkchlorid handelt.
35. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß es das Dispergieren von feinverteilten einzelnen Teilchen des Somatotropins in einem bioverträglichen Öl in solchen Anteilen, daß das Öl eine kontinuierliche Phase der resultierenden Dispersion bildet, und die Dispersion mindestens etwa 10Ma.-% des Somatotropins enthält und unter solchen Bedingungen, daß die resultierende Dispersion weitgehend nicht-wäßrig ist und das Somatotropin in der resultierenden Dispersion einen höchstens etwa 15 Mikrometer betragenden mittleren Teilchendurchmesser hat, umfaßt, wobei das Dispergieren bei mit der erwünschten biologischen Aktivität des Somatotropins verträglichen Temperaturen erfolgt.
36. Verfahren nach Anspruch 35, gekennzeichnet dadurch, daß ein Antihydratationsmittel indem Öl im Bereich von etwa 1 %bis etwa5Ma.-%inbezug auf das Öl und Antihydratationsmittel vorhanden ist, wobei das Antihydratationsmittel ein Metallsalz einer Fettsäure mit 8 bis 22 Kohlenstoffatomen aufweist und das Metall aus der Aluminium, Calcium und Magnesium umfassenden Gruppe ausgewählt ist.
37. Verfahren nach Anspruch 36, gekennzeichnet dadurch, daß das Öl aus der Maisöl, Erdnußöl, Sesamöl, Olivenöl, Palmöl, Safloröl, Sojabohnenöl, Baumwollsamenöl, Rapssamenöl und Gemische davon umfassenden Gruppe ausgewählt ist und die Fettsäure aus der Stearinsäure, Palmitinsäure, Laurinsäure und Gemische davon umfassenden Gruppe ausgewählt ist.
38. Verfahren nach Anspruch 35, gekennzeichnet dadurch, daß das Dispergieren bei zwischen etwa 4°C und etwa 1250C liegenden Temperaturen ausgeführt wird.
39. Verfahren nach Anspruch 35, gekennzeichnet dadurch, daß das Somatotropin Rinder- oder Schweine-Somatotropin ist.
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