PL178793B1

PL178793B1 - Białko fuzyjne, sposób wytwarzania białka fuzyjnego i środek farmaceutyczny

Info

Publication number: PL178793B1
Application number: PL94306474A
Authority: PL
Inventors: Hoegen Ilka Von; Uwe Hofmann; Carlota-Silvia Jäggle; Wolfgang Strittmatter; Jörg Stadlmüller; Siegfried Matzku
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 1993-12-24
Filing date: 1994-12-22
Publication date: 2000-06-30
Also published as: DK0659439T3; HU9403784D0; US6979726B1; RU2129018C1; DE69428764T2; DE69428764D1; AU8159394A; NO944980D0; JPH07223968A; SK283494B6; UA41888C2; KR950016781A; CA2138928A1; ZA9410282B; HU219680B; SK156294A3; NO944980L; NO315903B1; CZ330694A3; CA2138928C

Abstract

1. Bialko fuzyjne, zawierajace mysie lub humanizowane przeciwcialo Mab 425 lub jego fragment skierowany przeciw komórce nowotworowej z epitopem antygenowym receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) i biologicznie aktywna cytokine wybrana z grupy TNF a , IL-2, IL-4i, IL-7, która jest polaczona przez fuzje do wspomnianego przeciwciala lub jego fragmentu i wykazuje wlasciwosc cytotoksyczna wywolywania swoiscie lizy komórki nowotworowej. 6. Sposób wytwarzania bialka fuzyjnego zawierajacego mysie lub humanizowane przeciwcialo Mab 425 lub jego frag- ment skierowany przeciw komórce nowotworowej z epitopem antygenowym receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) i biologicznie aktywna cytokine wybrana z grupy TNF a , IL-2, IL-4i, IL-7, która jest polaczona przez fuzje do wspo- mnianego przeciwciala lub jego fragmentu i wykazuje wlasciwosc cytotoksyczna wy woly wania swoiscie lizy komórki no- wotworowej, znamienny tym, ze dokonuje sie fuzji sekwencji DNA kodujacych przeciwcialo Mab 425 lub jego fragment skierowany przeciw komórce nowotworowej zawierajacej epitop antygenowy receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) z sekwencjaDNAkodujacabiologicznie aktywna cytokine wybranaz grupy TNFa , IL-2, IL-4 i, IL-7, umieszcza sie otrzymany konstrukt w wektorze ekspresyjnym, który jest transformowany do organizmu gospodarza, hoduje sie komórke gospodarza w roztworze pozywki i przeprowadza sie ekspresje bialka fuzyjnego. 10. Srodek farmaceutyczny zawierajacy bialko fuzyjne obejmujace przeciwcialo i cytokine oraz fizjologicznie dopusz- czalne nosniki, znamienny tym, ze zawiera co najmniej jedno bialko fuzyjne zawierajace mysie lub humanizowane przeciw- cialo Mab 425 lub jego fragment skierowany przeciw komórce nowotworowej zawierajacej epitop antygenowy receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) i biologicznie aktywna cytokine wybranaz grupy TNF a , IL-2, IL4 i, IL-7, która jest polaczona przez fuzje do wspomnianego przeciwciala lub jego fragmentu i wykazuje wlasciwosc cytotoksyczna wywolywania swoiscie lizy komórki nowotworowej oraz dopuszczalny fizjologicznie nosnik. PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest białko fuzyjne, sposób wytwarzania białka fuzyjnego i środek farmaceutyczny. Przedmiotem wynalazku jest zwłaszcza białko fuzyjne składające się z wiążącego się z nowotworem elementu docelowego, korzystnie przeciwciała monoklonalnego lub jego fragmentu, rozpoznającego cząsteczkę preferencyjnie wytwarzaną na ludzkich komórkach nowotworowych, taką jak receptor ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) i z aktywnego biologicznie ligandu, takiego jak czynnik wzrostu i/lub czynnik różnicowania. Uzyskane białko fuzyjne może być użyte do dostarczania aktywnego biologicznie ligandu do określonej, docelowej komórki lub tkanki. Te nowe immunokoniugaty mogą być stosowane do leczenia nowotworów. Do leczenia pacjentów cierpiących na nowotwory stosuje się wiele różnych podejść terapeutycznych. W ostatnich latach prowadzi się próby kliniczne z przeciwciałami monoklonalnymi, które swoiście albo preferencyjnie rozpoznają cząsteczki wytwarzane na powierzchni komórek złośliwych. W niniejszym podejściu, w celu wyeliminowania komórek nowotworowych indukuje się cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciała (ADCC) lub cytotoksyczność przy współudziale dopełniacza (CDC). W tym drugim podejściu aktywuje się odpowiedź immunologiczną w której pośredniczą cytokiny. Na indukowaną cytokinami aktywność przeciwnowotworową można wpływać przez:

1) bezpośredni cytotoksyczny/cytostatyczny wpływ cytokiny na wzrost nowotworu;

2) nieswoiste mechanizmy reakcji: nowotwór - antygen, takie jak aktywność aktywowanych limfokinami komórek K (komórek LAK) albo cytotoksyczność, w której uczestniczą monocyty i makrofagi;

3) swoiste odpowiedzi immunologiczne: nowotwór - antygen, z udziałem CD4 i CD8 dodatnich limfocytów T. W tej sytuacji, odporność ogólną na nowotwór obserwowano na modelach zwierzęcych.

Przeszkodą w ogólnym stosowaniu cytokin, takich jak interleukina IL-2 czy czynnik martwicy nowotworu alfa. (TNFa) jest ich toksyczność (Rubin, Cancer Invest. 11, 460-472, 1990; Balkwill, Naturę, 361, 206-207, 1993). W celu uzyskania wystarczającego stężenia cytokiny w miejscu nowotworu należałoby podawać wysokie jej dawki, tymczasem maksymalna tolerowana dawka cytokiny jest niższa niż dawka wymagana dla wykazania skuteczności. Tak więc, ujemne skutki działania cytokin są w głównej mierze wynikiem podawania ogólnego, jednak ich kliniczna przydatność w terapii nowotworów jest niepodważalna. Na modelach zwierzęcych wykazano, że cytokina obecna in situ, wprowadzona przez injekcję do nowotworu bądź obecna w wyniku sekrecji poddanych transfekcji komórek nowotworowych, może pro

178 793 wadzić do regresji nowotworu (Hock i wsp., PNAS 90: 2774 - 2778, 1993; Colombo i wsp., Cancer Res. 52: 4853 - 4857, 1992; McBride i wsp., Cancer Res.52: 3931 - 3937, 1992;Tepper i wsp., Science 257: 548 - 551, 1992; Mullen i wsp., Cancer Res. 52: 6020 - 6024. 1992; Blankenstein i wsp., J.Exp. Med. 173: 1047 - 1052, 1991; Gansbacher i wsp. J.Exp. Med. 172. 1217 - 1224, 1990). W tych układach, cytokiny nie zaburzają proliferacji nowotworu ale mają zdolność aktywowania szybkiej i silnej reakcji antynowotworowej. Tak więc, fizyczna kombinacja cząsteczki efektorowej i elementu kierującego na cel jest sposobem obniżania stężenia poza nowotworem i zwiększania wewnątrz-nowotworowej dostępności biologicznie aktywnego ligandu. Ponadto, celem dla tych cząsteczek mogą być również pojedyncze komórki nowotworowe i mikroprzerzuty.

Biologicznie aktywny ligand w połączeniu z celowaniem kierowanym za pomocą przeciwciała, powinien wywoływać destrukcję docelowej komórki, bądź bezpośrednio bądź przez wytworzenie środowiska śmiertelnego dla tej komórki. Takim biologicznie aktywnym ligandem może być cytokina, a więc, interleukiny: IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-13, interferony (IFN), czynnik martwicy nowotworu (TNFa) lub czynniki stymulujące tworzenie kolonii (CSF). Wykazano, że powyższe cytokiny wykazują działanie przeciw-nowotworowe albo bezpośrednio albo poprzez aktywowanie mechanizmów obronnych gospodarza (Mire-Sluis, TIBTECH H: 74 - 77, 1993; Colombo i wsp., Cancer Res. 52: 4853 - 4857, 1992; Thomas i Balkwill, Pharmac. Ther. 52: 307 - 330, 1991).

Przykładowo, uważa się że IL-2 jest centralnym mediatorem odpowiedzi immunologicznej. Wykazano, że stymuluje ona proliferację limfocytów T i komórek NK i indukuje aktywowane limfokinami komórki K (LAK). W odpowiedzi na IL-2 zachodzi proliferacja przenikających do nowotworu limfocytów T (komórek TIL). Ponadto, IL-2 wzmaga cytotoksyczność limfocytów T i monocytów. Indukuje ona również kaskadę cytokin wydzielanych przez limfocyty T, komórki NK i monocyty, co następnie potęguje odpowiedź immunologiczną.

TNF_a znalazł szerokie zastosowanie do leczenia nowotworów, głównie z powodu bezpośredniej cytotoksyczności w stosunku do pewnych typów komórek nowotworowych i indukowania krwotocznej regresji nowotworów. Ponadto, TNF_a potęguje odpowiedź immunologiczną: jest kostymulatorem proliferacji limfocytów T,.indukuje ekspresję antygenów głównego układu zgodności tkankowej klasy I i klasy II i pobudza sekrecję TNF_a, interferonu i IL-1 przez makrofagi. Interleukinę IL-4 początkowo opisano jako czynnik wzrostu limfocytów B. W dalszych badaniach wykazano, że IL-4 stymuluje swoiste antygenowo cytotoksyczne limfocyty T i działa swoiście na limfocyto T - podobne komórki LAK a nie na NK - podobne komórki LAK. IL-4 hamuje wzrost ludzkich komórek czerniaka, wzmaga w nich ekspresję antygenów klas I i II głównego układu zgodności tkankowej. Wciąż kontrowersyjne jest działanie IL-4 polegające na indukowaniu efektów przeciwnowotworowych, w których pośredniczą makrofagi.

IL-7 jest czynnikiem wzrostu dla komórek pre-β oraz dla ludzkich CD4 i CD8 dodatnich limfocytów T. IL-7 bezpośrednio wzmaga cytotoksyczność subpopulacji limfocytów T CD8-dodatnich. Ponadto, IL-7 indukuje wytwarzanie IL-1, IL-6 i TNF_a przez monocyty obwodowe. W doświadczeniach in vitro, aktywność przeciwnowotworową monocytów/makrofagów można stymulować interleukiną IL-7; prawdopodobnie w procesie uczestniczą cytokiny takie jak TNF_a. Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF) jest hormonem polipeptydowym, mitogennym dla komórek naskórka i nabłonka. Kiedy EGF wchodzi w reakcję z komórkami wrażliwymi, wówczas wiąże się z receptorami błonowymi (EGFR). EGFR jest glikoproteiną trans-błonową o wielkości około 170 kD, produktem genu c-erb-B proto onkogen.

Mysie przeciwciało monoklonalne Mab 425 jest przeciwciałem przeciw ludzkiej linii komórek raka A431 (ATCC CRL 1555). Wiąże się ono z polipeptydowym epitopem na zewnętrznej domenie EGFR. Hamuje wiązanie EGF, pośredniczy w cytotoksyczności nowotworowej in vitro i hamuje wzrost komórek nowotworowych w liniach pochodzących z raka

178 793 naskórka i raka odbytu i okrężnicy in vitro (Rodeck i wsp., Cancer Res. 47: 3692, 1987). Humanizowane i chimerowe wersje Mab 425 są znane z opisu patentowego PCT, WO 92/15683.

W literaturze są opisane immunokoniugaty: przeciwciało-cytokina w różnych połączeniach przeznaczonych do bezpośredniego dostarczania aktywnych białek. Interleukinę IL-2 łączono z ludzkim nowotworo-swoistym przeciwciałem L6 (Feli i wsp., J. Immunol. 146: 2446 - 2452, 1991; publikacja zgłoszenia patentowego europejskiego EP 0439095) albo z przeciwciałem anty-gangliozydowym GD2 (Gillies i wsp., PNAS 89: 1428 - 1432, 1992; publikacja zgłoszenia patentowego PCT, WO 92/08495). Immunokoniugaty zawierające przeciwciało „anty-dansyl” (przeciw grupie dansylowej) i IgFj zaprojektowano do celów bezpośredniego dostarczania hormonów (Shin i Morrison, PNAS 87: 5322 - 5326, 1990; publikacja zgłoszenia patentowego PCT, WO 91/14438).

Tak więc, celem wynalazku było skonstruowanie przeciwciał lub ich fragmentów, zawierających (1) epitop skierowany przeciw antygenowi EGFR na powierzchni komórki nowotworowej i (2) biologicznie aktywny ligand o wysokim potencjale indukowania cytotoksyczności, wykazujących zwiększone działanie przeciwnowotworowe in situ.

Przedmiotem wynalazku jest białko fuzyjne łączące w sobie część przeciwciała monoklonalnego, co najmniej miejsce rozpoznawania antygenu albo całkowite przeciwciało monoklonalne i biologicznie aktywny ligand. Konstrukcje genowe kodujące to białko fuzyjne wytwarza się technikami rekombinacji DNA. Takie białko fuzyjne zawiera rejon zmienny łańcucha ciężkiego przeciwciała oraz domenę CHI rejonu stałego (koniugat: przeciwciało CHI) albo domenę CHI i CH2 rejonu stałego (koniugat: przeciwciało - CH2) lub domenę CHI, CH2 i CH3 rejonu stałego (koniugat: przeciwciało - CH3), połączone poprzez fuzję z biologicznie aktywnym ligandem. Przez addycję odpowiedniego łańcucha lekkiego można wytwarzać immunokoniugaty, które kierują się do komórek posiadających antygen i dostarczają aktywny ligand do określonego miejsca w organizmie (fig. 1 a-c).

Dzięki użyciu białka fuzyjnego według wynalazku można z powodzeniem wykrywać i leczyć nowotwory takie jak czerniak, glejak i rak.

Przedmiotem wynalazku jest białko fuzyjne, zawierające mysie lub humanizowane przeciwciało Mab 425 lub jego fragment skierowany przeciw komórce nowotworowej z epitopem antygenowym receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) i biologicznie aktywną cytokinę wybraną z grupy TNF_a, IL-2, IL-4i, IL-7, która jest połączona przez fuzję do wspomnianego przeciwciała lub jego fragmentu i wykazuje właściwość cytotoksyczną wywoływania swoiście lizy komórki nowotworowej.

Korzystnie białko fuzyjne charakteryzuje się tym, że jako przeciwciało zawiera fragment Fab lub fragment Ffyb^ złożony w zasadzie ze zmiennego regionu łańcucha ciężkiego tego przeciwciała, domeny CHI rejonu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat przeciwciało-CH 1).

W innej korzystnej postaci wynalazku białko fuzyjne jako przeciwciało zawiera fragment przeciwciała składający się zasadniczo z rejonu zmiennego łańcucha ciężkiego tego przeciwciała, domen CHI i CH2 rejonu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat przeciwciało-CH2).

Również korzystnie białko fuzyjne według wynalazku jako przeciwciało zawiera zasadniczo rejon zmienny łańcucha ciężkiego tego przeciwciała, domeny CHI, CH2 i CH3 rejonu stałego i odpowiedni łańcuch lekki (koniugat przeciwciało-CH3).

Przedmiotem wynalazku jest także białko fuzyjne wybrane z grupy: Mab 425-CH1-TNF Mab 425-CH2-TNF_a, Mab 425-CH3-TNF_a, Mab 425-CH1-IL-2, Mab 425-CH2-IL-2 i Mab 425-CH3-IL-2.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania białka fuzyjnego zawierającego mysie lub humanizowane przeciwciało Mab 425 lub jego fragment skierowany przeciw komórce nowotworowej z epitopem antygenowym receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) i biologicznie aktywną cytokinę wybraną z grupy TNF_a, IL-2, IL-4i, IL-7, która jest połączona przez fuzję do wspomnianego przeciwciała lub jego fragmentu i wykazuje

178 793 właściwość cytotoksyczną wywoływania swoiście lizy komórki nowotworowej, polegający na tym, że dokonuje się fuzji sekwencji DNA kodujących przeciwciało Mab 425 lub jego fragment skierowany przeciw komórce nowotworowej zawierającej epitop antygenowy receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) z sekwencją DNA kodującą biologicznie aktywną cytokinę wybraną z grupy TNF^ IL-2, IL-4i, IL-7, umieszcza się otrzymany konstrukt w wektorze ekspresyjnym, który jest transformowany do organizmu gospodarza, hoduje się komórkę gospodarza w roztworze pożywki i przeprowadza się ekspresję białka fuzyjnego.

W korzystnym wykonaniu sposobu według wynalazku dokonuje się fuzji sekwencji DNA kodujących przeciwciało lub fragmenty przeciwciała z sekwencjami DNA kodującymi biologicznie aktywną cytokinę, na jednoniciowym DNA, stosując oligonukleotyd komplementarny do żądanej fuzyjnej sekwencji DNA. Korzystnie dokonuje się ekspresji białka fuzyjnego przeciwciało-CH 1 w E.coli jako komórce gospodarza, ewentualnie dokonuje się ekspresji białek fuzyjnych: przeciwciało-CH2 albo przeciwciało-CH3 w gospodarzu eukariotycznym.

Przedmiotem wynalazku jest także środek farmaceutyczny zawierający białko fuzyjne obejmujące przeciwciało i cytokinę oraz fizjologicznie dopuszczalne nośniki, charakteryzujący się tym, że zawiera co najmniej jedno białko fuzyjne zawierające mysie lub humanizowane przeciwciało Mab 425 lub jego fragment skierowany przeciw komórce nowotworowej zawierającej epitop antygenowy receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) i biologicznie aktywną cytokinę wybraną z grupy TNF^ IL-2, IL-4i, IL-7, która jest połączona przez fuzję do wspomnianego przeciwciała lub jego fragmentu i wykazuje właściwość cytotoksyczną wywoływania swoiście lizy komórki nowotworowej oraz dopuszczalny fizjologicznie nośnik.

Jako przeciwciało, środek farmaceutyczny według wynalazku zawiera fragment Fab lub fragment F^b^ złożony w zasadzie ze zmiennego regionu łańcucha ciężkiego tego przeciwciała, domeny CHI rejonu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat przeciwciało-CHl).

Środek farmaceutyczny, korzystnie charakteryzuje się tym również, że jako przeciwciało może zawierać fragment przeciwciała składający się w zasadzie z rejonu zmiennego łańcucha ciężkiego tego przeciwciała, domen CHI i CH2 rejonu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat przeciwciało-CH2), a także jako przeciwciało może zawierać zasadniczo rejon zmienny łańcucha ciężkiego tego przeciwciała, domeny CHI, CH2 i CH3 rejonu stałego i odpowiedni łańcuch lekki (koniugat przeciwciało-CH3). Najbardziej korzystnie środek farmaceutyczny zawiera białko fuzyjne wybrane z grupy: Mab 425-CHl-INF_a, Mab 425-CH2-INF_a, Mab 425-CH3-TNF_a, Mab 425-CH1-IL-2, Mab 425-CH2-IL-2 i Mab 425-CH3-IL-2.

Okazało się, że zwłaszcza w przypadku immunokoniugatów: przeciwciało-CH2 i przeciwciało-CH3, takich jak na przykład Mab 425-CH2-TNF_;x i Mab 425-CH3-TNF_a, indukcja toksyczności komórkowej jest silniejsza w porównaniu z niesprzężonym TNF_a. Prawdopodobnie wynika to z połączenia cech odnośnie właściwości wiązania i indukcji ADCC przez rejony stałe przeciwciała monoklonalnego z aktywnością cytokin.

Białka fuzyjne: przeciwciało-CH 1 według wynalazku są korzystne ze względu na małe wymiary cząsteczek oraz możliwość ekspresji w organizmach prokariotycznych. Małe wymiary cząsteczek ułatwiają ponadto penetrację do tkanki (nowotworowej).

Białka fuzyjne według wynalazku wykazują przy tym korzystne właściwości wiązania i proliferacji w porównaniu z przeciwciałem monoklonałnym, korzystnie Mab 425, stosowanym jako takim lub w postaci fragmentów.

Materiały i metody

Przeciwciała monoklonalne. Mab 425 jest mysim przeciwciałem monoklonałnym IgGl przeciw ludzkiej linii komórkowej raka A431 (ATCC CRL 1555). Mab 425 wiąże się z polipeptydem epitopem na zewnętrznej domenie receptora ludzkiego EGF i współzawodniczy w wiązaniu z EGF. Wykazano, że przeciwciało to uczestniczy w procesie powstawania cyto

178 793

Ί toksyczności wobec nowotworu in vitro i hamuje in vitro wzrost komórek nowotworowych w liniach pochodzących z raka naskórka-podobnego i okrężniczo-odbytniczego (Rodeck i wsp., Cancer Res. 47: 3692, 1987). Odmiany humanizowane i chimerowe Mab 425 są ujawnione w opisie zgłoszenia patentowego PCT WO 92/15683.

Cytokiny. cDNA kodujące cytokiny uzyskano z firmy British Biotechnology Limited (Herrmann Biermann GmbH, Bad Nauheim, Republika Federalna Niemcy). Są to: cDNA dla ludzkiej IL-2 BBG30, ludzkiej IL-4 BBG15, ludzkiej IL-7 BBG43, ludzkiego TNF_a BBG18. Dostępne w handlu cDNA nie mają sekwencji sygnalnej niezbędnej do wydzielania białka z komórki. cDNA kodujące cytokiny można również uzyskiwać z mRNA wyizolowanego z komórek wytwarzających cytokiny.

Wektory. Plazmid pUC19 należy do serii plazmidowych wektorów do klonowania, występujących w dużej ilości kopii w E. coli. Zawiera on części plazmidu pBR322 i plazmidu M13mpl9. pUC19 zawiera indukowalny, bakteryjny promotor/generator lac a za nim miejsce wielokrotnego klonowania (Yanisch-Perron i wsp., Gene 33: 103-109, 1985). Wektory pUC są dostępne w handlu (na przykład z firmy New England Biolabs). Wektory fagemidowe pBluescript KS/KS+ i KS/KS- pochodzą od pUC19. Są one dostępne w handlu, na przykład z firmy Stratagene).

Eukariotyczny wektor ekspresyjny pHCMV, (Gillies i wsp., Celi 33: 717, 1983) zawiera źródło replikacji z wirusa Simiana 40 (SV40) i rejon promotora i wzmacniacza z cytomegalowirusa ludzkiego. Za tym rejonem promotora/wzmacniacza znajduje się miejsce multiklonowania (mes) dla wprowadzania genów, które mają podlegać ekspresji. W tym wektorze łączy się chimerową formę rejonu zmiennego ciężkiego łańcucha Mab 425 z rejonem ASacII cyl związanym przez fuzję z cząsteczką efektorową na końcu odpowiednio domeny CHI, CH2 lub CH3, generując białko fuzyjne łańcucha ciężkiego Mab 425. Ten fuzyjny łańcuch Ig można włączyć do immunokoniugatu przez połączenie go z odpowiednim łańcuchem lekkim, z utworzeniem jednowartościowego rejonu wiązania antygenu, który z kolei można łączyć, wytwarzając dwuwartościowy immunokoniugat swoisty względem docelowego antygenu (fig. 1). Konstrukcje łańcuchów ciężkich i lekkich można umieszczać w tych samych lub w oddzielnych wektorach.

Prokariotyczny wektor ekspresyjny jest oparty na opisanym przez Ward’a wektorze pSWl (Ward i wsp., Naturę 341: 544-546, 1989), będącym pochodną wektora pUC19. Wektor pSWl zawiera sekwencję kodującą peptyd liderowy bakteryjnego genu pel/B z Erwinia carotovora (Lei i wsp., J. Bacteriol. 169: 4379-4383, 1987). W celu bezpośredniej ekspresji białka do periplazmy można wprowadzać obce DNA w zgodnej fazie odczytu za sekwencją liderową pelB.

Na załączonych rysunkach tabela 1 przedstawia primery do reakcji łańcuchowej polimerazy (reakcji PCR) stosowane do wytwarzania białek fuzyjnych Mab 425-cytokina (ekspresja eukariotyczna).

Znak oznacza odwrotny primer hybrydyzujący z wektorami Stratagene pBluescript SK+/- i KS+/- ((dostępne w handlu);

Znak ”**” oznacza primer hybrydyzujący ze stałym rejonem Cgl łącznie z unikalnym miejscem SacII;

Znak ”***” oznacza odwrotny primer hybrydyzujący z wektorami pochodzącymi od Ml3 (dostępnymi w handlu).

Tabela 2 przedstawia primery reakcji łańcuchowej polimerazy (reakcji PCR) stosowane do wytwarzania białek fuzyjnych Mab 425-cytokina (ekspresja prokariotyczna)

Figura 1 przedstawia model immunokoniugatów: przeciwciało-cytokina

C oznacza cytokinę, VH oznacza rejon zmienny łańcucha ciężkiego, VL oznacza rejon zmienny łańcucha lekkiego, CH oznacza łańcuch ciężki rejonu stałego, CL oznacza łańcuch lekki rejonu stałego.

(a) = koniugat: przeciwciało-CHl, (b) = koniugat: przeciwciało-CH2, (c) = koniugat: przeciwciało-CH3,

178 793

Figura 2 przedstawia wiązanie immunokoniugatów z receptorem EGF w próbie wykonanej techniką ELISA swoistej wobec EGF-R.

Supematanty przejściowo zakażonych metodą transfekcji komórek COS-7 testowano na obecność immunokoniugatu. Oś pionowa: procent absorbancji przy długości fali 490 nm; oś pozioma: rozcieńczenie supematantu (log 2). Na krzywych, wypełnione kółka oznaczają Mab425CHl-TNF_ct, wypełnione kwadraty oznaczają Mab425CH2-TNF_ct, wypełnione trójkąty oznaczają Mab425CH3-TNF_a, wypełnione romby oznaczają kontrolę Mab425, odwrócone wypełnione trójkąty oznaczają Mab425Fab, wypełnione sześciokąty oznaczają przekształcone Mab425F(ab')₂ (oczyszczone białko).

Figura 3A przedstawia aktywność IL-2 immunokoniugatów Mab425-CHl-IL-2 wytwarzanych w komórkach COS-7.

Jako linię indykatorową użyto komórki CTLL-2. Na lewej części wykresu przedstawiona jest aktywność proliferacyjna seryjnych rozcieńczeń supematantu komórek COS zawierającego Mab425CHl-IL-2 (wypełnione kółka). Jako kontrolę użyto supematanty COS zawierające Mab425Fab (kontrola; niewypełnione kółka). Na prawej części wykresu przedstawiona jest odpowiedź proliferacyjna komórek CTLL.2 w wyniku aktywacji handlowym, rekombinantowym białkiem IL-2 albo bez dodatku IL-2 (KO).

Figura 3B przedstawia aktywność IL-2 immunokoniugatu Mab425CHl-IL-2 wytwarzanego w E. coli.

lako linię indykatorową użyto komórki CTLL-2. Na lewej części wykresu przedstawiona jest aktywność proliferacyjna seryjnych rozcieńczeń Mab425CHI-IL-2 wytwarzanego w E. coli i oczyszczonego metodą powinowactwa na kolumnie idiotypowej anty-Mab425 (wypełnione trójkąty). Jako kontrolę użyto supematanty COS zawierające Mab425-CHl-IL-2 (zamknięte kółka). Wypełnionymi kwadratami oznaczona jest krzywa buforu do dializy. Dla stwierdzenia, że ten bufor nie wpływa na aktywność IL-2, bufor do dializy miareczkuje się wobec stałego stężenia IL-2 (1 jednostka/ml) (odwrócone wypełnione trójkąty). Na prawej części wykresu przedstawiona jest odpowiedź proliferacyjna komórek CTLL.2 na aktywację handlowym, rekombinantowym białkiem IL-2 albo bez dodatku IL-2 (KO).

Figura 3C obrazuje indukowanie proliferacji limfocytów TIL przez immunokoniugat Mab425-CHl-IL-2.

Limfocyty przenikające do czerniaka hodowano bez (KO) albo w obecności seryjnych rozcieńczeń supematantów COS zawierających immunokoniugat 425-CH1-IL-2 (lewa część wykresu). Odpowiedź proliferacyjna komórek TIL po aktywacji rekombinantową handlową IL-2 jest przedstawiona na prawej części wykresu.

Figura 4 przedstawia indukcję proliferacji HPBL przez immunokoniugaty Mab425-IL-4.

Aktywowane przez PHA komórki HPBL hodowano w obecności seryjnych rozcieńczeń supematantów COS zawierających białka fuzyjne Mab425-CH2-IL-4 (zamknięte kółka), Mab425-CH3-IL-4 (zamknięte trójkąty). Jako kontrolę zastosowano supematanty zawierające Mab425 (zamknięte kwadraty), IL-4 (zamknięte romby) i kontrolne wektory (zamknięte odwrócone trójkąty). Odpowiedź proliferacyjna komórek HPBL w wyniku aktywacji handlową rekombinantową IL-4 i bez dodatku czynnika wzrostu (KO) jest zobrazowana na prawej części wykresu.

Figura 5 obrazuje cytotoksyczność immunokoniugatu Mab425-TNF_a wobec komórek WEHI 164.

Wrażliwą na TNF_a mysią linię komórkową włókniakomięsaka WEHI 164 hodowano przez 48 godzin w obecności seryjnych rozcieńczeń supematantów COS (lewa część wykresu) zawierających immunokoniugat 425-CHl-TNF_a (wypełnione kwadraty) albo 425-CH2-TNF_a(wypełnione trójkąty) albo Mab425Fab - kontrola (wypełnione kółka). Na prawej części wykresu przedstawione jest hamowanie wzrostu komórek indykatorowych, indukowanych handlowym, rekombinantowym ludzkim TNF_a.

Figura 6 obrazuje cytolizę nowotworu przez PBMC z udziałem immunokoniugatu Mab425-TNF_a.

178 793

Jako komórki efektorowe użyto nieaktywowane, ludzkie limfocyty krwi obwodowej (PBMC) i hodowano je razem, z allogenicznymi EGF-R-dodatnimi komórkami docelowymi C8161 znakowanymi izotopem chromu ⁵¹Cr w proporcji komórek efektorowych do docelowych wynoszącej 30:1. Na wykresie podany jest procent specyficznej lizy po 18 godzinach wspólnej hodowli bez lub w obecności seryjnych rozcieńczeń supematantów COS zawierających immunokoniugat Mab425CH3-TNF_a (słupki zakreskowane). Rekombinantowy TNF_a(Genzyme) był wytwarzany w E. coli w postaci dimeru o wielkości 36 kDaltonów (słupki kropkowane).

Inne mikroorganizmy, linie komórkowe, plazmidy, promotory, markery oporności, źródła replikacji, miejsca restrykcyjne lub inne fragmenty wektorów wzmianowane w niniejszym opisie są handlowo lub w inny sposób ogólnie dostępne. O ile nie są one w inny sposób opisane, użyto je tylko przykładowo i nie stanowią one istoty wynalazku; można je zastąpić innymi odpowiednimi środkami i materiałami biologicznymi.

Techniki mające zasadnicze znaczenie dla istoty wynalazku opisane są szczegółowo poniżej. Inne techniki, które nie są opisane szczegółowo, odpowiadają znanym metodom standardowym, ogólnie znanym specjalistom lub są opisane bardziej szczegółowo w cytowanym piśmiennictwie, cytowanych opisach zgłoszeń patentowych i w literaturze klasycznej (na przykład „Antibodies, A Labotatory Manuał”, Harlow, Lane, Cold Spring Harbor, 1988). Ekspresja białek fuzyjnych w komórkach eukariotycznych.

Konstruowanie eukariotycznych wektorów ekspresyjnych do ekspresji białka fuzyjnego Fab425-cytokina.

Fuzja Mab 425 z cytokinami za pomocą technologii „loop-out”

Generowanie konstrukcji kodujących TNF_a: Fragment SacII/Xbal z klonu ASacII cyl wprowadza się przez insercję do plazmidu Bluescript SK+ zawierającego sekwencje kodujące cytokinę, przykładowo sekwencję cDNA dla TNF_a. Ten cDNA dla TNF_a wprowadza się między miejsce Smal i miejsce EcoRI. Powstałą konstrukcję przygotowuje się w postaci jednoniciowego DNA przez dodanie odpowiedniego faga pomocniczego. Następnie dokonuje się fuzji w zgodnej fazie odczytu, sekwencji kodujących domeny CH2 lub CH3 z końcem 5' sekwencji kodującej TNF_a. Oligonukleotydy:

¹ CGAAGATGATCTGACCAT TTTGGCTTTGGAGATGGT 3 ¹

TNFa I domena cgl CH2

5’ CGAAGATGATCTGACCAT TTTACCCGGAGACAGGGA 3

TNFa 1 domena cgl CH3 są homologiczne odpowiednio z końcem 3' domeny CH2 i domeny CH3 i z końcem 5' sekwencji kodującej TNF^ Te jednoniciowe sekwencje DNA łączy się za pomocą oligonukleotydu, po czym z tej konstrukcji usuwa się znajdujące się pomiędzy nimi sekwencje niepożądane. Oligonukleotydy mają orientację przeciwną, ponieważ nić górna była generowana j ako DNA j ednoniciowy.

178 793

Do tego DNA dobudowuje się drugi łańcuch komplementarny stosując do tego celu sekwenazo-polimerazę. Ten enzym nie jest tak skłonny do błędów jak polimeraza DNA Amplitaq, a zatem oznacza się jedynie sekwencja DNA z połączenia izolowanych klonów. Klony zawierające prawidłową sekwencję łączono z sekwencjami niezbędnymi do generowania całkowitego białka fuzyjnego Mab 425 i klonowano do wektora pHCMV w celu ekspresji w komórkach eukariotycznych.

Generowanie konstrukcji kodujących IL-4

W celu wytworzenia tych konstrukcji, dokonuje się insercji całkowitego klonu ASacII cy 1 do plazmidu Bluescript KS+ w formie fragmentu Kpnl/Sall. Do tego samego wektora klonuje się sekwencję kodującą IL-4 w formie fragmentu HIndlll/EcoRI. Fuzję prowadzi się w taki sam sposób jak dla konstrukcji TNF^ stosując do fuzji z sekwencją dla domeny CH2 i domeny CH3 odpowiednio oligonukleotydy:

5' GATATCGCACTTGTGCAT TTTGGCTTTGGAGATGGT 3' IL-4 cgl domena CH2 i

5' GATATCGCACTTGTGCAT TTTACCCGGAGACAGGGA 3'

IL-4 cgl domena CH3

Klony zawierające prawidłową sekwencję łączono z sekwencjami niezbędnymi do generowania całkowitego białka fuzyjnego Mab425 i klonowano do wektora pHCMV w celu ekspresji w komórkach eukariotycznych.

Fuzja sekwencji kodujących Mab 425 i cytokiny z zastosowaniem technologii reakcji łańcuchowej polimerazy

DNA polimeraza Amplitaq jest skłonna do błędów, więc aby się upewnić, że nie wprowadzono błędów, oznaczano sekwencje tych segmentów, które były amplifikowane techniką reakcji łańcuchowej polimerazy. Primery użyte w tych doświadczeniach są podane w tabeli 1.

Tabela 1

Primery reakcji PCR stosowane do wytwarzania białek fiizyjnych Mab425-cytokina

Konstrukcja	Primer	Sekwencja DNA primera
1	2	3
CH2-1L-2	cyl 5' primer*	5 'AACAGCTATGACCATG 3'
	cyl 3' primer	5 'ACTTGAAGTAGGTGCCATTTTGGCTTTGGAGA
	cytokina 5' primer	5 'ATGGCACCTACTTCAAGT 3'
	cytokina 3' primer	5 'TATAGCGGCCGCGTCGACTCAAGTTAGTGTTGAGATG 3'
CH-3IL-2	cyl 5' primer **	5 'CAAGACAAAGCCGCGGGAG 3'
	cyl 3' primer	5 'ACTTGAAGTAGGTGCCATTTTACCCGGAGACAGGGAG 3'
	cytokina 5' primer	5 'ATGGCACCTACTTCAAGT 3'
	cytokina 3' primer	5 'CTTCTTCTAGACACTGCAG 3'
CHI-IL-4	cytokina 5' primer	5' ATCACCATGGTAATGCACAAGTGCGATATCACC 3'
	cytokina 3' primer***	5' CAGGAAACAGCTATGAC 3'

178 793 ciąg dalszy tabeli 1

1	2	3
CHI-IL-7	cytokina 5' primer	5' CTTACCTGCCATGGATTG 3'
	cytokina 3' primer	5' CAGAATTCGGATCCTTATCAGTG 3'
CH2-IL-7	cyl 5' primer*	5' AACAGCTATGACCATG 3'
	cyl 3' primer	5' TTCGATATCACAATCCATTTTGGCTTTGGAGATGGT 3'
	cytokina 5' primer	5' ATGGATTGTGATATCGAA 3'
	cytokina 3' primer	5' TAATTCTAGATCAGTGTTCTTTAGTGC 3'

Generowanie sekwencji kodujących białka fuzyjne CHI

Plazmid pUH5 zawiera sekwencje kodujące fragment ciężkiego łańcucha FAb425 do ekspresji w organizmach prokariotycznych z N-terminalną sekwencją liderową pelB pochodzącą z Erwinia carotovora (Lei i wsp., J.Bact. 169: 4379-4383. 1987), zapewniającą sekrecję białka. Fragment Hindin/Notl sklonowano do wektora Bluescript KS+. Sekwencje kodujące cytokiny IL-4 i IL-7 amplifikowano techniką reakcji łańcuchowej polimerazy, wprowadzając odpowiednio miejsca restrykcyjne 5' Ncol i 3' BamHI. Po tym procesie, sekwencje kodujące IL-2 i TNF_a zawierają miejsca restrykcyjne 5' Ncol i 3' BamHI. Sekwencje dla wszystkich cytokin klonowano w formie fragmentów Ncol/BamHI za domeną CHI. W tych konstrukcjach sekwencje dla cytokin nie występują w zgodnej fazie odczytu, dlatego, pomiędzy miejsca restrykcyjne Sali i Ncol wprowadzono sekwencję adapterową 5' TCGACAAGAAAG 3'. W wyniku ekspresji uzyskanych konstrukcji, wytwarzany jest łańcuch ciężki i cytokina jako białko fuzyjne z jednym dodatkowym aminokwasem (Ala) wprowadzonym przez sekwencję adaptorową. Fragmenty Dralll/BamHI klonowano do wektora ekspresyjnego pHCMV zawierającego klon cDNA dla całkowitego ciężkiego łańcucha Mab 425. W tej konstrukcji, sekwencję liderową pelB zamieniono na sekwencję liderową cDNA ciężkiego łańcucha Mab 425.

Generowanie sekwencji kodujących białka fuzyjne CH2 i CH3

Amplifikuje się ASacII cyl DNA techniką reakcji łańcuchowej polimerazy, prowadząc dwie oddzielne reakcje z zastosowaniem primerów dla końca 3' sekwencji kodującej CH2, zachodzących w zgodnej fazie na końce 5'sekwencji kodującej odpowiednią cytokinę, takąjak IL-2 i IL-7. Klony cDNA dla IL-2 i IL-7 również amplifikowano techniką PCR. Do konstrukcji IL-2, do końca 3' wprowadzano unikalne miejsca Notl i Sali a do konstrukcji IL-7 wprowadzano unikalne miejsce Xbal, dla ułatwienia subklonowania do wektora SK+ i następnego klonowania do wektora ekspresyjnego pHCMV.

Fuzji produktów reakcji PCR dla IL-2 i IL-7 z całkowitym rejonem Δ SacII cy 1 dokonano przez rekombinację PCR. Uzyskany fragment BarnHI/Notl DSacII cyl CH2-IL-2 subklonowano do SK+ zawierającego sekwencję kodującą zmienny rejon łańcucha ciężkiego mAb425. Fragment SacII/XbaI DSacII cyl CH2-IL-7 subklonowano do wektora SK+ zawierającego sekwencję kodującą rejon zmienny łańcucha ciężkiego mAb425 i rejon DSacII cyl aż do miejsca SacII. W tej procedurze generowano całkowite geny fuzyjne kodujące mAb425-CH2- IL-2 i IL-7. Całkowity gen fuzyjny mAb425-CH3 IL-2 generowano w podobny sposób, z tym że DSacII cyl amplifikowano od unikalnego miejsca SacII jako koniec 5'. Fragment SacII/Pstl z mAB 425-CH2 IL-2 w wektorze SK+ zawierającym fuzję CH2-IL-2 wymienia się następnie na fragment SacII/Pstl zawierający fuzję CH3-IL-2. W celu ekspresji w komórkach eukariotycznych, całkowite geny fuzyjne mAb425 klonowano do wektora pHCMV.

178 793

Ekspresja immunokoniugatów

Konstrukcje wektorowe do ekspresji jedno wartościowego immunokoniugatu zawierającego jedynie domenę CHI lub immunokoniugatów dwuwartościowych zawierających domeny CH2 i CH2 plus CH3 można wprowadzać do komórek gospodarza technikami elektroporacji, z użyciem DEAE dekstranu, fosforanu wapniowego, lipofektyny lub przez fuzję protoplastów. Do tego celu można użyć każdy typ komórek gospodarza, pod warunkiem, że rekombinantowe sekwencje DNA kodujące immunokoniugaty i odpowiedni łańcuch lekki podlegają prawidłowej transkrypcji do mRNA w tym typie komórki. Jako komórki gospodarza można zwłaszcza użyć mysie komórki szpiczaka, które nie wytwarzają immunoglobuliny, przykładowo Sp2/0-AG14 (ATCC CRL 1581), P3X63Ag8. 653 (ATCC CRL 1580) albo komórki chomika, takie jak CHO-K1 (ATCC CCL 61), albo CHO /dhFr- (ATCC CRL 9096) lub BHK-21 (ATCC CCL 10). Do przejściowej ekspresji można użyć komórki COS-1 (ATCC CRL 1650) albo COS-7 (ATCC CRL 1651).

Przejściowa ekspresja immunokoniugatów

Wektor ekspresyjny pHCMV zawiera źródło replikacji z wirusa Simiana 40 (SV40). Linia komórkowa COS-7 pochodzi z linii komórek Simiana CV-1, którą transformowano defektywnym wirusem SV40. Tak więc, plazmidy zawierające źródło replikacji z SV40 będą ulegać amplifikacji i będą się charakteryzować ulepszonym wytwarzaniem immunokoniugatów. Po 72 godzinach hodowli zbierano supematanty i oznaczano w nich wiązanie EGF-receptor i stężenie cytokiny.

Trwała ekspresja immunokoniugatów

Wektory zawierające konstrukcje rekombinantowe do ekspresji immunokoniugatów wprowadzano do odpowiednich komórek gospodarza. Konstrukcje zawierające kod dla łańcucha ciężkiego i konstrukcje zawierające sekwencje dla łańcucha lekkiego można umieszczać w tym samym wektorze lub w wektorach odrębnych. W tym ostatnim przypadku, obydwa wektory mogą posiadać identyczny marker selekcyjny, taki jak gen oporności na neomycynę albo dhFr lub też dwa różne markery selekcyjne, co umożliwia zróżnicowanie obecności obydwu wektorów. Selekcję według markera dhFr można prowadzić jedynie w dhFr-ujemnych liniach komórkowych, takich jak CHO/dhFr-. Analizę klonów na ekspresję immunokoniugatów prowadzi się techniką ELISA swoistą dla receptora EGF. Wyselekcjonowane klony oczyszcza się metodą klonowania w ograniczonych rozcieńczeniach.

Konstruowanie prokariotycznych wektorów ekspresyjnych do ekspresji białka fuzyjnego Mab 425-CHl-cytokina

Sekwencje DNA kodujące łańcuch lekki Mab 425 i fragment Fd łańcucha ciężkiego wprowadzano do wielomiejscowego wektora klonującego pSWl. Sekwencja kodująca dojrzały łańcuch lekki i sekwencja kodująca dojrzały łańcuch ciężki są poprzedzone peptydem liderowym z bakteryjnego genu pelB. Sekwencja kodująca łańcuch ciężki zawiera miejsce 3' Ncol. DNA kodujące cytokiny modyfikuje się w reakcji PCR w celu wprowadzenia miejsc restrykcyjnych Ncol (koniec 53 i Notl (koniec 3^. Geny cytokin łączy się w zgodnej fazie odczytu, bezpośrednio z genami dla domeny CHI łańcucha ciężkiego. Primery użyte w tych doświadczeniach są podane w tabeli 2.

178 793

Tabela 2

Primery reakcji PCR stosowane do wytwarzania białek fuzyjnych FAb425-cytokina (ekspresja prokariotyczna)

Konstrukcja	Primer	Sekwencja DNA primera
CH1-IL-2	cytokiną 5' primer	5' CTTACCTGCCATGGCACCT 3'
	cytokiną 3' primer	5' TGGTAGCGGCCGCTTATCAAGTTAGTGTTGA 3'
CH1-IL-4	cytokiną 5' primer	5' ATCACCATGGTAATGCACAAGTGCGATATCACC 3'
	cytokiną 3' primer	5' GGTAGCGGCCGCTTATCAGCTCGAACACTT 3'
CH-IL-7	cytokiną 5' primer	5' CTTACCTGCCATGGATTG 3'
	cytokiną 3' primer	5' TGGTAGCGGCCGCTTATCAGTGTTCTTTAGT 3'

Wektory te umożliwiają wydajną ekspresję funkcjonalnych białek fuzyjnych Fab-cytokina w E. coli. Białka fuzyjne łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego z cytokiną są zlokalizowane na dicistronicznym, informacyjnym RNA, pod kontrolą indukowanego promotora lac (Skerra i Pluckthun, Science, 242: 1038-104, 1988). Tak więc, można indukować ekspresję białka fiizyjnego-Fab zgodnie z wymaganiami dla warunków hodowli. Translacja obydwu białek z dicistronicznego mRNA sprzyja syntezie równych ilości białka fuzyjnego Fd-IL-2 i białka fuzyjnego zawierającego łańcuch lekki, co zwiększa szansę prawidłowego złożenia zapewniającego zachowanie cech funkcjonalnych wytwarzanych białek fuzyjnych Fab. Te dwa polipeptydy wydzielane są do periplazmy E. coli, gdzie zachodzi fałdowanie, tworzenie mostków dwusiarczkowych i składanie do funkcjonalnego białka fuzyjnego Fab425CHl. Przy dłuższej hodowli bakterii, białka wydzielane są do podłoża hodowli.

Ekspresja białka fuzyjnego Mab 425-CH1-IL-2 w E. coli i oczyszczanie

Szczepy E. coli nadające się do ekspresji białka transformuje się plazmidami ekspresyjnymi. Komórki hoduje się do fazy OD₅₈₀ = 0.5 i indukuje przez dodanie IPTG (1 mM). Komórki hoduje się przez dobę, po czym zbiera się supematanty i komórki. Następnie supematant podaje się na antyidiotypową kolumnę anty-Mab 425. Kolumnę przemywa się buforowanym fosforanem 0,5 M roztworem NaCl, po czym eluuje się związane białka roztworem zawierającym 100 mM glicyny i 0,5 M NaCl (pH - 2,5). Eluat niezwłocznie zobojętnia się 2.5 M roztworem Tris (pH = 8). Frakcje zawierające Mab 425-CH1-IL-2 zbiera się, zatęża i dializuje wobec PBS.

Właściwości wiążące immunokoniugatów Mab 425

Właściwości wiążące immunokoniugatów Mab 425 oznaczano techniką ELISA swoistą wobec receptorów EGF. Metoda w zarysie polega na tym, że płytki do mikromianowania powleka się oczyszczonym receptorem EGF przez dobę w temperaturze 4°C, po czym przemywa się w celu usunięcia niezwiązanego białka. Następnie płytki indukuje się z zawierającymi białko fuzyjne supematantami albo z supematantami zawierającymi nieskoniugowane Mab lub fragmenty Fab bądź też białka w formie oczyszczonej. Po tej inkubacji płytki przemywa się i inkubuje z anty-ludzką IgG i IgM kozła (łańcuch ciężki i lekki) skoniugowaną z peroksydazą. Dodaje się substrat i oznacza się ilość związanego białka swoistego względem receptora EGF przez pomiar przy długości fali 450 nm (fig. 2). Stężenie cytokiny oznaczano w dostępnych w handlu zestawach ELISA swoistych względem każdej cytokiny, postępując według instrukcji podanej przez producenta (dane nie są przytoczone).

Proliferacja leukocytów Nowotworowo-swoiste komórki efektorowe

Leukocyty jednojądrzaste z krwi obwodowej i limfocyty przechodzące do nowotworu (TIL) izolowane od pacjentów z czerniakiem hoduje się wspólnie z napromieniowanymi (30 grejow) autologicznymi komórkami nowotworowymi w pożywce RPMI 1640 o składzie: 1% penicyliny/streptomycyny, 1% glutaminy, 20 mM Hepes, 50 mM β-merkaptoetanol,

178 793

10% płodowej surowicy bydlęcej, 20 jednostek/ml IL-2, 20 jednostek/ml IL-4). Komórki odpowiadające były słabo stymulowane autologicznymi komórkami nowotworowymi.

Oznaczanie proliferacji

Proliferację, w której pośredniczą cytokiny można oznaczać przez:

a) użycie odpowiednich wskaźnikowych linii komórkowych.

Dla IL-2 można użyć IL-2 zależną mysią linię komórkową CTLL-2 (ATCC TIB 241; fig. 3 A) albo inną IL-2-zależną linię komórkową.

b) oznaczanie ekspandowanych in vitro limfocytów przechodzących do nowotworu (fig. 3B).

c) oznaczanie świeżo wyizolowanych jednojądrzastych limfocytów krwi uprzednio traktowanych odczynnikiem PHA-M (Sigma). W tym przypadku doświadczenie wykonano z użyciem białek fuzyjnych Mab 425-IL-4 (fig. 4).

Świeżo wyizolowane leukocyty z krwi obwodowej od zdrowych dawców krwi lub od pacjentów z czerniakiem albo limfocyty TIL wyizolowane od pacjentów z czerniakiem namnażano in vitro (w sposób podany powyżej). W celu oznaczenia białek fuzyjnych, limfocyty hodowano w 96-dołkowych płytkach do mikromiareczkowania z płaskimi dnami dołków przy gęstości lxl0⁵ komórek/dołek w końcowej objętości 200 μΐ. Komórki indukowano z supematantami zawierającymi białko fuzyjne lub z supematantami zawierającymi nieskoniugowane Mab lub supematantami zawierającymi nieskoniugowane cytokiny bądź te białka w postaci oczyszczonej. Po 72 godzinach komórki znakowano ilością 0.5 pCi ³H-tymidyny. Wprowadzoną aktywność oznaczano po dobowej inkubacji przez zliczanie w cieczowym liczniku scyntylacyjnym z beta-elektrodą. Wyniki wyrażono jako średnią liczbę impulsów na minutę (cpm).

Oznaczenie cytotoksyczności immunokoniugatów Mab 425-TNF_aOznaczenie cytotoksyczności, w której pośredniczy TNF_a

Z piśmiennictwa wiadomo, że TNF_a wykazuje bezpośrednią cytotoksyczność w stosunku do pewnych komórek, w tym do licznych komórek nowotworowych. Bezpośredni potencjał cytotoksyczny TNF_a można oznaczyć na mysich fibroblastach L929 (ATCC CCL 1) albo WEHI 164 (ATCC CRL 1751) lub na innych wrażliwych na TNF_a liniach komórkowych (Flick i Gifford, J. Immunol. Meth. 68: 167, 1984). Cytotoksyczny potencjał Mab 425CHl-TNF_a Mab 425 CH2-TNF_a oznaczony na linii komórkowej WEHI 164 jako linii wskaźnikowej jest przedstawiony na fig. 4.

Oznaczanie cytotoksyczności indukowanej przez TNF_a

Jako komórki docelowe do cytolizy przez allogeniczne limfocyty przenikające do nowotworu albo przez świeżo wyizolowane ludzkie limfocyty krwi obwodowej pobranej od pacjentów z czerniakiem lub od zdrowych dawców, można użyć EGFR-dodatnie linie komórkowe, takie jak wysoce inwazyjną i samorzutnie przerzutową EGFR-dodatnią linię komórkową C8161 (Welch i wsp., Int. J. Cancer 47: 227, 1991 i cytowane tam piśmiennictwo). Warunki hodowli komórek nowotworowych i limfocytów TIL zostały opisane przez Shimizu i wsp. (Cancer Res. 51: 6153, 1991).

Badania cytotoksyczności in vitro prowadzono stosując znakowane ⁵¹Cr, docelowe komórtki nowotworowe. Znakowanie komórek docelowych chromem ⁵'Cr (100 pCi/10⁷ komórek) prowadzono w czasie godziny, następnie prowadzono trzy etapy przemywania usuwając nadmiar ⁵'Cr. Ilość 2 χ 10³ komórek docelowych /dołek inkubowano z komórkami efektorowymi w 96 dołkowych płytkach do mikromianowania, w obecności supematantów zawierających białko fuzyjne, supematantów zawierających nieskoniugowane przeciwciała monoklonalne, supematantów zawierających nieskoniugowane cytokiny (kontrole) lub tych białek w formie oczyszczonej. Zarówno supematanty jak i białka oczyszczone były seryjnie rozcieńczane w pożywce hodowlanej i oznaczane w trzech doświadczeniach. Płytki inkubowano przez 4 godziny w temperaturze 37°C w atmosferze zawierającej 10% CO₂. Następnie komórki usuwano przez odwirowanie i oznaczano radioaktywność w supematantach w liczniku promieniowania γ. Procentowe, specyficzne uwolnienie ⁵'Cr wyliczano według wzoru:

178 793 _η . . . , _ _η (uwalnianie doświadczalne - uwalnianie samorzutne)

Procentowe swoiste uwalnianie 51_Cr = 100x---------^r (uwalnianie maksymalne - uwalnianie samorzutne)

Zastosowanie lecznicze immunokoniugatów

Immunokoniugaty według wynalazku mogąbyć stosowane do leczenia ludzi. Tak więc, celem wynalazku było opracowanie środka farmaceutycznego zawierającego jako składnik aktywny co najmniej jedno białko fuzyjne zdefiniowane powyżej i w zastrzeżeniach oraz jeden lub więcej niż jeden dopuszczalny farmaceutycznie nośnik, środek pomocniczy lub rozcieńczalnik.

W zasadzie, immunokoniugaty według wynalazku będą podawane dożylnie lub inną drogą parenteralną. Na ogół, zakres dawkowania tych immunokoniugatów będzie na tyle szeroki, aby wywołać żądane supresyjne działanie na nowotwór i lizę nowotworu. Dawkowanie będzie zależeć od wieku, stanu chorego, płci i stopnia zaawansowania choroby u pacjenta. Może się ono wahać od 0.1 mg/kg do 200 mg/kg, korzystnie od 0.1 mg/kg do 100 mg/kg/dawkę. Lek będzie mógł być podawany raz lub kilka razy dziennie przez jeden lub wiele dni.

Preparaty do podawania parenteralnego stanowią wodne lub niewodne roztwory, zawiesiny lub emulsje. Przykładami rozpuszczalników niewodnych są: glikol propylenowy, glikol polietylenowy, oleje roślinne, na przykład oleje z oliwek a także injekcyjne estry organiczne, między innymi oleinian etylowy i inne rozpuszczalniki znane w technologii farmaceutycznej, odpowiednie do tych celów. Immunokoniugaty według wynalazku mogą być stosowane w kompozycji zawierającej fizjologicznie dopuszczalny nośnik. Przykładami takich nośników są: sól fizjologiczna, PBS, płyn Ringera lub płyn Ringera z dodatkiem mleczanu. W środkach farmaceutycznych według wynalazku mogą również występować środki konserwujące i inne dodatki, takie jak antybiotyki, środki antyutleniające i środki chelatujące.

Środki farmaceutyczne według wynalazku są przeznaczone do leczenia wszystkich rodzajów nowotworów, w tym czerniaków, glejaków i raków, jak również nowotworów krwi i nowotworowych guzów litych.

178 793

TNFa (ng/mD

178 793 ccpm ccpm

450000

400000

350000

300000

250000

200000

150000

100000

50000 0

450000

400000

350000

300000

250000

200000

150000

100000

50000 0

2 3 β 13 25 60 100

Fig. 5

178 793

200000

150000 ccpm ccpm

100000

50000

200000

150000

100000

50000

KO 3 6 13 25 50 100 2 20

KO 1/128 1/64 1/32 1/16 1/8 1/4 1/2

Fig. 4

Fig. 3

178 793

Fig. 2

178 793

(a)

Fig. 1

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Białko fuzyjne, zawierające mysie lub humanizowane przeciwciało Mab 425 lub jego fragment skierowany przeciw komórce nowotworowej z epitopem antygenowym receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) i biologicznie aktywną cytokinę wybraną z grupy TNF_a, IL-2, IL-4i, IL-7, która jest połączona przez fuzję do wspomnianego przeciwciała .lub jego fragmentu i wykazuje właściwość cytotoksyczną wywoływania swoiście lizy komórki nowotworowej.
2. Białko fuzyjne według zastrz. 1, znamienne tym, że jako przeciwciało zawiera fragment Fab lub fragment F^b^ złożony w zasadzie ze zmiennego regionu łańcucha ciężkiego tego przeciwciała, domeny CHI rejonu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat przeciwciało-CH 1).
3. Białko fuzyjne według zastrz. 1, znamienne tym, że jako przeciwciało zawiera fragment przeciwciała składający się zasadniczo z rejonu zmiennego łańcucha ciężkiego tego przeciwciała, domen CHI i CH2 rejonu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat przeciwciało-CH2).
4. Białko fuzyjne według zastrz. 1, znamienne tym, że jako przeciwciało zawiera zasadniczo rejon zmienny łańcucha ciężkiego tego przeciwciała, domeny CHI, CH2 i CH3 rejonu stałego i odpowiedni łańcuch lekki (koniugat przeciwciało-CH3).
5. Białko fuzyjne wybrane z grupy: Mab 425-CHl-TNF_a, Mab-425-CH2-TNF_a, Mab 425-CH3-TNF_a, Mab 425-CH1-IL-2, Mab 425-CH2-IL-2, i Mab 425-CH3-IL-2.
6. Sposób wytwarzania białka fuzyjnego zawierającego mysie lub humanizowane przeciwciało Mab 425 lub jego fragment skierowany przeciw komórce nowotworowej z epitopem antygenowym receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) i biologicznie aktywną cytokinę wybraną z grupy TNF^ IL-2, IL-4i, IL-7, która jest połączona przez fuzję do wspomnianego przeciwciała lub jego fragmentu i wykazuje właściwość cytotoksyczną wywoływania swoiście lizy komórki nowotworowej, znamienny tym, że dokonuje się fuzji sekwencji DNA kodujących przeciwciało Mab 425 lub jego fragment skierowany przeciw komórce nowotworowej zawierającej epitop antygenowy receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) z sekwencją DNA kodującą biologicznie aktywną cytokinę wybraną z grupy TNF_a, IL-2, IL-4 i, IL-7, umieszcza się otrzymany konstrukt w wektorze ekspresyjnym, który jest transformowany do organizmu gospodarza, hoduje się komórkę gospodarza w roztworze pożywki i przeprowadza się ekspresję białka fuzyjnego.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że dokonuje się fuzji sekwencji DNA kodujących przeciwciało lub fragmenty przeciwciała z sekwencjami DNA kodującymi biologicznie aktywną cytokinę, na jednoniciowym DNA, stosując oligonukleotyd komplementarny do żądanej fuzyjnej sekwencji DNA.
8. Sposób według zastrz. 6 albo 7, znamienny tym, że dokonuje się ekspresji białka fuzyjnego przeciwciało-CH 1 wE. coli jako komórce gospodarza.
9. Sposób według zastrz. 6 albo 7, znamienny tym, że dokonuje się ekspresji białek fuzyjnych: przeciwciało-CH2 albo przeciwciało-CH3 w gospodarzu eukariotycznym.
10. Środek farmaceutyczny zawierający białko fuzyjne obejmujące przeciwciało i cytokinę oraz fizjologicznie dopuszczalne nośniki, znamienny tym, że zawiera co najmniej jedno białko fuzyjne zawierające mysie lub humanizowane przeciwciało Mab 425 lub jego fragment skierowany przeciw komórce nowotworowej zawierającej epitop antygenowy receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) i biologicznie aktywną cytokinę wybraną z grupy TNF^ IL-2, IL4 i, IL-7, która jest połączona przez fuzję do wspomnianego przeciwciała lub jego

178 793 fragmentu i wykazuje właściwość cyto toksyczną wywoływania swoiście lizy komórki nowotworowej oraz dopuszczalny fizjologicznie nośnik.
11. Środek farmaceutyczny według zastrz. 10, znamienny tym, że jako przeciwciało zawiera fragment Fab lub fragment F(ab')₂ złożony w zasadzie ze zmiennego regionu łańcucha ciężkiego tego przeciwciała, domeny CHI rejonu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat przeciwciało-CHl).
12. Środek farmaceutyczny według zastrz. 11, znamienny tym, że jako przeciwciało zawiera fragment przeciwciała składający się w zasadzie z rejonu zmiennego łańcucha ciężkiego tego przeciwciała, domen CHI i CH2 rejonu stałego i odpowiedniego łańcucha lekkiego (koniugat przeciwciało-CH2).
13. Środek farmaceutyczny według zastrz. 12, znamienny tym, że jako przeciwciało zawiera zasadniczo rejon zmienny łańcucha ciężkiego tego przeciwciała, domeny CHI, CH2 i CH3 rejonu stałego i odpowiedni łańcuch lekki (koniugat przeciwciało-CH3).
14. Środek farmaceutyczny według zastrz. 13, znamienny tym, że zawiera białko fuzyjne wybrane z grupy: Mab 425-CHl-TNF_a, Mab 425-CH2-TNF_a, Mab 425-CH3-TNF_a, Mab 425-CH1-IL-2, Mab 425-CH2-IL-2 i Mab 425-CH3-IL-2.

* * *