PL169122B1 - Sposób wytwarzania bialka z Theobroma cacao PL PL PL PL PL PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania bialka z Theobroma cacao o masie 67 kDa lub jego fragmentu o co najmniej 20 aminokwasach, znamienny tym, ze transformuje sie komórki gospodarza kwasem nukleinowym kodujacym bialko lub jego fragment i hoduje sie te komórki gospo- darza, przy czym kwas nukleinowy ma co najmniej czesc sekwencji okreslonej na fig. 2. 10. Sposób wytwarzania bialka Theobroma cacao o masie 47 kDa lub jego fragmentu o co najmniej 20 aminokwasach, znamienny tym, ze transformuje sie komórki gospodarza kwasem nukleinowym kodujacym bialko lub jego fragment i hoduje sie te komórki gospo- darza, przy czym kwas nukleinowy ma co najmniej czesc sekwencji okreslonej na fig. 2. 19. Sposób wytwarzania bialka z Theobroma cacao o masie 31 kDa lub jego fragmentu o co najmniej 20 aminokwasach, znamienny tym, ze transformuje sie komórki gospodarza kwasem nukleinowym kodujacym to bialko lub jego fragment i hoduje sie te komórki gospodarza przy czym kwas nukleinowym ma co najmniej czesci sekwencji okreslonej na fig. 2. PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania białka z Theobroma cacao o masie 67 kDa, 47 kDa i 31 kDa lub ich fragmenty.

Ziarna kakaowca (Theobroma cacao) stanowią surowiec do produkcji kakao, czekolady oraz naturalnych kakaowych i czekoladowych esencji smakowo-zapachowych. Jak opisał Rihan (Processing of Raw Cocoa for the Market, FAO/UN /1963//, surowe ziarna kakaowe oddziela się od zebranych owoców kakaowca, w których zwykle usuwa się owocnię, po czym ziarna poddaje się “fermentacji” trwającej kilka dni, podczas której ziarna ulegają zabiciu, a z liścieni uwalnia się purpurowy barwnik. Podczas fermentacji powstają “nieznane” związki, które podczas wypalania dają charakterystyczny kakaowy smak i zapach. Rohan sugeruje, że w wytwarzaniu prekursora smaku biorąudział polifenole i teobromina. Po zakończeniu fermentacji ziarna suszy się; podczas tego suszenia powstaje charakterystyczne, brązowe zabarwienie, a następnie wysuszone ziarna magazynuje się i wysyła.

Biehl i wsp., 1982, badali rozkład białka podczas beztlenowej inkubacji ziarna kakaowego i zidentyfikowali białka o masie 26 kDa i 44 kDa, które akumulowały się podczas dojrzewania i ulegały degradacji podczas kiełkowania. Biehl założył, że były to białka zapasowe i sugerował, że te białka mogąbyć przyczyną powstawania peptydów o specyficznym smaku i zapachu.

Fritz i wsp., 1985, zidentyfikowali polipeptydy o masie 20 kDa i 28 kDa pojawiające się w cytoplazmatycznej frakcji ekstraktów ziarna kakaowego w około 100 dni po zapyleniu. Wydaje się, że białko o masie 20 kDa wykazuje aktywność acylotransferazy glicerylowej.

Pomimo opisanych wyżej wątpliwości w tej dziedzinie wiedzy, dopiero obecnie zidentyfikowano białka rzeczywiście odpowiedzialne za powstawanie smaku i zapachu ziarna kakaowego. Ponadto odkryto, że wbrew przypuszczeniu Fritz'a, jakoby “poziomy mRNA ziarna kakaowego są wyjątkowo niskie w porównaniu z innymi roślinami” (cytat), możliwe jest stosowanie technik rekombinacji DNA do wytwarzania takich białek.

Białko o masie 67 kDa wydaje się być najważniejszym produktem translacji będącym przedmiotem zainteresowania spośród białek biorących udział w powstaniu kakaowego smaku i zapachu. Białko o masie 67 kDa może ulegać przetwarzaniu in vivo, w wyniku czego powstają polipeptydy o masie 47 kDa i 31 kDa, a także ich fragmenty.

Używane tu określenie “fragment”, stosowane do białek lub peptydów dotyczy fragmentu, w którym występuje wystarczająca liczba reszt aminokwasowych, aby fragment taki był użyteczny. Zwykle w takim fragmencie może występować co najmniej cztery, pięć, sześć lub

169 122 nawet co najmniej 10 lub 20 aminokwasów. Użyteczne fragmenty to te, które są takie same, podobne, albo równoważne fragmentom wytwarzanym naturalnie w etapie podczas obróbki ziarna kakaowego. Uważa się, że takie fragmenty biorą udział w reakcjach Maillard'a podczas wypalania, w których powstaje co najmniej kilka ze składników smakowo-zapachowych kakao.

Białka te mogą być białkami syntetycznymi, można je syntetyzować chemicznie, lub korzystnie, stosując techniki rekombinacji DNA. Białka tak wytworzone można zatem nazwać “rekombinowanymi białkami”. Białka rekombinowane mogąbyć glikozylowane lub nieglikozylowane; nieglikozylowane białka będą wynikiem ekspresji w układach prokariotycznych.

Theobroma cacao występuje w dwóch podstawowych podgatunkach, Th.cacao cacao i Th.cacao sphaerocarpum. Białka mogą pochodzić z tych podgatunków, a także od gatunków będących hybrydami gatunkowymi. Przykładem takiej hybrydy jest odmiana trinitario.

Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania białka z Theobroma cacao o masie 67 kDa, 47 kDa i 31 kDa lub ich fragmentów polegający na tym, że hoduje się komórki gospodarza zawierające kwas nukleinowy kodujący te białka lub ich fragmenty.

W sposobie według wynalazku do hodowli stosuje się komórki gospodarza zawierające jako kwas nukleinowy DNA kodujące wyżej wymienione białka lub ich fragmenty.

Stosowany w sposobie według wynalazku kwas nukleinowy ma korzystnie co najmniej część sekwencji przedstawionej na fig. 2.

Kwas nukleinowy w sposobie według wynalazku wstawia się do wektora (ekspresyjnego lub innego), takiego jak plazmid. Odpowiednie wektory ekspresyjne zawierające odpowiedni promotor, dobrany w zależności od przewidzianego gospodarza ekspresyjnego hodowanego według wynalazku. Odpowiednim promotorem dla drożdży jest promotor kinazy pirogronianowej (PK), zaś dla bakterii - silny promotor lambda.

Produkt ekspresji może ulegać sekrecji lub nie. Preferuje się produkt ekspresji ulegający sekrecji, zwłaszcza w eukariotycznych układach ekspresyjnych; w takim przypadku obecna jest odpowiednia sekwencja sygnałowa. Sekwencje sygnałowe pochodzące od gospodarza ekspresyjnego (taicie jak z drożdżowego czynnika alfa w przypadku drożdży) mogą okazać się dogodniejsze niz natywne sekwencje sygnałowe kakao.

Manipulacje genetyczne mogąbyć korzystniejsze w prokariotach. Ekspresja natomiast jest korzystniejsza w gospodarzach dopuszczonych do spożycia. Szczególnie preferuje się drożdże Saccharomyces cerevisiae.

Wyżej opisany kwas nukleinowy i białka może także być otrzymywany na drodze replikacji kwasu nukleinowego i ekspresji, odpowiednio.

cDNA może znaleźć zastosowanie nie tylko do uzyskiwania ekspresji białka, ale także w badaniach polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP). Do takich badań wytwarza się cDNA znakowany tak, aby możliwe było jego wykrywanie (na przykład znakowany radiologicznie). W takim przypadku preparuje się DNA roślin uprawnych do analizy i trawi się go za pomocą enzymów restrykcyjnych. W celu odkrycia genetycznych korelacji pomiędzy roślinami uprawnymi stosuje się technikę blottingu Southern ze znakowanym cDNA. Można wówczas wnioskować odnośnie korelacji fenotypowych.

Wynalazek zostanie zilustrowany poniższymi przykładami, które nie ograniczają jego zakresu. Przykłady odnoszą się do załączonych rysunków, na których:

Figura 1 przedstawia mapę regionu kodującego białko o masie 67 kDa, wraz ze współzależnością plazmidów pMS600, pMS700 i pMS800, z których otrzymano dane sekwencyjne;

Figura 2 przestawia całą sekwencję nukleotydową kodującą białko o masie 67 kDa i wprowadzoną sekwencję aminokwasową;

Figura 3 przedstawia sekwencję aminokwasową z figury 2;

Figura 4 przedstawia porównanie pomiędzy białkiem o masie 67 kDa i zapasowymi białkami z nasion innych roślin;

Figura 5 przedstawia mapę plazmidu pJLA502;

Figura 6 przedstawia schemat konstruowania plazmidu pMS900;

169 122

Figura 7 przedstawia dwa drożdżowe wektory ekspresyjne stosowane w niniejszym wynalazku; wektor A jest przeznaczony do ekspresji wewnętrznej, a wektor B do sekrecji produktu ekspresji;

Figura 8a przedstawia, w odniesieniu do wektora A, część genu pirogronianowej kinazy drożdżowej, uwidaczniając miejsce do klonowania wektora A oraz stosowanie łączników Hin-Nco do składania heterologicznego genu;

Figura 8b przedstawia, w odniesieniu do wektora B, część sekwencji sygnałowej drożdży czynnika alfa, uwidaczniając miejsce do klonowania wektora B oraz stosowanie łączników Hin-Nco do wytwarzania fuzji w fazie odczytu;

Figura 9a przedstawia sposób obróbki plazmidu pMS900 i wytwarzania z niego palzmidów pMS901, pM903, pMS907, pMS908, pMS911, pMS912 i pMS914;

Figura 9b przedstawia sposób obróbki plazmidu pMS903 i wytwarzania z niego plazmidów pMS904, pMS905, pMS906, pMS909 i pMS916;

Figura 10 przedstawia mapy plazmidów pMS908, pMS914, pMS912, pMS906, pMS916 ipMS910.

Figura 11 przedstawia konstrukcję plazmidu do ekspresji w Hansenula polymorpha białka o masie 67 kDa przy użyciu promotora ΑΟΧ w zintegrowanym wektorze oraz

Figura 12 przedstawia konstrukcję plazmidu do ekspresji w Hansenula polymorpha białka o masie 67 kDa przy użyciu promotora ΑΟΧ w połączeniu z sygnałem sekrecji drozdżowego czynnika α w zintegrowanym wektorze.

Przykład I. Identyfikacja najważniejszych białek ziarna.

W praktyce nie stosuje się bezpośredniego ekstrahowania białek z ziaren kakao z powodu wysokiej zawartości tłuszczów i polifenoli, dlatego też białka ekstrahowano z proszków acetonowych wytworzonych jak następuje: Dojrzałe ziarna kakaowca z Afryki Zachodniej (Theobroma cacao amelonada) zliofilizowano i wstępnie rozdrobniono w moździerzu za pomocą tłuczka. Lipidy wyekstrahowano metodą ekstrakcji Soxhlet'a eterem dwuetylowym w dwóch czterogodzinnych ekstrakcjach, ziarno suszono i dalej rozdrobniano między ekstrakcjami. Następnie usunięto polifenole i barwniki na drodze kilku ekstrakcji 80% acetonem, 0,1% kwasem tioglikolowym. Masę poekstrakcyjną wysuszono pod próżniąi rozdrobniono na miałki proszek.

Wszystkie białka rozpuszczono przez wymieszanie proszku z buforem ekstrakcyjnym (0,05 M fosforan sodowy, pH 7,2; 0,01 M 2-mekraptoetanol; 1% SDS) w ręcznym homogenizatorze, 5 mg/ml. Zawiesinę ogrzewano w ciągu 5 minut w temperaturze 95°C i odwirowano w temperaturze 18K w ciągu 20 minut, usuwając w ten sposób substancje nierozpuszczalne. Tak otrzymany klarowny supematant zawierał około 1 mg/ml całego białka. W wyniku elektroforezy 25 μΐ na żelu SDS-PAGE (Laemmli, 1970) otrzymano 3 główne pasma, z których dwa odpowiadały masom 47 kDa i 31 kDa, i zawierały ponad 60% wszystkich białek. Przypuszcza się, że białka o masach 47 kDa i 31 kDa stanowiąpodjednostki polipeptydowe głównych białek zapasowych.

Właściwości polipeptydów zapasowych.

Rozpuszczalność polipeptydów o masach 47 kDa i 31 kDa określono wstępnie, wykonując jedno lub dwa szybkie doświadczenia Dializa roztworu polipeptydu wobec buforu ekstrakcyjnego pozbawionego SDS wykazała nierozpuszczalność polipeptydów o masach 47 kDa i 31 kDa, co oceniono na podstawie ich zdolności do przechodzenia przez 0,22-mikronową błonę.

Szybka chromatografia cieczowa białek (FPLC) wykazała również, że polipeptydy o masach 47 kDa i 31 kDa były silnie zasocjowane po ekstrakcji buforem Mcllvaines'a, pH 6,8 (0,02 M dwusodowego kwaśnego fosforanu miareczkowanego za pomocą 0,1 M kwasu cytrynowego).

Z uwagi na swoją rozpuszczalność polipeptydy o masach 47 kDa i 31 kDa są globulinami.

Oczyszczanie głównego polipeptydu.

Polipeptydy o masach 47 kDa i 31 kDa oczyszczono w dwóch etapach chromatografii żelowej na kolumnie Superose-12 do szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC) firmy Pharmacia, lub przez elektroeluowanie pasm otrzymanych w wyniku preparatywnej elektroforezy (Słowa: Superose i Pharmacia są znakami towarowymi). Z 50 mg proszku acetonowego

169 122 na 1 ml buforu ekstrakcyjnego przygotowano zatężone ekstrakty białkowe, i 1 - 2 ml ekstraktów naniesiono na żele SDS-PAGE o grubości 2 mm. Po przeprowadzeniu elektroforezy, powierzchnię żelu zabarwiono za pomocą wodnego błękitu Coomassie Blue, i wycięto skalpelem pasma odpowiadające masom 47 kDa i 31 kDa. Kawałki żelu poddano 24-godzinnej elektroelucji w torebkach do dializy, w przepływającym buforze do elektroforezy, pod napięciem 15V, a dializat poddano dalszej dializie wobec 0,1% SDS. Próbki można było zatężyć przez liofilizację.

Przykład II. Dane odnośnie sekwencji aminokwasowej białek.

Próbki białka (około 10 pg) poddano znanemu sekwencjonowaniuN-końcowych aminokwasów. Polipeptydy o masach 47 kDa i 31 kDa zabezpieczono na N-końcach, tak że z peptydów o masach 47 kDa i 31 kDa wytworzono bromocyj anopepty dy, a z nich wyprowadzono sekwencj e aminokwasowe. Bromocyjan rozszczepia łańcuchy polipeptydowe w miejscach reszt metionino wy ch, tak więc nastąpiło rozszczepienie polipeptydów o masach 47 kDa i 31 kDa na peptydy o masach 24 kDa i 17 kDa. Poza tym z polipeptydu o masie 47 kDa powstał dodatkowy peptyd o masie 20 kDa. Peptydy o masach 24 kDa i 17 kDa posiadały 9 takich samych N-końcowych reszt aminokwasowych. W oparciu o ten fakt i w powiązaniu z oczywistym faktem, że polipeptyd o masie 31 kDa nie mógł zawierać ułożonych kolejno obu peptydów wysunięto sugestię, ze peptyd o masie 24 kDa powstał na skutek częściowego trawienia, podczas gdy w wyniku pełnego trawienia mógł utworzyć się peptyd o masie 17 kDa. Inną zdumiewającą konkluzjąjest spostrzeżenie, że białka o masach 47 kDa i 31 kDa są spokrewnione, i że białko o masie 31 kDa może stanowić dalej procesowaną postać białka o masie 47 kDa. Sekwencję dziewięcioaminokwasową zastosowano do skonstruowania sondy oligonukleotydowej dla genu(ów) białek o masach 47 kDa/31 kDa.

Przykład III. Wytwarzanie przeciwciał przeciwko polipeptydom o masach 47 kDa i 31 kDa.

Przeciwciała poliklonalne wytworzono metodą Catty'ego i Raykundalia'ego (1988). Surowicę podzielono na próbki o objętości 1 ml i przechowywano w temperaturze -20°C.

Określenie właściwości przeciwciał przeciwko polipeptydom o masach 47 kDa i 31 kDa.

Surowicę natychmiast zbadano przy zastosowaniu techniki podwójnej dyfuzji Ochterloney'ego, w której antygeny i przeciwciała dyfundują w kierunku do siebie od ścianek wyciętych w żelu agarozowym, w buforze sól fizjologiczna-boran. Linie precypitacyjne powstają w miejscach, w których przeciwciało rozpoznaje antygen. Ten test uwidocznił, że wytworzono przeciwciała przeciwko obu antygenom, a ponadto, że pomiędzy polipeptydami o masach 47 kDa i 31 kDa a odpowiadającymi im przeciwciałami zachodziła ekstensywna reakcja krzyżowa. Fakt ten wskazuje na to, że polipeptydy o masach 47 kDa i 31 kDa są ściśle spokrewnione, tak jak sugerowano w związku z wynikami rozszczepienia ich przez bromocyjan.

Frakcję gamma-globulinową surowicy oczyszczono częściowo przez wytrącanie 50% siarczanem amonowym, rozpuszczenie w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) i chromatograficznie na kolumnie do bibułowej chromatografii jonowymiennej DE 52, jak opisał Hill, 1984. Frakcje zawierające gamma-globulinę obserwowano przy 280 nm (OD280 wynosząca 1,4 odpowiada 1 mg/ml gamma globuliny) i przechowywano w temperaturze -20°C.

Skuteczne miano przeciwciał zmierzono przy zastosowaniu techniki wykrywania reakcji antygen-przeciwciało przy użyciu przeciwciał związanych z enzymem (ELISA). Studzienki polistyrenowej płytki do mikroznaczeń pokryto antygenem (10 - 1000 ng) i odstawiono na noc w temperaturze 4°C pokryte buforem węglanowym. Studzienki przemyto za pomocąPBS-Tween i dodano badaną gamma globulinę w stężeniach: 10,1 i 0,1 pg/ml (rozcieńczenia w przybliżeniu: 1 : 100, 1 : 1000 i 1 : 10000). Jako rozcieńczalnik zastosowano PBS-Tween zawierający 2% poliwinylopirolidon (PVP) i 0,2% BSA. W charakterze próbek kontrolnych zastosowano przedtem immunizowaną surowicę tego samego zwierzęcia. Wiązanie zachodziło w temperaturze 37°C w ciągu 3-4 godzin. Studzienki przemyto jak wyżej i dodano drugie przeciwciało (kozia przeciwkrólicza IgG związana z zasadową fosfatazą) w stężeniu 1 pg/ml, stosując te same warunki, jak w przypadku pierwszego przeciwciała. Studzienki znowu przemyto i dodano substratu zasadowej fosfatazy (p-nitrofenylofosforan, 0,6 mg/ml, w buforze dwuetanol-amina, pH 9,8). W ciągu 30 minut powstawało żółte zabarwienie wskazując na reakcję dodatnią, po

169 122 czym reakcję zakończono za pomocą 3 M NaOH. Zabarwienie określono ilościowo przy 405 nm. Więcej szczegółów odnośnie tej metody ujawnia Hill, 1984. Zastosowanie tej metody potwierdziło, że wszystkie przeciwciała mająwysokie miano i że mogąbyć stosowane w stężeniu 1 pg/ml.

Przykład IV. Izolowanie całego RNA z niedojrzałych ziaren kakaowca.

Materiał wyjściowy dla RNA, zawierający dużą ilość mRNA białek zapasowych stanowiły niedojrzałe ziarna kakaowca, w wieku około 130 dni po zapyleniu. Wcześniejsza praca sugerowała, ze synteza białek zapasowych w tym okresie osiąga swój szczyt (Biehl i wsp., 1982). Ziarna w tym wieku są lekko pofałdowane i bladoróżowo-purpurowe.

Wstępnym warunkiem, jaki musiał spełniać cały preparat RNA z ziaren kakaowca było to, aby: po pierwsze nie zawierał on zanieczyszczeń, co oceniono za pomocą widma UV, zwłaszcza w dalekim UV, gdzie czysty RNA można rozpoznać z dużą dokładnością dzięki głębokiemu skokowi przy 230 nm (stosunek 260 nm : 230 nm wynosi w przybliżeniu 2,0), po drugie, aby był on nieuszkodzony, co oceniono metodą elektroforezy próbek zdenaturowanych termicznie w żelu agarozowym, w wyniku której powinny powstać czyste pasma rRNA. Przy wytwarzaniu nieuszkodzonego RNA niezbędne jest zachowanie absolutnej czystości oraz rygorystycznych środków ostrożności przeciwko RNA-azom, które są powszechnie występującymi i bardzo trwałymi enzymami. Szkło laboratoryjne na ogół wypraża się w wysokich temperaturach, a roztwory i aparaturę poddaje się działaniu inhibitora RNA-azy w postaci eteru dwuetylowego kwasu pirowęglowego (DEPC, 0,1%) przed obróbką w autoklawie.

Zwykle, ekstrakcji roślinnego (i zwierzęcego) RNA dokonuje się przez ekstrahowanie białek za pomocą fenolu/chloroformu w obecności SDS, prowadzące do zniszczenia kompleksów białko-kwas nukleinowy i do hamowania enzymów RNA-az, które wystepująpowszechnie w materiale roślinnym. Po ekstrakcji fenolem, RNA poddaje się obróbce w gradiencie chlorku cezowego, przed lub po precypitacji etanolem. Tym sposobem wytworzono bardziej lub mniej nieuszkodzony RNA, jednakże był on bardzo zanieczyszczony ciemno-brązowym zabarwieniem, prawdopodobnie utlenionymi polifenolami i taninami, które zawsze pozostawały razem z RNA. Wysokie zawartości polifenoli stanowią najważniejszy problem w przypadku tkanek Theobroma.

Z tego powodu zastosowano metodę, w której unika się używania fenolu, a mianowicie metodę Halla i wsp. (1978), która polega na rozbijaniu tkanki w gorącym buforze SDS-boranowym, trawieniu białek proteinazaK i wybiórczej precypitacji RNA za pomocą LiCl. Sposób ten zapewniał uzyskanie wysokich wydajności stosunkowo czystego, nieuszkodzonego RNA. Ponieważ jednak zanieczyszczenia w dalszym ciągu stanowiły problem, sposób zmodyfikowano przez zastosowanie powtarzających się etapów wytrącania w LiCl, przy czym po każdym etapie osad rozpuszczono w wodzie i klarowano przy użyciu mikrowirówki. W wyniku takiego postępowania otrzymano preparaty RNA o idealnych widmach, które sprawdziły się dobrze w dalszych testach na ich działanie, takich jak translacja in vitro.

Preparowanie mRNA z całego RNA

Frakcję mRNA oddzielono od całego RNA na drodze chromatografii powinowactwa na małej (1 ml) kolumnie oligo-dT, przy czym mRNA wiązał się z kolumną poprzez swój koniec poli A. RNA (1-2 mg) zdenaturowano przez ogrzewanie w temperaturze 65°C i naniesiono na kolumnę w buforze o wysokiej zawartości soli. Poli A+ eluował wraz z buforem o niskiej zawartości soli i zebrano go przez precypitację etanolem. Sposób ten zasadniczo jest taki, jak opisali Aviv i Leder (1972), a zmodyfikowali Maniatis i wsp. (1982). Z 1 mg całego RNA otrzymano około 10 - 20 pg poli A+ RNA (1 - 2%).

Translacja mRNA in vitro

Dobrym wskaźnikiem czystości i braku uszkodzeń mRNA jest jego zdolność do translacji in vitro. Przy użyciu kolumny oligo-dT dokonuje się selekcji jedynie kwasów mRNA z nieuszkodzonym końcem poli A (koniec 3'), natomiast zdolność wydajnej translacji mają tylko kwasy mRNA posiadające także nieuszkodzony koniec 5' (początek translacji). Translację in vitro przeprowadzono przy użyciu lizatu z kiełków pszennych, pozbawionego RNA (Amersham

16!) 122

International), a syntezę nowo powstającego białka kontrolowano przez włączanie metioniny znakowanej S³⁵ (Roberts i Paterson, 1973). Początkowo szybkość syntetyzowania nowo-powstającego białka mierzono przez włączanie metioniny-S35 do substancji, którą można wytrącić za pomocą TCA, zatrzymywanej na sączkach z włókien szklanych (GFC, Whatman). Rzeczywiste produkty translacji badano metodą elektroforezy w żelu SDS-PAGE, żel nasycano fluorem, suszono i badano autoradiograficznie. Preparaty mRNA były zdolne do wydajnej translacji, a uzyskane produkty translacji obejmowały szeroki zakres mas cząsteczkowych, co wskazywało na to, że otrzymano nieuszkodzone kwasy mRNA nawet największych białek. Żaden z głównych produktów translacji nie odpowiadał wielkością zapasowym polipeptydom o masach 47 kDa i 31 kDa zidentyfikowanym w dojrzałych ziarnach, tak więc stało się oczywiste, że nowo powstające polipeptydy muszą ulegać znacznemu procesowaniu, w wyniku którego tworzą się formy dojrzałe.

Przykład V. Identyfikacja prekursora polipeptydów o masach 47 kDa i 31 kDa przez immunoprecypitacj ę.

Z uwagi na to, że zapasowe polipeptydy o masach 47 kDa i 31 kDa nie były widoczne wśród produktów translacji mRNA z rozwijających się ziaren kakaowca, do identyfikacji prekursorów w mieszaninie translacyjnej zastosowano technikę immunoprecypitacji przeciwciałami swoistymi wobec polipeptydów zapasowych. Zrobiono tak z dwóch powodów: po pierwsze - w celu potwierdzenia, że odpowiedni mRNA obecny przed klonowaniem, a po drugie - w celu uzyskania informacji odnośnie przewidywanej wielkości genów kodujących.

Immunoprecypitację przeprowadzono metodą Cuming'a i wsp., 1986. Produkty translacji in vitro, znakowane S3 * poddano dysocjacji w sDs i dopuszczono do wiązania się ich ze swoistym przeciwciałem w PBS + 1% BSA. Następnie mieszaninę przeciwciało-antygen zmieszano z białkiem A-Sepharose i inkubowano na lodzie aby IgG związała się z białkiem A. Zawiesinę umieszczono w strzykawce jednorazowego użytku o pojemności 1 ml i niezwiązane białka usunięto, przemywając PBS + 1%o Nonidet P-40. Związane przeciwciało wypłukano 1 M kwasem octowym, a białka wytrącono za pomocą TCA. Kompleks przeciwciało-antygen zdysocjowano w SDS i poddano elektroforezie SDS-PAGE oraz fluorografii uwidaczniającej, które znakowane antygeny związały się ze swoistymi przeciwciałami.

Wyniki wskazywały na to, że oba przeciwciała, anty-47 kDa i anty-31 kDa wytrącały prekursor o masie 67 kDa. Masa prekursora odpowiadała głównemu pasmu produktów translacji in vitro. Wyniki doświadczenia z przeciwciałami 47 kDa i 31 kDa potwierdziły, że polipeptydy pochodzą od jednego prekursora, lub prekursorów o takiej samej masie. Duża masa prekursora sugerowała, że w celu otrzymania klonów może być konieczna selekcja pod względem wielkości mRNA lub cDNA.

Przykład VI. Synteza cDNA z preparatów mRNA.

Syntezy cDNA dokonano przy zastosowaniu zestawu firmy Amersham International. Pierwszą nić cDNA zsyntetyzowano przy użyciu enzymu odwrotnej transkryptazy, czterech zasad nukleotydowych DNA (dATP, dTTP, dGTP, dCTP i startera oligo-dT. Drugą nić zsyntetyzowano metodąGubler'a i Hoffman'a (1983), w której nić RNA rozrywa się w wielu miejscach za pomocą RNA-azy H, a pozostałe fragmenty stosuje się do syntezy na drodze wymiany nowej nici DNA, którą to syntezą kieruje enzym polimeraza DNA I E.coli. Wystające końce 3' DNA wypełnia się przy użyciu polimerazy T4. Cały proces kontrolowano przez dodanie do wyjściowej mieszaniny nukleotydów małej ilości dCTP-fP²’²] i mierzenie w % włączania znakowanego nukleotydu do DNA. Zakładając, że nukleotydy nieznakowane ulegają włączaniu z taką samą szybkością i że cztery zasady ulegają włączaniu równomiernie, można ocenić przebieg syntezy cDNA. Z 1 pg mRNA zsyntetyzowano w przybliżeniu 140 ng cDNA. Produkty analizowano na alkalicznym 1,-4% żelu agarozowym tak, jak ujawniono w sposobach Amersham'a. cDNA globiny, który syntetyzowano w zestawie jako kontrolę, przepuszczono przez ten sam żel, który wysuszono i poddano autoradiografii. Masy cząstkowe cDNA z kakaowca wahały się w pewnym zakresie, przy czym jest on dłuższy od cDNA globiny zasadniczo o więcej niż 600 bp.

Przykład VII. Klonowanie cDNA w wektorze plazmidowym metodą przyłączania identycznych zasad do końca 3' cząsteczki DNA (Homopolymer Tailing).

169 122

Sposób klonowania cDNA w wektorze plazmidowym polegał na tym, że koniec 3' cDNA przedłużono resztami dC przy użyciu enzymu terminalnej transferazy (Boehringer Corporation Ltd) i zhybrydyzowano z plazmidem przeciętnym przez PstI i przedłużonym na końcu 5' (Maniatis i wsp., 1982, Eschenfeldt i wsp., 1987). Optymalna długość przedłużenia dC wynosi 12-20 reszt. Reakcję przedłużania (warunki jak podane przez wytwórców) kontrolowano przy użyciu fragmentu restrykcyjnego o długości 1,5 kb z tępymi końcami, pobierając próbki co pewien czas obserwując włączanie małych ilości dCTP znakowanego [P³²]. Próbkę cDNA (70 ng) przedłużono w ustalonych z góry warunkach.

Wektor plazmidowy z przedłużeniem dG (pUC9 z przedłużeniem 3'-oligo(dG)) zakupiono w firmie Pharmacia. 15 ng wektora poddano hybrydyzacji z 0,5 - 5 ng cDNA w temperaturze 58°C w ciągu 2 godzin w buforze do hybrydyzacji: 5 mM Tris-HCl, pH 7,6; 1 mM EDTA, 75 mM NaCl w całkowitej objętości 50 μΐ. Mieszaniną poddaną hybrydyzacji stransformowano E.coli RRI (Bethesda Research Laboratories), a transformanty wyselekcjonowano na agarze-α + 100 μg/ml ampicyliny. Otrzymano około 200 transformantów na 1 ng cDNA. Transformanty utrzymywano przez hodowanie ich w 100 μl pożywki L, w studzienkach płytki do mikrooznaczeń, dodając 100 μl 80% glicerolu i przechowując w temperaturze -20°C.

Pewną ilość cDNA przedłużonego o dC wyselekcjonowano przez elektroforezę w 0,8% żelu agarozowym, wycięcie kawałków żelu z miejsc odpowiadających 0,5, 1,0 i 1,5 kb, wstawienie bibuły dE81 i kontynuowanie elektroforezy do momentu, aż cDNA wniknął na bibułę DE81. Następnie DNA wypłukano z bibuły za pomocą buforu o wysokiej zawartości soli sposobem Dretzen'a i wsp. (1981).

Przykład VIII. Konstruowanie sond oligonukleotydowych dla genu białek 47/31 kDa

Sekwencja aminokwasowa z bromocyjanopeptydu wspólna dla polipeptydów o masach 47 kDa i 31 kDa jest następująca:

Met-Phe-Glu-Ala-Asn-Pro-Asn-Thr-Phe, a najmniejszą sondę o 17 resztach (mieszanina 32) przedstawiono poniżej: Met-Phe-Glu-Ala-Asn-Pro

5' ATG TTT GAA GCT AAT CC 3'

C G C C

A

G

Czynna sonda była antysensowna, tak aby można jąbyło stosować do sondowania mRNA. Sondę zsyntetyzowano w urządzeniu Applied Biosystems.

Przykład IX. Zastosowanie oligonukleotydów do sondowania biblioteki cDNA

Sondy oligonukleotydowe znakowano na końcach 5' za pomocą gamma-[P³²] dATP i enzymem kinazą polinukleotydową (Amersham International). Stosowano metodę Woods'a (1982, 1984) z takim wyjątkiem, że do znakowania około 40 ng sondy w 10 nM MgCh, 100 mM Tris-HCl, pH 7,6; używano mniejszej ilości izotopu (15 μC) oraz 20 mM 2-merkaptoetanolu.

Bibliotekę cDNA namnożono na nylonowych błonach GeneScreen (New England Nuclear) umieszczonych na powierzchni płytek z agarem L+ 100 μg/ml ampicyliny. (Słowo GeneScreen jest znakiem towarowym). Kolonie przeniesiono z płytek do mikrooznaczeń na błony przy użyciu urządzenia z wypustkami 6x8, dopasowanego do studzianek połówki płytki do mikrooznaczeń. Kolonie hodowano w ciągu nocy w temperaturze 37°C, zlizowano przy użyciu wodorotlenku sodowego i związano z błonami jak opisał Woods (1982, 1984). Po wysuszeniu płytki przemyto dokładnie w 3 x SSC/0,1% SDS o temperaturze 65°C i poddano hybrydyzacji ze znakowaną sondą przy użyciu urządzenia Hybaid firmy Hybaid Ltd, PO Box 82, Twickenham, Middlesex. (Słowo Hybaid jest znakiem towarowym). Stosowano warunki hybrydyzacji jak opisali Mason i Williams (1985), a Td obliczono dla każdego oligonukleotydu według wzoru:

Td = 4°C na parę zasad GC + 2°C na parę zasad AT (W przypadku pozycji złożonych stosowano najniższą wartość)

Hybrydyzację prowadzono w Ty -5°C. Przemywano w 6 x SSC, 0,1% SDS, początkowo w temperaturze pokojowej w urządzeniu Hybaid, a następnie w temperaturze hybrydyzacji (Td: -5°C) w ciągu kilku godzin i ostatecznie w temperaturze Td w ciągu dokładnie 2 minut. Błony poddano autoradiografii na filmie do promień X Fuji, przeszukując intensywnie w temperaturze -70°C. (Słowo Fuji jest znakiem towarowym). Po 24 - 48 godzinach powstały dodatnie kolonie w postaci występujących kropel na podłożu.

Przykład X. Analiza klonów dodatnich dla polipeptydu 47 kDa/31 kDa

Otrzymano tylko jeden dodatni klon, pMS600. Uwolnił on w trakcie trawienia dwa fragmenty Pstl, o całkowitej długości 1,3 kb niewystarczającej do zakodowania prekursora o masie 67 kDa. Całą wstawkę usunięto z wektora w postaci fragmentu Hindlll-EcoRl, dokonano przemieszczenia pęknięć i zastosowano do sondowania biblioteki cDNA, wychwytując dwa dodatkowe dodatnie klony, pMS700 i pMS800. Mapowanie restrykcyjne wszystkich trzech wstawek doprowadziło do otrzymania mapy pokrywających się fragmentów o długości blisko 2,0 kb wystarczającej do zakodowania prekursora o masie 67 kDa (patrz figura 1).

Przykład XI. Sekwencjonowanie sklonowanych wstawek

Strategia sekwencj onowania polegała na klonowaniu wstawek i klonowaniu odpowiednich ich subklonów w wielokrotnym miejscu do klonowania plazmidów pTZ18R/pTZ18/19R (Pharmacia). Plazmidy te są skonstruowane w oparciu o lepiej znane wektory pUC18/19 (Norrander i wsp., 1983), lecz zawieeajajednoniciowy początek r<^j^^^^a<cji pochodzący z wlókienkowatego faga f1. Superinfekcja fagami w tej samej grupie indukuje jednoniciowąreplikację plazmidu, a pojedyncze nici sąupakowywane i w postaci fagów wydzielane do otoczenia. Znanymi sposobami dla fagów M13 (Miller, 1987) można z tych “fagów” wypreparować DNA i sekwencjonować metodą Sanger'a (1977) przy użyciu odwróconego startera do sekwencjonowania. Stosowany do superinfekcji fag M13K07 pochodzi od faga M13, ulega słabej replikacji i dlatego nie współzawodniczy z plazmidem, a ponadto zawiera marker selekcyjny w postaci oporności na kanamycynę. Dalsze szczegóły sposobów wytwarzania pojedynczych nici z plazmidów pTZ oraz fagów pomocniczych dostarcza firma Pharmacia. Sekwencję DNA zestawiono i przeanalizowano stosując zestaw programów komputerowych Staden'a (Staden, 1986) na komputerze Prime 9955. (Słowo Prime jest znakiem towarowym).

Przykład XII. Cechy cDNA dla 47 kDa/31 kDa i wyprowadzona sekwencja aminokwasowa prekursora o masie 67 kDa.

Analiza sekwencji DNA trzech klonów dodatnich, pMS600, pMS700, pMS800 potwierdziła nakładanie się przewidywane według figury 1. W zachodzących na siebie regionach nie znaleziono różnic w sekwencji (w sumie około 300 bp), co sugeruje, ze trzy kwasy cDNA pochodziły z tego samego genu. Sekwencję połączonych kwasów cDNA zawierającą 1818 zasad przedstawiono na figurze 2. Pierwszy kodon ATG znaleziony w pozycji 14 poprzedza otwartą fazę odczytu 566 kodonów. Występuje tam nieulegający translacji region 3' o 104 zasadach, zawierający sygnał poliadenylacji w pozycji 1764. Sekwencję sondy oligonukleotydowej znaleziono w pozycji 569.

Wynikiem translacji otwartej fazy odczytu jest polipeptyd o 566 aminokwasach, (figura 2) i masie cząsteczkowej wynoszącej 65612, zasadniczo bliskiej masie 67 kDa otrzymanej w wyniku pomiaru na żelach SDS-PAGE. Reszty N-końcowe są wyraźnie hydrofobowe i przypominają typowe sekwencje sygnałowe. Sugeruje się według zasad Von Heije'a (1983) przewidywania miejsc odszczepiania sekwencji, że miejsce rozszczepienia znajduje się pomiędzy aminokwasami 20 i 21 (patrz figura). Region następujący po tym miejscu jest bardzo hydrofobowy i zawiera cztery następujące motywy: Cys-X-X-X-Cys. N-koniec dojrzałego białka wstępnie zidentyfikowano jako resztę glutaminową w pozycji 135 (figura 3), przy użyciu kilku próbnych sekwencji N-końcowych (EEPGSQFANPAYHF). Ten koniec mógłby przedstawić dojrzałe białko o masie 49068 Da, co z grubsza zgadza się z danymi z obserwacji. Wydaje się, ze w sekwencji dojrzałego białka nie ma miejsca glikozylacji (Asn-X-Ser/Thr).

Homologie pomiędzy prekursorem o masie 67 kDa a innymi znanymi białkami.

169 122

Poszukiwania prowadzone w danych identyfikacyjnych białek PIR oraz w literaturze ujawniły ścisłe homologie pomiędzy polipeptydem o masie 67 kDa a klasą zapasowych białek zwanych wicylinami, jedną z dwóch głównych klas globulin znalezionych w nasionach (Borroto i Dure, 1987). Porównanie pomiędzy polipeptydem o masie 67 kDa i wicylinami z bawełny (Gossypium hirsutum, Ghi), soi (Glycine max, Gma), grochu (Pisum Sativum. Psa-c jest konwicyliną, Psa-v jest wicyliną) i fasoli (Phasedus vulgaris, Pvu) przedstawiono na figurze 4 (Bown i wsp., 1988; Chlan i wsp., 1986; Doyle i wsp., 1986; Lycett i wsp., 1983). Reszty identyczne zaznaczono za pomocą ramek.

Wszystkie dojrzałe białka z klasy wicylin mają masę cząsteczkową około 47 kDa, za wyjątkiem konglicyny alfa i podjednostek alfa 1 o masach cząsteczkowych wynoszących odpowiednio 72 kDa i 76 kDa i dojrzałej konwicyliny grochu o masie cząsteczkowej 64 kDa. Podjednostki z grochu i fasoli (po dwie podklasy) sa syntetyzowane w postaci małych prekursorów, o masach wynoszących około 50 kDa. Najwyraźniejsza jest homologia polipeptydu o masie 67 kDa z wicyliną z bawełny (Chlan i wsp., 1986). Bawełna jest również najbliżej spokrewniona z kakaowcem - obie rośliny należą do rzędu ślazowatych. Interesujące jest, że prekursor pochodzący z bawełny ma masę cząsteczkową wynoszącą 69 kDa, zawiera krótką sekwencję sygnałową, dużą domenę hydrofilową zawi.eraaacą sześć motywów Cys-X-X-X-Cys i dojrzałego białka. W związku z tym istnieje możliwość syntetyzowania odpowiedniego białka bawełny przy zastosowaniu technik analogicznych do ujawnionych w niniejszym zgłoszeniu i stosowania białka bawełny lub jego fragmentów do wytwarzania dodatków smakowo-zapachowych analogicznych do kakaowych dodatków smakowo-zapachowych.

Przykład XIII. Ekspresja polipeptydu o masie 67 kDa w E.coli

Przed włączeniem do wektora ekspresyjnego regionu kodującego polipeptyd o masie 67 kDa, zachodzące na siebie fragmenty z trzech oddzielnych dodatnich klonów należało złożyć tak, aby utworzyć ciągły fragment DNA. Metodę składania zilustrowano na figurze 6: fragment HindIII-BglII z pMS600, fragment BglH-EcoRI z pMS700 i fragment EcRI-SalI z pMS800 zligowano z pTZ19R przeciętym restryktazami HindIII i SaII. Tak otrzymany plazmid zawierający cały cDNA polipeptydu o masie cząsteczkowej 67 kDa nazwano pMS900. W miejscu kodonu startu ATG wprowadzono miejsce NcoI przy użyciu mutagennego startera.

5' TAG CAA CCA TGG TGA TCA 3'

Mutagenezę in vitro przeprowadzono za pomocą zestawu sprzedawanego przez firmę Amersham International metodą Eckstein'a i wsp. (Taylor i wsp., 1985). Po sparowaniu mutagennego startera z jednoniciowym DNA, podczas syntezy drugiej nici w miejscach dCTP włączaniu ulegał alfa-tio-dCTP. Po przedłużeniu i zligowaniu do zamkniętej postaci kolistej, plazmid trawiono enzymem NciI, który nie rozrywa DNA zawierającego tio-dC. Tak więc, jedynie pierwotna nić ulegała rozrywaniu i kolejnemu trawieniu egzonukleazą III. Następnie ponownie zsyntetyzowano pierwotną nić, przy czym jako startery służyły pozostałe fragmenty DNA, uzupełniając zmutowane miejsce w pierwotnej nici. Następnie plazmidami transformowano E.coli i kontrolowano przy zastosowaniu minipreparatów plazmidowych.

Następnie cDNA polipeptydu o masie 67 kDa klonowano w plazmidzie ekspresyjnym E.coli, pJLA502 (figura 5), we fragmencie NcaI-SaII (pMS902). PJLA502 (Schauder i wsp., 1987) jest do nabycia w firmie Medac GmbH, Postfach 303629, D-7000, Hamburger 36. Zawiera on silne promotory lambda, Pl i Pr, sekwencję liderową i miejsce wiążące rybozomy genu atpE E.coli ulegającego bardzo wydajnej translacji. Plazmid ten zawiera również represor CI wrażliwy na temperaturę, tak więc ekspresja ulega represji w temperaturze 30°C, a aktywacji w temperaturze 42°C. Wektor posiada miejsca NcoI (zawierające kodon ATG: CCATGG) prawidłowo umiejscowione względem miejsca wiążącego rybozony; obce sekwencje kodujące wprowadza się w tym miejscu.

Wektorem ekspresyjnym stransformowano E.coli UT580. Stransformowany szczep hodowano w pożywce L z ampicyliną (100 pg/ml) w temperaturze 30°C do osiągnięcia logarytmicznej fazy wzrostu (OD610 = 0,5), następnie temperaturę zwiększono do 42°C i co pewien czas pobierano próbki. Próbki rozpuszczono we wrzącym buforze SDS i przepuszczono przez żele

169 122

SDS-PAGE. Stosowano elektroblotting białek na błonach nitrocelulozowych (Towbin i wsp., 1979) i analizowano metodą Western blotting przy użyciu przeciwciała przeciwko peptydowi o masie 21 kDa wytworzonego jak opisano wyżej w przykładzie 3 (2 μg/ml), a w charakterze drugiego przeciwciała stosowano koziąprzeciwkrólicczi IgG w połączeniu z alkaliczną fosfatazą (Scott i wsp., 1988).

Plazmid pMS902 wytwarzał pasmo charakterystyczne dla masy 67 kDa, co wskazuje na to, że obecny był działający gen.

Przykład IV. Ekspresja polipeptydu o masie 67 kDa w drożdżach

Zastosowano dwa drożdżowe wektory ekspresyjne, oba oparte o wahadłowy wektor drożdżowo-E.coli zawierający miejsca początku replikacji z drożdży i z E.coli oraz odpowiednie markery selekcyjne (odporność na ampicylinę dla E.coli i auksotrofię leucynowądla drożdży). Oba wektory zawierajądrożdżowy promotor kinazy pirogronianowej (PK) i sekwencję liderową oraz posiadają miejsce do klonowania HindIII znajdujące się w kierunku w dół od promotora. Jeden z tych wektorów - wektor A (YVA) przeznaczony jest do ekspresji wewnętrznej, a drugi - wektor B (YVB) do ekspresji wraz z sekrecją i posiada część sekwencji sygnałowej drożdżowego płciowego czynnika a, położoną w kierunku w dół od promotora oraz miejsca HindIII służące do wytwarzania białek fuzyjnych przy użyciu dołączonych sekwencji kodujących. Wektory te przedstawiono na figurze 7.

Aby wydajnie stosować wektory, pożądane jest wprowadzenie obcego regionu kodującego; w przypadku wektora A - regionu od miejsca do klonowania HindIII do startu ATG, takiego samego jak drożdżowy gen PK, a w przypadku wektora B - reszty sekwencji sygnałowej czynnika a, włącznie z lizyną w punkcie rozszczepienia. W praktyce osiągnięto to przez zsyntetyzowanie dwóch kompletów łączników HindIII-NcoI służących do zlikwidowania luki pomiędzy miejscem do klonowania HindIII w wektorze i NcoI w miejscu startu ATG sekwencji kodującej. Zilustrowano to na figurze 8.

W celu zastosowania drożdżowego wektora B, najpierw należy dokonać delecji hydrofobowej sekwencji sygnałowej z cDNA peptydu o masie 67 kDa. Chociaż brak było bezpośredniego dowodu na położenie naturalnego miejsca rozszczepienia, algorytm Von Heije'ego przewiduje położenie tego miejsca pomiędzy aminokwasami 20 (alanina) i 21 (leucyna). Jednakże zdecydowano usunąć aminokwasy 2-19 przez delecję, tak aby potrzebne miejsce NcoI w miejscu startu translacji mogło pozostać.

Dla ułatwienia konstruowania wektorów drożdżowych zastosowano następującą strategię: najpierw klonowano łączniki HindIII-NcoI w odpowiednich plazmidach PTZ, a potem w wektorach drożdżowych klonowano łączniki wraz z regionem kodującym, we fragmentach HindIII-BamHI. Jednakże region kodujący zawiera wewnętrzne mejsce BamHI, które musiało zostać usunięte przez nutagenezę in vitro, w wyniku czego otrzymano plazmid pMS903. Z pMS903 usunięto sekwencję sygnałową przy użyciu mutagennego startera:

5' AGCATAGCAACCATGGTTGCTTTGTTCT 3' otrzymując pMS904. W pMS903 i pMS904 klonowano odpowiednie łączniki HindIII-NcoI, otrzymując odpowiednio pMS907 i pMS905, a fragmenty HindIII-BamHI tych przejściowych plazmidów (łączniki + region kodujący) subklonowano odpowiednio w YVA i YVB, uzyskując drożdżowe plazmidy ekspresyjne pMS908 i pMS906. Te i inne konstrukcje przedstawiono schematycznie na figurze 9.

Dalszą modyfikację wprowadzono przez skonstruowanie wektora ekspresyjnego, w którym usunięto roślinną sekwencję terminacji i zastąpiono jądrożdżową sekwencją terminacji ADH (występującą w YVA i YVB). Roślinną sekwencję sygnałową usunięto przez przecięcie przejściowych plazmidów pMS907 i pMS905 w miejscu PvuII znajdującym się zaraz za regionem kodującym w kierunku w dół, w pozycji 1716 na figurze 2. Dodano łączniki HindIII i cały region kodujący klonowano w drożdżowych wektorach ekspresyjnych we fragmentach HindIII-HindIII, otrzymując plazmidy ekspresyjne pMS914 (YVA) i pMS916 (YVB) (figura 9). Wykonane konstrukcje przedstawiono na figurze 10.

16!) 122

Drożdżowe plazmidy ekspresyjne przeniesiono do drożdżowych sferoplastów metodą Johnston'a (1988). Jako gospodarza do transformacji zastosowano szczep AH22 LEU' i wyselekcjonowano transformanty na minimalnej pożywce bez leucyny. Transformanty LEU występowały w postaci pasm pojedynczych kolonii, które hodowano w 50 ml pożywki YEPD (Johnston, 1988) w temperaturze 28°C w celu zbadania zasięgu i rozkładu obcego białka. Z hodowli zebrano komórki w przedtem zważonych probówkach przy użyciu wirówki i przemyto 10 ml buforu lizującego (200 mM Tries, pH 8,1; 10% glicerol). Substancję komórkową zebrano i zatężono 10-25 razy w minizatęzaczu Amicon (Słowo Amicon jest znakiem towarowym). Przemyte komórki zważono i ponownie zawieszono w buforze lizującym z dodatkiem inhibitorów proteazy (1 mM fenylometylosulfonylofluorku (PMSF); 1 pg/ml trasylolu; 0,5 pg/ml leupeptyny) w stężeniu 1 g/ml. Dodano jedną objętość kulek szklanych przemytych kwasem i rozbijano komórki przez wirowanie trwające 8 minut, stosując jednominutowe impulsy i jednominutowe przerwy, na lodzie. Po sprawdzeniu pod mikroskopem, czy komórki zostały rozbite, mieszaninę odwirowano w ciągu 3 minut z szybkością 7000 obrotów/minutę w celu osadzenia szklanych kulek. Supernatant usunięto do schłodzonej przedtem probówki do wirowania i wirowano w ciągu 1 godziny z szybkością 20000 obrotów/minutę. (Małe próbki można wirować w mikrowirówce, w niskiej temperaturze). Supernatant tworzy rozpuszczoną frakcję. Osad ponownie zawieszono w 1 ml buforu lizującego z dodatkiem 10% SDS i 1%o markaptoetanolu i ogrzewano w temperaturze 90°C w ciągu 10 minut. Po 15-minutowym odwirowaniu w mikrowirówce powstał supernatant tworzący jednorodną frakcję.

Próbki każdej frakcji i substancji zatężonej poddano analizie blottingowej Western. Odnośnie plazmidów przeznaczonych do ekspresji wewnętrznej w YVA, pMS908 wytwarzał immunoreaktywne białka o masach 67 kDa i 16 kDajedynie wewnątrz komórek. Nie obserwowano sekrecji białka o masie 67 kDa pod wpływem jego własnej sekwencji sygnałowej. Przepuszcza się, ze mniejsze białko stanowi produkt degradacji. Podobny wynik, lecz z lepszą ekspresją, otrzymano przy użyciu plazmidu pMS914, w którym roślinną sekwencję terminacyjną zastąpiono drożdżowąsekwencćąterminacyjną. Nie zachodziła natomiast synteza immunoreaktywnego białka przy użyciu pMS912, w którym usunięto przez delecję region kodujący domenę hydrofilową.

Do wytwarzania białek heterologicznych w drożdżach na skalę przemysłową preferuje się sekrecję, ponieważ komórki drożdżowe trudno ulegają rozbiciu, a procesowanie całego białka komórkowego nie jest łatwe. Wyniki uzyskane przy użyciu wektorów skonstruowanych w celu ekspresji wraz z sekrecjąbyły raczej złożone. Przy użyciu najprostszej konstrukcji, pMS906, w której sekwencja sygnałowa drożdżowego czynnika a zastępuje natywną sekwencję sygnałową białka roślinnego, uzyskano immunoreaktywne białka o masach wynoszących w przybliżeniu 47 kDa, 28 kDa i 18-20 kDa, które ulegały sekrecji do środowiska. Na pierwszy rzut oka taki wynik jest zadziwiający, ponieważ wprowadzony region kodujący powinien syntetyzować białko o masie 67 kDa. Najbardziej prawdopodobnym wyjaśnieniem tego jest, ze proteaza drożdżowa KEX2, która rozpoznaje i odszczepia sekwencję sygnałową czynnika a w miejscu Lys-Arg, rozszczepia również białko o masie 67 kDa w miejscach Lys-Arg w pozycjach 148 i 313 aminokwasowej. Obliczone masy fragmentów powstających w wyniku rozszczepiania białka w tych pozycjach wynoszą - 47 179 Da, 28 344 Da, i 18 835 Da, zatem są one zbliżone do mas obserwowanych.

W przypadku zastąpienia w pMS916 roślinnej sekwencji terminacji drożdżowąsekwencją terminacji, nie uzyskano ekspresji ani w komórkach, ani w pożywce; jest zatem możliwe, że przypadkowo wprowadzono mutację. Przy zastosowaniu konstrukcji pMS910, w której domenę hydrofilową usunięto przez delecję, najważniejszymi antygenami były wydzielane do pożywki białka o masach 28 kDa i 18-20 kDa. Przypuszcza się, że produkt o masie 47 kDa ulega rozszczepieniu w miejscu KEX2 w pozycji 313 natychmiast po jego powstaniu. Reasumując, cztery spośród sześciu skonstruowanych wektorów ekspresyjnych kierują syntezą białek, które wykazują reakcję krzyżową z przeciwciałami przeciwko 47 kDa. Dwie z tych konstrukcji powodują sekrecję białek do pożywki.

16!) 122

Przykład XV. Konstrukcja wektorów przeznaczonych do ekspresji białka o masie 67 kDa w Hansenula polymorpha.

Metylotroficzne drożdże Hansenula polymorpha jako gospodarz do ekspresji białek heterologicznych mają szereg zalet w porównaniu z Saccharomyces cerevisiae (Europejskie zgłoszenie patentowe nr EP-A-0173378 oraz Sudbery i wsp., 1988). Drożdże hoduje się na metanolu, jako jedynym źródle węgla; w tych warunkach enzym oksydaza metanolowa (MOX) może stanowić do 40% całego białka komórkowego. Tak więc,promotor MOXjest bardzo silnym promotorem, który można stosować w wektorze do kierowania syntezząbiałek heterologicznych, przy czymjest on wydajny nawet w postaci pojedynczej kopii. Umożliwia to stosowanie wektorów trwale zintegrowanych. Hansenula może także wzrastać na źródłach o dużej zawartości węgla takich jak glukoza, w którym to przypadku promotor MOX ulega całkowitej represji. To oznacza, że komórki zawierające heterologiczny gen można hodować aż do osiągnięcia wysokiej gęstości na glukozie i indukować wytwarzanie obcego białka przez usunięcie glukozy i dodanie metanolu.

Wytworzono plazmid pHGL1 zawierający promotor i sekwencję terminacyjnąMOX oraz kasetkę zawierającą sekwencję sygnałową sekrecji drożdżowego czynnika α. Region kodujący białko o masie 67 kDa sklonowano w wektorze pHGLl we fragmencie BamHI-BamHI, zastępując fragment BgIII zawierający koniec 3' regionu kodującego MOX. Cały region promotor-gen-sekwencja terminacyjna można wówczas przenieść do YEp13, jako fragment BamHIBamHI, otrzymując plazmid ekspresyjny pMS922. Szczegóły tej konstrukcji przedstawiono na figurze 11. Skonstruowano analogiczny plazmid ekspresyjny, pMS925 z sekwencją drożdżowego czynnika a połączoną z regionem kodującym białko o masie 67 kDa, zastępując naturalną roślinną sekwencję sygnałową. Kasetkę BamHI-HindIII zawierającą czynnik a poddano ligacji z fragmentem HindIII-BamHI, stosowanym do wprowadzenia regionu kodującego białko o masie 67 kDa do YVB. Następnie sekwencję czynnika a wraz z regionem kodującym sklonowano w pHGL1, we fragmencie BamHI-BamHI i przeniesiono do YEP13, jak przedtem. Szczegóły przedstawiono na figurze 12.

Dwiema konstrukcjami stransformowano Hansenula i hodowano w warunkach indukcyjnych na 0,5% lub 1% metanolu. Obie konstrukcje wytwarzały immunoreaktywne białko wewnątrz komórek, a pMS925 powodował sekrecję białka do pożywki pod wpływem sekwencji sygnałowej czynnika α.

Szczepy E.coli

RR1 F'vb’Mb ara-14 proA2 leuB6 lacY1 galK2 vpsL20 (str^r) xyl-5 mtl-1 supE44

CAG629 laCam tvpam phOam htpRam mal rpsL lon supCts

UT580 (lac-pro) supE thi hsdD5/F' tra D36 proA B⁺ lacI^q lacZ M15

Odnośniki literaturowe

Aviv, H., i Leder, P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 1408-1412 (1972). Purification of biologically active globin mRNA by chromatography on oligo dT cellulose.

Biehl, B., Wewetzer, C., i Passern, D. J. Sci. Food Agric. 33,1291-1304 (1982). Vacuolar (Storage) Proteins of Cocoa Seeds and their Degradation during Germination and Fermentation.

Borroto, K., i Dure, L. Plant Molecular Biology 8, 113-131 (1987). The globulin seed storage proteins of flowering plants are derived from two ancestral genes.

Bown. G., Ellis. T.H.N., i Gatehouse, J.A. Biochem. J. 251717-726 (1988). The sequence of a gene encoding convicilin from-pea (Pisum sativum) shows that convicilin differs from vicilin by an insertion near the N-terminus.

Catty, D. i Raykundalia, C. Production and Quality control of Polyklonal Antibodies, ntibodies: A Practical Approach” Vol I, IRL Press (1988)

Chlan, C.A., Pyle. J.B., Legocki, A.B., i Dure, L. Plant Molecular Biology 7, 475-489 (1986). Developmental biochemistry of cotton seed embryogenesis and germination XVIII. cDNA and amino acid sequences of members of the storage protein families.

Cuming, A.C., Williams, R.S., i Cullimore, J.V. “Immunology in Plant Science”, Wyd. Wang, T.L., Cambridge University Press, 1986. The use of Antibodies in Molecular Biology.

169 122

Doyle, J.J., Schuler, M.A., Godette, W.D., Zencer, V., Beachy, R.N., i Slightom, J.L. J. Biol. Chem. 2619228-9238 (1986). The glycosylated seed storage proteins of Glycine max and Phaseolus vulgaris: Structural homologies of genes and proteins.

Dretzen, G., Bellard, M., Sassone-Corsi, P., i Chambon, P. Analytical Biochemistry 112, 295-298 (1981). A reliable method for the recovery of DNA fragments from agarose and acrylamide gels.

Eschenfeldt, W.H., Puskas, R.S., i Berger, S.L. Methods in Enzymology 152, 337-342 (1987). Homopolymeric Tailing.

Fritz i wsp. (J. Food Sci. 50 946-950 (1985))

Gubler, U., i Hoffman, B.J. Gene 25, 263 (1983). A simple and very efficient method for generating cDNA libraries.

Hall, T.C., Ma, Y., Buchbinder, B.U., Pyrne J.W., Sun, S.M., i Bliss, F.A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75,3196-3200 (1978). Messenger RNA for G1 protein of French bean seeds: cell-free translation and product characterisation.

Hill, S.A. “Methods in Plant Virology”, Blackwell 1984. Johnston, J.R., “Yeast : A practical approach”, Wyd.: Campbell, I., i Duffus. J.H. IRL Press. 1988. Yeast Genetics, Molecular Aspects.

Kreil. G. Annual Rev Biochem. 50. 317-348 (1981). Transfer of proteins across membranes.

Laemmli, U.K. Nature 227,680 (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.

Lipman, D.J., i Pearson, W.R. Science 227, 1435-1441 (1985). Rapid protein sequence similarity searches.

Lycett, G.W., Delauney, A.J., Gatehouse, J.A., Gilroy, J., Croy, R.R.D., i Boulter, D. Nucleic Acids Res, 11, 2367-2380 (1983).

Maniatis, T., Fritsch, E.F., i Sambrook, J. “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbour Laboratory, 1982.

Mason, P.J. i Williams, J.G., “Nucleic Acid Hybridisation : A Practical Approach”, Wyd.: Hams, B.D., i Higgins, S.J. IRL Press 1985. Hybridisation in the Analysis of Recombinant dNa.

Meinhoth, J., i Wahl, G.M. Analytical Biochemistry 138,267 (1984). Methods of Southern blotting and DNA probing.

Miller, H. Methods in Enzymology 152, 145-170 (1987). Practical Aspects of Preparing Phage and Plasmid DNA : Growth. Maintenance and Storage of Bacteria and Bacteriophage.

Norrander, J., Kempe, T., i Messing, J. Gene 26, 101 (1983). Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagensis.

Proudfoot, N.J., i Brownlee, G.G. Nature 263, 211-214 (1976). 3' Non-coding region sequences in enkayotic mesenger RNA.

Roberts, B.E., i Paterson, B.M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70, 2330 (1973). Efficient translation of tobacco mosaic virus RNA and rabbit globin 9S RNA in a call-free system from commercial wheat germ.

Sanger, F., Nicklen, S., i Coulson, A.R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 5463-5467 (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.

Schauder, B., Blocker, H., Frank, R., i McCarthy, J.E.G. Gene 52, 279-283 (1987). Inducible expression vectors incorporating the E. coli aptE translation initiation region.

Scott, R., Jefferson, R., Dury, G., i Jacob, L., “Plant Genetic Transformation and Gene Expression: A Laboratory Manual”. Wyd.: Draper, J., Scott, R., Armitage, P., Walden, R. Blackwell 1988. Analysis of gene organisation and expression in plants.

Staden, R. Nucleic Acids Res. 14, 217-231 (1986). The current status and portability of our sequence handling software.

Sudbery, P.E., Gleeson, M.A., Veale, R.A., Lederboer, A.M., i Zoetmulder, M.C.M. Biochem. Soc. Trans 16 1081-103 (1988). Hansenula polymorpha as a novel yeast system for the expression of heterologous genes.

169 122

Taylor, J.W., Ott, J., i Eckstein, F. Nucleic Acids Res. 13, 8765-8785 (1985). The rapid generation of oligonucleotide-directed nutations at high frequency using phosphorothioatemodified DNA.

Towbin, H. Staehelin, T., i Gordon, J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4534 (1979). Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets : procedure and some applications.

Von Heije, G. Eur. J. Biochem 133, 17-21 (1983). Patterns of Amino-acids near SignalSequence Cleavage Sites. Wahl, G.M., i Berger, S.L. Methods in Enzymology 152, 415-423 (1987). Screening Colonies of Plaques with Radioactive Nucleic Acid Probes'.

Woods, D.E. Focus (Bethesda Research Labs) 6, 3 (1984). Oligonucleotide Screening of cDNA Libraries.

Woods, D.E., Markham. A.F., Ricker, A.T., Goldberger, G., i Colten, H.R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5561 (1982).

FIG. 1

-,-!

0.5 1.0 1.5 .Τ Υ............. ~7Τ Τ 3--Ρ Bg Ba Ε Κ

- pMS600

----- pMS700

.0 kb pMS800 sekwencja z pMS600

PMS700 pKS800

169 122

FIG. 2A

MVISKSPFIVLIFSLL AAGCATAGCAAATATGGTGATCAGTAAGTCTCCTTTCATAGTTTTGATCTTCTCTCTTCT 10 20 30 40 50 60

LSFALLCSGVSAYGRKQYER CCTTTCTTTTGCGTTGCTTTGTTCTGGTGTCAGCGCCTATGGCAGAAAACAATATGAGCG 70 80 90 100 110 120

DPRQQYEQCQRRCESEATEE TGATCCTCGACAGCAATACGAGCAATGCCAGAGGCGATGCGAGTCGGAAGCGACTGAAGA 130 140 150 160 170 180

REQEQCEQRCEREYKEQQRQ AAGGGAGCAAGAGCAGTGTGAACAACGCTGTGAAAGGGAGTACAAGGAGCAGCAGAGACA 190 200 210 220 230 240

QEEELQRQYQQCQGRCQEQQ GCAAGAAGAAGAGCTTCAAAGGCAATACCAGCAATGTCAAGGGCGTTGTCAAGAGCAACA 250 260 270 280 290 300

QGQREQQQCQRKCWEQYKEQ ACAGGGGCAGAGAGAGCAGCAGCAGTGCCAGAGAAAATGCTGGGAGCAATATAAGGAACA 310 320 330 340 350 360

ERGEHENYHNHKKNRSEEEE AGAGAGAGGCGAGCACGAGAATTACCATAATCACAAAAAAAATAGGAGCGAAGAAGAAGA 370 380 390 400 410 420

GQQRNNPYYFPKRRSFQTRF AGGGCAACAAAGAAACAATCCTTACTATTTTCCTAAAAGAAGATCATTCCAAACTCGATT 430 440 450 460 470 480

169 122

FIG.2D

AS kdqplnavafglnaqnnq TGCATCCAAAGACCAGCCCCTGAATGCAGTTGCGTTTGGACTCAACGCCCAGAACAACCA 1450 1460 1470 1480 1490 1500

RIFLAGKKNLVRQMDSEAKE GAGAATTTTCCTTGCAGGGAAAAAGAACTTGGTCAGACAAATGGATAGCGAGGCAAAGGA 1510 1520 1530 1540 1550 1560

LSFGVPSKLVDNIFNNPDES GTTATCATTTGGGGTACCATCGAAATTGGTAGATAATATATTCAACAACCCGGATGAGTC 1570 1580 1590 1600 1610 1620

Y FMSFSQQRQRRDERRGNPL GTATTTCATGTCTTTCTCTCAACAGAGGCAGCGTCGAGATGAAAGGAGGGGCAATCCCTT 1630 1640 1650 1660 1670 1680

ASILDFARLF* ggcctcaattctggactttgcccgcttgttctaagcagctgcttccacttttgtatcaga

1690 1700 1710 1720 1730 1740

CATGCAGAGGCATGTAATGCAATAAATAAGTTGGCCTATGTAAAGAGGAGAGAGTTTGCT 1750 1760 1770 1780 1790 1800

TTTGTCTTGTTCTAACCTTGTTTTGAACTAGTAAACTTTCAATGTAATGAGAGTTGTTAT 1810 1820 1830 1840 1850 1860

CTTTCTA

169 122

FIG. 2B

RDEEGNFKILQRFAENSPPL CAGGCATGAAGAGGGCAACTTCAAGATCCTCCAGAGGTTTGCTGAGAACTCTCCTCCACT 490 500 510 520 530 540

KGIUDYRLAMFEANPNTFIL CAAGGGCATCAACGATTACCGCTTGGCCATGTTCGAAGCAAATCCCAACACTTTTATTCT 550 560 570 580 590 600

PHHCDAEAIYFVTNGKGTIT TCCGCACCACTGTGATGCTGAGGCAATTTACTTCGTGACAAACGGAAAGGGGACAATTAC 610 620 630 640 650 660

FVTHENKESYNVQRGTVVSV GTTTGTGACTCATGAAAACAAAGAGTCCTATAATGTACAGCGTGGAACAGTAGTCAGCGT 670 680 690 700 710 720

PAGSTVYVVSQDNQEKLTIA TCCTGCAGGAAGCACTGTTTACGTGGTTAGCCAAGACAACCAAGAGAAGCTAACCATAGC 730 740 750 760 770 780

VLALPVNSPGKYELFFPAGN TGTGCTCGCCCTGCCTGTTAATTCTCCTGGCAAATATGAGTTATTCTTCCCCGCTGGAAA 790 800 810 820 830 840

NKPESYYGAFSYEVLETVFN TAATAAACCTGAATCATATTACGGAGCCTTCAGCTATGAAGTTCTTGAGACCGTCTTCAA 850 860 870 880 890 900

TQREKLEEILEEQRGQKRQQ TACACAAAGAGAGAAGCTGGAGGAGATCTTGGAGGAACAGAGAGGGCAGAAGAGGCAGCA 910 920 930 940 950 960

169 122

FIG. 2C gqqgmfrkakpeqiraisqq GGGGCAGCAGGGTATGTTCCCGAAAGCCAAACCAGAGCAGATAAGAGCAATAAGCCAACA 970 980 990 1000 1010 1020

ATSPRHRGGERLAINLLSQS AGCTACTTCTCCAAGGCACAGAGGCGGGGAGAGACTTGCCATCAATCTATTGAGCCAATC 1030 1040 1050 1060 1070 1080

PVYSNQNGRFFEACPEDFSQ GCCTGTCTACTCCAACCAAAACGGACGCTTCTTTGAGGCTTGTCCTGAGGACTTCAGTCA 1090 1100 1110 1120 1130 1140

FQNMDVAVSAFKLNQGAI F V atttcagaacatggatgtcgctgtttcagccttcaaactgaatcagggagccatatttgt 1150 1160 1170 1180 1190 1200

PHYNSKATFVVFVTDGYGYA GCCACACTACAATTCTAAGGCTACATTCGTGGTGTTTGTCACGGACGGATATGGGTACGC 1210 1220 1230 1240 1250 1260

QMACPHLSRQSQGSQSGRQD TCAAATGGCTTGCCCGCATCTCTCCAGACAGAGCCAGGGATCCCAAAGTGGAAGGCAAGA 1270 1280 1290 1300 1310 1320

RREQEEESEEETFGEFQQVK CAGAAGAGAACAAGAAGAAGAGTCAGAAGAGGAGACATTTGGAGAATTCCAGCAGGTCAA 1330 1340 1350 1360 1370 1380

APLSPGDVFVAPAGHAVTFF AGCCCCATTGTCACCTGGTGACGTCTTTGTAGCCCCGGCAGGCCATGCAGTTACATTCTT 1390 1400 1410 1420 1430 1440

169 122

FIG.3

10	20	30	40	50	60
MVISKSPFIV	LIFSLLLSFA	LLCSGVSAYG	RKQYERDPRQ	QYEQCQRRCE	SEATEEREQE
70	80	90	100	110	120
QCEQRCEREY	KEQQRQQEEE	LQRQYQQCQG	RCQEQQQGQR	EQQQCQRKCW	EQYKEQERGE
130	140	150	160	170	180
	EEPGSQF	ANPAYHF
HENYHNHKKN	RSEEEEGQQR	NNPYYFPKRR	SFQTRFRDEE	GNFKILQRFA	ENSPPLKGIN
190	200	210	220	230	240
DYRLAMFEAN	PNTFILPHHC	DAEAIYFVTN	GKGTITFVTH	ENKESYNVQR	GTWSVPAGS
250	260	270	280	290	300
TVYWSQDNQ	EKLTIAVLAL	PVNSPGKYEL	FFPAGNNKPE	SYYGAFSYEV	LETVFNTQRE
310	320	330	340	350	360
KLEEILEEQR	GQKRQQGQQG	MFRKAKPEQI	RAISQQATSP	RHRGGERLAI	NLLSQSPVYS
370	380	390	400	410	420
NQNGRFFEAC	PEDFSQFQNM	DVAVSAFKLN	QGAIFVPHYN	SKATFWFVT	DGYGYAQMAC
430	440	450	460	470	480
PHLSRQSQGS	QSGRQDRREQ	EEESEEETFG	EFQQVKAPLS	PGDVFVAPAG	HAVTFFASKD
490	500	510	520	530	540
QPLNAVAFGL	NAQNNQRIFL	AGKKNLVRQM	DSEAKELSFG	VPSKLVDNIF	NNPDESYFMS
550	560	570	580	590	600
FSQQRQRRDE	RRGNPLASIL	DFARLF

169 122

FIG. 4A

ok a. M lu Ui—· Cd

CS Cd CL > o σ ee σ i O ojft. ta

U i

CS

3

f3

«3

«S

3

fs

«4 ęa

w

-C έ

®ł

9)

>

U

E

tft

en

>

u

jz ε

en

C O

Cu

&

Ł,

o

O

Q«

Od

0-

&*

O O

o.

Psa169 122

FIG.4

©

CM © χ χ &o o cm (X i Cm

υ >

i i in - a rę a □ U X E W W > ę-* u o o- o- ou >

i i «·* O 3 U X ć o) 0) > t— O 0 0-0-0as o o o

I o

I X I o

I CO I Cm

J ·—··—· O< e- < z

IQ —* /0 Z3 u j: ε η n >

H O O cl ω cl ω ω ω ω ω ω taj fcJ taj hj £> ►M ta^ »-» te»« ►“* [m Cłjjz 2 X X > £ tt & ł<

co o w w CO W

Cs, U. U. Cl Cl Cl < <|u ο o ω o α σ « w σ

Ιω ω ω ωΐσ 3= ο

ΓΜ

σ ł< 2 u s ac z s sjo q cl ω α α α ω α I o ofcZlolos cu

<e —« g f8 UJ 3 u £ E m tn >

O O o. cl cl

169 122

□s	OS	Z		Cd	3oS
		-		«	6—«
α	σ	σ σ a a
ω	Cd	Cd	Cd	[Zl«
o«	σ		as	as	03
	03	W	03	03	a
		*-d	>	>	I-d
		ω			Z
	1	>		>	>
	I	—	B-d
	1	>	»-d	>	>

oj oj CA 0g|o oij *»· Cs. J J J _3 j ' O I CA ca cs cs zfojs < < as 3Λ ot z • Ξ^ζ · i o u ι ι fzlca ι I Cd Z I i Cd — I I o ω i

Ο xr

Ο £

1 1	1
1 1	03
ł 1	Cd
Eb Cb	a
z z
0 0	as
cs σ	i

o m i

m Cb Eb Eb Cb o(T<]q. z z ί? J Co. as ω o

CA Cd Cd Cdjoj Z O W O O Cd fajce z μ(ο|μ Icdlu wfĆdCd «1

Cd O b. J J b.

Eb-EHZZl — j > > > > Cd Cdjas as as z cdfo zjcd Cd [z . Ί ·-* M ac OM h Μ M [μ M Cd Cd Id m| cd « Ł χ > Ł

U > I I

<0

w<d m

w

nj

3

ra

— g

rs

m

3

ίθ

—s m

ίΰ

3

u

JZ E

ot

V3

>

u

Z E

OT

ot

>

υ

JZ E

OT

OT

>

i-

O O

O.

0.

0.

t-

U u

z

0.

o-

e-

U U

Oa

Ol

Ol

> Z —1 Cd *1
Iz z z z z|
CA E- cs z ot1>>	Q X Z OS Z OS
OT CA cni
J u-3	os ca cc
α α z z	J α j z z z

z as ja fa. co o cd aa m ca rajca O oj CA CĄ CA ad O ca 03 a, en ca β « w’J > J z ra E-> cn cn 03

Ras ad as ad Z as as z CA CA OT CA « Ca] E- E-|CA CA CA CA

I I 03 CA CA CA 1 1 as as as as

CJ CA I < > > _J > >

jz zjJ J J J

O CS W Cd Cd Cd Cd ot ’ί’ < > J Ł >

{>1 z o x jo o|< a- z α as z cd jo o o o o oj

<<<<<< as as asjz zjas W W w Μ M OT

Z Z Z zf>.

2;

z z z zfzj:

I CP ** ⁰³ ** o o U O UO CS ojca as > Gd z z zjas H pj|x »-. « z o as o α ca α cd

Z ►-> J J J 1 z α α o o 1

169 122

o > *—»

« OS CS2 Cd qs os > > > >· >

O Sć « 05 J CO [oj ta ce {o c^m w χ > > > s||wl σIw Ed|oiwl

	z	z	z	z	Z	o		O	fcj	σ
[z	zg	o	o	o	o	z	Cd	ca	ω	o
	HM	o	o	Cd	fr-	Q£	W	Cd	Cd	Cd

a£|C0 OT W] Ojo O O O O < < ’ΨΊ'* -a--Eu Cu Cb Cb &·!»□ hm Z SS os os os os os O O CD OJ Cd 3S z z z z z

	1 Z	z	Z	Z	Z
1	1 O	Cd		Cd	z
O 1	ι Ο»	M	•=c	oi	<
P*
tn i	1 Z	z	z	z	z
1	1 HM	M	HM	HM	HM

u 1

> 1

u |

>

u

>

re

— ra

(3

5

*3

M-J f»

fS

3

f3

—j (3

<3

R3

3

V

JZ έ

V)

CO

>

O

jz έ

10

W

>

U

Λ 6

CO

00

>

fr-

O o

Od

&

Oa

6-

o o

3,

Od

Od

e-

O o

Od

Od

O>

169 122

FIG. 5

Pr,P_l RBS Start ==>--GGAGACTGCCATGG ^K ' »\/40 zasad w kierunku w góra od apt E z E.coli

169 122 oo

CO w

Oco

CO o

υ bJ

E

CO

CO co

FIG. 6

JLJ

O	O	O
O	o	o
O	r-~	00
CZ)	w	CZ)
z	Σ	z
CL	cl	CL

•H

O	O -H	40	A
xn	J4 O	44 -H
C	Χ13	O
cnm O	m xn	ID
3 σ» ετ’τ O	m		r—I
-M - 3 Ό O <M Ό	·» ζρ *> 0 3 0 rM		CO —ρ. w ,!
0	0	Ό				1
+J		O
c	44
<0	C	44
g	V	c
en	g	V		u
<0	CP	g
u	«3	CP	i-H
<4-4	34	«3		(0	o
	<44	1-4		W	u
		<4-1			ω
c «3	c	>		•H	\
s	«3	C		HI
o	5	<0		K
rH	0			H	g
o	rH	0			co
N	0	r—ł		'O	CO
•H	N	o		C
>1	-r4	N		•H
	>1	-r4		SC
•	Z	>
1—1 i—<	• I-I	z •		0 cn Φ
	04	l—l		P
f—4	1 °			oz	ι—1
00	u	i—4		•H	00
co	1 ω	CO		O Φ	CQ
		cn		N
+				μι
				CU	44
l—l	•H	Ή		O\	w
1—1				rH	o.
Η-1	1—1			04
	I-I	l—l
-σ		04		Eh CU
c	r—1	O
•H	00	U		O
X	CO	W		Ό

0) c

	>1	>4	<0
44	44	44	S
OZ	V	az	O
-H	-H	•H	CP
U	O	o	-H
<y	Φ	0)	r4
N	N	N	N
34	34	34
04	0.	O<	>4 i >
O	O	O	c
o	O	O	«
	r*·	CO	g cn «3
CZ)	CZ3	CZ)
z	Z	z	34
cl	cl	Cl	Cm

.U <

z:

Q

O

O

OJ

S

II

II

N

O i—l o

o σ\ cn

S

CL

N >1

C <0 o

G

O rd

Λ g

O

Xł

O

II

169 122

FIG. 7

169 122 co <0 £

00 <	00 <
Li O	M U		OJ	0
< <	< <		(—1	Eh
Η H	Μ E-*		1—1	<
Φ U	01 U		r-l	0
W F«	W H		(0	Eh
U 0	-P O	0	>	0
0) E-i	Φ E-t	<	4->	0
2 <	2 <	Eh	0)	Eh
2	<	0	2	<
U	U	0 o		0
<	<	< Eh		0
u	u	U 0		<
Ε-»	Eh	Eh <		0
<	<	< Eh		Eh
U	U	O 0		<
	Eh	M <		0
<	<	< Eh		Eh
U	U	U 0		<

Ο

UJ

2Ζ

O u

o o

<

Ε-»

H

H

0		0 0
Eh		Eh <
<		< Eh
2		< Eh
0		0 0
0		0 0
Eh		Eh <
Eh		Eh
0	C	0
0 5	ZZ	0 <
0
<
Eh
Eh
Eh

c <o o

c

O <u υ

o

Ό

N			<0
<β		c	υ
c		0	(0
•H		-H	-r-ι	Ο
	•m	c	φ	u
	G)	V	-Η	ζ
>1	S	•H	ε	1
	0	ε		ζ
o	c	N	ιβ	Η
•N	(0		-Η	Μ
'O	•H	«ί	C
*N	C	-m	φ	•Η
o	o	υ	Ν
	P	c	Μ	Ή
'O	cn	Φ	Ο	C
	0	ł	?	Ν
c		Λί	4J	υ
Φ	•H	φ	>1	«θ’
O	CU	ω	ϊ

M

O •U λ:

Φ >1

C (O •n Q >ι Λ4 m

Φ r— M KO

Λ

Ai r-i W Ό

169 122

ŻE

FIG. 8B o

0» «

* o

•N a

-N o

Li

Ό «

ł

O «

C θ' a

« •n

O

C

V

a.

V

Ul c

o

-H σ» e>

—I c

c >1 (4

U o

u z

I z

HI s

—I c

N u

Itf *4

N.

4J >1

N

O

Ό

O

0) —i N (0

S ffl •n

N

Cu kodującym 67 kDa

169 122

FIC. 9A pMS900

Cały region kodujący 67 kDa w p¹-2 mutageneza in vitro w celu wprowadzenia miejsca NcoI w miejscu ATG pMS901 mutageneza in vitro w celu usunięcia wewnętrznego miejsca BamHI pMS903 dodanie łączników Hin-Nco pMS907

pMS911 cięcie za pomocą PvuII dodanie łączników Hin klonowanie w YVA we fragmencie Hin delecja odcinka hydrofiłowego pMS914 klonowanie w YVA we fragmencie Hin-Bam pMS912

169 122

•m
Φ
0	0
<M	υ
10	ζ
c	I
θ'	C
>,	•Η
«	Β
-H	*
n	Ό
U	*
C	•Η
Φ	C
	Ν
X	υ
Φ	<tf
α	ιΜ
(0	Φ
•|—1	•Η
υ	C
ω	<0
r4	Ό
Φ	Ο
Ό	Ό

η	Μ·	tn
ο	Ο	o
σ»	A <*	cn
W	* w	► w
£	£	£
a	a	a

c

Ή

SC

Φ

Ή o

c (U e

σ>

« u

Ή

O

ω ? -η υ

φ c •H φ c

<d

O c

o <0 ł-i

Ή vo o

cn ω

£ a

rd Φ

169 122

FIG. 10

Serie ΪΥ&p M S 9 O 8 —«^—{5353^p M S 914 « -t -t=rrr-pMS912 —............. .....-JSerie YVB _PMS9O6 —>—-eZZ2E2^p M S 916 -—2 2 ·Ο1ια>.>Μ ........... -fc:pMS910 ——T Z Z ZI ........— . ]ES3 Sygnał 67kDa kakaowca

1S S l sygnał drożdżowego czynnika o£ Terminator kakaowca

ΕΓΞ3 domena hydro fi Iowa

1.........I region kodujący 47 kDa ' terminator drożdżowy

169 122

łBam z pHGL 1 przeciętym BGL

169 122 kodujący 67 kD

169 122

ligać ja fragmentu Ba: pHGLl przeciętym Bgl

169 122

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 90 egz

Cena 6,00 zł

Claims (27)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania białka z Theobroma cacao o masie 67 kDa lub jego fragmentu o co najmniej 20 aminokwasach, znamienny tym, że transformuje się komórki gospodarza kwasem nukleinowym kodującym białko lub jego fragment i hoduje się te komórki gospodarza, przy czym kwas nukleinowy ma co najmniej część sekwencji określonej na fig. 2.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako kwas nukleinowy stosuje się DNA.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się kwas nukleinowy w postaci wektora.
4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako wektor stosuje się wektor ekspresyjny a sekwencja kodująca białko lub jego fragment jest połączona w sposób umożliwiający działanie z promotorem.
5. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że jako wektor ekspresyjny stosuje się drożdżowy wektor ekspresyjny a jako promotor stosuje się promotor drożdżowej kinazy pirogronianowej (PK).
6. 6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że jako wektor ekspresyjny stosuje się bakteryjny wektor ekspresyjny a jako promotor stosuje się silny promotor lambda.
7. 7. Sposób według zastrz. 4, albo 5, albo 6, znamienny tym, że stosuje się kwas nukleinowy obejmujący sekwencję sygnałową.
8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze jako komórkę gospodarza stosuje się komórkę Saccharomyces cerevisiae.
9. 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako komórkę gospodarza stosuje się komórkę E.coli.
10. 10. Sposób wytwarzania białka Theobroma cacao o masie 47 kDa lub jego fragmentu o co najmniej 20 aminokwasach, znamienny tym, że transformuje się komórki gospodarza kwasem nukleinowym kodującym białko lub jego fragment i hoduje się te komórki gospodarza, przy czym kwas nukleinowy ma co najmniej część sekwencji określonej na fig. 2.
11. 11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że jako kwas nukleinowy stosuje się DNA.
12. 12. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że stosuje się kwas nukleinowy w postaci wektora.
13. 13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że jako wektor stosuje się wektor ekspresyjny a sekwencja kodująca białko lub jego fragment jest połączona w sposób umożliwiający działanie z promotorem.
14. 14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że jako wektor ekspresyjny stosuje się drożdżowy wektor ekspresyny a jako promotor stosuje się promotor drożdżowej kinazy pirogronianowej (PK).
15. 15. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że jako wektor ekspresyjny stosuje się bakteryjny wektor ekspresyjny a jako promotor stosuje się silny promotor lambda.
16. 16. Sposób według zastrz. 13, albo 14, albo 15, znamienny tym, ze stosuje się kwas nukleinowy obejmujący sekwencję sygnałową.
17. 17 Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, ze jako komórkę gospodarza stosuje się komórkę Saccharomyces cerevisiae.
18. 18. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że jako komórkę gospodarza stosuje się komórkę E.coli.
19. 19. Sposób wytwarzania białka z Theobroma cacao o masie 31 kDa lub jego fragmentu o co najmniej 20 aminokwasach, znamienny tym, że transformuje się komórki gospodarza kwasem nukleinowym kodującym to białko lub jego fragment i hoduje się te komórki gospodarza przy czym kwas nukleinowym ma co najmniej części sekwencji określonej na fig. 2.
20. 20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że jako kwas nukleinowy stosuje się DNA.
21. 21. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że stosuje się kwas nukleinowy w postaci wektora.
22. 22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że jako wektor stosuje się wektor ekspresyjny a sekwencja kodująca białko lub jego fragment jest połączona w sposób umożliwiający działanie z promotorem.
23. 23. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że jako wektor ekspresyjny stosuje się drozdżowy wektor ekspresyjny a jako promotor stosuje się promotor drożdżowej kinazy pirogronianowej (PK).
24. 24. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że jako wektor ekspresyjny stosuje się bakteryjny wektor ekspresyjny a jako promotor stosuje się silny promotor lambda.
25. 25. Sposób według zastrz. 21, albo 22, albo 23, znamienny tym, ze stosuje się kwas nukleinowy obejmujący sekwencję sygnałową.
26. 26. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że jako komórkę gospodarza stosuje się komórkę Saccharomyces cerevisiae.
27. 27. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że jako komórkę gospodarza stosuje się komórkę E.coli.

    * * *