PT81248B - Processo para a preparacao de composicoes de polipeptideos biologicamente activos com libertacao prolongada - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DO INVENTO

Através desta Memória Descritiva, as percentagens das composições são em peso, e as temperaturas são em graus Celsius, salvo indicação em contrário.

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-10Tal como empregado nesta Memória Descritiva e nas reivindicações juntas, o termo "substancialmente não aquosa" designa essencialmente anidro ou contendo água, em uma tão reduzida proporção, que não acelera, intoleravelmente, o desprendimento do polipeptido noanimal. Não obstante esta proporção da ãgua variar com cada composição do invento, ela ê, muito vulgarmente, inferior a cerca de 2% (mesmo mais tipicamente inferior a cerca de 1%), numa modalidade que venha a ter um efeito no desprendimento do polipeptido.

0 termo "não tóxico"; designa, nesta Memória Descritiva, componentes de composições, deste invento que são razoavelmente dignos de confiança e/ou são inócuos, quando empregados em quantidades adequadas e sob condições apropriadas, na administração parenteral de tais composições.

0 termo polipéptido "activo biologicamente" ou "bioactivo" designa, nesta Memória Descritiva, um polipeptido que, seguindo-se uma administração parenteral ade quada a um animal, manifesta um efeito visível, num processo biológico daquele animal. 0 efeito pode ser hormonal, nutritivo, terapêutico, profilático ou outro qualquer , e pode simular, completar ou inibir um processo biológico, que decorra naturalmente, conquanto exista uma enorme diversidade de tais efeitos e processos, o estímulo do desenvolvimento, da lactação, da produção de ovos e da progénio e/ou da eficiência da alimentação em animais que forneçam os alimentos, pode ser mencionado como servindo de exemplo. Outros exemplos incluem a produção da lâ, da pele ou de outros produtos animais alimentares, conquanto os polipeptidos de peso molecular mais reduzido (por exemplo, pelo menos cerca de 300) possam ser empregados, estes polipeptidos, são geralmente, de um peso molecular substancial, por exemplo pelo menos cerca de 1.000 habitualmente pelo menos cerca de 4.000, nos modos de realização mais preferidos pelo menos cerca de

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55.9¾

-119.000 e, em muitos modos de realização mesmo os mais preferj_ dos, pelo menos cerca de 18.000 até cerca de 30.000 ou mais. Conquanto o polipeptido possa encontrar-se na sua forma activa, nas composições deste invento, antes da sua administração a um animal o termo, nesta Memória Descritiva, inclui também os polipeptidos que desenvolvem a bioactividade, depois de tal administração.

Em muitos modos de realização do invento, o polipeptido ê administrado numa modalidade química não combinada. Muitos outros modos de realização são levados a efeito, vantajosamente, empregando-se o polipeptido numa modalidade (por exemplo, combinado quimicamente com outra substância) em que ele tem uma solubilidade substanciaj_ mente inferior em fluidos aquosos (por exemplo, do corpo animal) do que o polipeptido não combinado. Por exemplo, o polipeptido pode estar predominantemente (por exemplo, totalmente) associado a um mdal não tóxico ou numa modalidade de um éster, de uma amida ou de outra qualquer que proporcione a bioactividade desejada e não transmita efeitos secundários intoleráveis. Quando associado quimicamente com um tal metal, o metal pode encontrar-se presente como o metal "per se" (por exemplo, num sal do metal ou num complexo com o polipeptido) ou na modalidade de um sal ou de um complexo do metal, com um ou mais outros aniões.

Conquanto os metais monovalentes (por exemplo, o sódio ou o potássio) possam ser empregados com vantagem, em algumas composições deste invento, os metais polivalentes são preferidos para o emprego, em-muitas outras circunstâncias. Exemplos de tais metais polivalentes incluem o zinco, o ferro, o cálcio, o bismuto, o bário, o magnésio, o alumínio, o cobre, o cobalto, o níquel, o cádmio e outros afins. Em alguns modos de realização altamente preferidos, tais polipeptidos associados arretais são produtos da reacção de tais metais, por exemplo na modalidade iónica, com os polipeptidos dissolvidos. A proporção do metal em relação

ao polipeptido pode variar, dependendo do número das situações activas do polipeptido, que se associa com um tal metal, duran te o processo da formação. Por exemplo, o metal pode estar associado com alguns, ou com todos, residuos de amino ácidos (por exemplo, o aspártico ou o glutâmico), carregados negativamente no polipeptido ou com o seu término de carboxi. Alguns ou todos os metais podem estar associados num sal do polipeptido, ocluidos nas pregas, nos cristais ou nas formas amorfas do polipeptido, ou associados como uma ponte de catiões entre, pelo menos, duas moléculas de polipeptidos.

Quando o metal ê polivalente, a sua valência pode estar somente parcialmente associada, quimicamente, com o polipeptido, em alguns casos, por exemplo, por causa do impedimento estêrico. Em tais casos, a valência restante do metal pode estar associada, quimicamente, com outros aniões. Em muitos modos de realização desejáveis, o metal não está associado, quimicamente, em proporções substanciais, com outros aniões, que formam sais tendo uma solubil ida_ de reduzida em água com o citado metal. Quando o metal está, parcialmente, associado, quimicamente, com outros aniões, tais outros aniões (orgânicos ou inorgânicos), são, muitas vezes, seleccionados de modo .desejável, daqueles que formam sais solúveis em âgua com aquele metal, por exemplo, Br', Cl",

I", SO" ou CHgCOO", quando o metal ê o zinco. Os aniões monovalentes, por exemplo o Cl", são geralmente, os mais preferidos .

Os novos e os preferidos polipeptidos associados a metais, deste invento incluem as somatotropinas, associadas com o zinco. Em alguns casos, eles podem conter atê cerca de 5% de zinco, ou mais, baseado no peso da somatotropina. Para se minimizar a possibilidade de reacções indesejáveis dos locais da injecção, nos animais, pode contudo tornar-se desejável que eles, os polipeptidos, não contenham mais do que cerca de 2%, em alguns casos não mais do que cerca de 1% de zinco (na mesma base). Em muitos modos de realização

-13preferidos, estes polipeptidos contêm, pelo menos, cerca de 0,3% (habitualmente, pelo menos, cerca de 0,5%) de zinco (na mesma base), conquanto percentagens inferiores de zinco possam ser adequadas, em alguns casos.

Exemplos de outros sais de polipeptidos, proveitosos neste invento, incluem (a) sais de adição de ácidos, formados com ácidos inorgânicos, por exemplo, o cloridricc, o bromidrico, o sulfúrico, o fosfórico ou o nítrico; ou com os ácidos orgânicos, por exemplo, o acético o oxálico, o tartárico, o succínico, o maleico, fumárico, o glucónico, o cítrico, o málico, o ascórbico, o benzoico, o tânico, o pamoico, o alginico, o poiiglutâmico, o naftalenossulfónico, o naftaleno-dissulfónico ou o poiigalactut-ónico;

(b) sais com eatiões polivalentes orgânicos, por exemplo a N '-dibenziletilenodiamina ou a etilenodiamina; e (c) combinações de dois ou mais dos tipos mencionados no precedente, de sais por exemplo, o tanato de zinco.

Preferidos são os sais de zinco, de ferro, de cálcio, de magnésio, de manganês, de sódio, de potássio e suas misturas. Os mais preferidos sais, especialmente quando o polipeptido ê uma somatotropina, são os de zinco, de sódio ou de potássio. Muito vantajosamente, tem-se verificado que tais sais, quando administrados num óleo biocompatível, nas proporções empregadas em composições deste invento, actuam reciprocamente com o óleo resultante nu_ ma matriz ou outra estrutura, que com surpresa, aumentam o prolongamento do desprendimento do polipeptido, e graus eficientes. Esta descoberta inesperada tem sido verificada quer na administração subcutânea, quer na administração intramuscular, e afigura-se como contribuindo, grandemente, na eficácia de muitas composições deste invento.

As composições deste invento são, também, proveitosas no desprendimento prolongado de polipeptidos conjugados ou não conjugados. Tais polipeptidos conjugados compreendem as 1ipoproteinas, por exemplo a beta 1ipoproteína; as glicoproteínas, por exemplo a gama globulina; as fosfoproteinas, por exemplo a caseína; as hemoproteinas, por exemplo a hemoglobina; as flavoproteinas, por exemplo a dehidrogenase de succinatos; e as metaloproteinas, por exemplo a fer ritina e a dehidrogenase de álcoois. As misturas destas e de quaisquer outras modalidades mencionadas no precedente dos polipeptidos devem ser consideradas como no campo do invento e como descritas e comoreivindicadas nesta Memória Descritiva.

Em muitos modos de realização atraentes, os polipeptidos, administrados em composições deste inven_ to , são somente ligeiramente solúveis em água (isto é, pelo menos 100 partes de água, â temperatura ambiente, são necess£ rias para se dissolver uma parte do polipeptido). Em muitos modos de realização desejáveis, eles não são muito solúveis no óleo biocompatível empregado neles, isto ê, não solúveis neles, à temperatura ambiente e a uma concentração superior a cerca de 2%, e muito mais de modo desejável â uma concentração não superior a cerca de 1%. Em alguns casos, por exemplo em composições que contêm diversas somatotropinas, o polipeptido ê tanto ligeiramente solúvel em água, como essencialmente insolúvel no óleo.

Como ficou dito no precedente, as composições deste invento contêm cada uma, como uma sua parcela contínua, um óleo biocompatível, isto é, um óleo, que não tem qualquer efeito prejudicial intolerável no polipeptído, no animal, ou no caso de animais cujos produtos entram na cadeia da alimentação, nos consumidores de tais produtos.

De preferência, tais óleos são de baixa acidez e essencialmente livres de rancidez. Tal como empregada nesta Memória Descritiva, o termo "óleo" designa um óleo gordo ou uma gordura

que seja liquida, â temperatura do corpo do animal. Deste modo, um tal óleo deve derreter, ou pelo menos começar a derreter, a uma temperatura inferior a cerca de 40°C, e de prefe rência, inferior a cerca de 35°. Os Óleos, que são líquidos a cerca de 25°, podem facilitar a injecção, ou outras adminis. trações, de algumas composições deste invento. Em alguns casos, os óleos polinãosaturados (por exemplo, hidrogenados parcialmente) podem ser bem acolhidos, pela sua maior bio-compatibi1 idade com o animal, ou por outras razões.

Num modo de realização preferido, o óleo biocompatível ê composto, essencialmente, de trigliceretos, isto ê, ésteres de ácidos gordos de cadeia longa (geralmente de Cg-C₂₄, de preferência de ^C-]2^_C18^ 9^^ice~ rol, ou de misturas de trigliceretos e de tais ácidos gordos (de preferência, em somente proporções menores, por exemplo menos do que cerca de 10% de ácido gordo livre). Em alguns modos de realização, outros compostos de trihidroxi ou de polihidroxi podem substituir o glicerol. Os Óleos especialmeii te preferidos compreendem os óleos vegetais, tais como o azeite o óleo da semente de gergelim, o óleo de amendoim, o óleo da semente de girassol, o óleo de soja, o óleo de semente de algodão, o óleo de milho, o óleo de açafrão bastardo, o óleo de palma, o óleo de semente de colza, e as misturas de tais óleos. Os óleos de gergelim e de amendoim são altamente preferidos, pana muitos modos de eralização. Os óleos de animais, ou de origem mineral, ou os óleos sintéticos, (incluindo os ésteres de ácidos gordos de cadeia longa de glicerol ou de glicol de propileno) podem também ser empregadós, com a ressalva de que eles sejam suficientemente biocompativeis.

Na maior parte dos modos de realização, um tal óleo constitui-se numa parte predominante, em peso, de tais composições. A parcela contínua de óleo biocompatível, tem na maior parte dos casos, partículas finampr^ tp divididas, de um modo desejável, e descontínuas do polipeptido, dispersas relativa a uniformemente nela, por exemplo numa suspensão. 0 limite superior de carga do polipeptido corresponde ao instante em que o óleo cessa de existir, numa parcela continua, porque existe apenas óleo insuficiente para envolver, total e essencialmente, todo o polipeptido na composição.

Tem-se verificado resultados surpreendentes e inesperados, ao empregarem-se cargas elevadas do polipeptido, em tais composições, mesmo quando a viscosidade ê substancialmente aumentada, por esse motivo. Além de mais a tais elevadas cargas, tem-se verificado uma acção reciproca entre o polipeptido e o óleo que em muitos casos favorece um desprendimento prolongado do polipeptido, de um depósito de duração por muito tempo. Esta acção reciproca é aumentada em muitos casos, como ficou dito no precedente, quando o polipeptido se encontra associado a um metal.

E por isso, as composições deste invento um polipeptido, em graus de carga elevados, de um modo desejável, por exemplo de, pelo menos, cerca de 10%.

Mesmo cargas mais elevadas do polipeptido, por exemplo pelo menos cerca de 15%, são muitas vezes, desejáveis e, especialmente, eficazes com as somatotropinas e com outros polipeptidos, tendo características essencialmente semelhantes. As cargas de cerca de 20%, ou mais elevadas, por exemplo de, pelo menos, cerca de 30%, ou mesmo até 42% ou mais elevadas, podem

ser empregadas, vantajosamente, em composições injectáveis parenteralmente, compreendendo uma somatotropina (por exemplo bovina), em particular quando a somatotropina se encontra associada com-um metal polivalente, tal como o zinco. Tais compo-

17sições podem proporcionar desprendimento prolongado da somatotropina (como foi avaliado no fluxo de sangue do gado vacum ou de outros animais), durante períodos até 30 dias ou mais longos.

Essencialmente, composições não aquosas, compreendendo graus de carga do polipeptido, tão elevadas como cerca de 10%, não foram sugeridas em qualquer tecnj_ ca anterior, de que nóa tenhamos conhecimento. Em tais tecnj. cas anteriores, as preparações de óleos tem estado limitadas a cargas muito baixas de polipeptidos, isto ê, não mais do que cerca de 2%. (Veja as Patentes N⁹. 2.964.448, N⁹. 3.869.549 e N⁹. 4.256.737, todas dos Estados Unidos da América).

As composições deste invento podem, também, compreender, em complemento do óleo biocompatível, um "agente de anti-hidratação", termo esse que, tal como empregado nesta Memória Descritiva, designa uma substância que retarda a hidratação de uma dada composição deste invento, ou do polipeptido e/ou do óleo biocompatível nele existente e, desse modo, diminui e/ou estabiliza o grau do desprendimento do polipeptido daquela composição, a seguir a administração a um animal. Uma grande diversidade de agentes de anti-hidratação não tóxicos são conhecidos. A titulo de exemplo, há agentes de "gelação", que quando dispersos e, alguns casos, aquecidos para se os dissolver no óleo, fornecem ao corpo do óleo uma viscoselasticida.de mais elevada (e, por isso, uma estabilidade estrutural mais elevada), e desse modo, abrandam a velocidade da penetração do óleo em fluidos aquosos (por exemplo. do corpo).

0 mecanismo preciso destes agentes, no invento em consideração, não estã totalmente esclarecido. E, assim, tem sido observado que determinados agentes "de gelação" conhecidos proporcionam o efeito de anti-hidratação desejado, mesmo quando o óleo, contendo um tal agente não tenha sido aquecido para aumentar o seu efeito de gelação, ou quando a formação do gel, uma vez formado, tenha sido substancialmente eliminada (por exemplo, pelas forças do cisalhamento). Também, diversos agentes de anti-hidratação, que não tenham capacidade substancial para fazer a gelação do óleo, são adequados para o emprego neste invento. 0 estearato de magnésio ê um exemplo.

Os agentes exemplares de anti-hidratação compreendem os diversos sais de ácidos orgânicos, por exemplo dos ácidos gordos, que tenham de cerca de 8 (de preferência, pelo menos cerca de 10) até cerca de 22 (de preferência, até cerca de 20), de átomos de carbono por exemplo sais de aluminio, de zinco, de magnésio ou de cálcio, do ácido laurico, do ácido palmitico, do ácido esteárico e de outros afins. Tais sais podem ser mono-, di-, ou tri-substj. tuidos, dependendo da valência do metal ou do grau da oxidação do metal pelo ácido. Particularmente proveitosos são os sais do aluminio de tais ácidos gordos. 0 monoestearato e o diestearato de aluminio são os agentes de anti-hidratação particularmente preferidos. Outros, que são proveitosos, incluem o triestearato de aluminio, o mono- e o diestearato de cálcio, o mono- e o diestearato de magnésio e os correspondentes palmitados, lauratos e outros afins. Em muitos modos de realização, a concentração de um tal agente de anti-hidratação, baseada no peso do óleo com o do aquele agente, situa-se vantajosamente entre cerca de 1% e cerca de 10% (mais tipicamente, entre cerca de 2% e cerca de 5%), con quanto outras concentrações possam ser adequadas, em alguns

casos.

De um modo geral, tanto os polipeptidos, como os agentes de anti-hidratação, tendem a aumentar a viscosidade das composições deste invento. Com muitos polipeptidos, especialmente com os de um peso molecular relativamente elevado e/ou de uma estrutura secundária ou terciária complexa, isto apresenta um problema, que verificamos que pode ser ultrapassado, empregando-se uma proporção, em peso, do polipeptido para o agente de anti-hidratação, que seja re lativamente elevada. Neste invento, aquela proporção ê geraj_ mente pelo menos, cerca de 1, mais tipicamente pelo menos cer ca de 3, mesmo mais tipicamente pelo menos cerca de 4, e mais vulgarmente pelo menos cerca de 6. Conquanto seja, habitualmente, menos embaraçosa, em termos de viscosidade da composição, aquela proporção não ê, geralmente superior a cerca de 40, e mais tipicamente não superior a cerca de 20.

Empregando-se tais proporções, temos verificado que, mesmo com as viscosidades da composição mais elevadas, inerentes âs concentrações de polipeptidos relativamente elevadas, tem-se obtido um desprendimento, vantajosamente mais prolongado e mais eficiente, do polipeptido.

Ainda mais surpreendente é o facto de que em algumas de tais composições o ritmo do desprendimento na realidade aumenta, à medida que aumenta a carga do polipeptido (e, por isso, a viscosidade da composição).

As composições deste invento podem ser utilizadas para o desprendimento prolongado dos polipeptidos em animais, especialmente nos mamíferos, incluindo o homem e outros primatas. Os polipeptidos proveitosos, para o tratamento de tais animais, incluem, por exemplo, as hormonas das aves, para o tratamento das aves de capoeira, dos perus, e de outros afins, as hormonas dos mamíferos, para o tratamento de seres humanos, do gado vacum, dos porcos, das ovelhas, das cabras e de outros afins, as hormonas de animais aquáticos, para o tratamento dos peixes e de outros

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afins. Os polipeptidos, especialmente proveitosos, incluem as hormonas de promoção do desenvolvimento e as hormonas do aumento da lactação. Tais hormonas incluem as somatotropinas, proveitosas para o aumento da proporção de carne magra para gordura, e para o aumento da eficiência da alimentação e da produção do leite, em diversas espécies de mamíferos, incluindo o gado vacum (por exemplo, as vacas leiteiras), as ovelhas, as cabras e os porcos.

Tal como empregado nesta Memória Descritiva, o termo "somatotropina" designa um polipeptido que tem uma actividade biológica e uma estrutura quimica, essencialmente semelhante âs da somatotropina produzida na glândula pituitária de um animal. Tais somatotropinas incluem as somatotropinas naturais, produzidas pelas células somatotrópicas da pituitária, e alternativamente, somatotropinas produzidas pelos microrganismos transformados geneticamente, tais como "E. coli", por outras bactérias ou fermentos. Tais somatotropinas, produzidas alternativamente, podem ter uma sequência amino ácida, idêntica à da somatotropina natural, ou podem ser análogas tendo uma ou mais variações na sequência amino ácida, que podem proporcionar uma actividade biológica aumentada ou alguma outra vantagem. Os polipeptidos, para os quais este invento ê particularmente proveitoso, incluem as somatropinas bovinas e porcinas, por exemplo as somatotropinas bovinas e porcinas produzidas microbialmente, as prolactinas bovinas, porcinas e de outros animais, os agentes de desprendimento das hormonas de desenvolvimento, os lactogênios placentários, os agentes de desenvolvimento afins da insulina e outros semelhantes. Estes polipeptidos têm facultativamente, um residuo de metionina no termino N, por exemplo uma metionina resultante da translação microbiana de um sinal de partida de ATG, num gene para o polipeptido. Contudo, em alguns casos, pode tornar-se desejável que tais residuos de metionina, no polipeptido, não sejam mais do que cerca de 20% (de preferência, não mais do que cerca de

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20% (de preferência, não mais do que cerca de 10%) da metionina de formilo, para reduzir qualquer tendência das defesas estranhas do corpo do animal, para desintegrar o polipeptido.

As observações de injecções de composições deste invento indicam que uma quantidade substancial do polipeptido ê, em alguns casos, desprendida, inicialmente após as injecções. Isto ê designada como uma "explosão", que se admite resultar de um aumento da extensão da superfície ocasionado pela injecção ou por outra administração. Em alguns casos, uma explosão modesta pode tornar-se desejável, por exemplo para activar um efeito biológico desejado. Uma caracteristica proveitosa, na formulação das composições deste invento ê a afinidade do grau da explosão inicial, determinado medindo-se a concentração do polipeptido no soro do animal tratado, imediatamente após a administração, com o grau do desprendimento prolongado, determinado medindo-se a concentração do polipeptido no soro do animal, um tempo mais tarde. Para os fins deste invento, o grau da explosão ê a concentração do polipeptido do soro, 24 horas após a injecção, e o grau do desprendimento prolongado ê a concentração do polipeptido no soro, 1.4 dias após a injecção.

Estas concentrações são utilizadas para se calcular uma proporção da "explosão para o desprendimento prolongado", que é considerada, geralmente, vantajosa, quando compreendida entre cerca de 1,2 e cerca de 6, digamos entre cerca de 1,5 e cerca de 3.

Uma outra caracteristica proveitosa, na avaliação e na formulação das composições deste invento, ê a "seringabi1 idade", uma medida de quão satisfatoriamente a composição flui, através de uma agulha de injecção hipodêr mica. Se as partículas do polipeptido são muito grandes ou se a composição'e mui to viscosa, pode tornar-se necessária uma pressão excessiva, para se forçar a composição, através de uma tal agulha. Para os fins deste invento a "seringabi1 idade"

é determinada, medindo-se o tempo para que um volume de uma composição deste invento passe através de uma agulha hipodérmica de calibre 18, tendo um I.D. de 0,033 polegada (0,838 mm) e um comprimento de 4 cm, quando uma pressão de 173 psi (1193 kPa) ê aplicada â composição, numa seringa adaptada à agulha. A "seringabi1 idade", para as composições deste invento, ê de um mono desejável, pelo menos, 0,03 mililitros por segundo (ml/seg). De preferência, tal seringabilj_ dade ê mais elevada, por exemplo pelo menos cerca de 0,1 ml/seg, ou mesmo de um modo ainda mais desejável, pelo menos cerca de 0,3 ml/seg.

As composições deste invento podem ser preparadas adicionando-se o polipeptido ao óleo isolado, ou ao óleo tendo um agente de anti-hidratação suspenso ou dissolvido no óleo. E muitas vezes conveniente dissolver-se um agente de anti-hidratação, para se proporcionar um óleo gelaj do. Quando as composições deste invento são preparadas por *

j

um processo, tal como um sal de alumínio de um ácido gordo j

pode ser adicionado, como um pó, a uma quantidade de óleo em ! agitação, para se efectuar uma suspensão daquele pó. A sus- j pensão em agitação pode ser aquecida, de um modo desejável, j

I ao pelo menos, ponto de fusão do sal do ácido gordo (por |

j exemplo, pelo menos 155°, para ALMS), ponto esse em que o '

sal se dissolverá no óleo. Temperaturas mais baixas podem ser empregadas, se o agente de gelação ou outro agente de anti-hidratação for dissolvido, adequadamente. As ajudas meticulosas e contínuas de agitação evitam a aglomeração ι

do sal do ácido gordo e mantêm a dispersão. Habitualmente !

o aquecimento e a agitação devem manter-se até que o sal suspenso se dissolva completamente. E muitas vezes, desejável manter-se a agitação durante um tempo complementar, para se assegurar a dissolução completa.

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í

A solução do óleo do sal do ácido go_r do pode, em seguida, ser arrrefecida, por exemplo até a temperatura ambiente, em que se produzirá uma estrutura de gelação rezoavelmente estável. 0 gel deve ser mantido _Sob vácuo ou um dessecante, para se evitar a contaminação com a água, que pode afectar, de um modo adverso, a estrutura do gel.

0 polipeptido pode, em seguida, ser adicionado ao óleo, a uma temperatura qualquer (por exemplo a do ambiente), que evite efeitos adversos intoleráveis (por exemplo, a desnaturação). Por exemplo a somatotropina bovina tem sido adicionada a um tal óleo, a temperaturas compreendidas entre cerca de 4° e cerca de 125°, sem afectar, de um modo adverso, a actividade biológica. Esta adição do polipeptido, ê de preferência, levada a efeito sob o vácuo, para se evitar a contaminação com a água ou com as bolhas de ar. Uma tal adição ê de um modo desejável, levada a efeito pela adição lenta do polipeptido, finamente dividido, ao óleo, que é

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submetido a uma mistura de elevado cisalhamento, para se pro- {

t

porcionar uma dispersão uniforme das partículas do polipepti- 1 do. E muitas vezes, desejável a redução da dimensão das particulas do polipeptido e ela pode ser levada a efeito, por I exemplo pelo emprego deum moinho de esferas, no qual uma sus- j ι pensão do polipeptido ê misturada com uma quantidade de esfe- ! ras de aço inoxidável, tendo de diâmetro de, por exemplo, !

0,3 a 0,6 cm.

Isto pode ser levado a efeito, vantajosamente, e simultaneamente, com uma tal dispersão, na parte inferior de um recipiente, em que se efectua a mistura de ele^ vado cisalhamento. Isto ê particularmente vantajoso com polipeptidos de carga elevada, que são difíceis de se reduzirem em dimensão a partículas, que tenham um diâmetro médio de partícula, baseado no volume, não superior a cerca de 15 microns j

í (isto ê, 50% do volume das partículas, tendo diâmetros não ; superiores a cerca de 15 microns). 0 emprego de polipeptidos i

de dimensão reduzida de partícula (por exemplo, de um tal diâmetro médio de partícula não superior a cerca de 10, de pre ferencia não superior a cerca de 5 microns) tem-se verificado ser desejável para aumentar a seringabi1 idade das composições deste invento. Laborando-se com um tal moinho de esferas, as partículas do polipeptido podem ser erduzidas, convenientemen te, a um tal diâmetro médio preferido de partícula, não superior e cerca de 5 microns. Em consequência disso, a composição deste invento pode ser recuperada do moinho de esferas, por filtração (sob o vácuo, vantajosamente).

Como foi exposto no precedente, as composições deste invento são proveitosas, atractivamente, para a administração parenteral, por exemplo, por injecção intraperitonal, ou habitualmente de um modo mais desejável, subcutaneamente ou intramuscularmente. A duração do desprendimento prolongado ê aquele periodo de tempo, durante o qual o polipeptido ê libertado ao fluxo exigido para o efeito biologico desejado, tipicamente indicado pela concentração do í polipeptid o no fluxo do sangue em circulação do animal. De- ! pendente do polipeptido especifico e do efeito biológico, o pe-! riodo do desprendimento prolongado ê de um modo desejável pelo menos cerca de 7 dias. Em outros casos, ele pode ser pelo me- j

nos, cerca de 15 dias, ou ainda de modo mais desejável para !

í muitas aplicações pelo menos cerca de 30 dias, ou mesmo pelo ;

| menos cerca de 60 dias ou mais ainda. E assim, de acordo com |

este invento, as composições compreendendo a somatotropina, associada com o zinco, têm-se verificado proporcionar, durante pelo menos, cerca de 7 dias no soro de uma vaca em lact^j ção injectada com uma dose de 2,5 mililitros, uma concentração

j média de somatropina bovina de pelo menos cerca de 12 ng/ml, I J o que se torna altamente vantajoso para fins de aumentar a i produção do leite e/ou a eficiência da conversão da alimentação no leite, no gado vacum. Para se proporcionar uma dose | eficiente da somatotropina bovina, para o tratamento de vacas j leiteiras por exemplo para aumentar a produção do leite, uma composição contendo pelo menos cerca de 300 mg de uma somato-

tropina bovina activa, durante, pelo menos, cerca de 15 dias.

E uma característica importante e atractiva deste invento que a somatotropina, associada ao zinco, se encontra presente, de um modo vantajoso, numa concentração suficientemente elevada (por exemplo, pelo menos cerca de 15%), para permitir o emprego de um volume convenientemente reduzido da composição (por exemplo, cerca de 10 ml ou menos, digamos cerca de 1 e cerca de 3 ml) para facilidade da administração.

Outras substâncias podem, como é evidente, ser adicionadas á composição, com a ressalva de que tais substâncias não inibam, inaceitavelmente, o desprendimento prolongado desejável do polipeptido, em graus eficientes. Por exemplo, pode tornar-se desejável adicionar-se um anti-inflamatório, ou outro aditivo, a uma composição deste invento, para se reduzir, impedir ou neutralizar, os efeitos da reacção de corpos estranhos (por exemplo, não alérgicos). Tais aditivos podem incluir agentes anti-inflamatórios esteróides e/ou não esteróides, que de preferência, se encontrarão presentes, na composição, num grau suficientemente reduzido, para se evitar qualquer efeito orgânico, mas suficien te para ser eficiente na redução da inflamação local.

Preparação de Polipeptídeos, Biologicamente Activos e Associados a Metais

Os polipeptídeos, associados a metais polivalentes, podem ser preparados fazendo reagir o polipeptídeos dissolvidos com os iões de metais não tóxicos (por exemplo, o zinco). De um modo geral, o polipeptídeos, associado a metal, ê preparado adicionando-se o metal, facultativamente na modalidade de um seu sal fracamente solúvel em água, mas geralmente de preferência como um seu sal solúvel em água (por exemplo, o cloreto de zinco), a uma solução em tampão do polipeptídeo, para precipitar o polipeptideo associado com o metal.

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Muitas vezes, os compostos orgâ_ nicos solubi1izantes, por exemplo a ureia, a guanidina ou outros afins, estão incluidos nas soluções, para auxiliar a di_s solução do polipeptideo, especialmente dos polipeptideos que são somente ligeiramente solúveis em água. Em muitos casos, a concentração do composto solubilizante e/ou o pH da solução pode constituir pormenor para criar problemas em mantendo-se uma conformação bioactiva do polipeptideo.

Além de mais, o pH da solução

constitui geralmente, um pormenor embaraçoso para a recuperação do polipeptídeo resultante, associado ao metal, geralmente como um precipitado. Podem existir escalões de pH, para criar problemas, dependentes, por exemplo das propriedades isoelêctricas do polipeptídeo. As temperaturas devem de preferência, ser mantidas baixas, por exemplo, geralmente não superiores â do ambiente, aproximadamente para se evitar a desnaturação.

Dependente da pureza do poli-,

peptídeo a ser utilizado, pode ser desejável a despirogenação e/ou a esterilização. Os pirogênios (por exemplo sa endotoxinas) se s encontrarem presentes, podem ser retiradas, contactando a solução do polipeptídeo, com a resina de troca de iões. A maior parte dos pirogênios liga-se às zonas de carga positiva, por exemplo, numa resina de troca de catiões. Alguns pirogênios ligam-se âs zonas de carga negativa. Em conformidade, uma camada mista de pérolas de resina de troca de iões ê proveitosa para se assegurar a retirada suficiente dos pirogênios. A solução do polipeptídeo pode ser esterilizada, para se retirar os corpos estranhos não esterilizados, tais como as bactérias ou os contaminados livres, de processamentos anteriores, por filtração através de um filtro fino, por exemplo, de malha de 0,2 micron.

-27A solução despirogenada e esterilizada do polipeptideo é, em seguida, posta em contacto com ι uma solução de um metal não tóxico, para se precipitar o polipeptideo associado ao metal, habitualmente formando, desejavelmente, uma suspensão. A proporção da adição do metal afecta a dimensão da partícula do polipeptideo resultante, associado ao metal. A adição do metal pode ser controlada, har monizando a concentração do metal na solução adicionada, o ritmo do fluxo volumétrico e/ou o ritmo da dispersão.

Habitualmente, a suspensão do

polipeptideo, associado ao metal, pode ser diluida, para se reduzir a tendência para se aumentar a dimensão da partícula, J por exemplo, por aglomeração. 0 polipeptideo, associado ao metal, pode, em seguida, ser ercuperado, por múltipla centrifugação e lavagem, para se retirar o excesso do metal e dos aniões, seguida pela 1 iofi1ização.

Os polipeptideos, associados

a um metal monovalente (por exemplo, o sódio ou o potássio), podem ser preparados pela liofilização de uma solução do polipeptideo e do ião do metal.

Preparação de Somatotropinas, Biologicamente activas e Associadas a Metais.

Num exemplo, mais especifico,

do processo acabado de se descrever, uma somatotropina (por exemplo, a bovina) pode ser dissolvida, numa diversidade de soluções protegidas com tampões. De preferência, ela ê dissolvida numa solução aquosa de ureia, protegida com um tampão amino-metano tris (hidroximetilo) (TRIS), ou outro agente tampão adequado. Um limite superior desejável da concentração da ureia ê, habitualmente, cerca de 6M; em alguns casos, a concentração da ureia de cerca de 4,5 ê a preferida. Concen-

trações inferiores da ureia, digamos 3M, ou tão baixas como 2M ou mesmo IM, podem ser empregadas, mas com uma solubilidade inferior da somatotropina.

0 pH da solução da ureia, protegida com tampão, está de preferência, compreendido entre cerca de 7 e cerca de 10,5. Entre estes limites de pH, a recuperação da somatotropina precipitada da solução ê tipicamente, pelo menos, cerca de 60%. De um modo geral, uma recuperação mais elevada (por exemplo, pelo menos 90%) pode ser alcançada com um pH compreendido entre cerca de 9 e cerca de 9,5.

A temperatura da solução, através da precipitação, deve ser suficientemente baixa, para impedir a oligomerização da somatotropina. De um modo geral, tais temperaturas são desejavelmente inferiores a cerca de 10° e, com mais preferência, inferiores a cerca de 5°.

Para se produzir um polipeptideo associado a um metanol monovalente, a solução (despirogenada e esterilizada, como se disse no precedente) ê tratada pela diafiltração (ou diálise) para se trocar a ureia com uma solução do bicarbonato do metal (por exemplo, uma solução de 25 mM de bicarbonato de sódio, pH 9,5), ou de um outro sal adequado. Múltiplas trocas, com a solução dQ bicarbonato, são de preferência, conduzidas, para se assegurar a troca completa da ureia. A solução ê, em seguida, tratada por uma ulterior diafiltração com água, para se retirar o excesso do bicarbonato de sódio, o que é indicado pelo inicio da precipitação de MBS. A recuperação de sódio-somatotrpina pela liofilização, produz um pó do sal de sódio da somatotropina.

Para se produzir um polipeptideo associado a um metal polivalente, a solução (despirogenada e esterilizada, como se disse no precedente) é posta em contacto com um sal polivalente (por exemplo, o zinco). 0 emprego de 1M de uma solução do cloreto de zinco tem-se verificado produzir zinco-somatotropina precipitada aceitável, a partir de uma solução de 4,5M de ureia da somatotropina, não obstante as concentrações mais elevadas ou mais baixas do cloreto poderem ser utilizadas. A solução do cloreto de zinco é, de preferência, adicionada lentamente, por exemplo, como por titulação, enquanto se agita a solução da somatotropina.

à medida que se continua a adição da solução do cloreto de zinco, a solução da somatotropina atinge, primeiramente, uma cor quase branca, e, em seguida, uma cor branca pérola, à medida que a quantidade estequiomêtrica do cloreto de zinco se adiciona. Por exemplo, adicionando-se 4 ml de 1M de cloreto de zinco, a 400 ml de uma solução de pH 9,5 contendo cerca de 20 mg de somatotropina por ml e 0,09M de TRIS em 4,5M de ureia, forma-se uma suspensão de zinco-somatotropina, branca pérola, uniforme. Pode-se adicionar um suplemento de cloreto de zinco (por exemplo, atê cerca de 10 ml de uma solução de 1M de cloreto

ide zinco) para se assegurar a precipitação completa.

A suspensão ê em seguida, diluída, de um modo desejável, para se reduzir a tendência para aumentar a dimensão da partícula do precipitado. Tem-se verificado que a diluição com atê cerca de 3,5 volumes de água com atê cerca de 1M de ureia ê satisfatória, para conservar as par ticulas de zincosomatotropina sem se aglomerarem. A recuperação, por diafiltração (ou por centrifugação múltipla e lavagem) para se retirar a ureia, TRIS e iões de zinco e de cloro, seguida pela liofilização, produz um pó, que tem as dimensões das partículas, geralmente, inferiores a valores compreendiΪdos entre 10 e 20 microns.

ΙΤ·!

^affiíaaE3^30Quando a somatotropina ê bovina, as partículas contêm tipicamente, cerca de 0,3 a cerca de 1% de zinco (entre cerca de 1 a 4 moléculas de zinco, por molécula de somatotropina). Se o grau da adição do zinco for aumentado, quantidades maiores se encontram no precipitado, por exemplo atê 4 a 5%. Umas tais quantidades mais elevadas podem ser devidas a uma ligação suplementar do zinco a zonas activas de ácidos na somatotropina, por exemplo a resíduos suplementares do ácido aspârtico e/ou do ácido glutâmico, ou possivelmente a resíduos de histidina, ou ao término de carboxi do polipeptídeo. Não se pretende que esta teoria de ligação ao zinco seja considerada como limite ao âmbito deste invento. De um modo geral, a precipitação, empregando-se uma quantidade essencialmente mínima de zinco, é considerada a preferida.

A Memória Descritiva, que se segue, ê proporcionada para tornar claros os modos de realização

í e os aspectos, específicos, deste invento, mas não implica ji qualquer limitação do âmbito do invento.

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-31Exemplo 1

Este exemplo torna clara a preparação de uma somatotropina bovina, associada ao zinco, deste invento.

A somatotropina bovina, terminada em N, da metionina (MBS) foi preparada como se encontra descrito por Seeburg e outro em Efficient Bacterial Expression of Bovine and Porcina Growth Hormone, 2(1) DNA 37-45 (1983) incorporada, nesta Memória Descritiva a titulo de referência. A somatotropina foi recuperada, em modalidade útil, depurando as células bacterianas e, em seguida, separando a somatotropina dos detritos das células bacterianas.

Num processo de recuperação da MBS, as bactérias foram mortas por tratamento com o ácido sulfurico a 50%, suficiente para baixar o pH do caldo da fermentação atê 1,7. 0 caldo foi neutralizado com NaOH e

foi centrifugado, deixando uma pasta de células, que foi suspensa em ureia, foi homogeneizada, foi arrefecida atê cerca de 4°C (aquela temperatura foi mantida até que baixasse a citada 1iofilização da MBS), foi centrifugada βίοι lavada por três vezes, foi dissolvida em hidrocloreto de guanidina (7M) foi centrifugada para se retirar as substâncias insolúveis, foi filtrada, foi passada através de uma coluna de Sephadex G25, em que a guanidina foi trocada pela ureia, foi filtrada e, em seguida, foi passada através de uma coluna de troca de iões DE52. 0 volume do

efluente foi reduzido cerca de 30 vezes, pela ultrafiltração de fibra oca. A solução concentrada foi passada através de uma coluna de cromatograf ia de Sephadex G 75, e por uma outra fase de redução de volume da fibra oca, e, em seguj^ da, foi dialisada, para se trocar a ureia primeiramente

SsiCErjKx:

por uma solução de NaHCOg, e, em seguida, por água destilada para se precipitar a MBS. 0 precipitado foi liofilizado, deixando um sólido branco (ligeiramente solúvel em agua), contendo um polipeptideo (MBS) tendo a sequência do amino ácido de NH₂-met-fe(1)-pro(2)...leu(126)... fe(190)-C00H, expressa na publicação mencionada no precedente, por Seeburg e outro.

Uma tal MBS foi dissolvida numa ureia de 4,5M, e numa solução de 0,09M de TRIS, a 21,5 mg de MBS por mililitro, a 4° e pH 9,5. A solução de MBS foi despirogenada, misturando-se com 0,2 grama de contas de resina mista de troca de iões aniónicos/catiónicos (Biorad AG-501X8) por cada ml de solução da MBS esterilizada. A mistura foi agitada, durante cerca de 10 minutos, a 4° e, em seguida, foi filtrada com um filtro de nilon de 1 micron para se retirar as pérolas, contendo os pirogenios adsorvidos.

A MBS despirogenada foi esterilizada, fazendo passar a solução através de um filtro de cápsula pHs sada, esterilizado por radiação tendo uma malha de 0,2 micron, para se retirarem os corpos estranhos, não esterilizados, tais como as bactérias ou os corpos contaminados soltos, de processamento anteriores.

A MBS foi transformada num sal de zinco (ZnMBS), adicionando-se IM de cloreto de zinco, enquanto se agitava a solução de MBS despirogenada. A ZnMBS precipitada continha cerca de 1% de zinco. A solução contendo os solidos de ZnMBS, foi, em seguida, diluída com água despirogenada e esterilizada, para uma concentração de ureia de 1M.

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A ZnMBS foi recuperada por centrifugação, a lO.OOOxg, durante 30 rninutos, enquanto se mantinha a solução a 4°. A ZnMBS foi suspensa, em agua despirogenada e esteri1izada, a 50 mg de ZnMBS/ml, empregando-se uma mistura de cisalhamento elevada. A ZnMNS foi nova, mente recuperada, centrifugando-se a lO.OOOxg, durante 30 minutos, foi novamente suspensa em água despirogenada e esterilizada, a 50 mg de ZnMBS/ml, empregando-se uma mistura de cisalhamento elevado, e, em seguida, foi liofilizada, para se produzir um pó branco, com penugem, de ZnMBS esteri 1 izada.

Exemplo IA

Este exemplo torna clara uma preparação de alternativa da ZnMBS.

Uma solução despirogenada e esterilizada de 21 mg da MBS, por ml, em 4,5M de ureia, 0,05M de TRIS, 10° e pH de 8,8, foi tornada a circular, através de um reservatório de manutenção , por uma bomba de deslocação positiva. Adicionou-se IM de Cloreto de zinco ao dijs positivo de sucção, da bomba, até que a concentração da solução fosse 0,01M de cloreto de zinco, resultando numa precipitação de ZnMBS. Adicionou-se a água de diluição, para se proporcionar uma concentração de 10 mg de MBS, por ml, resultando numa ulterior precipitação de ZnMBS. A suspensão resultante da ZnMBS foi, em seguida, circulada, a 25°, através de uma membrana de fibra oca de diafiltração

II

-34tendo poros que deixam passar moléculas até 100,000MW, até que a concentração atingisse 40 mg de MBS, por ml; em seguida, adicionou-se a agua, para harmonizar o grau do filtrado da membrana, até que essencialmente todo o zinco, ureia e TRIS fosse retirado da suspensão. Interrompeu-se a adição da água, para se permitir que a conceii tração atingisse cerca de 80 mg de MBS, por ml. A suspensão concentrada foi, em seguida, liofilizada, produzindo-se um pó branco e seco de ZnMBS, tendo as dimensões das partículas da ordem de 0,5 a 11 microns.

Exemplo IB

Este exemplo torna clara a preparação de uma somatotropina bovina, associada ao sódio.

Uma solução despirogenada e esterilizada de 21,5 mg, por ml, em 4,5M de ureia, e 0,05M de

TRIS, 4° e pH de 9,5 foi dialisada, para trocar, primeiramente, a ureia por uma solução de NaHCOg e, em seguida,

por água destilada. A troca de agua interrompeu-se, quando a MBS comaçou a precipitar-se. A solução foi, em seguida, filtrada, com um filtro de 0,2 micron, para se retirar a MBS precipitada, e foi liofilizada, dando origem a um sal de sodio (NaMBS) que pode ser empregado em composições deste invento.

Exemplo 2

Este exemplo torna clara a preparação de uma composição deste invento, a qual contém uma so matotropina associada ao zinco.

Derramou-se um volume de óleo de gergelim (Grau NF de Fisher), num balão de fundo redondo e com três tubuladuras. Um agente de anti-hidratação (AIMS), a 5% do total de ALMS e do óleo de gergelim, foi adicionado. 0 balão foi colocado num banho de óleo, a 155°, e foi agitado, para dispensar o AIMS, tão rapidamente quão possível.

Continuou-se a agitação, durante 20 minutos, durante os quais o AIMS se dissolveu completamente no óleo. Retirou-se o balão do banho, foi mantido sob o vácuo e foi deixado a arrefecer-se até 25°. Ao arrefecer-se,

j a solução transformou-se um gel espesso. 0 gel arrefecido í foi carregado num moinho de esferas, tendo um agitador de

cisalhamento de grau elevado, numa base de esferas de aço inoxidável tendo diâmetros de 1/8, 3/6 e 1/4 de polegada

| (0,32, 0,48 e 0,64 centímetro). Aplicou-se o vácuo ao moinho j e o pó de ZnMBS (preparado como ficou descrito no Exemplo 1)

I

foi adicionado, lentamente, servindo-se de um alimentador I sem-fim até que a composição contivesse 40% de ZnMBS (proporI ção de 13,3, em peso, de ZnMBS para AIMS). Continuou-se a

agitação, durante 6 horas, durante as quais o diâmetro médio do volume das partículas e ZnMBS foi reduzido de 20 microns para 5 microns. A suspensão resultante, essencialmente não aquosa, do óleo gelado de ZnMBS, foi separada das esferas de aço, por filtração.

-36Exemplo 3

Este exemplo torna claro um emprego eficiente de uma composição deste invento, no desprendimento prolongado de um polipeptideo, isto ê, de uma somatotropina bovina, para aumentar a produção do leite, no gado

vacum leiteiro, em lactação.

Uma composição essencialmente

não aquosa, foi preparada, como no Exemplo 2, dissolvendo-se 5% de A1MS, em óleo de gergelim, aquecido a 155°C. 0 óleo

foi arrefecido, para se formar um óleo gelado. A ZnMBS foi dispersa e foi reduzida à farinha no óleo atê que a composição viesse a conter 32% de ZnMBS, numa parcela contínua do óleo (porporção de 9,4 em peso, de ZnMBS para A1MS). As seringas, equipadas com a capacidade de 18 e com agulhas compridas de 1,5 polegada (3,8 cm), foram carregadas com 2,54 gramas (2,5 ml) da composição, para proporcionar uma dose contendo 805 mg de ZnMBS. A composição tinha uma seringabilidade de 0,36 ml/seg. As composições de controlo de 5% de

’ A1MS, em óleo de gergelim, sem o polipeptideo, foram também

ί

i preparadas e carregadas com 2,4 gramas, em seringas idênticas .

As composições foram injectadas

em 23 vacas leiteiras da estirpe de Holstein, no segundo ou no terceiro trimestre da sua segunda (ou subsequente) lactação.

As vacas foram ordenadas ao acaso, em 4 grupos de 5 ou de 6. jDois grupos foram injectados intramuscularmente (IM), na região gluteal, um com a composição contendo ZnMBS e outro (um grupo de controlo) com a composição controlo. De um modo semelhante

jdois outros grupos foram injectados subcutaneamente (SQ), na iregião superescapular, com a composição contendo ZnMBS ou com la composição contendo ZnMBS ou com a composição controlo.

Cumulativamente, os meios menos substanciais, para uma produção média de leite (covariavelmente ajustados para as diferenças nos rendimentos do leite prê-tratado) , estão apresentados na Tabela 1, em que a produção do leite é expressa em quilogramas de leite, por dia. Como se encontra representado na Tabela 1, uma única injecção IM ou SQ, de uma composição convenientemente administrada, deste invento, produz um aperfeiçoamento rápido e prolongado na produção do leite, a niveis muito elevados de importância estatística.

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As amostras de sangue analisadas para pesquisa de somatotropina bovina, que sem a administra ção de acordo com este invento, se encontra, normalmente, presente, nos sistemas circulatórios do gado vacum. As anãlises representativas, pela radioimunoanâlise ("RIA") estão apresentadas na Tabela 2, em que as concentrações da somatotropina bovina, no soro do sangue,estão expressas em nanogramas, por mililitro (ng/ml).

Tabela 2

A Concentração Média do Plasma,da Somatotropina Bovina, ng/ml’

Dias após a injecção

Intramuscular Controlo ZnMBS

Subcutânea

Controlo

ZnMBS

0

1

2

3

4

5

6 7 9

11

13

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10,1 12,0 18,2 21,2 21,3 18 2

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13.8 11,2 10,6

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4.3 4,0 4 5

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3.9

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4.4 4 3

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16.6 17,5 15,7 11 7 12,0 10 0

9,5 9,0 8 5 7.4 ⁶’7

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Exemplo 4

Este exemplo torna clara a eficácia das composições deste invento, para o desprendimento prolongado de um polipeptideo (MBS), em animais, empregando-se uma diversidade de substancias, em tais composições.

Neste exemplo, as composições de ZnMBS foram formuladas essencialmente como foram divulgadas no Exemplo 3, empregando-se combinações dos constituintes seguintes :

Oleo biocompativel : Semente de gergelim ou

amendoim.

Agente de anti-hidratação: A1MS a 3% ou 5% de óleo com A1MS.

Carga de polipeptideo: ZnMBS, a 20%, a 30% ou a 40% da composição total.

A A1MS foi dispersa no óleo. A

i

[dispersão, após ter sido aquecida e mantida a 155°, durante 115 minutos, foi deixada a arrefecer-se atê 25°, formando-se lum óleo gelado. Adicionou-se o ZnMBS e ela foi dispersa por um misturador de cisalhamento elevado (homogeneizador de Politron), formando-se uma suspensão de ZnMBS, em óleo gelado,

A suspensão foi carregado em seringas de tuberculina, tendo agulhas hipodêrmicas de calibre 18.

Por injecção subcutânea, na região superescapular dorsal, as composições, relacionadas na Tabela 3, foram administradas a 16 grupos de 8 ratazanas da estirpe de Sprague-Dawley imunossupirmidas (IFS-D).

Λ

41Tabela 3

	Volume	da		Proporção.em
	Dose,	em	Ja) ZnMBS,%	peso de ZnMBS/
ipo	microlitros óleo A1MS	/A1MS
1	200	gergelim 3	nenhum
2	200	gergelim 3	20	8,3
3	130	• gergelim 3	30	14,3,
4	100	gergelim 3	40	. 22.2
5	200	gergelim 5	nenhum	-
6	200	gergelim 5	20	5.0
7	130	gergelim 5	30	8.6
8	100	gergelim 5	40	13,3
9	200	amendoim 3	nenhum	w
10	200	amendoim 3	20	8,3
11	130	amendoim 3	30	14.3
12	100	amendoim 3	40	22.2 >
13	200	amendoim 5	nenhum	an
14	200	amendoim 5	20	5,0
15	130	amendoim 5	30	8.6
16	100	amendoim 5	40	13,3 ·

(a) Baseado no peso do óleo com A1MS,

As amostras de sangue foram analisadas por RIA, para pesquisa da somatotropina bovina. As análises, na Tabela 4, são em ng/ml, do plasma do sangue.

Tais graus do plasma estão apresentados na Tabela 4, para amostras de sangue, tiradas antes da injecção, no dia 0 (0 dia da injecção). Algumas medidas de preferência, das ratazanas, nos Exemplos 4 a 7, são mais elevadas do que algumas medidas de referência e dos polipeptideos desprendidos, das vacas, no Exemplo 4. Isto é devido, parcialmente, âs diferenças das interespêcies, nos graus normais da somatotropina, e parcialmente, devido a que a RIA no Exemplo 3, foi mais precisa .

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indicados anteriormente).

.1,

-44Exemplo 5

Este exemplo torna clara a eficiência das composições deste invento, para o desprendimento prolongado de um polipeptideo (MBS), empregando-se outros sais de ácidos gordos de aluminio, como agentes de anti-hidratação. Nestas composições, o monolaurato de aluminio (A1ML) e o monopalmitato de alumínio (A1MP) foram empregados como agentes de anti-hidratação, com os óleos de gergelim e de amendoim.

Neste exemplo, os óleos gelados, contendo 3% de A1ML ou de A1MP, foram preparados essencialmente como no Exemplo 4. ZnMBS foi suspensa, nos óleos gelados, a uma concentração de 30% da composição total (proporção de 14,3, em peso, de ZnMBS para A1ML ou A1MP). Cada uma das composições foi injectada num grupo de 8 ratazanas

IFS-D, às dosagens indicadas na Tabela 5.

í

| Tabela 5

'! Composições Injectadas

g Grupo Volume da Dose, em microlitros Oleo Agente de Anti!{ _ _ _ hidratação

17	130	Gergelim	A1ML
18	130	Gergelim	A1MP
19	130	Amendoim	A1ML
20	130	Amendoim	A1MP

As análises das amostras de sangue, tiradas das ratazanas, nos dias indicados depois da injecção, traduziram-se nas concentrações da somatotropina bovina indicadas na Tabela 6, em que as leituras, no dia 0 são a linha de referência para a análise.

-45TABELA 6

As Concentrações Médias da Somatotropina Bovina, no Plasma,

em ng/ml.

Dias Após a Injecção

Grupo	0	1_	3	7	il	li
17	9	431	143	172	49	30
18	10	632	229	277	58	33
19	11	421	162	198	32	28
20	9	492	164	210	17	35

EXEMPLO 6.

Este exemplo torna clara a eficiência das composições deste invento, para o desprendimento prolongado de um polipéptideo (MBS), empregando-se o azeite ou o óleo de milho.

Neste exemplo, os óleos gelaios foram preparados, essencialmente, como no Exemplo 4, empregando-se 3% de A1MS, baseado no A1MS com o óleo. As suspensões de 30% ou de 40% de ZnMBS foram injectadas em dois grupos de 8 ratazanas da estirpe IFS-D, às dosagens indicados na Tabela 7.

TABELA 7

Composições Injectadas.

Grupo Volume da dose,em microlitros Oleo ZnMBS,% Proporção,em peso, de ZnMBS/ALMS

21 100 Azeite 40 22,2

22 130 Milho 30 14,3

As análises das amostras de sangue, tiradas das ratazanas, nos dias indicados, após a injecção, traduziram-se

-46nas concentrações da somatotropina bovina, expressas na Tabela 8, em que as leituras, no dia 0, são a linha de referência para a análise.

TABELA 8

As concentrações Médias da Somatotropina Bovina, no Plasma, em ng/ml.

		Dias	Após a	Injecção
Grupo	0		4	i_i_	14	25
21	7	996	314	174	98	36
22	7	1314	444	158	98	35
			EXEMPLO	7
		Este ©emplo ilustra as composições	deste

vento, compreendendo cerca de 10% dos polipêptidos, MBS e

ZnMBS, em óleo de amendoim. Este exemplo torna ainda claro que o efeito prolongado do polipéptideo pode ser aumentado, empregando-se o polipéptideo, associado a um metal, e com o emprego de um agente de anti-hidratação. As composições, como indicadas na Tabela 9, para injecção, foram preparadas, essencialmente, como no Exemplo 4.

WH?

— 47—

TABELA 9

Composições Injectadas

Grupo Polipéptideo Carga do Polipéptideo,em % Oleo A1MS ,erri(|

30	MBS	10	amendoim	-
31	ZnMBS	10	amendoim	-
32	MBS	10	amendoim	1
33	ZnMBS	10	amendoim	1
(a)	Baseado no peso do óleo	com A1MS.
	Cada uma das	composições foi	injectada,	sub

cutâneamente, num grupo de 8 ratazanas, da estirpe IFS-D, a uma dosagem de 300 microlitros. A análise das amostras de sangue, tiradas das ratazanas, nos dias indicados, após a injecçâo, revelou as concentrações do plasma, como se encontram expressas na Tabela 10, em que as leituras no dia 0 são a linha de referência para a análise.

í TABELA 10

As Concentrações	Médias	da	Somatotropina Bovina,	no Plasma,
em ng/ml
		Dias	Após	a Injecçâo
Grupo	0	1	3	5	7	11	14
				—	“		—
30	14	1350	375	145	75	50	20
31	15	1800	310	240	200	40	20
32	12	1200	250	123	64	35	21
33	18	620	350	330	280	175	125

1

48A comparação dos resultados, para os Grupos 30 e 31, torna claro o aumento do desprendimento prolongado de MBS, durante, pelo menos, 7 dias, pelo emprego de um metal polivalente associado. A comparação dos resultados, para os grupos 32 e 33, torna claro o aumento do desprendimento prolongado de MBS, pelo emprego de um agente de anti-hidratação, quando o MBS se encontra associado com um tal metal polivalente.

EXEMPLO 8

Este exemplo torna claras as composições deste invento, contendo 10% de somatotropina bovina, sem a presença de um agente de anti-hidratação em cada um dos óleos, que se seguem: gergelim, amendoim, milho, oliveira, açafrão bastardo, semente de algodão, palma, semente de colza e soja. Volumes separados de cada um dos Óleos foram

I mantidos a cada uma das seguintes temperaturas: 4², 25², j 50^s, 75², 100⁹ e 125². A ZnMBS foi dispersa e foi moída, em ! cada um dos óleos, como no Exemplo 2, até que a sua concenj tração atingisse 10%. Continuou-se a moagem, até que a

somatotropina atingisse um diâmetro médio da partícula não superior a 15 microns. Cada composição tinha uma seringabilidade superior a 0,1 ml/seg.

EXEMPLO 9

Este exemplo torna claras as composições deste invento, preparadas como no Exemplo 8, excepto que, antes de se adicionar a somatotropina, A1MS é dispersa em cada óleo, nuam concentração de 5%, baseada no óleo com A1MS. Estas composições tinham uma sringabi1 idade superior

a 0,1 ml/seg.

í

I

-49EXEMPLO 10

Este exemplo ilustra as composições deste invento, preparadas como no Exemplo 8, excepto que a adição da somatotropina se continua, até que as composições contenham 40% de somatotropina bovina. A dispersão e a moagem continuaram-se, atê que a somatotropina alcançasse um diâmetro de partícula não superior a 15 mícrons. Estas composições tinham uma seringabi1 idade superior a 0,03 ml/seg.

EXEMPLO 11

Este exemplo ilustra as composições deste invento, preparadas como no Exemplo 10, excepto que, antes de adicionar a somatotropina, A1MS ê dispersa em cada óleo, numa concentração de 5%, baseada no óleo com A1MS. Estas composições tinham uma seringabilidade superior a 0,03 ml/seg.

EXEMPLO 12

Este exemplo ilustra as composições deste invento, contendo 10% de somatotropina bovina, em cada um dos Óleos, que se seguem: gergelim, milho, oliveira, açafrão bastardo, semente de algodão, palma, semente de colza e soja. Cada óleo foi aquecido até 160° e foi agitado para se facilitar a dissolução de A1MS. Quando 1% de A1MS se encontrasse dissolvido, cada óleo foi arrefecido até 25°. A ZnMBS foi dispersa e foi moída no óleo arrefecido, como no Exemplo 2, até que a sua concentração atingisse 10%, e o seu diâmetro médio da partícula foi reduzido até que não fosse superior a 15 mícrons. Cada composição tinha uma seringabi1 idade superior a 0,1 ml/seg.

.--50

EXEMPLO 13

Este exemplo ilustra as composições deste invento, preparadas como no Exemplo 12, excepto que a adição da somatotropina se continuou atê que cada composição contivesse 40% de somatotropina. As composições foram moídas, como no Exemplo 2, até que a somatotropina alcançasse um diâmetro médio de partícula não superior a 15 mícrons. Cada composição tinha uma seringabi1 idade superior a 0,03 ml/seg.

EXEMPLO 14

Este exemplo ilustra as composições deste invento, contendo 10% de somatotropina bovina, em cada um dos Óleos, que se seguem, tendo neles dissolvido A1MS, numa concentração de 5%, baseada no óleo com A1MS: gergelim, amendoim, milho, açafrão bastardo, semente de algodão, palma, semente de colza e soja. Cada óleo foi aquecido até 160o e foi agitado, para se facilitar a dissolução do A1MS. Quando a A1MS se tivesse toda dissolvida, cada óleo foi arrefecido até 25°. A ZnMBS foi, em seguida, dispersa e moída, no óleo arrefecido, como no Exemplo 2, até que a sua concentração nele fosse 10%. A dispersão foi ainda moída, até que a somatotropina atingisse um diâmetro médio de partícula não superior a 15 mícrons. Cada composição tinha uma seringabilidade superior a 0,1 ml/seg.

ί(

EXEMPLO 15

Neste exemplo, as composições deste invento, contendo 42% de uma somatotropina bovina, foram preparadas, continuando-se a adição da somatotropina a composições do Exemplo 14, até que cada composição contivesse 42% de somatotropina. Ao mesmo tempo que ainda se mantinha o óleo como uma parcela continua, a somatotropina foi dispersa e foi moida, como no Exemplo 2, até que ela atingisse um diâmetro médio de partícula não maior do que 15 microns. Cada composição tinha uma seringabi1 idade maior do que 0,03 ml/seg.

EXEMPLO 16

Este exemplo ilustra as composições deste invento, contendo 20% de uma somatotropina bovina, em óleos idênticos aos empregados no Exemplo 9, mas que um dos agentes de anti-hidratação seguintes substitui o A1MS:

í

j diestearato ou triestearato de alumínio; mono-, di- ou trií palmitato de alumínio, ou mono-, di ou trilaurato de alumínio; í mono- ou diestearato de magnésio, mono- ou dilaurato de magnésio, mono- ou dipalmitato de magnésio; e mono- ou diestearato de cálcio, mono- ou dilaurato de cálcio, ou mono- ou dipalmitato de cálcio. 0 agente de anti-hidratação foi adicionado ao óleo, antes da adição da somatotropina. A ZnMBS foi adicio nada como no Exemplo 2, atê que a sua concentração atingisse 20%. A dispersão e a moagem, continuaram-se atê que a somatotropina atingisse um diâmetro médio de partícula não maior do que 15 microns. Cada composição tinha uma seringabi1 idade maior do que 0,03 ml/seg.

aí

-52EXEMPLO 17

Este exemplo ilustra a composição deste invento, contendo outras concentrações de uma somatotro. pinas bivina, em óleos idênticos ao do Exemplo 20, em que os óleos da espécie empregados no Exemplo 16, excepto que a adição da somatotropina se continuou, atê que a sua concentração atingisse 25%, 30% ou 35%. A dispersão e a moagem continuaram-se atê que a somatotropina atingisse um diâmetro médio de partícula não maior do que 15 microns. Cada composição tinha uma seringabi1 idade maior do que 0,03 ml/seg.

EXEMPLO 18

Obtiveram-se resultados essencialmente aos mesmos que os dos Exemplos 8 a 17 , quando a somatctropina bivina empregada es encontrava numa modalidade quimicamente não combinada, ou quando ela se encontrava associada quimicamente com os catiões de sódio ou de potássio.

ι EXEMPLO 19

Obtiberam-se resultados, essenjcialmente os mesmos que os dos Exemplos 8 a 18, quando se empregaram outras somatotropinas bovinas, por exemplo, aquelas que têm sequências amino á.cidas, tais como as que se seguem :

NH₂-met-phe(l)-pro(2)...,val(126)...,phe(190)-COOH NH₂-ala-phe(l)-pro(2)....val(l26)....phe(I90)-C00H NH₂-ala-phe(l)-pro(2)....leu(126)....phe(190)-C00H

NH₂-phe(l)-pro(2)....leu(126)_____phe(190)-C00H

NH₂-phe(l)-pro(2)....val(126)....phe(190)-COOH

NH₂-met-asp-glu-phe(l)-pro(2)....Ieu(l26)....phe(190)-C00H NH₂-met-asp-glu-phe(l)-pro(2)....val(126)....phe(190)-C00H

NH₂-met(4)....leu(126).,..phe(190)-C0OH NH₂-met(4)-----val(126)....phe(190)-CO0H

EXEMPLOS 20 a 30

Quando uma somatotropina porcina, substitui a somatotropina bovina, nos processos dos Exemplos 8 a 18, os resultados são essencialmente os mesmos, devido â semelhança da somatotropina bovina e da somatotropina porcina.

Não obstante terem sido descrito modos de realização específicos do invento, t'orna-se evidente j aos peritos na técnica, que diversas alterações suas poderão ser feitas, sem se afastarem no verdadeiro espirito e do campo da acção do invento. Em conformidade, pretende-se que as reivindicações que se seguem, cubram todas as tais alterações, no âmbito do todo o conceito inventivo.

ί.

54

Claims (33)

1. REIVINDICAÇÕES

   l^â. - Processo para a preparação de uma composição, substancialmente não aquosa, caracterizado por se incluir na referida composição, pelo menos, cerca de 10%, em peso, de um polipeptideo, biologicamente activo, e, como fase contínua da referida composição, um óleo biocompativel.
2. 2^â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polipeptideo ser ligeiramente solúvel em água.
3. 3^â. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o polipeptideo ser uma somatotropina.
4. 4^â. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o polipeptideo estar associado, quimicamente a um metal não tóxico.
5. 5^â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se incluir, na referida composição, pelo menos cerca de 15%, em peso, de uma somatotropina bovina.

   i.

   -55δ³. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se incluir na referida composição pelo menos cerca de 1%, em peso, de um agente de anti-hidratação, não tóxico, encontrando-se o referido polipeptideo presente, na referida composição, numa proporção, em peso, em relação ao referido agente de anti-hidratação, de pelo menos cerca de 1.
6. 7^â. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o agente de anti-hidratação, ser predominantemente, um composto ácido gordo ^C8"^C22
7. 8⁵. - Processo de acordo com a rej^ vindicação 6, caracterizado por o polipeptideo ser uma somatotropina.
8. 9^â. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a somatotropina estar associada, quimicamente a um metal polivalente, não tóxico.
9. 10^â. - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por se preparar uma composição tendo uma seringabi1 idade de, pelo menos, cerca de 0,03 mililitro por segundo.

   ll^â. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o polipeptideo ser uma somatotropina bovina.
10. 12^â. - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o agente de anti-hidratação ser, predominantemente, um sal de alumínio de ácido gordo Cg-C2₂13^â. - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por a somatotropina se encontrar presente, predominantemente na forma de um sal de zinco.
11. 14^ã. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polipeptídeo se encontrar presente, predominantemente, na forma de um sal de um metal não tóxico.
12. 15^â. - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o polipeptídeo ser ligeiramente solúvel em agua.
13. 16^â. - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o polipeptídeo ser uma somatotropina.
14. 17§. _ Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por 0 metal ser polivalente.

    -5718^â. - Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por se incluir na referida composição pelo menos cerca de 15%, em peso, de um sal de zinco de uma somatotropina.
15. 19^â. - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por a soma totropina ser bovina.
16. 20^â. - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por se preparar uma composição qua quando injectada intramuscularmente ou subcutaneamente numa vaca em lactação, numa dose de 2,5 mililitros, mantêm na referida vaca, uma concentração média de plasma desomatotropina de, pelo menos, cerca de 12 nanogramas, por mililitro, durante, pelo menos, cerca de 7 dias.
17. 21^â. - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por o sal ter um diâmetro médio de voluma de partícula não superior a cerca de 5 microns.
18. 22^â. - Processo para a preparação de uma dose unitária de uma composição, preparada de acordo com a reivindicação 17, caracterizada por se incluir na referida dose unitária pelo menos cerca de 300 miligramas de somatotropina.
19. 23³. - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por se incluir na referida composição, um composto ácido gordo ^C8“^C22’ numa quantidade eficaz para retardar a hidratação da referida composição.
20. 24^â. - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por se incluir na referida composição pelo menos cerca de 15% ern peso, de uma somatotria pina bovina.

    -5825^â. - Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por a somatotropina se encontrar presenta, predominantemente, na forma de um sal de zinco, de sodio ou de potássio.
21. 26^â. - Processo para se alcançar a libertação prolongada de um polipeptideo biologicamente activo, no sistema circulatório de um animal, caracterizado por se injectar um animal, com uma composição preparada, de acordo com a reivindicação 1, contendo 300 mg de somatotropina associada a zinco, de modo a que o nivel apreciável de somatotropina bovina activa se mantenha pelo menos durante 15 dias.
22. 27a. - Processo para a preparação de uma composição, essencialmente não aquosa, caracterizado por se incluir na referida composição entre cerca de 15% e cerca de 40%, em peso, de uma somatotropina bovina, associada quimicamente a zinco, entre cerca de 2% e cerca de

    5%, em peso, de um mono- ou de um doestearato de alumínio

    e, como fase continua da referida composição, um óleo vegetal biocompativel, tendo a referida somatotropina um diâmetro médio de volume de partícula não superior a cerca de 5 micron e encontrando-se presente numa proporção, em peso, em relação ao referido estearato, de pelo menos cerca de 3.

    283. _ Processo caracterizado por se associar quimicamente uma somatotropina a um metal polivalente não tóxico.

    293. - Processo de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por 0 referido metal não estar associado quimicamente, numa proporção substancial, com quaisquer outros aniões que formem sais, tendo uma solubilidade reduzida em água, com 0 referido metal.

    1.

    59reivindicação 28, predominantemente
23. 30^â. - Processo de acordo com a caracterizado por o referido metal ser zinco.
24. 31^â. - Processo de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por a somatotropina ser associado quimicamente com cerca de 0,3% a cerca de 2% de zinco, em peso, da referida somatotropina.
25. 32^â. - Processo de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por a referida somatotropina ser bovina.
26. 33^â. - Processo caracterizado

    por compreender a precipitação da somatotropina, numa solução aquosa por adição à referida solução de um sal solúvel em agua de um metal polivalente não tóxico.
27. 34^â. - Processo de acordo com a reivindicação 33, caracterizado por o metal ser zinco.
28. 35^â. - Processo de acordo com a reivindicação 34, caracterizado por a somatotropina ser bov^ na.
29. 36^â. - Processo de acordo com a reivindicação 35, caracterizado por o referido sal ser cloreto de zinco.
30. 37^â. - Processo para a preparação de uma composição de somatotropina não aquosa, caracterizado por compreender a dispersão de partículas finamente

    i

    divididas e discretas de somatotropina, num óleo biocompativel, em proporções tais que o óleo forma uma fase contínua da dispersão resultante, e a referida dispersão contém, pelo menos, cerca de 10%, em peso, da referida somatotropina, e sob condições tais que a dispersão resultante ê essencialmente não aquosa, e a somatotropina, na dispersão resultante, tem um diâmetro médio de partícula não superior a cerca de 15 micron, sendo a referida dispersão levada a efeito a temperaturas compatíveis com a actividade biologica desejada da somatotropina.
31. 38^â. - Processo de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por um agente cb anti-hidratação se encontrar presente no referido óleo, numa gama de cer. ca de 1% a cerca de 5%, em peso, do óleo e agente de anti-hidratação, compreendendo o referido agente de anti-hidratação um sal metálico de um ácido gordo, tendo de 8 a 22 átomos de carbono, sendo o referido metal seleccionado do grupo constituído por alumínio, cálcio e magnésio.
32. 39³. - Processo de acordo com a reivindicação 38, caracterizado por o referido óleo ser seleccionado do grupo constituído por óleo de milho, óleo de amendoim, óleo de gergelim, óleo de oliveira, óleo de palma, Óleo de açafrão bastardo, Óleo de soja, oleo de semente de algodão, óleo de semente de colza e suas misturas, e por o ácido gordo referido ser seleccionado do grupo constituído pelo ácido esteárico, ácido palmitico, ácido laúrico e suas misturas.

    1

    -6140^â. - Processo de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por a dispersão ser levada a efeito a uma temperatura compreendida entre cerca de 4° e cerca de 125°C.
33. 41^â. - Processo de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por a somatotropina referida ser bovina ou porcina.