CZ289099B6 - Imunokonjugát, způsob jeho výroby a pouľití a farmaceutický přípravek na jeho bázi - Google Patents

Imunokonjugát, způsob jeho výroby a pouľití a farmaceutický přípravek na jeho bázi Download PDF

Info

Publication number
CZ289099B6
CZ289099B6 CZ19943306A CZ330694A CZ289099B6 CZ 289099 B6 CZ289099 B6 CZ 289099B6 CZ 19943306 A CZ19943306 A CZ 19943306A CZ 330694 A CZ330694 A CZ 330694A CZ 289099 B6 CZ289099 B6 CZ 289099B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
antibody
immunoconjugate
fragment
mab
tumor
Prior art date
Application number
CZ19943306A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ330694A3 (en
Inventor
Hoegen Ilka Dr. Von
Uwe Dr. Hofmann
Carlota-Silvia Dr. Jäggle
Wolfgang Dr. Strittmatter
Jörg Dr. Stadlmüller
Siegfried Dr. Matzku
Original Assignee
Merck Patent Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck Patent Gmbh filed Critical Merck Patent Gmbh
Publication of CZ330694A3 publication Critical patent/CZ330694A3/cs
Publication of CZ289099B6 publication Critical patent/CZ289099B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5406—IL-4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5418—IL-7
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/028—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a herpesvirus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Imunokonjug t, obsahuj c 1) monoklon ln protil tku nebo jej fragment sm rovan² k n dorov bu ce nesouc antigenn epitop receptoru epiderm ln ho r stov ho faktoru (EGFR) a 2) biologicky aktivn ligand, kter² je f·zov n k uveden protil tce nebo fragmentu protil tky a maj c cytotoxickou kapacitu pro l²zi n dorov²ch bun k specificky in situ nebo indukuj c n dorov specifickou imunitn odezvu, kde biologicky aktivn m ligandem je cytokin. Zp sob v²roby tohoto imunokonjug tu, p°i n m se vz jemn f·zuj DNA sekvence, k duj c protil tku nebo fragment protil tky a biologicky aktivn ligand, v²sledn² konstrukt se um st do expresn ho vektoru, kter² se transformuje do hostitelsk ho organismu, hostitelsk bu ky se kultivuj v ivn m roztoku a exprimuje se f·zn protein. Pou it tohoto imunokonjug tu pro p° pravu protin dorov ho l iva a farmaceutick² p° pravek s obsahem tohoto imunokonjug tu.\

Description

Vynález se týká určitého imunokonjugátu, způsobu jeho výroby a použití a farmaceutického přípravku na jeho bázi. Konkrétněji se vynález týká nových fúzních proteinů které zahrnují s nádorem spojený cílový element, výhodně monoklonální protilátku nebo její fragment, rozpoznávající molekulu, která je výhodně exprimována na lidských nádorových buňkách jako je receptor lidského epidermálního růstového faktoru (EGFR), a biologicky aktivní ligand jako je růstový a/nebo diferenciační faktor. Výsledný fúzní protein může být použit k doručení biologicky aktivního ligandu ke specifické cílové buňce nebo tkáni. Tyto nové imunokonjugáty mohou být použity v terapii nádorů.
Dosavadní stav techniky
Mnoho různých terapeutických konceptů bylo použito pro léčbu pacientů s rakovinou.
V posledních letech byly provedeny klinické pokusy s monoklonálními protilátkami, které rozpoznávají specificky nebo preferenčně molekuly buněčného povrchu exprimované na maligních buňkách. Cílem tohoto přiblížení je indukce na protilátce závislé celulámí cytotoxicity (ADCC) nebo komplementem zprostředkované cytotoxicity (CDC) pro eliminování nádorových buněk. Druhým přiblížením je cytokinem zprostředkovaná aktivace imunitní odezvy. Cytokinem indukovaná protinádorová aktivita může být zprostředkována:
1) přímým cytotoxickým/cytostatickým účinkem cytokinu na růst nádoru,
2) nádor-antigen-nespecifickým mechanismem jako je LAK aktivita nebo monocyty/makrofágy zprostředkovaná cytotoxicita,
3) nádor-antigen specifickými imunitními odezvami zprostředkovanými CD4 a CD8-pozitivními T buňkami. V této situaci byla systémová imunitní odezva vůči nádoru pozorována ve Zvířecích modelech.
Naneštěstí je systémová aplikace cytokinů jako je IL-2 nebo TNF ztížena jejich toxicitou (Rubin, Cancer Invest, 11:460-472, 1990; Balkwill, Nátuře 361:206-207, 1993). K dosažení dostatečné cytokinové koncentrace na místě nádoru by měly být podávány spíše vysoké dávky a maximální tolerovatelná dávka je pod dávkou, která je vyžadována pro dosažení účinnosti. Proto jsou negativní účinky cytokinů hlavním následkem systémové aplikace, ale jejich klinická relevance v nádorové terapii je nepochybná. Na zvířecích modelech bylo demonstrováno, že in sítu přítomnost cytokinu buď při intranádorové injekci nebo při sekreci transfektovaných nádorových buněk může vést k regresi nádorů (Hock a kol., PNAS 90:2774-2778, 1993; Colombo a kol., Cancer Res. 52:4853-4857, 1992; McBride a kol., Cancer Res. 52:3931-3937, 1992; Tepper a kol., Science 257:548-551, 1992; Mullen a kol., Cancer Res. 52:6020-6024,1992; Blankenstein a kol., J. Exp. Med 173:1047-1052, 1991; Gansbacher a kol., J. Exp. Med. 172:1217-1224, 1990).
V těchto systémech cytokiny nezhoršují nádorovou proliferaci, ale jsou schopny aktivace rychlé a účinné protinádorové reakce. Proto fyzická kombinace efektorové molekuly a cílového elementu představuje prostředek redukce periferní přítomnosti a zvýšení protinádorové dostupnosti biologicky aktivního ligandu. Dále mohou být jednotlivé nádorové buňky nebo mikrometastázy také cíleny těmito molekulami.
Biologicky aktivní ligand pro protilátkou řízené cílení by měl indukovat destrukci cílové buňky buď přímo nebo vytvořením prostředí, které je pro tyto buňky letální. Biologicky aktivním ligandem může být cytokin jako je IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-13, IFN, TNF nebo CSF. Tyto cytokiny jsou uváděny jako elicitující protinádorové účinky buď přímo nebo aktivací hostitelova obranného mechanismu (Mire-Sluis, TIBTECH 11:74-77, 1993; Colombo a kol., Cancer Res. 52: 4853-4857, 1992; Thomas and Balkwill, Pharmac. Ther. 52:307-330, 1991).
-1 CZ 289099 B6
Například je IL-2 považován za centrální mediátor imunitní odezvy. IL-2 byl uváděn jako stimulující proliferaci T buněk a NK buněk a jako indukující lymfokinem aktivované zabíječské buňky (lymphokine-activated killer cells - LAK). Nádor infíltrující T lymfocyty proliferují v odezvě na IL-2. Dále zvyšuje IL-2 cytotoxicitu T buněk a monocytů. Navíc IL-2 indukuje cytokinovou kaskádu sekretovanou T buňkami, NK buňkami a monocyty, což dále potencuje imunitní odezvu.
TNFa nachází rozsáhlou aplikaci v tumorové terapii, zejména díky jeho přímé cytotoxicitě pro určité nádorové buňky a indukci hemorrhagické regrese nádorů. Dále TNAa potencuje imunitní odezvu: je kostimulantem T buněčné proliferace, indukuje expresi NHC třídy I a třídy II antigenů a TNFa, IFN a IL-1 sekreci makrofágů. IL-4 nejprve byl popsán jako B buněčný růstový faktor.
V dalších studiích bylo uvedeno, že stimuluje antigen-specifické cytotoxické T buňky a působí specificky na T-buňkám podobné LAK buňky spíše než NK buňkám podobné LAK buňky. IL-4 inhibuje růst buněk lidského melanomu zvyšováním exprese jejich MHC třídy I a Π. Indukce makrofágem mediovaných protinádorových efektů u IL-4 je ještě kontroverzní.
IL-7 je růstový faktor pro pre-B buňky jakož i pro lidské periferní a CD8 pozitivní T buňky. IL7 přímo zvyšuje produkci IL-1, IL-6 a TNFa periferními monocyty. In vitro může být protinádorová aktivita monocyty/makrofágy stimulována IL-7, možná zprostředkována cytokiny, jako je TNFa.
Epidermální růstový faktor (EGF) je polypeptidový hormon, který je mitogenní pro epidermální a epiteliální buňky. Jestliže EGF interaguje s citlivými buňkami, váže se k membránovým receptorům (EGFR). EGFR je transmembránový glykoprotein asi 170kDa a je genovým produktem c-erb-B proto-onkogenu.
Myší monoklonální protilátka MAb 425 byla zvýšena proti lidské A431 nádorové buněčné linii (ATCC CRL 1555) a byla nalezena jako vázající se k polypeptidovému epitopu na vnější doméně EGFR. Bylo nalezeno, že inhibuje vazbu k EGF a zprostředkuje nádorovou cytotoxicitu in vitro a potlačuje růst nádorových buněk buněčných linií odvozených z epidermálního a kolonrektálního karcinomu in vitro (Rodeck a kol., 1987, Cancer Res. 47,3692). Humanizované a chimemí verze MAb 425 jsou známy z WO 92/15683.
Protilátka-cytokin imunokonjugáty v různých kombinacích pro přímé doručení aktivních proteinů byly popsány dříve. IL-2 byl kombinován s lidskou specifickou protilátkou L6 (Fell a kol., 1991., J. Immunol. 146:2446-2452, EP-OS-0439095), nebo s antigangliosidovou GD2 protilátkou (Gillies a kol., 1992, PNAS 89:1428-1432, WO 92/08495). Imunokonjugáty obsahující anti-dansyl protilátku a IGF1 byly generovány pro přímé doručení hormonů (Shin and Morrison, 1990, PNAS 87:5322-5326, WO 91/14438).
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je imunokonjugát, obsahující 1) monoklonální protilátku nebo její fragment směrovaný k nádorové buňce nesoucí antigenní epitop receptorů epidermálního růstového faktoru (EGFR) a 2) biologicky aktivní ligand, který je fúzován k uvedené protilátce nebo fragmentu protilátky a mající cytotoxickou kapacitu pro lýzi nádorových buněk specificky in šitu nebo indukující nádorově specifickou imunitní odezvu, kde biologicky aktivním ligandem je cytokin.
Ve výhodném provedení imunokonjugátu podle vynálezu je cytokin vybrán ze skupiny TNFa, IL-2, IL-4 a IL-7.
V dalším výhodném provedení imunokonjugátu podle vynálezu může být protilátkou Fab fragment nebo F(ab')2 fragment, sestávající alespoň z variabilní oblasti těžkého řetězce protilátky, CH1 domény konstantní oblasti a vhodného lehkého řetězce.
V jiném výhodném provedení imunokonjugátu podle vynálezu může být protilátkou fragment protilátky, sestávající alespoň z variabilní oblasti těžkého řetězce protilátky, CH1 a CH2 domény konstantní oblasti a vhodného lehkého řetězce.
-2CZ 289099 B6
Ještě v jiném výhodném provedení imunokonjugátu podle vynálezu může protilátka sestávat z alespoň variabilní oblasti těžkého řetězce protilátky, CH1, CH2 a CH3 domény konstantní oblasti a vhodného lehkého řetězce.
V imunokonjugátu podle vynálezu je přednostně protilátka nebo fragment protilátky odvozen od myší, humanizované nebo chimérické MAb 425.
Zvláště výhodný imunokonjugát podle vynálezu je vybrán ze skupiny MAb 425-CHl-TNF-a, MAb 425-CH2-TNF-a, MAb 425-CH3-TNF-a, MAb 425-CH1-IL2, MAb 425-CH2-IL2 a MAb 425-CH3-IL2.
Předmětem vynálezu je také způsob výroby imunokonjugátu uvedeného výše, jehož podstata spočívá vtom, že se vzájemně fúzují DNA sekvence, kódující protilátku nebo fragment protilátky a biologicky aktivní ligand, výsledný konstrukt se umístí do expresního vektoru, který se transformuje do hostitelského organismu, hostitelské buňky se kultivují v živném roztoku a exprimuje se fúzní protein.
Ve výhodném provedení způsobu podle vynálezu se fúzují DNA sekvence kódující protilátku nebo fragmenty protilátky a biologicky aktivní ligand na jednořetězcovou DNA pomocí oligonukleotidu, který je komplementární k požadované fúzní DNA-sekvenci.
Jako hostitele pro expresi konjugátu protilátka-CHl se s výhodou používá E.coli a jako hostitele pro expresi konjugátu protilátka-CH2 nebo protilátka-CH3 se s výhodou používá eukaryotického hostitele.
Předmětem vynálezu je dále také farmaceutický přípravek, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje alespoň jeden imunokonjugát popsaný výše a fyziologicky přijatelný nosič.
Konečně je předmětem vynálezu také použití imunokonjugátu popsaného výše pro přípravu protinádorového léčiva.
Objektem vynálezu tak je vytvoření protilátek nebo jejich fragmentů, obsahujících 1) epitop řízený kEGFR antigenu na povrchu nádorové buňky a 2) biologicky aktivní ligand, mající vysokou schopnost indukce cytotoxicity a tím zesílení protinádorového účinku in šitu.
Bylo nalezeno zejména v případě konjugátů protilátka-CH2 a protilátka-CH3, jako například MAb 425-CH2-TNFa a MAb 425-CH3-TNFa, vyvolání celulámí cytotoxicity vynikající ve srovnání s nekopulovaným TNFa. Toto je pravděpodobně způsobeno kombinací vazebných vlastností a indukce ADCC konstantními regiony monoklonální protilátky a aktivit cytokinu.
Konjugáty protilátka-CHl podle předloženého vynálezu jsou výhodné vzhledem k malé molekulové velikosti a možnosti exprese v prokaryotech. Dále bude malá velikost usnadňovat penetraci tkání (nádorovou).
Imunokonjugáty podle vynálezu vykazují dále dobré vazebné a proliferační vlastnosti ve srovnání s monoklonální protilátkou, výhodně MAb 425 jako takovým nebo jeho fragmentem.
Materiály a metody
Monoklonální protilátky
MAb 425 je myší monoklonální protilátka směrovaná proti lidské A431 nádorové buněčné linii (ATCC CRL 1555). MAb 425 se váže k polypeptidovému epitopu vnější domény lidského EGF receptorů a soutěží s vazbou EGF. MAb byl nalezen jako zprostředkující nádorovou cytotoxicitu in vitro a potlačující buněčný růst epidermoidní a kolorektální nádorové odvozené buněčné linie in vitro (Rodeck a kol., 1987, Cancer Res. 47:3692). Humanizované a chimémí verze MAb 425 byly popsány ve WO 92/15683.
Cytokiny
Cytokin kódující cDNA byly buď dostupné od British Biotechnology Limited (Herrmann Biermann GMBH, Bad Nauheim SRN: lidský IL-2 BBG30, lidský IL-4 BBG15, lidský IL7BBG43, lidský TNFa BBG18). Komerčně dostupné cDNA postrádají signální sekvenci
-3CZ 289099 B6 nezbytnou pro sekreci proteinu. Cytokin kódující cDNA mohou být generovány z mRNA izolované z buněk, produkujících cytokin.
Vektory pUC19 patří do série vysoce kopiových členů E.coli plazmid klonujících vektorů a obsahuje části pBR322 a M13mpl9. pUC19 obsahuje indukční bakteriální lac promotor-operátor, následovaný násobným klonovacím místem (Yanish-Perron a kol., Gene 33:103-109, 1985). pUC vektory jsou obchodně dostupné (např. New England Biolabs). pBluescript KS/SK+ a KS/SK- fágové vektory jsou odvozeny od pUC19. Vektory jsou komerčně dostupné (Stratagene).
Eukaryotický expresní vektor pHCMV (Gillies a kol., 1983, Cell 33:717) obsahuje počátek replikace opičího viru 40 (SV40) a promotorovou a zesilovačovou oblast lidského cytomegaloviru. Oblast promotor/zesilovač je následována multiklonovacím místem (mcs) pro zavedení genů, které mají být exprimovány. V tomto vektoru jsou chimémí forma mAB425 variabilní oblasti těžkého řetězce a SacIIc 1 oblast fúzovány sefektorovou molekulou na konci CH1, CH2 nebo CH3 domény, kombinovány pro generování MAb 425 fuzního proteinu těžkého řetězce. Fůzní Ig řetězec může být sestaven do imunokonjugátu kombinováním se vhodným lehkým řetězcem za vzniku monovalentní antigen vázající oblasti, která pak může být asociována za vzniku divalentního imunokonjugátu specifického pro cílový antigen (obr. 1). Konstrukty těžkého a lehkého řetězce mohou být umístěny ve stejných nebo separátních vektorech.
Prokaryotický expresní vektor je založen na pSWl vektoru (Ward a kol., Nátuře 341:544-546, 1989), který je derivátem pUC19 vektoru. pSWl obsahuje sekvenci, kódující vedoucí peptid bakteriálního pelB genu zErwinia carotovora (Lei a kol., J. Bact. 169:4379-4383, 1987). Cizí DNA mohou být zavedeny do rámečku za pelB vedoucí sekvenci k přímé proteinové expresi do periplazmy.
Popis obrázků a tabulek
Tabulka I: PCR primery použité pro generování MAb425-cytokin fuzních proteinů (eukaryotická exprese).
*Reverzní primer hybridizující ke Stratagen pBluescript vektorům SK+/- a KS+/(komerčně dostupný).
Tento primer hybridizuje k Cgl konstantní oblasti, obsahující unikátní SacII místo. ‘Reverzní primer hybridizující k ml3 odvozeným vektorům (komerčně dostupný).
Tabulka II: PCR primery použité pro generování MAb425-cytokin fúzních proteinů (prokaryotická exprese).
Obr. 1: Model imunokonjugátů protilátka-cytokin
C = cytokin, VH - variabilní oblast těžkého řetězce, VL = variabilní oblast lehkého řetězce, CH = konstantní oblast těžkého řetězce, CK = konstantní oblast lehkého řetězce, (a) konjugát protilátka-CHl, (b) konjugát protilátka-CH2, konjugát protilátka-CH3.
Obr. 2: Vazba imunokonjugátů k EGF-R v EGF-R specifické ELISA
Supematanty přechodně transfektovaných COS-7 buněk byly testovány na obsah imunokonjugátu. Vertikální osa: % absorbance při 490 nm, horizontální osa: ředění supematantu (log2).
MAb425CHl-TNFa (plné kroužky), MAb425CH2-THFa (plné čtverečky), MAb425CH3-THFa (plné trojúhelníčky), MAb425-FAb-kontrola (obrácené plné trojúhelníčky), MAb425F(ab')2 přetvařovaný (čištěný protein) (plné kosodélníky).
Obr. 3: IL-2 aktivita MAb425-CHl-IL-2-imunokonjugátu exprimovaného v COS-7 buňkách
CTLL-2 buňky byly použity jako indikátorová buněčná linie. Proliferativní aktivita postupného ředění COS supematantu, obsahujícího MAb425-CHl-IL-2, je uvedena v
-4CZ 289099 B6 levé části (plné kroužky). COS supernatant, obsahující MAb425Fab-kontrolu, byl použit jako kontrola (prázdné kroužky). Proliferativní odezva CTLL.2 buněk po aktivaci rekombinantním komerčním IL-2 proteinem nebo bez IL-2 (KO) je uvedena v pravé části.
Obr. 3B: IL-2 aktivita MAb425-CH-l-IL-2 imunokonjugátu exprimovaného v E.coli
CTLL-2 buňky byly použity jako indikátorová buněčná linie. Proliferativní aktivita postupně ředěného MAb-425-CHl-IL-2 exprimovaného v E.coli a afinita čištěného přes anti-MAb425 idiotypickou kolonu je uvedena na levém panelu (plné trojúhelníčky). COS supernatant, obsahující MAb425-CHl-IL-2, byl použit jako kontrola (uzavřené kroužky). Dialyzační pufr (uzavřené čtverečky). Pro zajištění, že pufr neovlivňuje IL-2 aktivitu byl dialyzační pufr titrován za přítomnosti konstantní koncentrace IL-2 (1 J/ml) (obrácené plné trojúhelníčky). Proliferativní odezva CTLL.2 buněk po aktivaci s rekombinantním komerčně dostupným IL-2 proteinem nebo bez IL-2 (KO) je uvedena na pravém panelu.
Obr. 3C: Indukce TIL proliferace u MAb425-CHl-IL-2-imunokonjugátu
Melanomový nádor infiltrující lymfocyty byly kultivovány bez (KO) nebo za přítomnosti postupně ředěných COS supematantú, obsahujících 425-CH1-IL-2 imunokonjugát (levý panel). Proliferativní odezva TIL po aktivaci rekombinantním komerčním IL-2 je uvedena na pravém panelu.
Obr. 4: Indukce HPBL proliferace u MAb425-IL-4 imunokonjugátů
PHA aktivované HPBL byly kultivovány za přítomnosti postupně ředěných COSsupematantů, obsahujících MAb425-CH2-IL-4 (plné kroužky), MAb425-CH3-IL-4 (plné trojúhelníky) fúzní proteiny. Supernatanty, obsahující MAb425 (plné čtverečky), IL-4 (plné kosodélníky) a vektorová kontrola (plné obrácené trojúhelníčky) byly použity jako kontrola. Proliferativní odpověď HPBL po aktivaci s rekombinantním komerčním IL—4 a bez růstového faktoru je (KO) uvedena na pravém panelu.
Obr. 5: MAb425-TNFa imunokonjugátová cytotoxicity na WEHI164 buňkách
TNFAa citlivé buněčné linie WEHI 164 myšího fibrosarkomu byly kultivovány po 48 hodin za přítomnosti postupně ředěných COS supematantú (levý panel), obsahujících 425-CHl-TNFa imunokonjugát (plné čtverečky) nebo 425-CH2-TNFa imunokonjugát (plné trojúhelníčky) nebo MAb425Fab-kontrolu (plné kroužky). Inhibice růstu indikátorových buněk indukovaná komerčním rekombinantním lidským TNFa je uvedena na pravém panelu.
Obr. 6: MAb425-TNFa imunokonjugátem zprostředkovaná nádorová cytolýza u PBMC
Neaktivované lymfocyty lidské periferní krve /PBMC byly použity jako efektorové buňky a kokultivovány salogenními EGF-R-pozitivní 51Cr-značenými C8161 cílovými buňkami při poměru efektor/cíl 30:1. Procenta specifické lýze jsou uvedena po 18 h kokultivace bez nebo za přítomnosti sériově ředěného supematantú, obsahujícího MAb 425-CH3-TNFa imunokonjugát (šrafované sloupce). Rekombinantní TNF (Genzyme) byl exprimován jako 36 kDa dimer v E.coli (tečkované sloupce).
Podrobný popis vynálezu
Obecně
Jiné mikroorganismy, buněčné linie, plazmidy, promotory, markéry rezistence, počátky replikace, restrikční místa nebo jiné fragmenty vektorů, které jsou v přihlášce zmíněny jsou komerčně dostupné nebojsou dostupné jinak. Pokud zde jsou uváděny jsou míněny pouze jako příklady a nejsou podle vynálezu podstatné a mohou být nahrazeny jinými vhodnými nástroji a biologickými materiály.
-5CZ 289099 B6
Techniky, které jsou podle vynálezu podstatné jsou popsány podrobněji dále. Jiné techniky, které nejsou podrobně popsány odpovídají známým standardním metodám, které jsou odborníkům v oboru dobře známé nebo jsou podrobněji popsány v citovaných odkazech a patentových přihláškách a ve standardní literatuře (např. „Antibodies, A Laboratory Manual“, Harlow, Lané, Cold Spring Harbor, 1988).
Exprese fuzních proteinů v eukaryotických buňkách
Konstrukce eukaryotických expresních vektorů pro expresi Fab425-cytokin fuzního proteinu
Fúze MAb425 a cytokinů smyčkovou technologií
Generování TNFa konstruktů:
SacII/Xbal fragment ASacII cyl klonu byl inzertován do Bluescript SK+, obsahujícího cytokin kódující sekvence jako je TNFa cDNA. TNFa cDNA byla zavedena mezi Smál a EcoRI místo. Výsledný konstrukt byl připraven jako jednořetězcová DNA přídavkem vhodného pomocného fágu. CH2 nebo CH3 doména byly fúzovány v rámečku k 5' konci TNFa kódující sekvence. Oligonukleotidy
5'CGAAGATGATCTGACCAT TTTGGCTTTGGAGATGGT 3'
TNFa | cgl CH2 doména
5'CGAAGATGATCTGACCAT TTTACCCGGAGACAGGGA 3'
TNFa | cgl CH3 doména jsou homologní u 3'konce CH2 domény a CH3 domény a 5'konce TNF kódující sekvence. Jednořetězcové DNA sekvence jsou zachovány společně u oligonukleotidu a neočekávané sekvence mezi jsou odstraněny z konstruktu. Oligonukleotidy mají opačnou orientaci, protože horní řetězec byl generován jako jednořetězcová DNA.
DNA byla doplněna na dvojřetězcovou formu polymerázou sequenázou. Tento enzym není tak náchylný k chybám jako Amplitaq DNA polymeráza a proto byla stanovena pouze DNA sekvence spojení izolovaných klonů. Tyto klony se správnou sekvencí byly kombinovány se sekvencí nezbytnou pro vytvoření kompletního mAb425 fuzního proteinu a klonovány do pHCMV vektoru pro expresi v eukaryotických buňkách.
Generování IL-4 konstruktů:
Pro tyto konstrukty byl kompletní SacII c 1 klon inzertován do Bluescript KS+ as KpnI/SalI fragmentu. IL-4 byl klonován jako HindlII/EcoRI fragment do téhož vektoru. Fúze byla provedena jak je popsáno pro TNF konstrukty s oligonukleotidy
5'GATATCGCACTTGTGCAT TTTGGCTTTGGAGATGGT 3'
IL-4 | cgl CH2 doména
5'GATATCGCACTTGTGCAT TTTACCCGGAGACAGGGA 3'
IL-4 | cgl CH3 doména pro fúzi k CH2 nebo CH3 doméně.
Klony se správnou sekvencí byly kombinovány se sekvencemi nezbytnými pro generování kompletního mAb425 fuzního proteinu a klonovány do pHCMV vektoru pro expresi v eukaryotických buňkách.
Fůze MAb425 a cytokinů PCR technologií
Amplitaq DNA polymeráza je náchylná k chybám a pro ujištění, že nebyly do sekvencí těchto segmentů amplifikovaných PCR inkorporovány žádné chyby, bylo provedeno stanovení. Primery použité v těchto pokusech jsou shrnuty v tabulce I.
Generování CH1 fúzních proteinů
-6CZ 289099 B6 pUH5 plazmid obsahuje sekvence pro fragment těžkého řetězce FAb425 pro prokaryotickou expresi s N-terminální pel 8 vedoucí sekvencí odvozenou zErwinia carotovora (Lei a kol., J. Bact. 169:4379-4383, 1987) pro zajištění sekrece proteinu. HindlII/Notl fragment byl reklonován do Bluescript KS+ vektoru. Cytokiny IL-4 a IL-7 byly amplifikovány PCR technologií pro zavedení 5'Ncol a 3'BamHI restrikčního místa. IL-2 a TNFa vždy obsahují 5'Ncol a 3'BamHI restrikční místa. Všechny cytokiny byly klonovány jako NcoI/BamHI fragmenty za CH1 doménu. V těchto konstruktech nebyly cytokinové sekvence v rámečku. Proto byl adaptor (5'TCGAACAAGAAAG3') zaveden mezi Sall a Ncol restrikční místa. Ve výsledných konstruktech jsou těžký řetězec a cytokin exprimovány jako fuzní protein s jednou další aminokyselinou (Ala) zavedenou u adaptorové sekvence. DralII/BamHI fragmenty byly klonovány do pHCMV expresního vektoru, obsahujícího kompletní MAb425 klon MAb425 těžkého řetězce cDNA. V tomto konstruktu pelB vedoucí sekvence byla zaměněna za vedoucí sekvenci MAb425 těžkého řetězce cDNA.
Generování CH2 a CH3 fúzních proteinů
ASacII cyl DNA byla amplifikována PCR technologií ve dvou separátních reakcích za použití CH2-3'koncových primerů, které přesahují, v rámečku s 5'koncem odpovídajícího cytokinu jako je IL-2 a IL-7. IL-2 a IL-7 cDNA klony byly také amplifikovány PCR. Na 3'konci unikátního Notl a Sall místa byla inkorporována do IL-2 konstruktu unikátní Kbal místo do IL-7 konstruktu pro usnadnění subklonování do SK+ vektoru a následně do pHCMV expresního vektoru. Fúze IL-2 a IL-7 PCR produktů s kompletní ASacII cyl oblastí byla provedena PCR rekombinací. Výsledný BamHI/Notl ASacII cyl CH-2-IL-2 fragment byl subklonován do SK+, obsahujícího variabilní oblast mAb425 těžkého řetězce. SacII/Xbal ASacII cyl CH2 IL-7 fragment byl subklonován do SK+ vektoru, obsahujícího variabilní oblast mAb425 těžkého řetězce a ASacII cyl oblast až k SacII místu. Tento postup generuje kompletní mAb425-CH2 IL-2 a IL7 fuzní geny. Kompletní mAb425-CH3 IL-2 fuzní gen byl generován s tím rozdílem, že ASacII cyl byl amplifikován z unikátního SacII místa jako 5'konec. SacII/Pstl fragment mAb425-CH2 IL-2 v Sk+, obsahujícím CH2 IL-2 fúzi byl pak zaměněn s SacII/Pstl fragmentem, obsahujícím CH3 IL-2 fúzi. Kompletní mAb425 fúzní geny byly pak klonovány do pHCMV vektoru pro expresi v eukaryotických buňkách.
Exprese imunokonjugátů
Zavedení vektorových konstruktů pro expresi monovalentního imunokonjugátu, obsahujícího pouze CH1 doménu nebo divalentních imunokonjugátů, obsahujících CH2 a CH2 plus CH3 domény do hostitelských buněk mohlo být dosaženo elektroporací, DEAE dextranem, fosforečnanem vápenatým nebo Lipofectinem nebo fúzí protoplastů. Jakékoliv hostitelské buňky mohou být použity s tou podmínkou, že rekombinantní DNA sekvence kódující imunokonjugáty a vhodný lehký řetězec jsou správně transkribovány do mRNA v takovém typu buňky. Hostitelské buňky mohou být buňky myšího myelomu jako je Sp2/0-AG14 (ATCC CRL 1581), P3X63Ag8.653 (ATCC CRL 1580) nebo křečci buňky jako je CHO-K1 (ATCC CCL61) nebo CHO/dhFr- (ATCC CRL 9096) nebo BHK-21 (ATCC CCL 10). Pro přechodnou expresi mohou být použity COS-1 (ATCC CRL 1650) nebo COS-7 (ATCC CRL 1651).
Přechodná exprese imunokonjugátů
Expresní vektor pHCMV obsahuje počátek replikace opičího viru 40 (SV40). Buněčná linie COS-7 je derivátem opičí buněčné linie CV-1, která byla transformována s napočátku defektním SV40 virem. Proto plazmidy, obsahující SV40 počátek replikace budou amplifikovány a produkce imunokonjugátů bude zlepšena. Supematanty byly sklizeny o 72 hodin později a testovány na EGF-receptor vazbu a koncentraci cytokinu.
Permanentní exprese imunokonjugátů
Vektory, obsahující rekombinantní konstrukty pro expresi imunokonjugátů byly zavedeny do vhodných hostitelských buněk. Konstrukty těžkého a lehkého řetězce mohou být umístěny do stejných nebo separátních vektorů: V posledně uvedeném případě mohou oba vektory nést
-7CZ 289099 B6 shodný selekční markér jako je neomycinová rezistence nebo dhFr, nebo dva rozdílné markéry pro selekci přítomnosti obou vektorů. Selekce na dhFr markér může být provedena pouze v dhFr negativních buněčných liniích jako je CHO/dhFr-. Klony jsou analyzovány na expresi imunokonjugátů pomocí Egf-receptor-specifické ELISA. Selektované klony se pak dále čistí klonováním v limitujícím ředění.
Konstrukce prokaryotických expresních vektorů pro expresi fuzního proteinu MAb425-CHlcytokin
DNA sekvence, kódující MAb425 lehký řetězec a Fd fragment těžkého řetězce byly zavedeny do násobného klonovacího místa pSWl vektoru. Zralá, lehký řetězec kódující sekvence a zralá, těžký řetězec kódující sekvence mají před sebou vedoucí peptid bakteriálního pelB genu. Sekvence, kódující těžký řetězec, obsahuje 3'Ncol místo. Cytokin kódující cDNA byly modifikovány PCR pro zavedení Ncol (3'konec) restrikčních míst. Cytokinové geny byly fúzovány v rámečku přímo k CH1 doméně těžkého řetězce. Příměry použité v těchto pokusech jsou shrnuty v tabulce II.
Tyto vektory umožňují účinnou expresi funkčních Fab-cytokin fuzních proteinů v E.coli. Fúzní protein lehkého řetězce a těžkého řetězce-cytokinu jsou umístěny na dicistronní nosičové RNA umístěné pod kontrolou indukujícího lac promotoru (Skerra a Pluckthun, Science 242:1038-104, 1988). Takto může být exprese Fab-fuzního proteinu indukována podle požadavků na kultivační podmínky. Translace obou proteinů z dicistronní nosičové RNA usnadňuje syntézu stejných množství Fd-IL-2 fuzního proteinu a lehký řetězec tak zvyšuje šance na správné zařazení se do Fab-fúzních proteinů. Tyto dva polypeptidy jsou sekretovány do periplazmy E. coli, kde skládáním, tvorbou disulfidových vazeb a sestavením vzniká funkční fuzní protein FAb425CHl. Při prodloužené kultivaci bakterií jsou proteiny exprimovány do kultivačního média.
Exprese fúzního proteinu MAb425-CHl-IL-2 v E.coli a čištění
E.coli kmeny vhodné pro expresi byly transformovány expresními plazmidy. Buňky rostly na OD58oO,5 a byly indukovány s IPTG (1 mM). Buňky rostly přes noc a supematanty a buňky byly sklizeny. Supematant byl aplikován na antiMAb425 antiidiotypickou kolonu. Kolona byla promyta fosfátem pufrovaným 0,5 N NaCl a navázané proteiny byly eluovány 10 mM glycinem 0,5 M NaCl, pH2,5. Eluát byl ihned neutralizován Tris 2,5 M pH 8. MAb425-CHl-IL-2obsahující frakce byly spojeny, koncentrovány a dialyzovány proti PBS.
Vazebné vlastnosti MAb425 imunokonjugátů
Vazebné vlastnosti MAb425 imunokonjugátů byly stanoveny EGF-receptor-specifickou ELISA. Mikrotitrační plotny byly potaženy přes noc při 4 °C čištěným EGF-receptorem a promyty pro odstranění nenavázaného proteinu. Plotny byly inkubovány se supematanty, obsahujícími fúzní protein nebo supematanty, obsahujícími nekonjugovaný MAb nebo Fab fragmenty nebo proteiny v čištěné formě. Plotny byly promyty a inkubovány s kozím-anti-humánním IgG a IgM (těžký a lehký řetězec) konjugovanými k peroxidáze. Byl přidán substrát a množství vazby EGFreceptor-specifický protein bylo stanoveno měřením při 450 nm (obr. 2). Koncentrace cytokinu byla stanovena komerčně dostupnou ELISA specifickou pro každý cytokin podle instrukcí výrobce (data neuvedena).
Proliferace leukocytů
Nádorově specifické efektorové buňky
Mononukleámí leukocyty periferní krve a nádor infiltrující lymfocyty (TIL) izolované z pacientů s melanomem byly společně kultivovány s ozářenými (30 Gy) autologními nádorovými buňkami v médiu (RPMI 1640, 1 % penicilin/streptomycin, 1 % glutamin, 20 mM Hepes, 50 mM β merkaptoethanolu, 10% fetálního telecího séra, 20 J/ml IL-2, 20J/ml IL-4). Odpovídající buňky byly týdně stimulovány s autologními nádorovými buňkami.
Stanovení proliferace
Cytokinem zprostředkovaná proliferace může být stanovena se
-8CZ 289099 B6
a) Vhodnou indikátorovou buněčnou linií. V případě 11-2 IL-2-závisející myší buněčnou linií CTLL-2 (ATCC TIB 241) (obr. 3 A) nebo jiné IL-2-závislé buněčné linie mohou být použity.
b) In vitro expandovanými nádor infiltrujícími lymfocyty (obr. 3B).
c) Čerstvě izolovanými monojademými buňkami předem ošetřenými s PHA-M(Sigma). V tomto případě byl experiment proveden s MAb425-IL4 fúzními proteiny (obr. 4).
Čerstvě připravené leukocyty periferní krve od zdravých dárců nebo pacientů s melanomem nebo TIL izolované z pacientů s melanomem byly kultivovány in vitro (viz výše). Pro zkoušení fúzních proteinů byly lymfocyty kultivovány v 96jamkové mikrotitrační destičce s plochým dnem při hustotě lxlO5 buněk na jamku v konečném objemu 200 μΐ. Buňky byly inkubovány s fúzní protein obsahujícími supematanty nebo supematanty, obsahujícími nekonjugovaný MAb nebo supematanty, obsahujícími nekonjugované cytokiny nebo proteiny v čištěné formě. Po 72 hodinách byly buňky pufrovány s 0,5 pCi 3H-thymidinem. Inkorporování radioaktivity bylo stanoveno po inkubaci přes noc spočtením kapalinové scintilace β-plotny. Výsledky jsou vyjádřeny jako průměr cpm.
Stanovení cytotoxicity MAb425-TNFa imunokonjugátů
Stanovení TNFa-zprostředkované cytotoxicity
TNF byl popsán jako přímo toxický pro určité buňky, zahrnující různé nádorové buňky. Přímý cytotoxický potenciál TNF může být stanoven s L929 myšími fibroblasty (ATCC CCL1) nebo WEHI 164 (ATCC CRL 1751) nebo jinými TNF -citlivými buněčnými liniemi jak bylo popsáno (Flick a Gifford, 1984, J. Immunol. Meth. 68:167). Na obr. 4 jsou cytotoxické potenciály MAb425CHl-TNFa a MAb425CH2-TNF demonstrovány na WEHI 164 buňkách jako indikátorové buněčné linii.
Stanovení TNFa-indukované cytotoxicity
EGF-receptor-pozitivní buněčná linie jako vysoce invazivní a spontánně metastatická, EGFreceptor-pozitivní buněčná linie C8161 (Welch a kol., 1991, Int. J. Cancer 47:227 a zde citované odkazy) může být použita jako cílové buňky pro cytolýzu alogenních nádor infiltrujících lymfocytů nebo čerstvě izolovaných lymfocytů periferní krve z pacientů s melanomem nebo od zdravých dárců. Kultivační podmínky pro nádorové buňky a TIL byly dříve popsány (Shimizu a kol., Cancer Res. 51:6153).
In vitro studie cytotoxicity se provádějí za použití 5lCr nádorových cílových buněk. Cílové buňky byly značeny s 51Cr /100 pCi/107 buněk/ po 1 hodinu s následujícím trojnásobným promytím pro odstranění přebytku 51Cr. 2x103 cílových buněk bylo koinkubováno s efektorovými buňkami v 96jamkových mikrotitračních destičkách za přítomnosti fuzní protein obsahujících supematantů nebo supematantů, obsahujících nekonjugovaný MAb nebo supematantů, obsahujících nekonjugované cytokiny (kontroly) nebo proteiny v čištěné formě. Supematanty nebo čištěné proteiny byly postupně ředěny v kultivačním médiu a trojnásobně zkoušeny. Plotny byly inkubovány po 4 hodiny při 37 °C v atmosféře s 10 % CO2. Buňky pak byly odstraněny odstředěním a radioaktivita v supematantech byla stanovena v čítači. Procenta 51Cr-uvolnění byla vypočtena podle vzorce:
(experimentální uvolnění - spontánní uvolnění) % specifického 51Cr-uvolnění = --------------------------------------------- xlOO (maximální uvolnění - spontánní uvolnění)
Terapeutické použití imunokonjugátů
Imunokonjugáty podle vynálezu mohou být podávány lidským pacientům jako léčebné. Proto je objektem vynálezu poskytnutí farmaceutického přípravku, obsahujícího jako účinnou složku alespoň jeden fúzní protein definovaný výše a v nárocích, spojený s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými nosiči, přísadami nebo ředidly.
-9CZ 289099 B6
Typicky mohou být imunokonjugáty podle vynálezu injektovány intravenózně nebo parenterálně. Obecně dávková rozmezí pro podání imunokonjugátů jsou dostatečně velká pro produkci požadovaného potlačení nádoru a uskutečnění lýze nádoru. Dávka bude záviset na věku, stavu, pohlaví a rozsahu pacientovy choroby a může se měnit od 0,1 mg/kg do 200 mg/kg, výhodně od 5 0,2 mg/kg do 100 mg/kg/dávka v jednom nebo více denních podáních, po jeden nebo několik dnů.
Přípravky pro parenterální podání obsahují sterilní vodné nebo nevodné roztoky, suspenze a emulze. Příklady nevodných rozpouštědel jsou propylenglykol, polyethylenglykol, rostlinné oleje jako jsou olivové oleje a injektovatelné organické estery jako je ethyloleát a jiná rozpouštědla 10 známá v oboru, která jsou vhodná pro tyto účely. Imunokonjugáty podle vynálezu mohou být použity v přípravku, obsahujícím fyziologicky přijatelný nosič. Příklady takových vhodných nosičů jsou salinický roztok, PBS, Ringerův roztok nebo Ringerův roztok s laktátem. Ve farmaceutických přípravcích mohou být také použity ochranné látky a jiné přísady jako jsou antibiotika, antioxidanty a chelatační činidla.
Farmaceutické přípravky podle předloženého vynálezu jsou vhodné pro léčbu všech typů nádorů, zahrnujících melanomy, gliomy a karcinomy, jakož i krevní tumory a pevné tumory.
Tabulka I. PCR primery použité pro generaci MAb425-cytokin fuznich proteinů
konstrukt primer primer DNA sekvence
CH2-IL-2 cyl 5' primer* 5'AACAGCTATGACCATG 3'
cyl 3' primer 5'ACTTGAAGTAGGTGCCATTTTGGCTTTGGAGATGGT3'
cytokin 5'primer 5'ATGGCACCTACTTCAAGT 3'
cytokin 3'primer 5'TATAGCGGCCGCGTCGACTCAAGTTAGTGTTGAGATG 3'
CH3-IL-2 cyl 5' primer*’ 5'CAAGACAAAGCCGCGGGAG 3'
cyl 3' primer 5'ACTTGAAGTAGGTGCCATTTTACCCGGAGACAGGGAG 3'
cytokin 5'primer 5'ATGGCACCTACTTCAAGT 3'
cytokin 3' primer 5'CTTCTTCTAGACACTGCAG 3'
CH1-IL-4 cytokin 5' primer 5'ATCACCATGGTAATGCACAAGTGCGATATCACC 3'
cytokin 3' primer*** 5'CAGGAAACAGCTATGAC 3'
CH1-IL-7 cytokin 5' primer 5'CTTACCTGCCATGGATTG 3'
cytokin 3' primer 5'CAGAATTCGGATCCTTATCAGTG 3'
CH2-IL-7 cyl 5' primer* 5'AACAGCTATGACCATG 3'
cyl 3' primer 5'TTCGATATCACAATCCATTTTGGCTTTGGAGATGGT3'
cytokin 5' primer 5'ATGGATTGTGATATCGAA 3'
cytokin 3' primer 5'TAATTCTAGATCAGTGTTCTTTAGTGC 3'
Tabulka II. PCR primery použité pro generaci FAb425-cytokin fuznich proteinů (prokaiyotická exprese)
konstrukt primer primer DNA sekvence
CH2-IL-2 cytokin 5' primer 5'CTTACCTGCCATGGCACCT 3'
cytokin 3' primer 5'TGGTAGCGGCCGCTTATCAAGTTAGTGTTGA 3'
CH1-IL-4 cytokin 5' primer 5'ATCACCATGGTAATGCACAAGTGCGATATCACC 3'
cytokin 3' primer 5'GGTAGCGGCCGCTTATCAGCTCGAACACTT 3'
CH1-IL-7 cytokin 5' primer 5'CTTACCTGCCATGGATTG 3'
cytokin 3' primer 5'TGGTAGCGGCCGCTTATCAGTGTTCTTTAGT 3'

Claims (13)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Imunokonjugát, obsahující 1) monoklonální protilátku nebo její fragment směrovaný k nádorové buňce nesoucí antigenní epitop receptoru epidermálního růstového faktoru, EGFR, a 2) biologicky aktivní ligand, který je fúzován k uvedené protilátce nebo fragmentu protilátky a mající cytotoxickou kapacitu pro lýzi nádorových buněk specificky in šitu nebo indukující nádorově specifickou imunitní odezvu, kde biologicky aktivním ligandem je cytokin.
  2. 2. Imunokonjugát podle nároku 1, kde cytokin je vybrán ze skupiny TNFa, IL-2, IL-^4 a IL-7.
  3. 3. Imunokonjugát podle nároku 1 nebo 2, kde protilátkou je Fab fragment nebo F(ab')2 fragment, sestávající alespoň z variabilní oblasti těžkého řetězce protilátky, CH1 domény konstantní oblasti a vhodného lehkého řetězce.
  4. 4. Imunokonjugát podle nároku 1 nebo 2, kde protilátkou je fragment protilátky, sestávající alespoň z variabilní oblasti těžkého řetězce protilátky, CH1 a CH2 domény konstantní oblasti a vhodného lehkého řetězce.
  5. 5. Imunokonjugát podle nároku 1 nebo 2, kde protilátka sestává z alespoň variabilní oblasti těžkého řetězce protilátky, CH1, CH2 a CH3 domény konstantní oblasti a vhodného lehkého řetězce.
  6. 6. Imunokonjugát podle některého z nároků 1 až 4, kde je protilátka nebo fragment protilátky odvozen od myší, humanizované nebo chimérické MAb 425.
  7. 7. Imunokonjugát podle nároku 6, vybraný ze skupiny MAb 425-CHl-TNFa, MAb 425CH2-TNFa, MAb 425-CH3-TNFa, MAb 425-CH1-IL2, MAb 425-CH2-IL2 a MAb 425CH3-IL2.
  8. 8. Způsob výroby imunokonjugátu podle některého z nároků laž7, vyznačující se tím, že se vzájemně fúzují DNA sekvence, kódující protilátku nebo fragment protilátky a biologicky aktivní ligand, výsledný konstrukt se umístí do expresního vektoru, který se transformuje do hostitelského organismu, hostitelské buňky se kultivují v živném roztoku a exprimuje se fúzní protein.
  9. 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že se fúzují DNA sekvence kódující protilátku nebo fragmenty protilátky a biologicky aktivní ligand na jednořetězcovou DNA pomocí oligonukleotidu, který je komplementární k požadované fúzní DNA-sekvenci.
  10. 10. Způsob podle nároku 8 nebo 9, vyznačující se tím, že konjugáty protilátka-CHl se exprimují v hostiteli E.coli.
  11. 11. Způsob podle nároku 8 nebo 9, vy zn ač u j í c í se t í m, že konjugáty protilátka-CH2 nebo protilátka-CH3 se exprimují v eukaryotickém hostiteli.
  12. 12. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden imunokonjugát podle nároků 1 až 7 a fyziologicky přijatelný nosič.
  13. 13. Použití imunokonjugátu podle některého z nároků 1 až 7 pro přípravu léčiva směrovaného proti nádorům.
CZ19943306A 1993-12-24 1994-12-27 Imunokonjugát, způsob jeho výroby a pouľití a farmaceutický přípravek na jeho bázi CZ289099B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP93120865 1993-12-24

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ330694A3 CZ330694A3 (en) 1995-10-18
CZ289099B6 true CZ289099B6 (cs) 2001-11-14

Family

ID=8213530

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19943306A CZ289099B6 (cs) 1993-12-24 1994-12-27 Imunokonjugát, způsob jeho výroby a pouľití a farmaceutický přípravek na jeho bázi

Country Status (19)

Country Link
US (1) US6979726B1 (cs)
EP (1) EP0659439B1 (cs)
JP (2) JPH07223968A (cs)
KR (1) KR950016781A (cs)
AT (1) ATE207366T1 (cs)
AU (1) AU688817B2 (cs)
CA (1) CA2138928C (cs)
CZ (1) CZ289099B6 (cs)
DE (1) DE69428764T2 (cs)
DK (1) DK0659439T3 (cs)
ES (1) ES2166368T3 (cs)
HU (1) HU219680B (cs)
NO (1) NO315903B1 (cs)
PL (1) PL178793B1 (cs)
PT (1) PT659439E (cs)
RU (1) RU2129018C1 (cs)
SK (1) SK283494B6 (cs)
UA (1) UA41888C2 (cs)
ZA (1) ZA9410282B (cs)

Families Citing this family (189)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CU22545A1 (es) * 1994-11-18 1999-03-31 Centro Inmunologia Molecular Obtención de un anticuerpo quimérico y humanizado contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico para uso diagnóstico y terapéutico
RU2219942C2 (ru) * 1996-02-24 2003-12-27 Берингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх Лекарственный состав с иммуномодуляторным действием, содержащий пептиды и вспомогательные средства
AU4208897A (en) * 1996-09-16 1998-04-02 Merck Patent Gmbh Oligocistronic expression system for the production of heteromeric proteins
AR024464A1 (es) 1999-06-25 2002-10-02 Genentech Inc Anticuerpos anti-erbb2 humanizados.
RU2279441C2 (ru) * 1999-12-23 2006-07-10 Займодженетикс, Инк. Выделенный растворимый il-20 рецептор (варианты)
YU63302A (sh) * 2000-02-25 2005-09-19 The Government Of The Un.Stat. Anti-egfrv iii scfvs sa pojačanom citotoksičnošću i povećanim prinosom, imunotoksini na bazi istog i metodi za upotrebu na bazi istog
RU2196604C1 (ru) * 2001-12-21 2003-01-20 Северин Евгений Сергеевич Полипептид, являющийся аналогом рецепторсвязывающего фрагмента эпидермального фактора роста с 21-й по 31-ю аминокислоту, его конъюгат с доксорубицином и фармацевтическая композиция на его основе
HUP0600340A3 (en) 2002-07-15 2011-06-28 Genentech Inc Methods for identifying tumors that are responsive to treatment with anti-erbb2 antibodies
ES2605443T3 (es) 2003-11-06 2017-03-14 Seattle Genetics, Inc. Conjugados de auristatina con anticuerpos anti-HER2 o anti-CD22 y su uso en terapia
RU2265027C2 (ru) * 2003-11-14 2005-11-27 Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ГНЦ ВБ "Вектор") Опухоль-адресованный пептид
KR101163424B1 (ko) 2003-12-30 2012-07-13 메르크 파텐트 게엠베하 Ｉｌ－７ 융합 단백질
US8017321B2 (en) 2004-01-23 2011-09-13 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Gefitinib sensitivity-related gene expression and products and methods related thereto
AU2005232657B2 (en) 2004-04-08 2010-12-16 David B. Agus ErbB antagonists for pain therapy
JP5422120B2 (ja) 2004-05-27 2014-02-19 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ コロラド，ア ボディー コーポレイト 癌患者による上皮成長因子受容体阻害薬に対する臨床転帰の予測方法
NZ551180A (en) 2004-06-01 2009-10-30 Genentech Inc Antibody drug conjugates and methods
TR201808537T4 (tr) 2004-09-23 2018-07-23 Genentech Inc Sistein değiştirilmiş antikorlar ve konjugatlar.
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
EP3698807A1 (en) 2005-01-21 2020-08-26 Genentech, Inc. Fixed dosing of her antibodies
RS53128B (sr) 2005-02-23 2014-06-30 Genentech Inc. Produžavanje vremena progresije bolesti ili preživljavanja kod pacijenata obolelih od kancera jajnika korišćenjem pertuzumaba
AR053272A1 (es) 2005-05-11 2007-04-25 Hoffmann La Roche Determinacion de responsivos a la quimioterapia
SI1966238T1 (sl) 2005-12-30 2012-08-31 Merck Patent Gmbh Variante interlevkina-12P40 z izboljšano stabilnostjo
AU2006332155B2 (en) 2005-12-30 2013-01-10 Cancer Research Technology Limited Anti-CD19 antibodies with reduced immunogenicity
RU2451521C2 (ru) * 2006-06-16 2012-05-27 Онкотерапи Сайенс, Инк. Sparc-производные антигенные пептиды отторжения опухоли и лекарственные средства, содержащие их
EP2061906B1 (en) 2006-09-12 2011-08-31 Genentech, Inc. Methods and compositions for the diagnosis and treatment of lung cancer using pdgfra, kit or kdr gene as genetic marker
MX2009008981A (es) 2007-03-02 2009-09-02 Genentech Inc Prediccion de respuesta a un inhibidor her.
WO2008154249A2 (en) 2007-06-08 2008-12-18 Genentech, Inc. Gene expression markers of tumor resistance to her2 inhibitor treatment
TWI472339B (zh) 2008-01-30 2015-02-11 Genentech Inc 包含結合至ｈｅｒ２結構域ii之抗體及其酸性變異體的組合物
KR20150036824A (ko) 2009-03-20 2015-04-07 제넨테크, 인크. 이중특이적 항-ｈｅｒ 항체
US9345661B2 (en) 2009-07-31 2016-05-24 Genentech, Inc. Subcutaneous anti-HER2 antibody formulations and uses thereof
CA2781682A1 (en) 2009-12-04 2011-06-09 Genentech, Inc. Multispecific antibodies, antibody analogs, compositions, and methods
CN102712640A (zh) 2010-01-12 2012-10-03 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 三环杂环化合物、其组合物和应用方法
ES2519348T3 (es) 2010-02-18 2014-11-06 Genentech, Inc. Antagonistas de neurregulina y uso de los mismos en el tratamiento del cáncer
WO2011112935A2 (en) * 2010-03-12 2011-09-15 The Regents Of The University Of California Antibody fusion proteins with disrupted heparin-binding activity
US20130096104A1 (en) 2010-03-17 2013-04-18 Genentech, Inc. Imidazopyridine compounds, compositions and methods of use
KR20130058672A (ko) 2010-04-16 2013-06-04 제넨테크, 인크. ＰＩ3Ｋ/ＡＫＴ 키나제 경로 억제제 효능에 대한 예측 바이오마커로서의 ＦＯＸＯ３ａ
WO2011146568A1 (en) 2010-05-19 2011-11-24 Genentech, Inc. Predicting response to a her inhibitor
SG10201408229WA (en) 2010-08-31 2015-02-27 Genentech Inc Biomarkers and methods of treatment
RU2013114352A (ru) 2010-09-15 2014-10-20 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Азабензотиазолы, композиции и способы применения
UY33679A (es) 2010-10-22 2012-03-30 Esbatech Anticuerpos estables y solubles
JP5828902B2 (ja) 2010-10-29 2015-12-09 イミュノジェン， インコーポレイテッド 非拮抗性ｅｇｆｒ結合分子およびその免疫複合体
CA2815277A1 (en) 2010-10-29 2012-05-03 Immunogen, Inc. Novel egfr-binding molecules and immunoconjugates thereof
WO2012065161A2 (en) 2010-11-12 2012-05-18 Scott & White Healthcare Antibodies to tumor endothelial marker 8
KR20140009259A (ko) 2010-11-19 2014-01-22 에프. 호프만-라 로슈 아게 피라졸로피리딘 및 tyk2 억제제로서 이의 용도
WO2012085176A1 (en) 2010-12-23 2012-06-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Tricyclic pyrazinone compounds, compositions and methods of use thereof as janus kinase inhibitors
WO2013007768A1 (en) 2011-07-13 2013-01-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Tricyclic heterocyclic compounds, compositions and methods of use thereof as jak inhibitors
WO2013007765A1 (en) 2011-07-13 2013-01-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Fused tricyclic compounds for use as inhibitors of janus kinases
RU2014105624A (ru) 2011-08-12 2015-09-20 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Соединения индазола, способ их применения и фармацевтическая композиция
BR112014003431A2 (pt) 2011-08-17 2017-06-13 Genentech Inc anticorpo, ácido nucleico, célula hospedeira, método de produção de um anticorpo, imunoconjugado, formulação farmacêutica, agente farmacêutico, uso do anticorpo, método de tratamento de um indivíduo que tem câncer e método de aumento de tempo para recorrência de tumor
BR112014006643A2 (pt) 2011-09-20 2017-04-04 Hoffmann La Roche compostos de imidazopiridina, composições e métodos de uso dos mesmos
JP2014533954A (ja) 2011-11-21 2014-12-18 イミュノジェン， インコーポレイテッド Ｅｇｆｒ抗体細胞傷害性薬物複合体による、ｅｇｆｒ療法に耐性である腫瘍の治療方法
AU2012346540C1 (en) 2011-11-30 2019-07-04 Genentech, Inc. ErbB3 mutations in cancer
WO2013148315A1 (en) 2012-03-27 2013-10-03 Genentech, Inc. Diagnosis and treatments relating to her3 inhibitors
WO2014128235A1 (en) 2013-02-22 2014-08-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods of treating cancer and preventing drug resistance
JP2016510751A (ja) 2013-03-06 2016-04-11 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗がん剤耐性を治療及び予防する方法
RU2015143517A (ru) 2013-03-13 2017-04-19 Дженентек, Инк. Пиразолсодержащие соединения и их применения
WO2014152358A2 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Genentech, Inc. Combinations of a mek inhibitor compound with an her3/egfr inhibitor compound and methods of use
EP2968565A2 (en) 2013-03-14 2016-01-20 Genentech, Inc. Methods of treating cancer and preventing cancer drug resistance
HK1214533A1 (zh) 2013-03-15 2016-07-29 基因泰克公司 治疗癌症和预防癌症耐药性的方法
HK1219044A1 (zh) * 2013-03-15 2017-03-24 艾伯维德国有限责任两合公司 抗egfr抗体药物偶联物制剂
CN104250302B (zh) * 2013-06-26 2017-11-14 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗pd‑1抗体及其应用
KR20160049003A (ko) 2013-09-05 2016-05-04 제넨테크, 인크. 항증식성 화합물
TW201605857A (zh) 2013-10-03 2016-02-16 赫孚孟拉羅股份公司 Ｃｄｋ８之醫療性抑制劑及其用途
US20150147333A1 (en) 2013-10-18 2015-05-28 Genentech, Inc. Anti-rspo antibodies and methods of use
MX2016007965A (es) 2013-12-17 2016-10-28 Genentech Inc Terapia de combinacion que comprende agonistas de union a ox40 y antagonistas de union al eje pd-1.
ES2763429T5 (es) 2013-12-17 2023-06-21 Hoffmann La Roche Procedimientos de tratamiento de cánceres usando antagonistas de la unión al eje de PD-1 y taxanos
EP3122900A1 (en) 2014-03-24 2017-02-01 F. Hoffmann-La Roche AG Cancer treatment with c-met antagonists and correlation of the latter with hgf expression
SG11201607969XA (en) 2014-03-31 2016-10-28 Genentech Inc Anti-ox40 antibodies and methods of use
KR20160146747A (ko) 2014-03-31 2016-12-21 제넨테크, 인크. 항혈관신생제 및 ox40 결합 효능제를 포함하는 조합 요법
ES2765710T3 (es) * 2014-04-03 2020-06-10 Cellectis Receptores de antígeno quimérico específicos de CD33 para la inmunoterapia del cáncer
CN107074823B (zh) 2014-09-05 2021-05-04 基因泰克公司 治疗性化合物及其用途
CN107073125A (zh) 2014-09-19 2017-08-18 基因泰克公司 Cbp/ep300和bet抑制剂用于治疗癌症的用途
EP3204379B1 (en) 2014-10-10 2019-03-06 Genentech, Inc. Pyrrolidine amide compounds as histone demethylase inhibitors
CA2966507A1 (en) 2014-11-03 2016-05-12 Genentech, Inc. Methods and biomarkers for predicting efficacy and evaluation of an ox40 agonist treatment
KR20170086540A (ko) 2014-11-03 2017-07-26 제넨테크, 인크. T 세포 면역 하위세트를 검출하기 위한 검정 및 그의 사용 방법
CA2963974A1 (en) 2014-11-06 2016-05-12 Genentech, Inc. Combination therapy comprising ox40 binding agonists and tigit inhibitors
JP6639497B2 (ja) 2014-11-10 2020-02-05 ジェネンテック， インコーポレイテッド ブロモドメインインヒビターおよびその使用
MA40943A (fr) 2014-11-10 2017-09-19 Constellation Pharmaceuticals Inc Pyrrolopyridines substituées utilisées en tant qu'inhibiteurs de bromodomaines
MA40940A (fr) 2014-11-10 2017-09-19 Constellation Pharmaceuticals Inc Pyrrolopyridines substituées utilisées en tant qu'inhibiteurs de bromodomaines
CN106999583A (zh) 2014-11-17 2017-08-01 豪夫迈·罗氏有限公司 包含ox40结合激动剂和pd‑1轴结合拮抗剂的组合疗法
EP3632915A1 (en) 2014-11-27 2020-04-08 Genentech, Inc. 4,5,6,7-tetrahydro-1 h-pyrazolo[4,3-c]pyridin-3-amine compounds as cbp and/or ep300 inhibitors
EP3229836B1 (en) 2014-12-09 2019-11-13 Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale (INSERM) Human monoclonal antibodies against axl
EP3237639A2 (en) 2014-12-23 2017-11-01 Genentech, Inc. Compositions and methods for treating and diagnosing chemotherapy-resistant cancers
EP3240908A2 (en) 2014-12-30 2017-11-08 F. Hoffmann-La Roche AG Methods and compositions for prognosis and treatment of cancers
WO2016112284A1 (en) 2015-01-09 2016-07-14 Genentech, Inc. (piperidin-3-yl)(naphthalen-2-yl)methanone derivatives and related compounds as inhibitors of the histone demethylase kdm2b for the treatment of cancer
CN107406429B (zh) 2015-01-09 2021-07-06 基因泰克公司 哒嗪酮衍生物及其在治疗癌症中的用途
EP3242875B1 (en) 2015-01-09 2022-02-23 Genentech, Inc. 4,5-dihydroimidazole derivatives and their use as histone demethylase (kdm2b) inhibitors
CA2973585A1 (en) 2015-01-12 2016-07-21 Children's Medical Center Corporation Pro-inflammatory and adjuvant functions of toll-like receptor 4 antagonists
WO2016123391A1 (en) 2015-01-29 2016-08-04 Genentech, Inc. Therapeutic compounds and uses thereof
EP3250552B1 (en) 2015-01-30 2019-03-27 Genentech, Inc. Therapeutic compounds and uses thereof
KR20170116039A (ko) * 2015-02-18 2017-10-18 에프. 호프만-라 로슈 아게 표적 세포에 대항하여 t 세포 세포독성을 특이적으로 유도하기 위한 면역컨주게이트
MA41598A (fr) 2015-02-25 2018-01-02 Constellation Pharmaceuticals Inc Composés thérapeutiques de pyridazine et leurs utilisations
WO2016135041A1 (en) 2015-02-26 2016-09-01 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Fusion proteins and antibodies comprising thereof for promoting apoptosis
MX2017012805A (es) 2015-04-07 2018-04-11 Genentech Inc Complejo de unión a antígenos con actividad agonista y métodos de uso.
DK3294770T4 (da) 2015-05-12 2024-05-21 Hoffmann La Roche Terapeutiske og diagnostiske fremgangsmåder til cancer
EP3303632B2 (en) 2015-05-29 2023-05-10 F. Hoffmann-La Roche AG Therapeutic and diagnostic methods for cancer
EP3303397A1 (en) 2015-06-08 2018-04-11 H. Hoffnabb-La Roche Ag Methods of treating cancer using anti-ox40 antibodies and pd-1 axis binding antagonists
AU2016274585A1 (en) 2015-06-08 2017-12-14 Genentech, Inc. Methods of treating cancer using anti-OX40 antibodies
HRP20260689T1 (hr) 2015-06-17 2026-07-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Postupci za liječenje lokalno uznapredovalog ili metastatskog raka dojke primjenom antagonista vezivanja osi pd-1 i taksana
AU2016313263B2 (en) 2015-08-26 2021-02-04 Fundación Del Sector Público Estatal Centro Nacional De Investigaciones Oncológicas Carlos III (F.S.P. CNIO) Condensed tricyclic compounds as protein kinase inhibitors
SG10202007764TA (en) 2015-09-25 2020-09-29 Genentech Inc Anti-tigit antibodies and methods of use
HRP20220227T1 (hr) 2015-12-16 2022-04-29 Genentech, Inc. Postupak priprave tricikličnih spojeva inhibitora p13k i postupci upotrebe navedenih spojeva u liječenju raka
BR112018011029A2 (pt) 2016-01-08 2018-11-21 Hoffmann La Roche métodos para tratar ou atrasar a progressão do câncer e para melhorar a função imune em um indivíduo com câncer, usos de um antagonista de ligação e de um anticorpo biespecífico, composições e kits
WO2017151502A1 (en) 2016-02-29 2017-09-08 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for cancer
EP3443004A1 (en) 2016-04-14 2019-02-20 H. Hoffnabb-La Roche Ag Anti-rspo3 antibodies and methods of use
WO2017181079A2 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Genentech, Inc. Methods for monitoring and treating cancer
PL3443350T3 (pl) 2016-04-15 2021-05-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Sposoby monitorowania i leczenia nowotworu
AU2017249229A1 (en) 2016-04-15 2018-10-04 Genentech, Inc. Diagnostic and therapeutic methods for cancer
US20190151346A1 (en) 2016-05-10 2019-05-23 INSERM (Institute National de la Santé et de la Recherche Médicale) Combinations therapies for the treatment of cancer
WO2017205536A2 (en) 2016-05-24 2017-11-30 Genentech, Inc. Therapeutic compounds and uses thereof
MA45146A (fr) 2016-05-24 2021-03-24 Constellation Pharmaceuticals Inc Dérivés de pyrazolopyridine pour le traitement du cancer
CN109312407A (zh) 2016-06-08 2019-02-05 豪夫迈·罗氏有限公司 用于癌症的诊断和治疗方法
EP3494139B1 (en) 2016-08-05 2022-01-12 F. Hoffmann-La Roche AG Multivalent and multiepitopic anitibodies having agonistic activity and methods of use
WO2018029124A1 (en) 2016-08-08 2018-02-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Therapeutic and diagnostic methods for cancer
KR102804118B1 (ko) 2016-10-06 2025-05-09 제넨테크, 인크. 암에 대한 치료 및 진단 방법
EP3532091A2 (en) 2016-10-29 2019-09-04 H. Hoffnabb-La Roche Ag Anti-mic antibidies and methods of use
MX2019010295A (es) 2017-03-01 2019-11-21 Genentech Inc Métodos de diagnóstico y terapéuticos para el cáncer.
SG11201908929VA (en) * 2017-03-31 2019-10-30 Univ Leland Stanford Junior Synthekine compositions and methods of use
KR20190136076A (ko) 2017-04-13 2019-12-09 에프. 호프만-라 로슈 아게 암 치료 방법에 사용하기 위한 인터루킨-2 면역접합체, cd40 작용제 및 임의적인 pd-1 축 결합 길항제
AU2018304458B2 (en) 2017-07-21 2021-12-09 Foundation Medicine, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for cancer
WO2019033043A2 (en) 2017-08-11 2019-02-14 Genentech, Inc. ANTI-CD8 ANTIBODIES AND USES THEREOF
KR102811888B1 (ko) 2017-09-08 2025-05-27 에프. 호프만-라 로슈 아게 암의 진단 및 치료 방법
WO2019084395A1 (en) 2017-10-27 2019-05-02 University Of Virginia Patent Foundation COMPOUNDS AND METHODS FOR REGULATING, LIMITING OR INHIBITING AVIL EXPRESSION
WO2019090263A1 (en) 2017-11-06 2019-05-09 Genentech, Inc. Diagnostic and therapeutic methods for cancer
US12174193B2 (en) 2018-01-15 2024-12-24 Epiaxis Therapeutics Pty Ltd Agents and methods for predicting response to therapy
US20200399376A1 (en) 2018-02-26 2020-12-24 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-tigit and anti-pd-l1 antagonist antibodies
US20210363590A1 (en) 2018-05-21 2021-11-25 Nanostring Technologies, Inc. Molecular gene signatures and methods of using same
TWI890148B (zh) 2018-06-23 2025-07-11 美商建南德克公司 以pd-1軸結合拮抗劑、鉑劑及拓撲異構酶ii抑制劑治療肺癌之方法
EP3823611A1 (en) 2018-07-18 2021-05-26 Genentech, Inc. Methods of treating lung cancer with a pd-1 axis binding antagonist, an antimetabolite, and a platinum agent
TW202024023A (zh) 2018-09-03 2020-07-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 治療性化合物及其使用方法
CA3111401A1 (en) 2018-09-19 2020-03-26 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for bladder cancer
AU2019342133B8 (en) 2018-09-21 2025-08-07 Genentech, Inc. Diagnostic methods for triple-negative breast cancer
EP3867405A4 (en) 2018-10-17 2022-07-20 The University of Queensland EPIGENETIC BIOMARKER AND USES THEREOF
EP3867646A1 (en) 2018-10-18 2021-08-25 F. Hoffmann-La Roche AG Diagnostic and therapeutic methods for sarcomatoid kidney cancer
US12344646B2 (en) 2018-12-13 2025-07-01 Bang DING Antibody-TNF α fusion protein and its preparation and applications
CN113396230A (zh) 2019-02-08 2021-09-14 豪夫迈·罗氏有限公司 癌症的诊断和治疗方法
SG11202108707WA (en) 2019-02-27 2021-09-29 Epiaxis Therapeutics Pty Ltd Methods and agents for assessing t-cell function and predicting response to therapy
CN113710706A (zh) 2019-02-27 2021-11-26 豪夫迈·罗氏有限公司 用于抗tigit抗体和抗cd20抗体或抗cd38抗体治疗的给药
WO2020223233A1 (en) 2019-04-30 2020-11-05 Genentech, Inc. Prognostic and therapeutic methods for colorectal cancer
MX2021013222A (es) 2019-05-03 2022-01-06 Genentech Inc Metodos para tratar el cancer con un anticuerpo anti-pd-l1.
CN112300279A (zh) 2019-07-26 2021-02-02 上海复宏汉霖生物技术股份有限公司 针对抗cd73抗体和变体的方法和组合物
TW202519557A (zh) 2019-09-04 2025-05-16 美商建南德克公司 Cd8 結合劑及其用途
AU2020351734A1 (en) 2019-09-27 2022-04-14 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-TIGIT and anti-PD-L1 antagonist antibodies
CN114728936A (zh) 2019-10-29 2022-07-08 豪夫迈·罗氏有限公司 用于治疗癌症的双功能化合物
IL292458A (en) 2019-11-06 2022-06-01 Genentech Inc Diagnostic and treatment methods for the treatment of hematological cancer
EP4058435A1 (en) 2019-11-13 2022-09-21 Genentech, Inc. Therapeutic compounds and methods of use
CR20220330A (es) 2019-12-13 2022-08-04 Genentech Inc Anticuerpos anti-ly6g6d y métodos de uso.
CA3164995A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Erasca, Inc. Tricyclic pyridones and pyrimidones
WO2021194481A1 (en) 2020-03-24 2021-09-30 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-tigit and anti-pd-l1 antagonist antibodies
WO2021177980A1 (en) 2020-03-06 2021-09-10 Genentech, Inc. Combination therapy for cancer comprising pd-1 axis binding antagonist and il6 antagonist
CN115698717A (zh) 2020-04-03 2023-02-03 基因泰克公司 癌症的治疗和诊断方法
EP4143345A1 (en) 2020-04-28 2023-03-08 Genentech, Inc. Methods and compositions for non-small cell lung cancer immunotherapy
EP3915576A1 (en) 2020-05-28 2021-12-01 Fundació Privada Institut d'Investigació Oncològica de Vall-Hebron Chimeric antigen receptors specific for p95her2 and uses thereof
WO2021257503A1 (en) 2020-06-16 2021-12-23 Genentech, Inc. Methods and compositions for treating triple-negative breast cancer
WO2021257124A1 (en) 2020-06-18 2021-12-23 Genentech, Inc. Treatment with anti-tigit antibodies and pd-1 axis binding antagonists
EP4172621A1 (en) 2020-06-30 2023-05-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for predicting the risk of recurrence and/or death of patients suffering from a solid cancer after preoperative adjuvant therapies
JP7741831B2 (ja) 2020-06-30 2025-09-18 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 術前補助療法及び根治手術後の固形がんを患っている患者の再発及び／又は死亡のリスクを予測するための方法
EP3939999A1 (en) 2020-07-14 2022-01-19 Fundación del Sector Público Estatal Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas Carlos III (F.S.P. CNIO) Interleukin 11 receptor alpha subunit (il11ra) neutralizing antibodies and uses thereof
US11787775B2 (en) 2020-07-24 2023-10-17 Genentech, Inc. Therapeutic compounds and methods of use
JP7904195B2 (ja) 2020-08-03 2026-08-12 ジェネンテック， インコーポレイテッド リンパ腫のための診断及び治療方法
US12540188B2 (en) 2020-08-05 2026-02-03 Synthekine, Inc. IL10Rα/IL2Rγ synthetic cytokines
EP4196612A1 (en) 2020-08-12 2023-06-21 Genentech, Inc. Diagnostic and therapeutic methods for cancer
TW202446417A (zh) 2020-10-05 2024-12-01 美商建南德克公司 用抗 fcrh5/抗 cd3 雙特異性抗體進行治療之給藥
US20230107642A1 (en) 2020-12-18 2023-04-06 Erasca, Inc. Tricyclic pyridones and pyrimidones
MX2023009379A (es) 2021-02-12 2023-10-10 Hoffmann La Roche Derivados de tetrahidroazepina biciclicos para el tratamiento del cancer.
CA3221390A1 (en) 2021-05-25 2022-12-01 Erasca, Inc. Sulfur-containing heteroaromatic tricyclic kras inhibitors
WO2022266206A1 (en) 2021-06-16 2022-12-22 Erasca, Inc. Kras inhibitor conjugates
EP4384522A1 (en) 2021-08-10 2024-06-19 Erasca, Inc. Selective kras inhibitors
US12275745B2 (en) 2021-11-24 2025-04-15 Genentech, Inc. Therapeutic compounds and methods of use
US12110276B2 (en) 2021-11-24 2024-10-08 Genentech, Inc. Pyrazolo compounds and methods of use thereof
EP4253418A1 (en) 2022-03-29 2023-10-04 Fundació Privada Institut d'Investigació Oncològica de Vall-Hebron Immune cells expressing chimeric antigen receptors and bispecific antibodies and uses thereof
WO2023191816A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
JP2025517650A (ja) 2022-05-11 2025-06-10 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ＦｃＲＨ５／抗ＣＤ３二重特異性抗体による処置のための投与
JP2025523387A (ja) 2022-06-07 2025-07-23 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｐｄ－ｌ１アンタゴニストおよび抗ｔｉｇｉｔアンタゴニスト抗体を含む、肺がん治療の有効性を判定するための方法
CN119585308A (zh) 2022-07-13 2025-03-07 基因泰克公司 针对用抗fcrh5/抗cd3双特异性抗体进行的治疗的给药
KR20250040020A (ko) 2022-07-19 2025-03-21 제넨테크, 인크. 항-fcrh5/항-cd3 이중특이성 항체로 치료하기 위한 투약법
CN119677733A (zh) 2022-08-11 2025-03-21 豪夫迈·罗氏有限公司 双环四氢硫氮杂䓬衍生物
WO2024033457A1 (en) 2022-08-11 2024-02-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Bicyclic tetrahydrothiazepine derivatives
WO2024033458A1 (en) 2022-08-11 2024-02-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Bicyclic tetrahydroazepine derivatives
US20260035364A1 (en) 2022-08-11 2026-02-05 Hoffmann-La Roche Inc. Bicyclic tetrahydrothiazepine derivatives
WO2024085242A2 (en) 2022-10-21 2024-04-25 Kawasaki Institute Of Industrial Promotion Non-fouling or super stealth vesicle
JP2026500084A (ja) 2022-10-25 2026-01-06 ジェネンテック， インコーポレイテッド 多発性骨髄腫の治療方法および診断方法
EP4406973A1 (en) 2023-01-27 2024-07-31 Fundació Privada Institut de Recerca de la SIDA-Caixa Antibodies and uses thereof for the treatment of infections caused by enveloped viruses
WO2024173842A1 (en) 2023-02-17 2024-08-22 Erasca, Inc. Kras inhibitors
WO2024233341A1 (en) 2023-05-05 2024-11-14 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
WO2024254455A1 (en) 2023-06-08 2024-12-12 Genentech, Inc. Macrophage signatures for diagnostic and therapeutic methods for lymphoma
WO2025024257A1 (en) 2023-07-21 2025-01-30 Genentech, Inc. Diagnostic and therapeutic methods for cancer
WO2026030464A1 (en) 2024-07-30 2026-02-05 Genentech, Inc. Dosage regimen for reducing cytokine release syndrome (crs) with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies in multiple myeloma therapy
WO2026030476A1 (en) 2024-07-30 2026-02-05 Genentech, Inc. Precision medicine for optimal dosage of combined therapies systems and methods of use thereof
WO2026102349A1 (en) 2024-11-08 2026-05-15 Genentech, Inc. Anti-interleukin-23 receptor vhh antibodies and uses thereof

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4997913A (en) * 1986-06-30 1991-03-05 Oncogen pH-sensitive immunoconjugates and methods for their use in tumor therapy
US5470571A (en) * 1988-01-27 1995-11-28 The Wistar Institute Method of treating human EGF receptor-expressing gliomas using radiolabeled EGF receptor-specific MAB 425
IE63847B1 (en) * 1989-05-05 1995-06-14 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
DE69025946T2 (de) * 1989-09-08 1996-10-17 Univ Duke Modifikationen der struktur des egf-rezeptor-gens in menschlichen glioma
US5314995A (en) * 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
ATE218889T1 (de) * 1990-11-09 2002-06-15 Stephen D Gillies Cytokine immunokonjugate
AU658396B2 (en) * 1991-03-06 1995-04-13 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschrankter Haftung Humanized and chimeric monoclonal antibodies
CA2112473A1 (en) * 1991-07-05 1993-01-21 Patricia A. Bacha Epidermal growth factor receptor targeted molecules for treatment of inflammatory arthritis
EP0586002B1 (en) * 1992-08-18 2000-01-19 CENTRO de IMMUNOLOGIA MOLECULAR Monoclonal antibodies recognizing the epidermal growth factor receptor, cells and methods for their production and compositions containing them
DK139193D0 (da) 1993-09-24 1993-12-13 Hartmann As Brdr Rektangulaer aegbakke
HU221001B1 (hu) * 1994-03-17 2002-07-29 Merck Patent Gmbh. Egyláncú anti-EGFR Fv-k és anti-EGFR ellenanyagok

Also Published As

Publication number Publication date
DK0659439T3 (da) 2002-01-14
PL178793B1 (pl) 2000-06-30
HU9403784D0 (en) 1995-02-28
US6979726B1 (en) 2005-12-27
RU2129018C1 (ru) 1999-04-20
DE69428764T2 (de) 2002-06-20
DE69428764D1 (de) 2001-11-29
AU8159394A (en) 1995-06-29
NO944980D0 (no) 1994-12-22
JPH07223968A (ja) 1995-08-22
SK283494B6 (sk) 2003-08-05
UA41888C2 (uk) 2001-10-15
KR950016781A (ko) 1995-07-20
CA2138928A1 (en) 1995-06-25
ZA9410282B (en) 1995-08-29
HU219680B (hu) 2001-06-28
SK156294A3 (en) 1995-07-11
NO944980L (no) 1995-06-26
NO315903B1 (no) 2003-11-10
CZ330694A3 (en) 1995-10-18
CA2138928C (en) 2009-02-17
EP0659439A2 (en) 1995-06-28
PL306474A1 (en) 1995-06-26
JP2006298936A (ja) 2006-11-02
PT659439E (pt) 2002-04-29
ATE207366T1 (de) 2001-11-15
AU688817B2 (en) 1998-03-19
EP0659439B1 (en) 2001-10-24
RU94045281A (ru) 1996-11-10
ES2166368T3 (es) 2002-04-16
EP0659439A3 (en) 1996-12-04
HUT70471A (en) 1995-10-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2138928C (en) Immunoconjugates
AU702184B2 (en) Immunoconjugates II
JP4793971B2 (ja) 複合サイトカイン−抗体複合体
AU763719B2 (en) Heterodimeric fusion proteins useful for targeted immune therapy and general immune stimulation
ES2284209T3 (es) Citolisis de celulas diana por conjugados de superantigenos que inducen la activacion de celulas t.
AU2017358578B2 (en) IL2 and TNF mutant immunoconjugates
US20160200789A1 (en) Il4 conjugated to antibodies against extracellular matrix components
AU9059691A (en) Cytokine immunoconjugates
WO1997030089A1 (en) Novel antibody-cytokine fusion protein, and methods of making and using the same
US20070003514A1 (en) Mono-and bi-functional antibody conjugates as effective adjuvants of protein vaccination
EP3660039A1 (en) Il2 immunoconjugates
EP1731531B1 (en) Multiple cytokine-antibody complexes
CA3194929A1 (en) Modified cxcl10 for immunotherapy of cancer diseases
CN115703840A (zh) 抗Her-2抗体-粒细胞调节因子融合蛋白及其制法和应用
Harvill Properties of an IgG3-IL-2 fusion protein: Enhanced binding to the IL-2R alpha subunit and stimulation of LAK activity in vitro; improved half-life; adjuvant properties and anti-tumor activity in vivo

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20101227