PL177263B1

PL177263B1 - Monoestryfikowane związki przeciwwirusowe i kompozycja zawierająca te związki

Info

Publication number: PL177263B1
Application number: PL94310970A
Authority: PL
Inventors: Bernt Borretzen; Are Dalen; Finn Myhren; Kjell T. Stokke
Original assignee: Norsk Hydro As
Priority date: 1993-04-05
Filing date: 1994-04-05
Publication date: 1999-10-29
Also published as: HUT73659A; UA41361C2; SK281231B6; AU685104B2; JP3049258B2; DE69413529D1; CA2158853A1; HU228064B1; ES2124883T3; CZ259395A3; PL310970A1; NZ263888A; DE69413529T2; AU6514194A; DK0693077T3; HK1003437A1; HU9502896D0; CA2158853C; FI111370B; RU2139884C1

Abstract

1. Monoestryfikowane zwiazki przeciwwirusowe o wzorze: Nu - O - Fa w którym O oznacza atom tlenu, Nu oznacza analog nukleozydu, a Fa oznacza grupe acylowa mono- nienasyconego kwasu tluszczowego o dlugosci lancucha obejmujacej 18 do 20 atomów wegla i wiazaniem mononienasyconym ? w pozycji 9, przy czym kwas jest zestryfikowany poprzez grupe hydroksylowa reszty cukrowej analogu nukleozydu w pozycji 5’ lub poprzez koncowa grupe hydroksylowa przylaczona do niecy- klicznej czesci tego analogu oraz w którym Nu ma wzór: B -S w którym S oznacza pochodna monocukrowa wybrana sposród nastepujacych zwiazków: 1-ß -D- rybofuranozy, 1 -ß-D-arabinofuranozy, 2-dezoksy- 1-ß -D-rybofuranozy, 2,3-didezoksy-1-ß -D-rybofuranozy, 2-dezoksy-2-fluoio-1-ß -D-arabinofuranozy a B oznacza heterocykliczny uklad pierscieniowy wybrany spo- sród zwiazków: (i) o wzorze 1, wzorze 5 w którym w miejsce X mozna podstawic atom tlenu (O), którym w miejsce Y mozna podstawic grupe - C = CH , a w miejsce R1 - grupe NH2 lub (ii) o wzorze 9, o wzorze 10, w których w miejsce R4 mozna podstawic grupe NH2 , a w miejsce R5 - atom wodoru (H) oraz w miej- sce R6 - atom wodoru lub atom chlorowca lub (iii) o wzorze 11, w którym w miejsce R2 mozna podstawic atom wodoru (H), NH2 , lub grupe OH, a w miejsce R3 - atom wodoru (H), z zastrzezeniem, ze gdy w miejsce S podstawiono 1-ß -D-arabinofuranoze to w pozycji B nie moga znajdowac sie zwiazki o wzorze 10a. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest grupa nowych związków chemicznych o ogólnym wzorze liniowym.

Nu - O -Fa w którym Nu ma wzór B-S stanowiący symbol analogu nukleozydu, w którym B oznacza ewentualnie podstawiony heterocykliczny układ pierścieniowy, S oznacza pochodną monocukrową, O oznacza atom tlenu, a Fa - grupę acylową mononienasyconego kwasu tłuszczowego o długości łańcucha obejmującej 18 do 20 atomów węgla. Wynalazek dotyczy także kompozycji farmaceutycznej o działaniu przeciwwirusowym, do zastosowania u ludzi lub zwierząt, zawierającej związek o wzorze Nu - O -Fa, występujący w kompozycji pojedynczo lub w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. Sposób leczenia polega na podawaniu związku o wzorze Nu - O - Fa chorym ludziom lub zwierzętom, u których wystąpiły objawy zakażenia wirusowego.

Ponadto, niektóre składowe związku o wzorze Nu - O - Fa mogą zostać także użyte jako substancje antybiotyczne lub przeciwnowotworowe.

Znaczna liczba poważnych chorób, takich jak np. AIDS, wirusowe zapalenie wątroby typu B, opryszczka i nowotwory narządu rodego kobiety rozwijające się na podłożu zmian brodawczakowatych, a będących odległym skutkiem zakażenia wirusem, papilloma, spowodowane są zakażeniem wirusowym.

Wirusy są drobnymi cząsteczkami zakaźnymi niezdolnymi do samoistnego namnażania (replikacji), wymagającymi w związku z tym udziału w procesach replikacji komórek ustroju żywiciela . Materiałem genetycznym stanowiącym rdzeń wirusa jest zarówno RNA jak i DNA.

W czasie zakażenia organizmu' wirusy przyłączają się do specyficznych dla siebie komórek ustroju. Po przyłączeniu się do nich wirus penetruje poprzez błony cytoplazmatyczne,

177 263 a genom wirusowy uwalniany jest do wnętrza komórki. Materiał genetyczny wirusa jest następnie najczęściej transportowany do jądra komórkowego, gdzie z regUły następuje jego replikacja. Na matrycy materiału genetycznego wirusa, już w obrębie cytoplazmy komórki, syntetyzowane są następnie wirusowe białka i w ten sposób w pobliżu błony cytoplazmatycznej lub jądrowej komórki żywiciela tworzą się nowe cząsteczki zakaźne wirusa.

Niektóre wirusy posiadają zdolność bezpośredniego (DNA-wirusy) lub pośredniego (RNA-wirusy, wykazujące zdolność do odwrotnej transkrypcji materiału genetycznego) wbudowywania się do genomu komórek ustroju chorego organizmu.

Pozostające poza komórkami wirusy są unieczynniane przez krążące w płynach ustrojowych przeciwciała, a komórki układu odpornościowego atakują i eliminują zakażone przez wirusy komórki. Wirusy mogą jednak przeżyć atak komórek immunokompetentnych wewnątrz zakażonych komórek pod warunkiem, że na powierzchni tych komórek nie będą eksponowane wirusowe antygeny (białka).

Atak immunologiczny na zakażone przez wirusy narządy wewętrzne prowadzi do wystąpienia objawów choroby, a zmiany leżące u podstaw takiego schorzenia określa się mianem immunopatologii zależnej od zakażenia wirusowego.

Mechanizmy immunopatogenetyczne leżące u podstawy różnych chorób wirusowych różnią się od siebie.

U chorych zakażonych wirusem HTV dochodzi do zakażenia i zniszczenia limfocytów T pomocniczych u pacjentów. Powoduje to ogólnoustrojowe zaburzenia odporności i w konsekwencji uwrażliwia chorego na zakażenia drobnoustrojami, z jakimi w normalnych warunkach u osób zdrowych układ immunologiczny radzi sobie bez problemu.

Wirusy zapalenia wątroby typu B atakują komórki wątroby chorego. Próba wyeliminowania wirusa, a tym samym zakażonych hepatocytów przez komórki układu immunologicznego pacjenta może doprowadzić do wystąpienia objawów ciężkiej choroby. Jeśli zakażenie nie zostanie opanowane przez układ immunologiczny we wczesnej fazie, dochodzi do wytworzenia przewlekłego zapalenia wątroby. Pacjent może wtedy zakażać innych przez całe swoje życie. U pewnej grupy takich chorych obserwuje się rozwój marskości lub nowotworu wątroby.

W przypadku zakażenia wirusami z grupy Herpes simplex początkowo komórkami docelowymi stają się dla nich komórki naskórka. Po ich zakażeniu infekcja szerzy się dalej, a wirusy opanowują komórki układu nerwowego, gdzie trwają w formie utajonej, ujawniając się co jakiś czas. Jakkolwiek opryszczka nie jest w większości przypadków chorobą zagrażającą życiu, to jednak powoduje znaczne dolegliwości bólowe u pacjentów, którzy dodatkowo w czasie reaktywacji zakażenia są zakaźni dla otoczenia.

Zakażenie wirusem brodawczaka dotyczy zwłaszcza komórek nabłonka dróg rodnych kobiety, w których genom wirusa lokalizuje się w jądrze, jednak nie zostaje zintegrowany z chromosomami tych komórek. W przypadku niektórych szczepów wirusa wyzwalających rozwój nowotworu, przetrwałe przebywanie ich materiału genetycznego w jądrze komórek nabłonka może w końcu doprowadzić do wbudowania się wirusowego genomu do DNA komórki i sprowokować rozwój guza. W takich przypadkach wirusowy genom posiada właściwości inicjujące proces nowotworzenia, a wynikiem takiego zakażenia jest rozwój brodawczaka.

Jeśli własny układ immunologiczny chorego jest w stanie uwolnić jego organizm od wirusa we wczesnym okresie rozwoju zakażenia to prowadzi to do wytworzenia stanu długotrwałej, obecnej przez całe życie pacjenta, odporności na zakażenie danym wirusem. W przeciwnym przypadku, gdy wirus jest zbyt agresywny i nie poddaje się działaniu aparatu immunologicznego, ustrój nie osiąga odporności na zakażenie, a proces zapalny przechodzi w fazę przewlekłą.

Z powodu różnego mechanizmu patogenetycznego przebiegu zakażeń wirusowych strategie postępowania leczniczego, dostosowane do obserwowanej sytuacji klinicznej, także różnią się między sobą.

Podstawowym celem leczenia zakażenia wirusem HTV (choroby AIDS) jest uwolnienie pacjenta od zakaźnego wirusa. Przy obecnym rozwoju wiedzy cel ten wydaje się jeszcze odległy. Niemniej, poprzez poprawienie ogólnego stanu zdrowia pacjenta można nadal wiele

1ΊΊ 263 osiągnąć. Zmniejszenie obciążenia wirusem może wydłużyć okres wolny od objawów klinicznych rozwiniętej choroby i zmniejszyć zakaźność, co stanowi priorytet ze względu na obecną sytuację epidemiologiczną, Wszystkie stosowane dotychczas środki obarczone są toksycznymi działaniami niepożądanymi co powoduje, że agresywna terapia przeciwwirusowa, jedyna zapewniająca rzeczywisty efekt leczniczy, nie jest możliwa do przeprowadzenia przy ich pomocy.

Ocenia, się że na świecie istnieje 250 do 300 milionów nosicieli wirusa zapalenia wątroby typu B. Wiadomo, że u znacznej liczby wśród nich rozwinie się nowotwór wątroby (hepatoma) lub niewydolność tego narządu spowodowane przewlekłym zakażeniem. W ostatnich latach osiągnięto obiecujące wyniki leczenia stanów przewlekłego nosicielstwa wirusa poprzez indukcję własnego układu immunologicznego pacjenta uzyskaną dzięki podawaniu interferonu. Postępowanie terapeutyczne mające na celu zmniejszenie obciążenia organizmu wirusem, polegające na skutecznym leczeniu ostrej fazy zakażenia, jest ważne przede wszystkim ze względu na możliwość zmniejszenia ilości osób, u których zakażenie przejdzie w fazę przewlekłą. Odkryty ostatnio wirus zapalenia wątroby typu C powoduje ogromną liczbę zakażeń wątroby, spośród których większość przejdzie w stan nosicielstwa. Wstępne doniesienia będące wynikiem prowadzonych prac badawczych suregują, że stan nosicielstwa spowodowany wirusem C zapalenia wątroby może być skutecznie przerwany przy zastosowaniu podobnych sposobów leczenia jakie prowadzi się w przypadku zakażeń wirusem zapalenia wątroby typu B.

Wirusy Herpes simplex typu 1 i 2 często zakażają ludzi powodując nosicielstwo i nawracające infekcje o miejscowym znaczeniu.

Zakażenia uogólnione obejmujące w swym spektrum chorobowym zapalenie mózgu są rzadkie, jednak nieuchronnie mogą prowadzić do zgonu pacjentów. Obserwuje się ogromną zmienność osobniczą w częstości występowania zlokalizowanych zakażeń (opryszczki). Dla pacjentów dotkniętych chorobą występującą w obrębie narządów płciowych lub okolic jamy ustnej, opryszczka stanowi poważny problem zdrowotny natury fizycznej, psychicznej i socjalnej. Żadna z wprowadzonych dotychczas metod leczenia nie powoduje wyleczenia i wyeliminowania utajonej (latentnej) formy wirusa z komórek centralnego układu nerwowego. Dlatego celem terapii jest zminimalizowanie objawów klinicznych choroby: ich nawTotowości i czasu trwania.

Zapadalność na infekcje dróg rodnych spowodowane wirusem brodawczaka (Papilloma) wzrosła dramatycznie w latach osiemdziesiątych naszego wieku. Ustalono ostatnio, że niektóre genotypy wirusa wykazują właściwości onkogenne, to znaczy zapoczątkowują takie zmiany w obrębie komórki, które po okresie utajenia prowadzą do rozwoju guza nowotworowego. Wirus Papilloma powoduje długotrwałą infekcję w obrębie narządów rodnych. Czynniki wywołujące transformację nowotworową zmian chorobowych nie są jeszcze wystarczająco poznane i zrozumiałe, jednak uważa się, że jedną z ważniejszych funkcji odgrywa układ immunologiczny chorego. Sprawdzono, że do przekształcenia w nowotwór zdolne są te zmiany chorobowe, które w przeciągu miesięcy lub lat trwania choroby wykazują stałą progresję. Szczególna postać zmian brodawczakowatych narządu płciowego, określana jako kłykciny, leczone są obecnie metodami fizycznymi polegającymi na ich chirurgicznym usunięciu, wymrożeniu ciekłym azotem lub spowodowaniu martwicy przy użyciu innych metod. Brodawczaki pojawiające się na narządach płciowych są na początku guzami łagodnymi, charakteryzującymi się zmienionymi szlakami metabolicznymi, wśród innych również i tych, które dotyczą przemian analogów nukleozydowych. Leki stanowiące pochodne nukleozydów zaburzają episomalną proliferację wirusa Papilloma i prowadzą do zanikania brodawczaków.

Profilaktyczne szczepienia okazały się bardzo skuteczne w odniesieniu do takich ostro przebiegających chorób wirusowych jak: zapalenie rogów przednich rdzenia kręgowego (wirus Polio), świnka, odra i podobne. Nie udało się jednak opracować skutecznych szczepionek przeciwko wielu poważnym schorzeniom wywoływanym przez inne wirusy.

Pomimo tego, że w ostatnim dziesięcioleciu zaangażowano poważne środki w celu wyprodukowania skutecznego leku przeciwwirusowego, większości pacjentom cierpiącym z powodu rozwoju zakażeń wirusowych nadal nie możemy zaoferować zadawalającej metody

177 263 terapii. Nakłady pracy badawczej zostały znacząco zwiększone szczególnie od chwili pojawienia się wirusa HIV i jemu podobnych, rozprzestrzeniających się po całym świecie w alarmującym tempie. Zwłaszcza, że efekt terapeutyczny uzyskany dzięki zastosowaniu takich środków jak azydotymidyna (AZT) i acyklowir (ACV) dla terapii AIDS i zakażeń opryszczkowych może być oceniony jako tylko częściowo skuteczny. Te najbardziej obiecujące środki przeciwwirusowe są pochodnymi naturalnie obecnych w przyrodzie nukleozydów, w których zmodyfikowano tylko strukturę zasady lub reszty cukrowej cząsteczki. Nie spełniły one jednak pokładanych w nich oczekiwań co do skuteczności terapeutycznej, zwłaszcza ze względu na objawy niepożądane terapii obserwowane u części chorych, a brak lub niewielką skuteczność u innych. Co więcej, leczenie tymi środkami jest niezwykle kosztowne. Z tych powodów jedynie chorzy obarczeni bardzo poważnymi chorobami, takimi jak na przykład AIDS, mogą zostać poddani takiemu leczeniu. Pacjenci chorujący na mniej poważne schorzenia o wirusowej etiologii, ale również sprawiają ból, często pozostawieni są bez leczenia tak, aby infekcja mogła toczyć się własnym torem.

Nieleczeni chorzy będący nosicielami znacznego potencjału zakaźnego wirusa stanowią ryzyko zakażenia innych istot ludzkich przebywających w ich otoczeniu. Jeśli są oni leczeni środkami przeciwwirusowymi, celem prowadzonej terapii jest zmniejszenie potencjału zakaźnego tak, aby umożliwić własnemu układowi immunologicznemu chorego przezwyciężyć infekcję. Kolejnym celem takiego leczenia jest zmniejszenie zakaźności chorych oraz liczby nowych zachorowań i liczby nosicieli wirusa.

Tak więc, ze względu na wszystkie przedstawione tu przyczyny, w oczywisty sposób istnieje konieczność stworzenia skuteczniejszego od już istniejących leku odznaczającego się lepszym indeksem terapeutycznym.

Zapotrzebowanie takie dotyczy zwłaszcza chorób wirusowych o przewlekłym lub nawracającym charakterze, powodujących istotne zagrożenie zdrowia pacjenta w ostrej fazie rozwoju infekcji lub powodujących długotrwały, ujemny wpływ na stan ogólny chorego, takich jak: AIDS, zakażenia wątroby typu B i C czy też zakażenia wirusami z grupy Herpes i Papilloma. Podobnie, istnieje również konieczność stworzenia skutecznego leku przeciwwirusowego do zastosowania u zwierząt cierpiących z powo,du infekcji wirusowych.

W celu poprawienia efektu terapeutycznego wprowadzono i badano wiele związków pochodnych od nukleozydów, o zmodyfikowanej strukturze chemicznej zasady azotowej lub reszty cukrowej cząsteczki. W szczególności, celem zwiększenia lipofilności badanych związków i tym samym osiągnięcia lepszej przenikalności przez błony komórkowe, rozwinięto rodzinę związków będących estrami kwasów tłuszczowych z pochodnymi nukleozydów.

Takie związki są już znane i opatentowane zostały w Stanach Zjednoczonych Ameryki pod numerem patentu US 3984,396 przez Witkowskiego i współpracowników. Patent ten dotyczy estrów rybawiryny z aromatycznymi i nasyconymi kwasami tłuszczowymi o długości łańcuchów wynoszącej od 1 do 18 atomów węgla (C).

Niespodziewanie stwierdzono, że wybrana grupa estrów kwasów tłuszczowych z analogami nukleozydów obdarzonych działaniem przeciwwirusowym, w których kwasy tłuszczowe należały do rodziny mononienasyconych związków o długości łańcucha od 18 do 20 atomów węgla, zapewnia znacznie lepszy efekt terapeutyczny.

Jakkolwiek wiadomo, że zarówno same nukleozydy jak i ich analogi oraz niektóre nienasycone kwasy tłuszczowe wykazują bezpośrednie działanie przeciwwirusowe, znaczenie efektu jaki osiągnięto przy zastosowaniu związków według wynalazku polega na tym, iż wzajemne ich oddziaływanie ma charakter raczej synergistyczny a nie addytywny, co szczególnie dotyczy związków chemicznych o ogólnym wzorze Nu-O-Fa. Mechanizm składający się na takie działanie omawianych związków nie jest jeszcze znany. Uważa się jednak, że nie jest on spowodowany jedynie poprzez efekt przenikania przez błony lub efekt łatwiejszego docierania substancji do miejsc docelowych.

Co więcej, jak wykazano w badaniach biologicznych zawartych w dalszej części opisu wynalazku, że wyniki jakie osiągnięto przy zastosowaniu tych związków przewyższają efekty osiągnięte z zastosowaniem matczynych nukleozydów wyjściowych.

177 263

Związki stanowiące istotę tego wynalazku charakteryzują się ogólnym wzorem Nu-O-Fa w którym O oznacza atom tlenu, Nu ma wzór B-S stanowiący symbol analogu nukleozydu przy czym B oznacza ewentualnie podstawiony heterocykliczny układ pierścieniowy oraz S oznacza pochodną monocukrową, a Fa oznacza grupę acylową mononienasyconego kwasu tłuszczowego o długości łańcucha obejmującej 18 do 20 atomów węgla.

Naturalne nuklezydy, nazywane tak ze względu na ich występowanie w strukturze RNA lub DNA, są cząsteczkami zawierającymi heterocykliczną. zasadę, taką jak cytozyna, uracyl, tymidyna, adenina lub guanina, połączona z cząsteczką rybozy lub 2-dezoksyrybozy. W analogach nukleozydów zmodyfikowana może zostać zarówno sama zasada azotowa jak i część rybozy. Dla przykładu, cząsteczka rybozy może zostać zastąpiona przez inną jednostkę cukrową lub poprzez łańcuch niecykliczny.

Zmodyfikowana zasada może zostać dla celów omawianego wynalazku wybrana spośród pochodnych należących zarówno do grupy pirymidyn lub puryn, w których w inny niż w występujących naturalnie nukleozydach sposób podstawiono grupę zasadową, lub też ewentualnie podstawionych układach hetero- (mono- lub poli-)cyklicznego pierścienia, nie należących do grupy zasad purynowych lub pirymidynowych.

Kwas tłuszczowy, estryfikuje się grupą hydroksylową reszty cukrowej analogu nukleozydu lub grupą hydroksylową niecyklicznej pochodnej analogu nukleozydu.

Przedmiotem wynalazku sąmonoestryfikowane związki przeciwwirusowe o wzorze: Nu-O-Fa w którym O oznacza atom tlenu, Nu oznacza analog nukleozydu, a Fa oznacza grupę acylową mononienasyconego kwasu tłuszczowego o długości łańcucha obejmującej 18 do 2θ atomów węgla i wiązaniem mononienasyconym ω w pozycji 9, przy czym kwas jest estryfikowany poprzez grupę hydroksylową reszty cukrowej analogu nukleozydu w pozycji 5 lub poprzez końcową grupę hydroksylową przyłączoną do niecyklicznej części tego analogu oraz w którym Nu ma wzór:

B-S w którym S oznacza pochodną monocukrową wybraną spośród następujących związków: Ι-β-D-rybofuranozy, Ι-β-D-arabinofuranozy, 2-dezoksy-1-P-D-rybofuranozy. 2,3didezoksy-l-P-D-rybofuranozy, 2-dezoksy-2-fluoro-1-e-D-arabinofuranozy a B oznacza heterocykliczny układ pierścieniowy wybrany spośród związków: (i) o wzorze 1, o wzorze 5, w którym w miejsce X można podstawić atom tlenu (O), w miejsce Y można podstawić grupę -OCH, a w miejsce R1 - grupę NH₂, łub (ii) o wzorze 9, o wzorze 10, w których w miejsce R4 można podstawić grupę NH₂, a w miejsce R5 - atom wodoru (H) oraz w miejsce R$ - atom wodoru lub atom chlorowca lub (iii) wzorze 11, w którym w miejsce R2 można podstawić atom wodoru (H), NH2 lub grupę OH, a w miejsce R3 - atom wodoru (H), z zastrzeżeniem, że gdy w miejsce S podstawiono Τ-β-Darabinofuranozę, to w pozycji B nie mogą znajdować się związki o wzorze 10a.

Monoestryfikowane związki korzystnie stanowią związki w których wzór B-S oznacza rybawirynę.

Monoestryfikowane związki korzystnie są związkami, w których podstawnik Fa stanowi kwas oleinowy, kwas elaidynowy lub kwas eikozenowy występujący zarówno w formie stereoizomerycznej cis jak i trans.

Monoestryfikowany związek korzystnie stanowi związek, w którym wzór B-S oznacza rybawirynę, a podstawnik Fa oznacza kwas oleinowy.

Monoestryfikowany związek korzystnie jest związkiem, w którym wzór B-S oznacza rybawirynę, a podstawnik Fa oznacza kwas elaidynowy.

Monoestryfikowane związki korzystnie są związkami, w których wzór B-S oznacza ry8

177 263 bawirynę, a podstawnik Fa oznacza stereoizometryczna formę cis albo trans kwasu eikozenowego.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję aktywną i znane środki pomocnicze, charakteryzująca się tym, że jako substancję aktywną zawiera monoestryfikowany związek o wzorze Nu-O-Fa, w którym to wzorze O oznacza atom tlenu, Nu oznacza analog nukleozydu, a Fa oznacza grupę acylowąmononienasyconego kwasu tłuszczowego o długości łańcucha obejmującej 18 do 20 atomów węgla i wiązaniem mononienasyconym ω w pozycji 9, przy czym kwas jest estryfikowany poprzez grupę hydroksylową reszty cukrowej analogu nukleozydu w pozycji 5’ lub poprzez końcową grupę hydroksylową przyłączoną do niecyklicznej części tego analogu oraz w którym Nu ma wzór:

B-S w którym S oznacza pochodną monocukrową wybraną spośród następujących związków: Ι-β-D-rybofuranozy, Ι-β-D-arabinofuranozy, 2-dezoksy-1-e-D-rybofuranozy, 2,3didezoksy-1-P-D-rybofuranozy, 2-dezoksy-2-fluoro-1-e-D-arabinofuranozy a B oznacza heterocykliczny układ pierścieniowy wybrany spośród związków: (i) o wzorze 1, wzorze 5, w którym w miejsce X można podstawić atom tlenu (O), (S), W miejsce Y można podstawić grupę -Οξ€Η, a w miejsce R1 - grupę NH2, lub (ii) o wzorze 9, o wzorze 10, w którym w miejsce R4 można podstawić grupę NH2, a w miejsce R5 - atom wodoru (H) oraz w miejsce R$ - atom wodoru lub atom chlorowca lub (iii) o wzorze 11, w którym w miejsce R2 można podstawić atom wodoru (H), NH2 lub grupę OH, a w miejsce R3 - atom wodoru (H), z zastrzeżeniem, że gdy w miejsce S podstawiono 1-β-Ωarabinofuranozę to w pozycji B nie mogą się znajdować związki o wzorze 10ąoraz zawiera dopuszczalny farmaceutycznie nośnik lub podłoże.

Kompozycja farmaceutyczna korzystnie oznacza kompozycję farmaceutyczną w której wzór B-S w związku będącym substancją aktywną oznacza rybawirynę.

Kompozycja farmaceutyczna korzystnie oznacza kompozycję farmaceutyczną 'w której podstawnik Fa w związku będącym substancją aktywną stanowi kwas oleinowy, kwas elaidynowy lub kwas eikozenowy występujący zarówno w formie stereoizomerycznej cis jak i trans.

Kompozycja farmaceutyczna korzystnie stanowi kompozycję, w której wzór B-S w związku będącym substancją aktywną oznacza rybawirynę, a podstawnik Fa oznacza kwas oleinowy.

Kompozycja farmaceutyczna korzystnie jest kompozycją, w której wzór B-S w związku będącym substancją aktywną oznacza rybawirynę, a podstawnik Fa oznacza kwas elaidynowy.

Kompozycja farmaceutyczna stanowi korzystnie kompozycję, w której wzór B-S w związku będącym substancją aktywną oznacza rybawirynę, a podstawnik Fa oznacza stereizomeryczną formę cis albo trans kwasu eikozenowego.

Przykładem takich analogów nukleozydów jest związek o wzorze 12, czyli 1-β-ϋrybofuranozylo-1,2,4-triazolo-3-karboksyamid (Rybawiryna).

Przykładami innych analogów nukleozydów są związki o wzorze 17, o wzorze 18, przy czym:

Związek przedstawiony wzorem 17 określa się jako FIAC.

Związek przedstawiony wzorem 18 określa się jako ddC.

Istnieje kilka metod określania pozycji podwójnego wiązania w łańcuchu nienasyconego kwasu tłuszczowego. W obecnym zgłoszeniu, dla oznaczenia podwójnego wiązania stosowany jest symbol ω, a pozycję tego wiązania ustala się licząc atomy węgla od tego końca łańcucha nienasyconego kwasu tłuszczowego, który zawiera grupę metylową. Dla przykładu kwas eikozenowy (C20:1^-9), posiada 20 atomów węgla (C) w swoim łańcuchu, a podwójne wiązanie występuje pomiędzy 9 a 10 atom węgla licząc od końca łańcucha.

Wybraną grupę kwasów tłuszczowych jaka może brać udział w reakcji z analogami nukleozydów z wytworzeniem estrów według wynalazku, jak stwierdzono z odznaczającą się

177 263 wyraźną aktywnością biologiczną, tworząjedynie mononienasycone kwasy tłuszczowe o długości łańcucha równej osiemnastu lub dwudziestu atomom węgla. Co więcej, niezależnie od stwierdzonego faktu różnicy w oddziaływaniu obserwowanej pomiędzy formami, w których podwójne wiązanie znajdowało się w pozycji cis lub trans kwasów tłuszczowych o tej samej długości łańcucha, obie formy wykazywały silną aktywność biologiczną.

Kwasami tłuszczowymi o długości C18 i C20 z wiązaniem ω-9, które po związaniu z analogiem nukleozydu powodowały zadziwiająco silny efekt są:

kwas oleinowy (C18:1, ω-9, cis), kwas elaidynowy (C18:1, ω-9, trans), kwas eikozenowy (C20:1, ω-9, cis) oraz (C20:1, ω-9, trans).

Korzystne połączenia związków według wynalazku przedstawione są jako: ester oleinowy rybawiryny, ester elaidynowy rybawiryny, ester cis-eikozenowy rybawiryny, ester trans-eikozenowy rybawiryny, ester oleinowy ddC, ester elaidynowy ddC, ester ciseikozenowy ddC, ester trans-eikozenowy ddC, ester oleinowy EICAR, ester elaidynowy EICAR, ester cis-eikozenowy EICAR, ester trans-eikozenowy EICAR:, ester oleinowy FIAC, ester elaidynowy FIAC, ester cis-eikozenowy EIAC,ester trans-eikozenowy FIAC,ester oleinowy ddJ, ester elaidynowy ddJ, ester cis-eikozenowy ddJ, ester transeikozenowy ddJ. Graficzny obraz tych związków umieszczono na figurze 4 - fig. 4 - rysunku według wynalazku.

Związki wykazują działanie przeciwwirusowe, a zatem obecny wynalazek obejmuje kompozycje farmaceutyczne lub weterynaryjne zawierające co najmniej jeden związek określony wzorem Nu-O-Fa jako pojedynczo występującą substancję czynną lub w połączeniu ze zgodnym farmaceutycznie nośnikiem lub podłożem. W pozostałej części tekstu oraz w zastrzeżeniach patentowych termin kompozycja farmaceutyczna oznaczać będzie mieszaninę służącą leczeniu chorych ludzi i zwierząt.

W dalszym toku okazało się, że niektóre związki analogów nukleozydów z mononienasyconymi kwasami tłuszczowymi będą szczególnie przydatne dla leczenia niektórych chorób wirusowych. Zatem, wykazano, że estry kwasów tłuszczowych rybawiryny są szczególnie skutecznymi substancjami do leczenia zakażeń spowodowanych wirusami z rodziny Herpes.

Podobnie, stwierdzono, że związkami według wynalazku lub kompozycje je zawierające są również użyteczne w leczeniu zakażeń występujących u człowieka, a spowodowanych przez adenowirusy, wirusy grupy typu A i B, wirusy oddechowe (RSV), wirus cytomegalii (CMV), wirusy z rodziny Papilloma, wirusy gorączki Bunyamwera (bunyaviruses), arenawirusy i HIV.

Tak jak o tym już wspomniano, wystąpienie niezbędnej do zwalczenia infekcji wirusowej odpowiedzi immunologicznej ustroju, jak np. w przypadku wirusowych zapaleń wątroby, może zostać sprowokowane równoczesnym podaniem interferonu.

Okazało się także, że estry kwasów tłuszczowych według wynalazku lub kompozycje je zawierające mogą zostać użyte również do leczenia innych poza człowiekiem ssaków oraz takich zwierząt jak ptaki, np. kurczęta, indyki, czy zwierząt zmiennocieplnych takich jak np. ryby, które zostały zakażone wirusami: bydlęcymi wirusami z rodziny Herpes typu 1,2,3,4 , końskimi wirusami z rodziny Herpes t. 1,2 3„ świńskimi wirusami Herpes 1, 2, bażancimi wirusami Herpes 1.1,2 (choroba Mareka) i wirusem zakaźnej martwicy trzustki (IPN).

W zależności od tego, które z omawianych zakażeń poddane zostaną leczeniu i w jakiej fazie choroby leczenie zostanie rozpoczęte oraz od tego czy chorym, jest człowiek czy zwierzę, wykorzystuje się obie drogi podania związków: zastosowanie ogólnoustrojowe lub miejscowe.

Celem zastosowania miejscowego związki mogą zostać przygotowane w każdej postaci farmaceutycznej zgodnie z zasadami sztuki obowiązującymi przy podawaniu leków na skórę i śluzówki.

Dla celów miejscowej terapi powierzchownej związki o wzorze Nu-O-Fa mogą zostać przygotowane w postaci maści, kremu, żelu, nalewki, aerozolu, mleczka lub innych zawierających związek o wzorze Nu-O-Fa zawieszony w nośniku płynnym, stałym lub obojętnym, zazwyczaj stosowanym dla takich form farmaceutycznych. Szczególne zastosowanie znajdą te spośród nośników, które zapewniają ochronę substancji czynnej przed jej rozpadem lub utlenieniem.

177 263

Preparaty farmaceutyczne zawierające substancje o wzorze Nu-O-Fa można również podawać systemowo, zarówno doustnie jak też i drogą pozajelitową.

Celem podania doustnego, związki o wzorze Nu-O-Fa mogą zostać przygotowane w postaci twardych lub miękkich kapsułek żelatynowych, tabletek, granulek, proszku lub ziaren, drażetek, syropów, zawiesin oraz roztworów.

Do zastosowania pozajelitowego, nadają się zwłaszcza takie formy zawierające substancje o wzorze . Nu-O-Fa jak: roztwory do iniekcji lub wlewów, zawiesiny lub emulsje.

Preparaty lecznicze mogą zawierać obojętne farmakodynamicznie aktywne dodatki. Tabletki lub granulki np. mogą zawierać szereg środków wiążących (spoiw), środków wypełniających, substancji nośnikowych lub rozcieńczalników. Postacie płynne kompozycji farmaceutycznej mogą występować dla przykładu jako sterylne roztwory. Kapsułki mogą zawierać środki wypełniające lub zagęszczające, będące dodatkiem do substancji czynnej. Co więcej, w preparatach takich mogą się znaleźć substancje poprawiające smak oraz substancje zwykle stosowane celem stabilizacji, usuwania wilgoci, ułatwienia emulgacji składników preparatu, konserwanty, sole dla wytworzenia oczekiwanego ciśnienia osmotycznego preparatu, substancje buforujące, jak również inne dodatki.

Sposób dawkowania preparatów według wynalazku różni się w zależności od sytuacji wymagającej zastosowania i od drogi podania oraz od zapotrzebowania chorego. Najczęściej, dzienna dawka substancji stosowana w leczeniu systemowym typowego dorosłego pacjenta lub zwierzęcia może wynosić od 0,1 do 100 mg/kg masy ciała/dzien, korzystnie 1 - 20 mg/kg/dzień. Dla terapii miejscowej, odpowiednią maścią będzie taka, która zawiera od 0,1 do 10% wagowych formuły farmaceutycznej, w szczególności zawierająca 0,5 - 5% wagowych.

Jeśli jest to niezbędne preparat farmaceutyczny związku o wzorze Nu-O-Fa może zawierać środki przeciwdziałające utlenianiu substancji, takie jak np. tokoferol, Nmetylotokoferamina, butylowany hydroksyanizol, kwas askorbinowy lub butylowany hydroksytoluen.

W wynalazku ujawniono także metodę leczenia infekcji wirusowych z wykorzystaniem przynajmniej jednej z substancji określonych wzorem Nu-O-Fa do zastosowania w przypadku zaistnienia takiej konieczności u chorych ludzi lub zwierząt.

Wynalazek obejmuje także sposób leczenia chorych przy zastosowaniu skojarzonej terapii związkiem o wzorze Nu-O-Fa i interferonu w przypadku zaistnienia takiej konieczności.

Próby biologiczne

Hodowla tkankowa wirusa IPN.

Stale wstrząsając, zawiesinę zawierającą 1000 pfu wirusa IPN wysiewa się na monowarstwę komórek CHSE-214 w hodowli i inkubuje w temperaturze 20°C przez 1 godzinę. Do komórek dodaje się małą objętość pożywki wzrostowej zawierającej substancję przeciwwirusową. Następnie hoduje się je (48 godzin) aż do momentu, kiedy w kontrolnej, nie poddanej leczniczemu działaniu substancji przeciwwirusowej linii hodowlanej stwierdzi się występowanie efektu cytopatycznego (efekt CPE). Następnie komórki są zamrażane przez okres nocy. Po odmrożeniu i odwirowaniu, supernatant dodawany jest w 5-krotnym rozcieńczeniu do świeżo przygotowanej jednowarstwowej hodowli komórkowej. Hodowlę prowadzi się w 96 dołkowym naczyniu. Efekt cytopatyczny (CPE) ocenia się po 48 godzinach, a miano wirusa liczone jest jako TCID50.

Figura 1 przedstawia hamujący efekt działania estru kwasu elaidynowego rybawiryny, zastosowanego w trzech różnych stężeniach. W przypadku zastosowania dwóch wysokich stężeń substancji czynnej uzyskano efekt całkowitego wyeliminowania wirusa, natomiast nawet w niskim stężeniu nastąpiło zmniejszenie miana wirusa o 10⁴.

A. Doświadczenia prowadzone in vitro.

Metoda tworzenia łysinek: hodowla tkankowa wirusa HSV typu 1 i 2.

Zawiesina zawierająca wirusy HSV typu 1 i HSV typu 2 (uzyskane po trzykrotnym pasażowaniu wirusa izolowanego klinicznie od chorego) jest rozcieńczana tak, aby uzyskać stężenie 250 lub 100 pfu/dołek w naczyniu hodowlanym. Następnie zawiesinę wysiewa się na

177 263 hodowle komórkowe i inkubuje je przez 1 godzinę. Hodowle prowadzi się z różnymi liniami komórkowymi.

Zakażone komórki poddaje się z kolei przez 48 godzin działaniu środka przeciwwirusowego. Hodowle są dalej zamrażane i odmrażane celem uwolnienia cząstek wirusa. Przygotowuje się roztwory rozcieńczone w stosunku jak 1/100 lub 1/10000 i dodaje je do świeżych hodowli tkankowych. Po jednogodzinnej inkubacji, dla zapewnienia ochrony przed migracją wirusa pomiędzy komórkami znajdującymi się w hodowli i jego rozprzestrzeniania się w hodowli, do dołków hodowlanych dodaje się karboksymetylocelulozę (CMC). Jednak nadal może następować kontaktowe przekazywanie wirusa pomiędzy komórkami ściśle do siebie przylegającymi, co powoduje tworzenie łysinek.

Jedna łysinka odzwierciedla zakażenie jednym zakaźnym wirusem. Zliczenie ilości łysinek daje precyzyjnie wyliczoną informację o ilości zakaźnych cząstek wirusa.

Figura 2 przedstawia efekt zahamowania jaki wywierają rybawiryna i jej 5’-oleilowy ester na szczepy 68495 wirusa HSV typu 2 w hodowli przy użyciu linii komórkowej HL1. Uzyskanie umiarkowanego zmniejszenia miana wirusa pod wpływem leku świadczy o względnej oporności tego szczepu wirusa HSV 2 na działanie samej rybawiryny, lecz nie jej estru oleilowego. Obserwowana oporność była jeszcze bardziej zaznaczona w hodowli z inną, użyta do badania linią, komórkową Niemniej, nawet przy użyciu linii komórkowej, która przyjęta została do zilustrowania działania substancji prezentowanych.,na figurze 2 rysunku, jednoznacznie wykazano, że wprowadzenie estru mononienasyconego kwasu tłuszczowego substancji wyjściowej trzykrotnie zwiększa jej aktywność.

B. Doświadczenia prowadzone in vivo.

Zakażenie wirusem FLC wywołane u myszy.

Młode, ważące 20 -25 g samice myszy NMRI zakażone zostały dootrzewnowo wyciągiem wirusa FLC (Friend leukemia Complex - wirus kompleksowej białaczki Frienda) należącym do rodziny retrowirusów. Leczenie zostało rozpoczęte po dwóch dniach od innokulacji myszy wirusem, a zwierzęta otrzymywały testowane leki przez 8 dni dootrzewnowo. Podawano im codziennie po 200 μΐ 20 pM emulsji liposomalnego preparatu testowanej substancji. Grupy testowanych zwierząt zabijano po upływie 13 lub 20 dni od zakażenia. Oceniano masę ciała zwierząt oraz wagę ich śledzion.

W ciągu 7-10 dni zakażenie wirusem FLC prowadziło do znacznego zwiększenia wagi śledziony, przypuszczalnie wskutek zwiększonej koncentracji w niej komórek białaczkowych.

Figura 3 przedstawia porównanie efektu działania wiodącego leku stosowanego w leczeniu chorób spowodowanych zakażeniem retrowirusami jakim jest AZT, elaidynianu ddC, a także odpowiadającego mu nasyconego analogu np. stearynianu ddC. Wyniki przedstawione zostały w postaci stosunku masy ciała zwierzęcia do masy śledziony. Wysoka wartość tego ilorazu wskazuje na wysoką aktywność przeciwwirusową ocenianego związku. Po 13 dniach prowadzonej terapii efekt leczniczy jaki osiągnięto stosując AZT był równy w swej skuteczności dobremu efektowi leczenia elaidynianem ddC. Po 20 dniach efekt leczenia AZT spadł do wartości charakterystycznych dla grupy kontrolnej, podczas gdy leczenie elaidynianem ddC powodowało nadal wyraźny, pozytywny efekt terapeutyczny. · Uwidoczniono także wyraźną zależność pomiędzy zastosowanymi estrami nienasyconymi i nasyconymi kwasów tłuszczowych. Wyniki leczenia stearynianem ddC nie przekroczyły wartości obserwowanych u zwierząt stanowiących grupę kontrolną.

Substancje przeciwwirusowe według wynalazku zostały przygotowane w postaci podstawowego roztworu cząstek koloidalnych w wodzie, o stężeniu 1 mg/ml, uzyskanego poprzez zmieszanie lecytyny i substancji czynnej w stosunku wagowym 1:1 i zawieszenie ich w sterylnej wodzie destylowanej.

177 263

WYTWARZANIE

Składniki o wzorze Nu-O-Fa mogą być ogólnie wytwarzane zgodnie z następującym równaniem chemicznym: zasada

Nu-OH-FaX

----------------> Nu-O-Fa

-HX gdzie Nu, O, Fa zostały zdefiniowane powyżej, . w miejsce..X można podstawić: atom chloru (Cl), bromu (Br) lub grupę O-CO-R', w której R, może stanowić: Fa, CH3, CH2CH3 lub CF 3. Podstawnik X może być także częścią benzotriazolową estru kwasu tłuszczowego i benzotriazolu.

Tak więc reakcja chemiczna polega na acylacji analogu nukleozydu. Można to osiągnąć używając stosowne reaktywne pochodne kwasów tłuszczowych, zwłaszcza halogenki lub bezwodniki kwasowe. Reaktywne pochodne kwasów tłuszczowych mogą wcześniej przygotowane lub być wytworzone in situ poprzez zastosowanie takich reagentów jak dicykloheksylokarbodiimid (DCC) lub O-(1H-benzotriazol-1 -il)N,N,N',N'-tetrametylouroniumtetrafluoroborat (TBTU). Stosując halogenki kwasów tłuszczowych, jakimi np. są chlorki tych . kwasów, do przeprowadzenia reakcji niezbędne są katalizujące ją aminy trzeciorzędowe takię . jak np. trietyloamina, N,N-dimetyloanilina, pirydyna lub N,N-dimetyloaminopirydyna. Dodanie ich do mieszaniny reagentów ma za zadanie przyłączenie uwalnianych w czasie reakcji wolnych kwasów halogenkowodorowych. Korzystnie, powyższe reakcje chemiczne przeprowadza się w środowisku niereagujących rozpuszczalników takich jak N,Ndimetyloformamid lub chlorowcowanych węglowodorów, takich jak dichlorometan.

Jeśli zajdzie taka potrzeba, jako rozpuszczalnik może zostać użyta każda z wymienionych powyżej, obdarzonych właściwościami katalizującymi amin trzeciorzędowych pod warunkiem, że zostanie zastosowana w nadmiarze wystarczającym dla potrzeb przeprowadzenia reakcji. Temperatura przebiegu opisanych reakcji może wahać się od 0 do 40°C z tym, że zdecydowanie;· korzystnie utrzymuje się temperaturę w zakresie pomiędzy 5 a 25°C. Po okresie 24 do 60 godzin reakcja zostaje zasadniczo zakończona. Przebieg reakcji może być kontrolowany przy użyciu chromatografii cienkowarstwowej (TLC) i właściwego układu rozpuszczalników. Gdy reakcja całkowicie się zakończy, co ocenia się przy pomocy TLC, produkt następnie ekstrahuje się przy pomocy rozpuszczalników organicznych i oczyszcza się metodą chromatograficzną i/lub metodą rekrystalizacji przy zastosowaniu odpowiednich rozpuszczalników.

Jeśli w otrzymanych analogach nukleozydów znajdują się więcej niż jedna grupa hydroksylowa lub grupy aminowe, może wytworzyć się mieszanina acylowanych produktów. Poszczególne związki mono- lub poliacylowane można rozdzielić stosując np. chromatografię.

Wynalazek jest ilustrowany przez nieograniczające jego zakresu przykłady.

Przykład 1. l-(5'-O[cw-9''-oktadecenoilo]-P-D-rybofuranozylo)-1,2,4-triazolo-3karboksyamid. (wzór 12)

Do roztworu 0,95 g (3,9x10*³ mola) 1-P-D-rybofuranozylu)-1,2,4-trójazolo-3-karboksyamidu (rybawiryny) w 10 ml bezwodnego N,N-dimetyloformamidu i 15 ml pirydyny dodano 2 ml podstawowego roztworu chlorku cis-9-oktadekanoilu (1,34 g, 4,7x10'³mola) w 6 ml dichlorometanu, i prowadzono reakcję, stale mieszając, w środowisku azotu w temperaturze pokojowej. Pozostałą ilość roztworu podstawowego, w porcjach o objętości 2 ml dodawano cyklicznie, w odstępie ok. 8 godzin. Po upływie 60 godzin całkowitego czasu trwania reakcji, rozpuszczalniki odparowano pod wysoką próżnią, a uzyskany produkt oczyszczano na kolumnach zawierających żel silikonowy przy użyciu 15% roztworu metanolu w chloroformie jako układu eluentu. Otrzymane tak homogenne frakcje zostały następnie odparowane uzyskując 1,25 g (63%) wymienionego w tytule związku, w postaci białej substancji stałej.

’H NMR (DMSO-d6, 300 (MHz) δ: 9,8(1H, s, H-5), 7,85 i 7,65 (1+1H, s, NH2), 5,88 (1H, d, H-1'), 5,65 (1H, D, OH-2'), 5,35(1H, d, OH-3'), 5,32(2H, m, CH=CH), 4,35-4,25(3H, m, H-2', H-3, H-5'· ), 4,15-4,0(2H, m, H-4', H-5^), 2,25(2H, t, CH2-COO), 1,95(4H, m, CH2177 263

C=), 1,45(2H, m, CH₂-C-COO), 1,25(20H, m, CH₂), 0,85(3H, t, CH3-CH2).

¹³C NMR (DMSO-d6, 75 MHz) δ: 172,59(C00), 160,15(CONH2), 157,40(C-3), 145,27(C-5), 129,46(CH=CH), 91,28(C-1'), 81,51(C-4'), 73,99(C-2'), 70,26(C-3'), 63,55(C5'), 33,07, 31,13, 28,94, 28,68, 28,54, 28,43, 28,33, 28,24, 26,42, 24,17, 21,94(CH2), 13,78(CH3-CH2).

Przykład 2. 1-(5'-O-[trans-9-oktadecenoilo]-2,3-didezoksy-e-D-gliceropenta-2enofuranozylo)tymina.

Do roztworu 0,83 g (3,7x10- mola) 1-2,3-didezoksy-e-D-gliceropenta-2-enofuranozylo)tyminy (d4T) w 10 ml bezwodnego N,N-dimetyloformamidu i 10 ml pirydyny dodano 2 ml podstawowego roztworu chlorku trans-9-oktadekanoilu (1,39 g, 4,9x10-3 inola) w 4 ml dichlorometanu, i prowadzono reakcję, stale mieszając, w środowisku azotu w temperaturze pokojowej. Pozostałą ilość roztworu podstawowego, w porcjach o objętości 1 ml dodawano cyklicznie, w odstępie ok. 8 godzin. Po upływie 60 godzin całkowitego czasu trwania reakcji, rozpuszczalniki odparowano pod wysoką próżnią. Pozostałość rozpuszczono w chloroformie i przemyto wodą. Wysuszona MgSO4 fazę organiczną zagęszczono, a surowy produkt oczyszczano na kolumnach zawierających żel silikonowy przy użyciu 7% roztworu metanolu w chloroformie jako układu eluenta. Otrzymaną tak homogenną frakcję następnie odparowano uzyskują: 1,26 g (70%) wymienionego w tytule związku, w postaci białej substancji stałej.

¹HNMR (DMSO-d6,300 MHz) δ: 11,35(1H, s, NH), 7,25 (1H, s, H-6), 6,81 (1H, m, H-1'), 6,38 (1H, m, H-3'), 6,0 (1H, m, H-2'), 5,35 (2H, m, CH=CH), 4,95 (1H, m, H-4'), 4,2 (2H, m, H-5'), 2,25 (2H, m, CH₂-COO), 1,95(4H, m, CH3-C=), 1,75(3H, s, GH3), 1,45(2H, m, CH₂-CCOO), 1,25(2OH, m, CH2), 0,85(3H, t, CH3-CH2).

Przykład 3. 5-0-(9'-trans-oktad-ecenoilo)-2,3~didezoksy-cytydyna

Do zawiesiny 1,2 g (5,7x10-3 mola) 2,3-didezoksy-cytydyny (ddC) w 40 ml bezwodnego N,N-dimetyloformamidu zawierającego 6,3x10- mola HCl (g) dodano 1 ml podstawowego roztworu chlorku trans-9-oktadekanoilu (1,7 g, 6,0x10- mola) w 6 ml dichlorometanu, i prowadzono reakcję, stale mieszając, w środowisku azotu w temperaturze pokojowej. Pozostałą ilość roztworu podstawowego, w porcjach o objętości 1 ml dodawano cyklicznie, w odstępie ok. 3 godzin. Po upływie 60 godzin całkowitego czasu trwania reakcji, rozpuszczalniki odparowano pod wysoką próżnią. Pozostałość rozpuszczono w chloroformie i przemywanej wodą. Wysuszoną MgSO4 fazę organiczną zagęszczano, a pozostałość rozpuszczano w heptanie. Dodanie frakcji ropy naftowej wrzącej w niskiej temperatrurze (petroleum ether) (40-60) pozwoliło na wytworzenie białej substancji (0,7g) utrzymywanej w chłodzie. Filtrat oczyszczano na .kolumnach zawierających żel silikonowy wymywanych 0 - 25% roztworem metanolu w etylooctanie. Otrzymaną tak homogenną frakcję następnie odparowano uzyskując kolejnych 0,8 g wymienionego w tytule związku (ogółem 1,5 g, 55%).

*H NMR (DMSO-d6, 300 MHz) δ: 7,63(1H, d, H-6), 7,t(2H, d, NH2), 5,95(1H, m, H1'), 5,7(1H, d, H-5), 5,35(2H, m, CH=CH), 4,25-4,10(3H, m, H-4' i H-5'), 2,3(3H, m, H-2' i CH2-COO), 2,0-1,6(7H, m, H-2', H-3' i CH2-C=), 1,45(2H, m, CH2-C-COO), 1,25(2 OH, m, CH2), 0,85(3H, t, CH-CH2).

13C NMR (DMSO-d6, 75 MHz) δ: 172,67(COO), 165,60(CNH2 4), 155,04(CO2), 140,45(CH 6), 130,00(CH=CH), 93,62(CH 5), 85,84(C 1'), 77,84(C 4'), 64,87(C 5'), 33,38, 31,96, 31,30, 29,02, 28,96, 28,86, 28,74, 28,52, 28,46, 28,36, 24,40, 22,11(CH2), 31,76, 25,47(CH 2' i 3'), 13,90(3¾).

Przyk ład 4. 5-0-(9'-hams-oktadecenoilo)-5-jodo-2'-dezoksy-urydyna.

Do roztworu 1,0 g (2,8x10*3 mola) 5-jodo-2-'dezoksy-urydyny w 10 ml bezwodnego N,N-dimetyloformamidzie i 15 ml pirydyny dodano 1 ml podstawowego roztworu chlorku trans-9-oktadekanoilu (1,12 g, 3,95x10- mola) w 4 ml dichlorometanu, i prowadzono reakcję, stale mieszając, w środowisku azotu w temperaturze pokojowej. Pozostałą ilość roztworu podstawowego, w porcjach o objętości 1 ml dodawano cyklicznie, w odstępie ok. 4 godzin. Po upływie 50 godzin całkowitego czasu trwania reakcji, rozpuszczalniki odparowano pod wysoką próżnią, a uzyskany produkt oczyszczano na kolumnach zawierających żel silikonowy przy użyciu 10% roztworu metanolu w chloroformie jako układu eluenta. Frakcję zawierająca produkt następnie zagęszczono a pozostałość rekrystalizowano z etanolu, co dało w

177 263 wyniku 1,43 g (82%) wymienionego w tytule związku, w postaci białej substancji stałej.

H NMR (DMSO-dć, 300 MHz) δ: 11,71 (1H, s, NH), 7,95(1H, s, H-6), 6,08(1H, t, HV), 5,4(1H, d, OH-3'), 5,35(2H, m, CH=CH), 4,2(3H, m, H-3' i 5'), 3,95(1H, m, H-4'), 2,35(2H, t, CH2-COO), 2,15(2H, m, H-2'), 1,95(4H, m, CH2-C=), 1,50(2H, m, CH2-C-COO), 1,25(2OH,m, CH2), 0,85(3H, t, CH3-C).

¹³C NMR (DMSO-dć, 75 MHz) δ: 172,16(COO), 159,90(C=O 4), 149,50(00 2), 143,89(06), 129,51(CH=CH), 84,43(049, 83,65(01'), 69,66(C-3'), 69,21(C-5), 63,06(C5'), 38,85(02'), 33,01, 31,45, 30,79, 28,51, 28,34, 28,22, 28,01, 27,92, 27,85, 27,46, 23,93, 21,60(0%), 13,43(C%-C),

Przykład 5. 5-O-(9'-hams-oktadecenoilo)-2,3-didezoksy-inozyna. (wzi^r23)

Roztwór 0,33 g (1,17x10- mola) kwasu trans-9-oktadecenolowego, 0,52 g (1,6x10'3 mola) O-( 1H-ben.zotnazolo-1-ilo)N,N,N' ,N'-tetrametylouroniumtetrafluoro-boratu (TbTU) i 0,5 ml aminy diizopropylo-etylu w 6 ml bezwodnego N,N-dimetyloformamidu, mieszano w środowisku azotu w temperaturze pokojowej. Do mieszaniny reagentów dodano 0,19 g (0,8x10’3 mola) 2,3-didezoksy-inozyny i stale mieszając, prowadzono reakcję przez 60 godzin. Rozpuszczalniki odparowano pod wysoką próanią, a pozostałość rozpuszczono w chloroformie i przemywano wodą Wysuszoną MgSO4 fazę organiczną zagęszczono, a otrzymany produkt oczyszczano na kolumnach zawierających żel silikonowy wymywanych 15¹% roztworem metanolu w chloroformie. Otrzymaną tak homogenną frakcję następnie odparowano uzyskując 0,25 g (62%) wymienionego w tytule związku w postaci jasnobrązowej, woskowatej substancji stałej.

‘H NMR (DMSO-dć, 300 MHz), δ: 12,35(1H, s, NH), 8,22(1H, s, H-2), 8,05(1H, s, H8), 6,25(1H, dd, H-1'), 5,32(2H, m, CH=CH), 4,35-4,10(3H, m, H-4' i H-5'), 2,45(2H, m, H2'), 2,25(2H, m, CH2-COO), 2,10(2H, m, H-3'), 1,95(4H, m, C%-0=), 1,45(2H, m, CH2-O COO), 1,25(2OH, m, CH2), 0,85(3H, t, CH3-C).

1³C NMR (DMSO-dć, 75 MHz), δ: 172,65(COO), 156,57(C-6), 147,68(C-3), 145,62(C2), 138,07708), 129,98(C=C), 124,38(05), 84,33(C-1'), 78,54(C-4'), 64,91(C-5'), 33,25, 31,94, 31,36, 28,99, 28,93, 28,84, 28,71, 28,50, 28,39, 28,32, 24,34, 22,09(C%), 31,27, 26,00(CH 2' i 3'), 13,88(C%).

Przykład 6. (S)-9-(2-hydroksy-3-C-[9'-trans-oktadejenoilo]propylo)-adenina. (wzór 24)

Do roztworu 0,8 g (3,8x10'3 mola) (S)-9-(2,3-dihydroksypropylo)adeniny, 1,2 g (4,25x10’3 mola) kwasu trans-9-oktadecenolowego i 50 mg N,N-dimetylo-amino-pirydyny w 20 ml bezwodnego N,N-dimetyloformamidu dodano 0,83 g (4,0x10'3 mola) dicykloheksylokarbodiimidu, i prowadzono reakcję, stale mieszając, w środowisku azotu w temperaturze pokojowej przez 40 godzin. Rozpuszczalnik odparowano pod wysoką próżnią, a otrzymany produkt oczyszczano poprzez powtarzaną chromatografię na kolumnach zawierających żel silikonowy wymywanych 5-15% roztworem metanolu w chloroformie. Jedną z porcji uzyskanej homogennej frakcji następnie zagęszczono. Uzyskano w ten sposób 0,7 g (38%) wymienionego w tytule związku w postaci białej substancji stałej.

^!H NMR (DMSO-dć, 300 MHz) δ: 8,12(1H, S, H-8), 8,05(1H, s, H-2), 7,20(2H, br, s, NH2), 5,48(1H, d, OH, 2'), 5,35(2H, m, CH=CH), 4,3(1H, m, H-1'), 4,15(3H,m, H-3' i H-1'), 3,95(1H, m, H-2'), 2,25(3H, t, CH^-COO), 1,95(4H, m, C%-C=), 1,45(2H, m, CH₂-C-COO), l, 25(2OH, m, C%), 0,85(3H, t, CH3-C).

¹³C NMR (DMSO-dć, 75 MHz) δ: 172,69(00, 155,94(C-6), 152,30(02), 149,65(0

4), 141,48(C-8), 130,02(CH=CH), 118,57(05), 66,52(02'), 65,44(C-3'), 46,10(C-1'), 33,48, 31,98, 31,31, 29,02, 28,87, 28,75, 28,60,28,52,28,40,24,37,22,13(CH2), 13,93(C%).

Z innej frakcji uzyskano 0,35 g (20%) izomerycznego produktu jakim była (S)-9-(3hydroksy-2O-[9'-trans-oktadecenoilo]-propylo)-adenina.

H NMR (DMSO-dć, 300 MHz), δ: 8,12(1H, S, H-8), 8,05(1 H, s, H-2), 7,20(2H, br, s, NH2), 5,35(2H, m, CH=CH), 5,12(1H, t, OH 3'), 4,35(1H, m, H-2'), 4,3(1H, m, H-1'), 4,05(1H, m, H-1'), 3,5(2H, m, H-3'), 2,15(2H, t, CH2-COO), 1,95(4H, m, CH2-C=), 1,45(2H, m, CH,-C-COO), 1,25 (20H, m, CH2), 0,85(3H, t, CH3-C).

13c NMR (DMSO-dć, 75 MHz), δ: 172,17(COO), 155,96(C-6), 152,41(02), 149,78(0 4), 141,11(C-8), 130,02(CH=CH), 118,52(C-5), 72,26(C-2'), 60,16(C-3'), 43,21(C-1'), 33,49,

177 263

31,99, 31,32,29,02, 28,88, 28,75, 28,53, 28,35,24,21,22,13(0%), 13,93(0%).

Przykład 7. 5'-O-(trans-9-oktadecenoilo)-5 -etynylo-1-e-D-rybofuranozyloimidazoio-4-karboksyamid.

Do roztworu 0,10 g (0,37x10~³ mola) 5-etynylo-1 -e-D-ryboźuranozylo-imidazolo-Tkarboksyamidu (EICAR) w 5 ml bezwodnego N,N-dimetyloformamidu i 5 ml pirydyny dodano 1 ml podstawowego roztworu chlorku cis-9-oktadekanoilu (1,13 g, 0,45x10'³ mola) w 3 ml dichlorometanu, i prowadzono reakcję, stale mieszając, w środowisku azotu w temperaturze pokojowej. Pozostałą ilość roztworu podstawowego, w porcjach o objętości 1 ml dodawano cyklicznie, w odstępie ok. 3 godzin. Po upływie 50 godzin całkowitego czasu trwania reakcji, rozpuszczalniki odparowano pod wysoką próżnią a uzyskany produkt oczyszczano na kolumnach zawierających żel silikonowy przy użyciu 15% roztworu metanolu w chloroformie jako układu eluenta. Otrzymaną tak homogenną frakcję następnie odparowano uzyskując 30 g (15%) wymienionego w tytule związku, w postaci białej substancji stałej.

1H NMR (DMSO-d₃, 300 MHz), δ: 8,05(1H, s, H-2), 7,35 i 7,25(2H, s + s, NH), 5,65(1H, d, H-1'), 5,6(1H, br d, OH-2'), 5,35(3H, m, CH=CH i OH-3'), 4,91(1H, s, C=*CH), 4,3(1 H, m, H-2'), 4,2(2H, m, H-5'), 4,05(2H, m, H-3' i H-4'), 2,30(2H, t, C%-COO), 1,95(4H, m, C%-C=), 1,45(2H, m, CH2-C-COO), 1,25(2OH, m, C%), 0,85(3H, t, C%).

ⁿC NMR (DMSO-d6, 75 MHz), δ: 172,76(COO), 162,57(CON%), 139,80(0-5), 135,82(0-2), 130,08(CH=CH), 115,51(0-4), 91,39(-C=*), 88,75(0-1'), 81,78(0-4'), 73,91(02'), 71,46(=*CH), 70,09(0-3'), 63,57(0-5'), 33,66, 31,95, 31,29, 29,00, 28,84, 28,72, 28,55, 28,50,28,42,28,^^, 24,49,22,12(0%), 13,97(0%).

Podążając za procedurami opisanymi w przykładach 1 -7 dodatkowe składniki opisane wzorem Nu-O-Fa można wytwarzać w oparciu o wyjściowe substancje wyszczególnione w kolejności poniżej:

Tabela 1

Nu - OH + FaX ->Nu-O-Fa (1) (2) (3)

Przykład nr.	Reagent (1)	Reagent (2)	Produkt (3)
8	2-e-D-rybofurHinzylo-selenazolo- -4-karboksyamid	kwas oleinowy	2-(5'-O-oleino-β-D-rybofUΓanozylo)- -selenazolo-4-karboksyamid
9	4-hydroksy-3-e-D-rybofurano- zylo-pirazolo-5-karboksyamid	kwas oleinowy	4-hydroksy-3-(5'-O-oleilo-β-D- -rybofuranozylo)-pirazolo-5-kaiboksyamid
10	2'-dezoksykofonnycyna	kwas elaidynowy	5'-O-elaidylo-2'-dezoksykofoimycyna
11	2'-dezoksy-2'-fluoro-5-jodo-1 -β-D-arabinofuirunozyo-cytozyna	kwas elaidynowy	5'-O-elaidylo-2'-dezoksy-2-'fluoro-5-jodo- -1-β-D-arabinofuralozylo-cytozyna
12	(E)-5-(2-bromowinylo)-2'- -dezoksy-urydyna	kwas 11 -cis-eikozenowy	5'-O-(cis-11 -eikozenoilo)-(E)-5-(2-bromowinylo)-2'-dezoksy-urydyna
13	1 -D-D-arabmofurano;zyo-(E)-5-(2-bromowinylo)uracyl	kwas oleinowy	5 '-O-(oleilo)-1 -β-D-arablnofur;mozylo-(E)-5-(2-bromowinylo)uracyl
14	9-(4-hydroksymetylo-2-cyklo- pentylo)-guanina	kwas oleinowy	9-(4-oleilometylo-2-cyklopentenylo)- -guanina
15	2'-dezoksy-2'-fluoro- 1-β-D-arabinofuirmozylo-1,2,4-triazolo3-karboksyamid	kwas 11-trans-eikozenowy	2'-dezoksy-2'-fluoro-5'-O-(trans-11 -eikozenoilo)- 1-β-D-arabmofuranozylo1,2,4-triazolo-3-karboksyamid

177 263

Istnieje możliwość syntezy większej ilości związków będących produktami (3) przeróżnych podstawień reakcji chemicznej reagentu (1) z reagentem (2) niż wymienione powyżej, tak jak np. 5'-O-elaidylo-2'-dezoksy-kofonnycyna, 5'-O-(cis-11-eikozenoilo)-2'-dezoksykoformycyna i 5'-O-(trans-11-eikozenoilo)-2'-dezoksy-koformycyna.

wzór 17

wzór 24

177 263

CJ c

cd

UJ c

o

CJ

CL

O

Cd >

<

Dd cn

Ul >

UJ _J

O in e

ω c_ ω

<u c

<v

N

CJ

JU

Θ e

>*

X o

c c_

CJ

JO >>

c_

O cn a/

X o

c

Έ;

o j

LD

O

W a

x

-i:

Conc. (pg/ml) Stężenie (jug/ml)

CO [\ sO

O O O + + +

CU UJ LJ m

O +

CU ’σ·

O +

UJ m

O ł

cu

CM

O cc

LU aj

33±I±SDUIA DsruiM oudiw

177 263 cr c

Cf c

c o

σ

CL

ZJ

E

OJ c_

-+— </)

O) o

cn <U

3= o

e c c Z >> m c > z>

OJ g to ^N n O c_ -Sc:

GJ

o

CM σι

IJL ε

©

CL

O

Ó

CU

rywvv>D<XXXXXXX?95X8&

O o

o ó

ci)

O o

o o

CM o

o o

o cn o

o o

o co o

o o

O

CM

A ó

c o

o s:

=;

OJ c

OJ

N

G>

t—

H3iii snaiA

DSDJIM 0UD1W

177 263

Fiq. 3

Treatment period 8 days

Wyniki uzyskane po 8 dniach leczenia

Stosunek masy ciafa myszy/masy śledziony

Ratio; mouse W. / spleen W. Czas jaki upłynął od zakażenia

Post infection ES313days 13dni 20 days 20dni

ddC

ELAIDATE

Elaidyman ddC ddC STEARATE

Stearynian ddC

Control

Kontrola

177 263

Ribavirin Elaidatc *~O oh

Elaidynian rybawiryny o

trans- Eikozenian rybawiryny

177 263

Fig. 4 cd

ddC Eicosenaie. cis

177 263

Fig. 4 cd

FlAC Oleate Olemian FlAC

OH

N-''

FlAC Eieoscddie. irans trans- Eikozenian FlAC

OH

Oleiman ddJ o

cis- Eikozenian ddJ O

o ikll Cicoscnatc trans trans-Eikozenian ddJ

177 263

NH,

Ο

E1CAR Eicosenaie. cis cis-Eikozenian E1CAR

OH OH

O

wzór 10a

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Monoestryfikowane związki przeciwwirusowe o wzorze :

Nu - O -Fa w którym O oznacza atom tlenu, Nu oznacza analog nukleozydu, a Fa oznacza grupę acylowąmononienasyconego kwasu tłuszczowego o długości łańcucha obejmującej 18 do 20 atomów węgla i wiązaniem mononienasyconym ω w pozycji 9, przy czym kwas jest zestryfikowany poprzez grupę hydroksylową reszty cukrowej analogu nukleozydu w pozycji 5’ lub poprzez końcową grupę hydroksylową przyłączoną do niecyklicznej części tego analogu oraz w którym Nu ma wzór:

B-S w którym S oznacza pochodną monocukrową wybraną spośród następujących związków: Ι-β-D-rybofuranozy, Ι-β-D-arabinofuranozy, 2-dezoksy-1-e-D-rybofuranozy, 2,3didezoksy-l-e-D-rybofuranozy, 2-dezoksy-2-fluoro- Ι-β-D-arabinofuranozy a B oznacza heterocykliczny układ pierścieniowy wybrany spośród związków: (i) o wzorze 1, wzorze 5 w którym w miejsce X można podstawić atom tlenu (O), którym w miejsce Y można podstawić grupę -C=CH, a w miejsce Rj - grupę NH2 lub (ii) o wzorze 9, o wzorze 10, w których w miejsce R4 można podstawić grupę NH2, a w miejsce R5 - atom wodoru (H) oraz w miejsce R - atom wodoru lub atom chlorowca lub (iii) o wzorze 11, w którym w miejsce R2 można podstawić atom wodoru (H), NH2, lub grupę OH, a w miejsce R3 - atom wodoru (H), z zastrzeżeniem, że gdy w miejsce S podstawiono Γ-β-Darabinofuranozę to w pozycji B nie mogą znajdować się związki o wzorze 10a.
2. Monoestryfikowane związki według zastrz. 1, w których wzór B-S oznacza rybawirynę.
3. Monoestryfikowane związki według zastrz. 1 albo 2, w których podstawnik Fa stanowi kwas oleinowy, kwas elaidynowy lub kwas eikozenowy występujący zarówno w formie stereoizomerycznej cis jak i trans.
4. Monoestryfkowany związek według zastrz. 1, w którym wzór B-S oznacza rybawirynę, a podstawnik Fa oznacza kwas oleinowy.
5. Monoestryfkowany związek według zastrz. 1, w którym wzór B-S oznacza rybawirynę, a podstawnik Fa oznacza kwas elaidynowy.
6. Monoestryfikowane związki według zastrz. 1, w którym wzór B-S oznacza rybawirynę, a podstawnik Fa oznacza stereoizometryczną formę cis albo trans kwasu eikozenowego.
7. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję aktywną i znane środki pomocnicze, znamienna tym, że jako substancję aktywną zawiera monoestryfkowany związek o wzorze Nu-O-Fa, w którym to wzorze O oznacza atom tlenu, Nu oznacza analog nukleozydu, a Fa oznacza grupę acylową mononienasyconego kwasu tłuszczowego o długości łańcucha obejmującej 18 do 20 atomów węgla i wiązaniem mononienasyconym ra w pozycji 9, przy czym kwas jest zestryfikowany poprzez grupę hydroksylową reszty cukrowej analogu nukleozydu w pozycji 5’ lub poprzez końcową grupę hydroksylową przyłączoną do niecyklicznej części tego analogu oraz w którym Nu ma wzór:

B-S w którym S oznacza pochodną monocukrową wybraną spośród następujących związków : 1-e-D-rybofuranozy, ^^β-D-arabinofuranozy, 2-dezoksy-1-e-D-rybofuranozy, 2,3177 263 didezoksy-1-e~D-rybofuranozy, 2-dezoksy-2-fluoro-1-e-D-arabmofuranozy aB oznacza heterocykliczny układ pierścieniowy wybrany spośród związków: (i) o wzorze 1, wzorze 5 w którym w miejsce X można podstawić atom tlenu (O), (S), w miejsce Y można podstawić grupę C=CH, a w miejsce R1 - grupę NH₂, lub (ii) o wzorze 9, o wzorze 10, w których w miejsce R4 można podstawić grupę NH2, a w miejsce R5 - atom wodoru (H) oraz w miejsce Rć - atom wodoru lub atom chlorowca lub (iii) o wzorze 11, w którym w miejsce R2 można podstawić atom wodoru (H), NH₂ lub grupę OH, a w miejsce R3 - atom wodoru (H), z zastrzeżeniem, że gdy w miejsce S podstawiono -Ι-β-Darabmofuranozę to w pozycji B nie mogą się znajdować związki o wzorze 10a, oraz zawiera dopuszczalny farmaceutyczne nośnik lub podłoże.
8. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 7, znamienna tym, że wzór B-S w związku będącym substancją aktywną oznacza rybawirynę.
9. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 7, znamienna tym, że podstawnik Fa w związku będącym substancją aktywną stanowi kwas oleinowy, kwas elaidynowy lub kwas eikozenowy występujący zarówno w formie stereoizomerycznej cis jak i trans.
10. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 7, znamienna tym, że wzór B-S w związku będącym substancją aktywną oznacza rybawirynę, a podstawnik Fa oznacza kwas oleinowy.
11. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 7, znamienna tym, że wzór B-S w związku będącym substancją aktywną oznacza rybawirynę, a podstawnik Fa oznacza kwas elaidynowy.
12. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 7, znamienna tym, że wzór B-S w związku będącym substancją aktywną oznacza rybawirynę, a podstawnik Fa oznacza stereoizomeryczna formę cis albo trans kwasu eikozenowego.