PL178478B1 - Odmiany subtilizyny, DNA kodujący odmiany subtilizyny, wektory ekspresji i komórka gospodarza transformowana wektorami ekspresji - Google Patents

Abstract

I Odmiany subtilizyny, zn am ien n e tym , ze ich sekw encja am inokwasowa nie wystepuje w przyrodzie i otrzym uje sie j a z prekursorowej subtilizyny i sek- w encja ta zawiera podstaw ienia innych reszt am inokwasowych w miejsce wiekszosci reszt am inokw asowych w pozycjach równowaznych z 76/99, 76/101, 76/103, 76/104, 76/107, 76/123, 76/99/101, 76/99/103, 76/99/104, 76/101/103, 76/101/104, 76/103/104, 76/104,107, 76/104/123, 76/107/123, 76/99/101/103, 76/99/101/104, 76/99/103/104, 76/101/103/104, 76/103/104/123, 76/104/107/123, 76/99/101/103/104, 76/99/103/104/123, 76/99/101/103/104/123, 76/103/104/126, 76/103/104/135, 76/103/104/197, 76/103/104/222, 76/103/104/260, 76/103/104/265, 76/103/104/126/265, 27/76/104/123/274,27/76/104/109/123/274, 27/76/104/123/218/274, 27/76/104/123,27/76/104/107/123, 27/76/104/109/123, 27/76/104/109/123/218/274, 27/76/104/123/197, 27/76/104/123/204, 27/76/104/123/206, 27/76/104/123/216, 27/76/104/123/218,27/76/104/123/260, 27/76/104/123/195/197, 27/76/104/123/195/218,27/76/104/123/197/218, 27/76/104/123/204/218, 27/76/104/123/206/218, 27/76/104/123/218/200,27/76/104/123/195/197/218, 76/103/104/217, 76/103/104/156, 76/103/104/166, 76/103/104/105, 76/101/103/104, 76/103/104/128, 76/103/104/210, 76/103/104/107, 76/103/104/204, 76/217 .76/103/104/156/166 8. DNA kodujace odmiany subtilizyny znam ienne tym , ze kodowana sekwencja am inokw asowa nie w ystepuje w przyrodzie i otrzym uje sie ja z prekurso- rowej subtilizyny zwierajacej podstaw ienia innych reszt am inokwasowych w miejsce wiekszosci reszt am inokw asowych w pozycjach rów nowaznych z 76/99, 76/101, 76/103, 76/104, 76/107, 76/123, 76/99/101, 76/99/103,76/99/104, 76/101/103, 76/101/104,76/103/104, 76/104,107,76/104/123, 76/107/123, 76/99/101/103, 76/99/101/104,76/99/103/104, 76/101/103/104,76/103/104/123,76/104/107/123,76/99/101/103/104,76/99/103/104/123, 76/99/101/103/104/123, 76/103/104/126, 76/103/104/135, 76/103/104/197, 76/103/104/222, 76/103/104/260, 76/103/104/265, 76/103/104/126/265, 27/76/104/123/274, 27/76/104/109/123/274, 27/76/104/123/218/274,27/76/104/123,27/76/104/107/123,27/76/104/109/123, 27/76/104/109/123/218/274, 27/76/104/123/197, 27/76/104/123/204, 27/76/104/123/206, 27/76/104/123/216, 27/76/104/123/218, 27/76/104/123/260, 27/76/104/123/195/197, 27/76/104/123/195/218,27/76/104/123/197/218, 27/76/104/123/204/218,27/76/104/123/206/218, 27/76/104/123/218/200, 27/76/104/123/195/197/218, 76/103/104/217, 76/103/104/156, 76/103/104/166, 76/103/104/105,76/101/103/104, 76/103/104/128, 76/103/104/210, 76/103/104/107, 76/103/104/204, 76/217 i 76/103/104/156/166 9 Wektory ekspresji, zn am ien n e tym , ze zaw ieraja D N A kodujace odmiany subtilizyny, przy czym kodow ana sekw encja am inokw asowa nie w ystepuje w przyrodzie i otrzymuje sie j a z prekursorow ej subtilizyny zwierajacej podstawienia innych reszt am inokw asowych w m iejsce wiekszosci reszt am inokw asowych w pozycjach równowaznych z 76/99, 76/101, 76/103, 76/104, 76/107, 76/123, 76/99/101, 76/99/103,76/99/104, 76/101/103, 76/101/104, 76/103/104, 76/104/107, 76/104/123, 76/107/123, 76/99/101/103, 76/99/101/104, 76/99/103/104, 76/101/103/104, 76/103/104/123, 76/104/107/123, 76/99/101/103/104, 76/99/103/104/123, 76/99/101/103/104/123, 76/103/104/126, 76/103/104/135, 76/103/104/197, 76/103/104/222, 76/103/104/260, 76/103/104/265, 76/103/104/126/265, 27/76/104/123/274,27/76/104/109/123/274, 27/76/104/123/218/274,27/76/104/123, 27/76/104/107/123,27/76/104/109/123,27/76/104/109/123/218/274, 27/76/104/123/197, 27/76/104/123/204, 27/76/104/123/206, 27/76/104/123/216, 27/76/104/123/218, 27/76/104/123/260, 27/76/104/123/195/197, 27/76/104/123/195/218, 27/76/104/123/197/218, 27/76/104/123/204/218,27/76/104/123/206/218, 27/76/104/123/218/200, 27/76/104/123/195/197/218, 76/103/104/217, 76/103/104/156, 76/103/104/166, 76/103/104/105, 76/101/103/104, 76/103/104/128, 76/103/104/210, 176/103/104/107, 76/103/104/204, 76/217 176/103/104/156/166 PL

Description

Przedmiotem wynalazku są nowe odmiany hydrolazy karbonylowej o sekwencji aminokwasów, w której podstawia się innymi aminokwasami większość reszt aminokwasowych prekursora hydrolazy karbonylowej, a zwłaszcza te, których pozycja odpowiada lub jest równoważna reszcie +76, w połączeniu z jedną lub więcej reszt wybranych z +99, +101, +103, +104, +107, +123, +27, +105, +109, +126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210, +210, +216, +217, +218, +222, +260, +265, i/lub +274 subtilizyny z Bacillus amyloliquefaciens. Ogólnie, powyżej opisane mutacje/odmiany hydrolazy karbonylowej, otrzymuje się przez modyfikacje in vitro sekwencji DNA kodującej prekursor hydrolazy karbonylowej występujący naturalnie lub zrekombinowany, tak aby sekwencj a ta kodowałaj edynie podstawienia większości tych -reszt aminokwasowych w sekwencji aminokwasowej prekursora lub w połączeniu z innymi podstawieniami, insercjami lub delecjami.

Proteazy serynowe stanowią podgrupę hydrolaz karbonylowych. Obejmują one różnorodną grupę enzymów o szerokiej specyficzności i funkcjach biologicznych. Stroud, R.Sci.Amer., 131:17-88. Pomimo ich różnorodności funkcjonalnej, katalityczne działanie proteazy seryjnej osiąga się przynajmniej w przypadku dwóch genetycznie różnych rodzin enzymów: subtilizyn i proteaz serynowych, spokrewnionych z chymotrypsyną ssaków oraz homologicznych bakteryj nych proteaz seryjnych (np. trypsyna i trypsyna z S.gresius). Te dwie rodziny proteaz serynowych wykazuja znaczne podobieństwo mechanizmu katalitycznego. Kraut, J. (1997), Ann. Rev. Biochem., 46:331-358. Co więcej, mimo różnej struktury pierwszorzędowej, struktura trzeciorzędowa tych dwóch rodzin enzymów umożliwia zbliżenie do siebie konserwowanej katalitycznej triady aminokwasów złożonej z reszty seryny, histydyny i asparaginianu.

Subtilizyna jest endoproteazą serynową (MW 27 500), wydzieloną w dużych ilościach przez wiele różnych gatunków Bacillus i inne mikroorganizmy. Sekwencja białkowa subtilizyny jest określona u co najmniej czterech różnych gatunków Bacillus. Markland, F.S., i wsp. (1983), Honne-Seyler’sZ. Physiol. Chem., 364:1537-1540. Opublikowano także trój wymiarową strukturę krystalograficzną subtilizyny z Bacillus amyloliąuefaciens, do rozdzielczości 2,5 A. Wright, C.S., i wsp. (1969), Nature, 221:23 5-242; Drenth, J., i wsp. (1972), Eur. J. Biochem., 26:177-181. Powyższe badania wskazują, że pomimo braku pokrewieństwa subtilizyny z proteazą serynową ssaków, wykazuje ona podobną strukturę miejsca aktywnego. Na podstawie analizy rentgenograficznej struktury krystalicznej zawierającej inhibitory peptydowe związane kowalencyjnie (Robertus, J.D., i wsp. (1972), Biochemistry, 11:2439-2449) lub kompleksy z produktem (Robertus, J.D., i wsp. (1976), J. Biol. Chem., 251:1097-1130). Otrzymano także informacje dotyczące miejsca aktywnego i prawdopodobną szczelinę wiążącą subtilizynę. Ponadto w wyniku przeprowadzenia szeregu badań kinetycznych oraz modyfikacji chemicznej subtilizyny (Philipp, M., i wsp. (1983), Mol. Celi. Biochem., 51:5-32; Svendsen, B (1976) Carlsberg Res. Comm., 41:237-291; Markland, F.S. Id.), podobnie jak w ostatnim artykule, gdzie boczny łańcuch metioniny wreszcie 222 subtilizyny został przekształcony nadtlenkiem wodoru w siarczan metioniny (Stauffer, D.C., i wsp. (1965), J.Biol. Chem., 244;5333-5338, a boczny łańcuch seryny w reszcie 221 został chemicznie przekształcony w cysteinę (Polgar, i wsp.. (1981), Biochemica et Biophisica Acta, 667:351-354.).

178 478

Z amerykańskiego opisu patentowego nr 4,760,025 (RE 34,606) znany jest sposób modyfikacji reszt aminokwasowych subtilizyny odpowiadających pozycjom reszt: tyrozyny -1, asaraginianu +32, asparaginy +155, tyrozyny +104, metioniny +222, glicyny +166, histydyny +64, glicyny +169, fenyloalaniny +189, seryny +3 3, seryny +221, tyrozyny +217, glutaminianu+156 i alaniny +152, w subtilizynie Bacillus amyloliquefaciens. Z amerykańskiego opisu patentowego nr 5,182,204 znany jest sposób modyfikacji reszt aminokwasowych +224 w subtilizynie Bacillus amyloliquefaciens i równoważnych pozycji w innych sybtilizynach, które mogą być modyfikowane przez podstawienie, insercję lub delecję i mogą być połączone z modyfikacjami w resztach opisanych w amerykańskim patencie nr nr 4,760,025 (RE 34,606), w celu stworzenia użytecznych mutantów lub odmian subtilizyny. Z amerykańskiego opisu patentowego nr 5,155,033 znany jest podobny mutant subtilizyny o modyfikacji w pozycji równoważnej do +225 w subtilizynie Bacillus amyloliquefaciens. Z amerykańskiego opisu patentowego nr 5,185,258 i 5,204,015 znany jest podobny mutant subtilizyny o modyfikacji w pozycji +123 i/lub +274. Opis tego wynalazkujest zamieszczony tutaj jako odnośnik, podobnie jak zgłoszenie amerykańskiego wynalazku SN07/898,382, które opisuje modyfikacje wielu reszt aminokwasowych subtilizyny, zwłaszcza +99, +101, +103, +107, +126, +128, +135, +197 i +204. Wszystkie powyższe opisy patentowe sąogólnie dostępne. Z amerykańskiego opisu patentowego nr 4,914,031 znane są analogi subtilizyny, m.in. subtilizyna modyfikowana w pozycji +76. Opis tego wynalazku jest także zamieszczony tutaj jako odnośnik. Jednakże poszczególne reszty zamieszczone w niniejszym opisie i/lub specyficzne kombinacje zastrzeżone tutaj, nie są zamieszczone we wspomnianych odnośnikach.

Przedmiotem wynalazku jest otrzymanie odmian hydrolazy karbonylowej (korzystnie subtilizyny) otrzymanych z DNA o podstawionych nukleotydach równoważnych w subtilizynie Bacillus amyloliquefaciens wielu resztom aminokwasowym w prekursorze hydrolazy karbonylowej równoważnym pozycj i +76 w połączeniu z j edną lub więcej pozycją z następującej grupy: +99, +101, +103, +104, +107, +123, +27, +105, +109, +126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210, +210, +216, +217, +218, +222, +260, +265, i/lub +274. Powyższe warianty wykazują zmianę przynajmniej jednej własności, różnej od tej samej właściwości prekursora hydrolazy karbonylowej, z którego pochodzi sekwencja aminokwasowa danej odmiany.

Przedmiotem wynalazku jest również otrzymanie sekwencji DNA kodujących odmiany hydrolazy karbonylowej, oraz wektorów ekspresyjnych zawierających te zmienione sekwencje DNA.

Przedmiotem wynalazku jest także otrzymanie komórek gospodarza transformowanych wyżej wymienionym wektorem, które sązdolne do ekspresji DNA, tak aby produkowały odmiany hydrolazy karbonylowej wewnątrz- lub zewnątrzkomórkowo.

Przedstawione powyżej odnośniki zamieszczono jedynie z powodu ich wcześniejszego ogłoszenia. Zamieszczenie ich nie może być interpretowane jako stwierdzenie, że wynalazcy nie mają prawa do umieszczania takich opisów z powodu wcześniejszych wynalazków lub pierwszeństwa złożenia wniosku patentowego.

Wynalazek dotyczy odmian hydrolazy karbonylowej, nie występujących naturalnie, o różnej aktywności proteolitycznej, stabilności, specyficzności, substratowej, profilu pH i/lub charakterystycznej specyficzności substratowej, w odniesieniu do prekursorowej hydrolazy karbonylowej, z której pochodzi sekwencja aminokwasowa danej odmiany. Prekursor hydrolazy karbonylowej może być hydrolaząkarbonylową występującą naturalnie lub hydrolazazrekombinowaną. Konkretniej, powyżej opisane odmiany hydrolazy karbonylowej mająsekwencję aminokwaso wąnie występującą w przyrodzie, którą otrzymuje się przez zastąpienie większości reszt aminokwasowych prekursorowej hydrolazy karbonylowej innymi aminokwasami. Większość reszt aminokwasowych enzymu prekursorowego odpowiada pozycji +76 w połączeniu z jedną lub więcej resztą z następującej grupy: +99, +101, +103, +104, +107, +123, +27, +105, +109, +126, +128, + 135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210, +210, +216, +217, +218, +222, +260, +265, i/lub +274, gdzie numer pozycji odpowiada subtilizynie z Bacillus amyloliquefaciens występującej naturalnie, lub różnoważnym resztom aminokwasowym w innych hydrolazach karbonylowych lub subtilizynach, np. subtilizynie Bacillus lentus. Korzystnie odmiany enzymów

178 478 opisane w wynalazku zawierająpodstawienia, delecje lub insercje reszt aminokwasowych w następujących kombinacjach:

76/99; 76/101; 76/103; 76/104; 76/107; 76/123; 76/99/101; 76/99/103; 76/99/104;

76/101/103; 76/101/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/104/123; 76/107/123; 76/99/101/103; 76/99/101/104; 76/101/103/104; 76/103/104/123; 76/104/107/123; 76/99/101/103/104; 76/99/103/104/123; 76/99/101/103/104/123; 76/103/104/128; 76/103/104/260;

76/103/104/265; 76/103/104/197; 76/103/104/105; 76/103/104/135; 76/103/104/126; 76/103/104/107; 76/103/104/210; 76/103/104/126/265 i/lub 76/103/104/222.

Korzystnym rozwiązaniem wynalazku ją odmiany enzymów zawierające podstawienia, delacje lub insercje reszt aminokwasowych w następujących kombinacjach:

76/99; 76/104; 76/99/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/101/103/104; 76/99/101/103/104 i 76/101/104 subtilizyny z Bacillus amyloliguefaciens.

Wynalazek obejmuje także zmienione sekwencje DNA kodujące powyżej opisane hydrolazy karbonylowej lub subtilizyny. Zmienione sekwencje DNA otrzymuje się prekursorowej sekwencji DNA, która koduje prekursor enzymu występujący naturalnie lub zrekombinowany. Zmienione sekwencje DNA otrzymuje się przez modyfikację prekursorowej sekwencji DNA tak aby kodowała podstawienia jednej lub więcej specyficznych reszt aminokwasowych kodowanych przez prekursorową sekwencję DNA równoważnym pozycjom: 76,99,101,103,104,107, 1/27^,22,105,109,126, 128,135,156,166,195,197,204,206,210,210,216,217,218,222,260, 265 i/lub 274 u Bacillus amyloliquefaciens lub ich jakiejkolwiek kombinacji. Mimo, iż w celu modyfikacji reszty aminokwasowe opisuje się według numerów stosowanych u B. amyloliquefaciens. (co jest zwyczajowym sposobem identyfikacji pozycji reszt dla wszystkich subtilizyn), korzystnym rozwiązaniem wynalazku jest stosowanie prekursorowej sekwencji DNA Bacillus lentus, jak pokazano na fig. 6 (Sekw. Nr 11).

Zmienione sekwencje DNA wynalazku kodują insercje lub podstawienia reszty aminokwasowej wpozycji 76 wpołączeniu zjednąlub więcej modyfikacją. Korzystnie zmienione sekwencje DNA koduj ją postawienie lub insercję reszt aminokwasowych w następujących kombinacjach: 76/99; 76/101; 76/103; 76/104; 76/107; 76/123; 76/99/101; 76/99/103; 76/99/104;

76/101/103; 76/101/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/104/123; 76/107/123; 76/99/101/103; 76/99/101/104; 76/101/103/104; 76/103/104/123; 76/104/107/123; 76/99/101/103/104; 76/99/103/104/123; 76/99/101/103/104/123; 76/103/104/128; 76/103/104/260;

76/103/104/265; 76/103/104/197; 76/103/104/105; 76/103/104/135; 76/103/104/126; 76/103/104/107; 76/103/104/210; 76/103/104/126/265 i/lub 76/103/104/222.

Najbardziej korzystnym rozwiązaniem wynalazku są odmiany enzymów zawierające podstawienia, delecje lub insercje reszt aminokwasowych w następujących kombinacjach:

76/99; 76/104; 76/99/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/101/103/104; 76/99/101/103/104 i 76/101/104.

Powyższe zrekombinowane sekwencje DNA, kodujące odmiany hydrolazy karbonylowej posiadająnową sekwencję aminokwasowąi przynajmniej jedną właściwość, która jest znacząco różna odnośnie do tej samej właściwości enzymu kodowanego przez prekursorową sekwencję DNA hydrolazy karbonylowej. Do wyżej wymienionych właściwości należą: aktywność proteolityczna, specyficzność substratowa, stabilność, różny profil pH i/lub wzmocnienie charakterystyki aktywności.

Wynalazek przedstawia podstawienie jakiegokolwiek z dziewiętnastu L-aminokwasów występujących w przyrodzie w określonej pozycji reszty aminokwasowej. Powyższe podstawienia dokonuje się w dowolnym prekursorze subtilizyny (u prokaryota, eukaryota, ssaków, etc.).Korzystnie, podstawienia reszty aminokwasowej dokonuje się w każdej z opisanych poniżej pozycji reszt aminokwasowych, obejmującej poniższe aminokwasy, lecz nie stanowi to ograniczenia:

podstawienia w pozycji 76 obejmują: D, H, E, G, F, K, P i N;

podstawienia w pozycji 99 obejmują: D, T, N, Q, G i S;

podstawienia w pozycji 101 obejmują: G, D, K, L, A, E, S i R;

178 478 podstawienia w pozycji 103 obejmują: Q, T, D, E, Y, K, G, R, S, i A;

podstawienia w pozycji 104 obejmują wszystkie 19 występujących w przyrodzie aminokwasów; podstawienia w pozycji 107 obejmują: V, L, M, Y, G, E, F, T, S, A, N i I; podstawienia w pozycji 123 obejmują: N, T, I, G, A, C i S;

podstawienia w pozycji 27 obejmują: K, N, C, V i T;

podstawienia w pozycji 105 obejmują: A, D, G, R i N;

podstawienia w pozycji 107 obejmują: A, L, V, Y, G, F, T, S i A;

podstawienia w pozycji 109 obejmują: S, K, R, A, N i D;

podstawienia w pozycji 126 obejmują: A, F, I, V i G;

podstawienia w pozycji 128 obejmują: G, L i A;

podstawienia w pozycji 135 obejmują: A, F, I, S i V;

podstawienia w pozycji 156 obejmują: D, E, A, G, Q i K;

podstawienia w pozycji 166 obejmują: wszystkie 19 występujących w przyrodzie aminokwasów;

podstawienia w pozycji 195 obejmują: E;

podstawienia w pozycji 197 obejmują: E;

podstawienia w pozycji 204 obejmują: A, G, C, S i D;

podstawienia w pozycji 206 obejmują: L, Y, N, D i E;

podstawienia w pozycji 210 obejmują: L, I, S, C i F;

podstawienia w pozycji 216 obejmują: V, E, T i K;

podstawienia w pozycji 217 obejmują: wszystkie 19 występujących w przyrodzie aminokwasów; podstawienia w pozycji 218 obejmują: S, A, G i V;

podstawienia w pozycji 222 obejmują: wszystkie 19 występujących w przyrodzie aminokwasów; podstawienia w pozycji 260 obejmują: P, N, G, A, S, C, K i D; podstawienia w pozycji 265 obejmują: N, G, A, S, C, K, Y i H; podstawienia w pozycji 274 obejmują: A i S.

Najkorzystniejsze zestawienia reszt aminokwasów, które podstawia się w odpowiedniej pozycji przedstawiono w tabeli I. Zrozumiałe jest, że dowolny aminokwas może być podstawiony w miejsce powyżej opisanych.

Tabela 1

Reszta aminokwasowa	Korzystny aminokwas podstawienia /insercji
1	2
+76	D, H
+99	D, T, N, G
+101	R, G, D, K, L, A, E
+103	A, Q, T, D, E, Y, K, G, R
+104	I, Y, S, L, A, T, G, F, M, W, D, V, N
+107	V, L, Y, G, F, T, S, A, N
+ 123	S, T, I
+27	K
+ 105	A, D
+ 109	S, K, R
+ 126	A, I, V, F
+ 128	G, L
+ 135	I, A, S

178 478 ciąg dalszy tabeli 1

1	2
+156	E, D, Q
+166	D, G, E, K, N, A, F, I, V, L
+195	E
+197	E
+204	A, G, C
+206	L
+210	I, S,C
+216	V
+217	H, I, Y, C, A, G, F, S, N, E, K
+218	S
+222	A, Q, S, C, I, K
+260	P, A, S, N, G
+265	N, A, G, S
+274	A, S

Wynalazek zawiera obejmuje również wektory ekspresyjne zawierające opisaną powyżej sekwencję DNA kodująca odmiany hydrolazy karbonylowej, jak i komórki gospodarza transformowane tymi wektorami, które sązdolne do produkcji odmian subtylizyny. Wynalazek przedstawia także mieszanine detergentu zawierającą odmiany hydrolazy karbonylowej.

Wynalazek jest przykładowo wyjaśniony na rysunku, na którym: fig. 1 A-C - przedstawia sekwencje DNA i sekwencję aminokwasowąsubtilizyny Bacillus amyloliquefaciens i częściową mapę restrykcyjną genu subtylizyny (Sekw; Nr 6).

Figura 2 - przedstawia konserwowane reszty we wszystkich subtilizynach Bacillus amyloliquefaciens (BPN) i Bacillus lentus (typ dziki).

Figura 3 A i 3B - przedstawia sekwencje aminokwasów 4 subtilizyn. Górny wiersz oznacza sekwencję aminokwasów subtilizyny z Bacillus amyloliquefaciens (czasem też opisywanąjako subtilizyna BPN') (Sekw; Nr 7). Drugi wiersz przedstawia sekwencję aminokwasów subtilizyny z Bacillus subtilis (Sekw. Nr 8). Trzeci wiersz przedstawia sekwencję aminokwasów subtilizyny z Bacillus licheniformis (Sekw. Nr 9). Czwarty wiersz przedstawia sekwencję aminokwasów subtilizyny z Bacillus lentus (czasem też opisywana jako subtilizyna 309 w PCT W089/06276) (Sekw. Nr 10) Symbol * oznacza brak specyficznych reszt aminokwasowych w odniesieniu do subtilizyny BPN'.

Figura 4 - przedstawia konstrukcję plazmidu GGA274.

Figura 5 - konstrukcja GGT274, który jest produktem pośrednim pewnych plazmidów ekspresji stosowanych w wynalazku.

Figura 6A i 6B - przedstawia sekwencję DNA i sekwencję aminokwasów subtilizyny z Bacillus lentus (Sekw. Nr 11). Dojrzałe białko subtilizyny jest kodowane przez kodony rozpoczynające się od kodonu GCG (334-336) odpowiadającemu Ala.

Figura 7A i 7B - przedstawia DNA i sekwencję aminokwasów korzystnej odmiany wynalazku (N76D/S103A/Y104I) (Sekw. Nr 12). Na fig. 7 przedstawiono modyfikacje DNA kodujące asparaginian w pozycji 76, alaninę w pozycji 103 i izoleucynęw pozycji 104. Dojrzałe zmienione białko jest kodowane przez kodony rozpoczynające się od kodonu GCG (334-336) odpowiadającemu Ala.

Figura 8 - przedstawia konstrukcje wektora pBCDAICAT.

Figura 9 - przedstawia konstrukcje wektora pUCCATFNA.

178 478

Figura 10 - przedstawia stabilność w mieszaninie ciekłego detergentu korzystnej mutacji enzymu względem typu dzikiego.

Stwierdzono, że dzięki mutacjom in vitro subtilizyny z B. lentus reszty aminokwasowej subtilizyny Bacillus amyloliquefaciens w pozycji +76, otrzymuje się odmiany subtilizyny wykazując zmienioną stabilność (np. stabilność modyfikowaną autoproteolitycznie) niż prekursor subtilizyny. (Tabele IV oraz VI).

Odkryto także, iż mutacje in vitro resztach w odpowiednich pozycjach: +99, +101, +103, +104, +107, +123, +27, +105, +109, +126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210, +210, +216, +217, +218, +222, +260, +265, i/lub +274 w subtilizynie Bacillus amyloliquefaciens, same lub w połączeniu ze sobąoraz w połączeniu z mutacjami w pozycji +76, produkują odmiany subtilizyny wykazujące inną aktywność proteolityczną, inną stabilność termiczną, inny profil pH, inną specyficzność substratową i/lub inną charakterystykę funkcjonalną.

Hydrolazy karbonylowe są enzymami, które hydrolizują O II

C-X związki zawierające powyższe wiązania, gdzie X oznacza atom tlenu lub azotu. Obejmują one także hydrolazy karbonylowe występujące w przyrodzie i zrekombinowane. Do hydrolaz karbonylowych występuj ących w przyrodzie zalicza się głównie hydrolazy, np. hydrolazy peptydowe tj. subtilizyny lub metaloproteazy. Hydrolazy peptydowe obejmują: hydrolazę α-aminoacylopeptydową, hydrolazę peptydyloaminokwusową. hydrolazę acyloaminową, karboksypeptydazę serynową, metalokarboksypeptydazę, proteinazę tiolową, karboksyproteinazę i metalokarboksyproteinazę. Obejmują również proteazę serynową, metaloproteazę, proteazę tiolowąjak również endo- i egzoproteazę.

Termin „zrekombinowana hydrolaza karbonylowa” odnosi się do hydrolazy karbonylowej, w której sekwencja DNA kodująca hydrolazę karbonylową występującą naturalnie modyfikuje się tak, aby otrzymać zmutowaną sekwencję DNA, kodującą podstawienie, insercję lub delecję jednej lub więcej reszty aminokwasowej w sekwencji aminokwasowej hydrolazy karbonylowej. Opis wynalazku zawiera odpowiednie sposoby modyfikacji, jak również sposoby te opisano w amerykańskim opisie patentowym 5,204,015, oraz 5,185,258, zamieszczonych w obecnym opisie jako odnośniki.

Subtilizyny sąhydrolazami karbonylowymi występującymi u bakterii lub grzybów, i ogólnie, ich działanie polega na przecinaniu wiązań peptydowych w białkach lub peptydach. W znaczeniu stosowanym w obecnym opisie patentowym, „subtilizyna” oznacza subtilizynę występującą w przyrodzie lub zrekombinowaną. Wiadomo, że wiele subbtilizyn występujących w przyrodzie, jest wytwarzanych i często wydzielanych przez różne mikrobowe gatunki. Sekwencje aminokwasowe tych subtilizyn nie są całkowicie homologiczne. Jednakże, subtilizyny te wykazują taki sam lub zbliżony typ aktywności protealitycznej. Klasę proteaz serynowych charakteryzuje wspólna sekwencja aminokwasowa, tworząca triadę katalityczną, która wyróżnia je z klasy proteaz serynowych spokrewnionych z chymotrypsyną. Zarówno subtilizyny jak i proteazy serynowe spokrewnione z chymotrypsyną, mają katalityczną triadę zwierającą asaraginian, histydynę i serynę. W proteazach spokrewnionych z subtilizyną względna kolejność tych aminokwasów, czytając od końca aminowego do karboksylowego, jest następująca: asparaginian-histydyna-seryna. Podczas gdy w proteazach serynowych spokrewnionych z chymotrypsyną względna kolejność jest następująca: histydyna-asparaginian-seryna. Na tej podstawie więc subtilizynę można zaliczyć do proteaz serynowych posiadających triadę katalityczną protaeaz spokrewnionych z subtilizyną. Przykłady obejmują, nie ograniczając zakresu wynalazku, subtilizyny przedstawione na fig. 3.

Termin „zrekombinowana subtilizyna” odnosi się do subtilizyny, w przypadku której sekwencję DNA kodującą tę subtilizynę modyfikuje się w ten sposób, aby otrzymać zmienioną sekwencję DNA (lub mutacje w sekwencji DNA) kodującą podstawienie, delecję lub insercję jednego lub więcej aminokwasów w sekwencji aminokwasowej subtilizyny występującej w przyrodzie. Opis dogodnych sposobów modyfikacji oraz tych, które można łączyć z przedsta10

178 478 wionymi w opisie wynalazku, znajduje się w patentach amerykańskich nr 4,760,025, 5,204,015 oraz 5,185,258, które są zamieszczone w obecnym opisie jako odnośniki.

„Hydrolizy karbonylowe nie pochodzące z człowieka” i DNA je kodujące otrzymuje się z wielu organizmów procaryota oraz eucaryota. Odpowiednimi organizmami procaryota mogą być organizmy Gramm-ujemne tj. E. Coli lub Pseudomonas oraz bakterie Gramm dodatnie tj. Micrococcus lub Bacillus. Jako przykłady organizmów eucaryota, z których otrzymuje się hydrolazę karbonylowąi ich geny można wymienić: drożdże tj. Saccharomyces cerevisiae, grzyby tj. Aspergillus sp. oraz ssaki, z pominięciem ludzi, np, bovine (wołowa) sp., z których otrzymuje się gen kodujący hydrolazę karbonylowąchymozyny. Tak jak w przypadku subtilizyn, grupa hydrolaz karbonylowych może być otrzymywana z różnych spokrewnionych gatunków, których sekwencje aminokwasowe nie są całkowicie homologiczne pomiędzy członkami grupy, jednakże wykazujące podobny lub jednakowy typ aktywności biologicznej. Zatem, hydrolazy karbonylowe nie pochodzące z człowieka, jak stosuje się w obecnym wynalazku, opisane sąfunkcjonalnie, jako hydrolazy karbonylowe związane pośrednio lub bezpośrednio ze źródłem prokariotycznym lub eukariotycznym.

„Odmiana hydrolazy karbonylowej” charakteryzuje się sekwencją aminokwasową, która otrzymuje się z sekwencji aminokwasowej ‘prekursora hydrolazy karbonylowej”. Prekursor hydrolazy karbonylowej (tj. subtilizyna) obejmuje hydrolazy karbonylowe występujące w przyrodzie (subtilizyna) i zrekombinowane hydrolazy karbonylowe (subtilizyna). Sekwencja aminokwasowa odmiany hydrolazy karbonylowej „pochodzi z” prekursorowej sekwencji aminokwasowej przez podstawienie, delecję lub insercję jednego lub więcej reszt aminokwasowych. Jest to raczej modyfikacja „prekursorowej sekwencji DNA”, kodującej sekwencję aminokwasową. prekursora hydrolazy karbonylowej (subtilizyny), niż prostą manipulacją enzymem prekursorowej hydrolazy karbonylowej (subtilizyną) . Wynalazek zawiera opis odpowiednich sposobów manipulacji prekursorową sekwencją DNA, jak również metody ogólnie znane specjalistom w tej dziedzinie (opisane w np. EP 0 328299, W089/06279 i wspomnianych już patentach amerykańskich).

Specyficzne reszty aminokwasowe poddaje się mutacji w pozycji +76 w połączeniu zjedną lub więcej pozycją wybraną z: +99, +101, +103, +104, +107, +123, +27, +105, +105, +109, +126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210, +210, +216, +217,. +218, +222, +260, +265, i/lub +274 subtilizyny Bacillus amyloliquefaciens. Korzystnie zmodyfikowane reszty wybiera się z następujących kombinacji:

76/99; 76/101; 76/103; 76/104; 76/107; 76/123; 76/99/101; 76/99/103; 76/99/104;

76/101/103; 76/101/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/104/123; 76/107/123; 76/99/101/103; 76/99/101/104; 76/101/103/104; 76/103/104/123; 76/104/107/123; 76/99/101/103/104; 76/99/103/104/123; 76/99/101/103/104/123, 76/103/104/128; 76/103/104/260; 76/103/104/265; 76/103/104/197; 76/103/104/105; 76/103/104/135; 76/103/104/126; 76/103/104/107; 76/103/104/210; 76/103/104/126/265 i/lub 76/103/104/222; a najkorzystniejsze są: 76/99; 76/104; 76/99/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/101/103/104; 76/99/101/103/104 i 76/101/104.

Powyższe numery pozycji odnoszą się do sekwencji dojrzałej subtilizyny Bacillus amyloliquefaciens przedstawionej na fig. 1. Wynalazek, jednakże, nie ogranicza się do mutacji tylko w tej subtilizynie, lecz dotyczy także prekursora hydrolaz karbonylowych zawierających reszty aminokwasowe w pozycjach dokładnie „równoważnych” pozycjom zidentyfikowanym w subtilizynie Bacillus amyloliquefaciens. W korzystnym zastosowaniu wynalazku, jako prekursorową subtilizynę stosuje się subtilizynę Bacillus lentus i podstawienia, delecje lub insercje prowadzi się w subtilizynie z B. lentus na resztach w pozycj ach równoważnych wymienionym powyżej.

Resztę (aminokwasową) prekursora hydrolazy karbonylowej uważa się za równoważnąreszcie subtilizyny Bacillus amyloliquefaciens jeśli jest ona homologiczna (tj. równoważna pozycji w strukturze pierwszo- lub trzeciorzędowej) lub analogiczna do specyficznej reszty lub części tej reszty w subtilizynie Bacillus amyloliquefaciens (tj. posiada tą samą lub podobną zdolność funkcjonalną do łączenia się, reagowania lub oddziaływania chemicznego).

178 478

W celu ustalenia homologii struktury pierwszorzędowej, sekwencję aminokwasowąprekursora hydrolazy karbonylowej porównuje się bezpośrednio z pierwszorzędową sekwencją subtilizyny Bacillus amyloliąuefaciens, a zwłaszcza ze zbiorem reszt, które są niezmienne we wszystkich znanych sekwencjach subtilizyn. Figura 2 przedstawia konserwowane reszty subtilizyny z B. amyloUąuefaciens i B. lentus. Po ustaleniu konserwowanych reszt, umożliwiających przeprowadzenie insercji i delecji w celu zachowania tego ustalenia (tj. uniknięcia eliminacji konserwowanych reszt przez arbitralnądelecję lub insercję), definiuje się reszty równoważne poszczególnym aminokwasom w pierwszorzędowej sekwencji subtilizyny Bacillus amyloliąuefaciens. Ustalenie konserwowanych reszt powinno prowadzić do zachowywania 100% tych reszt. Jednakże ustalenie 75% lub nawet tak niewiele jak 50% reszt konserwowanych jest wystarczające do zdefiniowania reszt równoważnych. Wymagane jest natomiast zachowanie triady katalitycznej: Asp32/His64/Ser221.

Przykładowo przedstawione na fig. 3, sekwencje subtilizyny z Bacillus amyllOląuefaciens, Bacillus sublitis, Bacillus licheniformis (carlsbergenis) i Bacillus lentus sąw formie liniowej, co zapewnia najwyższą homologię pomiędzy sekwencjami aminokwasów. Porównanie tych sekwencji wskazuje, że w każdej z podanych sekwencji występuje wiele konserwowanych reszt. Na fig. 2 przedstawiono konserwowane reszty (jak w przypadku DPN' i B. lentus).

Na podstawie konserwowanych reszt aminokwasowych można zdefiniować równoważne reszty aminokwasowe subtilizyny z Bacillus amyloliąuefaciens innym hydrolazom karbonylowym tj. subtilizynie z Bacillus lentus (PCT Nr W089/6279 opublikowana 13 lipca 1989), wybranemu prekursorowi enzymu subtilizyny będącemu przedmiotem wynalazku, lub subtilizyny opisywanej jako PB92 (EP 0 328 299), o wysokiej homologii do preferowanej subtilizyny Bacillus lentus. Sekwencje aminokwasowe niektórych subtilizyn porównano z subtilizyną Bacillus amyloliąuefaciens na fig. 3A i 3B. I tak, przykładowo równoważną resztą aminokwasową Val 165 subtilizyny Bacillus amyloliąuefaciens w subtilizynach a B. lentus i B. licheniformis jest izoleucyna.

Przykładowo, resztą aminokwasową w pozycji +76 jest asparagina (N) zarówno w subtilizynie B. amyloUąuefaciens, jak i B. lentus. Jednakże w preferowanej odmianie subtilizyny, równoważnik +76 subtilizyny Bacillus amyloUąuefaciens jest podstawiony kwasem asparaginowym (D). Porównanie niektórych reszt aminokwasowych poddawanych substytucji w niniejszym wynalazku względem najkorzystniejszch substytucji dla każdej z tych pozycji przedstawiono w tabeli II

Tabela II

	+76	+99	+ 101	+103	+ 104	+ 107	+ 123
B. amyloUąuefaciens (typ dziki)	N	D	S	Q	Y	I	N
B. lentus(typ dziki)	N	S	S	s	V	I	N
Podstawienie N ajkorzystniej sze	D	D	R	A	I/Y	V	S

Równoważne reszty definiuje się także przez określenie homologii w ustalonej rentgenograficznie strukturze trzeciorzędowej prekursora hydrolazy karbonylowej. Rónoważne reszty definiuje się jako te, dla których współrzędne atomowe dwóch łub więcej atomów głównych łańcuchów reszty aminokwasowej prekursora hydrolazy karbonylowej i subtilizyny Bacillus amyloUąuefaciens (N na N, CA na CA, C na C i O na O) zawieraj ą się poniżej 0,13 nm a korzystnie 0,1 nm po ustaniu reszt. Ustalenie reszt osiąga się przez zorientowanie najlepszego modelu i umieszczeniu go tak, aby dawał największe zachodzenie współrzędnych atomów (oprócz wodorów) białka hydrolazy karbonylowej, względem subtilizyny Bacillus amyloUąuefaciens. Najlepszym modelem jest model krystalograficzny o najniższym czynniku R dla doświadczalnych danych dyfrakcyjnych przy najwyższej możliwej rozdzielności.

178 478

Fo(h) I -1 Fc(h) I czynnik R =

EhlFo/h)!

Równoważne reszty, funkcjonalnie analogiczne do specyficznych reszt subtilizyny Bacillus amyloliąuefaciens definiuje się jako te reszty aminokwasowe hydrolazy karbonylowej, które mogą przyjmować taką konformację, że zmieniają, modyfikują lub biorą udział w strukturze białka, wiązaniu substratu lub katalizie w sposób opisany i przypisany specyficznej reszcie subtilizyny Bacillus amyloliąuefaciens. Ponadto, sąto te reszty prekursora hydrolizy karbonylowej (o strukturze trzeciorzędowej określonej rentgenograficznie), które zajmują analogiczne pozycje do tego stopnia, że mimo braku równoważności głównego łańcucha danej reszty ze względu na nie homologiczne położenie, współrzędne atomowe przynajmniej dwóch łańcuchów bocznych reszty leżąw odległości 0,13 nm względem odpowiednich atomów łańcucha bocznego subtilizyny Bacillus amyloliąuefaciens. Trójwymiarowe współrzędne struktury subtilizyny Bacillus amyloliąuefaciens zostały opublikowane w EPO nr 0,251 446 (równoważne z amerykańskim zgłoszeniem patentowym SN 08/212,219, zamieszczonym jako odnośnik) i mogą być użyte jak zarysowano powyżej, w celu określenia równoważnych reszt na poziomie struktury trzeciorzędowej .

Niektóre reszty, zidentyfikowane w pozycjach, w których następuje podstawienie, insercja lub delecjamogąbyć resztami konserwowanymi, podczas gdy inne nie. W przypadku reszt, które nie są konserwowane, zastąpienie jednej lub więcej reszt aminokwasowych jest ograniczone do podstawień, które produkują odmianę o sekwencji aminokwasów, która nie odpowiada żadnej występującej w przyrodzie. W przypadku stałych reszt, zastąpienie nie powinno dawać sekwencji występujących w przyrodzie. Odmiany hydrolazy karbonylowej, będącej przedmiotem obecnego wynalazku zawierają dojrzałe formy odmian hydrolaz karbonylowych, jak i pro- i prepro-formy. Formy prepro- są korzystne, gdyż ułatwiają ekspresję, wydzielanie i dojrzewanie odmian hydrolaz karbonylowych.

Termin „prosekwencja” oznacza sekwencje aminokwasowe związane z N-końcem dojrzałej formy hydrolazy karbonylowej, których usunięcie prowadzi do pojawienia się dojrzałej formy hydrolazy karbonylowej. Wiele enzymów proteolitycznych, których ekspresja zachodzi w ten sposób, jeśli nie następuje modyfikacja postraslancyjna obecnychjest w przyrodzie jako produkt ekspresj i w postaci proenzymu. Korzystna prosekwencj a, którą stosuj e się do otrzymywania odmian hydrolazy karbonylowej, zwłaszcza odmian subtilizyny jest domniemaną prosekwencją subtilizyny Bacillus amyloliąuefaciens, jednakże możliwe jest użycie innych prosekwencji subtilizyny. W przykładzie I i II użyto domniemane prosekwencje subtilizyny Bacillus lentus (ATCC 21536).

Termin „sekwencja sygnałowa” lub „prosekwencja” oznacza sekwencje aminokwasowe związane z N-końcem hydrolazy karbonylowej lub N-końcem części prohydrolazy-’, która może uczestniczyć w wydzielaniu dojrzałych form lub proform hydrolazy. Jest to definicja funkcjonalna sekwencji sygnałowej, mająca na celu objęcie wszystkich tych sekwencji aminokwasowych kodowanych przez część genu subtilizynowego kodującego N-koniec tego białka lub innych wydzielanych hydrolaz karbonylowych, które biorą udział w wydzielaniu subtilizyny lub innych hydrolaz karbonylowych w warunkach naturalnych. W wynalazku korzysta się z takich sekwencji, w celu zwiększenia wydzielania hydrolaz karbonylowych, jak zdefiniowano powyżej. Korzystna sekwencja sygnałowa przedstawiona w przykładach zawiera pierwsze siedem reszt aminokwasowych sekwencji sygnałowej subtlilizyny z Bacillus subtilis połączonych z pozostałą częścią sekwencji sygnałowej subtilizyny Bacillus lentus (ATCC 21536).

Forma „prepro” odmiany hydrolazy karbonylowej składa się z dojrzałej formy hydrolazy o prosekwencji funkcjonalnie związanej z końcem aminowym hydrolazy oraz sekwencji „pre” lub „sygnałowej” funkcjonalnie połączonej z końcem aminowym prosekwencji.

Termin „wektor ekspresyjny” odnosi się do konstruktu DNA zawierającego sekwencje DNA, funkcjonalnie połączoną z odpowiednią sekwencją kontrolną mogącą kontrolować ekspresje powyższego DNA w odpowiednim gospodarzu. Taka sekwencja kontrolna zawiera pro178 478 motor, w celu rozpoczęcia transkrypcji, ewentualnie sekwencję operatorową aby kontrolować tę transkrypcję, sekwencję kodującą odpowiednie rybosomalne miejsca wiążące mRNA i sekwencje kontrolujące zakończenie transkrypcji i translacji. Wektor może być plazmidem, cząsteczką faga, lub po prostu skuteczną wstawką genową. Po transformacji odpowiedniego gospodarza, wektor może ulegać replikacji i działać niezależnie od genomu gospodarza, lub może w pewnych przypadkach, zostać włączony do genomu. W obecnym opisie, terminy „plazmid” i „wektor” są czasami używane wymiennie, gdyż plazmid jest obecnie najczęściej używaną formą wektora. Jednakże, wynalazek obejmuje także inne formy wektorów ekspresyjnych, które służąrównoważnym funkcjom i które są lub staną się ogólnie znane.

W wynalazku używa się prokariotycznych lub eukariotycznych „komórek gospodarza”, które korzystnie zmienia się sposobami opisanymi w patencie amerykańskim 4,760,025 (RE 34, 606), aby uczynić je niezdolnymi do wydzielania endoproteaz aktywnych enzymatycznie. Korzystną komórką gospodarza dla ekspresji subtilizyny jest szczep Bacillus, BG2036, który nie wytwarza enzymatycznie czynnej neutralnej proteazy i proteazy alkalicznej (subtilizyny). Konstrukcja szczepu BG2036jest szczegółowo opisana w patencie amerykańskim 5,264,366. Innymi komórkami gospodarza mogą być Bacillus sublilis 1168 (także opisany w patencie amerykańskim 4, 760, 025 (RE 34606) i w patencie amerykańskim 5,264,366, zamieszczonymi jako odnośniki jak i każdy odpowiedni szczep Bacillus, tj. B. licheniformis, B. lentus, itp.

Komórki gospodarza transformuje się lub transfekuje wektorami, do których konstrukcji używa się technik rekombinacji DNA Transformowane komórki gospodarza maja zdolność do replikacji wektorów kodujących odmiany hydrolazy karbonylowej lub ekspresji potrzebnej odmiany hydrolazy karbonylowej. W przypadku wektorów, które kodująpre- lub prepro-formy odmiany hydrolazy karbonylowej, odmiany te, najczęściej po ekspresji są wydzielane z komórki gospodarza do pożywki.

Termin „funkcjonalnie połączony” w odniesieniu dwóch regionów DNA, oznacza, że są one funkcjonalnie połączone ze sobą. Przykładowo presekwencja jest funkcjonalnie połączona z peptydem, jeśli działa onajako sekwencja sygnałowa, biorącąudział w wydzielaniu dojrzałej formy białka, prawdopodobnie dzięki odcięciu sekwencji sygnałowej. Promotorjest funkcjonalnie związany z sekwencją kodującą jeśli kontroluje on transkrypcję sekwencji; miejsce wiążące rybosomjest funkcjonalnie związane z sekwencjąkodującą, jeśli jest umieszczone tak, aby umożliwić translację.

Geny kodujące prekursorową hydrolazę karbonylową otrzymuje się według sposobów ogólnie znanym specjalistom. Ogólnie polega to na syntezie znakowanych sond posiadających domniemane sekwencje kodujące żądane regiony hydrolazy, stworzeniu banków genów organizmów, w których prowadzi się ekspresje hydrolazy i przebadanie banków na żądany gen przez hybrydyzacje z sondą. Klony, które hybrydyzują z sondami, mapuje się i sekwencjonuje. W przykładzie I amerykańskiego patentu 5,185,258, opisano klonowanie genu B. lentus stosowanego w przykładach niniejszego wynalazku. W przykładzie I w RE 34,606, opisano gen BPN' stosowany w przykładzie V niniejszego wynalazku.

Sklonowany gen hydrolazy karbonylowej używa się następnie do transformacji komórek gospodarza w celu przeprowadzenia ekspresji. Następnie liguje się gen hydrolazy z plazmidem wielokopijnym. Plazmid ten ulega replikacji w gospodarzu, tak, że zawiera dobrze znane części niezbędne dla replikacji plazmidu: promotor, funkcjonalnie związany z żądanym genem (który może być zaopatrzony w swój własny homologiczny promotor, jeśli jest on rozpoznawalny, tj. może być transkrybowany przez gospodarza), region terminacji transkrypcji i poliadenylacji (niezbędny dla stabilności mRNA transkrybowanego przez gospodarza z genu hydrolazy w niektórych komórkach gospodarza eukariotycznego), który jest egzogenny lub jest dostarczony przez endogenny region terminacji genu hydrolazy i, korzystnie, gen selekcyjny tj. gen odporności na antybiotyk, umożliwiający stałe sprawdzanie hodowli komórek gospodarza zainfekowanych plazmidem przez wzrost na podłożu zawierającym antybiotyk. Plazmidy wielokopijne zawierają także miejsce inicjacji replikacji gospodarza, co umożliwia generowanie dużej liczby plazmidów w cytoplazmie, nie ograniczone chromosomalnie. Jednakże, obecny opis obejmuje

178 478 także sposób integracji powielonych kopii genu hydrolazy w genomie gospodarza. Jest to możliwe dzięki podatności organizmów prokariotycznych i eukariotycznych na rekombinacje homologiczną.

Geny użyte w przykładach są naturalnymi genami B. lentus i B. amyloliquefaciens. Możliwe jest otrzymanie syntetycznego genu kodującego hydrolazę karbonylową(subtilizynę) występującą naturalnie lub jej zmutowany prekursor. W tym przypadku, określa się sekwencję DNA i/lub sekwencję aminokwasów prekursora hydrolazy karbonylowej (subtilizyny). Powielone, nachodzące na siebie, syntetyczne,, jednoniciowe fragmenty DNA po syntezie poddaje się hybrydyzacji i ligacji, otrzymując syntetyczne DNA kodujące prekursor hydrolazy. W przykładzie 3 patentu amerykańskiego 5,204,015, jest przedstawiona konstrukcja genu syntetycznego.

Gdy gen prekursora hydrolazy karbonylowej występującej naturalnie lub syntetycznej został sklonowany, przeprowadza się szereg modyfikacji prowadzących do podwyższenia syntezy danego białka względem występującej naturalnie syntezy prekursora hydrolizy karbonylowej. Modyfikacje takie obejmują produkcję zrekombinowanej hydrolazy karbonylowej, jak opisano w amerykańskim patencie 4,760,025 (RE 34,606) i EPO nr 0 251 446 i produkcję odmian hydrolazy karbonylowej opisanej powyżej.

W celu ułatwienia konstrukcji i identyfikacji odmian hydrolazy karbonylowej stosuje się opisany poniżej sposób mutagenezy kasetowej (cassette). Możliwe jest zastosowanie innych sposobów, m.in. mutagenezy punktowej. W pierwszym etapie mutagenezy kasetowej otrzymuje się występujący naturalnie gen kodujący hydrolazę, a następnie sekwencjonuje się go częściowo lub całkowicie. Sekwencję odczytuje się w celu odnalezienia miejsca, w którym ma być mutacja (delecja, insercja lub podstawienie) jednego lub więcej aminokwasów z kodowanego enzymu. W sekwencjach, w których omija się ten punkt, sprawdza się obecność miejsc restrykcyjnych aby zastąpić krótki segment genu na inny oligonukleotyd, który w wyniku ekspresji będzie dawał szereg mutantów. Korzystnie jest, gdy miejsca restrykcyjne są unikalne w obrębie genu, co ułatwia zastępowanie segmentu genowego. Jednakże można stosować każde dogodne miejsce restrykcyjne, które w genie hydrolazy nie jest zbyt liczne, a otrzymane fragmenty genowe produkowane przez trawienie restrykcyjne mogą być ponownie złożone we właściwej sekwencji. Jeżeli miejsca restrykcyjne nie występują w dogodnej odległości od wybranego punktu (10 do 15 nukleotydów), tworzy się je przez podstawienie nukleotydów w genie tak, że w końcowym konstrukcie nie ulega zmianie ani ramka odczytu, ani kodowane aminokwasy. Mutacje genu, w celu dopasowania tego genu do sekwencji żądanej otrzymuje się przez rozszerzenie primera M13, według ogólnie znanych sposobów. Umieszczenie odpowiedniego regionu flankującego i wprowadzenie niezbędnych zmian, tak aby otrzymać dwie dogodne sekwencje miejsc restrykcyjnychjest procedurąrutynową i opiera się na dużej ilości kodu genetycznego, mapie restrykcyjnej enzymu i dużej liczbie enzymów restrykcyjnych. Warto zauważyć, że jeśli dostępne jest dogodne restrykcyjne miejsce flankujące, powyższa metoda musi być połączona z regionem flankowym, który nie zawiera miejsca restrykcyjnego.

Gdy sklonowano naturalne lub syntetyczne DNA, restrykcyjne miejsca znajdujące się w pozycjach, które mają być zmutowane, trawi się odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi i wiele kaset oligonukleotydowych o komplementarnych końcach liguje się do DNA. Metoda ta upraszcza mutagenezę, ponieważ wszystkie oligonukleotydy mogą być zsyntetyzowane tak, aby miały takie same miejsca restrykcyjne i nie sąpotrzebne syntetyczne łączniki aby je stworzyć.

Według niniejszego wynalazku, aktywność proteolitycznajest zdefiniowanajako stosunek wiązań peptydowych, które uległy hydrolizie na miligram aktywnego enzymu. Istnieje wiele dobrze znanych sposobów pomiaru aktywności proteolitycznej (K. M. Kalisz, „Microbial Proteinases”, Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, A. Fiechter ed. 1988). Dodatkowo, lub jako inna możliwość modyfikowania aktywności proteolitycznej, inne enzymy będące przedmiotem wynalazku mogą wykazywać inne, zmodyfikowane właściwości tj. K_in, k_cat, stosunek k_cat/K_m i/lub zmienioną specyficzność substratową i/lub zmieniony profil pH. Powyższe enzymy mogą być przypisane szczególnemu substratowi, którego obecność zakłada się, np. w preparatyce białkowej lub w procesach hydrolitycznych tj. stosowane w praniu.

178 478

Jedna odmiana wynalazku dotyczy zabezpieczenia zmienionej hydrolazy karbonylowej o innej aktywności proteolitycznej niż w przypadku prekursorowej hydrolazy karbonylowej, ze względu na to iż wzrost aktywności (numerycznie większej) umożliwia użycie enzymu z większą wydajnością. Także warte zainteresowania sązmienione enzymy o innej stabilności termicznej i/lub specyficzności substratowej niż prekursor. Korzystnie, gdy hydrolazą karbonylową poddaną mutacji jest subtilizyna. W przykładach przedstawiono specyficzne reszty aminokwasowe użyteczne do otrzymania takich wyników dla hydrolazy karbonylowej typu subtilizynowego znajdują się w pozycjach równoważnych z +76, +99, +101, +103, +104, +107, +123, +27, +105, +109, +126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210, +210, +216, +217, +218, +222, +260, +265, i/lub +274 lub dowolnąkombinacjątych pozycji w subtilizynie z Bacillus amyloliąuefaciens. W pewnych przypadkach, niższa aktywność proteolityczna może również być korzystna, np. zmniejszenie aktywności proteolitycznej może być użyteczne, tam gdzie potrzebnajest kontrolowana aktywność hydrolazy karbonylowej, np. w systemie peptydów, aby nie zniszczyć produktów tej syntezy. Przeciwnie, w niektórych przypadkach korzystne jest podwyższenie aktywności proteolitycznej odmiany enzymu względem jego prekursora. Dodatkowo, wzrost lub zmniejszenie stabilności odmiany, czy stabilności alkalicznej lub termicznej, mogą być użyteczne. Wzrost lub zmniejszenie K_m, k^j, k_Mt/K_m zależy od zastosowanego substratu użytego do określenia wartości tych parametrów.

W innym aspekcie wynalazku, stwierdzono, że reszty równoważne z +76 w połączeniu z innymi modyfikacjami subtilizyny są ważne dla zmian ogólnej stabilności i/lub aktywności proteolitycznej anzymu. Jak przedstawiono poniżej ' w przykładach, Asparagina (N) w subtilizynie Bacillus lentus w pozycji równoważnej +76 może być podstawiona kwasem asparaginowym (D) w korzystnym zastosowaniu w połączeniu z modyfikacjami jednego lub więcej następujących reszt aminokwasowych: +99, +101, +103, +104, +107, +123, +27, +105, +109, +126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210, +210, +216, +217, +218, +222, +260, +265, i/lub +274, aby otrzymać większą stabilność i/lub wyższą aktywność otrzymanego zmutowanego enzymu.

Najkorzystniejsze zastosowania wynalazku przedstawione będą w przykładach. Zawierają one następujące specyficzne kombinacje podstawionych reszt: N76/S99D; N76D/V104I; N76D/S99D/V104I; N76D/S103AW104I; N76D/V104I/I107V; N76DW104Y/I107V i N76D/S101R/S103A/V104I. W przykładach opisano także wszystkie kombinacje mutacji zastrzeżone w wynalazku. Korzystnie podstawienia te wprowadza się w subtilizynie Bacillus lentus (zrekombinowanej lub typu naturalnego), jednakże podstawienia można wprowadzać w każdej subtilizynie z Bacillus sp.

Na podstawie wyników otrzymanych z niniejszym i innymi odmianami subtilizyn, oczywistym jest, że dla jej aktywności proteolitycznej, funkcjonowania i/lub stabilności oraz funkcji czyszczącej lub myjącej odmian tych enzymów ważne są reszty w odpowiednich pozycjach w hydrolazie karbonylowej (korzystnie subtilizynie), +76, +99, +101, +103, +104, +107, +123, +27, +105, +109, +126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210, +210, +216, +217, +218, +222, +260, +265, i/lub +274 subtilizyny z Bacillus amyloliquefaciens.

Wiele odmian hydrolazy karbonylowej zamieszczonych w wynalazku, zwłaszcza subtilizyn, jest użyteczna w tworzeniu różnych mieszanin detergentowych. Wiele znanych związków nadaje się jako związki powierzchniowo czynne w preparatach zawierających mutanty hydrolazy karbonylowej. Zaliczaią.się do nich: detergenty niejonowe, anionowe, karionowe zawierające kation i anion, jak opisano w amerykańskim opisie patentowym 4,404,128 - Barry J. Anderson i 4,261,868 - Jiri Flora et al. Odpowiednia mieszanina detergentowajest opisana w przykładzie VII patentu amerykańskiego 5,204,015. Produkt tenjest podobny do innych mieszanin, których używa się jako typowego środków czyszczących. Zrozumiałe jest, że oprócz typowych mieszanin czyszczących, odmiany subtilizyny opisane w wynalazku mogą być używane w mieszaninach, w podobnym celu, w jakim dotychczas używane były subtilizyny naturalne lub typu dzikiego. Odmiany te mogą więc być użyte np. w mydłach, mydłach w płynie, płynach do zmywania naczyń, roztworach lub produktach do czyszczenia szkieł kontaktowych, hydrolizie peptydów, oczysz16

178 478 czaniu śmieci, w tekstyliach, jako enzymy do cięcia termicznego w produkcji białek itp. Odmiany wynalazku mogą obejmować wzmocnione (w porównaniu do prekursora) działanie w mieszaninach detergentowych. Wzmocnione działanie w detergencie, według wynalazku, zdefiniuje się jako wzrost właściwości czyszczących plamy wrażliwe na dany enzym tj. krew lub trawa, zwiększone działanie wyznacza się stosując tradycyjne metody po standardowym cyklu prania.

Subtilizyny według wynalazku mogą być w postaci detergentów proszkowych i płynnych o pH pomiędzy 6,5 a 12,0 w ilościach około 0,01 do około 5% (korzystnie 0,1-0,5%) wagowych. Takie czyszczące preparaty detergentowe mogą także zawierać inne enzymy tj. proteazy, amylazy, cellulazy, lipazy lub endoglikozydazy, jak i stabilizatory oraz wypełniacze.

Dodatek subtilizyn według wynalazku do konwencjonalnej mieszaniny czyszczącej nie powoduje żadnych ograniczeń użytkowania. Innymi słowy, każda temperatura, odpowiednie dla detergentu pH może być stosowane w przypadku obecnego preparatu, jeżeli pH mieści się w wyżej wymienionym zakresie, a temperatura jest niższa niż temperatura denaturacji subtilizyny. Subtilizyna według wynalazku może być także stosowana w kompozycjach czyszczących nie zawierających detergentów, zarówno sama jak i w kombinacji z wypełniaczami oraz stabilizatorami.

Poniżej przedstawiono przykłady, nie ograniczając jednak zakresu wynalazku.

Przykład I. Konstrukt do ekspresji genu 0036 w B. subtilis.

Klonowanie i konstrukt do ekspresji genu subtilizyny w B. lentus przeprowadza się tak jak opisano w amerykańskim opisie patentowym nr 5,185,285. Plazmid GGA2/4 (przedstawiony na fig. 4) modyfikuje się tak, jak pokazano na fig. 5. Miejsce cięcia Pst I, wprowadzone podczas konstrukcji plazmidu GGA2/4 usuwa się przez mutagenezę ukierunkowaną na oligonukleotyd opisaną poniżej, oligonukleotydem o sekwencji 5' GAAGCTGCAACTCGTTAAA 3' (sekw'. Nr 1). Podkreślona reszta A wyeliminowała sekwencje rozpoznawalną przez enzym restrykcyjny Pstl i zmieniała w pozycji 2/4, równoważną resztę aminokwasową z reszty alaniny na treoninę. Reszta treoniny w pozycji 2/4 jest resztą aminokwasową subtilizyny typu dzikiego kodowaną przez sekwencję sklonowanego genu subtilizyny z B. lentus. Fragment DNA kodujący subtilizynę otrzymuje się z plazmidu GGA2/4 lub jego pochodnych (GGT2/4 pokazano na fig. 5) przez trawienie EcoRI i BamHI. Fragment DNA wklonowuje się do wektora opartego na bakretiofagu M13, tj. MP19 i przeprowadza się mutagenezę. Po mutagenezże ,trawi się EcoRI i Hindlll, klonuje, aby przenieść gen subtilizyny z powrotem do plazmidu ekspresyjnego takiego jak GGA2/4, w celu przeprowadzenia ekspresji i ponownego pojawienia się zmutowanego białka subtilizyny.

Przykład II. Mutageneza ukierunkowana na oligonukleotyd

Mutagenezę ukierunkowaną na oligonukleotyd wykonano jak opisano w Zoller, M., i wsp. (1983). Methods Enzymol., 100:468-500. Do zmiany reszty aminokwasowej w pozycji /6 z reszty asparaginy (N) na resztę kwasu asparaginowego (D) (lub N/6D) przykładowo zastosowano syntetyczny oligonukleotyd o sekwencji 5'GCTGCTCTAGACAATTCG 3' (Sekw-; Nr 2). Podkreślone reszty G i C oznaczają zmiany w sekwencji genu typu dzikiego. CA zatrzymuje leucynę w pozycji /5 i zmienia sekwencję aminokwasową, umożliwiając wprowadzenie miejsca cięcia enzymu restrykcyjnego Xbal (TCTAGA), podczas gdy GAC zmienia asparaginę +/6 na asparaginian.

W celu przeprowadzenia mutagenezy w pozycjach 99, 101, 103 i 104, używa się różnych oligonukleotydów w zależności od żądanych połączeń mutacji. Na przykład, stosuje się oligonukleotyd o sekwencji 5' GTATTAGGGGCGGACGGTCGAGGCGCCATCAGCTCGATT 3' (Sekw. Nr 3) aby równocześnie zmienić S99D; S10 IR; S103 A i V104V w jednej cząsteczce subtlizyny. Podobnie oligonukleotydy o sekwencji 5' TCAGGTTCGGTCTCGAGCGTTGCCCAAGGATTG 3' (Sekw. Nr 4) i 5' CACGTTGCTACGTTGACTTTAG stosuje się do wprowadzenia odpowiednio Πϋ/ν i N123S. Podkreślone reszty określają zmiany w sekwencji genu typu dzikiego, które produkują żądane zmiany zarówno w sekwencji aminokwasowej jak i sekwencjach rozpoznawalnych przez enzymy restrykcyjne.

178 478

Przykład III. Aktywność proteolityczna odmian subtilizyny

Tabela III przedstawia odmiany otrzymane w przykładzie II oraz aktywność proteolityczną każdej z odmian subtilizyn. Parametry kinetyczne Km, kcat, kcat/Km zmierzono w reakcji hydrolizy peptydu syntetycznego jako substratu: sukcynyl-L-Ala-L-Ala-I.-Pro-L-Phe-nitroanilid metodą opisaną w P.Bonneau, i wsp. (1991) J. Am. Chem. Soc., Vol. 113,No.3, str. 1030. W skrócie, małą ilość odmiany subtilizyny z roztworu wyjściowego dodano do 1 cm kuwety zawierającej substrat rozpuszczony w buforze 0,1 Tris-HCl, pH = 8,6 i termostatowano w 25 °C. Przebieg reakcji śledzono spektrofotometrycznie przez pomiar absorbancji produktu reakcji p-nitroaniliny, przy 410 nm. Parametry kinetyczne otrzymano stosując algorytmu regresji nieliniowej, w celu dopasowania szybkości reakcji i stężenia produktu każdej reakcji do równania Michealis-Menten’a.

Tabela III

Parametry kinetyczne Km, kcat i kcat/Km Mierzone dla subtilizyny i jej odmian z Bacillus lentus

Enzym	kcat (s )	Km (M)	kcat/KM (s^M ’-
B. lentus subtilizyna	170	0.00078	2.18x105
N76D	219	0.0008	2.74x105
N76D/S99D	88	0.00061	1.44x105
N76D/S103A	400	0.0014	2^^
N76D/V104I	459	0.0011	4.17x105
N76D/I107V/	219	0.0011	1.99x10s
N76D/N123S	115	0.0018	6.40x104
N76D/S99D/S101R	146	0.00038	3.84x105
N76D/S99D/S103A	157	0.0012	1.31x105
N76D/S99D/V104I	247	0.00097	2.55x10s
N76D/S101R/S103A	405	0.00069	5.90x10s
N76D/S101R/V104I	540	0.00049	1.10x106
N76D/S103A/V104I	832	0.0016	5.20x10s
N76D/V104M107V	497	0.00045	1.10x106
N76D/V104Y/I107V	330	0.00017	1.90x106
N76D/V104I/N123S	251	0.0026	9.65x104
N76D/I107V/N123S	147	0.0035	4.20x104
N76D/S99D/S101 R/S103 A	242	0.00074	3.27x105
N76D//S99D/S101R/V104I	403	0.00072	5.60x105
N76D/S99D/S103A/V104I	420	0.0016	2.62x105
N76D/S101 R/S 103 AV104I	731	0.00065	U^x106
N76D/S103A/V104I/N123S	321	0.0026	1.23x105
N76D/V104I/1107V/N123S	231	0.003	7.70x104
N76D/S99D/S101R/S103 AA114II	624	0.00098	6.37x105
N76D/S99D/S103A/V104I/N123 S	194	0.0043	4.51x104
N76D/S99D/S101 R/S 103A/V104I/N123 S	311	0.0023	1.35x105

Wyniki zamieszczone w tabeli III wskazują, że wszystkie odmiany subtilizyny poddane badaniom zachowują aktywność proteolityczną. Co więcej, szczegółowa analiza danych pozwą18

178 478 la na stwierdzenie, że aktywność proteolityczna subtilizyny Bacillus lentus ulega znacznym zmianom w zależności od różnych połączeń podstawień reszt aminokwasowych równoważnych z pozycjami 76, 99, 101, 103, 104, 107 i 123 w Bacillus amyloliquefaciens.

Przykład IV. Termiczna stabilność odmian subtilizyny

Porównanie stabilności termicznej obserwowanej dla subtilizyny z Bacillus lentus i odmian otrzymanych według sposobu opisanego w przykładzie II podstawiono w tabeli IV. Oczyszczony enzym, 15 ng/ml w 0,1 M glicynie 0,01 % Tween-80 pH=10,0, w obecności lub braku 50 mM CaCl₂, odmierzono do małych probówek i inkubowano w 10°C przez 5 min., do 60°C ponad 1 min., i 60°C przez 20 min. probówki umieszczono w iodszie na 10 min. Małe d^awki pobierane z probówek dodawano do 1 cm kuwet zawierających 1,2 mM substrat będący syntetycznym peptydem, : sukcynylo-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-nitroanilid rozpuszczony w buforze 0,1 Tris-HCl, pH = 8,6 i tetmostatowany w 25°C. Początkową szybkość reakcji liniowej badano spektrofotometrycznie przez pomiar absorbancji produktu reakcji p-nitroanilinu przy 410 nm w funkcji czasu. Dane przedstawiono jako procent aktywności względem aktywności przed ogrzaniem. Przedstawione w tabeli IV wyniki wskazują, że znaczna większość odmian wykazuje stabilność termiczną porównywalną do subtilizyny Bacillus lentus (24 z 26) w obecności 50 mM CaCl₂. W warunkach doświadczalnych bez dodatku 50 mM CaCl₂ znaczna większość odmian (19 z 26) wykazuje wyższą aktywność od subtilizyny Bacillus lentus. Również odmiany N76/S99D; N76D/V104I; N76D/S99D/V104I; N76D/S103A/V104I; N76D/V104I/1107V; N76D/V104Y/I107V i N76D/S101R/S103A/V104I są znacznie stabilniejsze niż odmiana o pojedynczym podstawieniu N76D w warunkach doświadczalnych bez dodatku 50 mM CaC®

Tabela IV

Stabilność termiczna mierzona dla subtilizyny i jej odmian z Bacillus lentus,. przy pH = 10, 60°C, +/- 50 mM CaCl2

Enzym	% pozostałości początkowej aktywności
- CaCl2	+ CaCl2
1	2	3
B. lentus subtilizyna	2	96
N76D	34	97
N76D/S99D	49	97
N76D/S103A	26	92
N76D/V104I	58	98
N76D/1107V	32	96
N76D/N123S	0	97
N76D//S99D/S101R	30	100
N76D/S99D/S103A	36	100
N76D/S99D/V104I	48	97
N76D/S101R/S103A	26	100
N76D/S101R/V104I	38	100
N76D/S103A/104I	58	100
N76D/V104I/I107V	60	97
N76D/V104Y/I107V	48	74
N76D/V104I/N123S	0	98
N76D/I107Y/N123S	16	100

178 478 ciąg dalszy tabeli IV

1	2	3
N76D/S99D/S101 R/S103A	38	100
N76D/S99D/S101RV104I	33	100
N76D/S99D/S103A/V104I	38	98
N76D/S101 R/S103A/V1041	40	99
N76D/S103 MN 1 041/N123 S	1	98
N76D/V104I/1107V/N123S	3	99
N76D/S99D/S101R/S103 AVH04I	36	99
N76D/S99D/S103A/V104IN123S	2	95 .
N76D/S99D/S10HRS103A/V104I/N123 S	0	100

Przykład V. Mutageneza ukierunkowana na oligonukleotyd z zastosowaniem jako matrycy pojedynczej nici DNA, otrzymanej z fagmidu A. Konstrukcja odmian B. lentus

Sposób przeprowadzenia mutagenezy nie różni się zasadniczo od przedstawionego w przykładzie II. Jedniniciowąmatrycę DNA, otrzymuje się z fagmidu. W celu otrzymania wektora fagmidowego do stworzenia jednoniciowej matrycy DNA, wstępnie konstruuje się wektor pBCDAICAT. Graf ilustrujący konstrukcję wektora przedstawiono na fig. 8. Na początku fragment ClaI - ClaI, kodujący gen CAT z plazmidu pC194 (Horinouchi, S. I Weisblum, El., J. Bacteril., 150: 8-15, 1982) klonuje się do miejsca AccI regionu polilinkera pUC19 (New England Biolabs, Beverly, MA) aby stworzyć plazmid pUCCHL, a fragment EcoRI-Dral 0,6 KB z końca 5' GG36DAI kodującego DNA klonuje się do miejsc cięcia EcoRI i EcoRV plazmidu pBSKS (Stratagene, Inc., San Diego, CA) otrzymując pBC2SK5. Pojedyncze miejsce cięcia EcoRI plazmidu pBC2SK5 eliminuje się przez trawienie EcoRI, a następnie stosuje się polimerazę DNA katalizowaną T4 i liguje się ze sobą aby stworzyć plazmid pBC2SK-5R, nie posiadający miejsca cięcia EcoRI. Fragment EcoRI-DraI, klonowany do pBCSK-5R, izoluje się jako fragment PstlHindlll i klonuje się do miejsca ciecia Pstl-Hindlll plazmidu pUCCHL (część polilinkera pUC19), aby stworzyć plazmid pUCCHL5R. Sekwencję kodującą genu GG36DAI wycina się jako fragment EcoRI-BamHI i klonuje się do miejsca cięcia EcoRI-BamHI pUCCHL5R aby stworzyć pUCCAT. Duży fragment EcoRI-Hindlll pUCCAT klonuje się do miejsc cięcia EcoRI i HindIII BS2KS+, aby stworzyć plazmid pBCDAICAT.

Aby stworzyć pojedynczą nić DNA, komórki E. coli zawierające pBCDAICAT infekuje się fagiem R408 (otrzymanym z Stratagene, San Diego, CA) według opisu Russel, M., Kidd., S.I. Kelley M.R., Gene 45:333-338,1986. Otrzymaną pojedynczą nić DNA poddaje się standartowej mutagenezie, jak opisano w przykładzie II. Konstrukcję niektórych mutantów przedstawiono poniżej w celu zobrazowania wynalazku.

Konstrukcję (GG36) N76D/S103A/V104I/L217H z B. lentus prowadzi się następująco: fragment DNA EcoRI-BamHI kodujący GG36 N76D/S103A/V104I stosuje się do konstrukcji pUCCAT (fig. 8) otrzymując plazmid pBCDAICAT. Po otrzymaniu jednoniciowej matrycy DNA, według opisu zamieszczonego powyżej, stosuje się primer do mutagenezy o sekwencji:

* *** ** _x ClaI

5' TAT GCC AGC CAC AAC GGT ACT TCG ATG GCT 3' (Sekw. nr 13) aby otrzymać L217H., Podobnie jak powyżej, podkreślone reszty opisują wprowadzone zmiany nukleotydów, a x ClaI wskazuje, że miejsce cięcia ClaI zostało usunięte przez mutagenezę. Sposób przeprowadzenia mutagenezy opisano w przykładzie II. Po jej przeprowadzeniu, sprawdza się czy w plazmid DNA zawiera miej sce wiążące ClaI i klony, w których ono nie występuj e poddaje się analizie

178 478 sekwencyjnej DNA, aby sprawdzić sekwencje DNA, względem zmiany L na H reszty aminokwasowej w pozycji 217.

B. Konstrukcja odmian BPN' i ich ekspresja w B. subtilis

Konstrukcję N76D/Q103A/Y104I/Y217L B. amyyt^liiąi^uefaciens (BNF) prowadzi się podobnie, z wyjątkiem dwóch następujących po sobie etapów. N76D wprowadza się do Y217L BPN', aby otrzymać N76D/Y217L BPN', zaś następną mutagenezę przeprowadza się w celu przekształceniaN76D/Y217L BPN' w N76D/Q103A/Y1041/Y217L BPN. Aby otrzymać jednoniciowąmatrycę DNA do pierwszej mutagenezy otrzymuje, konstruuje się plazmid pUCCATFNA z fragmentu EcoRI-BamHI kodującego subtilizyne Y217L BPN' (otrzymana z plazmidu Y217L opisanego w Weil, J., i wsp., PNAS, 84, 5167,1087) (patrz fig. 9). Następnie stosuje się plazmid pUCCATFNA zawierający Y217L BPN' do konstrukcji plazmidu pBCFNACAT (fig. 9). Pojedynczą nić DNA otrzymuje się jak opisano powyżej. Następnie w celu otrzymania BPN' N76D/Y217/L wprowadza się zmianę N76D używając oligonukleotydowego primera o sekwencji:

* *** ** _x xbaI

5' C ACA GTT GCG CTA GAT AAC TCA ATC GGT G 3' (Sekw. Nr 14). Następnie otrzymano jednoniciowe DNA z plazmidu pBCFNACAT zawierającego N76D/Y217L BPN' (plazmid pBCFNACAT po mutagenezie N76D) i poddano mutagenezie z innym oligonukleotydem o sekwencji:

* *** * χ PvuH

5' GCT GAC GGT TCC GGC GCT ATT AGT TGG ATC ATT 3' (Sekw. Nr 15) aby otrzymać N76D/Q103A/Y104I/Y217L BPN'. Wszystkie etapy klonowania, otrzymywania pojedynczej nici DNA, mutagenezy i sprawdzania mutacji przeprowadza się jak opisano powyżej.

Ekspresje genu BPN' jego odmian uzyskuje się przez bezpośrednią integrację plazmidu DNA (pBCFNACAT zawierającego różne warianty genu BPN') ze szczepem Bacillus subtilis wykazującym brak aktywnej proteazy, jak opisano w RE 34,606.

Według wskazówek zamieszczonych w przykładach II i V otrzymano szereg wariantów. Wyznaczono wartości kinetyczne i dane o stabilności tych odmian, według procedury opisanej w przykładzie III. Dane umieszczono w tabeli V. Dane opisujące stabilność otrzymano jak opisano poniżej. Wyniki przedstawiono w tabeli VI.

Analiza stabilności termicznej

Oczyszczony enzym poddano wymienia buforu na 0,1 M. glicynę, pH = 10,0; 0,01% Tween-80 przez naniesienie enzymu na kolumnę wypełnioną złożem Sefadex(Sephadex G-25), zrównoważonym powyższym buforem, którym również wymywano enzym z kolumny.

Do probówki zawierającej 0,1 M glicynę 0,01% Tween-80, pH=10,0 termostatowanej w 60°C, dodano enzym po wymianie buforu tak, że stężenie końcowe enzymy w próbie wynosiło 15 pg/ml. Następnie pobierano próbki w różnym czasie, przerywając inkubacje w 60°C i natychmiast sprawdzano aktywność enzymu przez wprowadzenie próbek do 1 cm kuwet zawierających 1,2 rmM syntetyccnego peptydu,j ako subsltrau: suukynylo--LAlli-lLAla-lLP^ro-lL'.Phe-rniroanilid rozpuszczonego w buforze 0,1 Tris-HCl, pH = 8,6 i termosatowanego w 25°C. Początkową szybkość reakcji liniowej badano seektrofotomerryczn-e przez pomiar absorbancji produktu reakcji ernirroaeiliny przy 410 nm w funkcji czasu.

Czas eółrozeadu, czyli czas niezbędny do dezaktywacji 50% enzymu, otrzymano z pierwszorzędowego wykresu szybkości reakcji w funkcji czasu inkubacji w 60°C.

Dane przedstawiono w tabeli VI jako procent półrozpadu obliczony względem subtilizyny Bacillus lentus (GG36) w takich samych warunkach.

178 478

Tabela V

Enzym	kcat (s'1)	KM(mM)	kcat/KM (β'Μ0
1	2	3	4
Subtilizyna z B.lentus*	170	0.78	2.20E+05
N76D/S103G/V104I	380	1.4	2.70E+05
N76D/S103A/V104F	730	0.33	2.20E+06
N76D/S103A/V104N	790	2.8	2.80E+05
N76D/S103A/V 104S	170	0.83	2.00E+05
N76D/S103A/V104T	370	1.9	2.00E+05
N76D/S103A/V104W	880	0.31	2.80E+06
N76D/S103A/V104Y	690	0.5	1.40E+06
K27R/N76D/V104YNI123 S	500	1.2	4.20E+05
N76D/S101G/S103A/V104I*	620	1.3	4.80E+05
N76D/S103A/V104I/S105A*	550	1.3	4.20E+05
N76D/S103 A/V1041/S105D*	440	1.7	2.60E+05
N76D/S103A/V104T/I107A*	120	5.7	2.10E+04
N76D/S103A/V104T/1107L*	310	3.2	9.70E+04
N76D/S103A/V1041/L126A	90	2.2	4.10E+04
N76D/S103A/V104I/L126F	180	1.9	9.50E+04
N76D/S103A/V104I/L126Ϊ	100	2.4	4.20E+04
N76D/S 103A/V104I/L126V	64	3.2	2.00E+04
N76D/S103A/V104I/S128G*	560	1.7	3.30E+05
N76D/S103A/V1041/S128L*	430	3.8	1.10E+05
N76D/S103A/V104I/L135A	140	0.76	1.80E+05
N76D/S103 A/V104ITL135F	390	0.69	5.70E+05
N76D/S103A/V104I/L135I	110	0.73	1.50E+05
N76D/S103A/V104I/L135V	140	0.86	1.60E+05
N76D/S 103 A/V104I/S156E*	170	2.6	6.50E+04
N76D/S103 A/V1041/S 166D*	160	3.5	4.60E+04
N76D/S103 AJV104I/D197E	510	1.4	3.60E+05
N76D/S 103A/V104I/N204A*	530	1.1	4.80E+05
N76D/S103 A/V104IN204G*	580	1.4	4.10E+05
N76D/S103 A/V104I/N204C *	370	1.3	2.90E+05
N76D/S103AAM 04I/P210I*	500	1.2	4.20E+05
N76D/S103A/V104I/L217H*	80	0.63	1.30E+05
N76D/S103A/V104IM2222A	70	3.1	2.30E+04
N76D/S103A/V104I/M222S	80	3.1	2.60E+04
N76D/S103A/V104I/T260P	660	1.5	4.40E+05
N76D/S103 A/V104I/S265N	590	1.3	4.50E+05

178 478 ciąg dalszy tabeli V

1	2	3	4
K27R/N76D/V104Y/I107V/N123S	220	1.4	1.60E+05
K27R/N76D/V104Y/N23 S/D197E	430	1.1	3.90E+05
K27R/N76D/V104Y/N123 SN2204C	400	1.1	3.60E+05
K27R/N76D/V104Y/N123 S/Q206L	440	1.2	3.70E+05
K27R/N76D/V104Y/N123S/S216 V	440	1.2	3.70E+05
K27R7N76D/V104Y/N123S/N218S	760	0.98	7.80E+05
K27R/N76D/V104Y/N123 ST2260P	410	1.2	3.40E+05
K27R/N76D/V104Y/N 123S'T274A	390	1	3.90E+05
N76D/S103A/V104I/L126F/S265N	170	2.1	8.10E+04
N76D/S103 A/V104I/S156E/S166D*	40	6.3	6.40E+03
K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/G197E	410	0.98	4.20E+05
K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/N218S	540	0.66	8.20E+05
K27R/N76D/V104Y/N123S/D197E/N218S	770	0.79	9.80E+05
K27R/N76D/V104Y/N123S/N204C/N218S	610	0.99	6.20E+05
K27R7N76D/V104Y/N123 S/Q206LN218S	580	0.78	7.40E+05
K27R/N76D/V 104Y/N123 SN218ST2260P	660	1	6.60E+05
K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/T274A	590	0.89	6.60E+05
K27RN76D/V104Y/Q109S/Nl 23 S/N218 S/T274A	520	1	5.20E+05
IK2IRNN7D/V100Y/N123 S/G195E/D197E/N 218S	460	0.65	7.10E+05
Subtylizyna z B.amyloliquefaciens(BPN')	50	0.14	3.60E+05
BPN'-N76D/Y217L*	380	0.46	8.30E+05

* Oznaczone mutanty otrzymano według przykładu V, wszystkie pozostałe według przykładu II

Tabela VI

Enzym	Stabilność termiczna (% półrozpadu naturalnego enzymu)
1	2
Subtilizyna z B. lentus	100
N76D	590
N76D/S99D	840
N76D/S103A	390
N76D/V104I	660
N76D/I107V	710
N76D/N123S	70
N76D/S99D/S101R	610
N76D/S99D/S103A	590
N76D/S99D/V104I	910
N76D/S101R7S103A	930

178 478 ciąg dalszy tabeli VI

1	2
N76D/Si0iR/Vi04I	500
N76D/Si03A/Vi04I	460
N76D/Si01GVi04I*	3/0
N76D/Si01A/Vi04F	480
N/6D/S103A/V104N	230
N76D/Si01A/Vi04S	230
N76D/Si01A/Vi04T	3/0
N76D/Si0lA/Vi04W	280
N76D/Si01A/Vi04Y	400
N76D/Vi04I/Ii07V	940
N76D/V104Y/Ii07V	820
N76D/Vi04I/Ni21S	80
N76D/Ii07V/Ni21S	150
^/R/N/óD^ 104YNJ123 S	100
N/6D/S 99D/Si0iR/Si01A	5/0
^60^9910//5101R/V104I	1000
N76D/S99D/S 103A/V104I	680
W6D/S unC/S 103 AVZ1041 *	390
N/6D/S101R7S103ż/V11 ^41	4/0
N/6D/S103 A/V104I/S105A*	360
N76D/Si01A/Vi 04I/S105D*	3/0
N76D/Si01A/Vi 04T/IW/A*	2/0
N/6D/S103 A/V104T/110/L*	230
N/6D/S103 A/V104I/N123S	110
N76D/Vi04I/n07V/Ni21S	220
N76D/Si01A/V 104I/L126A	2/0
N76D/Si01AA/i04I/Li26F	950
N76D/Si01A/Vi04I/Li26I	410
N/6D/S103 A/V104Σ/Ε126V	320
N/6D/S103A/V104I/S128G *	640
N76D/Si01A/Vi 04I/S128L*	/60 .
N/6D/S 101A/Vi04]/Li15A	230
N/6D/S1 03 A/V1 04I/L135F	200
N/6D/S103 A/V104I/L1351	510
N76D/Si01A/Vi04I/Li15V	500
N/6D/S103A/V104I/S156E*	120
N76D/Si01A/Vi 04I/S166D*	590

178 478 ciąg dalszy tabeli VI

1	2
N76D/S103A/V104I/D197E	460
N76D/S103 A/V104I/N204A*	230
N76D/S103 A/V104I/N204G*	240
N76D/S103A/V104I/N204C*	500
N76D/S103 A/V104I/P2101*	1370
N76D/S103 A/V104I/L217H*	60
N76D/S103 A/V104IM1222A	520
N76D/S103 A/V104I/M222S	490
N76D/S103 A/V104I/T260P	490
N76D/S103A/V104I/S265N	360
K27R/N76D/V104Y/1107V/N123S	210
K27R/N76D/V104Y/N123S/D197E	120
K27R/N76D/V 104Y/N123SN204C	110
K27R/N76D/V104Y/N123S/Q206L	380
K27R/N76D/V104Y/N123S/S216V	140
K27R/N76D/V104Y/N123 S/N218 S	270
K27R/N76D/V104Y/N123STE260P	40
K27R/N76D/V104Y/N123 ST2774A	60
N76D/S99D/S101R/S103 AAG 0II	590
N76D/S99D/S103 A/V104I/N123 S	110
N76D/S 103 A/V1 04I/L126F/S265N	810
N76D/S103A/V104I/S15 6E/S166D*	220
K27R/N76D/V104Y/N123 S/G195E/G197E	90
K27R/N76D/V104Y/N123 S/Gl 95EN1218S	250
K27R/N76D/V104Y/N123S'D>197E/N218S	270
K27R/N76D/V104Y/N123S/N204C/N218 S	460
K27R/N76D/V104Y/:N^^^^/^i^^0^LyT^:218S	1400
K27R/N76D/V104Y/N123 SN218 S/T200P	310
K27R/N76D/V104Y/N123 S/N218S/T274A	180
N76D//S99D/8101R/8103A/V104I/N1238	90
K271RN76D/V104Y/Q109S/N123 S/N2188/T270A	230
K27RN76D/V104Y/N123S/G195E/D197E/N218S	240
Subtiliznea z B. amyloliquefaciens (BPN')	100
BPN' -N76D/Y217L*	420

* Oznaczone mutanty otrzymano według przykładu V, wszystkie pozostałe według przykładu II

178 478

Przykład VI. Test własności czyszczących

Własności czyszczące odmian opisanych w powyższych przykładach określono przez pomiar usuwania plam z krwi, mleka, węgla na próbkach bawełnianych ubrań (EMiPA 116) (Testfabric Inc., Middlesex, NJ 07030).

Sześć próbek EMPA 116, pociętych na części o wymiarach 7,6 x 11,4 cm brzegach wyciętych w ząbki, umieszczono w naczyniach (Model 7243 S Terg-O-Tometer; United States Testing Co. Inc., Hoboken, NJ) zawierających 1000 ml wody, o twardości 15gpg (Ca⁺⁺:Mg⁺⁺: :3:1: :w: w), 7 g detergentu i enzym. Podstawą detergentu jest detergent WFK1 z wfk - Testgewebe GmbH, Adlerstrasse 42, Postfach 13 07 62, D-47759 Krefeld, Niemcy:

Składnik	% mieszaniny końcowej
Zeolit A	25%
Siarczan sodu	25%
Soda bezwodna	10%
Liniowy sulfonian alkilobenzenu	8,8%
Alkohol etylowy (7-8 EO)	4,5%
Mydło sodowe	3%
Krzemian sodowy (SiO2:Na2O::3,3:1)	3%

Do powyższego detergentu podstawowego dodaje się następujące składniki:

Składnik	% mieszaniny końcowej
Kwaśny nadboran sodowy	13%
Kopolimer (Sokalan CP5)	4%
TAED (Mykon ATC Green)	3%
Enzym	0,5%
Rozjaśniacz (Tinopal AMS-GX)	0,2%

Kwaśny nadboran sodowy otrzymano z Degussa Corporation, Rigdefield-Park, NJ 07054. Mykon ATC Green (TAED, tetraacetyloetyleno-diamina) otrzymano z Warwick International, Limited, Mostyn, Holywell, Clwyd CH8 9HE, Anglia. Tinopal AMs-GX otrzymano z Ciba-Geigy Corporation, Greensboro, NC 27419.

Sześć próbek EMPA116 prano w detergencie z enzymem przez 30 min. w 60°C i następnie płukano dwa razy przez 5 min. za każdym razem w 1000 ml wody. Końcowe stężenie dodanych enzymów wynosiło od 0,05 do 1 ppm dla krzywej standardowej i 0,25 ppm dla rutynowej analizy. Próbki wysuszono i uprasowano, a następnie zmierzono odbicie światła od próbek, przy użyciu wartości L na skali L*a*b miernika Minolta Chroma Meter, Model CR-200 (Minolta Coprporation, Ramsey, NJ 07446). Charakterystykę przedstawiono jako procent własności proteazy z B. lentus i (GG36) i obliczono dzieląc ilość proteazy z B. lentus przez ilość odmiany proteazy, koniecznej aby dostarczyć identycznej własności usuwania plam x 100. Dane przedstawiono w tabeli VII.

178 478

T a b e l a VII

Enzym	Własność czyszczenia
Subtilizyna z B.lentus	100
N76D	310
N76D/S103A	230
N76D/V104I	130
N76D/I107V	160
MóD^O/HHR	370
N76D/S99D/S103A	290
N76D/SI01R79103A	130
N76D/9I0IRSV104I	300
N76D/S103A/V104I	320
N76D/9I03GSV004I	160
^D/S^A/y^F	210
N76D/9I03AVI04N	110
^D/S^A/y^T	170
N76D/V1041/1107V	210
N76D/S99D/9101R?9I03A	220
N76D/999D/SI0IRSVI04I	140
N76D/S101G/S103A//VWII	170
N76D/S101 R/S103AA11041	150
N76D/S103 A/V104L/S105 A	170
N76D/S103 A/V104T/1107 A	120
N76D/S103A/V104T/H07L	110
N76D/S103 A/V104I/L166F	110
N76D/S103AIVI041/9128G	280
N76D/S103A/V104L/L135I	160
N76DI9I03A/VI04I/LI35V	160
N76D/S103 A/V104I/D197E	170
N76D/S103A/V 104/Ni204A	160
N76D/S103 A/V104/NI204G	150
N76D/S103A/V104I/P210I	470
N76D/S103AV104LMI222A	100
N76D/9I03AIVI041ST260P	280
N76D/S103 A/V104I/S265N	190

Przykład VII. Stabilność proteazy w detergencie płynnym

Porównanie stabilności proteazy względem dezaktywacji w detergencie płynnym przeprowadzono dla subtilizyny z Bacillus lenlus i jej odmian enzymów N76D/S103a/V104I według procedury opisanej poniżej. Do badań użyto, jako detergentu płynnego płynu do prania Tide

178 478

Ultra, wyprodukowanego w Stanach Zjednoczonych przez Spółkę Procter & Gamie, zakupionego w sklepie. Niezbędne było podgrzanie detergentu, aby dezaktywować proteazę. Osiągnięto to inkubując detergent w 96°C w czasie 4,5 godziny. Następnie do detergentu Tide Ultra poddanego ogrzaniu, dodawano w temp. pokojowej, stężone preparaty subtilizyny i jej odmiany N76D/S103A/V1041 z B. lentus w zakresie 20 g/litr enzymu, do uzyskania stężenia końcowego 0,3 g/litr enzymu w detergencie. Następnie w łaźni wodnej w temp. 50°C, inkubowano detergent poddany ogrzaniu, z dodanąproteazą. Po czym pobierano próbki w 0,24,46,76 i 112 godzinnych przedziałach i badano aktywność enzymu przez wprowadzenie próbek do 1 cm kuwet zawierających 1,2 mM syntetycznego peptydu, j ako substratu: sukcynylo-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-nitroanilidu rozpuszczonego w buforze 0,1 Tris-HCl, pH = 8,6 i termostatowanego w 25°C. Początkową szybkość reakcji liniowej badano spektrofotometrycznie przez pomiar absorbancji produktu reakcji p-nitroaniliny przy 410 nm w funkcji czasu. Jak pokazano na fig. 10, odmiana N76D/S103A/V104I wykazuje znacznie większą stabilność względem inaktywacji w detergencie Ultra Tide, niż natywny enzym B.Lentus. Przybliżone wartości czasu półrozpadu w reakcji inaktywacji w płynie do mycia Tide Ultra, zawierającym te dwa enzymy, w specyficznych warunkach testu wynosi dla subtilizyny Bacillus lentus 45 godzin, podczas gdy dla odmiany N76D/S103A/V104I wynosi 125 godzin.

Wynalazek przedstawia szereg reszt aminokwasowych w konwencji ogólnie znanych trzylub jednoliterowych kodów. Sąone opisane w Dale, J.W. (1989), Molecular Genetics of Bacteria, John Wiley & Sons, Ltd., Appendix B.

W wynalazku opisano korzystne zastosowania odmian wynalazku, jest oczywiste dla specjalistów, że po zapoznaniu się z całością wynalazku, można wprowadzić różne zmiany i równoważne modyfikacje w zakresie przedstawionych zastrzeżeń.

178 478

178 478

CE <1 h-β

5ć' ο

ο <

t «X £

i-i oo ο- I Οι Οβ _ ο

Φ Ο CO I ζ °

Ρ «X _ Ο 5 Ο to «χ

Ο >Ό Ο Ο Φ Ο £ t ο ro ο «X Ο — Ο ® ο— 2 «X

Ο I— «X £Ε — Ο φ κ2 <

_ Ο _c Ο 0— «<

_ ο φ ο CO «X — Ο ο Φ Η_ «X Η- «X r- &

— ·*Χ Ο ο φ f— sE ο _2τΌ Ο Ο

Ο

Ε⁵ = <

=> < 3 t

Ο ro <_> < Ο ro Ο < Ο £1 = ρ

LU Ο CC αΖ α Ο 31= φ ο to «χ ο J5r-O Ο Ο

Ξ»ο «X «X «Λ σ>

ro

Ο οΟ = $ Ο Ο

Ο Ο Ο c Ο σ» «X < <

u. «C φ Ο to ι— ο

>>ο ο ο «X ro ο < Ο

Ο _£5 <-> «χ Ο

- ° a «X Ο ο ο ο ro Ο °? <Ο φ Ο to I

Κί

Γ*»

178 478 «χ ro ο < Ο < Ο ro j— > Ο

S.C 0— ο—ι -*£.

φ Ο £ t £ $ ο ο tn >>

«χ θ C <ζ

Ύ Ο Ο

Ο ro ^> Ο

Ο

Ο Ο

Ο *Ό Ο Ο φ Ο CO 0— sE _ ο ro r~ > Ο •S η ο < Ο

Ο ro Ο

Ο _ Ο φ ο to «X σ>

·*τ

CM

Ο-ί?

«2 δ ro h> Ο .3 < Ο Ο

-2 $ Ο Ο ο ro ί= V > Ο ro Ο < Ο _ Ο ro h> Ο . Ο Φ Ο ŁO <

ο ο. ο ω < «X Ο

£.· £2 ¢= ο _= $ ο ο «X ro ·” > Ο ro ο < Ο _j <χ a $ ο ο (Λ <

<

3ί= _ *< a <-? ι— *χ ro ο «X Ο _Λ _ «X S φ ο ? ΙΟ Iro ο «X Ο ου η

Φ Ο CO ł— <»£ X Ο δ

J9 Ο «X ο ο ο- Ο ο JS Ο < ο ss§ _ < φ ο ŁO Η_ < ro b> Ο

Ο — <5 ο ο _ ο «X ο ο. Ο _ Ο ro ο~ > Ο

Ο φ ο ŁO ►— ο ° — «X ο ο ο ro ο «X Ο

Ο

3-.ΊΧ

Ο re ο < Ο «3 < X Ο «X ro ο < Ο ró? > Ο ο σ> «C X Ο

CO

2 t=

Ο 2 Ο w Ο- Ο φ Ο CO 0—

Φ Ο CO (— ¹⁰ ?£ < Ο ο

3½ *Ό Ο Ο φ Ο to <

«λ *< «X Ο

Ο

SS5

Ο <= ο roi > Ο rot > Ο

42S < Φ ο to (— < ^«ο ο ο a ο (— «X ο a-. «X ο

ο -2>Ο ® ο ο «τ r^.

-53178 478

o ro O <C O		ŁO 5 >- 3 _1 <Ł
-rot > O		< ta > O
O .52 < z: o		ł— ro O < a
h— £ O 1— c		o
< *>o o o	O cn	s t ® o
o .5 <. a: o	19 <	< 03 o CO
ι_ Ha> O CO W-	a> co	< to O < o
C O V) <Ł <		_ o w O co <
C σ> <. <		2 o o. o

a>	H-	ss o
S	<	c o	O CT
c €/> <	k- $	-rot > O	2o O- o
C CZ»	o $	o to o < o	t- ł—

£· o _>o a a ·< 25 O < o o

=s?£ o co o < O „ ^O e-o o

«T

ο. to <£

O tO <£ O

-£ < O O o> O £ t

O ro O < O

Tót > O

O ->O O O

J=?

o o o

£ o _>-O — O O c O V) *ΧΙ < <

a. £7 «t > O < ss o c o o co o < a co O <C O

CO >

O o

<

o <

o O- o < *>o o o — s co ►— 3-0

S o co c

O £t o o «= 9 _ o <

·— ίο ss o «t o o

O O

O >·. c «Λ «C

O c co

CM C

O gZ

Φ	o	t·» 03 O		</>
co	c	CO ł—	ζϊ5
a> co	< o h—	< to o < O	c 9 «Λ «< < <	CZ) -J
	O		c
Φ	o	2>O		Φ
CO	<	c <	O O	CO

- o o _ _ o .c a> O I— co i— <

<c o

° S o

CU O. O

C o D σι r: u < Q- O o «£ O a> O CO t—

S <

a. < <£ _ <c £ o ►— <

o o _ < 03 H> O a> O co ΙΕ O O. o t > O — O o in 5 <

_ O a5 o co c o o <c o c

*«o o o o

>-ϋ O O «t o <£ O

Sao o

h= <t <

a, O co ł— c θ vj «C C <

C F~ ΙΛ < < <

_ o Φ o co <

_ o >. <

_ < — <c o o o ^-o o o u_ O o υ co t— a>

O < O

O co O C O «t > o <

-= <=> ł— <c o ” o o o o

SS S-< < < O w 25 O < < O _>O o ω o

h—

O «t > O

O *- ’ co a> O — CO t—

S Έ O co ł— <

O 2Ό o o a $ a o c

«Λ «Γ < <

«= y «Λ <

<t <

o

O co <

_ o 55 o co c «t O tz oj l— -J O _ O £ o ł— <

o a5 O co C

2= $ O O o a>

S9 <

^5

C θ a eu <£

O>

τχ io

Cd o CL. O <t

-*>a o o o 2tO O O

3O a> ł—i O

O co <

— O S < «= S2 o o o co O < O

JS <

jg <

<

O

O a

o o

co O < o o o o — 2 co £— > O < co O < O

O co t— _ <

CO &> O

O O O c

«5 >

§5o

CU =*<

£o §ts _ o co ►> O _ <

co F> O _ O <0 H>· O

O o o _ o a> O CO t— _ O co F> O o o. o

CO O < O — o

H2 <

ę/>

± o

aZ a>

co r*.

r* o

xr oo o> O CO hS O a. O

O >“S <

o rs.·

Cd σ>

CO cx o

ł“ o

(— «c a

£ o

<

a>

CO

O >Cd -C Cd h1074 ACG TCA ATG GCA TCT CCG CAC GTT GCC GGA GCG GCT GCT HG ATT CU TCT AAG CAC CCG AAC TGG ACA AAC ACT

178 478

O ►— <£

O h—

O o o o _l «£ c >-a o o o

o

H— o

o o

o t— o

o >·. «<

o

I— <.

o o

o o

t— o

o ® o .c ία. i— g ω O cj cz> t— _>s O

O o g E _J o w

_ < -c t— <t

-= S?

h— «£

-y t— <

c O «Λ <ζ C <£ 3 < O o o o

o o

o o

o o

o o

o o

E o

o o

o o

o $

<

$ <t o

<

<

o

LO ej m c ^2 oj o δ

V**	«Μ
1	1	1
BO	CQ	CQ
	1	1
d	d	d
s:	£	Si

δ O CO <

_ o δ o to <

s>8 < o _ o to *— > o <

<

o < α o m o < o <c o o c < 2= < o o o -= H r-~ co Γ7; ej > O o

Ό* •3RS

178 478

KONSERWOWANE RESZTY SUBTILIZYNY Z BAILLUS AMYLOLIQUEFACIENS 1 10 20

A Q

S

V

P

•

G

A

P

A

•

H

•

. G

21 . T

G

s

•

V

K

V

30 A V .

D

9

G

9

9

9

•

40 Η P

41 D L

•

9

o

G

G

A

50 S . V

P

9

•

9

O

9

9

60 Q D

61 . N

o

H

G

T

H

V

70 A G T

9

A

A

L

N

N

s

80 I G

81 V L

G

V

A

P

S

A

90 . L Y

A

V

K

V

L

G

A

100 9 G

101 S G

9

9

S

«

L

•

110 9 G 9

E

W

A

•

N

o

•

120

121 V .

N

o

S

L

G

•

130 P S .

S

9

o

9

9

9

A

140 9 9

141

G

V

•

150 V V A

A

9

G

N

9

G

9

160 9 9

161

Y

P

170 . . Y

9

9

9

9

A

V

G

180 A .

181 D .

9

N

•

•

A

s

190 F S .

9

G

9

9

L

D

9

200 . A

201 P G

V

o

9

Q

S

T

210 . P G

9

9

Y

9

9

9

N

220 G T

221 S M

A

9

P

H

V

A

230 G A A

A

L

9

•

9

K

9

240 9 9

241 W .

o

O

Q

O

R

9

250 9 9

N

T

9

9

9

L

G

260 9 9

261

Y

G

G

L

270 N . .

A

A

9

FIG.

178 478

PORÓWNANIE SEKWENCJI SUBTILIZYNOWYCH Z:

o «0

Φ

Cr o wft: o© c

Φ ί'χιχ: c □ o φ

V) c

Φ

CQQQCQ0Q

04	04	04 04	0	0 0. 0	Ω Ω Ω	K	0 0	0 03
K	K	K K	H	Η Ε» H	Z Z Z	Z	03 03	03 0
03	03	03 «	03	03 El 03	Z Z 0	0	Ei 03	Z <
W	03	< Ei	Z	Z Z Z	Z Z Z	Z	0 0	0 0
Ω	Ω	Ο» 03	z	Z Ω Z	rtj 03 Ei	Z	01 01	03 03
H	t—1	H H	Ω	Ω Ω Ω	Η H E«	0	Z Z	Z z
O	0	0 0		rtj rij «<	< rij		0 0	0 0
W	03	Ei Ei		< < <	Z £ Z	Z		< 03
Ω	Ω	Ω Ω	>	Η > H	01 W 01	01	< rtj	tUj <
H	H	Ω Ω	Ei	E> Ei Ε-· o	Η Η t—I	Ω	O < Kij
		O		r-i			tn
>	>	> > t	0	0 0 0 8-1	0 0 0	0	1-t > <	> >
	<			*Jj < <	Z Z 03	Ot	> >	> >
>	>	> >	>	> > >	Η H >	*5	> >	> Ω
4	14	4 4	K	SKK	Η Η H	H	> H	> >
>	>	> >	E·	Ei Ei Ei	£ £ 0	03	0 0	0 0
Z	Z	Z 0	0	0 0 0	03 03 03	03	03 03	4 4
03	03	< 03	ffi	W K K	>4 >4 Jh	>	< 03	< 03
0	0	0 0	03	03 0 0	Of Ο» 03	03	> >	£h E4
E·	E·	4 E·	Z	03 Z Z	0 0 0	0	< *»!	(< <
;*	>i	04 Ω	Z	0 0 0 O	03 03 03	03	0 4 4	Z 03
		o		O			•8JI
0	0	O 0 U3	Ω	Ω Ω Ω 8-1	0 0 0	0	8-f Ω Ω	Ω Z
σσσρί	C» O E· Ot	Ω Ε» 03	03	S> >	> >
ω	03	< z	04	>i « E·	< 03 03		< >	·< <
w	ffi	Of ffi	04	04 Z 03	0 Ω Z	0	f< Ei	Of Of
Ω	Ω	> <	Z	Z iw 04	Ω Ω Ω	Ω	4 4	4 W
4		4 <	Ε·	Ei «< «	> > >	>	Ω Ω	Z Ω
04	04	Ω 04	W	01 0) 01	4 4 4	4	«< <	«4 Ei
			03	03 0 0	> > >	>	< Ei	Ei <
4		4 Of	04	04 < 04	< 0$ <	d!	03 03	03 03
H	H	H >	>	> > >	>4 >4 >4	5h	O 0 0	0 04
		O		O			n
σσ0 (U m	Z	04 04 04 ΟΊ	Ω Ω Ω	Ω	8-1 03 El	03 03
ω	03	04 03	03	03 03 03	03 03 03	H	04 04	04
>	H	H H	4	0$ f< <	Λ3 < >	·<	0 0	0 03
0	0	0 0	0	0 0 0	03 03 03	03	0 0	0 0
s*	X	>4 £	0	0 0 0	04 04 04	04	Ω Ω	Ω Ω
04	04	04 04		4 > 4	e< 03 (<		03 03	03 03
>	>	> >	>	> > H	> > >	>	Z Z	Z Ω
w	03	Ε· 03	4	Z Z Z	0 0 0	0	z z	Z Z
ot Ci ca of	Ω	Ω Ω Ω	Ω Ω Ω	Ω	8-1 Η H	H <
(<<<!<	Q	Ω Ω Ω co	> > >	>	8-f > >	> >

178 478

<< *łj < <

Z

E<

Z co

s

s

S

>

CL

CL

CL

CL

>

>

>

H

Z

W

Z

Z

Cl

o

w

Q

ić

Z

Z

Z

d

d

d

d

Ui

co

CO

O

w

w

w

O

d

d

d

Z

O

σ σ z

CL

co

H

H

H

>

c

Λί

El

O

ϋ

o

O

d

d

d

d

>

>

*4

o

W

co

co

O

o

<

O

a o w

z

Ch

ΓΟ

r-

d

co

co

co

co

Ci

Ci

>

>

>

4

(4

Cl

Cl

Cl

O

O

O

O

z

z

Z

z

co

co

co

co

H

H

H

>

<

<

>

>

>

>

d

d

d

d

Z

Od

od

Od

w

z

z

Z

o

O

O

o

α

α z

Z

CL

CL

CL

CL

z

z

z

co

z

z

co

Z

CO

Ei

CO

E·

o

o

o

o

co

co

z

Z

<

<

to

to

to

to

co

co

co

α

Z

Z

Z

Z

to

to

to

d

O

Cl

z

Cl

Q

o

CO

co

co

CO

o

CL

Z

z

Z

00

Ci

CD

d

>

>

>

E<

Ci

E·

El

Η

Ei

Ci

co

co

co

El

O

O

O

O

Q

Z

co

co

O

o

u

O

Z

Z

Z

Z

O

o

o

o

>

>

>

>

to

to

d

d

d

d

d

d

<

*<

Ei

co

Z

to

to

co

H

H

H

s

O

o

E*

Ε·

El

El

>

Ε-»

>

to

to

to

to

Ei

45

4

CO

co

co

z

Z

El

El

E*

Ei

Ei

E·

El

CL

Z

Q

Z

o

Z

co

Z

CO

co

z

O

to

>1

to

O

o

O

Ei

o

o

W

K

co

z

l>

d

in

d

Z

z

X

od

Ci

CL

CL

CL

CL

Ci

d

d

d

d

O

4

c

d

d

to

to

CO

Z

z

K

(L

CL

CL

CL

E·

Ei

El

El

CO

Q

z

Z

to

to

to

to

CO

CO

co

co

z

Z

z

Z

O

O

O

CO

ο» α to

o

>

>

>

H

>

>

d

H

H

H

>

>

ασσα

E>

E«

E·

d

co

W

o

z

Ει

co

>

co

CO

Z

>

>

>

z

Z

Z

d

co

E1

Ei

«

r·1

o

O

o

o

d

Ε·

Ei

co

co

CO

O

£

d

co

co

CO

*

Ci

CL

CL

CL

CL

Ci

5

d

Z

fi ι

El cq fi

I d

El

178 478

178 478

178 478

Ο tn

B

6)

B

G

B

β)

B

p-4

B

La

0

W

B

¢3

Β X

2

©

B

¢-4

B

©

0

β)

0

6)

0

f-4

B

&

2

2

W

0

>

B

Sfl

2

w

0

2

B

£3

B

@)

0

¢3

B

0

B

@1

B

©

B

¢-4

□

¢-4

B £

0

¢-4

0

U

B

f-4

B

r-4

B

sa

0

2

B

0

2

0

a,

4

¢-3

2

S-4

0

>

Ei

*=d

0

>1

0

e°d

B

©

0

©

>s

B

<3

0

ed

B

ίΰ

B

¢-4

0

p4

0

¢-4

2

>»

0

>

0

0

0

>

2

W

0

2

0

0

2

B

Li

B

0)

0

3

0

L»

2

0

0

Oa

2

F“1

0

6)

O

B

r4

O

<£

7=d

o

0

.G

O

0

Ll

o

0

Li

O

B

SQ

B

tZ)

7-i

<*

1-4

r-

0

U

m

(i

B

«Ζ»

0

B

&n

B

B

«—i

0

>

B

O

cH

2

□

«—t

0

0«

OJ

2

□

OJ

B

Q.j

m

2

O

«θ’

B

>»

B

r—1

B

©

2

©

2

¢-4

2

eo

0

M

0

p4

2

M

B

¢-3

0

2

0

0

0

2

0

&<

0

0

0

3

B

La

B

c

B

&

0

3

0

fi

B

Li

B

0)

2

>>

Ą

50

B £

B

©

B

(G

0

©

0

«J

B

B

2

2

B

SL

0

s-3

0

>

B

W

<

3

Q

2

©

2

3

2

3

2

Li

B

>>

B

©

>1

0

rd

2

r-d

3

p=d

0

0

0

¢-3

0

¢-3

¢-3

0

2

0

0

0 0

B

W

0

0

«3

O

O

H s

o sn

B

O

B

B

B

O

B

O o

B □

B o

3	B		B	3	< G	< Li
r-d	2 -*4	B	©	2 «-4	0 £
0	0	X	0	U	0 0	< B
rd	B	□	0	<3	0 «3	0 3
«d	B	β)	0	r-4	0 r-4	B ©
>	0	6-3	0	2	0 <	B »J
G	0	3	0	Pi	0 44
e-d	B	©	2	©	B ©	O p4
0	B	6-3	0	2		0 0
3		3	O 0	rd	o 2 M	o β σ»
rd	Ti 2	rd	o- B	(3	m 0 jc	σ> o Η
0	OJ 0	0	OJ 0	>	η < b	n 0 2
•H	B	&	B	Oa	0 M	0 c
*3	B	¢-4	2	ta	0 JC	(£ ©
>	itC	¢-4	0	<ś	2 B	2 2
©	2	□	2		2«-»	B ©
JZ	2	¢-4	2	i-d	B <3	< -4
SL	0	0	0	0	0 >	0 X
3	u	<-4	2	O	“5 3	0 ©
rd	B	(3	0	Li	2 “-4	0 -4
0	0	>	0	0«	0 0	0 2
Li		3	0	Lj	< <3	B «
β)	2	•-4	0	0)	0 p-4	0 P-J
W	0	0	2	W	0 <=£	0 2
rd	0	3	2	3	B O<	2 0
&	2	¢-4	B		©	0 Ij

>

«β f—i &

se i©

I o

o

S³

B tJ 0 3 2

O <$ □

ed u

u o

O	0	Pm	o	2	M	O	0	*Z	o	0	0	O	0	0	O	0	0	o	0	2
c=d	2	©		0	Li	n	2	3	σι	0	3	tn	B	¢-4	p4	2	3	r*	2	G
	2			0	©	Ti	2	r4	5-4	2	r-d	OJ	B	©	<n	2	«d	en	2	rd
	2	eJ		B	W		0	0		0	0		0	>		0	0		0	0
	0	©		2	Li		0	G		B	Li		0	Li		B	©		0	e-4
	2			0	©		2	pd		0	©		0	©		B	r-4		B	©
	2	¢-3		B	W		0	0		B	W		B	ω		2	¢-4		0	>
	0	44		B	Li		0	3		0	□		2	3		B	La		B	ty>
	B	©		0	©		2	rH		B	©		B	©		2			0	t4
	2	S		2	W		0	0		0	6-3		B s-3		Β B		0	2

178 478

F

CD

O Li

O

L)

o

3

rf

O

0

©

0

-P

F

sz

U X

rf

>4

Eh

Φ

0

Li

0

«Ή

Fi

Φ

F

CL

rf F

Eh

Eh

Eh

►4

0

CU

0

rf

4

X

U

La

0 >4

rf

3

rf

>4

0

Li

rf

«—i

rf

©

O

GJ

O rH

Eh

Φ

O

r-4

0

Φ

Eh

©

0

rH

rf

W

0 O

U

aJ

O

o

H

W

0

>

0

rf

f

©

U ©

rf

3

rf

c

Eh

0

Eh

r-a

0

c

u

ł—1

U —H

rf

p-4

rf

rH

0

La

Eh

©

O

o

rf

O rf

O

o

U

0

0

CU

0

>

rf

rf

u

>4

0 Ή

O

©

U

©

0

La

Eh

3

0

©

o

o

r-4

o

F ©

O

o

r-4

O

u

r4

O

0

Φ

O

Eh

Φ

o

U

r-4

Γ

o

o

Π7

O >

cn

o

rf

in

o

rf

«—I

W

Γ-»

0

i-4

m

0

rf

F

>4

in

F o

m

u

Li

K0

Eh

Φ

i

rf

>4

r-

F

r-l

00

Eh

Li

o

r-4

rf -—·

o

Φ

Eh

r—i

0

rH

Eh

©

rf

>4

o

O

U X

rf

Cfl

rf

M

0

0

0

>

Eh

F

F

cn

O Li

o

O

O

La

rf

3

0

>4

F

σ»

o

Ll

U X

u

La

U

Φ

Eh

Φ

0

r-4

0

La

u

fź

rf F

u

04

Eh

W

Eh

►4

0

0

0

F

Φ

U >i

o

©

U

u

F

Li

rf

cn

0

©

F

r—4

0 rH

u

rH

O

Φ

0

Φ

0

Li

0

rH

rf

Hł

O O

o

rf

rf

(0

rf

W

rf

rf

0

rf

F

c

E-ι ©

rf

r-4

U

r—1

0

3

F

Li

0

0

(O

rf »-ł

H

(β

Eh

©

H

Φ

0

Φ

0

La

2

t£

U X

O

>

O

>

Eh

aJ

Eh

V)

0

CU

2

3

u >

U

>1

O

Li

Eh

G

Eh

La

F

Li

F

Φ

O r-l

O

r-4

U

Φ

rf

©

0

X

rf

>4

F

►J

o O

O

o

Eh

w

rf

rf

Eh

Eh

F

U

CU

Eh C

Eh

3

Eh

>4

Eh

©

0

©

0

Li

rf

03

rf ©

Eh

Φ

O

r—1

0

r-4

0

rH

0

Φ

O

rf

rf rf

U

a4

O

0

0

rf

0

rf

rf

cn

O

rf

o

o

0 >i

O

Eh

r-4

O

rf

Ll

o

Eh

rH

o

0

Li

o

0

φ

in

U

u

«—<

o ·-»

r~

Eh

(tl

m

U

Φ

cn

Eh

<o

in

0

Φ

f—a

Eh

r—a

43·

u

CU

Ul

O 0

in

O

>

U)

Eh

C0

vO

0

>

r-

rf

W

GO

rf

a-i

F

©

H Cu

U

>4

Eh

>4

0

©

Eh

C

rf

La

rf

»*4

rf ©

O

r-4

O

rH

rf

--1

rf

©

0

Φ

U

X

O rf

O

o

O

0

0

X

rf

rf

Eh

cn

F

Li

*5 c

Eh

Φ

U

Li

0

X

Eh

rH

0

>4

U

X

rf r-ł

Eh

«—4

O

Φ

Eh

φ

Eh

©

0

r—a

rf

F

U o

rf

M

rf

(0

rf

X

0

>

0

0

U

Li

Eh Li

O

Ll

O

©

0

>4

Eh

©

rf

©

o

0)

υ X

O

Φ

o

rH

0

r-l

0

r-l

0

rH

F

W

rf F

Eh

(0

o

rf

0

0

0

rf

0

rf

F

Φ

U La

Eh

c

o

>4

Eh

c

*

C

Eh

>4

F

r-4

U Φ

4

m

o

l~ł

rf

©

rf

rH

0

»—a

rf

M

Eh cn

rf

rf

o

0

rf

0

0

0

0

F

>4

rf O

U

d

rf

3

0

C

0

3

rf

La

O

r-4

U La

rf!

©

Eh

Φ

4

©

rf

r-a

0

Φ

O

o

U 04

<si

rf

H

►4

rf

rf

0

0

Eh

cn

rf

Li

rf 3

3

rf

rH

0

>4

Eh

3

F

c

U

X

rf r-i

Eh

Φ

(0

0

r-4

Eh

Φ

rf

m

O

rf

F

O

0 o

O

Eh

aJ

o

O

>

o

0

0

O

0

u

O

rf

rf

m

F

Λ

cn

O >1

in

Eh

©

«—i

rf

©

rf

©

n

rf

Li

cn

0

>4

rf

0)

«5?

O r-8

m

U

r-4

<0

rf

>4

W3

0

r-4

r-

0

X

Γ-

0

O

rf

O o

O

4

rf

a-5

0

rf

rf

Fi

0

□

U

3

rf 0

Eh

©

Eh

r-4

0

CU

0

©

F

La

F

Φ

U La

U

r-4

Eh

fti

0

u

0

r-l

0

Φ

U

iJ

U 04

O

rf

O

>

Eh

Eh

0

rf

F

cn

α

r-4

rf <-H

F

Φ

Eh

©

rf

3

Eh

La

rf

©

F

©

Eh <0

Eh

r-4

O

rH

rf

rH

0

Φ

0

*“4

o

>

O >

rf

W

0

rf

0

0

rf

cza

0

rf

a9~ou

178 478 <3

Β

Β

Ο

Ο

Μ >4

Β ki

Λ

850 870 890

SS

ϋ ο

S □

ο ο

ο <

Β

Μ £

Β <3 e4

Η

JS

Η

C ο σ» □ Μ ο «ί *2 Μ 0 £ Β §5

Ο

ο	υ	Φ	Ο	0	«Η	Ο	α	o	0	r-4
«Λ	Ei	U1	Γ—i	0		Β 2	<	CO	0	<
σ>	Β	>4	Ο	<	β)	Ο 0	α	4-1		□
	0	«—1	«Η	0	«-Η	Μ ί£	>4	¢-4	2	r4
	□	0		0		*ε	»4		0	0
	C	0		<	«0		□			<0
	0	Μ		0	<r-J	Β	Φ		0	^4
	υ	CL		0		0	»4		0	<
	υ	ki		Β	>1	Β	α		B	c
	<			0	*—ί	α, -ή			n
	Β	Β		0	0	0 X		2
	<	ki		<	(θ	Β	C		0	j—J
	□ £		0	r-4	<	Ε0		B	10
	<	Β		0		2	<		0	>
	Ο	ki		Β	*4	0	σ»		B	3
	0	0)		Β	Λ	0	kl		B	tt
	<	«Λ		0	>	0	<		0	t4
	0	C		Β	η	ο	φ			>4
	<	f4			•*4	Β	»—5		0
	□	0		0 X	(ί	H		0	0
ο	0	r4	Ο	Β	0	ο 2	C	O	0	kl
η	Β	fS	σ»	0	ki	tn dj	«-4		0	tt
σ\	0	>	εη	0	04	Ο 0	0	»-4	*5	1Λ
	0	ε:		Β	Μ	*Η <	«—1	e-ł	2	>4
	»β“	α		0 £	Β	(0		0	,-4
	(ί			<	Β	0 >		0	0
	¢3°	e-4		Β	(0	Β	c		B	kl
	Β	ίΰ		0	r-J	<	09		<	>4
	0	>		0	<	2	*c		B	B
	Β	>4		0	4J	ο	kl		0	3
	0	•*4		Β	0)	0	tt		B	tt
	0	0			Β	w		B	»4
	<	0		0	kl	0	Pl		0	C
	U	kl		0	tt	0	kl		<	09
	0	CL		Β	ω	Β Β		2
	<	«0		<	kl	Β	kl		0	kl
	0	r4		0 £	0	tt		0 £
	0	<		<	Β	Β	W		<	B
	0	«Η		Β	>4		0		0	kl
	Β	10		0	r4	0	kl		0	tt
ο	0	>	ο	0	0	Ο 0	CU	O	<	W
V1	Β	θ)	Γ~	0	C	η 0	c	04	2	>4

σ*

	83	O
to	to	to
0	8	8
d	d	d
G:	El	El

Β

Ο

Ο

Β

Β □

Ρι α

<

□

0) «4 σ>

Ο ϋΗ ΗΟϋ < 3

Η

Η

Ο &

Μ

0)

W

178 478

φ	H C	E-i 0)	E-ł »-4
JC	< o	E-J r-4	H ©
CU		< W	0 >
©	Η ©	O ©	H 0
r-ł	Η Λ	U r-i	α m
<	H CU	O <&	U Λ
	□	U r-4	H OJ
©	0 -4	Η «i	H »-ł
>	0 O	0 >	< H

Ο m

ο ro

	E->	u		U	ki		H ©
	O	©		O	©		0 r-4
	E-i	so		rf	SO		0 rf
	Ε-»	0)		H	©		E-l r-4
	f-«	r-4		H	r-ł		H ©
	<©	W		rf	W		0 >
	O	ee		2			rf ©
	O	f—4		o	r-4		2 >*
	0	&		0	0		2 *-4
	*	0		o	cu		<© r-4
O	0		O	o	kł	O	B ©
o\	o	CU	m	H		r-i	0 >
OJ	H	CU	ro	rf	0	't?	£-4 >i
	<c	18		U	ki		0 r-4
	o	&		u	CU		0 0
	u	3		o	*“*}		H ki
	l·*	&		H	©		O ©
	u	»4		0	>		H W
		3		rf	ki		H >i
		r-J		U	©		0 r-i
	o	O		H	to		0 0
	H	3			c		rf ki
	E«	©		2	r—ί		U £5
	U	eJ		□	0		rf B
	0	t3		0	©		0 3
	u	r-i		u	r-4		B ©
	o	rf		o	rf		H «-3
	o	CU		o	4J		rf
	&	«		H	©		0 r-ł
	0	rf		rf	X		0 0
O	0	6“ł	o	2	ki	O	H Oh
o-		©	Γ0	u	jC	O%	0 ks
OJ	0	>	ro	rf	H	ro	U rf
	H	Oa		a	k3		U c
	rf	a		u	£		rf ©
	0	rf		rf	H		rf rf
	rf	3		2	cH		£h ©
	2	r-4		H	<e		rf -H
	0	0		0	>		a ae
	rf	0		*s	3		u ©
	O	kj		2			0 r-i
	o	CU		o	0		0 rf
	u	ki		rf	©		H 2
	0	©		u	r-i		0 r-ł
	rf	so		0	rf		0 rf
	2	3		Ε-»	CU		rf 0
		©		rf	©		0 M
	H		0	rf		0 CU
	o	3		0	3		0 ©
	rf	cH		rf	r-4		0 r-i
O	0	o	O	0	0	O	0 rf
ŁD	H	«-4	w	rf	3	O-	rf 2
OJ	H	©	ro	2	r-i	ro	2 -·
	0 >		0	0		0 0
	U	ki		H	©		0 r-ł
	0	©		H	»—i		B ©
	H	SO		rf	w		0 >
		3		H	ki		B 0*
	H	©		rf	>.		0 M
	H *4			£ί		0 rf

FIG._ 7A

178 478

Ει ©

0

ta

0

ta

0

□

di

0

0

13

0

4J

Ει £,

0

rf

rf

to

E

©

0

ta

0

a-4

E

©

Ε Ζ

2

E

E

E

E

c-3

0

CL

63

rf

2

X

0 ta

0

to

rf

□

2

to

0

ta

rf

ta

2

«3

0 ©

0

ta

E

©

0

(*-5

0

©

E

¢3

0

ϋί 60

0

0

0

id

0

0

E

60

0

>

0

2

El «δ

0

<3

3

2

C

E

0

E

ta

0

d

U ta

0

ta

2

ta

2

•—5

0

ta

E

<3

2

a

0 rf

0

2

0

0

0

0

0

CL

63

>

2

rf

Ο to

0

63

<0

0

<3

0

ta

E

3

0

2

Ο

0 ta

O

E<

«3

O

0

ta

o

o

f=3

O

0

©

o

E

©

o

0

o—5

to

63 0

to

0

>

O*

0

2

&o

0

rf

ta

6/3

to

U

ffO

0

rf

Ει to

60

Ei

a

60

□

ta

60

E

©

to

2

to

to

E

«=-}

ω

E

ta

63 ta

2

ta

0

©

E

ta

0

ta

E

<3

rf

to

63 0

U

ss

rf

6/3

«i

ta

0

0

63

>

E

E

Ei G»

63

ta

0

O

0

ta

di

□

0

to

E

636

63 ta

0

rf

0

ta

0

©

E

©

0

ta

0

ta

O di

2

E

0

CL

E

60

E

»4

0

0

0

2

Ei ®

0

to

0

<3

0

ta

E

ta

rf

Cń

0

E ta

0

0

r—4

0

©

0

©

0

ta

0

f—ł

rf M

0

0

0

2

di

6/3

rf

(0

rf

rf

0

2

Ei C

Ei

33

rf

r-4

0

©

0

3

E

ta

0

O

rf o

2

-ta

E

<o

E

ta

E

©

0

©

0

ta

2 &

0

SS

0

>

di

ta

E

U

E

60

0

CL

2 3

0

to

0

to

0

<3

E

c

E

ta

E

ta

Ei ©

0

«ta

0

0

ta

rf

ffl

0

X

rf

to

E t-3

0

0

0

0

0

rf

2

rf

E

E

E

0 0«

E

C

E

3

0

to

E

2

0

(3

0

ta

rf β

2

α

E

©

0

ta

0

0

ta

0

©

63 Λ

2

2

0

0

0

0

rf

0

rf

rf

60

ο

2 0

O

0

to

O

E

i—}

o

ta

O

E

ta

o

0

ta

o

0

©

ΙΟ

0 ta

«-1

0

«ta

to

E

«J

n

0

©

σ»

E

d

60

0

©

ta

E

ta

ί?

U Z

60

0

0

ŁO

0

>

ω

E

6/3

UD

0

>

to

rf

w

«a

2

ta

Ε» 0

E

Pa

0

to

E

to

U

ffi

E

G

2

ta

rf ta

2

a

0

f—φ

0

r-3

rf

ta

a

0

©

U SC

0

0

0

0

0

0

2

rf

E

60

Ei ta

2

E

©

U

ta

0

4J

E

ta

0

to

O rf

2

r=*5

E

«ta

0

©

E

©

E

<3

0

ta

rf Ε»

0

0

rf

ta

2

60

rf

X

0

>

0

0

U ta

E

ta

0

ta

0

(3

0

to

E

(3

2

a

U ©

0

JZ

0

©

0

ta

0

ta

0

ta

0

ta

E W

2

E

E

to

0

«i

0

63

0

rf

0

2

E ©

0

ta

0

c

0

to

E

C

2

C

E

to

E ta

0

©

a

0

rf

a

2

ta

0

ta

υί M

E

60

2

di

0

0

2

2

0

0

0

0

Ei to

2

0

0

Pa

2

3

O

c

0

3

rf

ta

63 ta

α

ta

rf

53

E

©

rf

a

rf

ta

0

©

63 63

0

CL

0

2

E

e-J

2

rf

0

0

E

60

<rf ta

2

3

rf

3

di

0

to

E

3

E

c

0 rf

2

«ta

E

©

E

<β

0

*-4

E

©

2

a

Ο

rf E<

O

0

0

O

E

iJ

o

0

>

O

0

0

O

0

o

2

rf

m

E &

0*

o

to

IO

E

(3

ta

rf

©

to

rf

d

n

rf

ta

Oł

0

to

rf 0

0

ta

IO

0

i©

2

to

60

0

ta

to

0

JS

to

0

«*4

0 rf

0

0

0

di

2

0

rf

rf

E

0

0

U 3

O

E

d

E

ta

0

CL

0

<3

E

ta

H ©

0

ta

0

0—5

E

¢3

0

ta

0

0

©

U U

0

CL

0

di

0

>

E

E

0

rf

E

60

0 ta

2

e—i

E

©

E

c3

rf

3

E

ta

rf

<3

Ei <3

E

(3

E

ta

0

ta

rf

0

©

0

^9

0 >

0

>

ta

0

rf

0

0

rf

co

0

rf

178 478

Ο ο r-l

Ο υ ο ο ο υ

υ ο

Η <

Η □

Φ

Κι >8

Η

Μ χ:

□

Μ £

Η

Φ β-Η <

kl £

<

ο»

Μ

Μ χ:

Η <0

0

0

“5

Η

0

Ω

<

Η

0

4

Η

Μ

2

ki

0

(0

Η

C

0

2

Ο

>»

Ο

υ

Φ

Ο 0

rH

ο

α

Ο

0

*“2

ω

Η

Η

ιη

Η

ΙΛ

4-1 0

r-

2

<

<η

0

ω

0

C

σ»

Η

>4

Ο <

2

ο

0

ο

ϋ“4

<

3

<

r-4

0

ρα}

ΓΗ 0

Μ

4“4

>1

e-4

2

f-4

0

0

0

0

0

*

fi

Ω

0

0

λ:

Μ

<

0

<

2

fi

3

<

Φ

0

Φ

0

Μ

0

<Η

Η

Φ

0

t^3

η

Η

Η

Η (0

Φ

Λ «ζ >9

Ω

Β>

Η <

Η

Μ >8

Η

Η 0 0 0

Η *£ m

<

	0	u	«Φ	kl	t£. Φ		H	C	0 r-i
	0	φ	0	£	0 M			a	Η Φ
	<	<η	<	Ei	0 <		2	<	0 >
	0	φ	0	kl	Η «-Ι		0	03	H 3
	0		0	Φ	Η Φ		0	M	H ©
	0	*c		0)	0 >		0	<	0 Ω
	0	03	0	G	Η o		0	Φ	< >·
	0	u	<	·—3	<t£ Ω		H	r4	0 r-4
	0	*	0	0	0 X		rf!	W	0 0
ο	0	c	O 0		OHO	O	2	c	O 0 H
Γ-		o	η H	Φ	03 0 ki	tn	ej;	Ω	r4 0 Φ
ΟΟ	2		03 0	>	03 0 CU	O	0	0	r-i & W
	0	c	0	£	H kl	4“ł	4	«“I	«-!<>,

< 0)	0 £	Η Φ	0 -4
2 <	< H	0 >	0 0
(¾ ·—1	Η Φ	H C	H ki
Η Φ	0 r-J	«£ 03	< >9
0 >	0 <	2 <	Η H
H >9	0 4J	0 kl	0 3
0 r-5	H ©	0 Φ	Η Φ
0 0	< X	Η W	Η Ω
< o	0 ki	0 A	0 C
0 kl	0 Φ	0 ki	ot m
0 Aa	H W	Η H	2 <
< Φ	< ki	H ki	0 kl
0 r-4	0 £	0 Φ	0 X
0 <	< H	H W	< H
0 r4	H >4	< O	0 ki
Η Φ	0 r-l	0 kl	0 Φ

O

0

<

o

0

>

o

0

0

O

0

{k

O

t£ CO

tn

&

4-1

H

Φ

Γ—

0

G

n

0

c

03

2 >5

GO

0

p—i

03

H

p—J

03

03

o

03

o

0 r-4

Ο Η 0 aS 0 &

Φ >

tC

Η

Η

Ο.

<

Φ

Ω

0

Η

Η

Φ

Ω kl φ

W

5 1 6 iu

ś d u:

o K I O LU

FSG..7

<3 «Ε

178 478

O X c

> - 2 £ o 5 -* o .2 ω iu c $

Σ -o c (t co <u £ E >, CD _Λ Ci 2 φ -»-* »*— '0 ° > q> >> -N ~f -Q 3 O CU Ό

O o

UJ

Cięcie EcoRI, wypełnianie polimerazą T4 DNA i dNTPs i religacja co θ' co

CD

(0

O ω

178 478

178 478 _>~ £ŻCC = CLUjUłl

Cięcie EcoRI, wypełnionego polimerazą T4 DNA i dNTPs i religajca

I	V
E	h-		—
CO	<	w	X3
CD	O	0-	C
			ΐ

O><o o

ω

178 478

	• Τ -
3		©
σ>		σ>
d		d
Ε		Ε
1____

178 478

% POZOSTAŁEJ AKTYWNOŚCI >N □

O

O ω

<

N

O

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims (10)

1. Zastrzeżenia patentowe.

   1. Odmiany subtilizyny, znamienne tym, że ich sekwencja aminokwasowa nie występuje w przyrodzie i otrzymuje się jąz prekursorowej subtilizyny i sekwencja ta zawiera podstawienia innych reszt aminokwasowych w miejsce większości reszt aminokwasowych w pozycjach równoważnych z:

   76/99, 76/101, 76/103, 76/104, 76/107, 76/123, 76/99/101, 76/99/103, 76/99/104, 76/101/103, 76/101/104, 76/103/104, 76/104,107, 76/104/123, 76/107/123, 76/99/101/103, 76/99/101/104, 76/99/103/104, 76/101/103/104, 76/103/104/123, 76/104/107/123, 76/99/101/103/104, 76/99/103/104/123, 76/99/101/103/104/123, 76/103/104/126, 76/103/104/135,

   76/103/104/197, 76/103/104/222, 76/103/104/260, 76/103/104/265, 76/103/104/126/265, 27/76/104/123/274, 27/76/104/109/123/274, 27/76/104/123/218/274, 27/76/104/123, 27/76/104/107/123, 27/76/104/109/123, 27/76/104/109/123/218/274, 27/76/104/123/197, 27/76/104/123/204, 27/76/104/123/206, 27/76/104/123/216, 27/76/104/123/218, 27/76/104/123/260, 27/76/104/123/195/197, 27/76/104/123/195/218, 27/76/104/123/197/218, 27/76/104/123/204/218,27/76/104/123/206/218, 27/76/104/123/218/200, 27/76/104/123/195/197/218, 76/103/104/217, 76/103/104/156, 76/103/104/166, 76/103/104/105, 76/101/103/104, 76/103/104/128, 76/103/104/210, 76/103/104/107, 76/103/104/204, 76/217 i 76/103/104/156/166.
2. 2. Odmiany subtilizyny według zastrz. 1, znamienne tym, że połączenie podstawień występuje w pozycjach równoważnych do:

   76/99. 76/101, 76/103, 76/104, 76/107, 76/123, 76/99/101, 76/99/103, 76/99/104, 76/101/103, 76/101/104, 76/103/104, 76/104/107, 76/104/123,76/107/123, 76/99/101/103, 76/99/101/104, 76/99/103/104, 76/101/103/104, 76/103/104/123, 76/104/107/123, 76/99/101/103/104, 76/99/103/104/123; 76/99/101/103/104/123; 76/103/104/128; 76/103/104/260;

   76/103/104/265; 76/103/104/197; 76/103/104/105; 76/103/104/135; 76/103/104/126; 76/103/104/107; 76/103/104/210; 76/103/104/126/265 i/lub 76/103/104/222.
3. 3. Odmiany subtilizyny według zastrz. 1 wybrane z grupy zawierającej podstawienia reszt aminokwasowych w pozycjach równoważnych do:

   76/99, 76/104, 76/99/104, 76/102/104, 76/104/107,76/101/103/104, 76/99/101/103/104 i 76/101/104.
4. 4. Odmiany subtilizyny według zastrz. 2, znamienne tym, że odmiany subtilizyny zawieraj ą podstawienia:

   N76D/S99D; N76D/S101R; N76D/S103A; N76D/V104I; N76D/I107V; N76D/N123S; N76D/S99D/S101R; N76D/S99D/S103A; N76D/S99D/V104I; N76D/S101R/S103A; N76D/S101R/V104I; N76D/S103A/V104I; N76D/V104I/I107V; N76D/V104Y/I107V; N'76D/V104I/N123S; N76D/I1D7V/N123S; N76D/S99D/S101R/S103A; N76D/S99D/S101R/V104I; N76D/S99D1S103A/V104I; N76D/S101R/S103A/V104I; N76D/S103 A/V104I/N123S; N76D/V104I/Z107V/N123S;

   N76D/S99D/S101R/5103 A/V104I; N76D/S99D/S103A/V104I/N123S;

   N76D/S99D/S101 R/S103A/V104I/N123S; N76D/S103A/V104I/S128G;

   N76D/S103 A/V104Z/T260P; IT 16D/S103A/V104I/S265N; N76D/S103 A/V104I/D197E; N76D/5103A/V104I/S105A; N76D/S103A/V104I/L1351; N76D/S103A/V104I/L126F; N76D/5103 A/V104T/L107T; NZ6D/S103A/V104I/P210I;

   N76D/S103 A/Y104I/L126F/S265N i N76D/S103A/V104T/M222A.

   178 478
5. 5. Odmiany subtilizyny według zastrz. 4, znamienne tym, że odmiany subtilizyny zawieraj ą podstawienia:

   N76D/S99D, N76D/V104I, N76D/S99D/V104I, N76D/S103A/V104I, N76D/V104I/I107V, N76D/V104Y/1107V, N76D/S101 R/S 103A/V1041, N76D/S99D/5101 R/S103 AW104I i N76D/S101R/V104I.
6. 6. Odmiany subtilizyny według zastrz. 2, znamienne tym, że otrzymuje się jąz subtilizyny z Bacillus.
7. 7. Odmiany subtilizyny według zastrz. 6, znamienne tym, że otrzymuje się jąz subtilizyny z Bacillus lentus.
8. 8. DNA kodujące odmiany subtilizyny znamienne tym, że kodowana sekwencja aminokwasowa nie występuje w przyrodzie i otrzymuje się jązprekursorowej subtilizyny zwierającej podstawienia innych reszt aminokwasowych w miejsce większości reszt aminokwasowych w pozycjach równoważnych z:

   76/99, 76/101, 76/103, 76/104, 76/107, 76/123, 76/99/101, 76/99/103, 76/99/104, 76/101/103, 76/101/104, 76/103/104, 76/104,107, 76/104/123, 76/107/123, 76/99/101/103, 76/99/101/104, 76/99/103/104, 76/101/103/104, 76/103/104/123, 76/104/107/123, 76/99/101/103/104, 76/99/103/104/123, 76/99/101/103/104/123, 76/103/104/126, 76/103/104/135,

   76/103/104/197, 76/103/104/222, 76/103/104/260, 76/103/104/265, 76/103/104/126/265, 27/76/104/123/274, 27/76/104/109/123/274, 27/76/104/123/218/274, 27/76/104/123, 27/76/104/107/123, 27/76/104/109/123,27/76/104/109/123/218/274, 27/76/104/123/197, 27/76/104/123/204, 27/76/104/123/206· 27/76/104/123/216, 27/76/104/123/218, 27/76/104/123/260, 27/76/104/123/195/197, 27/76/104/123/195/218, 27/76/104/123/197/218, 27/76/104/123/204/218, 27/76/104/123/206/218, 27/76/104/123/218/200, 27/76/104/123/195/197/218, 76/103/104/217, 76/103/104/156, 76/103/104/166, 76/103/104/105, 76/101/103/104, 76/103/104/128, 76/103/104/210, 76/103/104/107, 76/103/104/204, 76/217 i 76/103/104/156/166.
9. 9. Wektory ekspresji, znamienne tym, że zawierają DNA kodujące odmiany subtilizyny, przy czym kodowana sekwencja aminokwasowa nie występuje w przyrodzie i otrzymuje się jąz prekursorowej subtilizyny zwierającej podstawienia innych reszt aminokwasowych w miejsce większości reszt aminokwasowych w pozycjach równoważnych z:

   76/99, 76/101, 76/103, 76/104, 76/107, 76/123, 76/99/101, 76/99/103, 76/99/104, 76/101/103, 76/101/104, 76/103/104, 76/104/107, 76/104/123, 76/107/123, 76/99/101/103, 76/99/101/104, 76/99/103/104, 76/101/103/104, 76/103/104/123, 76/104/107/123, 76/99/101/103/104, 76/99/103/104/123, 76/99/101/103/104/123, 76/103/104/126, 76/103/104/135,

   76/103/104/197, 76/103/104/222, 76/103/104/260, 76/103/104/265, 76/103/104/126/265, 27/76/104/123/274, 27/76/104/109/123/274, 27/76/104/123/218/274, 27/76/104/123, 27/76/104/107/123, 27/76/104/109/123, 27/76/104/109/123/218/274, 27/76/104/123/197, 27/76/104/123/204, 27/76/104/123/206, 27/76/104/123/216, 27/76/104/123/218, 27/76/104/123/260, 27/76/104/123/195/197, 27/76/104/123/195/218, 27/76/104/123/197/218, 27/76/104/123/204/218, 27/76/104/123/206/218, 27/76/104/123/218/200, 27/76/104/123/195/197/218, 76/103/104/217, 76/103/104/156, 76/103/104/166, 76/103/104/105, 76/101/103/104, 76/103/104/128, 76/103/104/210, 176/103/104/107, 76/103/104/204, 76/217 i 76/103/104/156/166.
10. 10. Komórka gospodarza transformowana wektorami ekspresji zawierającym DNA kodującym odmianę subtilizyny, przy czym· kodowana sekwencja aminokwasowa nie występuje w przyrodzie i otrzymuje się jąz prekursorowej subtilizyny zawierającej podstawienia innych reszt aminokwasowych w miejsce większości reszt aminokwasowych w pozycjach równoważnych z: 76/99, 76/101, 76/103, 76/104, 76/107, 76/123, 76/99/101, 76/99/103, 76/99/104, 76/101/103, 76/101/104, 76/103/104, 76/104/107/76/104/123, 76/107/123, 76/99/101/103, 76/99/101/104, 76/99/103/104, 76/101/103/104, 76/103/104/123, 76/104/107/123, 76/99/101/103/104, 76/99/103/104/123, 76/99/101/103/104/123, 76/103/104/126, 76/103/104/135,

    76/103/104/197, 76/103/104/222, 76/103/104/260, 76/103/104/265, 76/103/104/126/265,

    178 478

    27/76/104/123/274, 27/76/104/109/123/274, 27/76/104/123/218/274, 27/76/104/123, 27/76/104/107/123, 27/76/104/109/123, 27/76/104/109/123/218/274, 27/76/104/123/197, 27/76/104/123/204, 27/76/104/123/206, 27/76/104/123/216, 27/76/104/123/218, 27/76/104/123/260, 27/76/104/123/195/197, 27/76/104/123/195/218, 27/76/104/123/197/218, 27/76/104/123/204/218,27/76/104/123/206/218, 27/76/104/123/218/200,

    27/76/104/123/195/197/218, 76/103/104/217, 76/103/104/156, 76/103/104/166,

    76/103/104/105, 76/101/103/104, 76/103/104/128, 76/103/104/210, 76/103/104/107, 76/103/104/204, 76/217 i 76/103/104/156/166.

    Obecny wynalazek jest częściowa, kontynuacją zgłoszenia wynalazku amerykańskiego, nr 08/137,240 z dn. 14 października 1993, który jest zamieszczony jako odnośnik.