PT97896B - Processo para a preparacao de proteinas recombinantes de 47 e 31 kd do cacau e do seu precursor - Google Patents

Description

responsáveis pela produção do aroina nos grãos de cacau. Ainda f descobriu-se que, apesar do resultados de Frita de que "os níveis ãe íhHNA da semente do cacau são notavelmente baixos comparado com outras plantas" Qoc cit). é possível aplicar técnicas de DM recojabinante â produção de tais proteínas.

De acordo com um primeiro aspecto do invento, é proporcionada uma proteína de 67 KD de Tbeobroma cacao ou um seu fragmento. A proteína de 67 τΡ parece ser um produto de. tradução primário com interesse para as proteínas envolvidas na produção de aroma no cacau, â proteína de 67 KD pode ser processada in vivo para formar polipeptideos de 47 KD e 31 KD.

De acordo com um segundo aspecto do invento, é proporcionada uma proteína de 47 KD de- Tb. cacao ou um seu fragmento.

De acordo com um terceiro aspecto do invento, é proporcionada uma proteína de 31 KD de Th. cacao ou um seu fragmento. 0 termo "fragmento" como aqui é usado e conforme aplicado a proteínas ou peptideos indica que um número suficiente de resíduos de aminoãcidos estão presentes para o fragmento sei' útil. Tipicamente, pelo menos quatro, cinco, seis ou sete ou mesmo pelo menos 10 ou 20 aminoãcidos podem estar presentes num fr-agíasnto. Fragmentos úteis incluem os que são iguais ou semelhantes ou equivalentes aos produaidos naturalmente durante a fase de fermentação do processamento de grãos de cacau. Pensa-se que- tais fragmentos tomem parte nas reacçôes Maillard durante a torra, para formar pelo menos alguns dos componentes essenciais rio aroma do cacau. 4

Proteínas de acordo com o invento podern ser sintéticas; !ia ser obtidas por síntese química ou de preferência produsi-por técnicas de DM recombinante. As proteínas produaidas por técnicas podem portanto ser designadas "proteínas recorabi-^antes". As proteínas recombinantes podem ser glicosiladas ou não glicosiladas; as proteínas não glicosiladas resultarão de siste ν &ο,3, das mas de expressão procariõticos.

Theobroroa cacao tem basicamente duas subespécies, Th. cacao cacao e Th. cacao sphaerocarpum. Se bem que as proteínas de acordo com o invento possam ser derivadas destas subspécies, o invento não está limitado apenas a estas subespécies. Por exemplo, muitas variedades de cacau são híbridos de diferentes espécies; um exemplo de tal híbrido é a variedade trinitario. 0 invento também está relacionado com ácido nucleico, particularmente DNA, codificador das proteínas referidas atrás (quer sejam produtos de tradução primários, proteínas processadas ou fragmentos). 0 invento também proporciona noutros aspectos; ácido nucleico codificador de uma proteína de 67KD de Th cacao ou de um seu fragmento; ácido nucleico codificador de uma proteína de 47KD de Th. cacao ou de um seu fragmento; ácido nucleico codificador de uma proteína de d1KB de Th. cacao ou de um seu fragmento; nucleico que é degenera-e que codifica mutantes . 0 ácido nucleico que á também incluído.

Está incluído no invento ácido do relativaiaente à proteína selvagem conservados ou outros não deletérios híbrida com o material tipo selvagem est ácido nucleico dentro do âmbito do invento será geral-mente ácido nucleico recombinante e pode estar na forma isolada-Frequentemente, o ácido nucleico de acordo com o invento será incorporado num veotor Cvector de expressão ou outro) como seia ura plasmídeo. Yectores de expressão adequados conterão ura promotor adequado, dependendo do hospedeiro de expressão pretendido, Para levedura, um promotor adequado é o promotor da piruvato-ci-nase de levedura (PK); para bactérias um promotor adequado é ura promotor forte de lambda. A expressão pode ser seeretada ou não secretada. Prefere-se a expressão secretada, particularmente em sistemas de expressão eucarióticos; para esta finalidade pode estar presente uma sequência sinal adequada. Sequências sinal derivadas do hospedeiro de expressão (corno seja a do factor alfa de levedura no caso de levedura) poderão ser mais adequadas do que as sequências sinal nativas de cacau. 0 invento está ainda relacionado com células hospedeiras compreendendo ácido nucleico como descrito atrás. A manipulação genética pode preferencialmente ter lugar era procariontes. De preferência a expressão decorrerá num hospedeiro aprovado para consumo. 2 particularmente preferida a levedura 5acetaromzoss. 0 invento também está preparação de ácido nucleico e replicacão e expressão de ácido relacionado com processos para a proteína como descrito atrás por nucleico, respectivamente. 0 cDNA de acordo com o invento poderá ser útil não

O

obtenção da triction Fr expressão de proteína mas também para .grnent Length Fo 1 vmo r phi s m" CRFLF). studos de Im tais estudos preparou- cDNA marcado de f erma detectável (e.g. mareado radioactivamente). D NA de um cultivar em análise foi então preparado e digerido com ensimas de restrição. Transferências Southern com o cDNA marcado poderá então permitir que sejam feitas correlações genéticas entre cultivares. 0 invento será agora ilustrado pelos exemplos não lissitantes que se seguem. Os exemplos referem-se aos desenhos Juntos, em que;

Figura 1 mostra um mapa da região codificadora da proteína de 67KB, Juntamente com as relações entre os plasmídeos PMS600, pMS700 e pMS800, a partir do qual foram obtidos os dados de sequências; 0,gura 2 mostra a sequência de nucleótidos completa do oBMá codificador da proteína de 67KD e a sequência de aminoácidos dedusido; jTf.ffn.ra 3 mostra a sequência de aminoácidos referida na Figura 2; gj.guya. 4 mostra a relaccão entre a proteína de 67KB e as proteínas de reserva de sementes de outras plantas; gjrgura 5 mostra um mapa do plasmídeo pJLA502; gj,gu,ra 6 mostra esquematicamente a formação do plasmídeo pMS9®@; gj.auga 7 mostra dois vectores de expressão de levedura úteis no presente invento; o veetor Δ foi proJectado para expressão xivbema e o veetor B foi proJectado para expressão seeretada; sitio de gj.aura 8a. mostra, em relação ao veetor A, parte do gene da piruvato-oinase de levedura mostrando o sitio de clonagem do vector A e a utilisação de adaptadores Hin-Nco para remoção do gene heterôlogo;

Figura 8b mostra, em relação ao vector B, parte da sequência sinal do factor alfa de levedura mostrando o sítio de elonagem do vector Be a utilização de adaptadores Hin-Nco para criar uma fusão numa fase de leitura correcta;

Figura 9a mostra como o plasmídeo pSM900 pode ser manipulado para produzir os plssmídeos pMS901, pMS903, pMS907, pHS908, pMS9115 PMS812 e pMS914; ser manipulado para PMS909 e pHS916;

Figura. 9b mostra como o plasmídeo pMS903 pode produzir os plasmideos pMS904, PMS905. pMS806

Figura 10 mostra mapas dos plasmideos pMS908, pMS914. pMS912s PMS906, PMS916 e pMS910;

Figura 11 mostra a construção de um plasmídeo para expressar a proteína de 67 KD por meio do promotor AOX num vector integrado em Hansenu!a poIvmorpha; e expressar a com o sinal ntegrado em

Figura 12 mostra a construção de um plasmídeo para proteína de 67KB por meio do promotor ΔΟΧ juntamente de secreçãodo factor α de levedura num vector Hansenu la polvmprpna. 8

E3F,%?T,0S

Exemplo -1.

Identificação das principais proteínas de sementes; Não é praticável extrair proteínas directarnente a partir de grãos de cacau devido ao elevado teôr em gordura e polifenóis e as proteínas foram portanto extraídas a partir de pós de acetona obtidos como se segue. Grãos maduros de cacau originário da África Ocidental (Theobroiaa cacao arnelonada) foram liofiliaados e triturados num almofaris. Os lípidos foram extraídos por extracção Soxhlet com éter dietilico durante dois períodos de quatro horas , os grãos foram secos e ainda triturados entre as extraceões. Os polifenóis e pigmentos foram então removidos por várias extraccoes com 80% acetona, 0,1% de ácido tioglicólico. Após extracção a pasta resultante foi seca sob vácuo e triturada para dar um pó fino.

Proteínas totais foram solubilisadas por trituração do pó com tampão de extracção (fosfato de sódio, pH 7,2; 0,01¾ 2-mercaptoetanol; 1% SDS) num homogenisadro, a 5 mg/ml. A suspensão foi aquecida a 95°C durante cinco minutos e centrifugada a 18 K durante 2¾ minutos para remover o material insolúvel. 0 sobrenadante clarificado resultante continha cerca de í mg/ml de proteína total. Electroforese cie 25 ul num gel de SDS-PAGE (Laemmli, 1978) deu três bandas principais, duas das quais eram de 47 KD e 31KD, compreendendo cerca de 80% das proteínas totais. Pensa-se que as proteínas de 47RB e 31 KD sejam subunidades polipeptídicas das principais proteínas de reserva. 9

Caraeterístieas d S.S ΡΓΟ teínas de reserva;

As caraeterísticas de solubilidade dos polipeptídeos de 47KB e 31 KD foram definidas por uma ou duas experiências rápidas, A diálise da solução de polipeptídeos contra tampão de extracção sem SBS tornou insolúveis os polipeptídeos 47KB e 31KD, conforme avaliado pela sua capacidade para passar através de uma membrana de 0,22 micron. A análise por Gromatografia Líquida Rápida de Proteínas CFPLC) também mostrou que os polipeptídeos de 47KD e de 31KD estão altamente associados após extracção com tampão Mcllvaines pH 6,8 (hidrogenofosfato dissõdico 0,2M titulado com ácido cítrico 0,1M). Os polipeptídeos de 41KD e 31KD são glohulinas com base na sua solubilidade.

Purificação dos polipeptídeos de 47 KB e 31 KD:

Os polipeptídeos de 47KD e de 31KB foram purificados por dois ciclos de filtração em gel numa coluna de SUPERQSE-12 do sistema PHARMACIA Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) ou por electroeluição das bandas após electroforese preparativa. (As palavras SUPEROSE e PHARMACIA são marcas registadas.) Os extrae-tos de proteína concentrada foram feitos a partir de 50 mg de pó de acetona por ml de tampão de extracção e 1-2 ml aplicado eis géis de SBS'-FASE de 2mm de espessura sem pente. Após electroforese o gel foi corado com aaul Coomassie e as bandas de 47KB e 31KB cortadas com um bisturi. As fatias de gel foram electroeluidas para manga de diálise em tampão de electroforese a 15'V durante 24 horas e o material dialisado novamente dialisado contra 0,1¾ SDS. As amostras podem ser concentradas por liofilisaçao. Π Jk

Exemplo

Dados das sequências de aminoácidos das proteínas

As amostras de proteína (cerca de 10 ug) foram sujeitas a sequenciação convencional de aminoácidos N-terminal. Os poli-peptídeos de 47KD e de 31KD foram bloqueados no extremo Cs assim prepararam-se os peptícleos de brometo de. cianogénio dos peptídeos de 47KD e 31KD e derivaram-se algumas sequências de aminoácidos a partir destes. 0 brometo de cianogénio cliva cadeias polipeptídi-cas em resíduos de metionina e assim clivou os polipeptídeos de 47KD e 31KD dando origem a peptídeos de 24KD e 17KD. Sm adição o polipeptídeo de 47KD deu um peptídeo de 20KB. Os peptídeos de 24KD e 17KD têm os mesmos 9 resíduos de aminoácidos N-terminais. Este resultado está de acordo com o facto de o polipeptídeo de 31KB não poder conter ambos os peptídeos consecutivamente, sugeriu que o peptídeo de 24KD deriva de uma digestão parcial, enquanto que a digestão completa daria o peptídeo de 17KB. á outra conclusão forte é que as proteínas 47KB e 31KB estão relacionadas e 31KD poderá ser ainda uma forma processada de 47KD. A sequência de 9 aminoácidos foi usada para construir um oligonucleótido sonda para oCs) gene(s) 47KD/31KD.

Baamplo 3.

Indução de anticorpos contra os polipeptídeos 47KD e 31KB'.

Preparam-se anticorpos monoclonais usando a metodologia de Catty e Haykundalia (1988). 0 soro foi dividido em fraoções de 1 ml e guardado a -20°C,

Caracleríããção de anticorpos contra os polipeptídeos 47KB e 31KB: 11 0 soro foi imediatamente caracterisado usando a técnica de dupla difusão de Ochterloney, pela qual o antigénio e anticorpo são deixados a difundir um era direcção ao outro a partir de cavidades cortadas na agarose em tampão borato salino.

Formaram-se linhas de preoipitina onde os dois inter-actuam se o anticorpo reconhecer o antigénio. Este teste mostrou que os anticorpos contra ambos os antigénios tinham-se formado e ainda que se deu uma extensa reacção erusada entre polipeptídeos 47KD e 31KDe respectivos anticorpos. Isto é ainda indicação de que os polipeptídeos 47KD e 31KD estão estreitamente relacionados, conforme sugerido pelos seus padrões de clivagem com brometo de cianogénio. á fracção de gama-globulina do soro foi parcialmente purificada por precipitação com sulfato de amónio a 50%, solubi-liEação em tampão de fosfatos salino CPES) e cromatografia numa coluna de permuta iônica de BI52 celulose como descrito por Hill, 384. As fracções contendo gama-globulina foram controladas a 28® m& de 1,4 é equivalente a 1 mg/ml de gama-globulina) e guardou-se a -20°C. 0 título real dos anticorpos foi medido usando um ensaio imunossorvente ligado a ensima (ELISA). ás cavidades de uma placa de microtitulação em polistireno foram revestidas com antigénio (10-1®00 ng) durante a noite a 4°C em tampão de revestimento carbonato. As cavidades foram lavadas em PBS-Tween e a gama-globulina a testar adicionada em concentrações de 10, 1 e 0,1 u.g/ml (diluições de aproximadamente 1:100, 1:1000 e 1:10000), 0 diluente foi FBS-Tween contendo 2% polivinilpirro-lidona CFYF) e 0,2% BSA. As testemunhas foram soro pre-imune do mesmo animal. A ligação teve lugar a 37°C durante 1 co horas. As cavidades foram lavadas como atrás e adicionado an' bicor po sei oun- dário (anticorpos de e sabra anti- •IgG de coelho conjugado com fosfatase alcalina) numa concentração de Ijug/ml, usando as mesmas condições do anticorpo primário. As cavidades foram novamente 12

lavadas e adicionado o substrato da fosfatase alcalina (p-nitro-fenilfosfato; 0,6 rng/ml era tampão dietanolamina pH 9,8). A cor amarela indicando uma reacção positiva, foi deixada a desenvolver durante 30 minutos e a reacção parada com 3M NaOH. A cor foi quantificada a 405 nm. Mais detalhes deste método estão apresena-dos em Hill, 1984. 0 método confirmou que todos os anticorpos tinham um título elevado podendo ser usados a uma concentração de lug/ml.

Isolamento de RNA total a partir de grãos imaturos de cacau 0 material de partida para SNA que deverá conter uraa proporção elevada de mRNA específico das proteínas de reserva foi grãos de cacau imaturos a cerca de 130 dias após polinização. Trabalho anterior sugeriu que a síntese de proteínas de armazenamento atinge o seu máximo por esta altura CBiehl et. al. 1982). Os grãos apresentam-se ligeiramente enrugados e rosa-púrpura nesta A necessidade inicial da preparação de RNA total a partir de grãos de cacau foi que deveria estar livre de contami-nantes, conforme avaliado pelo espectro de UV, particularmente no OV afastado, onde uma depressão profunda a 230 nm (razão 26@nm;230nm é de aproximadamente 2,8) é um diagnóstico de ENA limpo e está intacto conforme avaliado por electroforese em gel de -agarose de amostras desnaturadas pelo calor, que deverão •apresentar bandas limpas de rENA. Um prérequesito para obtenção de ENA intacto é uma limpeza escrupulosa e precauções rigorosas contra RNases, as quais são enzimas ubíquas e extremamente estáveis. 0 vidro é normalmente tratado a temperaturas eivadas e

as soluções e aparelhos tratados com o inibidor de RNases dietil-pirocarbonato (DEPC5 0,1%) antes da autoclavagem. 0 método normalmente mais usado para a extraeção de EM vegetal (e animal) é a extraeção das proteínas com fenol/eloro-formío na presença de SDS para destruir os complexos de proteina--ácido nucleico e inibir as RNases que são abundantes no material vegetal. Após extraeção eom fenol o RNA é sedimentado num gradiente de cloreto de césio antes ou após precipitação com etanol. Este método produziu RNA mais ou menos intacto, mas estava altamene contaminado com pigmento castanho escuro, provavelmente poiifenóis e taninos oxidados que copurificam sempre com o RNA. Níveis elevados de polifenóis são um grande problema em tecidos Iheobroma.

Adoptou-se pois um método que evita a utilização de £<snol e em seu lugar usa o método de Hall et al. (1878) que envolve o rebentamento do tecido em tampão quente SDS-borato, --4-festão das proteínas com protelnase K e precipitação especifica, -vu E'.M eom LiCl. Este método deu rendimentos elevados de RNA -fttacto razoavelmente limpo. Os contaminantes continuaram a ser Problema e. o método foi modificado pela introdução de passos -%P^tddos de precipitação coro L-iCl, o precipitado sendo dissolvi- f] ^ - e® água e clarificado por microcentrifugação após cada um dos lassos, Isto resultou era preparações de EM com espectros ideais qu-ais funcionaram .oem em testes funcionais subsequentes tais ~oiao tradução in vibro.

Preparação de mEM a artir de RNA total: bsfia A fraeção d· ie afinidade. mENA foi separada do RNA total por numa coluna oligo-dT pequena (1 ml),

oroaa-o roRNA que ligando-se à coluna pela sua cauda poliA. 0 RNA (l-2mg) foi desnaturado por aquecimento a 65 °C e plicou-se à coluna num tampão com concentração salina elevada. Poli A+ foi eluiao cosa colhido por precipitação o de Aviv e Leder (1972), tampão de concentração salina baixa e com etanol. 0 método é essencialmente modificado por Maniatis et al. (1982). A partir de 1 mg de EHA total, obteve-se aproximadamente 10-20 ug de RNA poliA+ (1-2%),

Tradução in vitro de mRNA; A capacidade de mRNA para suportar a tradução é uma boa indicação da sua limpeza e da sua forma Intacta. Apenas mRNAs com uma cauda poliA (extremo 3*) intacta serão selecciona-dos pela coluna oligo-dT e apenas mRNAs que também possuam um extremo 5’ (início da tradução) intacto serão traduzidos eficaz-mente. A tradução in vitro foi realizada usando lisado de germen de trigo sem RNA (Arsersham International), a síntese proteica de novo sendo controlada pela incorporação de [ S]-metionina (Boberts e Paterson, 1973). Inicialmente a velocidade da síntese de novo foi medida pela incorporação de [^Sl-metionina em material precipitável com TCA capturado nos filtros de fibra de vidro (GFC, Whatman). Os produtos de tradução foram estudados por migração em SDS-PAGI, embebição do gel em flúor e autorradiogra-fia, As preparações de mRNA traduziram eficasmente e os produtos cobriam uma larga de pesos moleculares, mostrando que se obtiveram mRNAs intactos mesmo para as proteínas maiores. Nenhum dos principais produtos de tradução correspondia em tamanho aos polipeptídeos de reserva de 47ED ou 31KD identificados em grãos maduros e foi aparente que deve ocorrer processamento considerável dos polipeptídeos nascentes. 15 -

I&reflSElfl-iL

Identificação do precursor dos polipeptídeos de 47KD e 31KD por imunopreo i ρ i taçao

Devido aos polipeptídeos de reserva de 47KD e 31KD não serem aparentes entre os produtos de tradução do mRNA a partir de grãos de cacau em desenvolvimento, a técnica de imunoprecipita-gao, com anticorpos específicos induaidos contra polipeptídeos de reserva, foi usada para identificar os precursores a partir da mistura de tradução. Isto foi feito por dois motivos; primeiro para confirmar que o mENA adequado estava presente antes da clonagem e segundo para ganhar informação sobre o tamanho esperado dos genes codificadores. A imunoprecipitação foi realizada pelo método de Cuming 35 et. al. 1986. Os produtos da tradução jn vitro. marcados com [“““SI foram dissociados em SDS e deixados ligar coma anticorpo especifico em PBS mais 1% BSA. A mistura de antigénio anticorpo foi então misturada com proteína A-SEPHAROSE e incubada em gelo para permitir que a IgG se ligue ã proteína A. A pasta foi vertida para uma seringa descartável de 1 ml e as proteínas não ligadas forais removidas por lavagem com PBS + 1¾ NONIDET P-40. 0 anticorpo ligado foi eluido com ácido acético 1M e as proteínas precipitadas com TOA, 0 complexo antigénio-anticorpo foi dissociado em SDS e sujeito a SDS-PAGE e fluorografia, a qual revelou quais os antígénios marcados que se ligaram a anticorpos específicos.

Os resultados mostraram que os anticorpos anti-47 KD e antí-31KD precipitam ambos um precursor 87 KD. 0 tamanho do precursor correspondia a uma banda forte nos produtos de tradução in vitro. Os resultados com os anticorpos contra 47 KD e 31 KD confirmaram que os polipeptídeos derivam de um Cvnico precursor 16 ou pelo menos de precursores do mesmo tamanho. 0 tamanho grande do precursor sugeriu que a selecção por tamanho anível de mRNA ou de cBNA pode ser necessário para se obter clones.

Exemplo 6 Síntese de cBNA a partir de preparações de mEHá A síntese de cBNA foi realizada usando um kit da ámersham International. A primeira cadeia do cBNA foi sintetizada pela enzima transeriptase reversa, usando as quatro bases de nucleótidos encontradas no DNA CdATP, dTTP, dGTP, dGTP) e um iniciador oligo-dT. A síntese da segunda cadeia foi feita pelo método de Gubler e Hoffman (1983), pelo que a cadeia de rNA é cortada em muitas posições pela RNAse-H e os restantes fragmentos usados para iniciar a síntese de substituição de uma nova cadeia de DNA dirigida pela enzima DNA-polimerase I de E. coli. Quaisquer extremos 3* salientes de DNA são preenchidos usando a enzima poiiraerase T4. A totalidade do processo foi controlada pela adição de uma pequena proporção de [“'“Pl-dCTP na mistura de nucleótidos inicial e medindo a percentagem de incorporação da marca no DNA. Assumindo que os nucleótidos frios são incorporados à mesma velocidade e que as quatro bases são incorporadas igualmente pode-se fazer uma estimativa da síntese de cBNA. A partir de Ijig de mRNA sintetizou-se aproximadamente 140 ng de cBNA. Os produtos foram analisados num alcalino de 1,4% de agarose como descrito nos métodos da Amersham. No mesmo gel foi aplicado cBNA de globina sintetizado como controle fornecido com o kit, o gel foi seco e autorradiografado. 0 cBNA de cacau tem uma gama de pesos moleculares com uma quantidade substancial com mais 600 pb do que- o cBNA da globina.

Exemplo 7

Cionagem de cDNA num vector plasmídeo por colocação de caudas homopo1iméricas 0 método de clonagem de cDNA num vector plasmídeo foi colocar caudas 3* de resíduos dC no cDNA usando a ensima transfe-rase terminal (Boehringer Corporation Ltd), e emparelhamento num sítio de corte com PstI do extremo 5S do plasmídeo (Maniatis et al. . 1982 Eschenfeldt et al. . 1987). 0 comprimento óptimo da cauda dC é 12-20 resíduos. A reacção de colocação de caudas (condições como descrito pelo fabricante) foi testada com um fragmento de restrição de 1,5 Kb com extremos cerses, tirando amostras a vários intervalos e controlando a incorporação de uma pequena quantidade de [^Pl-dCTP. Uma amostra de cDNA (70 ng) foi então dotada de caudas usando condições predeterminadas.

Um vector plasmídeo com caudas dG (pUC9 com caudas oli(dG) 3*) foi adquirido à Pharmacia. 15 ng de vector foi emparelhado com 0,5-5 ng de cDNA a 58°C durante 2 horas em tampão de emparelhamento: 5mM Tris-HCl pH 7:6; 1 mM EDTA, 75 mM NaCl num volume total de 58 ul. A mistura emparelhada foi usada para transformar E. coli RRI (Eethesda Research Laboratories), os transformantes sendo seleccionados em agar L + 100 nig/ml de aapicilina. Obteve-se aproximadamente 200 transformantes por ng de cDNA. ul d adição de

Os transformantes foram guardados fasendo-os crescer era e caldo L em cavidades de placas de microtitulação, 180 ul de 801 glicerol e guardando a -28°0.

Algum do cDNA com caudas dC foi seleocionado pelo tamanho submetendo-o a electroforese num gel de 8,8% de agarose, cortando fendas no gel nas posições correspondentes a 8,5, 1,0 e 1.5 Kb, inserção de papel DE81 e continuação da electroforese até. 18 o cDNAter corrido para o papel DE81, 0 DNA foi então eluido do papel com tampão de concentrarão salina elevada, seguindo o método de Dretaen et al. (1981).

para o gene 47/31 KD

Construção de oligonucleõtidos sondas A sequência de aminoácidos obtida a partir de ma peptídeo de brometo de cianogénio comum aos polipeptídeos 47KD e 31KD é a seguinte:

Me t- F en- Glu- Ala- Asn- Fr o - Asn- Tre- Feri e a sonda menos redundante de esta apresentada abaixo: 17 resíduos (uma mistura de

Met-Fen-Glu-Ala-Asn-Pro 5* ATG TTT GAA GCT AAT CC 35 C G C C

A á sonda foi feita com antieodões de forma a poder ser também usada no despiste de mRMA. A síntese da sonda foi realiaa-da usando um sistema Applied Biosystems.

EjtsiBPlõ-A

Utilisação de oligonucleótidos para faser o despiste da biblioteca de cDHA

Os oligonucleótidos sonda foram marcados no extremo 5* com gama- C “P] dATP e a ena ima polinueleótido-cinase (Amersham International). 0 método foi essencialmente o de Woods (1982, 1884), excepto ter sido usada uma quantidade menor de isótopo Ç15p.Ci) para marcar cerca de 40 ng de sonda, em 10 mH MgCl,:,, 100 mH Tris-HCl, pH 7,6; 20 mH 2-mercaptoetanol. A biblioteca de eDNA foi cultivada em membranas de nylon GeneScreen (New England nuclear) colocadas na superfície de de placas de L-agar + 100 ug/ml. (A palavra GeneScreen é uma marca registada). As colónias foram transferidas das placas de microtitulação para membranas usando um dispositivo multi-pontas de 6 x 8, proJectado para se adaptar às cavidades de metade da placa. As colónias forarn cultivadas durante a noite a 37°Cf Usadas em hidróxido de sódio e ligadas a membranas como descrito por Woods (1982, 1984). Após secagem as membranas foram lavadas extensivamente em 3 x SSC/0,1% SDS a 65°C e hibridadas com a sonda marcada, usando um sistema da Hybaid Ltd, PO Box 82, Twiekenham, Middlesex. (A palavra HYBAID é uma marca registada.) As condições de hibridação foram como descritas por Mason & William (1985), uma sendo calculada para cada oligonucleótido de acordo com a fórmula;

T 4°C por par de bases GC +

por par de bases AI 6x

tibridacao foi realiaada a T^-5 SDS inicialmente â temperatura °G. Â lavagem foi em ambiente no sistema HYBAID, em seguida à temperatura de hibridação (Τ^-5σΟ durante algumas horas e finalmente a durante exactamente Ξ minutos. As membranas foram sujeitas a autorradiografia num filme de raios X FUKI, com ecran intensifiçador a -70°C, (A palavra FUJI é uma marca registada). Após 24-48 horas as colónias positivas surgiram como manchas intensas contra um fundo baixo.

Exemplo 10

Análise de clones positivos para o polipeptídeo 47KD/31KD

Obteve-se apenas um clone positivo, pMS600. Este deu origem a dois fragmentos de restrição FstI quando da digestão de 1,3 Kb totais, insuficientes para codificar o precursor 67KD. A inserção total foi removida do vector num fragmento HindlII--EcoRI, sujeita a "nick-translation" e usada como sonda de uma biblioteca de cDNA, permitindo detectar mais dois clones positivos* PMS700 e pMS800. 0 mapeamento de restrição das três inserções sugeriu um mapa sobreponível cobrindo quase 2,0 Kb, suficiente para codificar o precursor 67KD (ver Figura 1).

Ev*s-w»«lo 11 ftifcfrV"*' «i -f "' **" *·

Sequenciação de inserções clonadas simples como A estratégia de sequenciação foi clonar as inserções e sempre que adequado fazer subclones, no sítio de clonagem múltipla dos plasffiideo gTZ18R/pTZ19R (Fharmacia). estes plasmídeos baseiam-se nos Plasmídeos mais conhecidos pUC18/19 (Norrander et S-L-' 1883), mas contêm uma origem de replicação de cadeia simples do fago filamentoso fl. Quando superinfectado com os fogos do mesmo grupo, o plasmldeo é induzido a sofrer replicação em cadeia simples e as cadeias simples são empacotadas como fagos 21 libertados para o meio. 0 DM pode ser preparado a partir destes "fagos” usando métodos estabelecidos para os fagos M13 (Miller, 1987) e usado para sequenciação pelo método de Sanger (1977) usando o iniciador de sequenciação reversa. 0 fago superinfec-ianie usado é um derivado de M13 designado M13K07, o qual se replica mal e portanto não vai competir com o plasmídeo e contem uma marca de resistência à canamicina seleccionável. Métodos detalhados para a preparação de cadeias simples a partir de plasmideos pT2 e de fagos auxiliares são fornecidos pela Pharmacia. A sequência de BM foi compilada e analisada usando o conjunto de programas Staden (Staden, 1986) num computador PRIME 9955. CA palavra PRIME é urna marca registada).

Exemulo 12

Ç&raeterísticas do cDM de 47 KB/31 KB e sequência de aminoácidos deduzida do precursor 67 KD A sequenciação de BM dos três clones positivos, PMS800. pMS700, pMS800, confirmou a sobreposição presumível na Figura 1. Não se encontraram diferenças nas regibes sobreponíveis (cerca de 300 pb na totalidade), sugerindo que estes três oDNAs derivam do mesmo gene. A sequência dos cBNAs combinados compreendendo 1818 bases está apresentada na Figura 2. 0 primeiro codão ATG encontra-se na posiç-ão 14 e é seguido de uma grelha de elitura aberta de 566 codÕes. Existe uma região não traduzida 3’ de 104 bases contendo um sinal de poliadenilação na posição 1764. A sequência do o 1 igonucleõtido sonda encontra-se na posição 568.- A grelha de leitura aberta é tradusida para dar ura polipeptídeo de 566 aminoácidos (Figura 2) e um peso molecular de 65612, o qual está razoavelmente SDS-PÂGE. Os resíduos N-terminais rto de 67 KB medido em géis de são claramente hidrofõbicos e

assemelham-se a uma sequência sinal característica. Aplicando as regras de Von Heiie. (1983), que podem prever sítios de clivagem de sequências sinal, sugere um ponto de clivagem entre os aminoá-eidos 20 e 21 (ver Figura 3). A região a seguir é altamente Mdrofóbiea e contem quatro motivos Cis-X-X-X-Cis. 0 extremo N da proteína madura foi identificado como resíduo glutarnato (E) em 135 (Figura 3), com base na sequência N-termianl (EEFGSQFANPAYHF). Este extremo M daria uma proteína madura de 49068 KD basicamente de acordo com o observado. Parece não haver sítios de glicosilação (Asn-X-Ser/Tre) na proteína madura da sequência.

Homologias entre o precursor 67 KD e outras proteínas conhecidas

Pesquisa na base de dados PIS e na literatura, revelaram homologias estreitas entre o polipeptídeo 67 KD e uma classe d.e- proteínas de reserva das sementes designadas vicilinas, uma das duas classes principais de globulinas encontradas na semente ÍBorroto e Dure, 1987). Os alinhamentos entre o polipeptídeo 67 KD e vicilinas do algodoeiro (Gossypium hirsutnm, Qhi), soja (Slvoine max, Gma) . ervilha (Pis.um sativum, Psa-c é convicilina, Psa-v é vicilina) e feijão CFhaesnlus vulgar is. Pvu) como se mostra na Figura 4 CBown et al, . 1988; Chlan et al. T 1986; Doyle St_AL_, 1986; Lycett et al. . 1983). Os resíduos dentro de caixas são idênticos. T* o das as vi* cilinas ; volta de 47 KD. co m excepc-So congl ieina * de soda, as quais t oonvi cilina madura d'e ervilha safoun iciades de ervi lha e do fi mras nem um peso molecular a is subunidades alfa e alfa 1 da 72 KD e 76 KB respeetivamente e >m um peso molecular de 64 KD. As ioeiro (2 subclasses cada) foram sintetiaados como precursores pequenos, cerca de 50 KD. A homolo- gía mais forte com 67 KD ê da vicilina do algodão (Chlan et al.. 3

1988). 0 algodão está também rnais perto do cacau: ambos são membros da ordem Malvales. S interessante que o algodão também contem um precursor maior de 69 KD compreendendo uma sequência sinal pequena, um domínio hidrofilico grande contendo seis motivos Cis-X-X-X-Cis e um domínio maduro. Pode portanto ser possível sintetizar a correspondente proteína do algodão, por técnicas análogas às divulgadas neste pedido e usar a proteína do algodão ou um seu fragmento na preparação de componentes aromati-santes análogos aos componentes aromatizantes do cacau. 1,3

Expressão do polipeptídeo 67 KD em E. coli

Antes da região codificadora de 67 KD poder ser inserida num vector de expressão, os fragmentos sobroponíveis derivados de- três clones positivos separados têm de ser removidos na forma de segmentos de DM contínuos. 0 método de remoção está ilustrado na Figura 6: um fragmento HindlII-BvlII do PMS600, um fragmento BelII-ecoRI de pMS700 e um fragmento EooRI-SalI de pMS800 foram ligados ao pTZISR cortado com HindiII e Sall. 0 plasmídeo resultante contendo todo o cDNA de 67 KD foi designado pMS9®0„

Um sítio Hcol foi introduzido no codão de iniciação ATG usando o iniciador mutagénico: 5* TAG CAA CCA TGG TGA TCÂ 3*. um kit método empare— A mutagênese ín · comercializado pela Amersham de Ecksteín e colaboradores vltro foi realizada usando International, que. utiliza o CTaylor et al. . 1935). Após lamento o iniciador mutagénico com DNA de cadeia simples, a .atese da segunda cadeia incorpora alfa-tio-dCTP em vez de dCTF\ 24

Após extensão e ligação para formar círculos fechados, o plasmí-deo foi digerido com Ncil. uma enzima que não pode cortar DBA contendo tio-dC. Assim, apenas a cadeia original é cortada e subsequentemente digerida com exonuclease III. A cadeia original foi então ressintetizada, iniciada pelos restantes fragmentos de DBA e complementando a posição mutageniaada na cadeia original. Os· plasmídeos foram então usados para transformar E. coli e testados através de minipreparações de plasmídeos. 0 cDHA de 67 KD expressão de E. coliPJLA582 foi então clonado no plasmídeo de (Figura 5) num fragmento Hcol-Sall

CplS902). PJLA502 (Schauder et al. . 1987) é comercializado pela Medac GmbH, Postfach 303629, D-7000, Hamburg 36 e contem promotores fortes de lambda, e Pg e a sequência líder e sítio de ligação ao ribossoma do gene eficaamente traduzido de. E. coli. atpg. Ele também contem um repressor cl sensível à temperatura e assim a expressão é reprimida a 30°C e activada a 42°G. 0 vector teia um sítio HcoI (contendo um codão ATG: CCATGG) correctamerite colocado em relação ao sítio de ligação ao ribossoma e sequências codificadoras estranhas devem ser retiradas neste ponto. 0 vector de expressão foi usado para transformar E. C-Pli UT580. A estirpe transformada foi cultivada em caldo L + ampicilina (100 iig/ml5 a 30°C até à fase logarítmica ,5) e s temperatura foi então alterada para 42 °C e retiradas amostras em intervalos. As amostras foram dissociadas por fervura em tampão de amostra com SDS e correram em géis de SDS-FAGE. As proteínas foram electrotransferidas para membranas de nitroeelu-loss (Towbin et al,. 1979) e transferência Western realizada usando o anticorpo anti-21 KD preparado no Exemplo 3 atrás £a 2

Ug/ml) e como anticorpo secundário, anticorpos de cabra anti-IgG de coelho conjugados com fosfatase alcalina (Scott et al.. 1898),

Uma banda específica em 67 KD produsida por pMS882« mostrou a presença de um gene funcional. ΕκφρρΙο -14

Expressão do polipeptídeo de 67 KD em levedura

Usaram-se dois vectores de expressão de levedura, ambos baseados num vector vai-vem levedura-E. coli contendo origens de replioação de levedura e de E. coli ambos e marcas seleccionáveis adequadas (resistência á arnpieilina para E. coli e auxotrofia relativamente a leucina para levedura). Ambos os vectores conterá o promotor e sequência líder da piruvato-cinase (PK) de levedura ® têm um sítio de clonagem HindIII a jusante do promotor. Um vector, A (YVA), foi projectado para expressão interna e o outro, BíYVB), para expressão secretada, tendo uma fracção da sequência sinal do factor de conjugação alfa de levedura a jusante do Promotor, com um sítio HindIII dentro dele para criar proteínas de fusão com sequências codificadoras inseridas. Os vectores ftstao ilustrados na Figura 7. na

Para usar os vectores eficasmente é desejável introdu-sir a região codificadora estranha de forma a que para o vector à, a. região desde o sítio de clonagem HindIII até à iniciação ATG seJa a mesma do gene PK de levedura e para o vector B, o restante do sinal do factor alfa, incluindo a lisina no ponto de clivagem. Na prática,esta situação foi conseguida através da síntese de duas séries de adaptadores HindiII-Hcol para preencher o intervalo entre o sitio de clonagem HindIII no vector e Hcol - 26 -

iniciação ATG da sequência codificadora. Isto está ilustrado na Figura 8.

Para usar o vector B de levedura, a sequência sinal niàrofõbica deve primeiro ser eliminada do oDNA de 67 KB. Se bera que não baia evidência directa da localisação do sítio de clivagem natural, o algoritmo de Von Heiie prevê um sítio entre os aminoãcidos 20 (alanina) e 21 (leucina). No entanto decidiu-de remover os aminoáeidos 2-19 por deleção, de forma a que o sítio i3.til Ncol no inicio da tradução fosse mantido.

Para facilidade de construção dos vectores de levedura, a estratégia foi clonar primeiro os adaptadores HíndIII-Ncol nos plasmídeos pTZ adequados e depois clonar os adaptadores mais a região codificadora nos veetores de levedura nos fragmentos HindiII-BamHI. No entanto a região codificadora contem um BamHI interno que deve ser removido por mutagénese in vitro. dando um novo plasmídeo PMS803. A sequência sinal foi eliminada a partir do pMS903 usando o iniciador mutagênico AGCATAGCAACCATGGTGCTTTGTTCT 3: para dar pHS904. Os adaptadores HindiII-Ncol foram então clonados em pMS903 e pMS904 para dar pMS907 e pMS905 respectivamente e os fragmentos H.indlII-BamHI (adaptadores + região codificadora) subclonados a partir destes plasmídeos intermediários em YVA e YYB respectivamente para dar os plasmídeos de expressão de levedura pMS908 e pMS908. Na Figura 9 está apresentado um esquema para estas e outras construções. forma a expressarem

Devido â proteína madura do cacau não ter domínio N-termianl Mdrofilieo, corno descrito no exemplo 12, os veetores de expressão também foram proòectados de forma a expressarem a

proteína madura directamente. É improvável que a levedura contenha as mesmas enzimas de processamento do cacau e a expressão óptima possa ser obtida para uma proteína tão perto quanto possível da encontrada naturalmente no cacau. Assim o DNA codificador do domínio hidrofílico (aminoácidos 20-134) foi eliminado dos plasmídeos intermediários pMS907 e pMS905 para dar plasmídeos PNS901 e pMS909 respectivamente e os fragmentos HindiII-BaroHI para estes forma clonados em YVA e YVB para dar os plasmídeos de expressão pMSS12 e pMS910 (Figura 9).

Oma outra modificação foi introduzida através da construção de vectores de expressão em que o terminador vegetal foi removido e substituido pelo terminador ADH de levedura (presente em YVA e YVB). 0 sinal vegetal foi removido cortando os plasmídeos intermediários pMS907 e pMS985 no sitio PvuII imediatamente a jusante da região codificadora, na posição 1716 na Figura 2. Os adaptadores HindIII foram adicionados e toda a região codificadora clonada nos vectores de expressão de levedura nos fragmentos HindiII-HindIII dando plasmídeos de expressão pMS914 (YVA) e pMB916 (YVB) (Figura 9). Na figura 10 está apresentado um sumário das construções.

I

Os plasmídeos de expressão de levedura foram transferidos para esferoplastos de levedura usando o método de Johnston (1988). 0 hospedeiro de transformação foi LEU estirpe AH22 e os transformantes foram seleccionados em meio mínimo sem leucina. Os transformantes LEU" foram semeados para dar colónias isoladas, as ) quais foram cultivadas em 50 ml de meio YEPD (Johnston, 1988) a 28°0 para testar o grau e distribuição do gene estranho. As oélulas foram colhidas a partir das culturas em tubos pré-pesados numa centrífuga de bancada e- lavadas em 10 ml de tampão de lise (280 mH Tris, pH 8,1; 10% glicerol). 0 meio celular foi guardado e concentrado 10-25 x num miniconcentrador AMICQN. (A palavra

âMICOH é uma marca registada). As células lavadas foram pesados e ressuspensas em tampão de lise mais inibidores de proteases (fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 rnM (PMSF)j 1 wg/ml de aprotí' niíia; 0,5 ug/ml de leupeptina) numa concentração de Ig/ml* âdicionou-se 1 volume de esferas de vidro lavadas com ácido e aS células foram rebentadas por vortex durante 8 minutos total, com pulsos de 1 minuto e com intervalos de 1 minuto em gelo. ApõS confirmar ao microscópio o rebentamento celular, a mistura foi cenirifugada a 7000 rpm durante 3 minutos para sedimentar a£ esferas de vidro. 0 sobrenadante foi removido para um tubo de centrífuga previamente arrefecido e centrifugado durante 1 hora a 280Θ0 rpm. (Pequenas amostras podern ser centrifugadas nuffiS microcentrífuga no frio). 0 sobrenadante constitui a fraeção solúvel. 0 sedimento foi ressuspenso em 1 rol de tampão de lise mais 10% SDS e 1% mercaptoetanol e aquecido a 90°G durante 10 minutos. Após centrifugação durante 15 minutos numa microcentrí-fuga o sobrenadante constitui a fraeção de partículas.

Amostras de cada fraeção e o meio concentrado foram examinados por transferência Western. Considerando primeiro os plasmídeos destinados à expressão interna em YVA, pMS908 produaiu proteínas imuno-reactivas a 67 KD e 16 KD apenas dentro das células. Não houve evidência da proteína 67 KD ser seeretada sob a influência da sua própria sequência sinal. Um resultado semelhante, mas com expressão melhorada foi obtido com pMS914, em que o terminador vegetal foi substituído por um terminador de levedura. No entanto em pMS912, no qual a região codificadora do domínio hidrofilico foi eliminado não se deu síntese de proteína irsimo-reactiva.

Para a produção industrial de proteínas heterôlogas e» levedura é prefeível usar a secreção pois as células de levedura sSo muito difíceis de rebentar e o processamento a Jusante da

proteína total não é fácil. Os resultados dos vectores construídos pra expressão com secreção foram complicados. A partir da construção mais simples, pMS988, era que a sequência sinal do factor a de levedura substitui a sequência sinal vegetal da própria proteína, obtiveram-se proteínas imuno-reactivas de aproxirnadamente 47 KD, 28 KD e 18-28 KD que foram seeretadas para o meio. Ã primeira vista isto é surpreendente pois a região codificadora introdusida deverá sintetisar uma proteína de 67 KD. No entanto, a explicação mais provável é que a protease KEX2 de levedura, que reconhece e cliva o sinal do factor ano sítio Lis-Arg cliva também a proteína 67 KD nos dipeptídeos Lis-Arg nas posições 148 e 313 na sequência de aminoácidos. Os tamanhos calculados para os fragmentos de proteína resultantes da clivagem destas posições são 47179 Daltons, 28344 Daltons e 18835 Daltons, muito perto dos tamanhos observados.

Quando o terrainador vegetal é substituído por um terrainador de levedura em pMS916 não se obtém expressão nas células ou no meio; é também possível que uma mutação tenha sido inadvertidamente introduaida. A partir da construção pMS910, em que o domínio hidrofílico foi eliminado os principais produtos antígénicos foram 28 KD e 18-28 KD, novamente secretados para o meio. Pensa-se que o produto 47 KD criado de novo é imediatamente clivado no sítio KEX na posição 313.

Era resumo, quatro dos seis vectores de expressão construídos dirigem a síntese de proteínas que dão reacção erusada com os anticorpos anti-47 KD. Duas das construções secretam proteínas para o meio.

Construção de vectores destinados a expressarem a proteína 87 em Hansenula pq Ivmorp'ha, Δ levedura metilotrópica Hansenula pelvmorpha. oferece usa série de vantagens relativamente a Saccharorovces oerevisiae ooiao hospedeiro para a expressão de proteínas heterôlogas CEP-â--§173373 q Sudbery et al,. 1988). A levedura crescerá em metanol coso única fonte de carbono e nestas condições a enzima metanoi--oxidase (MOX) pode representar até 40% da proteína celular total. Assim, o promotor MOX é muito forte podendo ser usado num veotor para dirigir a síntese de proteínas heterôlogas e é eficaz mesmo como cópia única. Isto dá o potencial para usar vectores integrados estáveis. Hansenula pode também crescer em fontes de carbono enriquecidas tais corno glucose, neste caso o promotor MOX é completamente· reprimido. Isto significa que as células contendo o gene heterõlogo podem ser cultivadas até uma densidade elevada em glucose e induzidas para produzirem a proteína estranha permitindo sair e adicionando metanol.

Prepararam-se uni plasmídeo, pHGLl, contendo o promotor e terminador MOX e uma cassete contendo a sequência sinal secretora do factor a de levedura. A região codificadora de 67 KD foi elonada em pHGLl num fragmento BamHI-BamHI. substituindo o fragmento BglII que contem o extremo 3* da região codificadora de MOX. A região total de promotor-gene-terminador pode ser então transferida para YIpl3 no fragmento BamHI-BamHI para dar o plasmídeo de expressão pMS922, Os detalhes da construção estão ilustrados na Figura 11. Um plasmídeo de expressão análogo, PÍS925 foi construído com o factor a de levedura inserido na região codificadora de 67KD, substituindo o sinal vegetal natural. A cassete BamHI-HindiII contendo o factor a foi ligada ao fragmento HindlII-BamHT usado para introduzir a região codificadora de 67 KD em YVB. 0 factor cc mais a região codificadora foi então clonado com pHGLl num fragmento BamHI-BamHI e transferido para YEP13 como anteriormente. Os detalhes estão apresentados na Figura 12.

Ambas as construções foram usadas para transformar Hansenn1 a e cultivadas nas condições indutoras com 0.5¾ ou 1% de metanol. Ambas as construções dirigem a produção de proteína imuno-reactiva dentro das células e pMS925 secretou a proteína para o meio sob a influência da sequência sinal do factor

Estirpes de E. coli' BB1 F~vríara-14 proA2 leuB6 lacYl galK2 vpsL20 (strr) xyl-5 mtl-1 supI44 CAGS29 lacaffi tvpam phoam htPSam mal rpsL lon suPCts UT580 (lac-pro) supE thi hsdD5 / F’tra D36 proA+B+ laclq lacZ Hl 5 32 -

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pyTVIBDICACSES IS. - Processo para a preparação de uma proteína de 67 KD de Theobroma cacao ou de um seu fragmento, earacterisado por oompreeender o acoplamento sucessivo de aminoácidos através da formação de ligações peptídicas. 2â. - Processo para a preparação de urna proteína de 47 KD de Th,.....cacao ou seu fragmento, earacterisado por compreender o acoplamento sucessivo de aminoácidos através da formação de ligações peptídicas. 3â. - Processo para a preparação de uma proteína de 31 CD de Th. cacao ou um seu fragmento, earacterisado por compreender o acoplamento sucessivo de aminoácidos através da formação de Ligações peptídicas. 4ã. - Processo de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, earacterisado por a proteína ter pelo menos parte da sequência mostrada na Figura que segue*

Claims (1)

1. MVISKSPFIVLIFS l ε, AAGCATAGCAAATATGGTGATCAGTAAGTCTCCTTTCATAGTTTTGATCTTCTCTCTTCT XO 20 30 40 50 60 LSFALLCSGVSAYGRKQYER CCTTTCTTTTGCGTTGCTTTGTTCTGGTGTCAGCGCCTATGGCAGAAAACAATATGAGCG 70 30 90 100 110 120 D P R Q <2 Y E Q C Q R R C E S E A T E E TGATCCTCGACAGCAATACGAGCAATGCCAGAGGCGATGCGAGTCGGAAGCGACTGAAGA 130 140 150 160 170 180 R E Q E Q C E Q R C E R E Y K E Q Q R Q aagggagcaagagcagtgtgaacaacgctgtgaaagggagtacaaggagcagcagagaca 190 200 210 220 230 240 Q E E E L Q R Q Y Q Q C Q G R C Q E Q Q gcaagaagaagagcttcaaaggcaataccagcaatgtcaagggcgttgtcaagagcaaca 250 260 270 280 290 300 Q G Q R E Q Q Q C Q R X C W E Q Y K E Q ACAGGGGCAGAGAGAGCAGCAGCAGTGCCAGAGAAAATGCTGGGAGCAATATAAGGAACA 310 320 330 340 350 360 E R G E H E N Y Η N H K K N R S Ξ E E Ξ AGAGAGAGGCGAGCACGAGAATTACCATAATCACAAAAAAAATAGGAGCGAAGAAGAAGA 370 380 390 400 410 420 G Q Q R N N P Y Y P P K R R S F Q T R F AGGGCAACAAAGAAACAATCCTTACTATTTTCCTAAAAGAAGATCATTCCAAACTCGA í r 430 440 450 460 470 480 R D E E G N F K I L Q R F A E N S P " L CAGGGATGAAGAGGGCAACTTCAAGATCCTCCAGAGGTTTGCTGAGAACTCTCCTCCACT 490 500 510 520 530 540 K GIN D Y R L A M F E A N P N T F I I» CAAGGGCATCAACGATTACCGCTTGGCCATGTTCGAAGCAAATCCCAACACTTTTATTCT 550 560 570 580 590 600 P Η H C D A E A I Y F V T N G K G T I T TCCGCACCACTGTGATGCTGAGGCAATTTACTTCGTGACAAACGGAAAGGGGACAATTAC 610 5 20 630 640 650 660 F V T H E N K E S Y N V Q R G T V V S V GTTTGTGACTCATGAAAACAAAGAGTCCTATAATGTACAGCGTGGAACAGTAGTCAGCGT 670 680 690 700 710 720 P A G S T V Y V V S Q D N Q E K L T I A TCCTGCAGGAAGCACTGTTTACGTGGTTAGCCAAGACAACCAAGAGAAGCTAACCATAGC 730 740 750 760 770 780 V L A L P V N S P G K Y E L F F P A G N TGTGCTCGCCCTGCCTGTTAATTCTCCTGGCAAATATGAGTTATTCTTCCCCGCTGGAAA 790 300 810 320 830 840 N K P E s Y Y G A F S Y E V L E T V F N TAATAAACCTGAATCATATTACGGAGCCTTCAGCTATGAAGTTCTTGAGACCGTCTTCAA 350 860 870 880 890 900 T Q R E K L E E I L E E Q R G Q K R Q Q TACACAAAGAGAGAAGCTGGAGGAGATCTTGGAGGAACAGAGAGGGCAGAAGAGGCAGCA 910 920 930 940 950 960 40 G Q Q G M F R K A K p E Q I R A I S Q Q GGGGCAGCAGGGTATGTTGCGGAAAGCCAAACCAGAGCAGATAAGAGCAATAAGCCAACA 970 980 990 1000 1010 1020 A T s P R H R G G E R L A X N L li S Q S agctacttctccaaggcacagaggcggggagagacttgccatcaatctattgagccaatc 1030 1040 1050 1060 1070 1080 P V ¥ s N Q N G R F F E A C P E D F S Q GCCTGTCTACTCCAACCAAAACGGACGCTTCTTTGAGGCTTGTCCTGAGGACTTCAGTCA 1090 1100 1110 1120 1130 1140 F Q N M D V A V S A F K L N Q G A X F V ATTTCAGAACATGGATGTCGCTGTTTCAGCCTTCAAACTGAATCAGGGAGCCATATTTGT 1150 1160 117 0 1180 1190 1200 P K ¥ N S K A T F V V F V T D G ¥ G ¥ A. GCCACACTACAATTCTAAGGCTACATTCGTGGTGTTTGTCACGGACGGATATGGGTACGC 1210 1220 1230 1240 1250 1260 Q Μ A C P H I* S R Q S Q G S Q S G R Q D TCAAATGGCTTGCCCGCATCTCTCCAGACAGAGCCAGGGATCCCAAAGTGGAAGGCAAGA 1270 1280 1290 1300 1310 1320 R R E Q £ E E Ξ E E Ξ T F G E F Q Q V K CAGAAGAGAACAAGAAGAAGAGTCAGAAGAGGAGACATTTGGAGAATTCCAGCAGGTCAA 1330 1340 1350 1360 1370 1380 A P L S P G D V F V A PAG Η A V T F F AGCCCCATTGTCACCTGGTGACGTCTTTGTAGCCCCGGCAGGCCATGCAGTTACATTCTT 1390 1400 1410 1420 1430 1440 A S K D Q P L N A V A F G L N A Q N N Q TGCATCCAAAGACCAGCCCCTGAATGCAGTTGCGTTTGGACTCAACGCCCAGAACAACCA 1450 1460 1470 1480 1490 1500 R I F L A G K K N L V R Q H D S E A K E gagaattttccttgcagggaaaaagaacxtggtcagacaaatggatagcgaggcaaagga 1510 1520 1530 1540 1550 1560 L S F G V P s K li V D N I F N N P D E S GTTATCATTTGGGGTACCATCGAAATTGGTAGATAATATATTCAACAACCCGGATGAGTC 1370 1580 1590 1600 1610 1620 ¥ F M S F S Q Q R Q R R D E R R G N P L GTATTTCATGTCTTTCTCTCAACAGAGGCAGCGTCGAGATGAAAGGAGGGGCAATCCCTT 1630 1640 1650 1660 1670 1680 A S Γ L D F A R L F * GGCCTCAATTCTGGACTTTGCCCGCTTGTTCTAAGCAGCTGOTTCCACTTTTGTATCAGA 1690 1700 1710 1720 1730 1740 catgcagaggcatgtaatgcaataaataagttggcctatgtaaagaggagagagtttgct 1750 1760 1770 1730 1790 1800 tttgtcttgttctaaccttgttttgaactagtaaactttcaatgtaatgagagttgttat 1310 1820 1330 1840 1850 1860 CTTTCTA aas nder 5â, - Processo de acordo coro era qualquer uma reivindicações 1 a 4, caracteriaado por o fragmento compre pelo menos quatro aminoáeidos. 8&. - Processo para a preparação de ácido nucleico codificador de urna proteína ou fragmento preparãvel por um processo de acordo com em qualquer uma das reivindicações la 5, caracteriaado por compreender o acoplamento sucessivo de nucleó-tidos e/ou ligação de oligonucleótidos ou de polinucleõtidos. 7a, - Processo de acordo com a reivindicação 6, carae-terisado por o ácido nucleico ser DNA. 8â, - Processo de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracteriaado por o ácido nucleico ter pelo menos parte da sequência mostrada na Figura referida na reivindicação 4. 8â. - Processo de acordo com a reivindicação 6, 7 ou 8, caracteriaado por o ácido nucleico está na forma de um vector. 10â. - Processo de caracteriaado por o vector é um codificadora da proteína ou do ligada a um promotor. acordo com a reivindicação 9, vector de expressão e a sequência fragmento está operacionalmente 11S, - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracteriaado por o vector de expressão ser um vector de expressão de levedura e o promotor ser um promotor da Piruvato~cina.se <FK) de levedura. 12&. - oarac ter iz·ado por são bacteriano e < Processo de 0 vector de e: 1 promotor ser acordo com pressão ser um promotor a reivindicação 10, um vector de expres-lambda forte. 42 13â, - Processo de acordo com a reivindicação 10, 11 ou 12, earacterisado por o referido vector compreender uma sequência sinal, 14fi, - Processo para a preparação de uma célula hospe-deira, earacterisado por comprender a transfecção ou transformação de uma célula com ácido nucleico preparável por um processo de acordo com em qualquer uma das reivindicações 9 a 13, 15â. - Processo earacterisado por a célula de acordo com a reivindicação 14, lios pede ira ser Saccharotavces cere.vl-

   16ã. - Processo de acordo com a reivindicação 14, earacterisado por a célula hospedeira ser 1. coli. 17ã. - Processo para a preparação de uma proteína ou fragmento, earacterisado por compreender a cultura de urna célula hospedeira preparável por um processo de acordo com a reivindicação 14, 15 ou 16, Lisboa, 7 de Junho de 1991

   J. PEREIRA DA CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 10-A 3« 1200 LISBOA

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