PL161416B1

PL161416B1 - Sposób wytwarzania amykacyny PL

Info

Publication number: PL161416B1
Application number: PL1988276047A
Authority: PL
Inventors: Alberto Mangia
Original assignee: Pierrel Spa
Priority date: 1987-11-27
Filing date: 1988-11-28
Publication date: 1993-06-30
Also published as: BG49048A3; JPH0637512B2; DK661588D0; DK170050B1; FI90243C; NO171505C; DK661588A; DE3854225D1; YU218888A; AU2596388A; RO102339B1; CS277017B6; ZA888855B; EP0317970B1; IT8722783A0; NZ227113A; HU201771B; IT1225484B; JPH01186900A; FI885489A0

Abstract

1. Sposób wytwarzania amykacyny o wzorze 1 przez acylowanie zabezpieczonej pochodnej kanamycyny A o wzorze 4 za pomoca pochodnej kwasu L-(-)-4-amino-2- hydroksymaslowego (L-HABA) i usuniecie z produktu reakcji grup zabezpieczajacych, zna- mienny tym, ze acylowanie prowadzi sie w temperaturze 0-60°C stosujac jako rozpusz- czalnik tylko wode i utrzymujac wartosc pH w zakresie 3-10. Wzór 1 WZÓR 2 PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania amykacyny.

Amykacyna, to jest 0-3-amino-3-dezoksy-a-D-glukopiranozylo-( 1 —)(-0-[6-amino-6-dezoksya-D-glukopiranozyIo-/l — 4)]-N¹-(4-amino-2-hydroksy-l-ketobutylo)-2-dezoksy-D-streptamina o wzorze 1,jest półsyntetycznym antybiotykiem, szeroko stosowanym w lecznictwie, uzyskiwanym przez acylowanie kanamycyny A o wzorze 2.

Znanych jest wiele sposobów wytwarzania amykacyny. Podano je w europejskim zgłoszeniu patentowym nr 86201 663 1.

Jako środek acylujący zwykle stosuje się kwas L-(-)-4-amino-2-hydroksymasłowy o wzorze 3 (zwany dalej L-HABA), odpowiednio zaktywowany i zabezpieczony w znany sposób. Jako związek wyjściowy stosuje się np. pochodną o ogólnym wzorze 4, zabezpieczoną w pozacjach N-6' i N-3 grupami benzyloksykarbonylowymi, przy czym R' i R oznaczają atomy wodoru, a R oznacza grupę Ph-CH2-OCO. Związek taki opisano w publikacji T. L. Nagabushana i innych, J. Amer. Chem. Soc., 100, 5254 (1978), w opisie patentowym St. Zjedn. Am. nr 4 136254 i w publikacji T. Tsuchiyi i innych, Tet. Lett., 4951 (1979), jak również w belgijskim opisie patentowym nr 879925.

W belgijskim opisie patentowym nr 879 925 opisano przekształcenie zabezpieczonej pochodnej o wzorze 4, w którym R, R' i R mają podane znaczenie, w odpowiedni związek 3-trójfluoroacetamidowy o ogólnym wzorze 4, w którym R i R mają wyżej podane znaczenie, a R' oznacza grupę CF3CO, działaniem trójfluorooctanu etylu i następnie acylowanie w pozycji 1 odpowiednio dobraną pochodną L-HA.BA. Dwie różne grupy zabezpieczające, to znaczy trójfluoroacetylową i grupę benzyloksykarbonylową, usuwa się w takiej kolejności jak zostały wymienione, działaniem amoniaku i wodoru otrzymując, jako produkt końcowy, amykacynę. Wydajność tego procesu określono jako zadawalającą, ale proces nie jest wygodny do realizacji na skalę przemysłową, gdyż wymaga stosowania trójfluorooctanu etylu, to jest toksycznego i drogiego reagenta, oraz dwumetylosulfotlenku - rozpuszczalnika drogiego i trudnego do odzyskania ze względu na wysoką temperaturę wrzenia. Ponadto, jego usuwanie wiąże się z dodatkowymi kosztami.

W opisie patentowym St. Zjedn. Am. nr 4 136254 w przykładzie 23 opisano bezpośrednie acylowanie związku o wzorze 4, w którym R oznacza grupę Ph-CH2-OCO, a R' i R oznaczają atomy wodoru, prowadzone w homogenicznym roztworze tetrahydrofuranu w wodzie (50% objętościowych) za pomocą aktywnego estru N-hydroksysukcynimidu i N-benzyloksykarbonylowej pochodnej kwasu L-HABA rozpuszczonego w DMF, przy czym reakcję prowadzi się w fazie homogenicznej przy całkowitym rozpuszczeniu reagentów.

W publikacji J. J. Wrighta i innych, J. Antibiotics, 29, 714 (1976) omówiono możliwość zależności selektywności od pH środowiska reakcji, stwierdzając, że ulega ona gwałtownym zmianom pod wpływem doboru warunków reakcji, w których grupy aminowe związku antybiotycznego są w pełni protonowane. Ponadto jednak wyraźnie, że „stwierdzono niską selektywność acylowania wysoko hydroksylowanych antybiotyków, takich jak gentamycyna B i kanamycyna przy zmianie pH“. W rzeczywistości, zgodnie z informacją podaną przez wymienionych autorów,

161 416 3 można uzyskać N-acylowane pochodne szeregu aminoglikozydów (sysomycyna, werdamycyna, gentamycyna Ci a) z wydajnością zawsze niższą od 30%.

Celem wynalazku było opracowanie jak najprostszego sposobu selektywnego acylowania grupy aminowej w pozycji 1 pierścienia 2-dezoksystreptaminy w odpowiedniej pochodnej kanamycyny, pozwalającego unikąć stosowania toksycznych, drogich i trudnych do usunięcia rozpuszczalników i reagentów.

Sposób według wynalazku pozwala rozwiązać omówione wyżej problemy i uniknąć niedogodności znanych sposobów.

Sposób według wynalazku polega na tym, że acyluje się dwuzabezpieczoną pochodną kanamycyny A o ogólnym wzorze 4, w którym R oznacza grupę Ph-CH2-OCO, a R' i R ożnaczają atomy wodoru, stosując jako rozpuszczalnik wyłącznie wodę, co stanowi ewidentną zaletą zarówno z przemysłowego jak i ekologicznego punktu widzenia. Reakcję prowadzi się w fazie heterogenicznej (jako fazę heterogeniczną rozumie się obecność mieszaniny nie mieszających się ze sobą rozpuszczalników lub mieszaniny nie mieszających się ze sobą rozpuszczalników i trzeciej fazy stałej) bez użycia drogich rozpuszczalników, takich jak tetrahydrofuran i dwumetyloformamid.

Drugą istotną cechą sposobu według wynalazku jest to, że wyjściową pochodną kanamycyny A w ogólnym wzorze 4 , w którym R oznacza grupę Ph-CH2-OCO, a R' i R oznaczają atom wodoru, acyluje się bezpośrednio, otrzymując trójzacylowany związek o ogólnym wzorze 4, w którym R oznacza grupę Ph-CH2-OCO, R' oznacza atom wodoru, a R oznacza grupę COCH/OH/-CH2-CH2NH-CO-OCH2, a to poprzez regulowanie pH mieszaniny reakcyjnej, będącego głównym czynnikiem odpowiedzialnym za selektywność acylowania grup aminowych w pozycjach 1 i 3'. Taka selektywność acylowania jest oryginalnym i nowym wynikiem, którego nie można było przewidzieć na podstawie doniesień literaturowych. Fakt, że w sposobie według wynalazku acylowanie dwuzacylowanej pochodnej kanamycyny w pozycji N-l jest wysoce selektywne i jest funkcją pH, w którym przebiega reakcja, jest całkowicie nowy i nieoczekiwany.

Dokładniej, sposób według wynalazku, w którym jako związek wyjściowy stosuje się kanamycynę A zabezpieczoną w pozycjach 6' i 3, polega na reakcji tej pochodnej kanamycyny A z odpowiednio dobraną reaktywną pochodną kwasu L-HABA w środowisku heterogenicznym i przy ustalonym pH. Acylowanie prowadzi się w temperaturze 0-60°C stosując jako rozpuszczalnik tylko wodę i utrzymując wartość pH w zakresie 3-10.

Produkt reakcji (związek o wzorze 4, w którym R oznacza grupę Ph-CH2-OCO, R' oznacza atom wodoru, a R' oznacza grupę CO-CH/OHj-C^-C^NH-CO-OC^ poddaje się w znany sposób reakcji usuwania grup zabezpieczających i otrzymany surowy produkt oczyszcza się chromatograficznie, otrzymując amykacynę z optymalną wydajnością.

Jako związek wyjściowy można stosować dowolną pochodną kanamycyny A, w której grupy aminowe w pozycjach 6 i 3 są zabezpieczone przez podstawienie atomu wodoru grupą acylową, taką jak np. grupa benzyloksykarbonylowa lub podstawiona grupa benzyloksykarbonylowa, taka jak grupa p-nitrobenzyloksykarbonylowa lub grupa p-metoksybenzyloksykarbonylowa, grupa alkoksykarbonylowa, taka jak grupa hhh rzęd. butoksykarbonylowa lub hhh rzęd. amyloksykarbonylowa, grupa ftaloilowa, grupa chlorowcoalkilokarbonylowa, taka jak trójfluoroacetylowa lub chloroacetylowa, albo inne odpowiednie grupy zabezpieczające. Korzystnie, grupy aminowe w pozycjach 6' i 3 są zabezpieczone grupami benzyloksykarbonylowymi lub podstawionymi grupami benzyloksykarbonylowymi, ponieważ, jak juz wskazano, grupy te łatwo usuwa się po zakończeniu reakcji przez katalityczną redukcję.

Związki wyjściowe tego typu można wytwarzać sposobami opisanymi w belgijskim opisie patentowym nr 855 704 lub w kanadyjskim opisie patentowym nr - -3- 628.

Zabezpieczony związek wyjściowy suspenduje się w wodzie o wcześniej ustalonym pH, wahającym się od 3 do -0, przy czym najlepsze wyniki uzyskuje się przy pH w granicach od 4,5 do 6,5, i acyluje selektywnie w pozycji -, dodając wybraną reaktywną pochodną kwasu L-HABA rozpuszczoną w aprotycznym rozpuszczalniku źle rozpuszczającym się w wodzie. Do odpowiednich rozpuszczalników, nadających się do stosowania, należą np. węglowodory alifatyczne i chlorowcozwiązki, takie jak chlorek metylenu, chloroform, 1,2-dwuchloroetan i podobne.

Reakcję prowadzi się w temperaturze 0-60°C, mieszając w ciągu kilku godzin. Po zakończeniu reakcji odparowuje się organiczny rozpuszczalnik i w znany sposób usuwa grupy zabezpieczające z

161 416 pozycji 3 i 6'. Np., gdy zgodnie z korzystnym wariantem sposobu według wynalazku grupami zabezpieczającymi są ewentualnie podstawione grupy karbobenzyloksykarbonylowe, usuwa się je w znanej reakcji hydrogenolizy katalitycznej stosując jako katalizator platynę, tlenek palladu lub tlenek platyny, a gdy grupami zabezpieczającymi są grupy ftaloilowe, usuwa się je łatwo przez hydrolizę za pomocą hydrazyny, a III rzęd.butoksykarbonylowe grupy ochronne dogodnie usuwa się działając kwasem mrówkowym.

Otrzymany surowy produkt oczyszcza się chromatograficznie zgodnie ze znanym sposobem oczyszczania amykacyny.

Acylowanie 3,6'-dwu-N-zabezpieczonej kanamycyny A prowadzone sposobem według wynalazku w warunkach regulowanego pH i w fazie heterogenicznej przebiega z bardzo dobrą selektyw nością, która jest nieoczekiwanie wysoka, ponieważ korzystnie zamiast tworzenia się BB-K11 lub produktów podwójnego acylowania w pozycjach N-l i N-3, powstaje amykacyna. Ponadto bardzo istotne jest, że w sposobie według wynalazku, jako ewentualne zanieczyszczenie produktu finalnego może występować tylko produkt określany jako BB-K11 i produkt dwuzacylowany w pozycjach N-l i N-3, w których toksyczność jest niższa niż produktu określanego jako BB-K29, będącego głównym potencjalnym zanieczyszczeniem, powstającym w innych znanych sposobach.

Sposób według wynalazku, pozwalający otrzymać z wysoką wydajnością produkt o dużej czystości, jest szczególnie bezpieczny z punktu widzenia bezpieczeństwa i higieny pracy w przemyśle, ponieważ stosuje się w nim niemal nieszkodliwe reagenty i rozpuszczalniki, a sam proces jest łatwy do prowadzenia, ponieważ nie wymaga wyodrębniania produktów pośrednich.

Jeśli chodzi o produkt reakcji selektywnego acylowania sposobem według wynalazku, przedstawiony wzorem 4, w którym R oznacza grupę Ph-CH2-OCO, R' oznacza atom wodoru, a R oznacza grupę CO-CH(OH)-CH--CH-NH-CO-OCH-, to jego właściwości chemiczne i fizyczne nie były dotychczas nigdzie opisane, choć jest to produkt reakcji wymieniony w opisie patentowym St. Zjedn. Am. nr 4 -36254 i niewyodrębniony produkt pośredni wymieniony we wspomnianej już poprzednio publikacji Tsuchiyi i innych.

Zamiast bezpośrednio usuwać trzy grupy zabezpieczające grupy aminowe w produkcie reakcji acylowania, produkt ten można wytrącić w celu poprawienia jego czystości i następnie dalej prowadzić syntezę, z wytwarzaniem mniejszej ilości produktów bocznych.

Oznaczenia analityczne tego związku, o podstawowym znaczeniu dla sposobu według wynalazku, dały następujące wyniki:

- całkowita zawartość azotu oznaczona metodą Kjeldahla: 7,16% (wartość teoretyczna 7,09%, masa cząsteczkowa 988,03),

- miano potencjometryczne wobec 0,1 n HC1C4: 96% wartości teoretycznej,

- wolne kwasy (wyrażone jako kwas mrówkowy): 0,5%,

- wolny amoniak: brak.

Dalsze oznaczenia chromatograficzne tego związku prowadzono zarówno metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) jak i chromatografii cieczowej (HPLC).

Chromatografię cienkowarstwową (TLC) prowadzono w następujących warunkach.

Stosowano płytki z żelem krzemionkowym firmy Merck do analizy chromatograficznej, a jako eluent mieszaninę 125 części (objętościowo) chloroformu, 60 części metanolu, 5 części kwasu octowego i 10 części H-O. Komorę chromatograficzną wstępnie nasycano i po każdej próbie suszono strumieniem gorącego powietrza. Detekcję wizualną prowadzono przy użyciu roztworu kwasu solnego w etanolu (10% objętościowych), komorę ponownie suszono strumieniem gorącego powietrza i rozpylano w niej ninhydrynę. Na koniec trzymano ją w ciągu minut w suszarce w temperaturze 105°C.

Plamki odnoszące się do potencjalnych produktów ubocznych, którymi są czterozacylowana kanamycyna (z czterema grupami aminowymi zablokowanymi wybraną grupą zabezpieczającą) i trójzacylowana kanamycyna (w której trzecia grupa zabezpieczająca jest podstawiona w pozycji N-l lub N-3, a ponadto dwie grupy są podstawione w pozycjach N-3 i N-6') stanowią zwykle mniejsc niż 2% w porównaniu z próbką standardową.

Analizę chromatograficzną metodą MPLC prowadzono w następujących warunkach:

kolumna: RB-8,5pm, 250mm X 4,6 mm (Browulec Labs), eluent:

161 416

A/ - roztwór buforowy KH2P02 o pH 2,5 (1,36 g KH2PO4 rozpuszczono w 1 litrze wody, doprowadzono do pożądanego pH dodatkiem 5% kwasu fosforowego, przesączono przez filtr

0,45 μιη).

B/ - mieszanina acetonitryl - bufor o pH 2,5 (w stosunku objętościowym 80:20), szybkość przepływu 2ml/minutę, gradient: od 15% B do 90% B w ciągu 15 minut, temperatura: 30°C, detekcja: UV/350nm, roztwór dający pochodne: kwas 2,4,6-trójnitrobenzenosulfonowy w mieszaninie woda/pirydyna (50/50).

Na załączonych rysunkach fig. 1 przedstawia wyniki oznaczeń metody HPLC, a fig. 2 - widok IR w KBr.

Ponadto zgodnie z przedstawionym schematem syntezy, nie może tworzyć się izomeryczny produkt amykacyny, zwany BB-K29, bardziej toksyczny niż amykacyna. Potencjalnie obecnym zanieczyszczeniem może być tylko produkt zwany BB-K.11 i produkt pochodzący z podwójnego zacylowania w pozycjach N-l i N-3.

Przeprowadzono próby porównawcze dla porównania śmiertelności, toksyczności i toksyczności ostrej produktu dostępnego na rysunku, wytwarzanego przez firmę Bristol Myers (BB-K8), amykacyny wytwarzanej sposobem według wynalazku oraz potencjalnych zanieczyszczeń (BBK11, BB-K29 i dwuzacylo wanej pochodnej zacylowanej kwsem L-H ABA w pozycjach N-1 i N-3). Próby prowadzono na myszach, podając badane związki dożylnie (żyła ogonowa) grupom po 10 zwierząt. Wartość LD50 obliczano metodą Finnega-Probitsa. Wyniki podano w tabeli.

Tabela

Produkt	LD50 (mg/kg)	5% granica pewności
BB-K8 Bristol	202,3	(170-228)
Amykacyna	241	(241-271)
BB-K29	126	(119-134)
KK-K11	356	(264-480)
Pochodna dwuacylowa
(N-l 1 N-3)	268	(247-290)

Powyższe dane wykazują niewątpliwą wyższość syntezy prowadzonej sposobem według wynalazku, gdyż uzyskuje się produkty końcowe, w których ewentualne zanieczyszczenia, chociaż obecne w bardzo niewielkich ilościach w produkcie końcowym, są znacznie mniej toksyczne niż BB-K29, który może występować w produktach wytwarzanych sposobami innymi niż sposób według wynalazku.

Wynalazek ilustrują poniższe przykłady.

Przykład I. Związek o wzorze 4, w którym R oznacza grupę Ph-CH2-OCO, a R' i R oznaczają atomy wodoru, w ilości 53,4g suspenduje się w 1000ml wody i rozpuszcza, dodając 38,5 ml kwasu octowego, po czym po 30 minutach mieszania w temperaturze pokojowej doprowadza się pH roztworu do wartości 6 dodatkiem 30% roztworu NaOH (około 52 ml). Po dalszym przetrzymywaniu roztworu w ciągu 30 minut w temperaturze pokojowej, dodaje się jednorazowo 34,9 g N-benzyloksykarbonylo-L-HABA-N-hydroksysukcynimidu w 1442 ml chlorku metylenu. Następnie mieszaninę miesza się intensywnie w ciągu nocy w temperaturze pokojowej, po czym odparowuje się rozpuszczalnik w temperaturze poniżej 40°C i doprowadza się pH mieszaniny do 4,2 dodatkiem kwasu octowego.

Usunięcie trzech zabezpieczających grup benzyloksykarbonylowych prowadzi się w znany sposób, dodając do roztworu 50 g 2,5% Pd/C 1 wkraplając do niego w temperaturze pokojowej 50 ml kwasu mrówkowego. Po odsączeniu węgla na dekalicie i przemyciu wodą otrzymuje się 1900 ml bogatego w produkt wodnego roztworu o następującym składzie: amykacyna - 11,52 g/1, kanamycyna A - 2 g/I, BB-K11 - 0,25 g/1, dwu (HABA) ΚΑΝΑ - 1,3 g/1 co odpowiada stechiometrycznie wydajności amykacyny wynoszącej 65% (w stosunku do związku wyjściowego o wzorze 4).

Otrzymany roztwór absorbuje się na żywicy jonowymiennej typu Zerolit (produkt firmy Rohm and Haas) w postaci słabo kwaśnej, po doprowadzeniu jego pH do wartości 7,5.

161 416

Kanamycynę eluuje się przy liniowym gradiencie amoniaku od 0,5 n do 1,5 n i jest ona najpierw wymywana z kolumny, a po niej wymywaniu ulega amykacyna. Zbiera się frakcje 300-350 i zatęża pod zmniejszonym ciśnieniem dla całkowitego usunięcia amoniaku uzyskując końcowe stężenie amykacyny wynoszącej 20%. Roztwór zakwasza się 50% H2SO4 (% wagowo/objętościowe) do pH 2,5 i traktuje węglem. Po 30 minutach mieszania w temperaturze pokojowej odsącza się węgiel, pozostałość przemywa się i wytrąca metanolem dwusiarczu amykacyny. Po 2 godzinach mieszania w temperaturze pokojowej otrzymaną białą substancję stałą odsącza się i po przemyciu i wysuszeniu w ciągu 16 godzin pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 45°C otrzymuje się 33,3 g produktu.

Miano amykacyny w postaci zasady określono metodą HPLC wynosi 68% (miano mikrobiologiczne 690pg/mg), a inne właściwości są zgodne z właściwościami siarczanu amykacyny.

Przykładu. W 1500 ml odmineralizowanej wody suspensuje się 50 g 3,6'-dwu-N-benzyloksykarbonylokanamycyny A o mianie oznaczonym metodą HPLC wynoszącym 89,5% (59,3 milimoli), zawartości wody 3,3% i zawierającej jako główne zanieczyszczenie 1,3,6'-trój-N-benzyloksykarbonylokanamycynę A. Po mieszaniu w ciągu 30 minut dodaje się lodowaty kwas octowy w ilości koniecznej aby doprowadzić wartość pH mieszaniny do 6±0,2. Wówczas otrzymuje się praktycznie roztwór, do którego dodaje się aktywny ester kwasu L-(-)-y-benzyloksykarbonyloamino-ahydroksymasłowego i N-hydroksysukcynimidu, przy czym dodawanie prowadzi się w temperaturze pokojowej stosując roztwór tego estru w chlorku metylenu [25 g (80,6 milimoli) w 1000 ml rozpuszczalnika]. Mieszaninę miesza się intensywnie w ciągu około 2 godzin, po czym utrzymuje się ją w warunkach mieszania w ciągu całej nocy. Po oddzieleniu fazy organicznej doprowadza się pH roztworu do wartości 10 za pomocą 3 n roztworu amoniaku. Powstały biały osad odsącza się na lejku Buchnera pod zmniejszonym ciśnieniem i przemywa wodą. Lekko krystaliczną substancję stałą suszy się pod zmniejszonym ciśnieniem w ciągu około 30 godzin w temperaturze 30°C. Otrzymuje się 30,9 g 3,6'-dwu-N-benzyloksykarbonylo-l-N-L-(-)-y-benzytoksykarbonytoaminoα-hydroksybutyrylokanamycyny A o mianie 70% (HPLC).

Głównymi zanieczyszczeniami produktu są: dwuacylowy związek wyjściowy w ilości poniżej 1% i związek trójacylowy (z grupami benzyloksykarbonylowymi w pozycjach N-l, N-3 i N-6') w ilości 2%. Straty przy suszeniu (3 godziny, 105°C): 4,5%. Popiół siarczanowy: 0,15%.

Przykład III. Przeprowadzono następujące próby dla ustalenia krytycznej wartości pH dla regulacji wydajności i selektywności syntezy amykacyny. Wyjściowym produktem jest zawsze 3,6'-dwu-N-benzyloksykarbonylokanamycyna A o wzorze 4, a eksperymenty przeprowadzono zgodnie z następującym schematem:

1/ Sporządzenie zawiesiny produktu o wzorze 4 w wodzie, dodanie kwasu octowego i następnie wodorotlenku sodowego w celu regulacji pH 3-9.

2/ Dodanie estru kwasu 4-N-benzyloksykarbonylo-L-4-ammo-2-hydroksymasłowego i N-hydroksysukcynimidu w chlorku metylenu dla osiągnięcia zacytowania grupy aminowej w pozacji N-l.

3/ Hydrogenoliza trzech grup zabezpieczających, to jest grup benzyloksykarbonylowych, z użyciem Pd/C i kwasu mrówkowego. Po zwykłym odsączeniu węgla, roztwór poddaje się analizie metodą HPLC dla ustalenia wydajności amykacyny i obecności pokrewnych produktów ubocznych.

4/ Poddanie tego roztworu absorpcji na żywicy jonowymiennej i właściwe wyeluowanie rozcieńczonym roztworem amoniaku. Frakcje zawierające amykacynę zbiera się i zatęża pod próżnią.

5/ Dodanie kwasu siarkowego powoduje powstanie siarczanu amykacyny, który wykrystalizowuje po dodaniu metanolu. Po oddzieleniu i wysuszeniu substancji stałej otrzymuje się finalny siarczan amykacyny.

Próby acylowania przy pH 10 i 12,7 przeprowadzono stosując dokładnie następujące warunki eksperymentalne podane w opisach patentowych St. Zjedn. Am. nr 4136254 i 4547492 dla porównania i wykazania korzyści wynikających z realizacji sposobu według wynalazku.

Do 450 ml wody dodaje się 53,4 g związku pośredniego o wzorze 4 o czystości 89,5% (HPLC) i rozpuszcza się go za pomocą kwasu octowego. Po mieszaniu przez 30 minut w temperaturze pokojowej, dodaje się odpowiednią ilość 20% NaOH (gdy potrzeba) dla doprowadzenia pH do wartości potrzebnej dla porównania wydajności i selektywności (patrz tabela 2). Po dalszych 30 minutach w temperaturze pokojowej 41,75 g estru kwasu 4-N-benzyIoksykarbonylo-L-4-amino-2hydroksymasłowego i N-hydroksysukcynimidu w 770 ml chlorku metylenu dodaje się bardzo szybko w dwóch porcjach, dwie trzecie i jedną trzecią po 30 minutach. Mieszaninę utrzymuje się w trakcie intensywnego mieszania przez noc i potem dokładnie oddestylowuje się rozpuszczalnik. Do roztworu dodaje się 54 g 5% Pd/C i prowadzi się hydrogenolizę dodając 24 ml kwasu mrówkowego. Po 30 minutach w temperaturze pokojowej uwodornienie przebiega do końca. Po odsączeniu zużytego katalizatora i przemyciu wodą otrzymuje się roztwór (uzyskaną objętość podano w tabeli 2), w którym oznacza się zawartość amykacyny i pokrewnych produktów ubocznych stosując metodę HPLC. Wyszystkie te dane przedstawione są w tabeli 2. Roztwór następnie absorbuje się na żywicy jonowymiennej typu Zerolit (znak towarowy firmy Rohm and Haas) o czystości chromatograficznej, w postaci słabo kwaśnej, po doprowadzeniu do pH 7,5. Elucję przeprowadza się stosując liniowy gradient amoniaku od 0,5 do 1,5 M. Frakcje śledzi się za pomocą TLC i zbiera się razem frakcje 300-350. Roztwór amykacyny zatęża się przez oddestylowanie wody pod próżnią i w warunkach ścisłej kontroli temperatury dla osiągnięcia końcowego stężenia amykacyny wynoszącego 20%. Dodaje się kwas siarkowy aż do osiągnięcia pH 2,5 i potem dodaje się węgiel. Po mieszaniu przez 30 minut, węgiel odsącza się, pozostałość przemywa się wodą i do roztworu dodaje się powoli 3 objętości metanolu. Krystalizacja zachodzi w temperaturze pokojowej w ciągu 2 godzin. Białą substancję stałą odsącza się i suszy pod próżnią w 45°C przez 24 godziny. Jej ilość podano w tabeli 2 (w której kreska oznacza, że siarczanu amykacyny nie wyodrębniono), po przeprowadzeniu eksperymentów do końca. Końcową analizę przeprowadzono metodą HPLC i mikrobiologicznie.

Tabela 2

Wartość pH	Objętość roztworu wodnego po hydrogenokzie (ml)	Amykacyna (mg/ml. g)	BBK11 (mg/ml)	Dl(HABA) ΚΑΝΑ (mg/ml)	Kanamycyna (mg/ml)	W\dajno$ć stechiometrvczna ze związku o wzorze 4 do amykacyny (%)	Siarczan AMK (g)	Zmg/ml a/	Selektywność b
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
3	1540	2 40. 3.69	0.4	0,55	1700	9.9		3.35	7Ί
3.5	1672	3.30. 5.50	0.25	0.20	15.20	15.0	-	3 75	S8
4	1628	8.95. 14.57	0.3	0.60	10 10	39.0	17.3	9.85	91
4.5	1840	9.90; 18,35	0,289	0,46	6,70	49,4	21,58	10.64	93,0
5	2300	9.52,21.09	0,207	0.60	4,40	59,2	25,76	10,327	92.2
5.5	2100	10,56,22.18	0.166	0.71	4.53	59.7	25.44	11.436	92 3
6	1950	12,20. 24,03	0,256	1.05	3.49	64.7	28,97	13,606	90.4
7	1820	12.«, 22,70	0,466	2,85	2.10	61.1	26.70	15.716	78 9
8	1430	13.80, 19.60	0,35	5,57	2,35	53.0	23,30	19.72	70,0
9	1716	11,45, 19,64	0,35	5,10	1.95	53 0	23,30	16,90	67,0
io'	40	11.70, 0,468	1.02	5.60	3.39	40.0	0.55	18 32	63.8
12.7-	250	6.38, 1,59	0,60	3.10	2.29	39,0	1.85	10.08	63.2

a/ Suma amykacyny i pokrewnych produktów ubocznych (BBK11, Dl(HABA/KANA) t,/ _AMK0N.1)_¹θ_θ (AMKKN-1) + BBK11 (N-3) + Dl(HABA)KANA (N-l-3) c/ Oparta na przykładzie warunków eksperymentalnych podanych w opisie patentowym St Zjedn Am. nr4 136254,

THP + woda z użyciem 2 mmoli związku pośredniego o wzorze 4 d/ Oparta na przykładzie 1, ustęp (2), podanym w opisie patentowym St Zjedn Am nr 4 547 492 (7 mmoli związku o wzorze 4)

Na podstawie tych prób można wyciągnąć następujące wnioski dotyczące wydajności i ¹ selektywności.

1/ Wydajność. Z danych podanych w siódmej kolumnie tabeli 2 bezpośrednio wynika, że wydajność stechiometryczna ze związku pośredniego o wzorze 4 do amykacyny (w roztworze po etapie hydrogenolizy) jest bezpośrednio związana z pH. Najlepszą wydajność uzyskuje się w przedziale pH 5-7 (59,2-61,1%), przy czym najwyższą osiąga się przy pH 6 (64,7%). Te dane trzeba porównać z danymi w dwóch ostatnich rzędach, przedstawiających wyniki otrzymane z dokładnym zastosowaniem danych eksperymentalnych podanych w dwóch opisach patentowych St. Zjedn. Am. nr 4 136254 i 4 547492 cytowanych powyżej.

161 416

Według opisu patentowego St. Zjedn. Am. nr 4136254 acylowanie tego samego związku pośredniego o wzorze 4 w roztworze tetrahydrofuranu i wody prowadzi się przy pH 10 (ta dana nie była ujawniona i została sprawdzona); wydajność amykacyny, obliczona tak jak we wszystkich innych eksperymentach, wynosi tylko 40%. Natomiast według opisu patentowego St. Zjedn. Am. nr 4 547 492, nie ma dodatku węglanu sodowego do użytego związku pośredniego (który również jest zabezpieczony w pozycji N-3'); stosując te same warunki do związku pośredniego o wzorze 4, uzyskuje się pH 12,7. Przy tym pH wydajność acylowania wynosi 39%. Tak więc według dwóch opisów patentowych, przedstawiających najbliższe znane rozwiązania, osiąga się podobną wydajność, znacznie poniżej wydajności uzyskanej przy pH 6. W rzeczywistości 40% trzeba porównać z 64,7%. '

2/ Selektywność. Jako podano w opisie patentowym St. Zjedn. Am. nr 4 902 790, kluczowym problemem w syntezie amykacyny jest selektywna acylacja grupy aminowej w pozycji N-l kanamycyny (lub pokrewnej pochodnej) w porównaniu z innymi trzema grupami aminowymi w pozycji N-3, N-6' i N-3. Toteż selektywność definiuje się jako stosunek amykacyny do wszystkich produktów otrzymanych przez acylowanie. Są to: - amykacyna (acylacja w N-l) BB-K11 (acylacja w N-3) - dwu-HABA-kanamycyna (podwójna acylacja w N-l i N-3).

Postępując zgodnie ze schematem syntezy podanym w niniejszym opisie patentowym nie można znaleźć śladu BB-K6 (acylacja w N-6') i BB-K29 (acylacja w N-3). Tak więc z tego wynika, że selektywność acylowania wpływa w dużej mierze na wydajność amakacyny. Ponadto niska selektywność oznacza wysoki udział procentowy pokrewnych produktów ubocznych, które muszą być całkowicie wyeliminowane z Analnego produktu, co pociąga za sobą dalsze zmniejszenie wydajności.

Z ostatniej kolumny tabeli 2 wynika, że selektywność jest bardzo wysoka w przedziale pH 3,5-6, natomiast obniża się ona bardzo szybko od pH 7 w górę. Przy właściwej kombinacji wydajności i selektywności również dane przy pH poniżej 4,5 nie są bardzo przydatne, ponieważ wydajność jest dużo niższa niż przy wartościach środkowych. Toteż stwierdzenie, że w przypadku syntezy amykacyny najlepsze wartości pH są zawarte w przedziale 4,5-6,5 jest dobrze uzasadnione. Tych wyników nie można było przewidzieć na podstawie literatury, gdyż jak to już przytoczono powyżej, w publikacji J. J. Wrighta i innych, J. Antibiotics, 29,714 (1976), podano że „stwierdzono niską selektywność acylowania wysoko hydroksylowanych antybiotyków, takich jak gentamycyna B i kanamycyna, przy zmianie pH“. Tutaj znów wyraźnie wykazano, że pH jest ważne dla selektywności, podczas gdy w wyniku dwóch eksperymentów opartych na danych z opisów patentowych St. Zjedn. Am. nr 4 136 254 i 4 547 492 uzyskano selektywność tylko około 63%, czyli wartość znacznie niższą od poziomu 90% osiągniętego w naszych eksperymentach.

Fiq. 2 αθ Οϊ lo 'Ρ. ΓΠ —7 η

Pochodne

CM

ΓΠ

CM sO '*~Α~

Ο >4 uj α

ο ω

γμ σ· £ή αο 4 oo rn m *fi moo ęsi cm* m^oo oo«Z\oo fsjCMpri 0Q

CD aO

7Ih--K00 CO CO ίΜ^βί< >?

cx iaeoco ^£ co

Fig-1

Wzór U

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 10 000 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania amykacyny o wzorze 1 przez acylowanie zabezpieczonej pochodnej kanamycyny A o wzorze 4 za pomocą pochodnej kwasu L-(-)-4-amino-2-hydroksymasłowego (L-HABA) i usunięcie z produktu reakcji grup zabezpieczających, znamienny tym, że acylowanie prowadzi się w temperaturze 0-60°C stosując jako rozpuszczalnik tylko wodę i utrzymując wartość pH w zakresie 3-10.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że reakcję prowadzi się przy wartości pH 4,5-6,5.