CZ289323B6 - Izolovaná varianta subtilisinu - Google Patents

Izolovaná varianta subtilisinu Download PDF

Info

Publication number
CZ289323B6
CZ289323B6 CZ19961065A CZ106596A CZ289323B6 CZ 289323 B6 CZ289323 B6 CZ 289323B6 CZ 19961065 A CZ19961065 A CZ 19961065A CZ 106596 A CZ106596 A CZ 106596A CZ 289323 B6 CZ289323 B6 CZ 289323B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
subtilisin
amino acid
equivalent
precursor
bacillus amyloliquefaciens
Prior art date
Application number
CZ19961065A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ106596A3 (en
Inventor
Thomas P. Graycar
Richard R. Bott
Lori J. Wilson
Original Assignee
Genencor International, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genencor International, Inc. filed Critical Genencor International, Inc.
Publication of CZ106596A3 publication Critical patent/CZ106596A3/cs
Publication of CZ289323B6 publication Critical patent/CZ289323B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38609—Protease or amylase in solid compositions only
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Separation Of Suspended Particles By Flocculating Agents (AREA)
  • Fats And Perfumes (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Izolovan varianta subtilisinu se sekvenc aminokyselin obsahuj c °adu substituc jin²mi p° rodn mi aminokyselinami, p°i em tyto substituce se nach zej (a) v prekurzoru subtilisinu v poloze, ekvivalentn poloze +76 v substilisinu Bacillus amyloliquefaciens, p° rodn aminokyselina pro substituci se vol ze skupiny A, R, N, C, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y a V a (b) v jedn nebo v t mu po tu poloh v prekurzoru substilisinu, ekvivalentn ch poloh ch +27, +99, +101, +103, +104, +105, +107, +109, +123, +126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210, +216, +217, +218, +222, +260, +265 a +274 subtilisinu z Bacillus amyloliquefaciens, p°i em aminokyselina v poloze prekurzoru subtilisinu, ekvivalentn poloze +195 v subtilisinu z Bacillus amyloliquefaciens je substituov na odli n²mi p° rodn mi aminokyselinami, kter se vol ze skupiny A, R, N, D, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y a V a aminokyselina v poloze prekurzoru subtilisinu, ekvivalentn poloze +206 v subtilisinu Bacillus amyloliquefaciens je substituov na odli n²mi p° rodn mi aminokyselinami ze skupiny A, R, N, D, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y a V.\

Description

Izolovaná varianta subtilisinu
Oblast techniky
Vynález se týká nových variant karbonylhydrolázy, v jejichž řetězci aminokyselin je nahrazena řada zbytků aminokyselin prekurzoru karbonylhydrolázy, zvláště v poloze, odpovídající nebo ekvivalentní zbytku v poloze +76 v kombinaci s jedním nebo větším počtem zbytků v polohách 99, +101, +103, +104, +107, +123, +27, +105, +109, +126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210, +216, +217, +218, +222, +260, +265 a/nebo +274 v karbonylhydroláze Bacillus amyloliquafaciens (substilisinu) jinými zbytky aminokyselin. Takové mutanty nebo varianty karbonylhydroláz je obecně možno získat modifikací prekurzorového kódového řetězce DNA pro přírodně se vyskytující nebo rekombinantní karbonylhydrolázu na kódový řetězec pro jiné zbytky aminokyselin jednotlivě nebo v kombinaci s dalšími substitucemi, zařazením nebo vypuštěním dalších aminokyselin v prekurzorovém řetězci aminokyselin.
Serin proteázy tvoří podskupinu karbonylhydroláz. Tyto enzymy zahrnují enzymy různých skupin, specifické pro různé biologické funkce podle publikace Stroud R., Sci. Amer., 131:74 88. Navzdory funkční odlišnosti těchto enzymů jsou typickými představiteli těchto enzymů dvě geneticky odlišné skupiny těchto enzymů, a to subtilisiny a chymotrypsin savců spolu s homologní bakteriální serinproteázou (například trypsin a trypsin z S. gresius). Tyto dvě skupiny seriproteáz mají značně podobný mechanismus katalýzy podle Kraut J., 1977, Ann. Rev. Biochem., 46:331 - 358. Mimoto přesto že primární sktruktura těchto látek není příbuzná, terciární struktura těchto dvou skupin enzymů obsahuje konzervovaný řetězec tří aminokyselin, nezbytných pro katalytický účinek, trojici těchto aminokyselin tvoří serin, histidin a aspartát.
Subtilis je serinendoproteáza s molekulovou hmotností 27 500, vylučovaná ve velkém množství z mikroorganismů čeledi Bacillus a dalších mikroorganismů. Bílkovinný řetězec subtilisinu byl stanoven u nejméně tří odlišných čeledí Bacillus podle Markland F. S. a další, 1983, HoppeSeyler's Z. Physiol. Chem. 364:1537 - 1540. Trojrozměrná krystalická struktura subtilisinu z Bacillus amyloliquefeciens do rozlišení 2,5 A je popsána v Wright C. S a další, 1969, Nátuře, 221:235 - 242, Drenth J. a další, 1972, Eur. J. Biochem., 26:177- 181. Tyto studie prokazují, že přesto že je tento subtilisin geneticky nepříbuzný serinproteázám savcům, má podobnou strukturu místa účinku. Krystalická struktura subtilisinu podle analýzy rtg-paprsky obsahuje kovalentně vázané peptidové inhibitory podle Robertus J. D. a další, 1972, Biochemistry, 11:2439 - 2449 nebo různé komplexní struktury podle Robertus J. D. a další, 1976, J. Biol. Chem., 251:1097 1103 a poskytuje informaci, týkající se aktivních míst a vazby substrátu na subtilisin. Mimoto byla zveřejněna řada publikací, týkajících se kinetických a chemických modifikací této látky, například Philipp M., a další, 1983, Mol., Cell. Biochem., 51:5 - 32, Svendsen B., 1976, Carlsberg Res. Comm., 41:237 - 291, Merkland F. S., tamtéž a byly rovněž podány zprávy o případu, v němž byl postranní řetězec methioninu na zbytku aminokyseliny č. 222 substilisinu převeden působením peroxidu vodíku na methioninsulfoxid podle Stauffer D. C. a další, 1965, J. Biol. Chem., 244:5333 - 5338 a v postranním řetězci byl serin na zbytku 221 převeden na cystein chemickou modifikací podle Polgar a další, 1981, Biochimica et Biophysica Acta, 667:351 -354.
V US patentovém spisu č. 4 760 025 (RE 34 606) se popisuje modifikace zbytků aminokyselin substilisinu v polohách, které odpovídají v subtilisinu Bacillus amyloliquefaciens tyrosinu -1, aspartátu +32, asparaginu +155, tyrosinu +104, methioninu +222, glycinu +166, histidinu +64, glycinu +169, fenylalaninu +189, šeřinu +33, šeřinu +221, tyrosinu +217, glutamátu +156 aalaninu +152. V US patentovém spisu č. 5 182 204 se popisuje modifikace zbytku aminokyseliny v poloze +224 subtilisinu z Bacillus amyloliquefaciens a v odpovídajících polohách jiných subtilisinů, které je možno modifikovat substitucí, přidáním nebo vypuštěním zbytků aminokyselin, což je možno kombinovat s modifikacemi, uvedenými v US patentovém spisu
-1 CZ 289323 B6
č. 4 760 025 za vzniku použitelných mutant nebo variant subtilisinu. US patentový spis č. 5 155 033 popisuje podobné mutanty substilisinu s modifikací v poloze, ekvivalentní poloze +225 v subtilisinu B. amyloliquefaciens. V US patentových spisech č. 5 185 258 a 5 204 015 se popisuje mutanta substilisinu s modifikací v polohách +123 a/nebo +274. V US patentové přihlášce SN 07/898 382, která již byla zveřejněna, se popisují modifikace celé řady zbytků aminokyselin subtilisinu včetně specifických modifikací v polohách +99, +101, +103, +107, +126, +128, +135, +197 a +204. V US patentovém spisu č. 4 914 031 se popisují některé analogy subtilisinu včetně analogu, modifikovaného v poloze +76.
Vynález si klade za úkol navrhnout karbonylhydrolázu, s výhodou subtilisin ve formě variant, které obsahují substituci řady zbytků aminokyselin v kódové DNA pro prekurzor karbonylhydrolázy tak, aby tyto substituce odpovídaly poloze +76 v kombinaci s nejméně jednou další polohou ze skupiny +99, +101, +103, +104, +107, +123, +27, +105, +109, +126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210, +216, +217, +218, +222, +260, +265 a/nebo +274 v subtilisinu Bacillus amyloliquefaciens. Takové varianty zpravidla mají alespoň jednu vlastnost, odlišnou od vlastnosti prekurzoru karbonylhydrolázy, od nějž je řetězec aminokyselin uvedené varianty odvozen.
Novým variantám subtilisinu odpovídají kódové řetězce DNA pro uvedené varianty karbonylhydrolázy a také vektory pro expresi, které obsahují kódové řetězce DNA pro tyto varianty.
K získání nových variant je možno zkonstruovat hostitelské buňky, transformované svrchu uvedenými vektory, tyto hostitelské buňky by měly být schopné exprese uložené kódové DNA a produkovat varianty karbonylhydrolázy intracelulámě nebo extracelulámě.
Literární citace, které byly svrchu uvedeny, jsou uváděny pouze pro podrobnější rozbor známého stavu techniky až do dne podání předmětné přihlášky. V žádné z uvedených citací se neuvádí možnost získání variant karbonylhydrolázy podle vynálezu.
Podstata vynálezu
Podstatu vynálezu tvoří přírodně se nevyskytující varianty karbonylhydrolázy s odlišnou proteolytickou účinností stabilitou, specifičností pro substrát, profilem účinnosti při různém pH a/nebo jinými různými vlastnostmi ve srovnání s prekurzorovou karbonylhyrdolázou, z níž jsou tyto varianty odvozeny. Prekurzorovou karbonylhydrolázou může být přírodně se vyskytující karbonylhydroláza nebo také rekombinantní hydroláza. Takové varianty karbonylhydroláz mají řetězec aminokyselin, přírodně se nevyskytující a vytvořený náhradou řady zbytků aminokyselin prekurzorové karbonylhydrolázy jinými aminokyselinami.
Podstatu vynálezu tedy tvoří izolovaná varianta subtilisinu se sekvencí aminokyselin obsahující řadu substitucí jinými přírodními aminokyselinami, přičemž tyto substituce se nacházejí (a) v prekurzoru subtilisinu v poloze, ekvivalentní poloze +76 v subtilisinu Bacillus amyloliqueficiens, přírodní aminokyselina pro substituci se volí ze skupiny A, R, N, C, G, Η, I, L, K, M,F, P, S,T,W,YaVa (b) vjedné nebo většímu počtu poloh v prekurzoru subtilisinu, ekvivalentních polohách +27, +99, +101, +103, +104, +105, +107, +109, +123, +126, +238, +135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210, +216, +217, +218, +222, +260, +265 a +274 subtilisinu z Bacillus amyloliquefaciens, přičemž aminokyselina v poloze v prekurzoru subtilisinu, ekvivalentní poloze +195 v subtilisinu z Bacillus amyloliquefaciens je substituována odlišnými přírodními aminokyselinami, které se volí ze skupiny A, R, N, D, C, Q, G, Η, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y a V a aminokyselina v poloze
-2CZ 289323 B6 prekurzoru subtilisinu, ekvivalentní poloze +206 v subtilisinu Bači Hus amyloliquefaciens je substituována odlišnými přírodními aminokyselinami ze skupiny A, R, N, D, E, Q, G, Η, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y a V.
Výhodné varianty enzymu podle vynálezu obsahujíc substituci, vypuštěné nebo přídatné zbytky aminokyselin v následující kombinaci poloh: 76/99, 76/101, 76/103, 76/104, 76/107, 76/123, 76/99/101, 76/99/103, 76/99/104, 76/101/103, 76/101/104, 76/103/104, 76/104/107, 76/104/123, 76/107/123, 76/99/101/103, 76/99/101/104, 76/99/103/104, 76/101/103/104, 76/103/104/123, 76/104/107/123, 76/99/101/103/104, 76/99/103/104/123, 76/99/101/104/104/123, 76/103/104/128, 76/103/104/260, 76/103/104/265, 76/103/104/197, 76/103/104/105, 76/103/104/135, 76/103/104/126, 76/103/104/107, 76/103/104/210, 76/103/104/126/265 a/nebo 76/103/104/222. Ve velmi výhodném provedení obsahují varianty enzymu podle vynálezu substituci, vypuštění nebo zařazení dalšího zbytku aminokyseliny v následujících kombinacích poloh: 76/99, 76/104, 76/99/104, 76/103/104, 76/104/107, 76/101/103/104, 76/99/101/103/104 a 76/101/104 v subtilisinu B. amyloliquefaciens.
Uvedeným variantám odpovídají také kódové řetězce DNA pro uvedené varianty karbonylhydrolázy nebo subtilisinu. Tyto řetězce DNA jsou odvozeny od prekurzorového řetězce DNA, který je kódovým řetězcem pro přírodně se vyskytující nebo rekombinantní prekurzorový enzym. Řetězce DNA pro tyto varianty jsou odvozeny modifikací řetězce prekurzorové DNA tak, aby tyto řetězce byly kódovými řetězci pro substituci jedné nebo většího počtu aminokyselin, přičemž tyto substituce odpovídají polohám 76, 99, 101, 103, 104, 107, 123, 27, 105, 109, 126, 128, 135, 156, 166, 195, 197, 204, 206, 210, 216, 217, 218, 222, 260, 265 a/nebo 274 v enzymu Bacillus amyloliquefaciens nebo v jakékoliv kombinaci těchto poloh. Přestože zbytky amynokyselin, identifikované pro modifikaci, jsou uváděny podle číslování v B. amyloliquefaciens vzhledem ktomu, že jde o běžný postup pro identifikaci polohy zbytků ve všech substilisinech, je výhodným prekurzorovým řetězcem DNA pro použití podle vynálezu DNA z Bacillus lentus, tak jak je znázorněna na obr. 6 (řetězec č. 11).
Řetězce DNA pro varianty enzymu podle vynálezu jsou kódovými řetězci pro uložení nebo substituci zbytku aminokyseliny v poloze 76 v kombinaci s nejméně jednou další modifikací. S výhodou je pozměněná sekvence DNA kódovým řetězcem pro substituci nebo zařazení zbytku některé odlišné aminokyseliny v následujících možných kombinacích poloh: 76/99, 76/101, 76/103, 76/104, 76/107, 76/123, 76/99/101, 76/99/103, 76/99/104, 76/101/103, 76/101/104, 76/103/104, 76/104/107, 76/104/123, 76/107/123, 76/99/101/103, 76/99/101/104, 76/99/103/104, 76/101/103/104, 76/103/104/123, 76/104/107/123, 76/99/101/103/104, 76/99/103/104/123, 76/99/101/104/104/123, 76/103/104/128, 76/103/104/260, 76/103/104/265, 76/103/104/197, 76/103/104/105, 76/103/104/135, 76/103/104/126, 76/103/104/107, 76/103/104/210,
76/103/104/126/265 a/nebo 76/103/104/222. Ve velmi výhodném provedení je pozměněná sekvence DNA kódovým řetězcem pro modifikaci těchto kombinací: 76/99, 76/104, 76/99/104, 76/103/104, 76/104/107, 76/101/103/104, 76/99/101/103/104 a 76/101/104. Tyto rekombinantní sekvence DNA jsou kódovými řetězci pro varianty karbonylhydrolázy snovými řetězci aminokyselin a obecně s nejméně jednou vlastností, podstatně odlišnou od vlastností enzymu, pro nějž je kódovým řetězcem prekurzorová DNA. Z pozměněných vlastností je možno uvést zejména proteolytickou účinnost, specifičnost pro substrát, stálost, pozměněný profil účinnosti při různých hodnotách pH a/nebo odlišnou charakteristiku účinnosti.
Vynález zahrnuje substituci jakéhokoliv zbytku z devatenácti přírodně se vyskytujících zbytků L-aminokyselin v uvedených polohách. Tyto substituce je možno uskutečnit v kterémkoliv prekurzoru subtilisinu z prokaryotického nebo eukaryotického organismu, ze savce a podobně. Substituce, které lze s výhodou uskutečnit na každém ze zbytků aminokyselin v identifikovaných polohách, zahrnují, avšak nejsou omezeny na následující substituce: substituce v poloze 76 zahrnuje D, Η, E, G, F, K, P a N, substituce v poloze 99 zahrnuje D, T, N, Q, G a S, substituce v poloze 101 zahrnuje G, D, K, L, A, E, S a R, substituce v poloze 103 zahrnuje Q, T, D, Ε, Y, K, G, R, S a A, substituce v poloze 104 zahrnuje všech devatenáct přírodně se vyskytujících
-3CZ 289323 B6 aminokyselin, substituce v poloze 107 zahrnuje V, L, Μ, Y, G, E, F, T, S, A, N a I, substituce v poloze 123 zahrnuje N, T, I, G, A, C a S, substituce v poloze 27 zahrnuje K, N, C, V a T, substituce v poloze 105 zahrnuje, A, D, G, R a N, substituce v poloze 107 zahrnuje A, L, V, Y, G, F, T, S a A, substituce v poloze 109 zahrnuje S, K, R, A, N a D, substituce v poloze 126 zahrnuje A, F, I, V a G, substituce v poloze 128 zahrnuje G, L a A, substituce v poloze 135 zahrnuje A, F, I, S a V, substituce v poloze 156 zahrnuje D, E, A, G, Q a K, substituce v poloze 166 zahrnuje všech devatenáct přírodně se vyskytujících aminokyselin, substituce v poloze 195 zahrnuje E stejně jako substituce v poloze 197, substituce v poloze 204 zahrnuje A, G, C, S a D, substituce v poloze 206 zahrnuje L, Y, N, D a E, substituce v poloze 210 zahrnuje L, I, S, C a F, substituce v poloze 216 zahrnuje V, Ε, T a K, substituce v poloze 217 zahrnuje všech devatenáct přírodně se vyskytujících aminokyselin, substituce v poloze 218 zahrnuje S, A, G, T a V, substituce v poloze 222 zahrnuje všech devatenáct přírodně se vyskytujících aminokyselin, substituce v poloze 260 zahrnuje P, N, G, A, S, C, K a D, substituce v poloze 265 zahrnuje N, G, A, S, C, K, Y a H, a substituce v poloze 274 zahrnuje A a S. Vynález však není na uvedené typy substitucí omezen. Specifické výhodné aminokyseliny pro každou polohu jsou dále uvedeny v tabulce I. Přestože v této tabulce jsou uvedeny určité aminokyseliny, je možno v uvedených polohách k substituci použít jakoukoliv jinou aminokyselinu.
Tabulka I zbytek aminokyseliny výhodná aminokyselina pro substituci
-76 D,H
*99 D,T,N,G
*101
+103 A,Q,T,D,E,Y,K,G,R
*104 I,Y,S,L,A,T,G,F,M,W,D,V,N
*107 V,L,Y,G,F,T,S,A,N
*123 S,T,I
+27 K
+105 A,D,
*109 S.K.R
*126 A,I,V,F
+128 G,L
+135 I,A,S
*156 E.D,Q
-166 D,G,Z,K,N,A,F,Z,V,L
*195 ·* £
*197 Ξ
*204 A,G,C
*206 L
*210 I.S.C
*216 V
*217 H,Z,Y,C,A,G,F,S,N,E,K
-218 S
*222 A,Q,S,C,I,K
*260 P,A,S,N,G
-265 N.A.G.S
+274 A,S
Vynález dále zahrnuje vektory pro expresi, obsahující pozměněnou sekvenci DNA a hostitelské buňky, transformované takovými vektory a schopné produkce uvedených variant. Tyto varianty je možno použít v čisticích prostředcích.
-4CZ 289323 B6
Přehled obrázků na výkresech
Na obr. 1 A-C je znázorněna sekvence DNA a řetězec aminokyselin pro subtilisin Bacillus amyloliquefaciens a částečná mapa restrikčních míst pro tento gen (řetězec č. 6).
Na obr. 2 jsou znázorněny konzervované zbytky aminokyselin v subtilisinech z Bacillus amyloliquefaciens (BPN) a z Bacillus lentus (divoký typ).
Na obr. 3A a 3B jsou znázorněny řetězce aminokyselin pro čtyři druhy subtilisinu. V horním řádku je uveden řetězec aminokyselin pro subtilisin z Bacillus amyloliquevaciens (uváděný také jako subtilisin BPN', řetězec č. 7). V druhém řádkuje uveden řetězec aminokyselin pro subtilisin z Bacillus subtilis (řetězec č. 8). Ve třetím řádkuje znázorněn řetězec aminokyselin pro subtilisin z B. olicheniformis (řetězec č. 9). Ve čtvrtém řádku je znázorněn řetězec aminokyselin pro subtilisin z Bacillus lentus (uváděný také jako subtilisin 309 v PCŤ WO89/06276, řetězec č. 10). Označení hvězdičkou označuje nepřítomnost specifického zbytku aminokyseliny ve srovnání s řetězcem subtilisinu BPN'.
Na obr. 4 je znázorněna konstrukce plazmidu GGA274.
Na obr. 5 je znázorněna konstrukce GGT274, který je meziproduktem pro získání některých plazmídů pro expresi pro použití podle vynálezu.
Na obr. 6A a 6B je znázorněna sekvence DNA a řetězec aminokyselin pro subtilisin z Bacillus lentus (řetězec č. 11). Kódem pro úplnou bílkovinu jsou v tomto případě kodony, začínající od kodonů GCG (334-336), který odpovídá Ala.
Na obr. 7A a 7B je znázorněna sekvence 7A a řetězec aminokyselin pro výhodné provedení podle vynálezu, N76D/S103A/V1041, (řetězec č. 12). DNA byla v tomto případě modifikována popsaným způsobem tak, aby šlo o kódový řetězec pro aspartát v poloze 76, alanin v poloze 103 a isoleucin v poloze 104. Kódový řetězec pro úplnou variantu subtilisinu začíná na kodonu GCG (334-336), který odpovídá Ala.
Na obr. 8 je znázorněna konstrukce vektoru pro expresi pBcDAICAT.
Na obr. 9 je znázorněna konstrukce vektoru pro expresi pUCCATFINA.
Na obr. 10 je znázorněna stabilita výhodné mutanty enzymu ve srovnání se stabilitou divokého enzymu v kapalném čisticím prostředku.
Bylo prokázáno, že při uskutečnění mutací in vitro v subtilisinu z B. lentus v poloze, ekvivalentní zbytku aminokyseliny v poloze +76 v subtilisinu Bacillus amyloliquefaciens vznikají varianty subtilisinu, které mají odlišnou stabilitu (například odlišnou autoproteolytickou stabilitu) ve srovnání s prekurzorovým subtilisinem, jak je také uvedeno v tabulkách IV a VI.
Bylo rovněž zjištěno, že při mutaci in vitro na zbytcích aminokyselin, které jsou ekvivalentní polohám +99, +101, +103, +104, +107, +123, +27, +105, +109, +126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210, +216, +217, +218, +222, +260, +265 a/nebo +274 v subtilisinu
Bacillus amyloliquefaciens jednotlivě nebo ve vzájemných kombinacích a v jakékoliv kombinaci s mutací v poloze +76 vznikají varianty subtilisinu s odlišnou proteolytickou účinností, tepelnou stálostí, pozměněným profilem účinnosti při různém pH, odlišnou specifičností pro substrát a dalšími změnami.
-5CZ 289323 B6
Karbonylhydrolázy jsou enzymy, které hydrolyzují sloučeniny, obsahující skupiny obecného vzorce
O
II
-c-x kde X znamená atom kyslíku nebo atom dusíku. Tyto látky zahrnují přírodně se vyskytující karbonylhydrolázy i rekombinantní karbonylhydrolázy. Přírodně se vyskytující enzymy zahrnují hydrolázy, například hydrolázy peptidu, jako subtilisiny nebo metallopropteázy. Hydrolázy peptidů zahrnují hydrolázy alfa-aminoacylpeptidů, peptidylaminokyselin, dále acylaminohydrolázy, serinkarboxypeptidázy, metallokarboxypeptidázy, thiolproteinázy, karboxylproteinázy a metalloproteinázy. Zahrnuty jsou serinproteáza, metalloproteáza, thiolproteáza a kyselé proteázy, stejně jako endoproteázy a exoproteázy.
Rekombinantní karbonylhydroláza je taková hydroláza, v níž je kódový řetězec DNA přírodně se vyskytující karbonylhydrolázy modifikován za vzniku mutované sekvence DNA, která je kódem pro substituci, zařazení nebo vypuštění jedné nebo většího počtu aminokyselin v řetězci aminokyselin karbonylhydrolázy. Vhodné postupy jsou uvedeny v předmětné přihlášce a byly již uvedeny také v US patentových spisech č. 4 760 025, 5 204 015 a 5 185 258.
Subtilisiny jsou bakteriální nebo houbové karbonylhydrolázy, které obecně štěpí peptidové vazby bílkovin nebo peptidů. Pod tímto pojmem s tedy rozumí přírodně se vyskytující i rekombinantní subtilisiny. Je známo, že řada přírodně se vyskytujících subtilisinů, je produkováno a často také vylučováno různými druhy mikroorganismů. Řetězce aminokyselin enzymů z této skupiny nejsou zcela homologní. Subtilisiny této skupiny však mají stejný nebo obdobný typ proteolytické účinnosti. Tato skupina serinproteáz obsahuje společný řetězec aminokyselin, definující karalytickou trias, která je odlišuje od jiné skupiny serinproteáz, která je příbuzná chymotrypsinu. Serinproteiázy příbuzné subtilisinu a chymotrypsinu mají katalytickou trojici aminokyselin aspartát, histidin a serin. V proteázách, příbuzných subtilisinu je pořadí těchto aminokyselin od aminoterminálního konce ke karboxyterminálnímu konci aspartát-histidin-serin. V proteázách, příbuzných chymotrypsinu je však toto pořadí histidin-aspartát-serin. Subtilisin je tedy serinproteáza, v níž odpovídá pořadí uvedených tří aminokyselin pořadí v subtilisinu. Příklady jsou uvedeny například na subtilisinech z obr. 3.
Rekombinantní subtilisin je subtilisin, jehož kódová sekvence DNA byla modifikována za vzniku pozměněné nebo mutované sekvence DNA, která je kódem pro náhradu, vypuštěn nebo zařazení jedné nebo většího počtu aminokyselin do přírodně se vyskytujícího řetězce aminokyselin pro subtilisin. Vhodné postupy pro tyto modifikace, které je možno kombinovat s postupy, uváděnými v této přihlášce, byly popsány v US patentových spisech č. 4 760 025, 5 204 015 a 5 185 258.
Karbonylhydrolázy, odlišné od enzymů lidského původu a příslušné kódové DNA je možno získat z celé řady prokaryotických i eukaryotických organismů. Jako vhodné příklady prokaryotických organismů je možno uvést gramnegativní organismy, jako E. coli nebo Pseudomonas a grampositivní bakterie, jako Micrococcus nebo Bacillus. Příkladem eukaryotických organismů, z nichž je možno připravit karbonylhydrolázu a její geny, jsou také kvasinky, jako Saccharomyces cerevisiae, houby, jako Aspargillus (celá čeleď) a také savci, odlišní od člověka, jako skot. Ze skotu je například možno získat gen pro karbonylhydrolázu chymosin. Stejně jako v případě subtilisinů, je možno získat z příbuzných čeledí řadu karbonylhydroláz, jejichž řetězce aminokyselin nejsou zcela homologní, které však přesto mají stejný nebo podobný typ biologické účinnosti. Karbonylhydroláza jiného než lidského původu je tedy pouze funkční pojem, který se týká enzymů, přímo nebo nepřímo spojených s prokaiyotickými a eukaryotickými organismy.
-6CZ 289323 B6
Varianta karbonylhydrolázy obsahuje řetězec aminokyselin, který je odvozen od tak zvané prekurzorové karbonylhydrolázy. Prekurzorová karbonylhydroláza, například subtilisin zahrnuje přírodně se vyskytující i rekombinantní enzymy. Řetězec aminokyselin varianty enzymu je „odvozen“ od řetězce aminokyselin prekurzorové hydrolázy tak, že se nahradí, vypustí nebo zařadí jeden nebo větší počet zbytků aminokyselin v prekurzorovém řetězci. Tato modifikace se provádí v příslušné sekvenci DNA pro řetězec prekurzorů, která je kódem pro řetězec aminokyselin prekurzorové karbonylhydrolázy, například substilisinu a nikoliv přímou manipulací ve vlastním řetězci enzymu. Vhodné postupy pro zpracování sekvence DNA pro prekurzorový enzym zahrnují postupy, uvedené v této přihlášce a také známé postupy, které byly uvedeny například v EP 328 299, WO/89/06279 a ve svrchu uvedených US patentových spisech.
Pro mutaci jsou vhodné polohy, které odpovídají polohám zbytků aminokyselin +76, popřípadě v kombinaci s jedním nebo větším počtem zbytků aminokyselin v polohách +99, +101, +103, +104, +107, +123, +27, +105, +109, +126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210, +216, +217, +218, +222, +260, +265 a/nebo +274 subtilisinu Bacillus amyloliquefaciens. Výhodnými kombinacemi jednotlivých poloh pro modifikaci zbytků aminokyselin jsou tyto kombinace: 76/99, 76/101, 76/103, 76/104, 76/107, 76/123, 76/99/101, 76/99/103, 76/99/104, 76/101/103, 76/101/104, 76/103/104, 76/104/107, 76/104/123, 76/107/123, 76/99/101/103, 76/99/101/104, 76/99/103/104, 76/101/103/104, 76/103/104/123, 76/104/107/123, 76/99/101/103/104, 76/101/103/104/123, 76/99/101/104/104/123, 76/103/104/128, 76/103/104/260,
76/103/104/265, 76/103/104/197, 76/103/104/105, 76/103/104/135, 76/103/104/126, 76/103/104/107, 76/103/104/210, 76/103/104/126/265 a/nebo 76/103/104/222. Nej výhodnějšími polohami pro kombinace jsou polohy 76/99, 76/104, 76/99/104, 76/103/104, 76/104/107, 76/101/103/104, 76/99/101/103/104 a 76/101/104. Tyto polohy aminokyselin odpovídají polohám pro úplný subtilisin Bacillus amyloliquefaciens, tak jak je znázorněn na obr. 1. Vynález však není omezen na mutace tohoto specifického subtilisinu, avšak týká se také prekurzorových karbonylhydroláz, které obsahují zbytky aminokyselin v polohách, které jsou „ekvivalentní“ k uvedeným zbytkům v subtilisinu Bacillus amyloliguefaciens. Ve výhodném provedení vynálezu je prekurzorovým subtilisinem subtilisin z Bacillus lentus a náhrady, vypuštění nebo zařazení zbytků aminokyselin se uskuteční na ekvivalentním zbytku aminokyselin B. lentus, odpovídajícím svrchu uvedeným polohám.
Zbytek aminokyseliny v prekurzorové karbonylhydroláze je ekvivalentní zbytku v subtilisinu Bacillus amyloloquefaciens v případě, že je homologní (to znamená odpovídá poloze v primární nebo terciární struktuře) nebo je analogický specifickému zbytku nebo části tohoto zbytku (to znamená, že má odpovídající nebo podobnou funkční schopnost chemické vazby, reakce nebo interakce).
Aby bylo možno zhodnotit homologii s primární strukturou, srovnává se řetězec aminokyselin prekurzorové karbonylhydrolázy přímo s primárním řetězcem subtilisinu z Bacillus amyloliquefaciens a zvláště se skupinou zbytků, o nichž je známo, že se v řetězcích známých subtilisinů nemění. Na obr. 2 jsou znázorněny tyto konzervované zbytky v subtilisinech z B. amyloliquefaciens a B. lentus. Jakmile se srovnávají řetězce tak, že se konzervované zbytky zařadí nad sebe, je možno definovat ekvivalentní zbytky, které odpovídají určitým zbytkům aminokyselin v primárním řetězci subtilisinu z Bacillus amyloliquefaciens. S výhodou musí nový enzym obsahovat 100 % konzervovaných zbytků, nebo alespoň více než 75 % těchto zbytků, často však stačí pouze 50 % konzervovaných zbytků k určení poloh ekvivalentních zbytků aminokyselin. Zvláště je zapotřebí zachovat beze změny katalytickou trias, Asp32/Hia64/Ser221.
Například na obr. 3 jsou srovnány řetězce aminokyselin pro subtilisiny z Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis (carlsbergensisi) a Bacillus lentus tak, aby byla zřejmá homologie mezi jednotlivými řetězci aminokyselin. Ze srovnání je zřejmé, že každý z řetězců obsahuje celou řadu konzervovaných zbytků. Tyto zbytky, například mezi BPN' a B. lentus jsou identifikovány na obr. 2.
-7CZ 289323 B6
Je tedy zřejmé, že tyto konzervované zbytky je možno užít k definování odpovídajících ekvivalentních zbytků aminokyselin subtilisinu z Bacillus amyloliquefaciens v jiných karbonylhydrolázách, například z Bacillus lentus, jehož řetězec je uveden v PCT WO 89/06279, zveřejnění 13. července 1989. Jde o výhodný prekurzorový enzym, je však také možno použít subtiiisin, označovaný PB92 a popsaný v EP 329 299, který je vysoce homologní s výhodným subtilisinem z Bacillus lentus. Řetězce aminokyselin pro některé tyto subtilisiny jsou srovnány na obr. 3A a 3B s řetězcem subtilisinu z Bacillus amyloliquefaciens k získání maximální homologie konzervovaných zbytků. Jak je zřejmé, existuje několik vypouštěných částí, řetězce v řetězci enzymu z Bacillus lentus ve srovnání se subtilisinem z Bacillus amyloliquefaciens. Ekvivalentní aminokyselinou pro Vall65 v subtilisinu Bacillus amyloliquefaciens je v subtilisinu z B. lentus a B. licheniformis například isoleucin.
Aminokyselina v poloze +76 v subtilisinu z B. amyloliquefaciens a B. lentus je asparagin N. Ve výhodném variantě subtilisinu podle vynálezu je však v poloze +76 tato aminokyselina nahrazena aspartátem D. Pro ilustrativní účely je v následující tabulce II uvedeno srovnání některých zbytků aminokyselin, identifikovaných při substituci a nejvýhodnější substituce pro každou polohu.
Tabulka II
+76 +99 +101 +103 +104 +107 +123
B. amyloliquefaciens (divoký typ) N D s Q Y I N
B. lentus (divoký typ) N S s S V I N
nej výhodnější substituce D D R A I/Y v S
Ekvivalentní zbytky je také možno definovat stanovením homologie na úrovní terciární struktury pro prekurzorovou karbonylhydrolázu, jejíž terciární struktura byla stanovena krystalograficky pomocí rtg-záření. Ekvivalentní zbytky jsou definovány jako ty zbytky, pro které atomové koordináty dvou nebo většího počtu hlavních atomů v určitém řetězci aminokyselin prekurzorové karbonylhydrolázy a subtilisinu z Bacillus amyloliquefaciens (N na N, CA na CA, C na C a O na O) jsou nejvýše 0,12 nm a s výhodou 0,1 nm po srovnání řetězců. Toho je dosaženo po správné orientaci a umístění do polohy, v níž se maximálně překrývají atomové koordináty atomu bílkovin, odlišných od vodíkových atomů karbonylhydrolázy a subtilisinu Bacillus amyloliquefaciens. Nejlepším modelem je krystalografický model, uvádějící nejnižší faktor R pro experimentální difrakci při nejvyšším dostupném rozlišení.
Eh|Fo(h)| - |Fc(h)| R faktor =---------------Zh|Fo(h)|
Ekvivalentní zbytky, které jsou funkčně analogické specifickým zbytkům v subtilisinu Bacillus amyloliquefaciens jsou definovány jako ty aminokyseliny v prekurzorové karbonylhydroláze, které mohou pozměnit, nebo také modifikovat strukturu bílkoviny, mohou se vázat na substrát nebo katalyzovat reakci obdobným způsobem, jako specifický zbytek v subtilisinu z Bacillus amyloliquefaciens. Mimoto existují v prekurzorové karbonylhydroláze zbytky (pro které byla stanovena terciární struktura krystalografií v rtg-záření), které jsou uloženy v analogických polohách, přestože hlavní atomy řetězce daného zbytku nesplňují požadavky ekvivalence podle homologní polohy, podle atomových koordinát, které pro nejméně dva atomy postranního řetězce zbytku leží v rozmezí od 0,13 nm, vzhledem k odpovídajícím atomům postranního řetězce subtilisinu Bacillus amyloliquefaciens. Koordináty pro trojrozměrnou strukturu subtilisinu Bacillus amyloliquefaciens byly uvedeny v EP 251 446 a je možno je použít ke stanovení ekvivalentních zbytků aminokyselin na bázi terciární struktury.
-8CZ 289323 B6
Některé ze zbytků, identifikovaných pro substituci, zařazení nebo vypuštění pro konzervované zbytky, jiné nikoliv. V případě nekonzervovaných zbytků je náhrada jedné nebo většího počtu aminokyselin omezena na substituce, při jejichž použití vznikne varianta s řetězcem aminokyselin, odlišným od existujícího přírodního řetězce. V případě konzervovaných zbytků by rovněž náhradou neměl vzniknout přírodně se vyskytující řetězec. Varianty karbonylhydrolázy podle vynálezu zahrnují úplné varianty karbonylhydrolázy a také prekurzory a prekurzory prekurzorů těchto variant. Prekurzory prekurzorů jsou velmi výhodné vzhledem ktomu, že mohou usnadnit expresi, vylučování a vytvoření úplných variant karbonylhydroláz.
Řetězec prekurzorů je řetězec aminokyselin, vázaný na N-terminální část zralé formy karbonylhydrolázy, po jehož odstranění vzniká „zralá“ forma karbonylhydrolázy. Řada proteolytických enzymů se vyskytuje jako translační prekurzorové látky ve formě proenzymu a v případě, že nedojde k posttranslačnímu zpracování, dochází k jejich expresi v této podobě. Výhodný řetězec prekurzorů pro varianty karbonylhydrolázy, zvláště subtilisinu, je ten řetězec, který je obsažen v prekurzorů subtilisinu Bacillus amyloliquefaciens, je však možno užít i jiné řetězce. V příkladech 1 a 2 byl například použit řetězec ze subtilisinu z Bacillus lentus, ATCC 21536.
Signální řetězec je řetězec aminokyselin, vázaný na N-terminální část karbonylhydrolázy nebo prohydrolázy, který se může účastnit sekrece zralé formy nebo prekurzorů hydrolázy. Tato definice signálního řetězce je funkční a má zahrnovat všechny řetězce aminokyselin, pro něž je kódem N-terminální část genu pro subtilisin nebo jinou vylučování schopnost karbonylhydrolázu, řetězec se účastní vylučování těchto enzymů za přírodních podmínek. Podle vynálezu se takového řetězce využívá k dosažení sekrece variant karbonylhydrolázy. Výhodný signální řetězec, užitý v příkladové části obsahuje prvních sedm zbytků aminokyselin ze signálního řetězce subtilisinu z Bacillus subtilis, tento řetězec je navázán na zbytek signálního řetězce subtilisinu z Bacillus lentus ATCC 21536.
Prekurzor prekurzorů varianty karbonylhydrolázy je tvořen zralou formou hydrolázy s řetězcem prekurzorů, operativně vázaným na aminoterminální konec hydrolázy a se signálním řetězcem, operativně vázaným na aminoterminální konec prekurzorů.
Vektor pro expresi je konstrukce, obsahující sekvenci DNA, operativně vázanou na vhodný řídicí řetězec, schopný uskutečnění exprese takové DNA ve vhodném hostiteli. Řídicí řetězce zahrnují promotory k dosažení transkripce, případný operátorový řetězec pro řízení této transkripce, kódový řetězec pro vhodné místo pro vazbu mRNA ribosomu a řetězce, které řídí ukončení transkripce a translace. Vektorem může být plazmid, částice fágu nebo jednoduše potenciální řetězec genomu, určený pro uložení. Po transformaci v příslušném hostiteli může docházet k replikaci vektoru a jeho funkci nezávisle na genomu hostitele nebo může v některých případech dojít k integraci do genomu hostitele. V průběhu přihlášky se pojmy „plazmid“ a „vektor“ používají zaměnitelně vzhledem ktomu, že plazmid je nejběžnější užívanou formou vektoru v současné době. Avšak vynález zahrnuje i jiné formy vektorů pro expresi, které jsou v oboru známy a mohou rovněž splnit příslušnou funkci.
Hostitelskými buňkami jsou obvykle prokaryotické nebo eukaryotické hostitelské buňky, které byly s výhodou předběžně zpracovány postupy, popsanými například v US patentovém spisu č. 4 760 025, tak, aby nebyly schopné vylučovat enzymaticky účinnou endoproteázu. Výhodnou hostitelskou buňkou pro expresi subtilisinu je kmen Bacillus BG2036, který neprodukuje enzymaticky účinnou neutrální proteázu ani alkalickou proteázu, to znamená vlastní subtilisin. Konstrukce kmene GB2036 je podrobně popsán v US 5 264 366. Dalšími hostitelskými buňkami, vhodnými pro expresi subtilisinu jsou Bacillus subtilis 1168, rovněž popsaný v US 4 760 025 a US 5 264 366 a také jakýkoliv jiný vhodný kmen Bacillus, jako B. licheniformis, B. lentus a podobně.
Hostitelské buňky se transformují nebo se podrobí transfekcí při použití vektorů, zkonstruovaných rekombinantní technikou. Transformované hostitelské buňky jsou schopné
-9CZ 289323 B6 replikace vektorů, obsahujících kód pro varianty karbonylhydrolázy nebo přímou exprese požadované varianty karbonylhydrolázy. V případě vektorů, obsahujících kód pro prekurzor nebo pro prekurzor prekurzoru varianty karbonylhydrolázy dochází po expresi v typických případech k sekreci varianty z hostitelské buňky do živného prostředí.
Pod pojmem „operativně vázaný“ se při popisu vztahu mezi dvěma oblastmi DNA rozumí skutečnost, že obě oblasti jsou spolu funkčně spojeny. Například řetězec prekurzoru je operativně vázán na peptid v případě, že působí jako signální řetězec a účastní se vylučování zralé formy bílkoviny, což pravděpodobně zahrnuje také odštěpení signálního řetězce. Promotor je operativně vázán na kódový řetěz v případě, že řídí transkripci řetězce. Místo pro vazbu ribosomu je operativně vázáno na kódový řetězec v případě, že jeho poloha dovoluje zahájení translace.
Gen s kódovým řetězcem pro přírodně se vyskytující prekurzor karbonylhydrolázy je možno připravit běžnými postupy. Tyto postupy obvykle zahrnují přípravu značených sond s kódovými řetězci pro určité oblasti požadované hydrolázy, přípravu souborů genomu z organismu, u nějž dochází k expresi hydrolázy a pak prozkoumání tohoto souboru za účelem vyhledání požadovaného genu hybridizací s příslušnou sondou. Pozitivně hybridizující klony se pak podrobí analýze řetězce a vytvoří se mapa restrikčních míst. Gen zB. lentus, použitý v příkladové části byl klonován způsobem podle příkladu 1 US patentového spisu č. 5 185 258. Gen pro BPN' užitý v příkladu 5 byl klonován způsobe, popsaným v příkladu US 4 760 025 (RE 34 606).
Klonovaná karbonylhydroláza se pak užije k transformaci hostitelských buněk tak, aby došlo k expresi hydrolázy. Gen pro hydrolázu se naváže do plazmidu při vysokém počtu kopií. K replikaci plazmidu dochází v hostiteli, který obsahuje známé prvky, nezbytné pro replikaci plazmidu, to znamená promotor, operativně vázaný na příslušný kmen, může také jít o homologní promotor genu v případě, že kjeho transkripci dochází v použitém hostiteli, dále musí být přítomna oblast pro ukončení transkripce a polyadenylační oblast, nutná pro stabilizaci mRNA při transkripci hostitele z genu pro hydrolázu v některých eukaryotických hostitelských buňkách, tato oblast je exogenní nebo je obsažena v endogenní terminační oblasti genu pro hydrolázu, mimoto by měl být gen pro hydrolázu vázán ještě na gen, dovolující budoucí selekci, například na gen pro odolnost proti antibiotikům, který umožní pěstování hostitelské buňky, infikované plazmidem na živné prostředí s obsahem antibiotika. Plazmidy s vysokým počtem kopií mimoto obsahují počátek replikace hostitele, čímž se umožní vznik velkého počtu plazmidů bez omezení chromosomy. Je tedy možno také integrovat velký počet kopií genu pro hydrolázu do genomu hostitele. To je usnadněno povahou prokaryotických a eukaryotických organismů, u nichž je snadno možno dosáhnout homologní rekombinace.
Geny, užité v příkladové části jsou přírodní gen z B. lentus a přírodní gen z B. amyloliquefaciens. Je však možno připravit také syntetický gen, který je kódem pro přírodně se vyskytující nebo mutovaný prekurzor karbonylhydrolázy. V tomto případě se stanoví řetězec aminokyselin a/nebo sekvence DNA pro prekurzor hydrolázy. Pak se syntetizují překrývající se fragmenty DNA s jednoduchým řetězcem, z nichž vznikne po hybridizací a vazbě syntetická kódová DNA pro prekurzorovou hydrolázu. Jako příklad konstrukce syntetického genu je možno uvést postup, uvedený v příkladu 3 US patentového spisu č. 5 204 015.
Jakmile byl gen pro přírodně se vyskytující nebo syntetickou prekurzorovou karbonylhydrolázu klonován, je možno uskutečnit řadu modifikací k výhodnějšímu použití genu při syntéze přírodně se vyskytující prekurzorové karbonylhydrolázy. Tyto modifikace zahrnují přípravu rekombinantních karbonylhydroláz podle US 4 76é 025 (RE 34 606) a podle EP 251 446 a také dále popsanou produkci variant karbonylhydrolázy.
Následující tvorbu mutací při použití kazet je možno použít k usnadnění konstrukce a identifikace variant karbonylhydrolázy podle vynálezu, i když je možno použít i jiné postupy, včetně cílové tvorby mutací. Nejprve se připraví přírodně se vyskytující kódový gen pro
-10CZ 289323 B6 hydrolázu a jeho řetězec se zcela nebo z části analyzuje. Pak se stanoví místo, v němž je žádoucí uskutečnit mutaci ve smyslu vypuštění, zařazení nebo náhrady jedné nebo většího počtu aminokyselin v kódovém řetězci pro enzym. Řetězce, sousedící s tímto místem se vyhodnotí na přítomnost míst působení restrikčních enzymů tak, aby bylo možno krátký úsek genu nahradit směsí oligonukleotidů, které povedou po expresi ke vzniku kódových řetězců pro různé mutanty. S výhodou se vyhledávají jediná místa působení restrikčních enzymů v celém řetězci genu pro hydrolázu k usnadnění náhrady úseku genu. Je však možno použít zásadně jakékoliv místo působení restrikčního enzymu, které se v řetězci genu, vzniklé štěpením je možno znovu sestavit ve správném pořadí. V případě, že nejsou k dispozici místa působení restrikčních enzymů ve vhodné vzdálenosti od zvoleného místa (v rozmezí 10 až 15 nukleotidů), je zapotřebí taková místa vytvořit substitucí nukleotidů v genu tak, aby nedošlo ke změně čtecího rámce ani výsledných aminokyselin, pro něž je řetězec kódem. Mutace genu na žádoucí řetězec může být uskutečněna extensí při použití primeru M13 známým způsobem. Uložení vhodných postranních oblastí a vyhodnocení nutných změn pro dosažení dvou vhodných míst působení restrikčních enzymů je běžnou záležitostí po přípravě mapy působení restrikčních enzymů v průběhu celého genu s ohledem na velké množství existujících použitelných enzymů. V případě, že se vhodná oblast nachází alespoň na jedné straně, je možno uvedeným způsobem zpracovat pouze tu stranu, na níž přirozené místo působení restrikčního enzymu chybí.
Jakmile dojde ke klonování přírodně se vyskytující nebo syntetické DNA, rozštěpí se příslušná restrikční místa v blízkosti poloh, v nichž má dojít k mutaci pomocí příslušných restrikčních enzymů a fragmenty genů se podrobí vazbě při použití celé řady kazet, komplementárních k příslušnému zakončení a obsahujících oligonukleotidy. Tímto způsobem se tvorba mutace usnadní vzhledem k tomu, že všechny oligonukleotidy je možno syntetizovat tak, aby obsahovaly totéž místo působení restrikčního enzynu a není tedy zapotřebí použít syntetické vazby řetězce pro tvoření těchto míst.
Proteolytická účinnost je definována jako rychlost hydrolýzy peptidových vazeb na mg enzymu. Pro měření proteolytické účinnosti je známa celá řada postupů, popsaných například v souhrnné publikaci K. M. Kalisz, „Microbial Proteinases“, Advences in Biochemisal Engineering/Biotechnology, A. Fiechter ed., 1988. Mimoto nebo místo modifikace proteolytické účinnosti mohou mít varianty enzymu podle vynálezu jiné modifikované vlastnosti, například Km, kcat, poměr k^/Km a/nebo modifikovanou specifičnost pro substrát a/nebo modifikovaný profil účinnosti při různém pH. Je možno vytvořit specifické enzymy pro určitý substrát, jehož přítomnost se předpokládá, například při výrobě peptidů nebo v případě některých hydrolytických postupů, například při použití k praní prádla.
V jednom z provedení vynálezu má být dosaženo výroby variant karbonylhydrolázy s pozměněnou proteolytickou účinností ve srovnání s prekurzorovou karbonylhydrolázou vzhledem k tomu, že zvýšení účinnosti umožní efektivnější použití enzymu. Zajímavé jsou také varianty enzymu s odlišnou tepelnou stálostí a/nebo odlišnou specifičností pro substrát ve srovnání s původním enzymem. Výhodnou karbonylhydrolázou pro použití ke tvorbě variant na základě mutace je subtilisin. Specifickými aminokyselinami, vhodnými pro náhradu v karbonylhydroláze typu subtilisinu jsou aminokyseliny v polohách +76, +99, +101, +103, +104, +107, +123, +27, +105, +109, +126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210, +216, +217, +218, +222, +260, +265 a/nebo +274 nebo jakákoliv kombinace těchto poloh v subtilisinu z Bacillus amyloliquefaciens. V některých případech je žádoucí dosáhnout nižší proteolytické účinnosti, například při syntéze peptidů. Příliš vysoká proteolytická účinnost enzymů by v tomto případě totiž mohla rozrušit výsledný produkt syntézy. Na druhé straně může být v některých případech žádoucí zvýšit proteolytickou účinnost varianty ve srovnání s prekurzorem. Mimoto může být žádoucí zvýšit nebo snížit stálost enzymu, a to jak proti působení zásad, tak proti působení tepla. V některých dalších případech může být žádoucí zvýšit nebo snížit hodnoty kcat, Km nebo poměr k^/Km.
-11 CZ 289323 B6
V jiném provedení vynálezu bylo prokázáno, že zbytky, ekvivalentní zbytky v poloze +76 jsou v kombinaci s dalšími modifikacemi subtilisinu důležité při dosahování změn celkové stálosti a/nebo proteolytické účinnosti enzymu. Jak je uvedeno v příkladové části, je možno například nahradit asparagin N v poloze, ekvivalentní poloze +76 v subtilisinu Bacillus lentus aspartátem D, ve výhodném provedení v kombinaci s další modifikací jednoho nebo většího počtu zbytků aminokyselin v polohách +99, +101, +103, +104, +107, +123, +27, +105, +109, +126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210, +216, +217, +218, +222, +260, +265 a/nebo +274 k dosažení zvýšené stálosti a/nebo zvýšené účinnosti výsledného mutovaného enzymu.
Nej výhodnější provedení vynálezu jsou uvedena v jednotlivých příkladech. Tyto příklady zahrnují následující specifické kombinace nahrazených zbytků aminokyselin: N76D/S99D, N76D/S99D/V104I, N76D/S103A/V104I, N76D/V1041/1107V a N76D/S101R/S103A/V104I.
V příkladech jsou rovněž uvedeny všechny hlavní kombinace mutant podle vynálezu. Uvedené substituce se s výhodou provádějí v subtilisinu z Bacillus lentus, je však možno použít subtilisinu z jakéhokoliv typu Bacillus.
Na základě výzkumu, provedených s těmito a dalšími variantami subtilisinu je zřejmé, že zbytky aminokyselin v karbonylhydrolázách, s výhodou v subtilisinu, které jsou ekvivalentní zbytkům v polohách +76, +99, +101, +103, +104, +107, +123, +27, +105, +109, +126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210, +216, +217, +218, +222, +260, +265 a/nebo +274 v Bacillus amyloliquefaciens jsou důležité pro proteolytickou účinnost a/nebo stálost těchto enzymů a tedy i pro čisticí nebo prací schopnost takových variant.
Celá řada variant karbonylhydrolázy podle vynálezu, zvláště subtilisinu je použitelná pro výrobu různých čisticích prostředků. Řada známých látek jsou smáčedla, vhodná pro použití v prostředcích s obsahem mutant karbonylhydrolázy podle vynálezu. Jde o neiontová, aniontová, kationtová nebo amfothermní smáčedla, popsaná například v US 4 404 128 (Barry J. Anderson) a US 4 261 868 (Jiri Flora a další). Vhodný prostředek s obsahem smáčedla je popsán v příkladu 7 US 5 204 015. V oboru je uvedena řada prostředků s obsahem enzymů, použitelných jako čisticí nebo prací prostředky. Kromě typických čisticích prostředků mohou být varianty subtilisinu podle vynálezu použity kjakémukoliv účelu, k němuž se používají ostatní přírodní subtilisiny nebo subtilisiny divokého typu. Může jít o kapalná mýdla, prostředky na mytí nádobí, prostředky k čištění kontaktních čoček, prostředky pro použití při hydrolýze peptidů, zpracování odpadů, v textilním průmyslu, jako enzymu pro štěpení různých řetězců při výrobě bílkovin a podobně. Varianty podle vynálezu mohou mít zvýšenou účinnost v Čisticím prostředku ve srovnání s prekurzorem. Touto zvýšenou účinností se rozumí zvýšený čisticí účinek v případě různých nečistot, citlivých na působení enzymů, jako jsou tukové nebo krevní skvrny, stanovení se provádí obvyklým způsobem při použití standardních pracích postupů.
Subtilisiny podle vynálezu je možno zpracovat na známé práškové nebo kapalné čisticí prostředky, které mají pH v rozmezí 6,5 až 12,0, obsah enzymu je 0,01 až 5, s výhodou 0,1 až 0,5 % hmotnostních. Tyto čisticí prostředky mohou ještě obsahovat další enzymy, například známé proteázy, amylázy, celulázy, lipázy nebo endoglykosidázy, dále stabilizátory a další pomocné látky.
Přidáváním subtrilisinů podle vynálezu k běžným pracím prostředků nevzniká žádné zvláštní omezení při jejich použití. To znamená, že jakékoliv teplotní rozmezí nebo rozmezí pH, vhodné pro určitý čisticí prostředek je rovněž vhodné pro prostředky s přidáním subtilisinu, pokud se pH pohybuje ve svrchu uvedené rozmezí a teplota při použití je nižší než teplota, při níž dochází k denaturaci enzymu. Mimoto je možno subtilisiny podle vynálezu použít v čisticích prostředcích bez dalších čisticích látek jako takové, nebo v kombinaci s buildery a stabilizátory.
Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.
-12CZ 289323 B6
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Konstrukce pro expresi genu GG36 v B. subtilis
Klonování a konstrukce pro expresi genu pro subtilisin z B. lentus byly uskutečněny v podstatě stejným způsobem jako vUS č. 5 185 258. Plazmid GGA274 (popsaný na obr. 4) byl dále modifikován způsobem, znázorněným na obr. 5. Místo působení enzymu Pstl, vytvořené v průběhu konstrukce plazmidu GGA274 bylo odstraněno řízenou mutagenesou při použití oligonukleotidu s řetězcem 5' GAAGCTGCAACTCGTTAAA 3' (řetězec č. 1). Zařízením podtrženého nukleotidu A došlo k odstranění místa působení restrikčního enzymu Pstl a současně byl odpovídající zbytek aminokyseliny v poloze 274 změněn zalaninu na threonin. Threonin v poloze 274 je obvykle přítomen v enzymu divokého typu, například v sekvenci genu klonovaného subtilisinu z B. lentu. Kódový segment DNA pro subtilisin byl z plazmidu GGA274 nebo jeho derivátu vyjmut rozštěpením enzymy EcoRI a BamHI. Fragment DNA byl pak zpětně subklonován ve vektorech na bázi bakteriofágu Ml3, například MP19 tak, aby došlo ke vzniku mutace. Po vzniku mutace byl mutovaný gen pro subtilisin po klonování přenesen zpět z fragmentu po štěpení enzymy EcoRI a HindlII do plazmidu pro expresi, například GGA274 k expresi a izolaci mutovaného subtilisinu.
Příklad 2
Cílená tvorba mutace s použitím oligonukleotidu
Pokud byl uskutečněn podle publikace Zoller M. a další, 1983, Methods Enzymol., 100:468-500. Jako příklad je možno uvést použití syntetického oligonukleotidu se sekvencí 5' GCTGCTCTAGACAATTCG 3' (řetězec č. 2), tento oligonukleotid byl užit k náhradě zbytku aminokyseliny v poloze 76 zasparaginu N na kyselinu asparagovou D, to znamená N76D. Podtržené zbytky G a C označují změny proti sekvenci genu divokého typu. CA uchovává leucin v poloze +75 a mění řetězec aminokyselin zařazením místa působení enzymu Xbal, (TCTAGA), zatímco změna GAC mění asparagin v poloze +76 na aspartát.
V případě vzniku mutace v polohách 99, 101, 103 a 104 je možno použít různé oligonukleotidy v závislosti na požadované kombinaci mutací. Například byl použit nukleotid 5' GTATTAGGGGCGGACGGGTCGAGGCGCCATCAGCTCGATT 3' (řetězec č. 3) k současnému uskutečnění z následujících změn S99D, S101R, S103A a V104I v téže molekule subtilisinu. Podobným způsobem byly použity nukleotidy 5' TCAGGTTCGGTCTCGAGCGTTGCCCAAGGATTG 3' (řetězec č. 4) a 5' CACGTTGCTAGCTTGAGTTTAG 3' (řetězec č. 5) k získání mutací I107V a N123S. Podtržené nukleotidy opět označují změny ve srovnání s řetězcem divokého typu, v jejich důsledku vznikají požadované změny řetězci aminokyselin nebo v místech působení restrikčních enzymů.
Příklad 3
Proteolytická účinnost variant subtilisinu
Způsobem podle příkladu 2 byly připraveny varianty z tabulky III. V tabulce je uvedena proteolytická účinnost těchto variant. Kinetické parametry kcat, KM a L^/Km byly měřeny pro hydrolýzy syntetického peptidu, sukcinyl-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitroanilidu
-13CZ 289323 B6 způsobem podle publikace P. Bonneau a další, 1991, J. Am. Chem. Soc., sv. 113, č. 3, str. 1030. Postupuje se tak, že se malý podíl zásobního roztoku varianty subtilisinu přidá do kyvety s objemem 1 ml obsahující substrát, rozpuštěný v 0,1 M tris-HCl-pufru o pH 8,6 a uloží do termostatu při 25 °C. Reakce se sleduje spektrofotometricky sledováním absorpce reakčního produktu, p-nitroanilinu při 410 nm. Kinetické parametry byly zjištěny použitím algorithmu nelineární regrese, odpovídajícího rychlosti reakce a koncentrace produktu v MichaelisMentenově rovnici.
Tabulka III
Kinetické parametry kcat, KM a kcat/KM pro subtilisin z Bacillus lentus a jeho varianty
Enzym (s*1) Kn (M)
B. leasui Subtilisin 170 0.00078 2.18x10»
N76D 2X9 0.0008 2.74x10»
N76D/S99D 80 0.00061 1.44X10»
N76D/S103A 400 0.0014 2.86x10»
N76D/V104I 459 0.0011 4.17x10»
N76D/I107V 2X9 0.00X1 1.99x10»
N76D/N123S 115 0.0018 6.40x10·
N76D/S99D/S101R 146 0.00038 3.84x10»
N76D/S99D/5103A 157 0.0012 1.31X10’
N76D/S99D/V1043 247 0.00097 2.55x10»
N76D/S101R/S103A 405 0.00069 5.90x10»
N76D/S1C1R/V104I 540 0.00049 1.10x10·
N76D/S103A/V104I 832 0.00X6 5.20x10»
N76D/VX04X/X107V 497 0.00045 1.10x10*
N7SO/V104Y/:i07V 330 0.00017 1.90x10·
N76D/V104Z/N1235 25X 0.0026 9.65x10·
N76D/Z107V/II123S X47 0.0035 4.20x10*
N76D/399D/S101R/S103A 242 0.00074 3.27x10’
N76D/S99D/SX01R/V104I 403 0.00072 5.60x10’
N76D/S99D/S103A/V104X 420 0.00X6 2.62x10’
N760/$101R/S103A/V104- 73X 0.00065 1.12x10*
N76D/S1C3A/VX04I/N123S 32X 0.0026 1.23x10»
N76D/V104’/:i07V/NX23S 23X 0.003 7.70x10*
N760/S99D/S101R/S103A/V104X 624 0.00098 6.37x10»
S76D/S990/S103A/V104I/N123S X94 0.0043 4.51X10*
N76D/S99D/S101R/S103A/V104X/N123S 31X 0.0023 1.35x10»
Výsledky, uvedené v tabulce III prokazují, že všechny zkoumané varianty subtilisinu si udržely proteolytickou účinnost. Podrobnější údaje prokazují, že došlo k podstatným změnám proteolytické účinnosti po různých kombinacích substitucí v případě zbytků aminokyselin v polohách ekvivalentních polohách 76,99,101,103,104,107 a 123 z Bacillus amyloliquefaciens.
-14CZ 289323 B6
Příklad 4
Tepelná stálost variant subtilisinu
V následující tabulce IV je uvedeno srovnání tepelné stálosti subtilisinu z Bacillus lentus a jeho variant, získaných způsobem podle příkladu 2. Čištěný enzym, 15 mikrogramů/ml v 0,1 M glycinu s 0,01 % Tween-80 o pG 10,0 s přísadou nebo bez přísady 50 mM CaCI2, bylo po jednotlivých podílech rozděleno do malých zkumavek a směs byla inkubována 5 minut při 10 °C, pak byla každou minutu teplota zvýšena o 10 °C a nakonec byl roztok udržován 20 minut při ío teplotě 60 °C. Pak byly zkumavky na 10 minut uloženy do ledu. Podíly ze zkumavek byly sledovány na účinnost enzymu uložením do kyvety s objemem 1 ml s obsahem 1,2 mM syntetického peptidů jako substrátu, sukcinyl-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitroanilidu v roztoku v 0,1 M tris-HCl-pufru o pH 6 v termostatu při teplotě 25 °C. Počáteční lineární rychlost reakce byla sledována spektrofotometricky záznamem absorbance reakčního produktu, 15 p-nitroanilinu při 410 nm v průběhu času. Údaje jsou vyjádřeny v procentech účinnosti před zahřátím. Výsledky z tabulky IV prokazují, že většina variant je tepelně stálejší ve srovnání se subtilisinem z Bacillus lentus (24 vzorků ze 26) po přidání 50 mM CaCl2. Bez této látky je většina variant (19 z 26) podstatně stálejší než subtilisin z Bacillus lentus. Mimoto jsou varianty N76D/S99D, N76D/V104I, N76D/S99D/V104I, N76D/S103A/V104I, N76D/V1041/1107V, 20 N76D/V104Y/I107V a N76D/S101R/S103A/V104I podstatně stálejší než varianta sjedinou substitucí, N76D při pokusu, prováděném bez přidání 50 mM CaCl2.
-15CZ 289323 B6
Tabulka IV
Tepelná stálost subtilisinu z Bacillus lentus a jeho variant při pH 10, teplotně 60 °C, + nebo 50 mM CaCl2) zbývající účinnost v %
Enzyn - CaCl, * Čad,
3. íentttt Subtilisin 2 96
N75D 34 97
N76D/S99D 49 98
N76D/5103A 25 92
K76D/V104X 58 98
K76D/Z107V 32 96
N7SD/N122S 0 97
N76D/S99D/S101R 30 100
N76D/S99D/S103A 35 100
N76D/S99D/V104I 48 97
N7SD/S101R/S103A 25 100
N76D/S101R/V104I 38 100
H76D/S103A/V104I 58 100
H76D/V104X/I107V 60 97
N76D/V104Y/I107V 48 74
N76D/V104X/N123S 0 98
meo/H07V/NX23S 16 100
N76D/S99D/S101R/S103A 38 100
N76D/S99D/S101R/V104X 33 100
N76D/S99D/S103A/V104I 38 98
N76D/S101R/S103A/V104I 40 99
N76D/S103A/V104I/N123S X 98
R76D/V104X/X107V/N123S 3 99
N76O/S99D/S101R/S103A/V104I 36 99
N76O/S99D/S1Q3A/V104I/N122S 2 95
N76D/S99D/S101R/S102A7V104I/N122S 0 100
Příklad 5
Řízená tvorba mutace s použitím oligonukleotidu a DNA s jednoduchým řetězcem zfagemidu jako matrice
A. Konstrukce variant B. lentus
Mutace byla vytvořena v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 2. Matrice DNA s jednoduchým řetězcem byla získána s použitím fagemidu. Aby bylo možno zkonstruovat vektor typu fagemidu pro přípravu DNA s jednoduchým řetězcem jako matrice, byl nejprve zkonstruován vektor pBCDAICAT. Tento vektor je znázorněn na obr. 8. Nejprve byl klonován
-16CZ 289323 B6 kódový fragment Clal-Clal pro gen CAT z plazmidu pC194 (Horinouchi S. a Weisblum B., J. Bacterial. 150, 8-15, 1982) v místě AccI v oblasti vazného řetězce plazmidu pUC19 (New England Biolabs, Beverly, MA), za vzniku plazmidu pUCCHL. Fragment EcoRI-Dral o velikosti 0,6 kb z 5'-konce kódové DNA pro GG36DAI byl klonován v místech EcoRI a EcoRV plazmidu pBSKS (Stratagene, lne., San Diego, CA) za vzniku plazmidu pBC2SK5. Jediné místo působení enzymu EcoRi v plazmidu pBC2SK5 bylo odstraněno rozštěpením uvedeným enzymem s následným vyplněním vzniklých zakončení pomocí T4-DNA-polymerázy a pak byly fragmenty znovu navázány za vzniku plazmidu pBC2SK-5R, který již neobsahuje místo působení EcoRi. Fragment EcoRI-Dral, který byl klonován v plazmidu pBCSK-5R byl izolován jako fragment Pstl-HindlII a klonován vmiste Pstl—HindlII plazmidu pUCCHL (část vazné oblasti pUC19) za vzniku plazmidu pUCHHL5R. Kódový řetězec genu GG36DAI byl vyštěpen jako fragment EcoRI-BamHI a klonován v místech EcoRI-BamHI plazmidu pUCCHL5R za vzniku plazmidu pUCCAT. Velký fragment EcoRI-HindlII plazmidu pUCCAT byl pak klonován v místech působení EcoRi a HindlII v BS2KS+ za vzniku plazmidu pBCDAICAT.
K vytvoření DNA s jednoduchým řetězcem byl pBCDAICAT s obsahem E. coli infikován fágem R408 (Stratagene, San Diego, CA) způsobem podle publikace Russel M., Kidd S. a Kelley M. R., Gene, 45:333 - 338, 1986. Jakmile se získá DNA s jednoduchým řetězcem jako matrice, je možno uskutečnit běžnou tvorbu mutace podle příkladu 2. Dále bude uvedena pro lepší osvětlení konstrukce některých mutant.
Pro konstrukci B. lentus (GG36) N76D/S103A/V104I/L217H byl užit fragment EcoRI-BamHI DNA, který je kódem pro GG36 N76D/S103A/V104I při konstrukci pUCCAT (obr. 8) za vzniku plazmidu pBCDAICAT. Jakmile byla k dispozici DNA s jednoduchým řetězcem jako matrice, byl použit primer pro tvorbu mutace s následujícím řetězcem » *** ·’ X Clil ’ TAT GCC AGC CAC AAC GGT ACI TCG ATG GCT 3' (řetězec č. 13) za získání L217H. Stejně jako svrchu znamenají podržené nukleotidy změny, které byly uskutečněny a označení x Clal znamená, že po uskutečnění mutace bylo místo působení tohoto enzymu odstraněno. Mutace byla vytvořena způsobem podle příkladu 2. Po jejím uskutečnění byla nejprve DNA zkontrolována tak, aby bylo ověřeno vyloučení místa působení Clal. Ty klony, v nichž toto místo již nebylo přítomno, byly podrobeny analýze řetězce DNA, aby bylo ověřeno uskutečnění požadované změny L na H v poloze 217.
B. Konstrukce variant BPN' a jejich exprese v B. subtilis
Konstrukce BPN' zB. amyloliquefaciens, N76D/Q103A/Y104I/Y217L byla uskutečněna obdobným způsobem ve dvou po sobě následujících stupních. Nejprve byla v BPN' Y217L provedena záměna N76D za vzniku BPN' N76D/Y217L a pak byla provedena druhá mutace k převedení na výsledný BPN' N76D/Q103A/Y104I/Y217L. Aby bylo možno získat DNA s jednoduchým řetězcem jako matrici pro tvorbu první mutace, užije se kódový fragment pro subtilisin BPN' Y217L (EcoRI-BamHI, odvozený od plazmidu Y217L, popsaného v publikaci Wells J. a další, PNAD, 84, 5167, 1087) ke zkonstruování plazmidu pUCCATFNA (obr. 9). Plazmid pUCCATFNA, obsahující BPN' Y217L se užije ke zkonstruování plazmidu pBCFNACAT (obr. 9). DNA s jednoduchým řetězcem byla připravena svrchu uvedeným způsobem. Pro získání BPN' N76D/Y217L byl užit oligonukleotidový primer s řetězcem
- 17CZ 289323 B6 * **’ ** x Xbal ’ C ACA GTT GCG GCT CT& (JAT AAC TCA ATC GGT G 3 ‘ (řetězec č. 14) k uskutečnění změny N76D. Pak byla připravena DNA s jednoduchým řetězcem zplazmidu pBCFNACAT s obsahem BPN' N76D/Y217L (plazmid pBCFNACAT po uskutečnění mutace N76D) a pokračuje se mutací pomocí dalšího oligonukleotidu s řetězcem * ··* *’ X PvuII ’ GCT GAC GGT TCC GGC GCT ATT AG1 TGG ATC ATT 3 ’ (řetězec č. 15), čímž se získá BPN' N76D/Q103A/104I/Y217L. Všechny stupně, zahrnuté do klonování, přípravy DNA s jednoduchým řetězcem, tvorby mutace a vyhledávání mutant byly provedeny svrchu uvedeným způsobem.
Exprese genu pro BPN' a jeho varianty se dosáhne integrací DNA plazmidu (pBCFNACAT s obsahem různých variant genu BPN') přímo do kmene Bacillus subtilis, neprodukujícího proteázu, tak jak bylo popsáno v RE 34 606.
Způsobem podle příklad 2 a 5 bylo připraveno velké množství variant. Pro tyto varianty pak byly získány kinetické hodnoty a údaje o stálosti těchto látek. Kinetické zkoušky byly provedeny podle příkladu 3 a jejich výsledky jsou uvedeny v tabulce V. Údaje o stálosti byly získány dále uvedeným způsobem, výsledky jsou shrnuty v tabulce VI.
Zkoušky na tepelnou stálost
Čištěný enzym byl převeden do jiného pufru, a to do 0,1 M glycinu o pH 10,0 s 0,01 % prostředku Tween-80 tak, že enzym byl vynesen na vrchol sloupce s náplní Sephadex G-25 v rovnovážném stavu v uvedeném pufru a sloupec byl pak promýván tímtéž pufrem keluci enzymu.
Do zkumavky s obsahem 0,1 M glycinu s 0,01 % Tween-80 o pH 10,0 s teplotou 60 °C, udržovanou v termostatu byl přidán enzym v uvedeném pufru až do konečné koncentrace 15 pg/ml.
Podíly enzymu byly při stálé teplotě 60 °C odebírány po různých intervalech a okamžitě byla prokazována účinnost enzymu jeho přidáním do kyvety, obsahující 1,2 mM syntetického peptidu jako substrátu, šlo o sukcinyl-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitroanilid, rozpuštěný v 0,1 M tris-HCl-pufru o pH 8,6 a udržovaný na termostatu při teplotě 25 °C. Počáteční lineární reakční rychlost byla sledována spektrofotometricky záznamem absorbance reakčního produktu, p-nitroanilinu při 410 nm v průběhu času.
Poločas, to znamená doba do 50% inaktivace enzymu byla stanovena vynesením reakční rychlosti jako funkce doby inkubace při teplotě 60 °C.
Údaje jsou shrnuty v tabulce VI a jsou uvedeny v % poločasu, stanoveného pro subtilisin z Bacillust lentus (GG36) za stejných podmínek.
-18CZ 289323 B6
Tabulka V
enzym kcat Sí kcat/KM
(s'1) (mM) (s 1M~L
3. leacus subcilisin 170 0.78 2.20E-05
N76D/S1C3G/V104I’ 380 1.4 2.70E-05
N76D/S103A/V104F 730 0.33 2.20Ξ-06
N76D/S103A/V104N 790 2.8 2.80E-05
N76D/S103A/V104S 170 0.83 2.00E-05
N76D/S103A/V104T 37Q X.9 2.00E-05
N76D/S103A/V104W 880 0.31 2.80E*06
N763/S103A/V104Y 690 0.5 1.40Ε-Ό6
K27R/N763/V104Y/N123S 500 1.2 4.20E+05
N76D/S1C1G/S103A/V104I· 620 1.3 4.80E-0S
N76D/SX03A/V104X/S105A· 550 1.3 4.20E-05
N76D/S103A/V1041/S105D· 440 1.7 2.60E-05
N76D/S103A/V104T/T107A· 120 5.7 2.1Q£~04
N76D/S103A/V104T/I107I,* 310 3.2 9.70E-04
N76D/S103A/V104Z/L126A 90 2.2 4.10E-04
N76D/SIQ3A/V104Í/L126F 180 1.9 9.50E+04
N76D/S103A/V104Z/L126Z 100 2.4 4.20Ε·04
N76D/S103A/V104X/L126V 64 3.2 2.00E-04
N76D/S103A/V104Z/S128G* 560 1.7 3.3OE-O5
N76D/S103A/V104Z/S128L* 430 3.8 1.102-05
N76D/S103AZV104X/L135A 140 0.76 1.302-05
N76DZSX03A/V104IZLZ35F 390 0.69 5.702-05
N76DZSX03AZV104XZU35I 110 0.73 1.502+05
K76D/S103A/V104I/L135V 140 0.86 1.602-05
N76D/Si03A/V104I/S15«£· 170 2.6 5.502-04
N76DZSX03A/V104ZZS166D* 160 3.5 4.602-04
N76D/S103A/V104IZD197E 510 1.4 3.602-05
N7ÓD/S103A/V1O41/N2O4A· 530 1.1 4.802-05
N76DZS103A/V104IZN204C- 580 1.4 4.102-05
N763/SX03A/V104X/N204C’ 370 1.3 2.902-05
N76/S103AZV104XZP210Z’ 500 1.2 4.202-05
N76D/S103A/V104I/L217H· 80 0.63 1.302-05
N76D/SÍ03A/V104X/M222A 70 3.1 2.302-04
N76DZS103A/V1O4IZM222S 80 3.1 2.602*04
N76DZS103AZV104IZT260P 660 1.5 4.40E+05
N76DZS103A/V104Z/S265N 590 1.3 4.502-05
K27R/N763/VX04Y/X107V/N123S 220 1.4 1.60E+05
K27RZN76DZV104Y/N123SZD197E 430 1.1 3.9OE+O5
X27R/N763/V104YZN123SZN204C 400 1.1 3.60E+05
K27R/N75D/VX04Y/N123S/Q206Ú 440 1.2 3-70S-05
K27RZN76DZV104YZN123SZS216V 440 1.2 3.70E-05
-19CZ 289323 B6
K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S
K27R/N76D/V104Y/N123S/T260P
K27R/N76D/V104Y/N123S/T274A
N76D/S103A/V104I/L126F/S265N
K76D/S103A/V104I/S156E/S166D·
K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/G197E
K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/N218S
K27R/N76D/V104Y/N123S/D197E/N218S
K27R/N76D/V104Y/N123S/N204C/N218S
K27R/N76D/V104Y/N123S/Q2061./N218S
X27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/T260P
K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/'r274A
K27R/N76D/V104Y/Q109S/m.23S/N218S/T274A
X27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/D197E/N218S
3. aayleliquaíaciens subcilisin (BPN’)
BFN‘-N76D/Y217L*
760
410
390
170
0.98 7.80E*05
1.2 3.40E+05 l 3.90E-05
2.1 8.10E*04
6.3 6.40E-03
0.98 4.20E+05
410
540 0.66 8.20E+05
77Q 0.79 9.80E+05
610 0.99 6.20E*05
580 0.78 7.40E*05
660 1 6.60E*05
590 0.89 6.6ΟΕτΟ5
520 1 5.20E*05
460 0.65 7.10E+05
50 0.14 3.60E*05
380 0.46 8.30E+05
Tyto mutanty byly připraveny podle příkladu 5, všechny ostatní byly připraveny podle příkladu 2.
Tabulka VI enzym tepelná stálost (v % poločasu nativního enzymu)
B. lencus subcilisin 100
N76D 590
N76D/G99D 840
N76D/S103A 390
N76D/V104I 660
N76D/I107V 710
K76D/N123S 70
N76D/S99D/S101X 610
N76D/S99D/S103A 590
N76D/S99D/V104I 910
N76D/S101R./S103A 930
N76D/S101K/VXQ4I 500
N76D/S103A/V104I 460
N76D/S103G/V104I- 370
N76D/S103A/V104F 480
N76D/S103A/V104N 230
N760/S103A/VT04S 230
N760/S103A/V1Q4T 370
N760/S103A/V104W 280
-20CZ 289323 B6
N75D/S103A/V104Y400
N76D/V1Q4Z/X1O7V940
N76D/V104Y/I107V820
N76O/V104í/N123S80
N76D/X107V/N123S150
K27R/N76D/V104Y/N123SXOO
N76D/S99D/S101R/S103A570
N76O/S99D/S101R/V104I1000
N76D/S99D/S103A/V104I830
N76D/S101G/S103A/V104I·390
N76D/S101R/S103A/V104I470
N76D/S103A/V104X/S10SA’360
N76D/S1Q3A/V104I/S105D’370
N76D/S103A/V104T/X107A*270
N76D/S103A/V104T/I107L*230
N76D/S103A/V1O4I/N123S110
N7SD/V1Q4I/I107V/1Í123S220
N76D/S103A/V104I/L12SA270
N76D/S103A/V1Q4X/L126F950
N76D/S103A/V104X/L126Z410
N76D/S103A/V104X/U26V320
N75D/S103A/V104X/S123G’640
N76D/S103A/V104X/S12SL’750
N76D/S103A/V104X/L135A230
N76O/S103A/V104X/L135F200
N76D/S103A/V104X/L135X510
N76D/SÍ03A/V104X/L135V500
N76D/S103A/V104X/S15óS’120
N76D/S103A/V104X/S1Ó5D’590
N76D/S103A/V104I/D197E460
N76D/S103A/V104X/N204A’230
N76D/S103A/V104X/N204G’240
N76D/S103A/V104I/N204C’500
N76D/5103A/V104X/P210I*1370
N7SD/S103A/V104X/L217H’60
N76D/S103A/V104X/M222A520
N76D/S103A/V104I/M222S490
N76D/S103A/V104I/T260P490
N76D/S103A/V104I/S265N360
K27R/N76D/V104Y/X1Q7V/N123S210
K27R/N76D/V104Y/N123S/D197E120
K27R/N76D/V104Y/N123S/N204C110
K27R/N76D/V104Y/N123S/Q206L380
K27R/N76D/V104Y/N123S/S216V140
K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S270
K27R/N76D/V104Y/N123S/T260P40
K27R/N76D/V104Y/N123S/T274A50
N76D/S99D/S1Q1R/S103A/V104I590
N76D/S99D/S103A/V104I/N123S110
N76D/S103A/V104X/L126F/S265N310
N76D/S103A/V104E/5156E/S166D’220
-21 CZ 289323 B6
K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/G197E K27R/N76D/V104Y/N123S/G19SE/N218S K27R/N76D/V104Y/N123S/D197S/N218S K27R/N76D/V104Y/N123S/N204C/N218S K27R/N76D/V104Y/N123S/Q206L/N218S K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/T260P K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/T274A N76D/S99D/S101R/S103A/V104Z/N123S K27R/N76D/V104Y/Q109S/N123S/N21SS/T274A K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/D197E/N218S 90 250 270 460 1400 310 180 90 230 240
B. amyloliquefaciens subcilisin (ΒΡ5Γ) 3PN'-N76D/Y217L’ 100 420
* Tyto mutanty byly vyrobeny způsobem podle příkladu 5, všechny ostatní byly vyrobeny podle příkladu 2.
Příklad 6
Test na prací účinnost
Prací účinnost různých variant z předchozích příkladů byla vyhodnocena měřením odstranění skvrny, způsobené nanesením EMPA 116 (krev/mléko/uhlíková čerň na bavlně) na pokusných částech tkaniny (Testfabrick, Inc., Middlesex, NJ 07030).
Šest pokusných vzorků tkaniny EMPA 116, rozdělené na úseky s rozměrem 7,5 x 10 cm s vroubkovanými okraji se uloží do zkušebního zařízení Model 7243S Terg-O-Tometer (united States Testing CO., Inc. Hoboken, NJ) s obsahem 1000 ml vody s tvrdostí 15 gpg (hmotnostní poměr vápenatých a hořečnatých iontů 3 : 1), 7 g pracího prostředku a příslušného množství enzymu. Čisticí prostředek byl prostředek WFK1 (wfk-Testgewebe GmbH, Adlerstrasse 42, Postfach 13 07 62, D-47759, Krefeld, SRN). Složení je uvedeno v následující tabulce:
složka % výsledného prostředku
zeolit A 25
síran sodný 25
bezvodý uhličitan sodný 10
lineární alkylbenzensulfonáty 8,8
alkoholethoxylát (7-8 EO) 4,5
sodné mýdlo 3
křemičitan sodný
SiO2:Na2O = 3,3 : 1 3
L tomuto základnímu prostředku se přidají následující složky:
monohydrát perboritanu sodného 13
kopolymer (Sokalan CP5 4
TAED (Mykon ATC Green) 3
enzym 0,5
zjasňovač (Tinopal AMS-GX) 0,2
-22CZ 289323 B6
Monohydrát perboritanu sodného byl získán od Degussa Corporation, Ridgefíeld-Park, NJ 07660. Sokalan CP5 byl získán od BASF Corporation Parsippany, NJ 07054. Mykon ATC Green (TAED, tetraacetylethylendiamin) byl získán od Warwick Intemational Limite, Mostyn, Holywell, Clwyd CH8 9HE, Anglie, Tinopal AMS GX byl získán od Ciba-Geigy Corporation., 5 Greensboro, NC 27419.
Šest vzorků bylo vybráno pomocí čisticího prostředku s enzymem, praní trvalo 30 minut při teplotě 60 °C, pak byly vzorky dvakrát máchány vždy 5 minut v 1000 ml vody. Enzymy byly přidávány do konečné koncentrace 0,05 až 1 ppm pro standardní křivku a 0,25 ppm pro běžnou ío analýzu. Pak byly vzorky usušeny a vyžehleny a odraz světla byl měřen při použití hodnoty L křivky, získaný na Minolta Chromá Meter, Model CR-200 (Minolta Corporation, Ramsey, NJ 07446). Účinnost se vyjadřuje v procentech účinnosti proteázy B. lentus (GG36) a vypočítá se tak, že se množství proteázy B. lentus (GG36) vydělí množstvím varianty, jehož je zapotřebí k dosažení téhož účinku a výsledek se vynásobí stem. Údaje jsou shrnuty v tabulce VII.
Tabulka VII enzym prací účinnost
3. Lencus subcilisin N76D
N76D/S103A N76D/V104I N76D/X107V N76D/S99D/S101R N76D/S99D/S103A N76D/S1Q1R/S103A N76D/S10XR/V104I N76D/S103A/V104I N76D/SX03G/VL04I N76D/S103A/V104F N76D/S103A/V104N N76D/S103A/V104T N76D/V1Q4I/Z1Q7V N76D/S99D/S101R/S103A N76D/S99D/S101R/V104I N76D/S101G/S103A/V104Z N76D/S101R/S103A/V104X N76D/S103A/V104I/S105A N76D/S103A/V104'J/Z10A N76D/S103A/V104T/I107L N7ÍD/S103A/V104I/L126F N76D/S103A/VK34I/S128G N76D/S103A/V104I/L135r N76D/S103A/VZ04X/L13SV N76D/SIQ3A/V104I/D197E N76D/S103A/V104X/N204A N76D/S103A/V104X/N204G N76D/S103A/VZ04I/P210I N76D/S103A/V104I/M222A N760/S103A/V104I/T260P N76D/S103A/V104X/S285N
100
310
230
130
160
370
290
130
300
320
160
210
110
170
210
220
140
170
1S0
170
120
110
110
280
160
160
170
160
150
470
100
280
190
-23CZ 289323 B6
Příklad 7
Stálost proteázy v kapalném pracím prostředku
Srovnání stálosti proteázy v kapalném pracím prostředku bylo provedeno pro subtilisin z Bacillus lentus a jeho variantu N76D/S103A/V104Y svrchu uvedeným způsobem. Použitým pracím prostředkem byl běžně dodáván prostředek Tide Ultra (Procter and gamble Company, USA). K inaktivaci proteázy in sítu bylo zapotřebí prací prostředek zahřát. K tomuto účelu byl prostředek inkubován 4,5 hodiny při teplotě 96 °C. Pak byl ke pracovanému prostředku přidán subtilisin zB. lentus nebo jeho varianta N76D/S103A/V104I v množství 20 g/1 při teplotě místnosti, takže konečná koncentrace enzymu v pracím prostředku Tide Ultra byla 0,3 g/1. Pak byl prostředek inkubován ve vodní lázni s teplotou 50 °C v termostatu. Podíly byly odebrány v době 0 a 24, 46, 76 a 112 hodin od začátku zahřívání a byla stanovena účinnost enzymu jeho vložením do kyvety s obsahem 1,2 mM syntetického peptidu, suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilidu v 0,1 M tris-HCl pufru o pH 8,6 s teplotou 25 °C, uchovávanou v termostatu. Lineární rychlost reakce byla sledována spektrofotometricky sledováním absorbance reakčního produktu, p-nitroanilinu, při 410 nm v průběhu času. Jak je zřejmé z obr. 10, byla varianta N76D/S103A/VI041 významně stálejší proti inaktivaci tepla než nativní enzym B. lentus. Stanovený poločas inaktivace v uvedeném pracím prostředku pro oba enzymy za těchto podmínek je 45 hodin pro subtilisin B. lentus a 125 hodin pro uvedenou variantu.
V průběhu přihlášky jsou uvedeny kódy pro aminokyseliny ve formě jednoho nebo tří písmen. Jde o běžné kódy podle publikace Dále J. W. 1989, Molecular Genetics of Bacteria, John Wiley and Sons, Ltd., doplněk B.
Vynález byl popsán v souvislosti s řadou výhodných provedení. Je však zřejmé, že by bylo možno navrhnout ještě řadu změn a ekvivalentní modifikací bez odchýlení smyslu vynálezu tak, jak je vyjádřen v patentových nárocích, takže vynález nemůže být omezen na popsaná výhodná provedení.
2) Informace o řetězci č. 1:
i) vlastnosti řetězce:
A) délka: 19 párů bází
B) typ: nukleová kyselina
C) druh řetězce: jednoduchý
D) topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA (genomu) xi) Popis řetězce č. 1
GAAGCTGCAA CTCGTTAAA
2) Informace o řetězci č. 2:
i) vlastnosti řetězce:
A) délka: 18 párů bází
B) typ: nukleová kyselina
C) druh řetězce: jednoduchý
-24CZ 289323 B6
D) topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA (genomu) xi) Popis řetězce č. 2:
GCTGCTCTAG ACAATTCG
2) Informace o řetězci č. 3:
i) vlastnosti řetězce:
A) délka: 39 párů bází
B) typ: nukleová kyselina
C) druh řetězce: jednoduchý
D) topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA (genomu) xi) Popis řetězce č. 3:
GTATTAGGGG CGGACGGTCG AGGCGCCATC AGCTCGATT
2) Informace o řetězci č. 4:
i) vlastnosti řetězce:
A) délka: 33 párů bází
B) typ: nukleová kyselina
C) druh řetězce: jednoduchý
D) topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA (genomu) xi) Popis řetězce č. 4:
TCAGGTTCGG TCTCGAGCGT TGCCCAAGGA TTG
2) Informace o řetězci č. 5:
i) vlastnosti řetězce:
A) délka: 22 párů bází
B) typ: nukleová kyselina
C) druh řetězce: jednoduchý
D) topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA (genomu) xi) Popis řetězce č. 5:
CACGTTGCTA GCTTGAGTTT AG
-25CZ 289323 B6
2) Informace o řetězci č. 6:
i) vlastnosti řetězce:
A) délka: 1497 párů bází
B) typ: nukleová kyselina
C) druh řetězce: jednoduchý
D) topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA (genomu) xi) Popis řetězce č. 6:
AATATTATTC
CATACTATAC
AATTAATACA
CAGAATAATC
TGTCTATTGG
TTATTCJGCA
AATGAAAAAA
AGGAGAGGAT
AAAGAGTGAG
AGGCAAAAAA
GTATGGATCA
120
TGCTTTAGCG
TTAATGTTTA
CGATGGCGTT
CGGCAGCACA
TC 'CTGCC
130
AGGCGGCAGG
GAAATCAAAC
GGGGAAAAGA
AATATATTGT
CAGACAATGA
240
GCACGATGAG
CGCCGCTAAG
AAGAAAGATG
TCATTTCTGA
AAACTGCAAA
300
AGCAATTCAA
ATATGTAGAC
GCAGCTTCAG TCACATTAAA
CGAAAAAGC
GTAAAAGAAT
360
TGAAAAAAGA
AAGAAGATCA
CGTAGCACAT
GCSTACGCGC
420
CTGGATCAAA
TGTTAAAGTA
GCGGTTATCG
TAAAGGTAGC
AAGCGGAGC
ACTCTCACGG
TCACTTTACG
GCCAATACAG
TTAACATGAG
CAAGCACAGT
GCAGCAACCA
AAGAGCATCT
TTCTCAAGCG
GCGTATCTAT
CCAAAGCACG
TGGCATCTC
CAAACACTCA
AGTCCGCAGC
AGTTTAGAAA
ACTATGGAAA
AGGGCTGATC
V.
ATTArTTTTC
CGACGGATGG
CGTAACGGC
UrtA.
AAGCCCCTGC
CTTCTGAAAC
CTGTAAAAG?
AGTGGGCGAT
CTGCTGCTTT
CTTCTGTCAT
TAGGACCTGA
ACAAATACGG crTTGArrcr
ACACCACTAC
CGGCAGCTCA
TTCCTCCGCA
GAGAAACGGC cgccgcttc:
TCTGCACTC7
CAAGACAACA
4ao
540
600
TAATAACTCA
GACGGTTCCG
660
720
CGCAAACAAT
ATGGACGTTA
780
840
CGAAGGCACT
TGCAGTAGGC
GCTTGATGTC
TTCTAAGCAC
GTAAAACATA
TGTTCAATCí
ATCGCACCTG
CCGAACTGGA
GC7CCATAAT
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
80
1440
149?
-26CZ 289323 B6
2) Informace o řetězci č. 7:
i) vlastnosti řetězce:
A) délka: 275 párů bází
B) typ: aminokyseliny
C) druh řetězce: jednoduchý
D) topologie: lineární ii) Typ molekuly: bílkovina xi) Popis řetězce č. 7:
Ala Gin Ser 1 Val 3 Tyr Gly Val Ser Gin Ile 10 Lys Ala Pro Ala Leu 15
His Ser Gin Gly Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp
20 25 30
Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala
35 40 45
Ser Mec Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gin Asp Asn Asn Ser His
50 55 60
Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Zle Gly
65 70 7S 80
Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu
as 90 95
Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gin Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu
100 105 110
Trp Ala Ile Ala Asn Asn Meo Asd Val Ile Asn Mec Ser Leu Gly Gly
115 120 125
Pra Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala
130 135 140
Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly
145 150 153 160
Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala
163 170 175
Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gin Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val
180 185 190
Gly Pro Glu Leu Asp Val Mec Ala Pro Gly Val Ser Ile Gin Ser Thr
195 200 205
Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Hec Ala Ser
210 215 220
Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Zle Leu Ser Lys His Pro Asn
225 230 235 240
-27CZ 289323 B6
Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys
250 255
Cly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gin Ala 265 270
Trp Thr Asn Thr Gin Val Arg 245 Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr 260
Ala Ala Gin 275
2) Informace o řetězci č. 8:
J i) vlastnosti řetězce:
10 A) délka: 275 párů bází B) typ: aminokyseliny C) druh řetězce: jednoduchý D) topologie: lineární
ii) Typ molekuly: bílkovina
15 XÍ) Popis řetězce č. 8:
Ala Gin Ser Val Pro Tyr Gly Ile Ser Gin Ile Lys Ala Pro Ala Leu
1 5 10 15
His Ser Gin Gly Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp
20 25 30
Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro ASp Leu Asn Val Arg Gly Gly Ala
35 40 45
Ser Phe Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Tyr Gin Asp Gly Ser Ser His
50 55 60
Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly
65 70 75 80
Val Leu Gly Val Ser Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu
as 90 95
Asp Ser Thr Gly Ser Gly Gin Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu
100 105 110
Trp Ala Ile Ser Asn Asn Hec Asp Val Ile Asn Mec Ser Leu Gly Gly
115 120 125
Pro Thr Gly Ser Thr Ala Leu Lys Thr Val Val AS? Lys Ala Val Ser
130 135 140
Ser Gly Ile Val Val Ala Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Ser Ser Gly
145 150 155 160
Ser Thr Ser Thr Val Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Pro Ser Thr Ile Ala
165 170 175
-28CZ 289323 B6
Val Gly Ala Val Asn Ser Ser Asn Gin Arg Ala Ser Phe Ser Ser Ala
180 185 190
Gly Ser Glu Leu Asp Val Mec Ala Pra Gly Val Ser Ile Gin Ser Thr
195 200 205
Leu Pra Gly Gly Thr Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Hez Ala Thr
210 215 220
Pto His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His
225 230 235 24*0
Trp Thr Asn Ala Gin Val Arg Asp Arg Leu Glu Ser Thr Ala Tíxít Tyr
245 250 255
Leu Gly Asn Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Zle Asn Val Gin Ala
260 255 270
Ala Ala Gin
27S
2) Informace o řetězci č. 9:
10 i) i·) vlastnosti řetězce: A) délka: 274 párů bází B) typ: aminokyseliny C) druh řetězce: jednoduchý D) topologie: lineární Typ molekuly: bílkovina
15 xi) Popis řetězce č. 9:
Ala Gin Thr Val Prs Tyr Gly Zle Pra Leu Zle Lys Ala Asp Lys Val
* 5 10 15
Gin Ala Gin Gly Phe Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp
20 25 30
Thr Gly Zle Gin Ala Ser His Pro ASp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala
35 40 45
Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly
50 55 60
Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val
65 70 75 80
Leu Gly Val Ala Pro Ser Val Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn
85 90 95
Ser Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Ser Gly Zle Val Ser Gly Ile Glu Trp
100 105 110
-29CZ 289323 B6
Ala Thr Thr Asn Gly Mec Asp Val Zle Asn Mec Ser Leu Gly Gly Ala
115 120 125
Ser Gly Ser Thr Ala Mec Lys Gin Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg
130 135 140
Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Asn Ser Gly Ser
145 150 155 160
Thr Asn Thr Zle Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Val Zle Ala Val
165 170 175
Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly
180 185 190
Ala Glu Leu Glu Val Mec Ala Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr
195 20Q 205
Pro Thr Asn Thr Tyr Ala Thr Leu Asn Gly Thr Ser Mec Ala Ser ?ro
210 215 220
ais Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Zle Leu Ser Lys His Pro Asn Leu
225 230 235 240
Ses Ala Ser Gin Val Arg Asn Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu
245 250 255
Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Zle Asn Val Glu Ala Ala
260 265 270
Ala.
Gin
2) Informace o řetězci č. 10:
i) vlastnosti řetězce:
A) délka: 269 párů bází
B) typ: aminokyseliny
C) druh řetězce: jednoduchý
D) topologie: lineární
Typ molekuly: bílkovina ii)
xi) Pop iis řet< ízce č . 10:
Ala Glr. Ser Val Pro Trp Gly Zle Ser Arg Val Gin Ala Pro Ala Ala
1 5 10 15
His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp
20 25 30
Thr Gly Zle Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Zle Arg Gly Gly Ala Ser
35 40 45
Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gin Asp Gly Asn Gly His Gly Thr
50 55 60
-30CZ 289323 B6
His Val Ala Gly Thr Zle Ala Ala Leu Asn Asn Ser Zle Gly Val Leu
65 70 75 80
Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Glv Ala
85 90 95*
ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Zle Ala Gin Gly Leu Glu Tr? Ala
100 105 110
Gly Asn Asn Gly Hec His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser
115 120 125
Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gin Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Ar; Gly
130 135 140
Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser XL* Ser
145 150 155 160
Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Hec Ala Val Gly Ala Thr Asn Gin
165 170 175
Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gin Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Zle
130 135 190
Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gin Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr
195 200 205
Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Mec Ala Thr Pro His Val Ala Gly AL&
210 215 220
Ala Ala Leu Val Lys Gin Lys Asn Pro Ser Tm Ser Asn Val Glr. lis
225 230 235 240
Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Asn Leu
245 2S0 255
Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg
260 265
2) Informace o řetězci č. 11:
i) vlastnosti řetězce:
A) délka: 1140 párů bází
B) typ: nukleová kyselina ío C) druh řetězce: jednoduchý
D) topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA (genomu) xi) Popis řetězce č. 11:
-31 CZ 289323 B6
ATGAAGAAAC
TACTCATTTC
TGTTGC
AGTTCATCGA
GCAAAAGAAA
TGGCTTTAAT
120
GAGCAGGAAG
CTGTCAGTGA
GTTTGTAGAA \^\ΛΜ λ. ÓwAwV
130
CTCTCTGAGG
X * f* . * « MM .lAunuyAný 4
AATTTGAAAC
240
AGTTAAGC
AACTCGATCC
AGCGATTTC'
300
TATATTGAAG
AGGATGCAGA
AGTAACGACA
ATGGCGCAA'
CAGTGCGATG
GGGAATTAGC
360
CGTGTGCAAG
CGCGAGCTGC
420
GTCCTCGATA «* « mww > « t m «
IjaL « · ΛΛΑ1Λ
430
AACCATCCAC « Uvwrt t oxjw
AATGGGCATG
GCACGCATGT w*.<.U\aw%Lj
540
MV4M1 /»>*«««*«*
ΓΑ· ·4%ΙΑΚΤ4\* ;U\
GCTCGATTGC /»**« » ***» **
UuaaL . A.rtk.
600
660 /**
GGAACAATGG
GTTTAGGAAG
720
TTGAGCAAGC
TGTTAATAGC
GGGACTTCTA
780
GCATCTGGGA
AGGCTCAATC
840
GCAGTCGGAG
CTACTGACCA
AAACAACAAC
UA.UVwAŮ\·
TTTGACAGTA
TGGCGCAGGG
900
CTTGACATTG
TCGCACCAGG
CAGAGCACAT
ACCCAGGTTC
AACGTATGC
960
CAAAAGAAC
AGCTTAGGAA
GTACATCGAT
CATG7TGCAG
GTGCAGCAGC
CCTTGTTAAA
1020
CAATGTACAA
ATCCGCAATC
ATCTAAAGAA
TACGGCAACG
1080
GCACGAACTT
GTATGGAAGC
ATGCAGAAGC
GGCAACACGC
2) Informace o řetězci č. 12:
i) vlastnosti řetězce:
A) délka: 1140 párů bází
B) typ: nukleová kyselina
C) druh řetězce: jednoduchý
D) topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA (genomu) xi) Popis řetězce č. 12:
-32CZ 289323 B6
ATGAAGAAAC AATTGTCGCA AGCACCGCAC TACTCATTTC TGTTGCTTTT 60
AGTTCATCGA . uáju Uxjvt* TGCTGAAGAA GCAAAAGAAA AATATTTAAT TGGCTTTAAT 120
GAGCAGGAAG LÝ U kUwlUA GTTTGTAGAA CAAGTAGAGG CAAATGACGA GGTCGCCarr 130
CTCTCTGAGG AAGAGGAAGT CGAAATTGAA TTGCTTCATG AATTTGAAAC GATTCCTGT7 240
TTATCCGTTG AGTTAAGCCC AGAAGATGTG GACGCGCTTG AACTCGATCC AGCGATTTCT 300
TATATTGAAG AGGATGCAGA AGTAACGACA ATGGCGCAAT CAGTGCCATG GGGAATTAGC 360
CGTGTGCAAG CCCCAGCTGC CCATAACCGT GGATTGACAG GTTCTGGTG7 AAAAGTTGCT 420
GTCCTCGATA CAGGTATTTC CACTCATCCA GACTTAAATA TTCGTGGTGG CGCTAGCTTT 480
/»*** Ζ*Ζ·Ζ·Λ QkAtyl-AWWW AACGATCCAC TCAAGATGGG AATGGGCATG GCACGCATGT GGCCGGGACG 540
ATTGCTGCTT TAGACAACTC GATTGGCGTT CTTGGCGTAG CGCGGAGCGC GGAACTATAC 600
GCTGTTAAAG TATTAGGGGC η*'*,***«*Τ·Γ·1 4 x \Xa GGCGCCATCA CCAAGGATTG 660
wnA X ww'— GGAACAATGG GCTAATTTGA GT7TAGGAAG CGCTTCGCCA 720
Μ Λ 7TGAGCAAGC TGTTAATAGC GCGACTTC7A «k. « TGTTGTAGCG 730
ATTCAGGTGC AGGCTCAATC AGCTATCCGG CCCGTTATGC gaacgcaatg 340
GGAG7CGGAG CTACTGACCA AAACAACAAC CGCGCCAGCT TTTCACAGTA TGGCGCAGGG 900
CTTGACATTG z·**· TGTAAACGTG CAGAGCACAT ACCCAGGT7C AACGTATGCC 960
AGC7TAAACG GTACA7CGAT GGCtACTCCT CATGTTGCAG CCTTGTTAAA 1020
CAAAAGAACC CATCTTGGTC CAATGTACAA rti k· wWWJlA·s· A4^ iAAAÍJAA TACGGCAACG 1080
AGCTTAGGAA GCACGAACTT GTATGGAAGC GGACTTGTCA ATGCAGAAGC GGCAACACGC 1140
2) Informace o řetězci č. 13:
i) vlastnosti řetězce:
A) délka: 30 párů bází
B) typ: nukleová kyselina io C) druh řetězce: jednoduchý
D) topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA (genomu) xi) Popis řetězce č. 13:
TATGCOAGCC ACAACGGTAC TTCGATGGCT
-33CZ 289323 B6
2) Informace o řetězci č. 14:
i) vlastnosti řetězce:
A) délka: 31 párů bází
B) typ: nukleová kyselina
C) druh řetězce: jednoduchý
D) topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA (genomu) xi) Popis řetězce č. 14:
CACAGTTGCG GCTCTAGATA ACTCAATCGG T
2) Informace o řetězci č. 15:
i) vlastnosti řetězce:
A) délka: 33 párů bází
B) typ: nukleová kyselina
C) druh řetězce: jednoduchý
D) topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA (genomu) xi) Popis řetězce č. 15:

Claims (23)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Izolovaná varianta subtilisinu se sekvencí aminokyselin obsahující řadu substitucí jinými přírodními aminokyselinami, přičemž tyto substituce se nacházejí (a) v prekurzoru subtilisinu v poloze, ekvivalentní poloze +76 v subtilisinu Bacillus amyloliquefaciens, přírodní aminokyselina pro substituci se volí ze skupiny A, R, N, C, G, Η, I, L, K, M, F, P, S, T, W, YaVa (b) v jedné nebo většímu počtu poloh v prekurzoru sibtilisinu, ekvivalentních polohách +27, +99, +101, +103, +104, +105, +107, +109, +123, +126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210, +216, +217, +218, +222, +260, +265 a +274 subtilisinu z Bacillus amyloliquefaciens, přičemž aminokyselina v poloze v prekurzoru subtilisinu, ekvivalentní poloze +195 v subtilisinu z Bacillus amyloliquefaciens je substituována odlišnými přírodními aminokyselinami, které se volí ze skupiny A, R, N, D, C, Q, G, Η, I, L, K, M, F, P, S,T, W, Y a V a aminokyselina v poloze prekurzoru subtilisinu, ekvivalentní poloze +206 v subtilisinu Bacillus amyloliquefacient je
    -34CZ 289323 B6 substituována odlišnými přírodními aminokyselinami ze skupiny A, R, N, D, E, Q, G, Η, I, L, K,
    M, F, P, S, T, W.YaV.
  2. 2. Izolovaná varianta subtilisinu se sekvencí aminokyselin, obsahující řadu substitucí odlišnými přírodními aminokyselinami, přičemž tyto substituce se nacházejí (a) v poloze prekurzorů subtilisinu, ekvivalentní poloze +76 v subtilisinu Bacillus amyloliquefaciens a (b) v poloze, ekvivalentní poloze +101, v níž se odlišné přírodní aminokyseliny volí ze skupiny G, D, K, L, A, E, S a R a (c) v jedné nebo větším počtu poloh v prekurzorů subtilisinu, ekvivalentních polohách +27, +99, +103, +104, +105, +107, +123, +126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210, +216, +217, +222, +260, +265 a +274 subtilisinu z Bacillus amyloliquefaciens, přičemž aminokyselina v poloze v prekurzorů subtilisinu, ekvivalentní poloze +195 v subtilisinu z Bacillus amyloliquefaciens je substituována odlišnými přírodními aminokyselinami, které se volí ze skupiny A, R, N, D, C, Q, G, Η, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y a V a aminokyselina v poloze prekurzorů sibtilisinu, ekvivalentní poloze +206 v subtilisinu Bacillus amyloliquefaciens je substituována odlišnými přírodními aminokyselinami ze skupiny A, R, N, D, E, Q, G, Η, I, L, K, M, F, P, S, T, W, YaV.
  3. 3. Varianta subtilisinu podle nároku 2, v níž se aminokyseliny pro náhradu aminokyseliny v poloze, ekvivalentní poloze +101 volí ze skupiny R, G, D, K, L, A a E.
  4. 4. Izolovaná varianta subtilisinu se sekvencí aminokyselin, obsahující řadu substitucí odlišnou přírodní aminokyselinou, přičemž tyto substituce se nacházejí (a) v poloze prekurzorů subtilisinu, ekvivalentní poloze +76 v subtilisinu z Bacillus amyloliquefaciens a (b) v poloze ekvivalentní poloze +105, přičemž přírodní aminokyselina se volí ze skupiny A, D, G, R a N a (c) v jedné nebo většímu počtu poloh v prekurzorů subtilisinu, ekvivalentních polohách +27, +99, +101, +103, +104, +107, +123, +126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210, +216, +217, +222, +260, +265 a +274 subtilisinu z Bacillus amyloliquefaciens, přičemž aminokyselina v poloze v prekurzorů subtilisinu, ekvivalentní poloze +195 v subtilisinu z Bacillus amyloliquefaciens je substituována odlišnými přírodními aminokyselinami, které se volí ze skupiny A, R, N, D, C, Q, G, Η, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y a V a aminokyselina v poloze prekurzorů subtilisinu, ekvivalentní poloze +206 v subtilisinu Bacillus amyloliquefaciens je substituována odlišnými přírodními aminokyselinami ze skupiny A, R, N, D, E, Q, G, Η, I, L, K, M, F, P, S, T, W, YaV.
  5. 5. Varianta subtilisinu podle nároku 4, v níž se aminokyselina pro náhradu aminokyseliny v poloze, ekvivalentní poloze +105 volí ze skupiny A a D.
  6. 6. Izolovaná varianta subtilisinu se sekvencí aminokyselin, obsahující řadu substitucí odlišnými přírodními aminokyselinami, přičemž tyto substituce se nacházejí (a) v poloze prekurzorů subtilisinu, ekvivalentní poloze +76 v subtilisinu z Bacillus amyloliquefaciens,
    -35CZ 289323 B6 (b) v poloze, ekvivalentní poloze +135, přičemž odlišné přírodní aminokyseliny se volí ze skupiny A, F, I, S a V a (c) v jedné nebo většímu počtu poloh v prekurzoru subtilisinu, ekvivalentních polohách +27, +99, +101, +103, +104, +105, +107, +123, +126, +128, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210, +216, +217, +222, +260, +265 a +274 subtilisinu z Bacillus amyloliquefaciens, přičemž aminokyselina v poloze v prekurzoru subtilisinu, ekvivalentní poloze +195 v subtilisinu z Bacillus amyloliquefaciens je substituována odlišnými přírodními aminokyselinami, které se volí ze skupiny A, R, N, D, C, Q, G, Η, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y a V a aminokyselina v poloze prekurzoru subtilisinu, ekvivalentní poloze +206 v subtilisinu Bacillus amyloliquefaciens je substituována odlišnými přírodními aminokyselinami ze skupiny A, R, N, D, E, Q, G, Η, I, L, K, Μ, P, S, T, W, YaV.
  7. 7. Varianta subtilisinu podle nároku 6, v níž se aminokyselina pro náhradu aminokyseliny v poloze, ekvivalentní poloze +135 volí ze skupiny I, A a S.
  8. 8. Izolovaná varianta subtilisinu se sekvencí aminokyselin, obsahující řadu substitucí odlišnými přírodními aminokyselinami, přičemž tyto substituce se nacházejí (a) v poloze prekurzoru subtilisinu, ekvivalentní poloze +76 v subtilisinu Bacillus amyloliquefaciens, (b) v poloze, ekvivalentní poloze +210, přičemž přírodní aminokyselina pro náhradu této aminokyseliny se volí ze skupiny L, I, S, C a F a (c) v jedné nebo větším počtu poloh v prekurzoru subtilisinu ekvivalentních polohách +27, +99, +101, +103, +104, +105, +107, +123, +126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +216, +217, +222, +260, +265 a +274 subtilisinu z Bacillus amyloliquefaciens, přičemž aminokyselina v poloze v prekurzoru subtilisinu, ekvivalentní poloze +195 v subtilisinu z Bacillus amyloliquefaciens je substituována odlišnými přírodními aminokyselinami, které se volí ze skupiny A, R, N, D, C, Q, G, Η, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, a V a aminokyselina v poloze prekurzoru subtilisinu, ekvivalentní poloze +206 v subtilisinu Bacillus amyloliquefaciens je substituována odlišnými přírodními aminokyselinami ze skupiny A, R, N, D, E, Q, G, Η, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y a V.
  9. 9. Varianta subtilisinu podle nároku 8, v níž se aminokyselina pro náhradu aminokyseliny v poloze, ekvivalentní poloze +210 volí ze skupiny I, S a C.
  10. 10. Izolovaná varianta subtilisinu se sekvencí aminokyselin, obsahující řadu substitucí jinými přírodními aminokyselinami, přičemž tyto substituce se nacházejí (a) v poloze prekurzoru subtilisinu, ekvivalentní poloze +76 v subtilisinu Bacillus amyloliqefaciens, (b) v poloze, ekvivalentní poloze +260, přičemž odlišná přírodní aminokyselina pro náhradu se volí ze skupiny P, N, G, A, S, C, K, a D, a (c) v jedné nebo většímu počtu poloh v prekurzoru subtilisinu, ekvivalentních polohách +27, +99, +101, +103, +104, +105, +107, +123, +126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210, +216, +217, +222, +265 a +274 subtilisinu z Bacillus amyloliquefaciens, přičemž aminokyselina v poloze v prekurzoru subtilisinu, ekvivalentní poloze +195 v subtilisinu z Bacillus amyloliquefaciens je substituována odlišnými přírodními aminokyselinami, které se
    -36CZ 289323 B6 volí ze skupiny A, R, N, D, C, Q, G, Η, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Ya V a aminokyselina v poloze prekurzoru subtilisinu, ekvivalentní poloze +206 v subtilisinu Bacillus amyloliquefaciens je substituována odlišnými přírodními aminokyselinami ze skupiny A, R, N, D, E, Q, G, Η, I, L, K,
    M, F, P, S, T, W, Y a V.
  11. 11. Varianta subtilisinu podle nároku 10, v němž se aminokyselina pro náhradu aminokyseliny v poloze +260 volí ze skupiny P, A, S, N a G.
  12. 12. Izolovaná varianta subtilisinu se sekvencí aminokyselin, obsahujících řadu substitucí odlišnými přírodními aminokyselinami, přičemž tyto substituce se nacházejí (a) v poloze prekurzoru subtilisinu, ekvivalentní poloze +76 v subtilisinu Bacillus amyloliquefaciens, (b) v jedné nebo větším počtu poloh prekurzoru subtilisinu, ekvivalentním polohám +101, +105, +135,+210 a+260 a (c) v jedné nebo většímu počtu poloh v prekurzoru subtilisinu, ekvivalentních polohách polohách +27, +99, +103, +104, +107, +123, +126, +128, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +216, +217, +222, +260, +265 a +274 subtilisinu z Bacillus amyloliquefaciens, přičemž aminokyselina v poloze v prekurzoru subtilisinu, ekvivalentní poloze +195 v subtilisinu z Bacillus amyloliquefaciens je substituována odlišnými přírodními aminokyselinami, které se volí ze skupiny A, R, N, D, C, Q, G, Η, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y a V a aminokyselina v poloze prekurzoru subtilisinu, ekvivalentní poloze +206 v subtilisinu Bacillus amyloliquefaciens je substituována odlišnými přírodními aminokyselinami ze skupiny A, R, N, D, E, Q, G, Η, I, L, K, M, F, P, S, T, W, YaV.
  13. 13. Izolovaná varianta subtilisinu se sekvencí aminokyselin, obsahujících řadu substitucí odlišnými přírodními aminokyselinami, přičemž tyto substituce se nacházejí (a) v poloze prekurzoru subtilisinu, ekvivalentní poloze +76 v subtilisinu Bacillus amyloliquefaciens, (b) v poloze, ekvivalentní poloze +103, přičemž odlišná přírodní aminokyselina se volí ze skupiny Q, T, D, Ε, Y, K, G, R, S a A, a (c) v jedné nebo většímu počtu poloh v prekurzoru subtilisinu, ekvivalentních polohách polohách +27, +99, +101, +104, +105, +107, +123, +126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210, +216, +217, +222, +260, +265 a +274 subtilisinu z Bacillus amyloliquefaciens, přičemž aminokyselina v poloze v prekurzoru subtilisinu, ekvivalentní poloze +195 v subtilisinu z Bacillus amyloliquefaciens je substituována odlišnými přírodními aminokyselinami, které se volí ze skupiny A, R, N, D, C, Q, G, Η, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y a V a aminokyselina v poloze prekurzoru subtilisinu, ekvivalentní poloze +206 v subtilisinu Bacillus amyloliquefaciens je substituována odlišnými přírodními aminokyselinami ze skupiny A, R, N, D, E, Q, G, Η, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y a V.
  14. 14. Varianta subtilisinu podle nároku 13, v níž se aminokyselina pro substituci v poloze, ekvivalentní poloze +103 volí ze skupiny A, Q, T, D, Ε, Y, K, G a R.
  15. 15. Izolovaná varianta subtilisinu se sekvencí aminokyselin, obsahující řadu substitucí odlišnými přírodními aminokyselinami, přičemž tyto substituce se nacházejí
    -37CZ 289323 B6 (a) v poloze prekurzoru subtilisinu, ekvivalentní poloze +76 v substituci Bacillus amyloliquefaciens, (b) v poloze, ekvivalentní poloze 104, přičemž odlišná přírodní aminokyselina pro substituci se volí ze skupiny A, R, N, D, C, E, Q, G, Η, I, L, K, M, F, P, S, T, W a Y, a (c) vjedné nebo většímu počtu poloh v prekurzoru subtilisinu, ekvivalentních polohách +27, +99, +101, +103, +105, +107, +123, +126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210, +216, +217, +222, +260, +265 a +274 subtilisinu z Bacillus amyloliquefaciens, přičemž aminokyselina v poloze prekurzoru subtilisinu, ekvivalentní poloze +126 v subtilisinu Bacillus amyloliquefaciens je substituována odlišnou přírodní aminokyselinou, která se volí ze skupiny A, R, N, D, E, Q, G, Η, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y a V, aminokyselina v poloze v prekurzoru subtilisinu, ekvivalentní poloze +195 v subtilisinu z Bacillus amyloliquefaciens je substituována odlišnými přírodními aminokyselinami, které se volí ze skupiny A, R, N, D, C, Q, G, Η, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y a V a aminokyselina v poloze prekurzoru subtilisinu, ekvivalentní poloze +206 v subtilisinu Bacillus amyloliquefaciens je substituována odlišnými přírodními aminokyselinami ze skupiny A, R, N, D, E, Q, G, Η, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y a V.
  16. 16. Varianta subtilisinu podle nároku 15, v níž se aminokyselina pro substituci v poloze, ekvivalentní poloze +104 volí ze skupiny I, Y, S, L, A, T, G, F, M, W, D a N.
  17. 17. Izolovaná varianta subtilisinu se sekvencí aminokyselin obsahující kombinovanou sestavu substitucí odlišnými přírodními aminokyselinami, přičemž tyto kombinované skupiny substitucí jsou provedeny v polohách tvořených skupinami poloh, které jsou ekvivalentní polohám
    76/99, 76/101, 76/103, 76/104, 76/107, 76/123, 76/99/101, 76/99/103, 76/99/104, 76/101/103, 76/101/104, 76/103/104, 76/104/107, 76/104/123, 76/107/123, 76/99/101/103, 76/99/101/104, 76/99/103/104, 76/101/103/104, 76/103/104/123, 76/104/107/123, 76/99/101/103/104, 76/99/103/104/123, 76/99/101/103/104/123, 76/103/104/126, 76/103/104/135, 76/103/104/197, 76/103/104/222, 76/103/104/260, 76/103/104/265, 76/103/104/126/265, 27/76/104/123/274, 27/76/104/123,27/76/104/107/123, 27/76/104/123/197,27/76/104/123/204, 27/76/104/123/206, 27/76/104/123/216,27/76/104/123/260, 27/76/104/123/195/197, 76/103/104/217, 76/103/104/156, 76/103/104/166, 76/103/104/105, 76/101/103/104, 76/103/104/210, 76/103/104/107, 76/103/104/204, 76/217, 76/103/104/156/166, 76/103/104/156/166/210, 76/101/103/104/166/210, 76/101/103/104/156/166/210 a 76/103/104/128 v subtilisinu Bacillus amyloliquefaciens.
  18. 18. Izolovaná varianta subtilisinu podle nároku 17, dále obsahující alespoň jednu další substituci odlišnou přírodní aminokyselinou, přičemž tyto substituce jsou uvedeny vjedné nebo větším počtu poloh ze skupiny +109 a +218.
  19. 19. Varianta subtilisinu podle nároku 18, obsahující kombinované skupiny substitucí v polohách, které se volí ze skupiny poloh, které jsou ekvivalentní polohám
    27/76/104/109/123/274,27/76/104/123/218/274, 27/76/104/109/123,27/76/104/109/123/218/274,27/76/104/123/218, 27/76/104/123/195/218, 27/76/104/123/197/218,27/76/104/123/204/218,27/76/104/123/206/218,27/76/104/123/218/260, a 27/76/104/123/195/197/218.
  20. 20. Varianta subtilisinu podle nároku 17, která se volí ze skupiny
    N76D/S99D; N76D/S101R; N76D/S103A; N76D/V104I; N76D/I107V, N76D/N123S; N76D/S99D/S101R; N76D/S99D/S103A; N76D/S99D/V104I; N76D/S101R/S103A; N76D/S101R/V104I; N76D/S103A/V104I; N76D/V1041/1107V; N76D/V104Y/I1107V; N76D/V104I/N123S; N76DPI107V/N123S; N76D/S99D/S101R/S103A; N76D/S99D/S101R/V104I; N76D/S99D/-38CZ 289323 B6
    S103A/V104I; N76D/S101R/S103A/V104I; N76D/S103A/V1041/N123S; N76D/V1041/11O7VPN123S; N76D/S99D/S101/S103A/V104I; N76D/S99D/S103A/V104I/N123S; N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S; N76D/S103A/V104I/S128G; N76D/S103A/V104I/T260P; N76D/S103A/V104I/S265N; N76D/S103A/V104I/D197E; N76D/S103A/V104I/S105A; N76D/S103A/V104I/L135I; N76D/S103A/V104I/L126F; N76D/S103A/V104T/L107T; N76D/S103A/V104I/P2101; N76D/S103 A/V104I/L126/S265N; N76D/S103 A/V104I/S156E/S166D/P2101; N76D/S101G/S103 A/V 1041/S166D/P2101; N76D/S101G/S103 A/V 104I/S156E/S166D/P2101 a N76D/S103 A/V 104I/M222A.
  21. 21. Varianta subtilisinu podle nároku 20, která se volí ze skupiny N76D/S99D N76D/104I, N76D/S99D/V104I, N76D/S103A/V 1041, N76D/V104PI107V, N76DPV104Y/I107V, N76D/S101RPS103 A/V 1041, N76D/S99D/S101R/S103 A/V 1041 a N76D/S101R/V1041.
  22. 22. Varianta subtilisinu podle nároku 21, obsahující skupinu substitucí N76D/S103A/V 1041.
  23. 23. Izolovaná varianta subtilisinu se sekvencí aminokyselin obsahující kombinované skupiny substitucí odlišnými přírodními aminokyselinami, přičemž tyto kombinované skupiny substitucí jsou provedeny v polohách, které se volí ze skupiny poloh, ekvivalentních polohách 76/99, 76/101, 76/103, 76/104, 76/107, 76/123, 76/99/101, 76/99/103, 76/99/104, 76/101/103, 76/101/104, 76/103/104, 76/104/107, 76/104/123, 76/107/123, 76/99/101/103, 76/99/101/104, 76/99/103/104, 76/101/103/104, 76/103/104/123, 76/104/107/123, 76/99/101/103/104,
    76/99/103/104/123; 76/99/101/103/104/123; 76/103/104/128; 76/103/104/260; 76/103/104/265; 76/103/104/197; 76/103/104/105; 76/103/104/135; 76/103/104/126; 76/103/104/107;
    76/103/104/210; 76/103/104/126/265, 76/103/104/156/166/210; 76/101/103/104/166/210;
    76/101/103/104/156/166/210 a 76/103/104/222.
CZ19961065A 1993-10-14 1994-10-13 Izolovaná varianta subtilisinu CZ289323B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13724093A 1993-10-14 1993-10-14

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ106596A3 CZ106596A3 (en) 1996-09-11
CZ289323B6 true CZ289323B6 (cs) 2002-01-16

Family

ID=22476438

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19961065A CZ289323B6 (cs) 1993-10-14 1994-10-13 Izolovaná varianta subtilisinu

Country Status (24)

Country Link
US (2) US6586221B2 (cs)
EP (2) EP1526182A3 (cs)
JP (1) JP4086207B2 (cs)
KR (1) KR100344976B1 (cs)
CN (1) CN1056649C (cs)
AT (1) ATE284962T1 (cs)
AU (1) AU700373B2 (cs)
BR (1) BR9407825A (cs)
CA (1) CA2173973C (cs)
CZ (1) CZ289323B6 (cs)
DE (1) DE69434187T2 (cs)
DK (1) DK0723590T3 (cs)
ES (1) ES2235164T3 (cs)
FI (1) FI119697B (cs)
HK (1) HK1000649A1 (cs)
MA (1) MA23346A1 (cs)
NO (1) NO325568B1 (cs)
NZ (1) NZ274998A (cs)
PL (1) PL178478B1 (cs)
PT (1) PT723590E (cs)
RU (1) RU2136756C1 (cs)
TW (1) TW448230B (cs)
WO (1) WO1995010615A1 (cs)
ZA (1) ZA948086B (cs)

Families Citing this family (90)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HU219851B (hu) * 1993-10-14 2001-08-28 The Procter And Gamble Company Proteáz tartalmú tisztítókészítmények
ATE245185T1 (de) * 1993-10-14 2003-08-15 Procter & Gamble Proteasen enthaltende bleichmittelzusammensetzungen
MA23346A1 (fr) * 1993-10-14 1995-04-01 Genencor Int Variantes de la subtilisine
EP0687733A1 (en) * 1994-06-16 1995-12-20 The Procter & Gamble Company Detergent composition containing wool compatible high alkaline proteases
US6066611A (en) * 1994-10-13 2000-05-23 The Procter & Gamble Company Bleaching compositions comprising protease enzymes
US5837517A (en) * 1995-05-05 1998-11-17 Novo Nordisk A/S Protease variants and compositions
CZ349797A3 (cs) * 1995-05-05 1998-04-15 Unilever N. V. Prací prostředek
DE19530816A1 (de) * 1995-08-23 1997-02-27 Cognis Bio Umwelt Verwendung von mutierter Subtilisin-Protease in kosmetischen Produkten
DE19535082A1 (de) 1995-09-21 1997-03-27 Henkel Ecolab Gmbh & Co Ohg Pastenförmiges Wasch- und Reinigungsmittel
US5858948A (en) * 1996-05-03 1999-01-12 Procter & Gamble Company Liquid laundry detergent compositions comprising cotton soil release polymers and protease enzymes
DE19636035A1 (de) 1996-09-05 1998-03-12 Henkel Ecolab Gmbh & Co Ohg Pastenförmiges Wasch- und Reinigungsmittel
KR100591553B1 (ko) * 1996-11-04 2006-06-19 노보자임스 에이/에스 섭틸라제 변종과 조성물
DE19703364A1 (de) 1997-01-30 1998-08-06 Henkel Ecolab Gmbh & Co Ohg Pastenförmiges Wasch- und Reinigungsmittel
ATE338823T1 (de) * 1997-06-04 2006-09-15 Genecor Int Inc Protease zur gründlichen reinigung und/oder flecken- und filmreduktion und zusammensetzungen damit
BR9810081A (pt) * 1997-06-04 2000-08-08 Procter & Gamble Sistemas de enzima protease mista para limpeza de sujeiras à base de proteìna e composições incorporando os mesmos
ES2210751T3 (es) * 1997-06-04 2004-07-01 THE PROCTER &amp; GAMBLE COMPANY Particulas de enzimas detergentes que tienen una capa barrera de carboxilato soluble en agua y composiciones que incluyen las mismas.
US6284246B1 (en) 1997-07-30 2001-09-04 The Procter & Gamble Co. Modified polypeptides with high activity and reduced allergenicity
AU2002325461B2 (en) * 1997-10-23 2006-05-11 Genencor International, Inc. Multiply-substituted protease variants with altered net charge for use in detergents
AR016969A1 (es) 1997-10-23 2001-08-01 Procter & Gamble VARIANTE DE PROTEASA, ADN, VECTOR DE EXPRESIoN, MICROORGANISMO HUESPED, COMPOSICIoN DE LIMPIEZA, ALIMENTO PARA ANIMALES Y COMPOSICIoN PARA TRATAR UN TEXTIL
ES2368718T3 (es) * 1997-10-23 2011-11-21 Danisco Us Inc. Variantes de subtilisina con múltiples sustituciones.
AU2207099A (en) * 1997-12-24 1999-07-19 Genencor International, Inc. An improved method of assaying for a preferred enzyme and/or preferred detergentcomposition
US6528255B1 (en) 1997-12-30 2003-03-04 Genencor International, Inc. Proteases from gram positive organisms
US6465186B1 (en) 1997-12-30 2002-10-15 Genecor International, Inc. Proteases from gram positive organisms
US6599731B1 (en) 1997-12-30 2003-07-29 Genencor International, Inc. Proteases from gram positive organisms
GB9727470D0 (en) 1997-12-30 1998-02-25 Genencor Int Bv Proteases from gram positive organisms
BR9909130A (pt) 1998-03-26 2000-12-19 Procter & Gamble Variantes de protease de serina tendo substituições de amino-ácido
US6495136B1 (en) 1998-03-26 2002-12-17 The Procter & Gamble Company Proteases having modified amino acid sequences conjugated to addition moieties
US6908757B1 (en) 1998-03-26 2005-06-21 The Procter & Gamble Company Serine protease variants having amino acid deletions and substitutions
DE19857687A1 (de) 1998-12-15 2000-06-21 Henkel Ecolab Gmbh & Co Ohg Pastenförmiges Waschmittel
CA2355580C (en) * 1998-12-18 2011-03-15 Novozymes A/S Subtilase enzymes of the i-s1 and i-s2 sub-groups having an additional amino acid residue in the active site loop region
WO2000037658A2 (en) 1998-12-21 2000-06-29 Genencor International, Inc. Chemically modified enzymes with multiple charged variants
WO2001007578A2 (en) 1999-07-22 2001-02-01 The Procter & Gamble Company Subtilisin protease variants having amino acid substitutions in defined epitope regions
US6946128B1 (en) 1999-07-22 2005-09-20 The Procter & Gamble Company Protease conjugates having sterically protected epitope regions
JP2003505067A (ja) 1999-07-22 2003-02-12 ザ、プロクター、エンド、ギャンブル、カンパニー 特定のエピトープ領域にアミノ酸欠失及び置換を有するサブチリシンプロテアーゼの変異体
MXPA02000842A (es) 1999-07-22 2002-07-30 Procter & Gamble Conjugados de proteasa que tienen sitios de corte protegidos estericamente.
WO2001018165A1 (en) * 1999-09-09 2001-03-15 The Procter & Gamble Company A detergent composition containing a protease
JP2003516751A (ja) * 1999-12-15 2003-05-20 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 卵の染みに及ぼす洗浄性能改良を示すズブチラーゼ変異体
WO2001044452A1 (en) * 1999-12-15 2001-06-21 Novozymes A/S Subtilase variants having an improved wash performance on egg stains
US6777218B1 (en) 2000-03-14 2004-08-17 Novozymes A/S Subtilase enzymes having an improved wash performance on egg stains
US7303907B2 (en) 2001-01-08 2007-12-04 Health Protection Agency Degradation and detection of TSE infectivity
ATE527276T1 (de) * 2001-03-23 2011-10-15 Genencor Int Proteine, die veränderte immunogene reaktionen bewirken, und verfahren zu deren herstellung und anwendung
DK200101090A (da) 2001-07-12 2001-08-16 Novozymes As Subtilase variants
US7153820B2 (en) 2001-08-13 2006-12-26 Ecolab Inc. Solid detergent composition and method for solidifying a detergent composition
US20030157645A1 (en) * 2001-12-21 2003-08-21 Direvo Bio Tech Ag. Subtilisin variants with improved characteristics
US7332320B2 (en) * 2001-12-31 2008-02-19 Genencor International, Inc. Protease producing an altered immunogenic response and methods of making and using the same
JP5328002B2 (ja) * 2002-01-16 2013-10-30 ジェネンコー・インターナショナル・インク 複数置換プロテアーゼ変異体
ATE450606T1 (de) * 2002-01-16 2009-12-15 Genencor Int Mehrfachsubstituierte proteasevarianten
JP4819670B2 (ja) * 2003-05-07 2011-11-24 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 変異体スブチリシン酵素（サブチラーゼ）
US20090060933A1 (en) * 2004-06-14 2009-03-05 Estell David A Proteases producing an altered immunogenic response and methods of making and using the same
EP1814573B1 (en) 2004-10-29 2016-03-09 ratiopharm GmbH Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
CN104232365A (zh) * 2006-07-18 2014-12-24 丹尼斯科美国公司 在宽温度范围内具有活性的蛋白酶变体
JP2010507001A (ja) * 2006-10-16 2010-03-04 ダニスコ・ユーエス・インク、ジェネンコー・ディビジョン 非リン酸系食器洗浄剤
US8093200B2 (en) 2007-02-15 2012-01-10 Ecolab Usa Inc. Fast dissolving solid detergent
CN101827925B (zh) 2007-10-18 2012-11-28 埃科莱布有限公司 经压制的蜡状固体清洁组合物和它们的制造方法
BRPI0915681A2 (pt) 2008-06-06 2015-08-04 Danisco Us Inc Composições e métodos compreendendo proteases microbianas variantes
BRPI0922083A2 (pt) * 2008-11-11 2017-05-30 Danisco Us Inc proteases compreendendo uma ou mais mutações combináveis
BRPI0920925A2 (pt) * 2008-11-11 2015-08-18 Danisco Us Inc Composições e métodos compreendendo uma variante de subtilisina
CN102421893B (zh) * 2009-04-30 2014-10-29 花王株式会社 碱性蛋白酶变体
DE102009029513A1 (de) * 2009-09-16 2011-03-24 Henkel Ag & Co. Kgaa Lagerstabiles flüssiges Wasch- oder Reinigungsmittel enthaltend Proteasen
WO2011140316A1 (en) * 2010-05-06 2011-11-10 The Procter & Gamble Company Consumer products with protease variants
DE102010028951A1 (de) 2010-05-12 2011-11-17 Henkel Ag & Co. Kgaa Lagerstabiles flüssiges Wasch- oder Reinigungsmittel enthaltend Protease und Lipase
DE102010063458A1 (de) * 2010-12-17 2012-06-21 Henkel Ag & Co. Kgaa Lagerstabiles flüssiges Wasch- oder Reinigungsmittel enthaltend Protease und Amylase
DE102010063457A1 (de) * 2010-12-17 2012-06-21 Henkel Ag & Co. Kgaa Lagerstabiles flüssiges Wasch- oder Reinigungsmittel enthaltend Protease und Cellulase
CA3194062A1 (en) * 2011-05-05 2012-11-08 Danisco Us Inc. Compositions and methods comprising serine protease variants
EP2766462B1 (en) 2011-05-20 2019-08-28 Ecolab USA Inc. Acid formulations for use in a system for warewashing
KR101890147B1 (ko) 2011-05-20 2018-08-21 에코랍 유에스에이 인코퍼레이티드 식기세척을 위한 교대 알칼리/산 시스템에서의 비-포스페이트 세제 및 비-인산
EP2791301B1 (en) 2011-12-13 2017-10-04 Ecolab USA Inc. Concentrated warewashing compositions and methods
DE102012201522A1 (de) * 2012-02-02 2013-08-08 Basf Se Lagerstabiles flüssiges Geschirrspülmittel enthaltend Protease und Amylase
EP2628785B1 (en) * 2012-02-17 2016-05-18 Henkel AG & Co. KGaA Detergent compositions comprising subtilase variants
DE102012215107A1 (de) * 2012-08-24 2014-02-27 Basf Se Festes Geschirrspülmittel mit verbesserter Proteaseleistung
US9745543B2 (en) 2012-09-10 2017-08-29 Ecolab Usa Inc. Stable liquid manual dishwashing compositions containing enzymes
CN103013960A (zh) * 2012-12-21 2013-04-03 青岛蔚蓝生物集团有限公司 一种碱性蛋白酶及其重组表达工程菌
BR112016005143B1 (pt) 2013-09-09 2021-10-19 Ecolab Usa Inc Composição detergente concentrada, solução aquosa e uso de uma composição detergente concentrada
EP3561034B1 (en) 2013-09-09 2022-07-13 Ecolab USA Inc. Method of producing a detergent solid block having synergistic stain removal through novel chelator combination
EP3060640B2 (en) 2013-10-24 2026-02-18 Ecolab USA Inc. Methods for removing soils from surfaces
EP3739029A1 (en) 2014-07-04 2020-11-18 Novozymes A/S Subtilase variants and polynucleotides encoding same
MX2017006695A (es) 2014-12-04 2017-08-21 Novozymes As Variantes de subtilasa y polinucleotidos que las codifican.
EP3872174B1 (en) * 2015-05-13 2023-03-01 Danisco US Inc. Aprl-clade protease variants and uses thereof
WO2017089093A1 (en) 2015-11-25 2017-06-01 Unilever N.V. A liquid detergent composition
JP7609549B2 (ja) * 2016-05-31 2025-01-07 ダニスコ・ユーエス・インク プロテアーゼ変異体およびその使用
US20190185836A1 (en) * 2016-09-02 2019-06-20 The Regents Of The University Of California Engineered subtiligase variants for versatile, site-specific labeling of proteins
US20200354708A1 (en) * 2017-11-29 2020-11-12 Danisco Us Inc. Subtilisin variants having improved stability
WO2021022045A1 (en) 2019-07-31 2021-02-04 Ecolab Usa Inc. Personal protective equipment free delimer compositions
US11492571B2 (en) 2019-10-24 2022-11-08 The Procter & Gamble Company Automatic dishwashing detergent composition comprising a protease
WO2021230358A1 (ja) * 2020-05-15 2021-11-18 Jnc株式会社 抗ウイルス剤
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections
CN114836408B (zh) * 2022-05-28 2023-09-19 湖北大学 含有前肽突变体的碱性蛋白酶及应用
EP4446411A1 (en) * 2023-04-14 2024-10-16 Peaccel Variant subtilisin proteases
WO2026030345A1 (en) 2024-07-29 2026-02-05 Danisco Us Inc. Signal and pro-region sequence variants for enhanced protease production in bacillus cells
WO2026093440A1 (en) * 2024-11-04 2026-05-07 Novozymes A/S Protease variants and compositions comprising same

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4760025A (en) * 1984-05-29 1988-07-26 Genencor, Inc. Modified enzymes and methods for making same
US5155033A (en) 1989-01-06 1992-10-13 Genencor, Inc. Subtilisins modified at position 225 resulting in a shift in catalytic activity
US5185258A (en) 1984-05-29 1993-02-09 Genencor International, Inc. Subtilisin mutants
US5204015A (en) 1984-05-29 1993-04-20 Genencor International, Inc. Subtilisin mutants
US5182204A (en) 1984-05-29 1993-01-26 Genencor International, Inc. Non-human carbonyl hydrolase mutants, vectors encoding same and hosts transformed with said vectors
US5972682A (en) * 1984-05-29 1999-10-26 Genencor International, Inc. Enzymatically active modified subtilisins
US5763257A (en) * 1984-05-29 1998-06-09 Genencor International, Inc. Modified subtilisins having amino acid alterations
US4990452A (en) * 1986-02-12 1991-02-05 Genex Corporation Combining mutations for stabilization of subtilisin
US5013657A (en) 1988-04-12 1991-05-07 Bryan Philip N Subtilisin mutations
IE65767B1 (en) * 1986-04-30 1995-11-15 Genencor Int Non-human carbonyl hydrolase mutants DNA sequences and vectors encoding same and hosts transformed with said vectors
ATE371029T1 (de) 1987-04-06 2007-09-15 Novozymes As Regelung von elektrostatischen interaktionen an metallionen-bindungsstellen zur stabilisierung von proteinen
US4914031A (en) 1987-04-10 1990-04-03 Amgen, Inc. Subtilisin analogs
DK6488D0 (da) * 1988-01-07 1988-01-07 Novo Industri As Enzymer
EP0327801A1 (en) 1988-01-08 1989-08-16 Deutsches Primatenzentrum Gesellschaft Mbh HIV-2-type retroviruses of primates, vaccines, diagnostic and pharmaceutical compositions
US5324653A (en) 1988-02-11 1994-06-28 Gist-Brocades N.V. Recombinant genetic means for the production of serine protease muteins
PT89702B (pt) 1988-02-11 1994-04-29 Gist Brocades Nv Processo para a preparacao de novos enzimas proteoliticos e de detergentes que os contem
US5116741A (en) * 1988-04-12 1992-05-26 Genex Corporation Biosynthetic uses of thermostable proteases
SE8801426D0 (sv) * 1988-04-15 1988-04-15 Ulf Rothman Forfarande och medel for blodbehandling
AU618675B2 (en) * 1989-05-17 1992-01-02 Amgen, Inc. Multiply mutated subtilisins
BR9006832A (pt) 1989-06-26 1991-08-06 Unilever Nv Composicao detergente enzimatica
DE69034159T2 (de) 1989-06-26 2005-02-17 Unilever N.V. Enzymatische Waschmittelzusammensetzungen
DK316989D0 (da) 1989-06-26 1989-06-26 Novo Nordisk As Enzymer
US5665587A (en) * 1989-06-26 1997-09-09 Novo Nordisk A/S Modified subtilisins and detergent compositions containing same
JP2567282B2 (ja) * 1989-10-02 1996-12-25 日本ゼオン株式会社 ポジ型レジスト組成物
DK271490D0 (da) * 1990-11-14 1990-11-14 Novo Nordisk As Detergentkomposition
DE69128094T2 (de) 1990-12-21 1998-03-19 Novonordisk As Enzym-mutanten mit einer geringen variation der molekularladung über einen ph-bereich
US5340735A (en) 1991-05-29 1994-08-23 Cognis, Inc. Bacillus lentus alkaline protease variants with increased stability
US5316935A (en) * 1992-04-06 1994-05-31 California Institute Of Technology Subtilisin variants suitable for hydrolysis and synthesis in organic media
KR950702633A (ko) 1992-07-17 1995-07-29 한스 발터 라벤 고알칼리성 세린 프로테아제(high alkaline serine proteases)
DK39093D0 (da) 1993-04-01 1993-04-01 Novo Nordisk As Enzym
MA23346A1 (fr) * 1993-10-14 1995-04-01 Genencor Int Variantes de la subtilisine
HU219851B (hu) * 1993-10-14 2001-08-28 The Procter And Gamble Company Proteáz tartalmú tisztítókészítmények
ATE245185T1 (de) * 1993-10-14 2003-08-15 Procter & Gamble Proteasen enthaltende bleichmittelzusammensetzungen
AR016969A1 (es) * 1997-10-23 2001-08-01 Procter & Gamble VARIANTE DE PROTEASA, ADN, VECTOR DE EXPRESIoN, MICROORGANISMO HUESPED, COMPOSICIoN DE LIMPIEZA, ALIMENTO PARA ANIMALES Y COMPOSICIoN PARA TRATAR UN TEXTIL
US6835550B1 (en) * 1998-04-15 2004-12-28 Genencor International, Inc. Mutant proteins having lower allergenic response in humans and methods for constructing, identifying and producing such proteins
WO2000037658A2 (en) * 1998-12-21 2000-06-29 Genencor International, Inc. Chemically modified enzymes with multiple charged variants
ATE527276T1 (de) * 2001-03-23 2011-10-15 Genencor Int Proteine, die veränderte immunogene reaktionen bewirken, und verfahren zu deren herstellung und anwendung

Also Published As

Publication number Publication date
WO1995010615A1 (en) 1995-04-20
ATE284962T1 (de) 2005-01-15
NO961468D0 (no) 1996-04-12
NO961468L (no) 1996-04-12
EP0723590A1 (en) 1996-07-31
FI119697B (fi) 2009-02-13
AU8015794A (en) 1995-05-04
US6586221B2 (en) 2003-07-01
ES2235164T3 (es) 2005-07-01
PT723590E (pt) 2005-04-29
CZ106596A3 (en) 1996-09-11
RU2136756C1 (ru) 1999-09-10
CN1056649C (zh) 2000-09-20
CA2173973C (en) 2009-10-06
FI961631A0 (fi) 1996-04-12
KR100344976B1 (ko) 2002-11-23
PL178478B1 (pl) 2000-05-31
PL313942A1 (en) 1996-08-05
AU700373B2 (en) 1999-01-07
JP4086207B2 (ja) 2008-05-14
EP1526182A2 (en) 2005-04-27
TW448230B (en) 2001-08-01
NO325568B1 (no) 2008-06-23
EP0723590B1 (en) 2004-12-15
CA2173973A1 (en) 1995-04-20
NZ274998A (en) 1997-04-24
FI961631L (fi) 1996-04-15
CN1133068A (zh) 1996-10-09
US7250281B2 (en) 2007-07-31
US20030077807A1 (en) 2003-04-24
US20040023353A1 (en) 2004-02-05
EP1526182A3 (en) 2005-05-04
JPH09504170A (ja) 1997-04-28
BR9407825A (pt) 1997-05-06
DE69434187T2 (de) 2005-12-15
HK1000649A1 (en) 2005-06-03
DK0723590T3 (da) 2005-04-25
ZA948086B (en) 1995-06-07
DE69434187D1 (de) 2005-01-20
MA23346A1 (fr) 1995-04-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4086207B2 (ja) ズブチリシン変異体
JP3776244B2 (ja) プロテアーゼ含有クリーニング組成物
JP4511025B2 (ja) 複数置換プロテアーゼ変異体
HK1000649B (en) Subtilisin variants
JP6792524B2 (ja) 複数置換プロテアーゼ変異体
PT1523553E (pt) Variantes de protease de substituições múltiplas
RU2269572C2 (ru) Варианты протеазы, замещенные в нескольких положениях
HK1071398A (en) Subtilisin variants

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20141013