PL179525B1

PL179525B1 - Sposób wydzielania hemoglobiny z surowego roztworu metoda chromatografii PL

Info

Publication number: PL179525B1
Application number: PL94309034A
Authority: PL
Inventors: Diana Pliura; Diane Wiffen; Salman Ashraf; Anthony A Magnin
Original assignee: Hemosol
Priority date: 1993-09-21
Filing date: 1994-09-20
Publication date: 2000-09-29
Also published as: EP0668877A1; CZ128795A3; SK67895A3; AU7650394A; CZ287589B6; US5439591A; CA2106612A1; CA2106612C; PL309034A1; CN1051317C; AU681438B2; SK281839B6; WO1995008574A1; EP0668877B1; CN1114836A

Abstract

1. Sposób wydzielania hemoglobiny z surowego roztworu, zawierajacego co najmniej 60% hemoglobiny i zanieczyszczenia w postaci substancji bialkowych, metoda chromatografii, który obejmuje: - pierwszy etap chromatograficzny, w którym wprowadza sie surowy roztwór do kolumny chromatograficznej z liniowa predkoscia przyplywu wieksza niz 10 cm na minute i poddaje sie go chromatografii (a) anionowymiennej przy pH 7-10 i przewodnosci ponizej 3 mS, w których to wa- runkach skladniki surowego roztworu bardziej kwasowe niz hemoglobina wykazuja wybiórcze powinowactwo wiazania lub (b) kationowymiennej przy pH 5-9 i przewodnictwie ponizej 3 mS, w których to warunkach z kolei skladniki surowego roztworu bardziej zasadowe niz hemoglobina wykazuja wybiórcze powinowactwo wiazania; oraz drugi etap chromatograficzny, w którym eluat z pierwszego etapu zawierajacy hemo- globine wprowadza sie do kolumny chromatograficznej z liniowa predkoscia przeplywu nie wieksza niz 10 cm na minute i poddaje sie chromatografii w warunkach wymiany anionowej lub kationowej, tej, która nie zostala wybrana w pierwszym etapie, znamienny tym, ze w pierwszym etapie surowy roztwór podaje sie w sposób ciagly do kolumny chromatograficznej az do calkowitego obciazenia kolumny hemoglobina i skladnikami o wyzszym powinowactwie, po czym dalej prowadzi sie zasilanie kolumny az do jej przeciazenia i w konsekwencji wyrugowania z niej hemoglobiny, po czym podobnie w drugim etapie eluat z pierwszego etapu wprowadza sie w spo- sób ciagly do kolumny az do calkowitego jej obciazenia i dalej wprowadza sie eluat az do prze- ciazenia kolumny i wyrugowania z niej hemoglobiny. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wydzielania hemoglobiny z surowego roztworu metodą chromatografii, a w szczególności chromatograficzny sposób oczyszczania hemoglobiny w skali przemysłowej w celu uzyskania roztworu, w którym hemoglobina stanowi co najmniej 99% substancji rozpuszczonej. Wytworzone sposobem według wynalazku produkty hemoglobinowe mają nieoczekiwanie korzystne właściwości i służą do stosowania jako zamienniki krwi.

Rozwój opartych na hemoglobinie zamienników krwi jest w dalszym ciągu przedmiotem zainteresowań techniki, a ostatnie odkrycia wykazały, że hemoglobina z komórek krwi

179 525 ssaków po odpowiedniej modyfikacji takiej jak sieciowanie wewnątrzcząsteczkowe oraz, w pewnych przypadkach, polimeryzacja, jest obiecującym materiałem stanowiącym podstawę zamiennika krwi. Jednakże w miarę postępu stale zwiększają się wymagania odnośnie czystości hemoglobiny. Przez pewien czas uważano, że hemoglobina po prostu powinna być bezzrębowa, co osiąga się w wyniku przemywania i łagodnej lizy krwinek czerwonych, a następnie filtracji lizatu. Następnie stwierdzono, że obecność śladowych resztek zanieczyszczeń takich jak fosfolipidy, prowadzi do bardziej specyficznych reakcji produktu w próbach na zwierzętach, np. do zwężania naczyń. Nawet po przeprowadzeniu kilkuetapowej diafiltracji produktu, w dalszym ciągu zawiera on niedopuszczalnie wysokie śladowe ilości potencjalnie szkodliwych zanieczyszczeń takich jak enzymy erytrocytowe, zmodyfikowane i wariantowe formy hemoglobiny, fosfolipidy i antygeny powierzchniowe.

Jednym z najpilniejszych zadań w dziedzinie zamienników krwi, zwłaszcza w dziedzinie nośników tlenu opartych na hemoglobinie, jest opracowanie tanich sposobów skutecznego i opłacalnego ekonomicznie oczyszczania hemoglobiny w skali przemysłowej. Musi ona skutecznie konkurować z innymi potencjalnymi środkami zwiększającymi objętość krążącej krwi i płynami będącymi nośnikami tlenu, które proponuje się jako zamienniki krwi.

Jakkolwiek rozdzielczość i czas analizy odgrywają istotną rolę w rozdzielaniu analitycznym, do kluczowych parametrów w preparatywnej chromatografii do wykorzystania w skali przemysłowej lub półtechnicznej, należą:

- ilość materiału o określonym poziomie czystości wydzielanego w jednostce czasu (wydajność) oraz

- opłacalność procesu, która uwzględnia takie parametry jak wielkość kolumny, ośrodki, bufory, oprzyrządowanie, zawracanie i ponowne wykorzystanie składników i reagentów itp.

Brak jest sposobów oczyszczania hemoglobiny spełniających kryteria opłacalnego procesu produkcyjnego.

Zamiennik krwi oparty na hemoglobinie powinien zawierać jedną odmianę hemoglobiny lub, jeśli występuje więcej niż jedna odmiana hemoglobiny, znane odmiany hemoglobiny o dokładnie ustalonym składzie. W związku z tym korzystny sposób oczyszczania hemoglobiny powinien umożliwiać oddzielanie jednej hemoglobiny od innej, a także oddzielanie pożądanej odmiany hemoglobiny od składników stanowiących zanieczyszczenia pochodzące z krwinek czerwonych takich jak enzymy erytrocytowe, białka, fosfolipidy i antygeny.

Chromatograficzne metody stosowane są do oczyszczania roztworów hemoglobiny. W opisie patentowym USA nr 4 925 474, Hsia i inni, opisano zastosowanie technik chromatografii powinowactwa do oczyszczania hemoglobiny z wykorzystaniem kolumn, w których ligand wykazujący wybiórcze powinowactwo wiązania chemicznego z miejscem DPG hemoglobiny związano z fazą nieruchomą w kolumnie. Techniki chromatografii jonowymiennej również zastosowano do oczyszczania hemoglobiny. Podstawowe zasady technik chromatografii jonowymiennej są dobrze znane. Mieszaninę różnych składników w roztworze wprowadza się do odpowiednio przygotowanej kolumny jonowymiennej. Każdy ze składników mieszaniny wykazuje inne powinowactwo do grup chemicznych reagenta w kolumnie. Zmieniając warunki w kolumnie, np. pH roztworu, można osiągnąć to, że poszczególne składniki będą wiązały się lub będą eluowane z kolumny oddzielnie, tak aby wydzielić poszczególne składniki z mieszaniny. Zastosowanie tej techniki do oczyszczania białek takich jak hemoglobina jest nieopłacalne ekonomicznie, z wyjątkiem jej zastosowania w pracach w małej skali oraz w pracach analitycznych. Gdy hemoglobina ma być oczyszczana w skali przemysłowej, np. do zastosowania jako płyn reanimacyjny przenoszący tlen (zamiennik krwi), technika taka, zwłaszcza zastosowana w konwencjonalny sposób, jest niepraktyczna.

Ilości hemoglobiny, które mają się adsorbować, a następnie eluować z kolumny chromatograficznej są tak duże, że wymagane wymiary kolumny spowodowałyby, że byłaby ona niepraktycznie wielka i droga.

Christensen i inni, J. Biochem. Phys. 17 (1988), 143-154, opisali chromatograficzne oczyszczanie ludzkiej hemoglobiny. Zastosowana metodę stanowi standardowa chromatografia jonowymienna, tak że nie stanowi ona podstaw do zwiększania skali do skali produkcyjnej.

179 525

Winslow i Chapman, „Pilot-Scale Preparation of Hemoglobin Solutions”, Methods in Enzymology, Vol. 231, str. 3 (1994) opisali wytwarzanie bezzrębowej hemoglobiny (SFH), hemoglobiny A0 o wysokim stopniu czystości oraz hemoglobiny usieciowanej z zastosowanej jako substratu przeterminowanej ludzkiej krwi. SFH wytwarza się na drodze filtracji. Hemoglobinę A0 wytwarza się z SFH metodą chromatografii w skali przemysłowej z wykorzystaniem mocnego anionowymiennego ośrodka i gradientu siły jonowej.

Prace opublikowane przez Christensena i innych oraz Winslowa i innych wykonane zostały w Letterman Army Institute for Research (LAIR), obecnie znanym jako Walter Reed Army Institute of Research.

W opisie patentowym USA nr 5 084 588, Rausch i Feola (Biopure) opisano zastosowanie standardowych metod chromatografii aniono- i kationowymiennej do rozdzielania i oczyszczania hemoglobiny. W przypadku chromatografii anionowymiennej w opisie patentowym podano trzy standardowe rozwiązania:

a) wiązanie Hb przy podwyższonym pH oraz eluowanie z opadającym gradientem pH lub ze stopniowanym gradientem niższego pH;

b) wiązanie Hb przy wysokim pH, przy niskiej sile jonowej oraz eluowanie gradientem soli;

c) obciążanie w takich warunkach pH, że homoglobina nie wiąże się z anionitem, ale przechodzi w sposób niezakłócony przez kolumnę, a zanieczyszczenia (bardziej kwaśne składniki stanowiące zanieczyszczenia) wychwytywane są w kolumnie.

Rozwiązania a) i b) zostały obszernie udokumentowane, z tym że nie sa one atrakcyjne w produkcji w skali przemysłowej z uwagi na ograniczenia związane z niskimi pojemnościami obciążania potrzebnymi do osiągnięcia niezbędnego rozdziału produktów hemoglobinowych. Takie pojemności obciążania wynoszą zazwyczaj zaledwie 20-30 mg/ml, co stawia wysokie wymagania odnośnie wielkości i kosztów kolumny do oczyszczania hemoglobiny w skali przemysłowej. Tak np. uzyskanie ostatecznej pojedynczej dawki 50 g nośnika tlenu opartego na hemoglobinie (HBOC) wymagałoby zastosowania kolumny 1,5-2,5 litrowej.

Jakkolwiek rozwiązanie c) z początku wydaje się najkorzystniejsze w realizacji, to w praktyce okazało się, że właściwości chromatograficzne zwykłej, niemodyfikowanej hemoglobiny Ao dorosłego człowieka oraz pewnych podstawowych zanieczyszczeń takich jak HbAlc nie różnią się na tyle wyraźnie, aby rozwiązanie to można było zastosować.

Standardowe rozwiązania chromatografii kationowymiennej hemoglobiny ssaków wykazują podobne ograniczenia.

W opisie patentowym USA nr 5 084 588 ujawniono również roztwory hemoglobiny bydlęcej, w których ponad 99,9% białka stanowią hemoglobiny bydlęce, z tym że nie przedstawiono danych odnośnie identyfikacji składników białkowych.

Celem wynalazku jest dostarczenie nowego chromatograficznego sposobu oczyszczania hemoglobiny, który umożliwia uzyskiwanie w skali przemysłowej i w ekonomicznie opłacalny sposób hemoglobiny w roztworze wodnym o czystości ponad 99%, z jej zanieczyszczonego roztworu wodnego zawierającego co najmniej 60% hemoglobiny.

Wynalazek dotyczy sposobu, zgodnie z którym wodny roztwór wybranego gatunku hemoglobiny, Hb, w którym Hb stanowi od około 60 do około 99% rozpuszczonego materiału, poddaje się chromatogtrafii jonowymiennej w dwóch stadiach. Jedno ze stadiów stanowi chromatografia anionowymienna, a drugie chromatografia kationowymienna. Dwa rodzaje chromatografii jonowymiennej można przeprowadzić w dowolnej kolejności. Surowy roztwór wybranego gatunku hemoglobiny, np. HbA0, wprowadza się do pierwszego stadium chromatografii, np. do stadium chromatografii anionowymiennej, w warunkach tak dobranych, aby wszystkie składniki rozpuszczonej mieszaniny na wstępie zostały zaadsorbowane na stałej fazie w kolumnie chromatograficznej. W przypadku wymiany anionowej wymaga to stosunkowo wysokiego pH. Warunki są również tak dobrane, że uzyskuje się bardzo wysokie efektywne obciążenie kolumny przy stosowaniu roztworu zasilającego o niskiej sile jonowej, co prowadzi do sytuacji, że zasadniczo wszystkie dostępne centra na stałym ośrodku chromatograficznym są zajęte przez składniki roztworu zasilającego. Eluat zebrany z tego stadium nie zawiera produktu białkowego. Następnie przeprowadza się rugowanie HbA0 i zanieczyszczeń wykazujących mniejsze powinowactwo względem kolumny w wybranych warunkach wpro179 525 wadzając dodatkowe objętości wodnego roztworu zasilającego określonego powyżej. Osiągnięte dzięki temu warunki, określane w opisie jako przeciążanie, powodują, że składniki stanowiące zanieczyszczenia o większym powinowactwie względem kolumny będą rugować wybraną Hb i składniki stanowiące zanieczyszczenia o niższym powinowactwie względem kolumny, które będą eluowane z kolumny. Gdy pierwsze stadium rozdzielania chromatograficznego stanowi chromatografia anionowymienna, zanieczyszczenia bardziej kwaśne niż wybrany składnik Hb adsorbuja się na stałej fazie w kolumnie chromatograficznej i w ten sposób oddzielają się od wybranego składnika Hb, który pojawia się w eluacie wraz z zanieczyszczeniami bardziej zasadowymi. W przypadku, gdy jako pierwsze stadium wybierze się chromatografię kationowymienną, oddzielają się zanieczyszczenia bardziej zasadowe w wyniku większego powinowactwa do kolumny, a bardziej kwaśne zanieczyszczenia i wybrany składnik hemoglobinowy pojawiają się w eluacie.

Następnie w drugim stadium chromatograficznym sposobu według wynalazku przeprowadza się drugi etap chromatografii jonowymiennej w odniesieniu do częściowo oczyszczonego składnika hemoglobinowego zawartego w eluacie z pierwszej kolumny, w odmiennych warunkach pH. Gdy eluat z pierwszej kolumny zawiera składnik hemoglobinowy i zanieczyszczenia bardziej zasadowe, drugie stadium chromatografii stanowi chromatografia kationowymienna i odwrotnie. Zasilanie tym zanieczyszczonym roztworem drugiej kolumny również prowadzi się aż do osiągnięcia obciążenia nasycającego i jego przekroczenia, tak aby wytworzyć w kolumnie stan przeciążenia. W stanie przeciążenia wybrany składnik hemoglobinowy eluowany jest z kolumny w wyniku rugowania przez zanieczyszczenia o większym powinowactwie w wybranych warunkach, dzięki czemu w eluacie z drugiej kolumny uzyskuje się składnik hemoglobinowy o bardzo wysokiej czystości. W związku z tym sposób według wynalazku można ogólnie określić jako ..dwustadiowa chromatografię przez samorugowanie”.

W efekcie składnik Hb eluuje się z kolumny w wyjątkowo czystej postaci, zazwyczaj o czystości ponad 99% oraz w wydajnościach atrakcyjnych z punktu widzenia skali przemysłowej. Zanieczyszczenia bardziej kwaśne niż wybrany składnik Hb pozostają związane z żywicą w jednej kolumnie, a zanieczyszczenia bardziej zasadowe niż wybrany składnik Hb pozostają związane z żywicą w innej kolumnie. Kolumny można łatwo regenerować wykorzystując tradycyjne procedury czyszczenia i regeneracji.

Istotnym czynnikiem zapewniającym przeprowadzenie z powodzeniem procesu, zwłaszcza w dużej skali produkcyjnej, jest selektywne, wysokie obciążenie kolumn zanieczyszczeniami, umożliwiające eluowanie składnika Hb.

Gdy sposób według wynalazku wykorzysta się do oczyszczania ludzkiej hemoglobiny Ao, uzyska się nową ludzką hemoglobinę o składzie i właściwościach dotychczas nie osiąganych. Produkt ten wykazuje wysoce pożądane właściwości i charakterystyki nie spotykane i nie publikowane dotychczas w odniesieniu do jakiegokolwiek produktu ludzkiej hemoglobiny Ao, szczególnie cenne w związku z jego zastosowaniem jako podstawy zamiennika krwi. Do właściwości tych należy zasadniczo całkowity brak cząstek wirusowych, zwłaszcza cząstek z wirusów kapsułkowanych w lipidach; zasadniczy brak właściwości naczyniowoczynnych wykazywanych przez produkty podawane in vivo; oraz brak toksyczności w odniesieniu do komórek śródbłonkowych przy inkubowaniu in vitro, o czym świadczy zmniejszone uwalnianie dehydrogenazy mleczanowej w porównaniu z podobnym zastosowaniem innych preparatów homoglobinowych. Dodatkowo w odniesieniu do zazwyczaj pożądanych właściwości hemoglobiny stosowanej jako zamiennik krwi, takich jak brak endotoksyn i brak innych pirogenów; produkty wytwarzane sposobem według wynalazku również są lepsze w porównaniu z innymi, znanymi preparatami hemoglobinowymi.

Na załączonych rysunkach:

na fig. 1 przedstawiono schematycznie wstępną, anionowymienną część korzystnego procesu według wynalazku;

na fig. 2 przedstawiono drugą, kationową, część korzystnego procesu według wynalazku; na fig. 3 przedstawiono analityczny chromatogram anionowymienny ilustrujący wyniki z przykładów 2 i 3;

179 525 na fig. 4 przedstawiono analityczny chromatogram anionowymienny ilustrujący wyniki z przykładu 4;

na fig. 5 przedstawiono graficznie wyniki uzyskane w przykładzie 8;

na fig. 6 przedstawiono kopię pasków bibułowego ogniskowania izoelektrycznego z analizy produktów z przykładu 13;

na fig. 7 przedstawiono kopię wyników eksperymentów barwienia i blottingu, opisanych w przykładzie 13;

na fig. 8 przedstawiono graficznie wyniki uzyskane w przykładzie 14; na fig. 9 i 9A przedstawiono graficznie wyniki uzyskane w przykładzie 15; a na fig. 10 przedstawiono graficznie wyniki uzyskane w przykładzie 16.

Chromatografia przez rugowanie powszechnie określana również jako chromatografia elucyjna przez rugowanie, jest znaną techniką wykorzystywaną przy rozdzielaniu białek. Wykorzystuje się w niej jeden z trzech sposobów odzyskiwania próbki z kolumny chromatograficznej. Przy zastosowaniu do rozdzielania odpowiednich białek z mieszaniny białek w roztworze, białka o większym powinowactwie będą rugować białka o mniejszym powinowactwie względem matrycy, tak że w kolumnie od wlotu do wylotu ustali się hierarchia białek o zmniejszającym się powinowactwie. Gdy białka rugua ąunne białka, azadko tworzy sir o stia linia rozdzielająca składniki. Stanowi to przeciwwskazanie do zastosowania takiej techniki do wytwarzania bardzo czystych roztworów pojedynczego białka takiego jak hemoglobina. Jeśli dobierze się odmienne, aiąbiełkową składniki rugujące, wynik może być taki, że matryca chromatograficzna zwiąże materiały o bardzo wysokim powinowactwie, tak że bardzo trudno będzie ją zregenerować do ponownego użycia.

Sposób wykazuje przede wszystkim przydatność techniczną przy wytwarzaniu oczyszczonej hemoglobiny A0 dorosłego człowieka (HbA0) i dla wygody zostanie on szczegółowo opisany w odniesieniu do tego rozwiązealα. Jednakże sposób nie ogranicza się do oczyszczania HbA0, ale jest również przydatny do oczyszczania innych wybranych składników hemoglobinowych takich jak wybrane usiecloweae pochodne hemoglobiny, wybrane weriantk hemoglobiny bydlęcej, inne werieaty hemoglobiny takie jak hemoglobina płodowa, hemoglobiny z krwinek czerwonych sierpowatkch itp., hemoglobina zmodyfikowana metodami iażkaieril genetycznej itp.

Sposób według wynalazku jest wyjątkowo atrakcyjny pod względem ekonomicznym przy wykorzystaniu do oczyszczania hemoglobiny HbA0 w skali przemysłowej przy wytwarzaniu zamienników krwi. Zapewnia on bardzo wysokie efektywne pojemności obciążdaia kolumn. W związku z tym można stosować stosunkowo niewielkie kolumny do oczyszczania stosunkowo dużych objętości zanieczktzczoaągo roztworu hemoglobiny. Proces można prowadzić periodycznie, albo też w sposób ciągły można oczyszczać daną pertia roztworu hemoglobiny uzyskanego z krwinek czerwonych zwykłymi sposobami, przy czym roztwory takie zazwyczaj zawierają około 80% hemoglobiny, ale równocześnie zawierają wiele różnych zanieczyszczeń, zarówno białkowych jak i aiąbiałkowych. Ponadto sam zaaieczytzczoak roztwór hemoglobiny stosuje się jako ośrodek ruglujący. Unika się dzięki temu konieczności stosowania odrębnego środka rugującego, co związane było z niedogodnościami, komplikacjami i kosztami.

W typowym ogólnym procesie wytwarzania oczyszczonego roztworu HbA0 prowadzonym sposobem według wynalazku wychodzi się ze zwykłych krwinek czerwonych dorosłego człowieka. Zbiera się je i ewentualnie poddaje filtracji w celu usunięcia leukocytów. Komórki prząmowe się w celu usunięcia białek surowicy i poddaje lizie w celu węodrębaieaia hemoglobiny i innych składników komórek. Lizat sączy się w celu usunięcia błony krwinek czerwonych, po czym uzyskany roztwór hemoglobiny poddaje się diafiltracji i zatęża się. Zaaieczyszczony ekstrakt hemoglobiny poddaje się obróbce tlenkiem węgla w celu wytworzenia kompleksu CO-Hb i ogrzewa się w celu prząprowαWzeaia pasteryzacji i tym samym zdezaktywowdala zaniecjktjcząń wirusowych w roztworze. Następnie roztwór odwirowuje się i sączy w celu dokładniejszego usunięcia pozostałości i szczątków komórek. Roztwór nadaje się wówczas do zastosowania w procesie sαmorugowdaia według wynalazku.

179 525

Zgodnie z korzystnym wykonaniem wynalazku pierwsze stadium procesu chromatograficznego stanowi proces anionowymienny, a drugie stadium proces kationowymienny. Pierwszy, anionowymienny proces korzystnie przeprowadza się przy wysokim pH, np. 7-10, a jeszcze korzystniej 8,5-9,0, w warunkach niskiej siły jonowej, to znaczy niskiego przewodnictwa. Przewodnictwo dogodnie wynosi poniżej 3 mS (milisimensów), a korzystnie poniżej 1 mS. warunki takie zapewnia bufor zasadniczo nie zawierający soli. W takich warunkach pożądany składnik HbA0 będzie początkowo wiązać się z ośrodkiem w kolumnie wraz z innymi składnikami. W miarę kontynuowania zasilania kolumny zanieczyszczonym roztworem HbA0 te składniki, które wykazują większe powinowactwo niż HbA0 względem matrycy, zazwyczaj zanieczyszczenia bardziej kwaśne, będą stopniowo rugować z kolumny HbA0 i zanieczyszczenia bardziej zasadowe. Na koniec osiągnie się przeciążenie kolumny, tak że całość HbA0 i bardziej zasadowych zanieczyszczeń zostanie wyrugowana, a związane pozostaną tylko bardziej kwaśne zanieczyszczenia. W większości przypadków obciążenie to zdecydowanie przekracza zalecenia producenta. W ten sposób w stadium osiąga się wydzielenie bardziej kwaśnych zanieczyszczeń z HbA0.

Zasilania zanieczyszczonym roztworem hemoglobiny przeprowadza się niewielką liniową szybkością przepływu, nie większą niż 10 cm/minutę, a korzystnie około 1 cm/minutę.

Umożliwia to kinetyczne zrównoważenie kolumny. Zakres stężeń strumienia zasilającego nie ma zdecydowanego wpływu, z tym że zazwyczaj wynosi 0,1-20%, korzystnie 2-7%.

Osiągniecie stanu przeciążenia można wyśledzić na podstawie analizy odcieku z kolumny - gdy analiza składu odcieku nie wykaże obecności lub jedynie obecność śladowych ilości zanieczyszczeń kwaśnych, osiągnięte zostało maksymalne praktyczne obciążenie kolumny.

Na figurze 1 przedstawiono schematycznie anionowymienną cześć procesu według wynalazku. Kolumnę jonowymienna zawierającą grupy chemiczne -N+R3 (typowe dla żywic anionowymiennych, ale stanowiące jedynie przykład), pokazaną w stadium A procesu przedstawionego na fig. 1, zasila się roztworem zawierającym mieszaninę składników, które w przypadku zanieczyszczeń bardziej kwaśnych przedstawiono gwiazdkami, w przypadku HbA0 elipsami, a w przypadku zanieczyszczeń bardziej zasadowych prostokątami. W stadium B, obciążenia odpowiadającego pojemności, zasadniczo wszystkie aktywne grupy chemiczne N-R3 w kolumnie związane są poprzez ładukni elektrostatyczne z jednym ze składników zawartych w mieszaninie.

Do kolumny w stanie obciążenia odpowiadającego pojemności wprowadza się więcej tego samego roztworu w celu osiągnięcia stanu przeciążenia, co ilustruje stadium C na fig. 1. W tym stadium wszystkie bardziej zasadowe zanieczyszczenia (prostokąty) wraz z pewną ilością HbA0 (którą reprezentują elipsy) rugowane są z kolumny przez bardziej kwaśny składnik (oznaczany gwiazdkami), który wykazuje większe powinowactwo względem kolumny w tych warunkach. Kontynuując wprowadzanie jeszcze większej ilości tego samego roztworu do przeciążonej kolumny dochodzi się do stadium D przedstawionego na fig. 1, w którym kwaśne składniki wyrugowały zasadniczo całość HbA0 z kolumny z uwagi na większe powinowactwo w wybranych warunkach. W takich warunkach odciek opuszczający kolumnę zasadniczo nie zawiera wykrywalnych ilości kwaśnych zanieczyszczeń. Uzyskuje się w ten sposób stosunkowo czysty roztwór HbA0, który jednak w dalszym ciągu zawiera bardziej zasadowe składniki zanieczyszczenia.

W drugim stadium korzystnego wykonania wynalazku stosuje się kolumnę kationowymienną, zasilaną eluatem z pierwszej kolumny do osiągnięcia podobnego stanu przeciążenia. Pożądana HbA0 oraz inne, niepożądane, bardziej zasadowe zanieczyszczenia, związane zostają w ilościach przeciążonych. Kontynuuje się wprowadzanie częściowo oczyszczonego roztworu hemoglobiny z pierwszej kolumny do drugiej kolumny. Przeprowadza się to również z niewielką liniową szybkością przepływu, nie większą niż 10 cm/minutę, a korzystnie około 1 cm/minutę, aby umożliwić kinetyc:zne zrównoważenie fazy stałej i fazy ciekłej. pH eluatu z pierwszej kolumny dogodnie doprowadza się do wielkości w zakresie 5-9, korzystnie 6,5-8,5, a najkorzystniej 7-8 przed wprowadzeniem eluatu do kolumny kationowymiennej. Stosuje się roztwór o niskiej sile jonowej, np. o przewodnictwie poniżej 3 mS, korzystnie poniżej 1mS.

179 525

Roztwory o wysokim przewodnictwie rzędu 2,5 mS są przydatne tylko przy bardzo małych szybkościach przepływu oraz przy bardzo dużych roz.cieńczeniach. Również w tym przypadku wykorzystuje się warunki przeciążania. Zanieczyszczenia białkowe o wyższym powinowactwie, to znaczy bardziej zasadowe niż HbAo, rugują HbAo z kolumny, w wyniku czego HbA0 jest eluowana i odzyskiwana w wyjątkowo czystej formie.

Na figurze 2 przedstawiono schematycznie, w podobny sposób jak na fig. 1, część procesu zachodzącą w kolumnie kationowymiennej, z żywicą, zawierającą grupy SO3. Wprowadza się eluat z pierwszej kolumny po odpowiednim nastawieniu pH i na początku, w stadium A uzyskuje się obciążenia odpowiadające pojemności, zarówno HbAo (elipsy) jak i bardziej zasadowych zanieczyszczeń (prostokąty) wiążących się elektrostatycznie z grupami chemicznymi w kolumnie. Jakkolwiek w przedstawionym rozwiązaniu są to grupy sulfonowe, z równym powodzeniem wybrać można inne warianty, np. grupy karboksylowe. Zasilanie roztworem eluatu kolumny kontynuuje się do osiągnięcia stanu przeciążenia przedstawionego jako stadium B na fig. 2, w którym bardziej zasadowe zanieczyszczenia na skutek większego powinowactwa względem kolumny w takich warunkach, rugują HbAo z kolumny. Kontynuując zasilanie przeciążonej kolumny, co przedstawiono jako stadium C na fig. 2, prawie w 100% czystą HbAo ruguje się i uzyskuje w roztworze jako eluat z kolumny. W związku z tym im wyższe jest obciążenie kolumny, tym wyższy jest procentowy odzysk oczyszczonej HbAo z kolumny. Eluat analizuje się w celu wykrycia w nim obecności składników zasadowych (prostokątów). Nie osiąga się wówczas dalszego odzysku HbAo w wyniku rugowania z kolumny. Moment ten określa się jako obciążenie maksymalne.

W znaczeniu użytym w opisie określenie „bardziej zasadowe zanieczyszczenia” odnosi się do tych zanieczyszczeń, które eluują się z kolumny przy pH wyższym od wymaganego · do eluowania HbAo. I odwrotnie, określenie „zanieczyszczenia bardziej kwaśne” odnosi się do tych zanieczyszczeń, które eluują się z kolumny przy pH niższym od wymaganego do eluowania HbAo. W korzystnym wykonaniu wynalazku, gdy najpierw przeprowadza się chromatografię anionowymienną bardziej zasadowe zanieczyszczenia eluują się przed HbAo, a bardziej kwaśne zanieczyszczenia eluują się po HbAo. W zależności od środka jonowymiennego stosowanego w chromatografii, zaobserwować można różne profile elucji przy niewielkich zmianach w kolejności eluowania. Zarówno w pierwszej kolumnie jak i w drugiej kolumnie szybkości przepływu zanieczyszczonego roztworu hemoglobiny należy zoptymalizować w odniesieniu do wybranego stężenia zanieczyszczonego roztworu hemoglobiny. Liniowe szybkości przepływu 1 cm/minutę lub poniżej są optymalne w przypadku bardziej stężonych roztworów hemoglobiny, w zakresie 2 - 7%. Wysokie szybkości przepływu, wynoszące nawet 2 cm/minutę, można z powodzeniem stosować przy rozdzielaniu bardziej rozcieńczonych roztworów, np. zawierających poniżej 1% Hb. Rozdzielanie metodą chromatografii jonowymiennej przy niskich pojemnościach obciążeniowych jest zazwyczaj niezależne od liniowej szybkości przepływu; jednakże w procesie według wynalazku równoważenie kinetyczne podczas chromatografii jest w znacznym stopniu zależne od szybkości przepływu. Natomiast w żadnym ze stadiów stężenie roztworu zasilającego nie jest parametrem decydującym.

Przy prowadzeniu chromatografii przez rugowanie sposobem według wynalazku stosując najpierw chromatografię anionowymienną w celu usunięcia składników bardziej kwaśnych, a jako drugą chromatografię kationowymienną w celu usunięcia składników bardziej zasadowych, można uzyskać w skali technicznej wysokie wydajności wyjątkowo czystej HbAo, zasadniczo całkowicie pozbawionej wykrywalnych ilości innych białek takich jak białka surowicy i białka błony komórkowej. Czystości oceniane metodą analitycznej chromatografii anionowymiennej wynoszą ponad 99%, a zazwyczaj ponad 99,5%. Efektywne zdolności produkcyjne stadiów są co najmniej o rząd wielkości wyższe od zdolności stwierdzanych w zwykłych procesach chromatograficznych. Oprócz usuwania zanieczyszczeń białkowych sposób według wynalazku umożliwia również zasadniczo całkowite usunięcie zmodyfikowanych i innych niepożądanych form hemoglobiny, pozostawiając zasadniczo czystą (>99,5%) HbAo. Ponadto, jak to dokładniej opisano poniżej, można również osiągnąć zasadniczo całkowite usuniecie kapsułkowanych cząstek wirusów, zarówno aktywnych jak i zdezaktywowanych.

179 525

Zalety przy powiększaniu skali procesu według wynalazku w porównaniu z procesem, w którym wykorzystuje się zwykłą chromatografię jonowymienni! adsorpcyjną/elucyjną, przedstawiono poniżej w tabeli 1. Liczby w kolumnie „samorugowanie” pochodzą z przykładów procesu według wynalazku, opisanych poniżej. Liczby w kolumnie „adsorpcja/elucja” wzięto ze wspomnianego artykułu Winslowa i innych.

Tabela 1

Parametry procesu oczyszczania hemoglobiny A_oz wykorzystaniem chromatografii adsorpcyjnej/elucyjnej *i chromatografii przez samorugowanie

	Samorugowanie	Adsorpcja/elucja
Objętość kolumn	5 i 3 litry	120 litrów
Pojemność kolumn	200 - 300 mg/ml	15 mg/ml
Ilość g załadowanej Hb	1234	1818
% odzysku	81	55
Ilość g zebranej Hb	1000	1000
Objętość buforu w procesie	132 litry	900 litrów

* Winslow i inni, op. cit.

Z powyższych liczb wyraźnie wynika, że proces chromatografii przez samorugowanie według wynalazku można prowadzić szybciej i w znacznie mniejszych kolumnach. Można go prowadzić w warunkach niskich ciśnień i w temperaturach otoczenia. Osiągnąć można efektywne pojemności obciążeniowe 10-20 razy większe od pojemności podanych w odniesieniu do zwykłych procesów chromatograficznych, co umożliwia zastosowanie kolumn o stosunkowo małych objętościach. Prowadzi to do zmniejszenia zapotrzebowania na wodę, zmniejszenia ilości odpadów i zmniejszenia zapotrzebowania na bufor, przy czym wszystkie te parametry znacznie poprawiają opłacalność ekonomiczną procesu przemysłowego.

Oczyszczony roztwór hemoglobiny stanowiący eluat z kolumny kationowej można poddać diafiltracji do wybranego buforu i nastawić na wymagane stężenie HbAo.

Nie ma specjalnych ograniczeń odnośnie żelowego materiału jonowymiennego stosowanego w procesie według wynalazku jako faza stacjonarna. Dobór jest uzależniony od specjalisty. Zastosować można dowolny ze znanych, dostępnych w handlu żeli, pod warunkiem, że można je korzystnie zderywatyzować tak, aby wykazywały zdolność wymiany jonowej w wybranych warunkach powinowactwa względem rozdzielanych składników. Do ogólnych grup nośników ośrodków jonowymiennych należą makroporowate, makrousieciowane i nieporowate typy cząstek polistyrenów lub polimetakrylanów usieciowanych diwinylobenzenem, polialkilenoamin, celulozy, dekstranu, agarozy, krzemionki, materiałów ceramicznych, szkła, tlenku glinu, metali itp. Do dostępnych materiałów należą nośniki o znakach towarowych POROS, Fractogel, HyperD, Dowex, Amberlite, Duolite, Bio-Rex, Chelex, Sephadex, Sepharose, Toyopearl, Macro-prep, Bio-protocol, Accell, typy Mono i inne. Do grup funkcyjnych przyłączonych do takich nośników, zapewniających właściwości jonowymienne należy grupa sulfonianowa, sulfopropylowa, karboksymetylowa, karboksylanowa, fosfo, czwartorzędową aminowa, czwartorzędowa grupa aminoetylowa, polietylenoimina, grupa trimetyloaminoetylowa, dietyloaminoetylowa, dimetyloaminoetylowa, grupa amidu kwasu asparaginowego i inne grupy funkcyjne.

Proces według wynalazku można również zrealizować tak, aby uzyskać roztwór HbAo o czystości co najmniej 99,5%, nieoczekiwanie nie zawierający cząstek wirusowych, zwłaszcza wirusów kapsułkowanych w lipidach takich jak HIV, wirus opryszczki pospolitej (HSV) oraz wirus biegunki bydła, który w wielu przypadkach stanowi model ludzkiego wirusa zapalenie wątroby C. Są to pewne z najważniejszych i najbardziej kłopotliwych wirusów zanieczyszczających krew. Stanowi to bardzo ważną, dodatkową korzyść osiąganą dzięki zastosowaniu wynalazku, której nie można było przewidzieć przed wypróbowaniem procesu i

179 525 zanalizowaniem wyników, Jakkolwiek korzystne procesy według wynalazku obejmują etap pasteryzacji w celu zdezaktywowania wirusów przed oczyszczaniem, jak to opisano powyżej, osiągnięcie usunięcia cząstek wirusów w ramach procesu oczyszczania jest szczególnie korzystne. Usunięte zostają w ten sposób z materiału stanowiącego zamiennik krwi jakiekolwiek cząstki aktywnych wirusów, które mogły przetrwać pasteryzację, a także jakiekolwiek resztki cząstek zdezaktywowanych wirusów. Wszystko to można osiągnąć bez stosowania jakiegokolwiek dodatkowego, specjalnego etapu usuwania cząstek wirusów oraz bez dodawania jakichkolwiek specjalnych reagentów itp. w celu usunięcia wirusów. Osiągnąć można zasadniczo całkowite usunięcie wirusów kapsułkowanych w lipidach. Można także osiągnąć znaczne zmniejszenie ilości innych wirusów. Produkty hemoglobinowe wytworzone sposobem według wynalazku wykazują wyższy stopień czystości niż uprzednio opisane produkty hemoglobinowe. Prawdopodobnie ze względu na wysoki stopień czystości lub z uwagi na inne dotychczas nie w pełni wyjaśnione czynniki, produkty te wykazują nieoczekiwane u wysoce korzystne właściwości, dotychczas nie opisane w odniesieniu do produktów hemoglobinowych, co najmniej tych, które wytwarza się w dużej skali.

W szczególności produkty wytworzone sposobem według wynalazku, HbA0, nie zawierają żadnych białek błony krwinek czerwonych, co ustalono metoda ogniskowania izoelektrycznego i immunoblottingu. Technikami immunoabsorpcji wykryto obecność śladowych ilości ludzkiej albuminy surowiczej (HSA) w ilości poniżej 4pg a zazwyczaj 2-4 pg HSA/100 mg Hb. Do jedynych innych wykrywalnych białek czasami występujących w tych produktach należą fragmenty łańcuchów α- i β-globinowych hemoglobiny, przy czym ilość ich nie przekracza 1 pg/100 mg hemoglobiny. Przy tak wyjątkowo wysokim poziomie czystości produkty uzyskane sposobem według wynalazku są unikatowe i wykazują nieoczekiwane właściwości opisane poniżej. Jedną z nich jest zmniejszenie lub brak zdolności do wywoływania skurczu naczyń. Inna jest brak toksyczności w odniesieniu do hodowanych komórek śródbłonka. Opisywane uprzednio hemoglobiny o wysokiej czystości, zarówno usieciowane, jak i nieusieciowane, wykazują po infuzji efekt presyjny^(1, \ W związku z tym, że były to rzeczywiście produkty o wysokim stopniu czystości, współczesne teorie zakładają, że odpowiedzialna za to musi być wewnętrzna właściwość samej hemoglobiny. W szczególności uważano, że za efekt ten odpowiedzialna jest zdolność hemoglobiny do wiązania tlenku azotowego. Tlenek azotowy określany również jako czynnik rozluźniający pochodzący ze śródbłonka, jest silnym środkiem rozszerzającym naczynia, syntetyzowanym w komórkach śródbłonkowych z pośrednictwem syntezy tlenku azotowego. W związku z tym, że cząsteczki hemoglobiny będą wiązać tlenek azotowy z wysokim powinowactwem, założono i obecnie przyjmuje się, że dożylna infuzja roztworów hemoglobiny, zwłaszcza roztworów hemoglobiny nieusieciowanej, będzie powodować sekwestrację tlenku azotowego i wywoływać reakcję nadciśniemową ze skurczem naczyń.

Odkrycie faktu, że produkty uzyskane sposobem według wynalazku nie wykazują aktywności wazopresyjnej, w modelach zmiany izooligemicznej i wstrząsu krwotocznego, jest całkowicie nieoczekiwane i sprzeczne z obecnymi teoriami i przeświadczeniami dotyczącymi wewnętrznych właściwości hemoglobiny. Uzyskane wyniki sugerują, że nie tylko właściwość wewnętrzna hemoglobiny odpowiedzialna jest za jej dotychczasowe obserwowane działanie powodujące skurcz naczyń, ale co najmniej w części spowodowane jest to przez zanieczyszczenie występujące w wyjątkowo małych ilościach, które dotychczas nie było skutecznie usuwane pomimo doniesień o wyjątkowo wysokich poziomach czystości dotychczas opisywanych hemoglobin.

Korzystny brak działania wazopresyjnego produktów uzyskanych sposobem według wynalazku zachowany zostaje w usieciowanych polimeryzowanych produktach hemoglobinowych wytworzonych z tych produktów, np. sposobem opisanym w zgłoszeniu patentowym USA nr 08/231 945 z 21 kwietnia 1994.

Ponadto produkty uzyskane sposobem według wynalazku wykazują w badaniach in vitro znacznie mn^iei^^ią toksyczność w odniesieniu do komórek śródbłonkowych niż hemoglobiny opisane uprzednio. Badania roztworów oksyhemoglobin opisanych uprzednio, w tym hemoglobin oczyszczanych chromatograficznie, wykazały uszkodzenia komórek, na co wska179 525 zuje znaczący wzrost ilości dehydrogenazy mleczanowej w ośrodku hodowli komórek śródbłonkowych w porównaniu z poziomami dehydrogenazy mleczanowej w ośrodku kontrolnych komórek śródbłonkowych. Dehydrogenaza mleczanowa jest markerem uszkodzenia komórek. Również w tym przypadku założono i przyjęto, że toksyczność ta związana jest z wewnętrzną właściwością oksyhemoelobiny, gdyż badane roztwory zawierały oksyhemoglobinę w stanie o wysokiej czystości .

Nieoczekiwanie w sposób znaczący stwierdzono, że hemoglobina uzyskana sposobem według wynalazku nie uczestniczy w uwalnianiu dehydrogenazy mleczanowej. W przeciwieństwie do hemoglobiny oczyszczonej sposobem według wynalazku znaczący wzrost stopnia dehydrogenazy mleczanowej zaobserwowano przy inkubowaniu komórek śródbłonkowych z bezzrębowymi roztworami hemoglobiny oczyszczonej innymi metodami chromatograficznymi.

Ogólnie przyjmuje się i rzeczywiście jest to oczywiste, że każdy zamiennik krwi i każdy składnik lub surowiec do wytwarzania zamiennika krwi, powinien być na tyle oczyszczony, aby nie zawierał zanieczyszczeń uznanych za szkodliwe. Dotychczas uważam) ·' za takie szkodliwe zanieczyszczenia zręby komórkowe, endoksyny i inne pirogeny, białka niehemo globinowe, fosfolipidy itp. Znane zamienniki krwi określane były jako „zasadniczo wolne” od jednego lub więcej takich zanieczyszczeń. Określenie ..zasadniczo wolne” jest jednak względnym, subiektywnym określeniem, którego interpretacja i ograniczenie zależy od sposobu określania odnośnego parametru zastosowanego i opisanego w odnośnej znanej publikacji. Ulepszone techniki oczyszczania i analizy zaowocowały doniesieniami o zamiennikach krwi i produktach hemoglobinowych o coraz wyższych poziomach czystości. Tak np. znana literatura obejmuje doniesienia dotyczące roztworów hemoglobiny, w których 99,9% obecnego białka stanowi hemoglobina w danej lub innej formie (patrz wspomniany patent USA nr 5 084 588, Rausch i inni). Na podstawie wynalazku postuluje się, że nawet taka czystość nie jest wystarczająca dla korzystnego zamiennika krwi, gdyż charakter resztkowy zanieczyszczeń może powodować zwężenie naczyń i wykazywać toksyczność względem komórek.

Można wykazać, że bezzrębowa hemoglobina dostępna z Walter Reed Army Research Institute (WRAIR) i ogólnie uznawana jako przemysłowy wzorzec czystości, zawiera znaczą liczbę (ponad 10) różnych białek stanowiących zanieczyszczenia, przy czym wiele spośród nich występuje w ilościach stanowiących poniżej 0,01% całkowitego białka. Jakkolwiek pozornie jest to bardzo mała ilość, jednak faktem jest, że hemoglobina jako zamiennik krwi podawana jest pacjentowi we względnie dużych ilościach oraz że to całkowita ilość podanego zanieczyszczenia decyduje o tym, czy jest ono czy też nie jest szkodliwe, a nie jego stężenie w jakiejkolwiek z podawanych mieszanin. Dawka jednostkowa roztworu zamiennika krwi opartego na hemoglobinie będzie zawierać 25-50 g hemoglobiny, tak że 0,01% zanieczyszczenia oznacza 2,5-5 mg zanieczyszczenia. Wystarczy, że wśród wielu rodzajów obecnych białek będzie jedno lub dwa białka wyjątkowo szkodliwe przy takiej ilości. Wynalazek dostarcza produktu hemoglobinowego o zawartości niehemoglobinowego białka poniżej 0,5%, korzystnie poniżej 0,1%, czego przypuszczalna, ale nie bezwarunkową konsekwcncjją jest to, że nie wykazuje on dostrzegalnego zwężenia naczyń i znaczącej toksyczności w stosunku do komórek śródbłonkowych.

Jeszcze inną zaletę produktów uzyskanych sposobem według wynalazku stanowi ich zmniejszona zdolność powodowania krzepliwości krwi. Okazuje się, że produkty zawierają bardzo znacznie zmniejszone ilości środków wzmagających krzepliwość krwi w porównaniu z innymi dostępnymi i opisanymi bezzrębowymi produktami hemoglobinowymi.

Wynalazek dokładniej ilustrują poniższe przykłady nie ograniczające jego istoty.

Przykład 1. Wytwarzanie surowego lizatu Hb opakowań (około 30 litrów) krwinek czerwonych (RBC) tej samej grupy krwi połączono, a następnie rozcieńczono 24 litrami 0,9% roztworu soli. Pulę tę przesączono następnie przez 20-pm i 8-pm filtry polipropylenowe w celu usunięcia resztek leukocytów.

Po odsączeniu leukocytów RBC przemyto 6 litrami 0,9% roztworu soli w układzie diafiltracji o stałej gęstości stosując 3,5 m-‘membran Sepracor z 0,3-pm pustych włókien z polieterosulfonu. Bufor przemywający zastąpiono następnie 50 mM buforem Tris powodującym lizę i RBS poddawano stopniowo lizie do 6 objętości tego buforu powodującego lizę.

179 525

Surowy lizat zebrano i zatężono od około 2,5% całkowitej hemoglobiny (THb) do około 9,0% THb stosując membranę Millipore PTTK odcinającą ciężar cząsteczkowy (MWCO) 30K. Po zatężeniu zbiornik napełniono gazowym CO w celu przekształcenia hemoglobiny w postać COHb. Lizat pasteryzowano w 62 ± 2°C przez 10 godzin w zbiorniku z płaszczem. Pasteryzowany lizat schłodzono, a następnie odwirowano. W wyniku kolejnej głębokiej filtracji przez 0,8%, filtry Millipore przygotowano pasteryzowany lizat do diafiltracji przez kolejną membranę Millipore 30K PTTK. Materiał ten poddawano diafiltracji z 5 mM Tris o pH 8,9, aż do uzyskania przewodnictwa poniżej 0,3 mS i pH 8,9 - 0,2. Następnie rozcieńczono go do 4,5 - 5% THb otrzymując materiał nadający się do oczyszczania chromatograficznego.

Przykład 2. Chromatografia przez samorugowanie na żywicy anionowymiennej.

Kolumnę 1 x 10 cm wypełnioną żywicą, anionowymienną PerSeptive Poros HQ-50 przemyto 1N NaCl w ilości równej 4 objętościom kolumny, po czym przeprowadzono równoważenie w 5 mM buforze Tris o pH 8,8. Po zrównoważeniu 50 ml 3,0% (3 g/100 ml) surowego lizatu hemoglobiny (~85% HbA0) w 5 mM Tris, otrzymanego w sposób opisany w przykładzie 1, o pH 8,8, wprowadzono do kolumny z szybkością 0,78 ml/minutę (1 cm/minutę). Doprowadziło to w efekcie do przeciążenia kolumny - obciążenie 200 mg składników rozpuszczonych na ml żywicy, w porównaniu z podaną przez producenta pojemnością zapewmąjącą obciążenie 50 mg/ml. Eluat zebrano. Kolumnę przemyto następnie 5 mM buforem Tris o pH 8.8 w ilości równej dwóm objętościom kolumny i eluat ten połączono z eluatem zebranym podczas obciążania. Kolumnę przemyto 1N NaCl w celu wyeluowania reszty białek. Eluat ten odrzucono. Kolumnę zregenerowano stosując 1M NaCl/HCl w ilości równej 3 objętościom kolumny oraz 1M NAOH w ilości równej 4 objętościom kolumny. Eluat hemoglobinowy z żywicy anionowymiennej poddano analizie w analitycznej kolumnie anionowymiennej z gradientem pH, w sposób dokładniej opisany poniżej w przykładzie 11. Stwierdzono, że zawiera on około 95-96% HbA0, jak to wynika z fig. 3, przy odzysku 90% HbA0 wprowadzonej do kolumny.

Przykład 3. Chromatografia przez samorugowanie na żywicy anionowymiennej

Kolumnę 1 x 10 cm z wypełnieniem Merck Fractogel-TMAE przemyto 1N NaCl w ilości równej 4 objętościom kolumny, po czym przeprowadzono równoważenie w 5 mM buforze Tris o pH 8,8. Po zrównoważeniu 50 ml 3% (3 g/100 ml) surowego lizatu hemoglobiny (-85% HbA0) w 5 mM Tris, otrzymanego w sposób opisany w przykładzie 1, o pH 8,8, wprowadzono do kolumny z szybkością 0,78 ml/minutę (1 cm/minutę). W efekcie doprowadziło to również do przeciążenia kolumny. Eluat zebrano. Kolumnę przemyto następnie 5 mM buforem Tris o pH 8,8 w ilości równej dwóm objętościom kolumny i eluat ten połączono z eluatem zebranym podczas obciążania. Kolumnę przemyto 1N NaCl w celu wyeluowania reszty białek. Eluat ten odrzucono. Kolumnę zregenerowano stosując 0,5 N HCl w ilości równej 3 objętościom kolumny oraz 1M NAOH w ilości równej 4 objętościom kolumny. Eluat hemoglobinowy z żywicy anionowymiennej poddano analizie w analitycznej kolumnie anionowymiennej z gradientem pH, w sposób dokładniej opisany poniżej w przykładzie 11. Stwierdzono, że zawiera on około 95-96% HbA0, jak to wynika z fig. 3, przy odzysku 73% HbA0 wprowadzonej do kolumny.

Przykład 4. Chromatografia przez samorugowanie na żywicy kationowymiennej

Kolumnę 1 x 10 cm wypełnioną żywicą PerSeptive Poros HS-50 przemyto 1N NaCl w ilości równej 4 objętościom kolumny, po czym przeprowadzono równoważenie w 5 mM buforze Tris o pH 7,5. Po zrównoważeniu 120 ml 2,0% (2 g/100 ml) hemoglobiny oczyszczonej na amonicie (~95% HbA0) w 5 mM Tris o pH 7,5, otrzymanej w sposób opisany w przykładach 2 i 3, wprowadzono do kolumny z szybkością 0,78 ml/minutę (1 cm/minutę). Doprowadziło to w efekcie do przeciążenia kolumny w stopniu około 5-krotnie przekraczającym zalecenia producenta. Eluat zebrano. Kolumnę przemyto następnie 5 mM buforem Tris o pH 7,5 w ilości równej dwóm objętościom kolumny i eluat ten połączono z eluatem zebranym podczas obciążania. Kolumnę przemyto 1N NaCl w celu wyeluowania reszty białek. Eluat ten odrzucono. Kolumnę zregenerowano stosując 0,5 N HCl w ilości równej 3 objętościom kolumny oraz 1M NAOH w ilości równej 4 objętościom kolumny. Eluat hemoglobinowy z żywicy kationowymiennej poddano analizie w analitycznej kolumnie aniono179 525 wymiennej z gradientem pH. Stwierdzono, że zawiera on ponad 99% HbA0, jak to wynika z fig. 4, przy odzysku około 90% HbA0 wprowadzonej do kolumny.

Przykład 5. Zbadano wpływ przewodnictwa na chromatografię przez samoregulowaale na żywicy aaionowkmieaaej (stadium pierwsze)

Skuteczna chromatografia przez rugowanie jest zdecydowanie zależna od siły jonowej (której miarą jest przewodnictwo) buforylu i/lub próbki. Doświadczenia zestawione poniżej w tabeli 1 przeprowadzono wprowadzając surowy lizat z przykładu 1 do żywicy anionowymleaaej Poros-Hę-óC) z PerSeptiye Blosyttąms Inc. Eluat z kolumny analizowano metodą analitycznej chromatografii aaioaowkmląaaej. Wszystkie frakcje ujęsaacą w próbie nr 1 były wolne od wykrywalnych kwaśnych zanieczyszczeń, podczas gdy nawet pierwsza frakcja z próby nr 2 zawierała kwaśne jaaieczotzcjyaie.

Tabela 2

Próba	Obciążąaią, mg/ml	THb	pH	pS	Kolumna (L x D)	Bufor	Szybkość przepływu (cp/piauta)	Usuwanie kwaśnych jeaiącjotjcjąń
1	200	3,0	8,8	0,2/0,4	10 x 1	Tris	1	100%
2	200	2,8	8,8	2,85	10 x 1	Tris	1	0%

Przykład 6. Wydajność w funkcji obciążenia białkiem

Przy obciążeniu kolumny osiąga się większy odzysk oczyszczonej HbA0. Wyniki podane poniżej w tabeli 3 wykazują bardzo wysokie przeciążenie 10-ml kolumny z kationowymienną żywicą Poros HS-50, co zapewnia zajęcie wszystkich miejsc wiązania przez zanieczyszczenia i umożliwia większy odzysk oczyszczonej HbA0. Przeciążenie w pierwszym doświadczeniu było 13,5 razy większe od zaleceń producenta (308 mg białka/ml), a w drugim doświadczeniu było około 5 razy większe od zaleceń producenta. Wyższe przeciążenie prowadzi do znaczącej poprawy odzysku HbA0 z kolumny.

Tabela 3

białka pg/pl	THb	pH	pS	Kolumna (L x D)	Bufor	Szybkość przepływu (cp/piauta)	Uwrlaiącią od jeaiącjotjcjąń zasadowych
308	3,1	7,5	0,5	9,5 x 1	Tris	0,6	100% 88% odzysku
216	2,9	7,4	0,6	9,5 x 1	Tris	0,6	100% 77% odzysku

Przykład 7. Porównanie między małymi i wielkimi kolumnami

Proces chromatografii przez rugowanie według wynalazku można prowadzić w wielkich i w małych kolumnach. Stosując kolejno żywicę daloaowymleaną Poros HQ-50 i żywicę katioaowymląaną Poros HS-50 porównano zastosowanie odpowiednio kolumn 15 i 10 litrowych z 10-ml kolumnami. Roztwór zasilający kolumnę Poros HQ-50 przygotowano w sposób opisany w przykładzie 1. Eluat z kolumny HQ-50 wprowadzono do kolumny HS-50. W tabeli 4 zestawiono warunki i wyniki uzyskane w kolumnach Poros HQ-50. W tabeli 5 zestawiono wyniki uzyskane w kolumnach Poros HS-50. Wyniki te wskaz^ą że w celach produkcyjnych w obydwu stadiach powiększyć można skalę procesu do co najmniej 10-15 1.

Tabela 4

Załadowana ilość	Obciążąaią, pg/pl	THb	pH	Przewodnictwo pS	Kolumna (L x D)	Bufor	Szybkość przepływu (cp/piauta)	Usuwanie kwaśnych jealącjotjcjąń
1,6 g	210	5,6	8,9	0,5	10 x 1	Tris	1	100%
3,2 kg	200	4,7	8,8	0,3	10x45	Tris	1	100%

179 525

Tabela 5

Załadowana ilość	Obciążenie, mg/ml	THb	pH	Przewodnictwo mS	Kolumna (LxD)	Bufor	Szybkość przepływu (cm/minutę)	Usuwanie kwaśnych zanieczyszczeń
2,4 g	308	3,1	7,5	0,5	9,5 x 1	Tris	0,6	100%
1,7 kg	254	3,7	7,6	0,4	9,5 x 30	Tris	0,6	100%

Przykład 8. Analiza surowego lizatu hemoglobiny i oczyszczonej hemoglobiny metodą ogniskowania izoelektrycznego (IEF)

Analizę metodą ogniskowania izoelektrycznego (IEF) przeprowadzono z zastosowaniem żelu opartego na agarozie, w którym ustalono trwały gradient pH wykorzystując dostępne w handlu amfolity. Zastosowano takie amfolity, że 90% z nich była w zakresie pH 5-8, a 10% w zakresie pH 3,5-10. Ostateczne stężenie agarozy w żelu wynosiło 1,25%, a ostateczne stężenie amfolitów około 2%. Do oceny czystości żele silnie przeciążono (wprowadzono 1 mg białka/ścieżkę). Elektroforezę przeprowadzono przy niskich nastawach natężenia prądu, aby zapewnić migrację białek w postaci równomiernych, prostych pasm. Po osiągnięciu stanu ustalonego napięcie i prąd zwiększono na krótki okres czasu, aby jeszcze bardziej wyostrzyć pasma. Po elektroforezie białka w żelu agarozowym utrwalono za pomocą roztworu kwasu trichlorooctowego i sulfosalicylowego. Po etapie utrwalania żel zabarwiono za pomocą błękitu Comasie w celu uwidocznienia pasm białek. Przed wykonaniem skaningu żel wysuszono na powietrzu, po czym zastosowano densytometr laserowy w celu wyśledzenia elektroforetycznie zogniskowanych ścieżek zawierających surowy lizat hemoglobiny i hemoglobinę oczyszczoną. Na fig. 5 porównano IEF surowego lizatu hemoglobiny otrzymanego w sposób opisany w przykładzie 1 oraz oczyszczonej HbA0 uzyskanej sposobem według wynalazku.

Oczyszczanie roztworu hemoglobiny przeprowadzono stosując kolejno kolumnę Poros HQ-50 w sposób opisany w przykładzie 2 oraz kolumnę Poros HS-50 w sposób opisany w przykładzie 4.

Przykład 9. Analiza immunologiczna surowego lizatu hemoglobiny i hemoglobiny oczyszczonej

W celu oznaczenia ilości różnych zanieczyszczeń w surowym lizacie hemoglobiny z przykładu 1 oraz oczyszczonej hemoglobiny wytworzonej sposobem według wynalazku, zastosowano technikę immunobarwienia. Po elektroforetycznym zogniskowaniu białek na żelu agarozowym białka przeniesiono na papier nitrocelulozowy techniką blottingu kapilarnego. Resztę wolnych miejsc wiązania na papierze zablokowano inkubując blot w roztworze hydrolizowanej żelatyny rybiej. Po inkubowaniu blot przemyto roztworem soli biforowanym Tris (TBS) i przeprowadzono inkubowanie z przeciwciałem pierwotnym. (Przeciwciałem pierwotnym jest przeciwciało, przeciw któremu ma być zbadana próbka, tak że przeciwludzką albuminę surowniczą (anty-HSA) można zastosować do badania obecności HSA w roztworach hemoglobiny). Po tym inkubowaniu blot przemyto TBS i przeprowadzono inkubowanie z przeciwciałem wtórnym skoniugowanym z enzymem markerowym (np. z peroksydazą chrzanową), będącym przeciwciałem względem przeciwciała pierwotnego. Po inkubowaniu z przeciwciałem wtórnym blot ponownie przemyto za pomocą TBA i dodano substratu enzymu markerowego. Pojawia się barwne wytrącenie, gdy drugie przeciwciało wtórne związało się z przeciwciałem pierwotnym, które związało się z jego antygenem, co jest oznaka ilości i położenia antygenu względem antygenu pierwotnego na żelu iEF.

Wyniki podano poniżej w tabeli 6, przy czym („++++++” oznacza silny sygnał, „+” oznacza sygnał z trudem wykrywalny, a oznacza brak wykrywalnego sygnału).

179 525

Tabela 6

Zastosowane przeciwciało	Surowy lizat HB	Hemoglobina
Ludzka albumina surownicza	+++++++++++	+^a
Krwinki czerwone (RBC)	+++++++	+^b
Błona RBC	+ + + + +	-
Ludzkie osocze	+++++++++++	+^c
Anhydraza węglanowa I	+ + +	-
Spektryna	+ + + +	-
Glikoforyna	+ +	-

a. - Wykorzystując wzorce HSA na immunoblotach oszacowano, że ilość HSA w oczyszczonej HbA0 wynosi < 5 pg/mg Hb (< 50 ppm).

b. - Wykryto śladowe zanieczyszczenie o pl ~5,2, które reaguje krzyżowo z przeciwciałem anty-RBC. Inni badacze również donieśli o istnieniu podobnego białka w uzyskanych roztworach oczyszczonej Hb - patrz Christensen i inni, op. cit.

c. - Przeciwciało anty-HSA obecne w przeciw-ludzkim osoczu wykryło HSA obecną w oczyszczonej HbA0.

Przykład 10. Ludzka albumina surownicza - immunodetekcja (HSA-ID)

Metodę chromatograficzną zastosowano do ilościowego oznaczania HSA obecnej w roztworach hemoglobiny. W metodzie wykorzystuje się przeciwciało (anty-HSA) kowalencyjnie związane z matrycą w kolumnie. Po wstrzyknięciu próbki do kolumny wszystkie składniki z wyjątkiem antygenu dla przeciwciała (HSA) przechodzą przez kolumnę w etapie obciążania/wymywania. W wyniku zastosowania buforu eluującego związany antygen (HSA) eluuje się z kolumny, a powierzchnię piku wykorzystuje się do ilościowego oznaczenia antygenu obecnego w próbce.

W analizie zastosowano wkład ImmunoDetection* (ID) z PerSeptive Biosystems. Szybkość przepływu w czasie wykonywania analizy wynosiła 2 ml/minutę. Kolumnę dopasowaną kształtem do wkładu (średnica 1,6 mm x długość 26 mm) zrównoważono buforem obciążającym (10 mM bufor fosforanowy + 300 mM NaCl, pH 7,2), po czym wstrzyknięto 50 pl próbki. Bufor obciążający zastosowano do przemycia kolumny przez 0,25 minuty, po czym zastosowano bufor eluujący (przez 3,5 minuty) w celu wyeluowania związanej HSA z kolumny. Eluat analizowano za pomocą detektora Beckman’a z układem diodowym, nastawionego na 220 nm i 414 nm. Kolumnę zrównoważono ponownie buforem obciążającym w celu wykonania następnego pomiaru. Wykorzystując taką metodę oceniono, że ilość HSA obecnej w oczyszczonej hemoglobinie wynosi nie więcej niż 0,0005% w stosunku do wagi hemoglobiny.

* Znak towarowy.

Przykład 11. Analiza chromatograficzna anionowymienna

Analizę czystości hemoglobiny w produktach z przykładów 2 i 4 wykonano metodą chromatograficzną w sposób następujący. Zastosowany sposób oparty jest na metodzie opisanej przez Huismana i Dozy’ego'⁴’; próbkę wprowadza się do kolumny anionowymiennej przy wysokim pH (8,5), tak że całe białko zostaje związane z kolumną po czym stosuje się gradient pH od 8,5 do 6,5 w celu kolejnego eluowania białek z kolumny. Wykonując taką analizę chromatograficzną rozdzielić można bardzo podobne białka (np. różne warianty hemoglobiny). W analizie zastosowano analityczną kolumnę anionowymienną o wymiarach 4,6 x 100 mm z PerSeptive Biosystems. Jako bufor zastosowano A) 25 mM Tris + 25 mM Bis-tris, pH 8,5, oraz B) 25 mM Tris + 25 mM Bis-tris, pH 6,5. Analizę wykonano przy szybkości przepływu 5 ml/minutę. Po zrównoważeniu kolumny buforem B wstrzyknięto do niej 10 pl próbkę (stężenie 10 mg THb/ml) i uruchomiono eluowanie gradientowe (od 100% buforu A do 100% buforu B, 25 objętości kolumny). Eluat analizowano metodą detekcji UV przy 280 nm w celu zidentyfikowania pików białek. Na figurze 3 przedstawiono uzyskany tą metodą profil chromatograficzny hemoglobiny oczyszczonej metodą anionowymienną (produkt z przykładu 2), a na fig. 4 profil oczyszczonej HbA0 (produktu z przykładu 4), analizowanej tą metodą.

179 525

Metoda ta stanowi standardową metodę sprawdzania czystości roztworów hemoglobiny. Stwierdzono, że HbA0 oczyszczona sposobem według wynalazku nie zawiera żadnych zanieczyszczeń obecnych w hemoglobinie bezzrębowej. Czasami obserwowano niewielki występ poprzedzający pik HbA0, przypisywany utlenionej formie HbA0 (MetHbA0). W badaniach rutynowych przeprowadzanych tą metodą stwierdzono, że czystość produktu otrzymanego sposobem według wynalazku wynosi ponad 99,5%.

Przykład 12. Usuwanie wirusów

Zbadano możliwość usuwania wirusów z surowej hemoglobiny sposobem według wynalazku. Do próbek surowego lizatu otrzymanego w sposób opisany w przykładzie 1 oraz do próbek częściowo oczyszczonych roztworów hemoglobiny uzyskanych z kolumny anionowej, tj. produktów z przykładów 2 i 3, dodano określonych ilości następujących wirusów, w formie aktywnej.

Wirus polio typ 1

Ludzki wirus niedoboru odporności (HIV)

Wirus biegunki bydła stanowiący model ludzkiego wirusa zapalenia wątroby)

Wirus opryszczki pospolitej typu 1 (HSV-1)

Do badanych układów komórek dodano próbki eluatów z odpowiednich kolumn. W przypadku wirusa polio, wirusa opryszczki pospolitej i wirusa biegunki bydła, aktywny wirus oddziaływuje z komórkami testowymi tworząc łysmki. Następnie przeprowadzono znane, standardowe testy. W przypadku HlV próbki wprowadzano do ośrodka hodowli tkankowej. Ilość obecnego wirusa określano na podstawie zmiany szybkości wzrostu linii komórek. Zmianę tę określa się jako TCID50 (50% dawkę infekcyjną w hodowli komórkowej). Wyniki podano poniżej w tabeli 7.

Tabela 7

Logarytm zmniejszenia ilości wirusów osiągniętego w wyniku chromatografii

Wirus	Wirus polio typ 1	HIV	Wirus biegunki bydła	Wirus opryszczki pospolitej typ II
Genom	RNA	RNA	RNA	RNA
Otoczka	brak	tak	tak	tak
Układ testowy	Komórki Vero	Komórki MT-4	Komórki EBTr	Komórki Vero
Obciążenie anionowe	1,4 x 10⁷pfo/ml	1,4 x 105 _TC1D50_ml	1,7 x 105 pfu/ml	5,3 x 10⁶ pfu/ml
Eluat anionowy	8,5 x 10⁶pfu/ml	< 3 TCID5(0ml	< 20 pfu/ml	< 3 pfu/ml
Logarytm zmniejszenia	< 1	>5	>4	>6
Obciążenie kationowe	3,1 x 107 pfu/ml	3,2 x 10⁶ TCID5<0ml	2,8 x 105 pfu/ml	2,0 x 10⁶pfu/ml
Eluat kationowy	7,5 x 10⁶pfu/ml	5,6 x 10² TCID5(0ml	2,1 x 10⁴ pfu/ml	4,1 x 10³ pfu/ml
Logarytm zmniejszenia	< 1	>3	> 1	>3

Wyniki te wskazują, na niewielkie zmniejszenie ilości wirusa polio przy wykorzystaniu etapów anionowymiennego samorugowania lub kationowymiennego samorugowania sposobem według wynalazku, oraz znaczące zmniejszenie obciążenia wirusem w przypadku HIV, HSV i biegunki bydła po chromatografii anionowy-miennej oraz w mniejszym stopniu po chromatografii kationowymiennej. Było to całkowicie nieoczekiwane i stanowi znaczącą zaletę sposobu według wynalazku.

Przykład 13. Analiza czystości metodą ogniskowania izoelektrycznego i blottingu Westerna

Eksperymenty ogniskowania izoelektrycznego (IEF) przeprowadzono metodą opisaną przez SaraVisa i Zamcheck^/⁵)

179 525

Żele IEF odlano stosując agrozę (ostateczne stężenie 1%) i wytworzono gradient pH za pomocą amfolitów (Pharmacie Biotech Inc., Piscataway, N.J.), tak że 9O% amfolitów było w zakresie pH 5-8, a 1O% w zakresie pH 3,5-1O. Zazwyczaj do żelu IEF wprowadzano 1O pl roztworów o stężeniu Hb 1OO mg/ml. Po zogniskowaniu białek żel utrwalano stosując 1O% kwas trichłorooctowy (TCA), suszono i barwiono błękitem Coomassie [3]. Zazwyczaj całkowita ilość białka wynosiła 1 mg/ścieżkę.

Analizę metodą ogniskowania izoelektrycznego przeprowadzono w celu porównania czystości SFH z 4 różnych partii HbAo oczyszczonej sposobem według wynalazku. Na każdą ścieżkę wprowadzano 5O pg całkowitej Hb lub 1 mg całkowitej Hb. Wyniki przedstawiono na fig. 6. Ścieżka 2O reprezentuje bezzrębową hemoglobinę przy obciążeniu 5O pg całkowitej Hb, a ścieżki 22, 24, 26 i 28 reprezentuj partie Hb oczyszczonej sposobem według wynalazku, przy takim samym obciążeniu. Ścieżka 3O reprezentuje SFH przy całkowitym obciążeniu 1 mg, a ścieżki 32, 34, 36 i 38 repr^^^^^n^i^^ićą partie · Hb oczyszczonej sposobem według wynalazku, przy takim samym obciążeniu. Przy obciążeniu próbką 5O pg całkowitej Hb wydaje się, że oczyszczona HbAo i SFH wykazują zbliżoną czystość. Natomiast przy 1 mg całkowitej Hb/ścieżkę na ścieżce SFH obserwuje się liczne białka krwinek czerwonych, będące białkami osocza lub białkami błony, nie występujące na ścieżce oczyszczonej HbAo. Bardzo słabe pasmo białka o pI wokół 5,2 zaobserwowane w ścieżce oczyszczonej HbAo pochodzi prawdopodobnie od fragmentów łańcuchów globinowych. Pasma powyżej pasma HbAo na ścieżkach obciążonych próbką 5O fig spowodowane są bardziej dodatnio naładowanym składnikiem MetHb tworzącym się w czasie elektroogniskowania.

Po ogniskowaniu izoelektrycznym przeprowadzono blotting Westerna obejmujący korzystanie barwienia przeciwciał (immunobarwienie), w celu dokładniejszego zbadania czystości produktu wytworzonego sposobem według wynalazku. W tym celu białka z żeli IEF przeniesiono na papier nitrocelulozowy techniką blottingu kapilarnego. Resztę wolnych miejsc wiązania na papierze zablokowano inkubując blot w roztworze hydrolizowanej żelatyny rybiej (Hipure Ziquid Gelatin, Norland Products Inc., New Brunswick, N.J.). Blot inkubowano następnie z króliczym przeciwciałem przeciwko ludzkiemu osoczu (Dako Corp., Santa Barbara, CA, partia nr O1O) (przeciwciała rozcieńczono w skali 1:5OO roztworem soli biforowanym Tris). Po inkubowaniu przez noc blot przemyto roztworem soli buforowanym Tris (TBS) zawierającym 1% rybiej żelatyny, a następnie inkubowano z koniugatem peroksydazy chrzanowej (HRP) z kozim przeciwciałem przeciwko króliczym IgG (po rozcieńczaniu 1:1OOO w TBS). Po inkubowaniu przez 1 godzinę blot ponownie przemyto TBS zawierającym 1% rybiej żelatyny. Kompleks antygen-przeciwciało-HRP uwidoczniono stosując 4-chloro-1naftol (3O mg/2O ml metanolu) i nadtlenek wodoru (5O pl w 1OO ml TBS). Ciemnopurpurowe wytrącone pasma wskazują na obecność antygenów, w szczególności białek osocza.

Na żelach IEF zogniskowano podwójne próbki bezzrębowej hemoglobiny, Hb oczyszczonej sposobem według wynalazku, Hb oczyszczonej sposobem według wynalazku po IEF, oczyszczonej Hb z Walter Reed Army Research Institute (WRAIR) (oczyszczonej w sposób opisany we wspomnianej publikacji Winslowa i innych) oraz oczyszczonej Hb z Sigma Corporation (określonej w aktualnym katalogu odczynników diagnostycznych jako „Hemoglobin Ao, numer H O267). Połowę żelu zabarwiono błękitem Coomassie, a z drugiej połowy wykonano blotting na bibule nitrocelulozowej. Blot zabarwiono następnie w celu uwidocznienia kompleksów ludzkie osocze-przeciwciało przeciwko ludzkiemu osoczu.

Wyniki przedstawiono na fig. 7. Na rysunku ścieżka 4O odnosi się do zabarwionej błękitem Coomassie bezzrębowej hemoglobiny, a ścieżki 42, 44 i 46 dotyczą odpowiednio HbAo oczyszczonej sposobem według wynalazku, Hb WRAIR i Hb Sigma. Ścieżka 48 dotyczy testu przeciwciał przeciwko ludzkiemu osoczu dla bezzrębowej hemoglobiny, wykonanego metodą blottingu Westerna, a ścieżki 5O, 52 i 54 dotyczą odpowiednio HbAo oczyszczonej sposobem według wynalazku, Hb WRAIR i Hb Sigma.

W SFH wykryto znaczące ilości białek osocza. Natomiast tylko bardzo nikłe ślady ludzkiej albuminy surowiczej (HSA) wykryto w ścieżce produktu sposobu według wynalazku. Nie stwierdzono wykrywalnych ilości HSA w HbAo WRAIR, z tym że wykryto w niej liczne inne białka osocza powyżej i poniżej pasm HbAo. Wzorzec HbAo z Sigma zawiera liczne zanieczyszczenia białkowe, w tym HSA w znaczącym stężeniu.

179 525

Przykład 14. Badania ostrej hipowolemii u przytomnych szczurów

Zbadano działanie wazopresyjne produktu sposobu według wynalazku. Szczury SpragueDawley przypadkowo podzielono na grupy po 6 osobników (n=6) i aklimatyzowano przez 4 dni wykonując w tym czasie przewlekłe kaniulowanie z wykorzystaniem techniki Tbaty i Changa ⁽⁶⁾. Prawidłowo kaniulowanym zwierzętom podano dożylnie heparynę, 150 IU/kg. Jedną kaniulę tętniczą połączono z przetwornikiem ciśnienia Stratham w celu wykonania pomiarów ciśnienia krwi i częstotliwości akcji serca. Parametry te rejestrowano w sposób ciągły za pomocą rejestratora Grass polygraph. Po zarejestrowaniu ustabilizowanej linii podstawowej wywołano śmiertelny szok krwotoczny metoda Wiggersa obejmującą usunięcie 67% całkowitej objętości krwi przez inny cewnik tętniczy z szybkością 0,5 ml/minutę, w dwóch etapach. Natychmiast po wywołaniu szoku każdemu zwierzęciu podano z szybkością 0,5 ml/minutę badany materiał, to znaczy krew homologiczna, HbA0 otrzymana sposobem według wynalazku (HbA0) lub usieciowaną HbAo otrzymana sposobem według wynalazku poddaną reakcji z o-rafmozą jako środkiem sieciującym w sposób opisany we wspomnianym zgłoszeniu patentowym USA nr 08/231 945, z 21 kwietnia 1994 (objętość x 3). Średnie ciśnienie tętnicze (MAP) i częstość akcji serca rejestrowano w czasie do 30 minut od zakończenia infuzji. Każdego szczura ponownie umieszczono w odrębnej klatce rejestrując przez 14 dni wagę ciała, hematokryt i przeżycie.

Wyniki przedstawiono graficznie na fig. 8 w postaci wykresu MAP w funkcji czasu.

Wyniki te wykazują, że produkt sposobu według wynalazku stanowi wysoce oczyszczoną postać hemoglobiny A0, równie skuteczną jak pełna krew przy przywracaniu średniego ciśnienia tętniczego po szoku krwotocznym u modelowanych przytomnych szczurów. Nie obserwuje się różnic w przywracaniu ciśnienia tętniczego i częstości akcji serca między grupami, którym podawano pełną krew i HbA0.

Przykład 15. Efekty hemodynamiczne izowolemicznych transfuzji wymiennych u szczurów

Zbadano HbA0 otrzymaną sposobem według wynalazku w celu ustalenia efektów hemodynamicznych przy izowolemicznych transfuzjach wymiennych u przytomnych szczurów.

Zewnętrzna żyłę biodrową i tętnicę szczurów kaniulowano przez obszar udowy, patrz Keipert i Chang. 8⁸\ Po 24-godzinnym okresie regeneracji u przytomnych zwierząt wykonano ciągłe 50% izowolemiczne transfuzje wymienne. W czasie transfuzji wymiennej objętość krwi usuwanej przez tętnicę biodrową zastępowano badanym roztworem wprowadzanym przez żyłę biodrową z szybkością. 0,5 ml/minutę, za pomocą pompy infuzyjnej o stałym przepływie. W sposób ciągły śledzono ciśnienie krwi i częstość akcji serca: (1) przez 30 minut przed wymianą; (2) w czasie oraz (3) przez 2-3 godziny po wymianie.

Na podstawie zarejestrowanego ciśnienia krwi wyliczano średnie ciśnienie tętnicze i częstość akcji serca.

Jednej grupie szczurów (w liczbie 4) wykonano transfuzję ludzkiej albuminy surowiczej, HSA. W przypadku innej grupy szczurów (w liczbie 6) testowanym roztworem była bezzrębowa hemoglobina (SFH). W przypadku kolejnej grupy szczurów (w liczbie 8) testowany roztwór stanowiła HbA0 otrzymana sposobem według wynalazku.

Wyniki przedstawiono graficznie na fig. 9 i 9a.

W przypadku wszystkich testowanych roztworów średnie ciśnienie tętnicze podczas transfuzji wymiennej wzrosło o 10-20 mm Hg. W przypadku albuminowego roztworu kontrolnego średnie ciśnienie tętnicze obniżyło się o 15 mm Hg poniżej linii podstawowej w pozostałej części okresu rejestrowania po wymianie i pozostawało na obniżonym poziomie w całym okresie rejestrowania po wymianie, wynoszącym około 2,5 godziny (fig. 9). Obserwacje te są zgodne z wcześniej opublikowanymi obserwacjami Keiperta i Changa.⁽⁸⁾ W przypadku hemoglobiny bezzrębowej średnie ciśnienie tętnicze powróciło do linii podstawowej pod koniec okresu wymiany, ale wzrosło podczas okresu rejestrowania, po wymianie, osiągając maksimum, około 15 ram Hg powyżej linii podstawowej w ciągu; 30-40 minut po wymianie (fig. 9a).

Natomiast w przypadku HbA0 otrzymanej sposobem według wynalazku średnie ciśnienie tętnicze po wymianie powróciło do poziomu linii podstawowej i w czasie po wymianie wzrosło nie więcej niż o 5 mm Hg, tak że MAP utrzymało się w normalnych zakresach.

179 525

Wyniki tych badań wskazują, ze HbA0 otrzymane sposobem według wynalazku nie wykazuje silnego działania na naczynia krwionośne występującego przy transfuzji wymiennej z hemoglobiną bezzrębową

Przykład 16. Test hodowli tkankowej in vi?ro w celu sprawdzenia uszkodzeń utleniających w komórkach śródbłonkowych poddanych uprzednio działaniu preparatów hemoglobinowych.

Oceniono właściwości HbA0 otrzymanej sposobem według wynalazku mogące wywołać utleniające uszkodzenie komórek śródbłonkowych w hodowli. Uwalnianie dehydrogenazy mleczanowej do ośrodka jest oznaką, uszkodzenia komórek i cytotoksyczności.

Komórki śródbłonka z piersiowej aorty świńskiej hodowano do zlania, podzielono w stosunku 1:3 i hodowano w kolejnych pasażach. W okresie 48 godzin pasażu 7 komórki wykorzystano w doświadczeniu. Uszkodzenie komórek oceniano mierząc ilość dehydrogenazy mleczanowej uwolnionej z komórek do ośrodka. Przed dodaniem roztworów hemoglobiny ośrodek usunięto i komórki przemyto dwukrotnie roztworem soli buforowanym fosforanem. Komórki inkubowano z hemoglobinami (250 pM hem) w pełnym ośrodku EGM przez 6 lub 24 godziny w 37°C (n = 4-6). Same komórki inkubowane w pełnym ośrodku EGM stanowiły ujemne komórki kontrolne. Pod koniec okresu inkubacji z każdej hodowli usunięto po 50 pl ośrodka i oznaczono w nim aktywność dehydrogenazy mleczanowej wykonując test dehydrogenazy mleczanowej (Sigma). Aktywność dehydrogenazy mleczanowej w każdej studzience porównano z aktywnością dehydrogenazy mleczanowej uwolnionej z komórek po dodaniu 2% Triton’u X 100 (całkowite uwolnienie LDH) podając wynik jako procent całkowitego uwolnienia.

Po inkubowaniu przez 6 godzin zaobserwowano znaczny wzrost uwalniania dehydrogenazy mleczanowej w obecności hemoglobiny bezzrębowej SFH (74,4 ± 4,2%, p < 0,005). Podobny, choć mniejszy wzrost zaobserwowano w przypadku oczyszczonej hemoglobiny z Walter Reed Army Institute of Research. Nie zaobserwowano wzorstu w przypadku HbA0 oczyszczonej sposobem według wynalazku (39,8 ± 2,3%) w porównaniu z próbą kontrohną (37,5 ± 2,2%). Uwalnianie dehydrogenazy mleczanowej jeszcze bardziej wzrosło po 24 godzinach inkubowania w przypadku hemoglobiny bezzrębowej (99,6 ± 3,5%), podczas gdy nie zaobserwowano zmian w przypadku HbA0 otrzymanej sposobem według wynalazku (41,6 ± 4,6%) w porównaniu z próbą kontrolną (34,1 ±2,6%).

Inkubowanie hodowanych komórek śródbłonkowych z HbA0 wytworzoną sposobami według wynalazku nie przyczynia się do uwalniania aktywności dehydrogenazy mleczanowej będącej oznaką uszkodzenia komórek. W związku z tym cytotoksyczność w stosunku do hodowanych komórek śródbłonkowych nie stanowi wewnętrznej właściwości roztworów hemoglobiny, a oczyszczanie HbA0 usuwa składniki cytotoksyczne obecne w hemoglobinie bezzrębowej.

Przykład 17. Usuwanie aktywności powodującej krzepliwość

Oceniono produkt według wynalazku pod względem obecności czynników zwiększających krzepliwość krwi. Zastosowano metodę Biessls’a i innych.⁽⁹⁾

Świnki morskie uśpiono środkiem Hyponoim® i w tętnicę szyjną wstawiono kaniulę z silastiku. Po kaniulowaniu usunięto 30% objętości krwi (wliczonej jako 2% wagi ciała) i zastąpiono ją równą objętością badanego roztworu. Wykonano infuzję 1% roztworu ludzkiej albuminy z szybkością 2,5 ml/godzinę, aby utrzymać dostęp do kaniuli. Początek infuzji albuminy przyjęto jako początek doświadczenia. Fibrynopeptyd A (FPA), który, jak to ustalono, wytwarzany jest z fibrynogenu w wyniku krzepnięcia krwi, oznaczono przed i po infuzji Czynnika Xa (8-9 pg/kg), dawki, która sama nie powoduje krzepnięcia, Próbki krwi zbierano w przeciwkrzepliwej mieszaninie heparyny (1000 U/ml), Trasylolu (1000 U/ml) i cytrynianu sodu (3,8%), po czym rozdzielono je i osocze przechowywano w lodzie.

Próbki osocza poddawano obróbce w sposób opisany w odniesieniu do testu FPA metodą Leessma’y, 1984 ^{1 ;} i powstały FPA oznaczano metodą RIA opisaną przez Gerritsa ( ) Białka osocza wytrącano równą objętością 40% PEG 6000 w roztworze soli buforowanym fosforanem. Supernatant ogrzewano we wrzącej łaźni wodnej, odwirowano i przechowywano przed wykonaniem testu. Wyniki podano poniżej w tabeli 8.

179 525

Tabela 8

Badana próbka	Opis	AUC₁₀*
SFH	Szybki, przepijający wzrost FPA od 1,4 do 13,8 ± 3 ng/pl w ciągu pierwszych 10 minut, a aettapaią spadek do linii podstawowej po 40 minutach	87,6 ± 12
HSA	Wzrost FPA od linii podstawowej, 1,4 ng/pl do wielkości maksymalnej, 5,5 ± 1,5 ng/pl	45,7 ±8,2
HbA0	Wzrost FPA od linii podstawowej, 1,4 ng/pl do wielkości maksymalnej, 5,0 ±1,2 ng/pl	31,8 ±2,9

* Powierzchnia pod krzywą w pierwszych 10 minutach po prWeaiu cjęaniae Xa

Wyniki te wskazują, że produkt sposobu według wynalazku zasadniczo nie wykazuje działania zwiększającego krzepliwość krwi w porówadaiu z hemoglobiną bezz^bową. Uważa się, że takie działeaie zwiększające krzepliwość związane jest przede wszystkim z zenleczyszczeniem badanych roztworów lipidami i fosfolipidami.

Przykład 18. Ilościowe oznaczanie zanlączkszcjeń w postaci białek surowiczych technikami ELISA

Oznaczono ilość zeniączkszczeń w postaci białek surowiczych w produkcie hemoglobinowym oczyszczonym sposobem według wynalazku i porównano je z ilościami w innych dostępnych produktach hemoglobinowych, wykorzystując technikę tαadwiczowąELISA.

W przykładzie zastosowania technikę sandwiczową ELISA zgodnie z ogólnymi procedurami i technikami J.E. Butlera (12).

płytki microtltąr Dyaαtech o 96 1-ipp studzienkach powleczono zaadsorbowanępi na stałej fazie surowicy koziej króliczymi przeciwciałami przeciwludzkląj surowicy (Daco Corporation, Santa Barbara, CA, partia nr 072), po rozcieńczaniu 1:40 roztworem soli buforowanym Tris. Po iakubrwaniu przez 2 godziny w 37°C płytkę przemyto roztworem soli buforowanym Tris (TBS), a resztę wolnych miejsc na płytce zablokowano przez inkubowenie z hydrolizowaaą rybią żelatyną (Hipure Liquid Gelatin, Norlead Products Inc., New Bruaswlca,

N. J.). Po lakubowαaiu przez 1 godzinę płytkę przepyto TBS i dodano badane materiały stosując kolejne dwukrotne rozcieńczenia. Po iakubrwdalu przez 1 godzinę płytkę poaowalą przemyto TBS i inkubowano ze stałą fazą surowicy króliczej powleczoną kozimi przeciwciałami przeciw ludzkiej surowicy, frakcja IgG (Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, N.Y., partia nr H036) zawierająca 1% rybiej żelatoaę, w rozcieńczeniu 1:1000 w TBS. Po in^ubowaniu przez 1 godzinę płytkę przemyto TBS i lakubowaao z króliczym przeciwciałem przeciwkozim, oczyszczonym metodą chromatografii powinowactwa, frakcją IgG (saoalugoweaym z peroksydazą chrzanową HRP) (Biorad, partia nr 75312), w rozcieńczeniu 1:250 w TBS. Po laaubowaaiu przez 2 godziny płytkę przemyto TBS. Kompleks antygen-przeciweiało-I IRP uwidoczniono stosując dlchlorąa o-fenyląnodiemink (OPD - 26 mg/15ml kwasu cytrynowego, pH 5,0). Blado żółte zabarwienia wskazują na obecność antygenów, w szczególności białek surowiczych. Ich absorpcją zmierzono stosując cjktala Molecular Deyices Therpomax Micr^^te przy 390 nm.

Zbadano podwójne próbki zwykłej surowicy ludzkiej (Dlmąnslon Laboratories Inc., Mississauga, Ontario, partia nr; 20 30317), oczyszczonej HbA0 z Sigma Corporation (H0267), oczyszczonej HbA0 z Walter Reed Λπρο Resąarch Iastltutą (WRAIR) (partia nr 92092) i HbA0 oczyszczonej sposobem według wynalazku. Wyniki zestawiono w tabeli 9. W sposób oczywisty węniaa z niej, że produkt sposobu według wynalazku zawiera nie więcej niż

O, 0004% białek surowicznych, podczas gdy ince zbadane próbki zawierają je w ilości o co najmniej rząd wielkości wyższej.

179 525

Tabela 9

Próbka	Zawartość białka surowiczego (% w stosunku do Hb)	Białko surowicze, mg/ml roztworu
HbAe według wynalazku (8% roztwór całkowitej Hb)	0,0004%	0,000328 mg/ml
HbA0 z WRAIR (6,7 % roztwór całkowitej Hb)	0,0039%	0,00263 mg/ml
HbA0 z SIGMA (1,1% roztwór całkowitej Hb)	0,0029%	0,000328 mg/ml

We wszystkich przeprowadzonych testach jedynym białkiem surowiczym wykrytym w produkcie sposobu według wynalazku była ludzka albumina surowicza. Natomiast białka surowicze stwierdzone w innych, porównawczych produktach, okazały się niejednorodnymi mieszaninami zawierającymi HSA i inne białka surowicze.

LITERATURA

1. Hess et al. „Systemie & Pulmonary Hypertension After Resuscitation with Cell-Free Hemoglobin” 1993.

2. Chang et al., „Effect of Single Replacement...”, BIOMAT. Art Cells and Ommob. Biotech. 20(2-4), pp 503-510, (1992).

3. Simori et al., „Reaction of Human Endothelial Cells to Bovine Hemoglobin Solutions and Tumour Necrosis Factor”.

4. Huisman et al., „Studies on the Heterogeneity of Hemoglobins. IX - The Use of TrisHcl Buffers in the Anion-Exchange Chromatography of Hemoglobins”, J. Chromatog.. 19. 160-169,(1965).

5. Savavis and Zamcheck

6. Tabata and Chang, Artificial Organs, 6 213-214 (1982).

7. Wigger, C.J., „Physiology of Shock”, New York, The Common Fund, pp 138-139 (1950).

8. Keipert and Chang, „Effects of Partial...”, Vox. Sang 53. 7-14 (1987).

9. Biessels et al., Annual Report of the Karl Landsteiner Foundation, 1991.

10. Leeksma et al., Blood 67· 650-654,1986.

11. Gerrits et al., Thromb. Res 5· 197, 1974.

12. Butler, J.E., ELISA and other Solid Phase Immunoassays, edited by D.M. Kemeny and S.J. Challacombe, John Wiley and Sons Ltd, 1988, ppl-180.

179 525

FIG. 10

179 525

MAP (mmHg)

FIG. 9a

179 525

MAP (mmHg) uo 130 120-v no 100 90 -0

100 150 200

TIME (MIN)

CZAS (MIN)

FIG. 9

179 525

MEAN ARTERIAL PRESSURE(mmHg) ŚREDNIE CIŚNIENIE TĘTNICZE

TIME (MIN.) TIME (MIN·)

CZAS (MIN.) CZAS (MIN.)

MEAN ARTERIAL PRESSURE(mmHg) ŚREDNIE CIŚNIENIE TĘTNICZE

179 525

FIG. 7

179 525

FIG. 6

PL MARKERS

179 525

WZGLĘDNA GĘSTOŚĆ WZGLĘDNA GĘSTOŚĆ

RELATIYE DENSITY RELATIVE DENSITY

1.2 -i

0.8 0-6 0.4 0.2 CRUDE Hb IYSATE SUROWY LIZAT Hb

1.2

0.8 0.6

0.4 0.2 PURIFIED Hb Ao

OCZYSZCZONA Hb Ao

RELATIYE MIGRATION

WZGLĘDNA MIGRACJA

FIG. 5

TIME (M1NUTES)

CZAS (MINUTY) FIG, 4

1719525

Au 280 nm

TIME (MINUTES) CZAS (MINUTY)

FIG. 3

α ¹

Ί α

C3

C=>

α α

%

α α

C3 α

α α

α

FIG. 2Α

FIG. 2C

FIG. 2Β

179 525

N+R

FIG. 1B

★

A ★

A

A es

FIG. 1A

FIG. 1C co a

FIG.1D co * CS

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wydzielania hemoglobiny z surowego roztworu, zawierającego co najmniej 60% hemoglobiny i zanieczyszczenia w postaci substancji białkowych, metodą chromatografii, który obejmuje:

- pierwszy etap chromatograficzny, w którym wprowadza się surowy roztwór do kolumny chromatograficznej z liniową prędkością przypływu większą niż 10 cm na minutę i poddaje się go chromatografii (a) anionowymiennej przy pH 7-10 i przewodności poniżej 3 mS, w których to warunkach składniki surowego roztworu bardziej kwasowe niż hemoglobina wykazują wybiórcze powinowactwo wiązania lub (b) kationowymiennej przy pH 5-9 i przewodnictwie poniżej 3 mS, w których to warunkach z kolei składniki surowego roztworu bardziej zasadowe niż hemoglobina wykazują wybiórcze powinowactwo wiązania;

oraz drugi etap chromatograficzny, w którym eluat z pierwszego etapu zawierający hemoglobinę wprowadza się do kolumny chromatograficznej z liniowa pręd^<^i^<ciią przepływu nie większą niż 10 cm na minutę i poddaje się chromatografii w warunkach wymiany anionowej lub kationowej, tej, która nie została wybrana w pierwszym etapie, znamienny tym, że w pierwszym etapie surowy roztwór podaje się w sposób ciągły do kolumny chromatograficznej aż do całkowitego obciążenia kolumny hemoglobiną i składnikami o wyższym powinowactwie, po czym dalej prowadzi się zasilanie kolumny aż do jej przeciążenia i w konsekwencji wyrugowania z niej hemoglobiny, po czym podobnie w drugim etapie eluat z pierwszego etapu wprowadza się w sposób ciągły do kolumny aż do całkowitego jej obciążenia i dalej wprowadza się eluat aż do przeciążenia kolumny i wyrugowania z niej hemoglobiny.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pierwszy etap stanowi chromatografia anionowymienna, a drugi etap stanowi chromatografia kationowymienna.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się surowy roztwór zawierający zwykłą hemoglobinę dorosłego człowieka HbAn.
4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że pierwszy etap, wymianę anionową, przeprowadza się przy pH 8,5-9 stosując roztwór zasilający o niskim przewodnictwie, poniżej 1 mS.
5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stężenie roztworu zasilającego w pierwszym etapie chromatografii wynosi 0,1-20%.
6. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że drugi etap, wymianę kationową, przeprowadza się przy pH 6,5-8,5 stosując roztwór zasilający o niskim przewodnictwie, poniżej 3 mS.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że drugi etap, wymianę kationową, przeprowadza się przy pH 7-7,5 stosując roztwór zasilający o przewodnictwie poniżej 1 mS.
8. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stężenie roztworu zasilającego kolumnę kationowymienną w drugim etapie wynosi 2-7%.