PL168506B1 - Sposób wytwarzania bialka z Theobroma cacao PL PL PL PL PL PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania bialka z Theobrom a cacao o masie 67 kD a lub jego fragm entu o co najmniej 20 aminokwasach, znamienny tym, ze sprzega sie kolejne aminokwasy przez wytwarza- nie wiazania peptydowego. 4. Sposób wytwarzania bialka z Theobrom a cacao o masie 47 kD a lub jego fragm entu o co najmniej 20 aminokwasach, znamienny tym, ze sprzega sie kolejne aminokwasy przez wytworze- nie wiazania peptydowego. 7. Sposób wytwarzania bialka z Theobrom a cacao o masie 31 kD a lub jego fragm entu o co najmniej 20 aminokwasach, znamienny tym, ze sprzega sie kolejne aminokwasy przez wytworze- nie wiazania peptydowego. PL PL PL PL PL PL

Description

Ziarna kakaowca (Theobroma cacao) stanowią surowiec do produkcji kakao, czekolady oraz naturalnych kakaowych i czekoladowych esencji smakowo-zapachowych. Jak opisał Rohan („Processing of Raw Cocoa for the Market, FAO/UN (1963)), surowe ziarna kakaowe oddziela się od zebranych owoców kakaowca, z których zwykle usuwa się owocnię, po czym ziarna poddaje się „fermentacji trwającej kilka dni, podczas której ziarna ulegają zabiciu, a z liścieni uwalnia się purpurowy barwnik. Podczas fermentacji powstają „nieznane związki, które podczas wypalania dają charakterystyczny kakaowy smak i zapach. Rohan sugeruje, że w wytwarzaniu prekursora smaku biorą udział polifenole i teobromina. Po zakończeniu fermentacji ziarna suszy się; podczas tego suszenia powstaje charakterystyczne, brązowe zabarwienie, a następnie wysuszone ziarna magazynuje się i wysyła.

Biehl i wsp., 1982, badali rozkład białka podczas beztlenowej inkubacji ziarna kakaowego i zidentyfikowali białka o masie 26 kDa i 44 kDa, które akumulowały się podczas dojrzewania ziaren i ulegały degradacji podczas kiełkowania. Biehl założył, że były to białka zapasowe i sugerował, że te białka mogą być przyczyną powstawania peptydów o specyficznym smaku i zapachu.

Fritz i wsp., 1985, zidentyfikowali polipeptydy o masie 20 kDa i 28 kDa pojawiające się w cytoplazmatycznej frakcji ekstraktów ziarna kakaowego w około 100 dni po zapyleniu. Wydaje się, że białko o masie 20 kDa wykazuje aktywność acylotransferazy glicerylowej.

Pomimo opisanych wyżej wątpliwości w tej dziedzinie wiedzy, dopiero obecnie zidentyfikowano białko rzeczywiście odpowiedzialne za powstawanie smaku i zapachu ziarna kakaowego. Ponadto odkryto, że wbrew przypuszczeniu Fritz'a, jakoby „poziomy mRNA ziarna kakaowego są wyjątkowo niskie w porównaniu z innymi roślinami (cytat), możliwe jest stosowanie technik rekombinacji DNA do wytwarzania takich białek.

168 506

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania białka z Theobroma cacao o masie 67 kDa lub jego fragmentu o co najmniej 20 aminokwasach polegający na tym, że sprzęga się kolejne aminokwasy przez wytworzenie wiązania peptydowego.

Białko o masie 67 kDa wydaje się być najważniejszym produktem translacji będącym przedmiotem zainteresowania spośród białek biorących udział w powstawaniu kakaowego smaku i zapachu. Białko o masie 67 kDa może być przetwarzane in vivo, w wyniku czego powstają polipeptydy o masie 47 kDa i 31 kDa. Dlatego też przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania białka z Theobroma cacao o masie 47 kDa lub jego fragmentu o co najmniej 20 aminokwasach, który polega na tym, że sprzęga się kolejne aminokwasy przez wytworzenie wiązania peptydowego. Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania białka z Theobroma cacao o masie 31 kDa lub jego fragmentu o co najmniej 20 aminokwasach, polegający na tym, że sprzęga się kolejne aminokwasy przez wytworzenie wiązania peptydowego.

'Używane tu określenie „fragment, stosowane do białek lub peptydów dotyczy fragmentu, w którym występuje wystarczająca liczba reszt aminokwasowych, aby fragment taki był użyteczny. Zwykle w takim fragmencie może występować co najmniej cztery, pięć, sześć lub nawet co najmniej 10 lub 20 aminokwasów. Użyteczne fragmenty to te, które są takie same, podobne, albo równoważne fragmentom wytwarzanym naturalnie w etapie fermentacji podczas obróbki ziarna kakaowego. Uważa się, że takie fragmenty biorą udział w reakcjach Maillard'a podczas wypalania, w których powstaje co najmniej kilka ze składników smakowo-zapachowych kakao.

Białka otrzymywane sposobem według wynalazku mogą być białkami syntetycznymi, można je syntetyzować chemicznie lub korzystnie, stosując techniki rekombinacji DNA. Białka tak wytworzone można zatem nazwać „rekombinowanymi białkami. Białka rekombinowane mogą być glikozylowane lub nieglikozylowane: nieglikozylowane białka będą wynikiem ekspresji w układach prokariotycznych.

Theobroma cacao występuje w dwóch podstawowych podgatunkach, Th. cacao i Th. cacao sphaerocarpum. O ile białka według wynalazku mogą pochodzić z tych podgatunków, to wynalazek nie ogranicza się jedynie do wymienionych podgatunków. Na przykład, różne odmiany kakaowca są hybrydami różnych gatunków, przykładem takiej hybrydy jest odmiana trinitario. Białka wytwarzane sposobem według wynalazku kodowane są przez kwas nukleinowy, zwłaszcza DNA kodującego wyżej wymienione białka (albo pierwotne produkty translacji, lub białka przetwarzane lub fragmenty) a miano wicie:

- kwas nukleinowy kodujący białko Th. cacao o masie 67 kDa lub jego fragment;

- kwas nukleinowy kodujący białko Th. cacao o masie 47 kDa lub jego fragment;

- kwas nukleinowy kodujący białko Th. cacao o masie 31 kDa lub jego fragment.

Kwas nukleinowy może pochodzić z degeneracji kodu kwasu białka dzikiego typu i może nim być również kwas nukleinowy, który koduje konserwatywne lub inne nieszkodliwe mutanty, jak również taki kwas nukleinowy, który hybrydyzuje z kwasem dzikiego typu.

Kwas nukleinowy stanowi na ogół rekombinowany kwas nukleinowy, lecz także wyizolowany kwas nukleinowy. Często kwas nukleinowy może być wstawiony do wektora (ekspresyjnego lub innego), takiego jak plazmid. Odpowiednie wektory ekspresyjne zawierają odpowiedni promotor, dobrany w zależności od przewidzianego gospodarza ekspresyjnego. Odpowiednim promotorem dla drożdży jest promotor kinazy pirogronianowej (PK), zaś dla bakterii - silny promotor lambda.

Produkt ekspresji może ulegać sekrecji lub nie. Preferuje się produkt ekspresji ulegający sekrecji, zwłaszcza w eukariotycznych układach ekspresyjnych; w takim przypadku obecna jest odpowiednia sekwencja sygnałowa. Sekwencje sygnałowe pochodzące od gospodarza ekspresyjnego (takie jak z drożdżowego czynnika alfa w przypadku drożdży) mogą okazać się dogodniejsze niż natywne sekwencje sygnałowe kakao.

Manipulacje genetyczne, które prowadzi się w komórkach gospodarzy, mogą być korzystniejsze w prokariotach. Ekspresja natomiast jest korzystniejsza w gospodarzach dopuszczonych do spożycia. Szczególnie preferuje się drożdże Saccharomyces cerevisiae. W celu uzyskania ekspresji białka można wykorzystać cDNA, które jest użyteczne także w badaniach polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP). Do takich badań wytwarza się cDNA znakowany tak, aby możliwe było jego wykrywanie (na przykład znakowany radiologicznie). W takim przypadku preparuje się DNA roślin uprawnych do analizy i trawi się go za pomocą enzymów restrykcyjnych.

168 506

W celu odkrycia genetycznych korelacji pomiędzy roślinami uprawnymi stosuje się technikę blottingu Southern ze znakowanym cDNA. Można wówczas wnioskować odnośnie korelacji fenotypowych.

Wynalazek zostanie zilustrowany poniższymi przykładami, które nre ograniczają jego zakresu. Przykłady odnoszą się do załączonych rysunków, na których: fig. 1 przedstawia mapę regionu kodującego białko o masie 67 kDa, wraz ze współzależnością plazmidów pMS600, pMS700 i pMS800, z których otrzymano dane sekwencyjne; fig. 2 przedstawia całą sekwencję nukleotydową kodującą białko o masie 67 kDa i wyprowadzoną sekwencję aminokwasową; fig. 3 przedstawia sekwencję aminokwasową z fig. 2; fig. 4 przedstawia porównanie pomiędzy białkiem o masie 67 kDa i zapasowymi białkami z nasion innych roślin; fig. 5 przedstawia mapę plazmidu pJLA502; fig. 6 przedstawia schemat konstruowania plazmidu pMS900; fig. 7 przedstawia dwa drożdżowe wektory ekspresyjne stosowane w niniejszym wynalazku; wektor A jest przeznaczony do ekspresji wewnętrznej, a wektor B do sekrecji produktu ekspresji; fig. 8a przedstawia, w odniesieniu do wektora A, część genu pirogronianowej kinazy drożdżowej, uwidoczniając miejsce do klonowania wektora A oraz stosowanie łączników Hin-Nco do składania heterologicznego genu; fig. 8b przedstawia, w odniesieniu do wektora B, część sekwencji sygnałowej drożdżowego czynnika alfa, uwidaczniając miejsce do klonowania wektora B oraz stosowanie łączników Hin-Nco do wytwarzania fuzji w fazie odczytu; fig. 9a przedstawia sposób obróbki plazmidu pMS900 i wytwarzania z niego plazmidów pMS901, pM903, pMS907, pMS908, pMS911, pMS912 ipMS914; fig. 9b przedstawia sposób obróbki plazmidu pMS903 i wytwarzania z niego plazmidów pMS904, pMS905, pMS906, pMS909 i pMS916; fig. 10 przedstawia mapy plazmidów pMS908, pMS914, pMS912, pMS906, pMS916 i pMS910. Fig. 11 przedstawia konstrukcję plazmidu do ekspresji w Hansenula polymorpha białka o masie 67 kDa przy użyciu promotora AOX w zintegrowanym wektorze oraz fig. 12 przedstawia konstrukcję plazmidu do ekspresji w Hansenula polymorpha białka o masie 67 kDa przy użyciu promotora AOX w połączeniu z sygnałem sekrecji drożdżowego czynnika α w zintegrowanym wektorze.

Przykład I. Identyfikacja najważniejszych białek ziarna.

W praktyce nie stosuje się bezpośredniego ekstrahowania białek z ziaren kakao z powodu wysokiej zawartości tłuszczów i polifenoli, dlatego też białka ekstrahowano z proszków acetonowych wytworzonych jak następuje: Dojrzałe ziarna kakaowca z Afryki Zachodniej (Theobroma cacao amelonada) zliofilizowano i wstępnie rozdrobniono w moździerzu za pomocą tłuczka. Lipidy wyekstrahowano metodą ekstrakcji Soxhlet'a eterem dwuetylowym w dwóch czterogodzinnych ekstrakcjach, ziarno suszono i dalej rozdrabniano między ekstrakcjami. Następnie usunięto polifenole i barwniki na drodze kilku ekstrakcji 80% acetonem, 0,1% kwasem tioglikolowym. Masę poekstrakcyjną wysuszono pod próżnią i rozdrobniono na miałki proszek.

Wszystkie białka rozpuszczono przez wymieszanie proszku z buforem ekstrakcyjnym (0,05 M fosforan sodowy, pH 7,2; 0,01 M 2-merkaptoetanol; 1% SDS) w ręcznym homogenizatorze, 5 mg/ml. Zawiesinę ogrzewano w ciągu 5 minut w temperaturze 95°C i odwirowano w temperaturze 18 K w ciągu 20 minut, usuwając w ten sposób substancje nierozpuszczalne. Tak otrzymany klarowny supernatant zawierał około 1 mg/ml całego białka. W wyniku elektroforezy 25 μ\ na żelu SDS-PAGE (Laemmli, 1970) otrzymano 3 główne pasma, z których dwa odpowiadały masom 47 kDa i 31 kDa, i zawierały ponad 60% wszystkich białek. Przypuszcza się, że białka o masach 47 kDa i 31 kDa stanowią podjednostki polipeptydowe głównych białek zapasowych.

Właściwości polipeptydów zapasowych.

Rozpuszczalność polipeptydów o masach 47 kDa i 31 kDa określono wstępnie, wykonując jedno lub dwa szybkie doświadczenia. Dializa roztworu polipeptydu wobec buforu ekstrakcyjnego pozbawionego SDS wykazała nierozpuszczalność polipeptydów o masach 47 kDa i 31 kDa, co oceniono na podstawie ich zdolności do przechodzenia przez 0,22-mikronową błonę.

Szybka chromatografia cieczowa białek (FPLC) wykazała również, że polipeptydy o masach 47 kDa i 31 kDa były silnie zasocjowane po ekstrakcji buforem Mcllvaines'a, pH 6,8 (0,02 M dwusodowego kwaśnego fosforanu miareczkowanego za pomocą 0,1 M kwasu cytrynowego). Z uwagi na swoją rozpuszczalność polipeptydy o masach 47 kDa i 31 kDa są globulinami.

Oczyszczanie głównego polipeptydu.

168 506

Polipeptydy o masach 47 kDa i 31 kDa oczyszczono w dwóch etapach chromatografii żelowej na kolumnie Superose-12 do szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC) firmy Pharmacia lub przez elektroeluowanie pasm otrzymanych w wyniku preparatywnej elektroforezy (Słowa: Superose i Pharmacia są znakami towarowymi). Z 5a mg proszku bceionowego na 1 ml buforu ekstrakcyjnego przygotowano zatężone ekstrakty białkowe, i 1-2 ml ekstraktów naniesiono na żele SDSPAGE o grubości 2 mm. Po przeprowadzeniu elektroforezy, powierzchnię żelu zabarwiono za pomocą wodnego błękitu Coomassie Blue i wycięto skalpelem pasma odpowiadające masom 47 kDa i 31 kDa. Kawałki żelu poddano 24-godzinnej elektroelucji w torebkach do dializy, w przepływającym buforze do elektroforezy, pod napięciem 15 V, a dializat poddano dalszej dializie wobec 0,1% SDS. Próbki można było zatężyć przez liofilizację.

Przykład II. Dane odnośnie sekwencji aminokwasowej białek.

Próbki białka (około 10ug) poddano znanemu sekwencjonowaniu N-końcowych aminokwasów. Polipeptydy o masach 47 kDa i 31 kDa zabezpieczono na N-końcach, tak że z peptydów o masach 47 kDa i 31 kDa wytworzono bromocyjanopeptydy, a z nich wyprowadzono sekwencje aminokwasowe. Bromocyjan rozszczepia łańcuchy polipeptydowe w miejscach reszt metioninowych, tak więc nastąpiło rozszczepienie polipeptydów o masach 47 kDa i 31 kDa na peptydy o masach 24 kDa i 17 kDa. Poza tym z polipeptydu o masie 47 kDa powstał dodatkowy peptyd o masie 20 kDa. Peptydy o masach 24 kDa i 17 kDa posiadały 9 takich samych N-końcowych reszt aminokwasowych. W oparciu o ten fakt i powiązaniu z oczywistym faktem, że polipeptyd o masie 31 kDa nie mógł zawierać ułożonych kolejno obu peptydów wysunięto sugestię, że peptyd o masie 24 kDa powstał na skutek częściowego trawienia, podczas gdy w wyniku pełnego trawienia mógł utworzyć się peptyd o masie 17 kDa. Inną zdumiewającą konkluzją jest spostrzeżenie, że białka o masach 47 kDa i 31 kDa są spokrewnione, i że białko o masie 31 kDa może stanowić dalej procesowaną postać białka o masie 47 kDa. Sekwencję dziewięcioaminokwasową zastosowano do skonstruowania sondy oligonukleotydowej dla genu(ów) białek o masach 47kDa/31 kDa.

Przykład III. Wytwarzanie przeciwciał przeciwko polipeptydom o masach 47kDa i 31 kDa.

Przeciwciała poliklonalne wytworzono metodą Catty'ego i Raykundalia'ego (1988). Surowicę podzielono na próbki o objętości 1 ml i przechowywano w temperaturze -20°C.

Określenie właściwości przeciwciał przeciwko polipeptydom o masach 47 kDa i 31 kDa.

Surowicę natychmiast zbadano przy zastosowaniu techniki podwójnej dyfuzji Ochterloney'ego, w której antygeny i przeciwciała dyfundują w kierunku do siebie od ścianek wyciętych w żelu agarozowym, w buforze sól fizjologiczna-boran. Linie precypitacyjne powstają w miejscach, w których przeciwciało rozpoznaje antygen. Ten test uwidocznił, że wytworzono przeciwciała przeciwko obu antygenom, a ponadto, że pomiędzy polipeptydami o masach 47 kDa i 31 kDa a odpowiadającymi im przeciwciałami zachodziła ekstensywna reakcja krzyżowa. Fakt ten wskazuje na to', że polipeptydy o masach 47 kDa i 31 kDa są ściśle spokrewnione, tak jak sugerowano w związku z wynikami rozszczepienia ich przez bromocyjan.

Frakcję gamma-globulinową surowicy oczyszczono częściowo przez wytrącanie 50% siarczanem amonowym, rozpuszczenie w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) i chromatograficznie na kolumnie do bibułowej chromatografii jonowymiennej DE 52, jak opisał Hill, 1984. Frakcje zawierające gamma-globulinę obserwowano przy 280 nm (OD280 wynosząca 1,4 odpowiada 1 mg/ml gamma globuliny) i przechowywano w temperaturze -20°C.

Skuteczne miano przeciwciał zmierzono przy zastosowaniu techniki wykrywania reakcji antygen-przeciwciało przy użyciu przeciwciał związanych z enzymem (ELISA). Studzienki polistyrenowej płytki do mik-ooanaczeń pokryto antygenem (10 - 1000 ng) i odstawiono na noc w temperaturze 4°C pokryte buforem węglanowym. Studzienki przemyto za pomocą PBS-Tween i dodano badaną gamma globulinę w stężeniach: 10, 1 i 0,1 /rg/ml (rozcieńczenia w przybliżeniu: 1 : 100, 1 : 1000 i 1 : 10000). Jako rozcieńczalnik zastosowano PBS-Tween zawierający 2% poliwinylopirolidon (PVP) i 0,2% BSA. W charakterze próbek kontrolnych zastosowano przedtem immunizowaną surowicę tego samego zwierzęcia. Wiązanie zachodziło w temperaturze '37°C w ciągu 3-4 godzin. Studzienki przemyto jak wyżej i dodano drugie przeciwciało (kozia przeciwkrólicza IgG związana z zasadową fosfatazą) w stężeniu 1 rg/ml, stosując te same warunki, jak w przypadku pierwszego przeciwciała. Studzienki znowu przemyto i dodano substratu zasadowej

168 506 fosfatazy (p-nitrofenylofosforan, 0,6mg/ml, w buforze dwuetanol-amina, pH 9,8). W ciągu 30 minut powstawało żółte zabarwienie wskazujące na reakcję dodatnią, po czym reakcję zakończono za pomocą 3 M NaOH. Zabarwienie określono ilościowo przy 405 nm. Więcej szczegółów odnośnie wj lyawma niw ±>e~r. dam-uou nut *xv evj putwikiuzeny, no^^iu^/nwnwiuiu mają wysokie miano i że mogą być stosowane w stężeniu 1 ug/ml.

Przykład IV. Izolowanie całego RNA z niedojrzałych ziaren kakaowca.

Materiał wyjściowy dla RNA, zawierający dużą ilość mRNA białek zapasowych stanowiły niedojrzałe ziarna kakaowca, w wieku około 130 dni po zapyleniu. Wcześniejsza praca sugerowała, że synteza białek zapasowych w tym okresie osiąga swój szczyt (Biehl i wsp., 1982). Ziarna w tym., wieku są lekko pofałdowane i bladoróżowo-purpurowe.

Wstępnym warunkiem, jaki musiał spełniać cały preparat RNA z ziaren kakaowca było to, aby: po pierwsze nie zawierał on zanieczyszczeń, co oceniono za pomocą widma UV, zwłaszcza w dalekim UV, gdzie czysty RNA można rozpoznać z dużą dokładnością dzięki głębokiemu skokowi przy 230 nm (stosunek 260 nm: 230 nm wynosi w przybliżeniu 2,0), po drugie, aby był on nieuszkodzony, co oceniono metodą elektroforezy próbek zdenaturowanych termicznie w żelu agarozowym, w wyniku której powinny powstać czyste pasma rRNA. Przy wytwarzaniu nieuszkodzonego RNA niezbędne jest zachowanie absolutnej czystości oraz rygorystycznych środków ostrożności przeciwko RNA-azom, które są powszechnie występującymi i bardzo trwałymi enzymami. Szkło laboratoryjne na ogół wypraża się w wysokich temperaturach, a roztwory i aparaturę poddaje się działaniu inhibitora RNA-azy w postaci eteru dwuetylowego kwasu pirowęglowego (DEPC, 0,1%) przed obróbką w autoklawie.

Zwykle, ekstrakcji roślinnego (i zwierzęcego) RNA dokonuje się przez ekstrahowanie białek za pomocą fenolu/chloroformu w obecności SDS, prowadzące do zniszczenia kompleksów białko- . kwas nukleinowy i do hamowania enzymów RNA-az, które występują powszechnie w materiale roślinnym. Po ekstrakcji fenolem, RNA poddaje się obróbce w gradiencie chlorku cezowego, przed lub po precypitacji etanolem. Tym sposobem wytworzono bardziej lub mniej nieuszkodzony RNA, jednakże był on bardzo zanieczyszczony ciemno-brązowym zabarwieniem, prawdopodobnie utlenionymi polifenolami i taninami, które zawsze pozostawały razem z RNA. Wysokie zawartości polifenoli stanowią najważniejszy problem w przypadku tkanek Theobroma.

Z tego powodu zastosowano metodę, w której unika się używania fenolu, a mianowicie metodą Halla i wsp. (1978), która polega na rozbijaniu tkanki w gorącym buforze SDSboranowym, trawieniu białek proteinazą K i wybiórczej precypitacji RNA za pomocą LiCl. Sposób ten zapewniał uzyskanie wysokich wydajności stosunkowo czystego, nieuszkodzonego RNA. Ponieważ jednak zanieczyszczenia w dalszym ciągu stanowiły problem, sposób zmodyfikowano przez zastosowanie powtarzających się etapów wytrącania w LiCl, przy czym po każdym etapie osad rozpuszczano w wodzie i klarowano przy użyciu mikrowirówki. W wyniku takiego postępowania otrzymano preparaty RNA o idealnych widmach, które sprawdziły się dobrze w dalszych testach na ich działanie, takich jak translacja in vitro.

Preparowanie mRNA z całego RNA.

Frakcję mRNA oddzielono od całego RNA na drodze chromatografii powinowactwa na małej (1 ml) kolumnie oligo-dT, przy czym mRNA wiązał się z kolumną poprzez swój koniec poli A. RNA (1 - 2 mg) zdenaturowano przez ogrzewanie w temperaturze 65°C i naniesiono na kclumnę w buforze o wysokiej zawartości soli. Poli A + eluował wraz z buforem o niskiej zawartości soli i zebrano go przez precypitację etanolem. Sposób ten zasadniczo jest taki, jak opisali Aviv i Leder (1972), a zmodyfikowali Maniatisiwsp. (1982). Z 1 mg całego RNA otrzymano około 10-20 ug poli A+ RNA (1 -2%).

Translacja mRNA in vitro.

Dobrym wskaźnikiem czystości i braku uszkodzeń mRNA jest jego zdolność do translacji in vitro. Przy użyciu kolumny oligo-dT dokonuje się selekcji jedynie kwasów mRNA z nieuszkodzonym końcem poli A (koniec 3'), natomiast zdolność wydajnej translacji mają tylko kwasy mRNA posiadające także nieuszkodzony koniec 5' (początek translacji). Translację in vitro przeprowadzono przy użyciu lizatu z kiełków pszennych, pozbawionego RNA (Amersham International), a syntezę nowo powstającego białka kontrolowano przez włączanie metioniny znakowanej S³⁵ (Roberts i Paterson, 1973). Początkowo szybkość syntetyzowania nowo-powstającego białka

168 506 mierzono przez włączenie metioniny-S do substancji, którą można wytrącić za pomocą TCA, zatrzymywanej na sączkach z włókien Szklanych (GFC, Whatman). Rzeczywiste produkty translacji badano metodą elektroforezy w żelu SDS-PAGE, żel nasycano fluorem, suszono i badano autoradiograficznie. Preparaty mRNA były zdolne do wydajnej translacji, a uzyskane produkty translacji obejmowały szeroki zakres mas cząsteczkowych, co wskazywało na to, że otrzymano nieuszkodzone kwasy mRNA nawet największych białek. Żaden z głównych produktów translacji nie odpowiadał wielkością zapasowym polipeptydom o masach 47 kDa i 31 kDa zidentyfikowanym w dojrzałych ziarnach, tak więc stało się oczywiste, że nowo powstające polipeptydy muszą ulegać znacznemu procesowaniu, w wyniku którego tworzą się formy dojrzałe.

PrzykładV. Identyfikacja prekursora polipeptydów o masach 47kDa i 31 kDa przez immunoprecypitację.

Z uwagi na to, że zapasowe polipeptydy o masach 47 kDa i 31 kDa nie były widoczne wśród produktów translacji mRNA z rozwijających się ziaren kakaowca, do identyfikacji prekursorów w mieszaninie translacyjnej zastosowano technikę immunoprecypitacji przeciwciałami swoistymi wobec polipeptydów zapasowych. Zrobiono tak z dwóch powodów: po pierwsze - w celu potwierdzenia, że odpowiedni mRNA był obecny przed klonowaniem, a po drugie - w celu uzyskania informacji odnośnie przewidywanej wielkości genów kodujących.

Immunoprecypitację przeprowadzono metodą Cuming'a i wsp., 1986. Produkty translacji in vitro, znakowane S poddano dysocjacji w SDS i dopuszczono do wiązania się ich ze swoistym przeciwciałem w PBS + 1% BSA. Następnie mieszaninę przeciwciało-antygenen zmieszano z białkiem A-Sepharose i inkubowano na lodzie aby IgG związała się z białkiem A. Zawiesinę umieszczono w strzykawce jednorazowego użytku o pojemności 1 ml i niezwiązane białka usunięto, przemywając PBS +1% Nonidet P-40. Związane przeciwciało wypłukano 1 M kwasem octowym, a białka wytrącono za pomocą TCA. Kompleks przeciwciało-antygen zdysocjowano w SDS i poddano elektroforezie SDS-PAGE oraz fluorografii uwidoczniającej, które znakowane antygeny związały się ze swoistymi przeciwciałami.

Wyniki wskazywały na to, że oba przeciwciała, anty-47 kDa i anty-31 kDa wytrącały prekursor o masie 67 kDa. Masa prekursora odpowiadała głównemu pasmu produktów translacji in vitro. Wyniki doświadczenia z przeciwciałami 47 kDa i 31 kDa potwierdziły, że polipeptydy pochodzą od jednego prekursora lub prekursorów o takiej samej masie. Duża masa prekursora sugerowała, że w celu otrzymania klonów może być konieczna selekcja pod względem wielkości mRNA lub cDNA.

Przykład VI. Synteza cDNA z preparatów mRNA.

Syntezy cDNA dokonano przy zastosowaniu zestawu firmy Amersham International. Pierwszą nić cDNA zsyntetyzowano przy użyciu enzymu odwrotnej transkryptazy, czterech zasad nukleotydowych DNA (dATP, dTTP, dGTP, dCTP i startera oligo-dT). Drugą nić zsyntetyzowano metodą Gubler'a i Hoffman'a (1983), w której nić RNA rozrywa się w wielu miejscach za pomocą RNA-azy H, a pozostałe fragmenty stosuje się do syntezy na drodze wymiany nowej nici DNA, którą to syntezą kieruje enzym polimeraza DNA IE. coli. Wystające końce 3' DNA wypełnia się przy użyciu polimerazy T4. Cały proces kontrolowano przez dodanie do wyjściowej mieszaniny nukleotydów małej ilości dCTP-[p³²] i mierzenie w % włączania znakowanego nukleotydu do DNA. Zakładając, że nukleotydy nieznakowane ulegają włączaniu z taką samą szybkością i że cztery zasady ulegają włączaniu równomiernie, można ocenić przebieg syntezy cDNA. Z 1 pg mRNA zsyntetyzowano w przybliżeniu 140 ng cDNA. Produkty analizowano na alkalicznym 1,4% żelu agarozowym tak, jak ujawniono w sposobach Amersham'a. cDNA globiny, który syntetyzowano w zestawie jako kontrolę, przepuszczono przez ten sam żel, który wysuszono i poddano autoradiografii. Masy cząsieczkowe cDNA z kakaowca wahały się w pewnym zakresie, przy czym jest on dłuższy od cDNA globiny zasadniczo o więcej niż 600 bp.

Przykład VII. Klonowanie cDNA w wektorze plazmidowym metodą przyłączania identycznych zasad do końca 3' cząsteczki DNA (Homopolymer Tailing).

Sposób klonowania cDNA w wektorze plazmidowym polegał na tym, że koniec 3' cDNA przedłużono resztami dC przy użyciu enzymu terminalnej transferazy (Boehringer Corporation Ltd) i zhybrydyzowano z plazmidem przeciętym przez Pstl i przedłużonym na końcu 5' (Maniatis i wsp., 1982, Eschenfeldt i wsp., 1987). Optymalna długość przedłużenia dC wynosi 12 - 20 reszt. Reakcję przedłużania (warunki jak podane przez wytwórców) kontrolowano przy użyciu frag8

168 506 mentu restrykcyjnego o długości 1,5 kb z tępymi końcami, pobierając próbki co pewien czas i obserwując włączanie małych ilości dCTP znakowanego [P³²]. Próbkę cDNA (70 ng) przedłużono w ustalonych z góry warunkach.

Wektor plazmidowy z przedłużeniem dG (pUC9 z przedłużeniem 3'-oligo(dG)) zakupiono w firmie Pharmacia. 15 ng wektora poddano hybrydyzacji z 0,5 - 5 ng cDNA w temperaturze 58°C w ciągu 2 godzin w buforze do hybrydyzacji: 5 mM Tris-HCl, pH 7,6; 1 mM EDTA, 75 mM NaCl w całkowitej objętości 50 gl. Mieszaniną poddaną hybrydyzacji stransformowano E. coli RPI (Bethesda Research Laboratories), a transformanty wyselekcjonowano na agarze -a+100gg/ml ampicyliny. Otrzymano około 200 transformantów na 1 ng cDNA. Transformanty utrzymywano przez hodowanie ich w 100gl pożywki L, w studzienkach płytki do mikrooznaczeń, dodając 100 gl 80% glicerolu i przechowując w temperaturze -20°C.

Pewną ilość cDNA przedłużonego o dC wyselekcjonowano przez elektroforezę w 0,8% żelu agarozowym, wycięcie kawałków żelu z miejsc odpowiadających 0,5,1,0 i 1,5 kb, wstawienie bibuły DE81 i kontynuowanie elektroforezy do momentu, aż cDNA wniknął na bibułę DE81. Następnie DN A wypłukano z bibuły za pomocą buforu o wysokiej zawartości soli sposobem Dretzen'a i wsp. (1981).

Przykład VIII. Konstruowanie sond oligonukleotydowych dla genu białek 47/31 kDa.

Sekwencja aminokwasowa z bromocyjanopeptydu wspólna dla polipeptydów o masach 47 kDa i 31 kDa jest następująca:

Met-Phe-Glu-ALa-Asn-Pro-Asn-Thr-Phe, a najmniejszą sondę o 17 resztach (mieszanina 32) przedstawiono poniżej:

Met-Phe-Glu- AL a-Asn-Pro

5' ATG TTT GAA GCT AAT CC

CG CC A G

Czynna sonda była antysensowna, tak aby można ją było stosować do sondowania mRNA. Sondę zsyntetyzowano w urządzeniu Applied Biosystems.

Przykład IX. Zastosowanie oligonukleotydów do sondowania biblioteki cDNA.

Sondy oligonukleotydowe znakowano na końcach 5' za pomocą gamma-[P³2]dATP i enzymem kinazą polinukleotydową (Amersham International). Stosowano metodę Woods'a (1982, 1984) z takim wyjątkiem, że do znakowania około 40 ng sondy w 10 nM MgCh, 100 mM Tris-HCl, pH7,6; używano mniejszej ilości izotopu (15 gC) oraz 20 mM 2-merkaptoetanolu.

Bibliotekę cDNA namnożono na nylonowych błonach GeneScreen (New England Nuclear) umieszczonych na powierzchni płytek z agarem L + 100 gg/ml ampicyliny. (Słowo GeneScreen jest znakiem towarowym). Kolonie przeniesiono z płytek do mikrooznaczeń na błony przy użyciu urządzenia z wypustkami 6X8, dopasowanego do studzienek połówki płytki do mikrooznaczeń. Kolonie hodowano w ciągu nocy w temperaturze 37°C, zlizowano przy użyciu wodorotlenku sodowego i związano z błonami jak opisał Woods (1982, 1984). Po wysuszeniu płytki przemyto dokładnie w 3 X SSC/0,1% SDS o temperaturze 65°C i poddano hybrydyzacji ze znakowaną sondą przy użyciu urządzenia Hybaid firmy Hybaid Ltd, Po Box 82, Twickenham, Middlesex. (Słowo Hybaid jest znakiem towarowym). Stosowano warunki hybrydyzacji jak opisali Mason i Williams (1985), a Td obliczono dla każdego oligonukleotydu według wzoru:

Td = 4°C na parę zasad GC + 2°C na parę zasad AT (W przypadku pozycji złożonych stosowano najniższą wartość).

Hybrydyzację prowadzono w Td: -5°C. Przemywano w 6XSSC, 0,1% SDS, początkowo w temperaturze pokojowej w urządzeniu Hybaid, a następnie w temperaturze hybrydyzacji (Td: -5°C) w ciągu kilku godzin i ostatecznie w temperaturze Td w ciągu dokładnie 2 minut. Błony poddano autoradiografii na filmie FujiX-ray, przeszukując intensywnie w temperaturze -70°C. (Słowo Fuji jest znakiem towarowym). Po 24 - 48 godzinach powstały dodatnie kolonie w postaci wystających kropel na podłożu.

168 506

Przykład X. Analiza klonów dodatnich dla polipeptydu 47kDa/31 kDa.

Otrzymano tylko jeden dodatni klon, pMS600. Uwolnił on w trakcie trawienia dwa fragmenty Pstl, o całkowitej długości 1,3 kb niewystarczającej do zakodowania prekursora o masie 67 kDa. Całą wstawkę usunięto z wektora w postaci fragmentu HindIII- EcoRI, dokonano przemieszczenia pęknięć i zastosowano do sondowania biblioteki cDNA, wychwytując dwa dodatkowe dodatnie klony, pMS700 i pMS800. Mapowanie restrykcyjne wszystkich trzech wstawek doprowadziło do otrzymania mapy pokrywających się fragmentów o długości blisko 2,0 kb wystarczającej do zakodowania prekursora o masie 67 kDa (patrz fig. 1).

Przykład XI. Sekwencjonowanie sklonowanych wstawek.

Strategia sekwencjonowania polegała na klonowaniu wstawek i klonowaniu odpowiednich ich subklonów w wielokrotnym miejscu do klonowania plazmidów pTZ18R/pTZ18/19R (Pharmacia). Plazmidy te są skonstruowane w oparciu o lepiej znane wektory pUC18/19 (Norrander i wsp., 1983), lecz zawierają jednoniciowy początek replikacji pochodzący z włókienkowatego faga f1. Superinfekcja fagami w tej samej grupie indukuje jednoniciową replikację plazmidu, a pojedyncze nici są upakowywane i w postaci fagów wydzielane do otoczenia. Znanymi sposobami dla fagów M13 (Miller, 1987) można z tych „fagów“ wypreparować DNA i sekwencjonować metodą Sanger'a (1977) przy użyciu odwróconego startera do sekwencjonowania. Stosowany do superinfekcji fag M13K07 pochodzi od faga M13, ulega słabej replikacji i dlatego nie współzawodniczy z plazmidem, a ponadto zawiera marker selekcyjny w postaci oporności na kanamycynę. Dalsze szczegóły sposobów wytwarzania pojedynczych nici z plazmidów pTZ oraz fagów pomocniczych dostarcza firma Pharmacia. Sekwencję DNA zestawiono i przeanalizowano stosując zestaw programów komputerowych Staden'a (Staden, 1986) na komputerze Prime 9955. (Słowo Prime jest znakiem towarowym).

Przykład XII. Cechy cDNA dla 47kDA/31 kDa i wprowadzona sekwencja aminokwasowa prekursora o masie 67 kDa.

Analiza sekwencji DNA trzech klonów dodatnich, pMS600, pMS700, pMS800 potwierdziła nakładanie się przewidywane według fig. 1. W zachodzących na siebie regionach nie znaleziono różnic w sekwencji (w sumie około 300 bp), co sugeruje, że trzy kwasy cDNA pochodziły z tego samego genu. Sekwencję połączonych kwasów cDNA zawierającą 1818 zasad przedstawiono na fig. 2. Pierwszy kodon ATG znaleziony w pozycji 14 poprzedza otwartą fazę odczytu 566 kodonów. Występuje tam nieulegający translacji region 3' o 104 zasadach, zawierający sygnał poliadenylacji w pozycji 1764. Sekwencję sondy oligonukleotydowej' znaleziono w pozycji 569.

Wynikiem translacji otwartej fazy odczytu jest polipeptyd o 566 aminokwasach, (fig. 2) i masie cząsteczkowej wynoszącej 65612, zasadniczo bliskiej masie 67 kDa otrzymanej w wyniku pomiaru na żelach SDS-PAGE. Reszty N-końcowe są wyraźnie hydrofobowe i przypominają typowe sekwencje sygnałowe. Sugeruje się według zasad Von Heije'a (1983) przewidywania miejsc odszczepiania sekwencji, że miejsce rozszczepienia znajduje się pomiędzy aminokwasami 20 i 21 (patrz fig. 3). Region następujący po tym miejscu jest bardzo hydrofobowy i zawiera cztery następujące motywy: Cys-X-X-X-Cys. N-koniec dojrzałego białka wstępnie zidentyfikowano jako resztę glutaminową w pozycji 135 (fig. 3), przy użyciu kilku próbnych sekwencji N-końcowych (EEPGSQFANPAYHF). Ten koniec mógłby przedstawiać dojrzałe białko o masie 49069 Da, co z grubsza zgadza się z danymi z obserwacji. Wydaje się, że w sekwencji dojrzałego białka nie ma miejsc glikozylacji (Asn-X-Ser/Thr). Homologie pomiędzy prekursorem o masie 67 kDa a innymi znanymi białkami.

Poszukiwania prowadzone w danych identyfikacyjnych białek PIR oraz w literaturze ujawniły ścisłe homologie pomiędzy polipeptydem o masie 67 kDa a klasą zapasowych białek zwanych wicylinami, jedną z dwóch głównych klas globulin znalezionych w nasionych (Borroto i Dure, 1987). Porównanie pomiędzy polipeptydem o masie 67 kDa i wicylinami z bawełny (Gossypium hirsutum, Ghi), soi (Glycine mas, Gma), grochu (Pisum sativum, Psa-c jest konwicyliną, Psa-v jest wicyliną) i fasoli (Phasedus vulgaris, Pvu) przedstawiono na figurze 4 (Bown i wsp , 1988; Chlan i wsp., 1986; Doyle i wsp., 1986; Lycett i wsp., 1983). Reszty identyczne zaznaczono za pomocą ramek.

Wszystkie dojrzałe białka z klasy wicylin mają masę cząsteczkową około 47 kDa, za wyjątkiem konglicyny alfa i podjednostek alfa 1 o masach cząsteczkowych wynoszących odpowiednio 72 kDa i 76 kDa, i dojrzałej konwicyliny grochu o masie cząsteczkowej 64 kDa. Podjednostki z grochu i

168 506 fasoli (po dwie podklasy) są syntetyzowane w postaci małych prekursorów, o masach wynoszących około 50 kDa. Najwyraźniejsza jest homologia polipeptydu o masie 67 kDa z wicyliną z bawełny (Chlan i wsp., 1986). Bawełna jest również najbliżej spokrewniona z kakaowcem - obie rośliny należą do rzęou ślazowatycn. inteiesujące jest, że prekursor pochodzący z bawełny ma masę cząsteczkową wynoszącą 69 kDa, zawiera krótką sekwencję sygnałową, dużą domenę hydrofilową zawierającą sześć motywów Cys-X-X-X-Cys i domenę dojrzałego białka. W związku z tym istnieje możliwość syntetyzowania odpowiedniego białka bawełny przy zastosowaniu technik analogicznych do ujawnionych w niniejszym zgłoszeniu i stosowania białka bawełny lub jego fragmentów do wytwarzania dodatków smakowo-zapachowych.

Przykład XIII. Ekspresja polipeptydu o masie 67 kDa w E. coli.

Przed włączeniem do wektora ekspresyjnego regionu kodującego polipeptyd o masie 67 kDa, zachodzące na siebie fragmenty z trzech oddzielnych dodatnich klonów należało złożyć tak, aby utworzyć ciągły fragment DNA. Metodę składania zilustrowano na fig. 6: fragment Hindlll-Bglll z pMS600, fragment Bglll-EcoRI z pMS700 i fragment EcoRI-SalI z pMS800 zligowano z pTZ19R przeciętym restryktazami HindlU i SaII. Tak otrzymany plazmid zawierający cały cDNA polipeptydu o masie cząsteczkowej 67 kDa nazwano pMS900. W miejscu kodonu startu ATG wprowadzono miejsce Ncol przy użyciu mutagennego startera.

5' TAG CAA CCA TGG TGA TCA 3'

Mutagenezę in vitro przeprowadzono za pomocą zestawu sprzedawanego przez firmę Amersham International metodą Eckstein'a i wsp. (Taylor i wsp., 1985). Po sparowaniu mutagennego startera z jednoniciowym DNA, podczas syntezy drugiej nici w miejscach dCTP włączaniu ulegał alfa-tio-dCTP. Po przedłużeniu i zligowaniu do zamkniętej postaci kolistej, plazmid trawiono enzymem NciI, który nie rozrywa DNA zawierającego tio-dC. Tak więc, jedynie pierwotna nić ulegała rozrywaniu i kolejnemu trawieniu egzonukleazą III. Następnie ponownie zsyntetyzowano pierwotną nić, przy czym jako startery służyły pozostałe fragmenty DNA, uzupełniając zmutowane miejsce w pierwotnej nici. Następnie plazmidami transformowano E. coli i kontrolowano przy zastosowaniu minipreparatów plazmidowych.

Następnie cDNA polipeptydu o masie 67 kDa klonowano w plazmidzie ekspresyjnym E. coli, pJLA502 (fig. 5), we fragmencie Ncal-Sall (pMS902). pJLA502 (Schauder i wsp., 1987) jest do nabycia w firmie Medac GmbH, Postfach 303629, D-7000, Hamburg 36. Zawiera on silne promotory lambda, Pl i Pr, sekwencję liderową i miejsce wiążące rybozomy genu atpE E. coli ulegającego bardzo wydajnej translacji. Plazmid ten zawiera również represor CI wrażliwy na temperaturę, tak więc ekspresja ulega represji w temperaturze 30°C, a aktywacji w temperaturze 42°C. Wektor posiada miejsce Ncol (zawierające kodon ATG: CCATGG) prawidłowo umiejscowione względem miejsca wiążącego rybozony; obce sekwencje kodujące wprowadza się w tym miejscu.

Wektorem ekspresyjnym stransformowano E. coli UT580. Stransformowany szczep hodowano w pożywce L z ampicyliną (10(^g/ml) w temperaturze 30 °C do osiągnięcia logarytmicznej fazy wzrostu (OD610 = 0,5), następnie temperaturę zwiększono do 42°C i co pewien czas pobierano próbki. Próbki rozpuszczono we wrzącym' buforze SDS i przepuszczono przez żele SDS-PAGE. Stosowano elektroblotting białek na błonach nitrocelulozowych (Towbin i wsp., 1979) i analizowano metodą Western blotting przy użyciu przeciwciała przeciwko peptydowi o masie 21 kDa wytworzonego jak opisano wyżej w przykładzie III (2 ^g/ml), a w charakterze drugiego przeciwciała stosowano kozią przeciwkróliczą IgG w połączeniu z alkaliczną fosfatazą (Scott i wsp., 1988).

Plazmid pMS902 wytwarzał pasmo charakterystyczne dla masy 67 kDa, co wskazuje na to, że obecny był działający gen.

Przykład XIV. Ekspresja polipeptydu o masie 67kDa w drożdżach.

Zastosowano dwa drożdżowe wektory ekspresyjne, oba oparte o wahadłowy wektor drożdżowo-E. coli zawierający miejsca początku replikacji z drożdży i z E. coli oraz odpowiednie markery selekcyjne (oporność na ampicylinę dla E. coli i auksotrofię leucynową dla drożdży). Oba wektory zawierają drożdżowy promotor kinazy pirogronianowej (PK) i sekwencję liderową oraz posiadają miejsce do klonowania HindlU znajdujące się w kierunku w dół od promotora. Jeden z tych wektorów - wektor A (YVA) przeznaczony jest do ekspresji wewnętrznej, a drugi - wektor B (YVB) do ekspresji wraz z sekrecją i posiada część sekwencji sygnałowej drożdżowego płciowego czynnika a, położoną w kierunku w dół od promotora oraz miejsce HindlU służące do wytwarza168 506 nia białek fuzyjnych przy użyciu dołączanych sekwencji kodujących. Wektory te przedstawiono na fig 7.

Aby wydajnie stosować wektory, pożądane jest wprowadzenie obcego regionu kodującego; w przypadku wektora A - regionu od miejsca do klonowania HindlU do startu ATG, takiego samego jak drożdżowy gen PK, a w przypadku wektora B - reszty sekwencji sygnałowej czynnika α, włącznie z lizyną w punkcie rozszczepienia. W praktyce osiągnięto to przez zsyntetyzowanie dwóch kompletów łączników Hindlll-Ncol służących do zlikwidowania luki pomiędzy miejscem do klonowania HindIII w wektorze i Ncol w miejscu startu ATG sekwencji kodującej. Zilustrowano to na fig. 8.

W celu zastosowania drożdżowego wektora B, najpierw należy dokonać delecji hydrofobowej sekwencji sygnałowej z cDNA peptydu o masie 67 kDa. Chociaż brak było bezpośredniego dowodu na położenie naturalnego miejsca rozszczepienia, algorytm Von Heije'ego przewiduje położenie tego miejsca pomiędzy aminokwasami 20 (alanina) i 21 (leucyna). Jednakże zdecydowano usuńąć aminokwasy 2-19 przez delecję, tak aby potrzebne miejsce Ncol w miejscu startu translacji mogło pozostać.

Dla ułatwienia konstruowania wektorów drożdżowych zastosowano następującą strategię: najpierw klonowano łączniki Hindlll-Ncol w odpowiednich plazmidach PTZ, a potem w wektorach drożdżowych klonowano łączniki wraz z regionem kodującym, we fragmentach HindUIBamHI. Jednakże region kodujący zawiera wewnętrzne miejsce BamHI, które musiało zostać usunięte przez mutagenezę in vitro, w wyniku czego otrzymano plazmid pMS903. Z pMS903 usunięto sekwencję sygnałową przez użyciu mutagennego startera:

5' AGCATAGCAACCATGGTTGCTTTGTTCT 3' otrzymując pMS904. W pMS903 i pMS904 klonowano odpowiednie łączniki Hindlll-Ncol, otrzymując odpowiednio pMS907 i pMS905, a fragmenty Hindlll-BamHI tych przejściowych plazmidów (łączniki + region kodujący) subklonowano odpowiednio w YVA i YVB, uzyskując drożdżowe plazmidy ekspresyjne pMS908 i pMS906. Te i inne konstrukcje przedstawiono schematycznie na fig. 9.

Dalszą modyfikację wprowadzono przez skonstruowanie wektora ekspresyjnego, w którym usunięto roślinną sekwencję terminacji i zastąpiono ją drożdżową sekwencją terminacji ADH (występującą w YVA i YVB). Roślinną sekwencję sygnałową usunięto przez przecięcie przejściowych plazmidów pMS907 i pMS905 w miejscu PvuII znajdującym się zaraz za regionem kodującym w kierunku w dół, w pozycji 1716 na fig. 2. Dodano łączniki HindlU i cały region kodujący klonowano w drożdżowych wektorach ekspresyjnych we fragmentach HindlU-HindlU, otrzymując plazmidy ekspresyjne pMS914 (YVA) i pMS916 (YVB) (fig. 9). Wykonane konstrukcje przedstawiono na fig. 10.

Drożdżowe plazmidy ekspresyjne przeniesiono do drożdżowych sferoplastów metodą Johnston'a (1988). Jako gospodarza do transformacji zastosowano szczep AH22 LEU^- i wyselekcjonowano transformanty na minimalnej pożywce bez leucyny Transformanty LEU+ występowały w postaci pasm pojedynczych kolonii, które hodowano w 50 ml pożywki YEPD (Johnston, 1988) w temperaturze 28°C w celu zbadania zasięgu i rozkładu obcego białka. Z hodowli zebrano komórki w przedtem zważonych probówkach przy użyciu wirówki i przemyto 10 ml buforu lizującego (200 mM Tris, pH 8,1; 10% glicerol). Substancję komórkową zebrano i zatężono 10 - 25 razy w minizatężeniu Amicon (Słowo Amicon jest znakiem towarowym). Przemyte komórki zważono i ponownie zawieszono w buforze lizującym z dodatkiem inhibitorów proteazy (1 mM fenylometylosulfonyiofluorku (PMSF); 1 gg/ml trasylolu, 0,5 gg/ml leupeptyny) w stężeniu 1 g/ml. Dodano jedną objętość kulek szklanych przemytych kwasem i rozbijano komórki przez wirowanie trwające 8 minut, stosując jednominutowe impulsy i jednominutowe przerwy, na lodzie. Po sprawdzeniu pod mikroskopem, czy komórki zostały rozbite, mieszaninę odwirowano w ciągu 3 minut z szybkością 7000 obrotów/minutę w celu osadzenia szklanych kulek. Supernatant· usunięto do schłodzonej przedtem probówki do wirowania i wirowano w ciągu 1 godziny z szybkością 20000 obrotów/minutę. (Małe próbki można wirować w mikrowirówce, w niskiej temperaturze). Supernatant tworzy rozpuszczalną frakcję. Osad ponownie zawieszono w 1 ml buforu lizującego z dodatkiem 10% SDS i 1% merkaptoetanolu i ogrzewano w temperaturze 90°C w ciągu 10 minut. Po 15 minutowym odwirowaniu w mikrowirówce powstał supernatant tworzący jednorodną frakcję.

168 506

Próbki każdej frakcji i substancji zatężonej poddano analizie blottingowej Western. Odnośnie plazmidów przeznaczonych do ekspresji wewnętrznej w YVA, pMS908 wytwarzał immunoreaktywne białka o masach 67 kDa i 16 kDA jedynie wewnątrz komórek. Nie obserwowano sekrecji białka o masie 67kDa pod wpływem jego własnej sekwencji sygnałowej. Przypuszcza się, mniejsze białko stanowi produkt degradacji. Podobny wynik, lecz z lepszą ekspresją, otrzymano przy użyciu plazmidu pMS914, w którym roślinną sekwencję terminacyjną zastąpiono drożdżową sekwencją terminacyjną. Nie zachodziła natomiast synteza immunoreaktywnego białka przy użyciu pMS912, w którym usunięto przez delecję region kodujący domenę hydrofilową.

Do wytwarzania białek heterologicznych w drożdżach na skalę przemysłową preferuje się sekrecję, ponieważ komórki drożdżowe trudno ulegają rozbiciu, a procesowanie całego białka komórkowego nie jest łatwe. Wyniki uzyskane przy użyciu wektorów skonstruowanych w celu ekspresji wraz z sekrecją były raczej złożone. Przy użyciu najprostszej konstrukcji, pMS906, w której sekwencja sygnałowa drożdżowego czynnika α zastępuje natywną sekwencję sygnałową białka roślinnego, uzyskano immunoreaktywne białka o masach wynoszących w przybliżeniu 47 kDa, 28 kDa i 18 - 20 kDa, które ulegały sekrecji do środowiska. Na pierwszy rzut oka taki wynik jest zadziwiający, ponieważ wprowadzony region kodujący powinien syntetyzować białko o masie 67 kDa. Najbardziej prawdopodobnym wyjaśnieniem tego jest, że proteaza drożdżową KEX2, która rozpoznaje i odszczepia sekwencję sygnałową czynnika α w miejscu Lys-Arg, rozszczepia również białko o masie 67 kDa w miejscach Lys-Arg w pozycjach 148 i 313 sekwencji aminokwasowej. Obliczone masy fragmentów powstających w wyniku rozszczepiania białka w tych pozycjach wynoszą - 47 179 Da, 28 344 Da i 18 835 Da, zatem są one zbliżone do mas obserwowanych.

W przypadku zastąpienia w pMS916 roślinnej sekwencji terminacji drożdżową sekwencją terminacji, nie uzyskano ekspresji ani w komórkach, ani w pożywce; jest zatem możliwe, że przypadkowo wprowadzono mutację. Przy zastosowaniu konstrukcji pMS910, w której domenę hydrofilową usunięto przez delecję, najważniejszymi antygenami były wydzialane do pożywki białka o masach 28 kDa i 18 - 20 kDa. Przypuszcza się, że produkt o masie 47 kDa ulega rozszczepieniu w miejscu KEX2 w pozycji 313 natychmiast po jego powstaniu. Reasumując, cztery spośród sześciu skonstruowanych wektorów ekspresyjnych kierują syntezą białek, które wykazują reakcję krzyżową z przeciwciałami przeciwko 47 kDa. Dwie z tych konstrukcji powodują sekrecję białek do pożywki.

Przykład XV. Konstrukcja wektorów przeznaczonych do ekspresji białka o masie 67 kDa w Hansenula polymorpha.

Metylotroficzne drożdże Hansenula polymorpha jako gospodarz do ekspresji białek heterologicznych mają szereg zalet w porównaniu z Saccharomyces cervisiae (Europejskie zgłoszenie patentowe nr EP-A-0173378 oraz Sudbery i wsp., 1988). Drożdże hoduje się na metanolu, jako jedynym źródle węgla; w tych warunkach enzym oksydaza metanolowa (MOX) może stanowić do 40% całego białka komórkowego. Tak więc, promotor MOX jest bardzo silnym promotorem, który można stosować w wektorze do kierowania syntezą białek heterologicznych, przy czym jest on wydajny nawet w postaci pojedynczej kopii. Umożliwia to stosowanie wektorów trwale zintegrowanych. Hansenula może także wzrastać na źródłach o dużej zawartości węgla takich jak glukoza, w którym to przypadku promotor MOX ulega całkowitej represji. To oznacza, że komórki zawierające heterologiczny gen można hodować aż do osiągnięcia wysokiej gęstości na glukozie i indukować wytwarzanie obcego białka przez usunięcie glukozy i dodanie metanolu.

Wytworzono plazmid pHGL1 zawierający promotor 1 sekwencję terminacyjną MOX oraz kasetkę zawierającą sekwencję sygnałową sekrecji drożdżowego czynnika a. Region kodujący białko o masie 67 kDa sklonowano w wektorze pHGL1 we fragmencie BamHI-BamHI, zastępując fragment Bg^^II zawierający koniec 3' regionu kodującego MOX. Cały region promotor-gen-sekwencja terminacyjna można wówczas przenieść do YEp13, jako fragment BamHI-BamHI, otrzymując plazmid ekspresyjny pMS922. Szczegóły tej konstrukcji przedstawiono na fig. 11. Skonstruowano analogiczny plazmid ekspresyjny, pMS925 z sekwencją drożdżowego czynnika a połączoną z regionem kodującym białko o masie 67 kDa, zastępując naturalną roślinną sekwencję sygnałową. Kasetkę BamHI-HindlU zawierającą czynnik α poddano ligacji z fragmentem HindfflBamHI, stosowanym do wprowadzenia regionu kodującego białko o masie 67 kDa do YVB. Następnie sekwencję czynnika a wraz z regionem kodującym sklonowano w pHGL1, we fragmen168 506 cie BamHI-BamHI i przeniesiono do YEP13, jak przedtem. Szczegóły przedstawiono na fig. 12.

Dwiema konstrukcjami stransformowano Hansenula i hodowano w warunkach indukcyjnych na 0,5% lub 1% metanolu. Obie konstrukcje wytwarzały immunoreaktywne białko wewnątrz p ał η! knH Iw kwAodzi w\pv/1 w d Λ z^is^ek w»e^non on gntnoJweji

RUlHUl UK, Cl LJ W UUIU w Ul ovi\l Wjy Mltliiici UV pVL· y rv 1V1 V» pl j r» VIII V» vnvji o j £uuiv »t vj czynnika a.

Szczepy E. coli.

PR1 F' vb^Mb ara-14 proA2 leuB6 lacY1 galK2 vpsL20 (str ) xyl-5 mtl-1 supE44

CAG629 lacam tvp am pho am htpR am ma1 rpsL 1on supCts

UT580 (lac-pro) supE thi hsdD5/F'tra D36 proA⁺B⁺ lacl^q lacZ M15

Odnośniki literaturowe

Aviv, H., i Leder, P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69,1408-1412 (1972). Purification of biologically active globin mRNA by chromatography on oligo dT cellulose.

Biehl, B., Wewetzer, C., i Passern, D. J. Sci. Food Agric. 33, 1291-1304 (1982). Vacuolar (Storage) Proteins of Cocoa Seeds and their Degradation during Germination and Fermentation.

Borroto, K., i Dure,L. Plant Molecular Biology 8,113-131 (1987). The globulin seed storage proteins of flowering plants are derived from two ancestral genes.

B own . D., Ellis. T. H. N., i Gatehouse, J. A. Biochem. J. 251, 717-726 (1988). The sequence of a gene encoding convicilin from pea (Pisum sativum) shows that convicilin differs from vicilin by an insertion near the N-terminus.

Catty, D. i Raykundalia, C. Production and Quality control of Polyklonal Antibodies, „ntibodies: A Practical Approach“ Vol I, IRL Press (1988).

Chlan, C. A., Pyle. J. B., Legocki, A. B., i Dure, L. Plant Molecular Biology 7, 475-489 (1986). Developmental biochemistry of cotton seed embryogenesis and germination XVIII. cDNA and amino acid sequences of members of the storage protein families.

Cuming, A. C. Williams, R. S., i Cullimore, J. V. „Immunology in Plant Science“, Wyd. Wang, T. L., Cambridge University Press, 1986. The use of Antibodies in Molecular Biology.

Doyle, J. J., Schuler, M. A., Godette, W. D., Zencer, V., Beachy, R. N., i Slightom, J. L. J. Biol. Chem. 261, 8226-8236 (^b). The glycosylated seed storage proteins of Glycine max and Phaseolus vulgaris: Structural homologies of genes and proteins.

Dretzen, G., Bellard, M., Sassone-Corsi, P., i Chambon, P. Analytical Biochemistry 112,28--286 A reliable method for the recovery of DNA fragments from agarose a nn acrylamide gele.

Eschenfeldt, W. H., Puskas, R. S., i Berger, S. L. Methods m Enzymology 112, 3^37-^^^22 (1987). Homopolymeric Tailing.

Fritz i wsp. (J. Food Sci. 50 846-850 (1865)).

Gubler, U., i Hoffman, B. J. Gene 25, 263 (1983). A simple and very efficient method for generating cDNA libraries.

Hall, T. C., Ma, Y., Buchbinder, B. U., Pyrne J. W., Sun. S. M., i Bliss, F. A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75,3196-3200 (1876). Messenger RNA for G1 protein of French bean seeds: cell-free translation and product rhararthrisation.

Hill, S. A. „Methods in Plant Virology“, Blackwell 1984.

Johnston, J. R., „Yeast: A practical approach.“. Wyd.: Campbell, I., i Duffus. J. H. IRL Press. 1988. Yeast Genetics, Molecular Aspects.

Kreil. G. Annual Rev. Biochem. 50. 317-348 (^U Transfer of proteins across membranes.

Laemmli, U. K. Nature 227,680 (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.

Lipman, D. J., i Pearson, W. R. Science 227, 143--1449 (^^ Rapid protein sequhnre similarity searches.

Lycett, G. W., Delauney, A. J., Gatehouse, J. A., Gilroy, J., Croy, R. R. D., i Boulter, D. Nucleic Acids Res. 11, 2367-2380 (1863).

Maniatis, T., Fritsch, E. F., i Sambrook, J. „Molecular Cloning: A Laboratory Manual“, Cold Spring Harbour Laboratory, 1982.

Mason, P. J., i Williams, J. G., „Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach“, Wyd.: Hames, B. D., i Higgins, S. J. IRL Press 1985. Hybridisation in the Analysis of Recombinant DNA.

Meinhoth, J., i Wahl, G. M. Analytical Biochemistry 138,267 (1984). Methods of Southern blotting and DNA probing.

Miller, H. Methods in Enzymology 152, 145-170 (1867). Practical Aspects of Preparing Phage and Plasmid DNA : Growth. Maintenance and Storage of Bacteria and Bacteriophage.

168 506

Norrander, J., Kempe. T., i Messing, J. Gene 26, 101 (1983). Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagensis.

Proudfoot, N. J., i Brownlee, G. G. Nature 263, 211-214 (1976). 3' Non-coding region sequences in enkayotic messenger RNA.

Roberts, B. E., i Paterson, B. M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70, 2330 (1973). Efficient transiation of tabacco mosaic virus RNA and rabbit globin 9S RNA in a cell-free system from commercial wheat germ.

Sanger, F., Nicklen, S., i Coulson, A. R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.

Schauder,B., Blocker, H., Frank, R.,i McCarthy, J.E. G. Gene 52,279-283(1987). Inducible expression vectors incorporating the E. coli aptE translation initiation region.

Scott, R., Jefferson, R., Dury, G., i Jacob, L., „Plant Genetic Transformation and Gene Expression: A Laboratory Manual“. Wyd.: Draper, J., Scott, R., Armitage, P., Walden, R. Blackwell 1988. Analysis of gene organisation and expression in plants.

Staden, R. Nucleic Acids Res. 14, 217-231 (1986). The current status and portability of our sequence handling software.

Sudbery, P. E., Gleeson, M. A., Veale, R. A., Lederboer, A. M., i Zoetmulder, M. C. M. Biocem. Soc. Trans 16 1081-103 (1988). Hansenula polymorpha as a novel yeast system for the expression of heterologous genes.

Taylor, J. W., Ott, J., i Eckstein, F. Nucleic Acids Res. 13, 8765-8785 (1985). The rapid generation of oligonucleotide-directed nutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA.

Towbin, H. Staehelin, T., i Gordon, J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76,4350-4534 (1979). Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets : procedure and some applications.

Von Heije, G. Eur. J. Biochem 133, 17-21 (1983). Patterns of Amino-acids near Signal-Sequence Cleavage Sites.

Wahl, G. M., i Berger, S. L. Methods in Enzymology 152,415-423 (1987). Screening Colonies of Plaques with Radioactive Nucleic Acid Probes.

Woods, D. E. Focus (Bethesda Research Labs) 6, 3 (1984). Oligonucleotide Screening of cDNA Libraries. Woods, D. E., Markham, A. F., Ricker, A. T., Goldberger, G., i Colten, H. R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5561 (1982).

BAM HIN

Czynnik oć

NCO

HIN | kodujący 67kDa_₍ BAM fragment HIN-BAM z pMS905

3- krotna ligacja z pTZ przeciętym Bam

PROMOTORaox

BAM

NCO

TETR

końniacy 67kDa

ECO pMS925

BAM

TET' en fω e

fli ca n t * §

Λ « w ca

BAM t kodujący 67kDa _EC0

HIN NCO kodujący 67kDa HIN Fragment i-- HIN-HIN e

<0

CQ ε

-M <y

Ή ϋ

Φ

Ν

Οι <Μ

Ε-» α

υ (0 θ' ca o

168 506

FIG, 9B pMS9O3 delecja sekwencji sygnałowej

V pMS904 dodanie łączników Hin-Nco

V pMS905

pMS906 delecja odcinka hydrofilowego pMS909 cięcie za pomocą FvuII dodanie- łączników Hin klonowanie w Yvb we fragmencie Hin pMS916

Serie YVA pMS9O8

FIG. 10 ^pMS’¹⁴ pMS912

-es——IX M

Serie YVB pMS906 —— pMS916 b—KZZZ pMS910 —i/ Z Z ZI

IN. \~ΐ Sygnał 67kDa kakaowca llWWil f Z ZI I-1 ' ^f ’ · Sygnał drożdżowego czynnika o£ ¹-’

Terminator kakaowca ' domena hydrofilową region kodujący 47 kDa terminator drożdżowy

FIC. 9A pMS900

Cały region kodujący kDa v/ pTZ mutageneza in vitro w celu wprowadzenia miejsca Ncol w miejscu ATG pMS901 mutageneza in vitro w celu usunięcia wewnętrznego miejsca BamHI pMS9G3 dodanie łączników Hin-Nco pMS907

delecja odcinka hydrofiłowego cięcie za pomocą dodanie łączników Hin klonowanie w YVA we fragmencie Hin sr v ui j.

pMS911 pMS914 klonowanie w YVA we fragmencie Hin-Bam

V pMS912 η

r\j .Ξ χ

3	o
o>	Eh
	Eh
(0	O
1—(	O
<	U
4J	u
01
s	<
(0	U
r-ł	u
<	u
cn<
u u
<	>cC
ui	,er
►4	λ2
&Eh
Ul	<
<	C3
3	O
ω	Eh
1-1	Eh
	u
V	o
ω
rH	<
(0	Eh
>	O

>.U rH Ο U U 3 <

_C

ŹC co

U O I I I I I 1 -P u (U El s <

ęp	G
<υ			O
			•H
0			CP
•N			0)
»0			u
-N
0			N.
TJ			G
			P
fll			>
?			N
0			ϋ
iM		O	TJ	rtł
rtj		CJ	0	G
C		z		X
Cn		l	0)
>1		Z	•H	r-*
ω		H 33	N rtj
«ί			Ή	S
ΓΊ	nl	•H		>1
□		Λί	2t	O
c	»r*i	Ή
0)	£	c	«J	•n
?	C	N	•m	3
X			N	TJ
ω	N	ftf	3	0
cn	υ		&4

1658506

00 <	00 <
Ι-ι CJ	M O		(U	CJ
< <	< <		r—t	Eh
Μ H	>4 EH		H	<
φ o	fl) U		f—1	CJ
CO Eh	CO Eh		ffl	Eh
4-1 U	4J CJ	cj	>	CJ
fl) Eh	fl) EH	<	4J	CJ
2 <	2 <	Eh	0)	Eh
2	2	CJ	2
U	U	U O		υ
<		< Eh		CJ
o	U	CJ O		<
&H	Eh	Eh <		CJ
<	<	< Eh		E·
u	α	CJ O		<
Eh	Eh	Eh <		O
<	<	< Eh		Eh
α	U	U CJ		<
<	<	2 H		CJ

ο

Η

CJ

CJ

Ο

Ο α

Η

Ε-<

Η

CJ		o
EH		Eh
2 u		2 o
CJ		o
Eh		Eh
Eh		Eh
O	c	O
CJ $		CJ <
3
<
Eh
Eh
Eh

		β »—4	0 r-1
		0	44
		U
			O
		5	Ό
N		fl	fl
fl		β	ϋ
C		0	fl
•H		•H	•π	Ο
44	-n	β	<υ	ο
	Φ	0)	•Η	2
>1		-l-ł	ε	1
5	0	e		2
O	β	N	α	Η
•N	fl		•Η	2
Ό	•H	fl	β
N	β	•Γ-Ϊ	0)	•Η
O	0	υ	Ν	44
	μ	β	J-I	-Η
Ό	tr	<DZ	0	β
	o	3	5	Ν
β	Li	44	4J	U
0)	•H	0)	>ι	fl*
o	CU	W

μ ο

-μ ο

>ι β

α) μ

&

w dla 67 kDa

FIG .7

Οθ cc

XJ w

cu •μ

Ό Λ ·Η Λ Λ

Claims (9)

1. Sposób wytwarzania białka z Theobroma cacao

   1. Sposób wytwarzania białka z Theobroma cacao o masie 67 kDa lub jego fragmentu o co najmniej 20 aminokwasach, znamienny tym, że sprzęga się kolejne aminokwasy przez wytwarzanie wiązania peptydowego.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się co najmniej część sekwencji przedstawionej na fig. 2.
3. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że wytwarza się białko lub jego fragment, który jest białkiem lub fragmentem rekombinowanym.
4. 4. Sposób wytwarzania białka z Theobroma cacao o masie 47 kDa lub jego fragmentu o co najmniej 20 aminokwasach, znamienny tym, że sprzęga się kolejne aminokwasy przez wytworzenie wiązania peptydowego.
5. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się co najmniej część sekwencji przedstawionej na fig. 2.
6. 6. Sposób według zastrz. 4 albo 5, znamienny tym, że wytwarza się białko lub jego fragment, który jest białkiem lub fragmentem rekombinowanym.
7. 7. Sposób wytwarzania białka z Theobroma cacao o masie 31 kDa lub jego fragmentu o co najmniej 20 aminokwasach, znamienny tym, że sprzęga się kolejne aminokwasy przez wytworzenie wiązania peptydowego.
8. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że stosuje się co najmniej część substancji przedstawionej na fig. 2.
9. 9. Sposób według zastrz. 7 albo 8, znamienny tym, że wytwarza się białko lub jego fragment, który jest białkiem łub fragmentem rekombinowanym.

   Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania białka z Theobroma cacao o masie 67 kDa, 47 kDa i 31 kDa lub ich fragmentów.