PL154068B1 - The method of peptide derivative manufacture - Google Patents

Description

RZECZPOSPOLITA OPIS PATENTOWY 154 ©6

POLSKA

Patent dodatkowy do patentu nr Zgłoszono: 87 10 12 (P. 281585)

Int. Cl.⁵ C07K7/26

URZĄD

PATENTOWY

RP

Pierwszeństwo: 87 08 17 Szwajcaria

Zgłoszenie ogłoszono: 88 09 01

Opis patentowy opublikowano: 1992 02 28 «ntuu

6 4 1 HA

Twórca wynalazku —

Uprawniony z patentu: SandozA. G.,

Bazylea (Szwajcaria)

Sposób wytwarzania alkoholi peptydowych

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania alkoholi peptydowych, zawierających przy C-granicznym końcu łańcucha peptydowego dwie grupy alkoholowe lub jedną grupę alkoholową i jedną grupę tiolową. Sposób ten nadaje się zwłaszcza do wytwarzania alkoholi peptydowych, zawierających C-końcowy rodnik treoninolu, serynolu lub cysteinolu.

Prowadzona w fazie stałej synteza peptydów okazało się bardzo szybkim i korzystnym sposobem wytwarzania polipeptydów i przeto stała się metodą ogólnie rozpowszechnioną. Jak wiadomo, przy tym najpierw aminokwas za pomocą swojej grupy karboksylowej wobec utworzenia grupy estrowej lub amidowej wiąże się przy grupie hydroksylowej lub aminowej nierozpuszczalnej żywicy syntetycznej; następnie do tego przyłącza się dalsze aminokwasy w żądanej kolejności i wreszcie zupełny polipeptyd odszczepia się od żywicy nośnikowej.

Synteza ta przebiega bezproblemowo dla zwykłych polipeptydów o C-końcowych aminokwasach. Alkohole polipeptydowe, zawierające przy C-końcu aminoalkohol zamiast aminokwasu, jednak nie dają się tak łatwo wiązać z zawierającą grupy -OH lub -NH2 żywicą nośnikową i/lub ponownie odszczepiać w zakończeniu syntezy.

Jak możliwe, w fazie stałej prowadzone sposoby wytwarzania alkoholi peptydowych dotychczas proponowano:

a/ zwykłe wytwarzanie odpowiedniego, przy C-końcu aminokwas zawierającego polipeptydu (jako estru żywicy mającej grupy-OH) i następcze odszczepianie redukcyjne za pomocą borowodorków, przy czym równocześnie grupę karboksylową przekształca się w funkcjonlną grupę alkoholową. (Patrz opis patentowy St. Zjedn. Am. nr 4254023(4).

b/ przyłączenie zajmującego krańcowe położenie aminoalkoholu jako eteru do żywicy hydroksymetylowej za pomocą karbonylodwuimidazolu i dostatecznie po syntezie peptydu rozszczepienie za pomocą układu HC1/TFA lub HBr/TFA [Kun-hwa Hsieh i G. R. Marshall, ACS National Meeting, Nowy Orlean, 21-25 marca 1977 r.].

Wadą opisanych sposobów są jednak drastyczne warunki rozszczepiania.

Obecnie stwierdzono, że odszczepienie peptydu od żywicy z równoczesnym utworzeniem

C-końcowego alkoholu peptydowego zachodzi w łagodnych warunkach, jeżeli C-końcowy aminoalkohol połączy się z żywicą poprzez wiązanie acetalowe.

154 068

Zgodnie z wynalazkiem wytwarzanie¹, zawierającego ewentualnie jeszcze grupy zabezpieczające, alkoholu peptydowego zachodzi drogą kwasowej hydrolizy acetalu z (zabezpieczonego) alkoholu peptydowego i z żywicy zawierającej rodniki formylofenylowe.

Schematycznie reakcję tę przedstawia schemat 1, w którym^ oznacza rodnik nierozpuszczalnej żywicy syntetycznej, Z oznacza wiązanie bezpośrednie lub rodnik wiążący żywicę ze zacetalizowaną grupą formylofenylową, X oznacza tlen lub siarkę, Ri oznacza wodór lub metyl, a Y oznacza rodnik zawierający ewentualnie grupy zabezpieczające alkoholu peptydowego, przy czym (zacetalizowana) grupa -CHO zajmuje położenie -m lub -p względem rodnika Zj Dla uproszczenia we wzorach 2 i 3 schematu 1 wrysowano tylko jedną grupę podstawiającą przy żywicy; zrozumiałym jest jednak, że liczne takie grupy są związane przyjednej cząsteczce polimeru żywicy. Odszczepienie alkoholu peptydowego od żywicy drogą hydrolizy grupy acetalowej zachodzi, jak wyżej wspomniano, w warunkach kwaśnych, np. za pomocą rozcieńczonego kwasu trójfluorooctowego. Hydrolizę tą można przeprowadzać w temperaturze pokojowej.

W przypadku, gdy we wzorze 1 Z oznacza wiązanie bezpośrednie, obciążone grupami acetalowymi rodniki fenylowe są bezpośrednio związane przy rodniku polimeru i należą do polimeru. Przykładami takich związków o wzorze 2 są acetale formylowanej żywicy polistyrenowej (we wzorze 2 symbol® oznacza wówczas łańcuch polietylenowy). Jeśli Z stanowi rodnik, to taki rodnik zawiera grupę, która powstała drogą reakcji grupy reaktywnej, związanej bezpośrednio lub pośrednio przy polimerze, z inną grupą reaktywną, związaną bezpośrednio lub pośrednio przy (zacetalizowanej) grupie formylofenylowej. Ten rodnik Z można przykładowo odtworzyć za pomocą wzoru 4, w którym Qi oznacza rodnik związanej przy polimerze grupy reaktywnej, Q2 oznacza rodnik reaktywnej grupy związanej przy (zacetalizowanej) grupie formylofenylowej, D oznacza rodnik wiążący grupę Qi z polimerem, E oznacza rodnik wiążący grupę Q2 ze (zacetylizowaną) grupą formylofenylową, a p i q niezależnie od siebie oznaczają liczby 0 lub 1.

Grupa Qi - Q2 jest korzystnie grupą estrową lub amidową, zwłaszcza zaś grupą karbonamidową. Korzystnie symbol Q stanowi NH, symbol Q2 zaś CO.

Przykładowo D i E niezależnie od siebie stanowią rodniki alkilenowy lub alkilenyloksylowe o 1-5 atomach węgla. Przykładami takich związków o wzorze 2, w którym Z stanowi rodnik o wzorze 4, są związki, w których ugrupowanie®-D-Qi stanowi rodnik aminometylowanej żywicy polistyrenowej, a ugrupowanie o wzorze 5 stanowi rodnik o wzorze 6, w którym R oznacza wodór lub metyl, a m oznacza liczbę 0 lub 1, przy czym grupa acetalowa znowu zajmuje położenie -m lub -p. W tym przypadku więc Z stanowi grupę o wzorze -CH2-NH-CO-CH-(0)m-, a®oznacza polistyren. Rodnik o wzorze 6 korzystnie stanowi grupę o wzorze 7.

Zamiast aminometylowanego polistyrenu można również stosować inne polimery, zwłaszcza polimery z wolnymi grupami -NH2, np. poliakryloamidy mające grupy aminoetylowe.

Jak wyżej wspomniano, zacetalizowana grupa formylofenylową jest korzystnie związana z polimerem poprzez wiązanie amidowe. Dzięki temu jest zapewnione to, że związanie zacetalizowanego rodnika formylofenylowego przy żywicy jest trwałe podczas syntezy polipeptydu i podczas odszczepiania, rozszczepiania zaś, jak tego żądano, zachodzi w wiązaniu acetalowym, tak więc z jednej strony wytwarza się alkohol peptydowy, a z drugiej strony rodnik formylofenylowy pozostaje przy żywicy. W razie potrzeby można alkohol peptydowy przemieszczać dalej od żywicy dzięki wbudowaniu tak zwanych przekładek (grup przestrzennych) między reaktywnymi grupami polimeru (zwłaszcza grupami aminowymi) a reaktywnymi grupami zacetalizowanej pochodnej formylofenylowej (zwłaszcza grupami karboksylowymi). Może to być korzystne w przypadku określonych reakcji na alkoholu peptydowym przed odszczepieniem (np. utlenianie rodników cysteiny). W tym przypadku rodnik D lub E we wzorze 4 zawiera jeszcze dodatkowo tę przekładkę, a Qi lub Q2 jest reaktywnym rodnikiem tej przekładki.

Jako przekładkę można przykładowo stosować kwas ω-aminokarboksylowy, taki jak kwas ε-aminokapronowy.

W specjalnym przypadku przy stosowaniu aminometylowego polistyrenu, rodnika o wzorze 6 i kwasu ε-aminokapronowego jako przekładki symbol Z oznacza grupę o wzorze 8.

Związki o wzorze 2 można wytwarzać z wyjściowego związku o wzorze 9 metodami praktykowanymi w technologii fazy stałej.

We wzorze 9 A oznacza grupę zabezpieczającą funkcję aminową, a grupa acetalowa zajmuje położenie -m lub -p względem rodnika Z. W tym celu najpierw odszczepia się zabezpieczającą grupę

A, po czym tę wolną grupę aminową poddaje się reakcji z następnym N-zabezpieczającym ami15406S 3 nokwasem, itd , aż wszystkie aminokwasy zostaną przy żywicy przyłączone w kolejności odpowiadającej żądanemu alkoholowi peptydowemu.

Jako grupa zabezpieczająca aminę w stosowanych aminokwasach, lub w aminoalkoholu, należy dobierać takie grupy, które odszczepiają się w warunkach nie kwaśnych, gdyż w warunkach kwaśnych zachodzi hydroliza grupy acetalowej. Jako takie grupy zabezpieczające aminę można stosować np. grupę CF3CO- lub FMOC- (9-fluorofenylometyloksykarbonylową). Te grupy zabezpieczające odszczepia się w środowisku zasadowym na drodze znanej w chemii peptydów.

Tylko grupa zabezpieczająca w ostatnim przyłączonym aminokwasie może być nietrwała wobec kwasów i wówczas zostaje ona odszczepiona równocześnie z uwolnieniem alkoholu peptydowego z żywicy. Dla tego przypadku należy stosować np. grupę -Boc.

Jako zasady można stosować np. KOH, piperydynę, lub też NaBH4.

Również synteza łańcucha polipeptydowego następuje w znany sposób z rodnika peptydowego o wolnej grupie aminowej i z aminokwasu o wolnej lub zaktywowanej grupie karboksylowej. Można też dodawać środki wiążące wodę. I tak reakcję tę można przeprowadzać np. wobec dodania hydroksybenzotriazolu i dwucykloheksylokarbodwuimidu.

Związki o wzorze 9 można wytwarzać w ten sposób, że albo a/ zawierającą grupy aldehydowe żywicę o wzorze 3, w którym grupa -CHO zajmuje położenie -m lub -p względem podstawnika Z, poddaje się reakcji z N-zabezpieczonym aminialkoholem o wzorze HX-CHRi-CH(NHA}-CH2<0H lub ze zaktywowaną postacią tego związku, albo b/pochodną żywicy o wzorze@-(D)p-Q'i poddaje się reakcji ze związkiem o wzorze 10, w którym grupa acetalowa zajmuje położenie -m lub -p względem rodnika Q'2-(E)q-, a Q'i i Q* stanowią dwie grupy reaktywne, które mogą ze sobą reagować, tworząc mostek Qi-Q2.

Acetalizowanie (sposób a) przeprowadza się na znanej drodze za pomocą kwasu jako katalizatora. Jako kwas można stosować np. kwas p-toluenosulfonowy lub kwas trójfluorometanosulfonowy.

Zamiast wolnego alkoholu można przykładowo stosować pochodną trójmetylosililową.

Sposób b/ (np. estryfikacja lub zwłaszcza amidowanie) zachodzi również na znanej drodze, np. na drodze reakcji reaktywnej pochodnej kwasu karboksylowego z polimerem mającym grupę -OH lub -NH2.

Związki o wzorze 10 wytwarza się drogą acetalizowania związku o wzorze 11 za pomocą związku o wzorze HX-CHR-i-CH(NHA)-CH2OH. To acetalizowanie następuje tak, jak wyżej opisano dla sposobu a/.

Podczas syntezy i przed odszczepieniem alkoholu peptydowego od żywicy można też prowadzić reakcje na rodniku alkoholu peptydowego, np. usuwanie grup zabezpieczających, np. grup zabezpieczających siarkę, lub utlenianie rodników cysteiny. Reakcje te mogą też oczywiście po odszczepieniu (zabezpieczonego) alkoholu peptydowego następować w roztworze. Związki o wzorze 2, 9 i 10 są nowe.

Za pomocą sposobu według wynalazku można łatwo wytwarzać wszystkie, a w szczególności farmakologicznie czynne alkohole peptydowe, które przy C-końcu zawierają dwie grupy alkoholowe lub jedną grupę alkoholową i jedną grupę tiolową.

Wynalazek objaśniają niżej podane przykłady.

Przy kład I. Wytwarzanie pochodnej somatostatyny o wzorze H-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol ./Wytwarzanie acetalu kotwicznego (acetalu N-Cf3-CO-treoninolu z kwasem p-formylofenoksy-octowym)

105 g (1,0 mola) L-treoninolu umieszcza się w 200 ml metanolu, płucząc azotem. Do otrzymanego klarownego roztworu w temperaturze 0°C wkrapla się 200 ml trójiluorooctanu metylowego w 250 ml metanolu. Przy tym za pomocą łaźni lodowej utrzymuje się wewnętrzną temperaturę około 10°C. Po upływie 1,5 godziny w roztworze reakcyjnym nie stwierdza się już obecności treoninolu. Po odparowaniu w temperaturze 40°C otrzymuje się białą pozostałość krystaliczną. Rozpuszcza się ją w temperaturze 70°C w 200 ml octanu etylowego i strąca za pomocą 100 ml heksanu. Następnie

154 068 chłodzi się do temperatury 0°C, przemywa heksanem i suszy w temperaturze pokojowej. Otrzymuje się N-trójfluoroacetylo-treoninol.

50,3 g (0,25 mola) tak otrzymanego produktu rozpuszcza się: w 1,25 litra tetrahydrofuranu w atmosferze azotu i w temperaturze pokojowej wkrapla się 75 ml trójmetylochlorosiianu. Natomiast po tym dodaje się mieszaninę 70 ml trójetyloaminy i 250 ml tetrahydrofuranu. Powstaje biała zawiesina, którą w ciągu 4 godzin miesza się w temperaturze pokojowej. Następnie sączy się, a przesącz odparowuje się w temperaturze 40°C.

Otrzymuje się oleistą substancję. Rozpuszcza się ją w 1,5 litra chlorku metylenu i w temperaturze pokojowej zadaje się porcjami 90,4 g kwasu p-formylo-fenoksyoctowego. Następnie dodaje się porcjami łącznie 9 ml trójmetylosililowego estru kwasu trójfluorometanosulfonowego. Całość miesza się w temperaturze pokojowej w ciągu 24 godzin, po czym sączy się, a pozostałość starannie przemywa się chlorkiem metylenu. Przesącz ten odparowuje się w temperaturze 40°C, otrzymując jako pozostałość pomarańczowoczerwono zabarwiony produkt żywicowaty. Ten pomarańczowoczerwono zabarwiony produkt chromatografuje się na żelazu krzemionkowym, eluując octanem etylowym. Po odparowaniu żądanych frakcji otrzymuje się wyżej wspomniany acetal. Czystość według cieczowej chromatografii ciśnieniowej 97%.

2/ Synteza zabezpieczonego oktapeptydu, utlenianie przy żywicy i odszczepianie.

Z 17,2g aminometylowanego polistyrenu [0,7% wagowych azotu, co odpowiada 0,50 mmola/g] sporządza się zawiesinę w 80 ml układu chlorek metylenu/ dwumetyloformamid 4:1. Do całości sukcesywnie dodaje się 4,17 g produktu końcowego z etapu 1/, 1,6 g hydroksybenzotriazolu i 4,0 g dwucykloheksylokarbodwutmtdu. Po 2-godzinnym mieszaniu w temperaturze pokojowej jest test Kaiser'a negatywny. Prowadzi się sączenie i przemywanie. Przemytą żywicę przeprowadza się w stan zawiesiny w 100 ml układu tetrahydrofuran/metanol 3:1 i porcjami dodaje się 10,4 g borowodorku sodowego. Całość miesza się w ciągu 6 godzin w temperaturze pokojowej, sączy i przemywa. Z żywicy tej ponownie sporządza się zawiesinę w układzie chlorek metylenu/ dwumetyloformamid i dodaje 5,57 g FMOC-Cys/S-III-rz.-Bu/OH, 1,74 g hydroksybenzotriazolu (HOBT) i

3,6 g dwucykloheksylokarbodwuimidu (DCCI). Po odszczepieniu grnp-FMOC za pomocą piperydyny (2X20 minut) dalej sukcesywnie sprzęga się N-FMOC-zabezpieczone aminokwasy Thr-OH, Lys(BOC)-OH, D-Trp-OH, Phe-OH, Cys(S-III-rz.-Bu)OH i D-Phe-OH za pomocą układu HOBT/DCCI. Ostatecznie otrzymuje się układ FMOC-zabtzpitczony oktapeptyd-żywica. Nasycenie 0,26 mmola/g.

Żywicę tę przeprowadza się w stan zawiesiny w 100 ml układu trójfluoroetanol/chlorek metylenu 1:1 i zadaje za pomocą 50 ml trójbutylofosfiny, po czym miesza się w ciągu 70 godzin w temperaturze pokojowej. Następnie sączy się, przemywa i zadaje za pomocą 100 ml mieszaniny 1: 1 z tetrahydrofuranu i 1 molowego roztworu octanu amonowego. Do całości dodaje się 1,1 ml 30% wodnego roztworu nadtlenku wodoru i miesza w temperaturze pokojowej w ciągu 24 godzin. Następnie przemywa się, zadaje mieszaniną 20 ml kwasu trójfluorooctowego, 80 ml chlorku metylenu, 10 ml wody i 2 ml tioanizolu i miesza w ciągu 2 godzin, po czym sączy się i przemywa za pomocą kwasu trójfluorooctowego i chlorku metylenu. Do przesączu dodaje się 200 ml eteru etylowego, strącony osad odsącza się, rozpuszcza go w wodnym roztworze buforu dejonizujee się na drodze traktowania Duolifem i liofilizuje w postaci octanu.

Związek tytułowy otrzymuje sie w postaci soli kwasu octowego.

Przykład II. Wytwarzanie N^c^(α--glukozyio)l-4(-deoksyfruklozyIoy-SMS.

Sposobem przedstawionym w przykładzie wytworzono 393 g oktapeptydu związanego z żywicą. Grupy ochronne cysteiny usunięto na drodze redukcji. Peptyd związany z żywicą utleniono do cyklicznego oktapeptydu nadtlenkiem wodoru w mieszaninie tetrahydrofuran/woda.

Po przemyciu w tetrahydrofuranie, a następnie DMF, żywicę z peptydem wytrząsano w 3600 ml mieszaniny DMF/AcOH (8:1). Zawiesinę potraktowano 527 g D( + )-maltozy w postaci monohydratu. Mieszaninę ogrzano do 60°C i mieszano przez 18 godzin w tej temperaturze.

Mieszaninę ochłodzono i odsączono żywicę z peptydem i sukcesywnie przemywano DMF i metanolem, a następnie chlorkiem metylenu. Peptyd odszczepiano od żywicy w ciągu 1 godziny mieszaniną 2900 ml chlorku metylenu i 716 ml kwasu trifluorooctowego ze śladami wody.

154 068

Następnie mieszano przesącz, zadano 597 g węglanu sodowego, mieszano przez 30 minut i odsączono. Pozostałość przemyto chlorkiem metylenu i metanolem. Przesącz zatężono do sucha. Odmineralizowano stosując kolumnę wypełnioną polistyrenem nie zawierającym grup funkcyjnych, takim jak Duolite lub materiałem do ciśnieniowej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami, takim jak żel krzemionkowy potraktowany silikonem i zawierający grupy długołańcuchowego alkoholu tłuszczowego (np. Labomatic, Szwajcaria, Brand HB-SIL-18-20-100). Otrzymano czysty związek tytułowy.

Claims (5)

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania alkoholu peptydowego, który przy C-koócu łańcucha peptydowego zawiera dwie grupy alkoholowe lub jedną grupę alkoholową i jedną grupę tiolową, znamienny tym, że alkohol peptydowy odszczepia się za pomocą hydrolizy kwasowej od żywicy zawierającej reszty formylofenylowe, do których przyłączony jest alkohol peptydowy poprzez wiązanie acetalowe z C-końcową grupą alkoholową lub grupami alkoholową i tiolową.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania alkoholu peptydowego o wzorze 1, w którym Y-CO oznacza resztę peptydu, Ri oznacza wodór lub metyl, X oznacza 0 lub S hydrolizuje się w warunkach kwaśnych żywicę z przyłączonym peptydoalkoholem, przedstawioną wzorem 2, w którym@oznacza resztę nierozpuszczalnej syntetycznej żywicy, a Z oznacza bezpośrednie wiązanie lub resztę łączącą żywicę z acetalizowaną grupą formylofenylową, przy czym acetalizowana grupa CHO znajduje się w pozycji m- lub p- w stosunku do rodnika Z, a z cząsteczką żywicy polimerycznej związanych jest kilka acetalizowanych grup formylowych.

³. ^Sposó^b wedto^g zastrz. 2 znamienn^y t^ym, że stosuje s^ię ż^ywⁱcę o wzorze 2, w ^którym(® oznacza resztę polistyrenu, a Z oznacza bezpośrednie wiązanie.

4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się żywicę o wzorze 2, w którym X oznacza tlen, a Ri oznacza CH3.

^CHR_rXH

Y-CO-NH-CH

CHO ch₂oh

Wzór 1

Wzór 3

-(^/_p-Q_rQ₂-/E/^ą Wzór 4

Wzór 2 ΐ¹

X-CH

Q2’^E

CH-NH-CO-Y

O-CH2

Wzór-

5 /Y-CH

CH 2^ CH-NH-CO-Y

-c-ęH-/o/_m-^f ^o-ch₂ O R

Wzór 6 i¹

X-CH 'CH-NH-CO-Y

O-CH2

Wzór 7

-CH2-NH-CO-/CH2/5 -NH-CO-CH-/O/_mWzór 8

CH-NH-A

Wzór 9 ί¹

X-CH

CH ^CHH-NH-A

Wzór 10 ^=^C'^CH°

Q2-^/D/9AQ/

Wzór 11 ©-z^ ^Χ0-θζ

X-CH

CH J^CH-NH-CO-Y

Wzór 2

CHfR₁-XH I ¹ * Y-CO-NH-CH-CH2OH

Wzór 3

Wzór 1

Schemat 1

Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 100 egz.

Cena 3000 zł