PL181342B1 - Jednolancuchowe anty-EGFR Fv i przeciwciala anty-EGFR, czasteczka DNA, sposoby wytwarzania jednolancuchowego przeciwciala anty-EGFR i przeciwciala anty-EGFR oraz kompozycja farmaceutyczna PL PL PL PL PL PL PL - Google Patents

Abstract

1. Jednolancuchowy fragment Fv przeciwciala anty-EGF-R, otrzymywany z biblioteki fag-przeciwcialo konstruowanej z komórek immunizowanego ssaka, znamienny tym, ze lan- cuch lekki i lancuch ciezki zawiera sekwencje aminokwasowa wybrana z sekwencji oznaczo- nych jako SEQ ID nr 1 - SEQ nr 32,. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są nowe przeciwciała anty-EGFR i fragmenty przeciwciał, korzystnie jednołańcuchowe Fv (scFv), które można otrzymać z biblioteki fag-przeciwciało skonstruowanej z komórek immunizowanego ssaka, korzystnie myszy. Fragmenty przeciwciała izolowane z biblioteki fag-przeciwciało można poddać inżynierii w celu wytworzenia częściowo humanizowanych pełnych cząsteczek przeciwciała. Te chimeryczne przeciwciała anty-EGFR zawierają stałe regiony ludzkich immunoglobulin, i można je stosować, jak też ich fragmenty, jako środki do diagnozy i terapii ludzkich nowotworów.

Ponadto, wynalazek wykazuje, że biblioteki fag-przeciwciało są alternatywną i uniwersalna metodą wydzielania przeciwciał z immunizowanych ssaków w porównaniu ze standardową techniką hybry domową.

Ponadto przedmiotem wynalazku są kompozycje farmaceutyczne zawierające przeciwciała lub fragmenty do celów leczenia nowotworów takich jak melanoma, glioma lub karcynoma. Przeciwciała lub fragmenty można stosować także do diagnozy obejmującej odszukiwanie i potwierdzanie obecności nowotworu in vitro lub in vivo.

Opis zawiera klika technicznych terminów które zdefiniowano tutaj w następuj ący sposób:

„FRs” (regiony ramowe) oznaczają 4 subregiony zmiennych regionów lekkiego lub ciężkiego łańcucha, które niosą trzy CDR.

„CDRs” (regiony określające komplementamość) oznaczają trzy subregiony zmiennych regionów lekkiego lub ciężkiego łańcucha, które zawierają hiperzmienne sekwencje i tworzą struktury pętlowe odpowiedzialne głównie za bezpośredni kontakt z antygenem.

„Chimeryczne” lub częściowe humanizowane przeciwciała oznaczająprzeciwciała zawierające stałe regiony pochodzące ze źródeł takich jak człowiek i zmienne regiony (w tym CDRs) pochodzące ze źródeł innych niż człowiek, np. z myszy.

„Humanizowane” lub w pełni humanizowane przeciwciała oznaczają przeciwciała zawierające stałe regiony i FRs pochodzące ze źródeł takich jak człowiek, podczas gdy CDRs pochodzą że źródeł innych niż człowiek.

„EGF” i „EGFR” oznaczają czynnik wzrostu naskórka i jego receptor.

„PCR” oznacza polimerazową reakcję łańcuchową.

„scFv” oznacza jednołańcuchowe Fv, które jest fragmentem przeciwciała.

„V_L” oznacza zmienny region lekkiego łańcucha.

„V_K” oznacza zmienny region lekkiego łańcucha kappa.

„V_H” oznacza zmienny region ciężkiego łańcucha.

PBS oznacza solankę buforowaną fosforanem.

FCS oznacza płodową surowicę cielęcą.

HBSS oznacza zbilansowany roztwór soli Hanksa.

FITC oznacza izotiocyjanian fluoresceiny

MTC oznacza mieszaną hodowle komórkową

Czynnik wzrostu naskórka (EGF) j est hormonem polipeptydowym mitogenicznym dla komórek naskórka i nabłonka. Gdy EGF oddziaływuje z wrażliwymi komórkami, wiąże się z receptorami błony (EGFR). EGFR jest transbłonowy glikoproteiną około 170 kD i jest produktem genowym proto-onkogenu c-erb-B.

MAb 425 jest monoklonalnym mysim przeciwciałem wyhodowanym przeciwko dobrze znanej ludzkiej linii komórek raka A431 (ATCC CRL 1555), wiąże się z polipeptydowym epitopem zewnętrznej domeny ludzkiego EGFR i inhibituje wiązanie EGF. MAb 425 (ATCC HB 9629) okazał się mediować cytotoksyczność nowotworową in vitro i hamować wzrost komórek nowotworowych naskórkowych i odbytniczych rakowych linii komórek in vitro (Rodeck i in., Cancer Res. 1987. 47:3692). Humanizowaną i chimeryczną wersję MAb 425 opisano w publikacji WO 92/15683.

W kilku ostatnich latach opisano sposoby (Skerra i Plucthun, Science 1988,240; 1038; Better i in., Science 1988, 240:1041), przy pomocy których można wytworzyć funkcjonalne fragmenty przeciwciał w eukariotycznych komórkach gospodarzy, takich jak E. coli. Obejmują one fragment Fv i fragment Fab, przy czym fragment Fv jest szczególnie interesujący. Opisano także

181 342 jednołańcuchowe Fvs (w których łańcuchy V_L i V_H są związane) (Bird i in., Science 1988,242:423; Huston i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85: 5879).

Biblioteki fag-przeciwciało oferują alternatywną technikę do techniki hybrydomowej do wydzielania przeciwciała z immunizowanych zwierząt.

Technika hybrydomowa działa poprzez unieśmiertelnienie komórek wytwarzających przeciwciała. Technika fag-przeciwciało działa poprzez unieśmiertelnienie genów kodujących przeciwciała (Winter, G. i Milstein, C., Naturę 1991, 349: 293). W technice fag-przeciwciało geny zamiennego regionu ciężkiego przeciwciała (V_H) i zmiennego regionu lekkiego przeciwciała (V_L) wzmacnia się metodąPCR, zmienne regiony łączy się przypadkowo i poddaje ekspresji jako fragmenty przeciwciała na powierzchni cząsteczek faga, a biblioteki przeciwciał faga przesiewa się na przeciwciała wiążące się z interesującymi antygenami.

Technika hybrydomowa odniosła duże sukcesy w izolowaniu monoklonalnych przeciwciał myszy, gdy możliwa była silna odpowiedź immunologiczna w śledzionach zwierząt. Np. mysie MAbs wobec receptora ludzkiego czynnika wzrostu naskórka (EGFR) wyizolowano ze śledzion myszy immunizowanych dootrzewnowe ludzkimi nowotworowymi komórkami A431 (Murthy i in., Arch. Błochem. Biophys. 1987,252: 549). Potencjalna korzyść techniki fagprzeciwciało nad technikąhybrydomowąjest taka, że praktycznie można stosować jakiekolwiek źródło wydzielającej przeciwciało komórki jako substrat i że można szybko odsiać duże ilości różnych przeciwciał. Inną korzyścią z techniki fag-przeciwciało jest to, że geny kodujące zmienne regiony badanego przeciwciała już klonowano i nadająsię natychmiast do dalszych prac z zakresu inżynierii genetycznej.

W jednej z publikacji, fragment Fab antytężcowego toksoidu izolowany z biblioteki fagprzeciwciało przekształcono w pełną cząsteczkę przeciwciała (Bender i in., Hum. Antibod. Hybridomas 1993, 4. 74).

W ciągu ostatnich 10 lat, immunizację in vitro stosowano jako alternatywną technikę aktywnej immunizacji do wytwarzania monoklonalnego przeciwciała (mAbs) wobec wielu antygenów z ludzkich i mysich systemów (np. Vaux, D.J.T.; Helenius, A. i Mellman, L; Naturę, 1988, 336:36; Gathuru, J. K. i in.; J. Immunol. Methods, 1991,137:95; Borrebaeck, C.A.K.; Immunol. Today, 1988, 9:355). Korzyści tego podejścia są takie, że wymaga ono tylko niewielkich ilości antygenu i że sposób nadaje się do wytwarzania ludzkich hybrydom. Jednak wytwarzanie przeciwciała IgM o słabym powinowactwie i trudności z unieśmiertelnieniem ludzkich limfocytów po immunizacji in vitro stały się uporczywymi trudnościami związanymi z tą techniką.

Nowy sposób otrzymywania przeciwciał to wzmacnianie PCR repertuaru genów zmiennego regionu ciężkiego (V_H) i lekkiego (V_L) łańcucha, które poddaje się następnie przypadkowej rekombinacji i poddaje ekspresji jako biblioteki prezentacji faga (7-9). Geny zmiennego regionu przeciwciała klonowano i sklejano z małym białkiem powłokowym (gen 3) jako pojedynczołańcuchowy fragment Fv (scFv) (10). Cząstka faga z umieszczonym na swej powierzchni fragmentem przeciwciała może być wybrana, metodą panoramowania wykorzystując właściwości wiązania przeciwciała. W tej technice korzystnie .przypadkowa rekombinacja genów V może wytworzyć nowe pary o nowej specyficzności i powinowactwach, których nie można wybrać w naturalnych procesach. Ponadto takie podejście pozwala na zastosowanie naiwnych lub immunizowanych in vitro limfocytów z mysich lub ludzkich źródeł.

Dotychczasowe wysiłki wytworzenia mAbs wobec EGFR z immunizacji mysich komórek B in vitro i technika hybrydomowa dały przeciwciała o niskim powinowactwie i reagujące krzyżowo. W celu przezwyciężenia tych trudności prowadzono proces będący połączeniem immunizacji in vitro i następnie techniki klonowania PCR.

Przedmiotem wynalazku jest opracowanie przeciwciała i fragmentów przeciwciał o dużym powinowactwie do receptora EGF, które można otrzymać w korzystnej procedurze opisanej powyżej i poniżej. .

Wynalazek porównuje przeciwciała mysie anty-EGFR izolowane z trzech różnych bibliotek fag-przeciwciało z mysim MAb (425) izolowanym standardową techniką hybrydomową (Murthy i in., Arch. Biochem. Biophys. 1987,252:549; Kettleboroughi in., Protein Eng. 1991,4:773).

181 342

Biblioteki wytworzono nie tylko ze śledziony immunizowanej myszy, ale także z drenowanego węzła limfatycznego immunizowanej myszy i z mysiej komórki immunizowanej in vitro. Dwa z jednołańcuchowych Fvs (scFvs) izolowano z biblioteki i poddano procedurom inżynierii genetycznej w celu wytworzenia chimerycznego pełnego przeciwciała ze zmiennych regionów myszy złączonych z ludzkimi regionami stałymi.

Szczegółowo przedmiotem wynalazku jest jednołańcuchowe Fv anty-EGFR otrzymywane z biblioteki fag-przeciwciało skonstruowanej z komórki, korzystnie śledziony lub drenowanego węzła limfatycznego immunizowanego ssaka, korzystnie myszy, lub z in vitro immunizowanej komórki. W zasadzie wynalazek nie ogranicza się do scFvs, ale rozciąga także na inne fragmenty przeciwciał anty-EGFR, takie jak Fab lub F^b^.

Niektóre scFvs według wynalazku majądobrze zdefiniowane sekwencje DNA i aminokwasowe. Tak więc przedmiotem wynalazku jest jednołańcuchowy fragment Fv, w którym zmienne regiony ciężkiego i lekkiego łańcucha składają się z sekwencji DNA i/lub aminokwasów wybranej sekwencji ciężkiego lub lekkiego łańcucha podanej jako sekwencje 1- 32, korzystnie na fig. 5-8.

Ponieważ w wielu przypadkach tylko w pełni funkcjonalne, pełne przeciwciała można stosować do celów diagnostycznych i terapeutycznych, celem wynalazku jest związanie zmiennego regionu z jednołańcuchowym Fvs ze stałych regionów ludzkiej immunoglobuliny z wytworzeniem pełnego, częściowego lub humanizowanego przeciwciała anty-EGFR.

Tak więc, przedmiotem wynalazku jest pełne anty-EGFR przeciwciało skonstruowane z sekwencji DNA pochodzących z fragmentów przeciwciał zdefiniowanych powyżej, poniżej lub w zastrzeżeniach, i z sekwencji DNA pochodzących ze stałych regionów ludzkich immunogobulin, w którym, w korzystnej odmianie, ciężki łańcuch zawiera łańcucha gamma-1, a lekki sekwencję aminokwasową łańcucha kappa.

Zgodnie z wynalazkiem scFvs anty-EGFR izoluje się stosując technikę biblioteki fag-przeciwciało. Tak więc przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania jednołańcuchowych Fv anty-EGFR obejmujący następujące etapy:

(i) wydziela się RNA z komórki immunizowanego ssaka, korzystnie mysiej komórki,, (ia) syntetyzuje się pierwszą nić cDNA, (iii) wzmacnia się geny V_H i V_K w cDNA z immunizowanych komórek, (iv) klonuje się geny wraz z odpowiednimi miejscami restrykcji w fagemidowy wektor, (v) transformuje się prokariotyczne komórki mieszaninami ligującymi, (vi) przesiewa się biblioteki fagowe na przeciwciała fagowe skierowane na EGFR sto- sując oczyszczony EGFR, oraz (vii) wytwarza się żądane jednołańcuchowe Fv w prokariotycznych komórkach gospodarzy, korzystnie E. coli.

Ponadto, przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania pełnego przeciwciała anty-EGFR metodą klonowania DNA kodującego zmienne regiony fragmentu przeciwciała EGFR wytworzonego jak podano powyżej lub zdefiniowano w zastrzeżeniach do co najmniej jednego eukariotycznego wektora ekspresji zawierającego genomowy DNA kodujący stałe regiony ludzkich immunoglobulin, transformacji eukariotycznej komórki z wektora i ekspresji oraz wydzielenia przeciwciała.

Anty-EGFR scFvs, i nade wszystko pełne przeciwciała anty-EGFR można stosować w diagnostyce i terapii ludzkich nowotworów.

Tak więc przedmiotem wynalazku jest farmaceutyczna kompozycja zawierająca jednołańcuchowy anty-EGFR Fv lub pełne przeciwciało anty-EGFR jak zdefiniowano powyżej lub w zastrzeżeniach.

Wyniki i korzyści płynące z niniejszego wynalazku można podsumować jak następuje:

Nowe mysie przeciwciała anty-EGFR izolowano z biblioteki fag-przeciwciało. Nowe przeciwciała reprezentowały co najmniej cztery różne podgrupy V_H i cztery różne podgrupy V_K (Kabat i in., Seąuences of proteins of immunological interest. 5 wyd. U.S. Dept. of Health and Humań Services, Bethesda 1991). Wykazywały różne sparowanie, a ich sekwencje zastosowane przez mysie MAb izolowano stosując technikę hybrydomową. Mysie 425 MAb miało sparowa

181 342 nie V_H2b i V_k4 me zaobserwowane w przeciwciałach faga. V_H scFv L3 11D miało naj wyższąprocentowąidentyczność z 425 V_H (84,9%). Większość różnic występowała w CDR. V_k scFv S4 2D miało naj wyższąprocentową identyczność z 425 V_k (83,2%). Ponownie większość różnic występowała w CDR, szczególnie CDR3. W wynalazku wiele nowych przeciwciał anty-EGFR izolowano z biblioteki fag-przeciwciało i te przeciwciała wszystkie różnią się od 425 MAb co najmniej dwoma scFvs rozpoznając różny epitop na EGFR od rozpoznawanego przez 425 MAb, w przeciwieństwie do poprzednich doniesień, według których przeciwciała izolowane z kombinatorycznej biblioteki były bardzo podobne do izolowanych techniką hybrydomową (Caton i Koprowski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990, 87: 6450).

Z tych trzech bibliotek fag-przeciwciało, naj lepszą biblioteką w kategoriach liczby etapów selekcji wymaganych do osiągnięcia przeciwciała o wysokim powinowactwie i w kategoriach różnorodności izolowanych przeciwciał o wysokim powinowactwie była biblioteka generowana z drenującego węzła limfatycznego. Węzły limfatyczne wybrano jako źródło RNA do konstrukcji biblioteki fag-przeciwciało z dwu powodów. Po pierwsze poprzednie prace wykazały, że większą ilość komórek B wytwarzających przeciwciała IgG o wysokim powinowactwie otrzymano z podkolanowych węzłów limfatycznych po immunizacji przez stopę, niż ze śledzion po immunizacji via otrzewna (Venn i Dresser, J. Immunoł. Methods 1987,102: 95). Po drugie drenujące węzły limfatyczne są uważane za dobre źródło wydzielania ludzkich przeciwciał przeciwnowotworowych. Tak więc wydzielanie mysich przeciwciał anty-EGFR z podkolanowego węzła limfatycznego immunizowanej w stopę myszy było modelem wydzielania ludzkich przeciwciał anty-EGFR z pomocniczych węzłów limfatycznych pacjenta z rakiem piersi. Wykazano tak możliwość wytworzenia biblioteki o dużych rozmiarach z małych ilości materiału z węzła limfatycznego i izolacji przeciwciał o wysokim powinowactwie z biblioteki.

Chociaż mysie przeciwciała anty-EGFR były izolowane ze wszystkich trzech bibliotek fag-przeciwciało, niewiadomo, czy którekolwiek z nowo izolowanych przeciwciał ma wyższe powinowactwo od mysiego 425 MAb izolowanego techniką hybrydomową. W początkowych badaniach, scFv z biblioteki fag-przeciwciało wydawał się wiązać z EGFR lepiej niż scFv skonstruowane z 425 MAb (fig. 2). W innych eksperymentach z chimerycznymi pełnymi cząsteczkami przeciwciał, jedno z chimerycznych przeciwciał (S4 2D) wykazało powinowactwo z EGFR równe powinowactwu chimerycznego przeciwciała 425. Drugie chimeryczne przeciwciało (L3 1 ID) miało powinowactwo czterokrotnie niższe niż powinowactwo chimerycznego przeciwciała 425 (Fig. 4). Dane o wiązaniu otrzymane przy stosowaniu scFv były zapewne mylące, ponieważ preparaty scFv mogą zawierać mieszaniny monomerów i dimerów (Griffiths i in., EMBO J. 1993,12:725). W przeciwieństwie do tego, chimeryczne przeciwciała IgG nie powinny tworzyć dimerów i pokazano, że chimeryczne przeciwciała L3 1 ID i S4 2D mająrozmiary spodziewane dla dwuwartościowego, monomerycznego chimerycznego przeciwciała IgG. Analiza powinowactwa oczyszczonych preparatów 425, scFv L3 1 ID i S4 2D wykazała jednak, że te preparaty scFv zawierają monomeryczne, dimeryczne i inne multimeryczne formy. W dodatku względne proporcje monomerycznych i multimerycznych form wahają się dla każdego scFv. scFv 425 miał najniższy procent form dimerycznych. Jak można się było spodziewać, dimeryczne i szczególnie większe multimeryczne formy wykazały silniejsze wiązanie do oczyszczony EGFR niż monomeryczne. Okazuje się, że scFv 425 wykazuje słabszą tendencję do dimeryzacji niż niektóre nowo izolowane scFv.

Chociaż ekspresja fragmentów przeciwciał na powierzchni cząsteczek faga jest podstawą potężnej metody szybkiej selekcji przeciwciał z żądaną specyficznością ani przeciwciała faga, ani same fragmenty przeciwciał (scFv lub Fab) nie sąpożądanym produktem końcowym. Ponadto pokazano, jak mysie scFv izolowane fagowej biblioteki można łatwo przekształcić w cząsteczki pełnego przeciwciała. W tym przypadku mysie zmienne regiony połączono z ludzkimi stałymi regionami w celu wytworzenia częściowo humanizowango chimerycznego przeciwciała.

Te wyniki pokazują że jest możliwe stosowanie techniki fag-przeciwciało do wydzielania różnorodnych fragmentów przeciwciał anty-EGFR z immunizowanych myszy. Cząsteczkę pełnego przeciwciała z żądanymi stałymi regionami można następnie skonstruować z fragmentów przeciwciał. W pewnych przypadkach technika hybrydomową może nadal być sposobem z

181 342 wyboru wydzielania monoklonalnych przeciwciał z myszy. Jeśli dostępny jest wysoce immunogenny antygen i jeśli jest kilka odpowiednich hybrydomowych linii komórek wytwarzających jedno lub kilka różnych anty-antygenowych przeciwciał, jest mało powodów do rozważania techniki fag-przeciwciało. Jeśli jednak specjalne protokoły immunizacji, takie jak zastrzyki w stopę, będą korzystne przy wytwarzaniu przeciwciał o wysokim powinowactwie, lub jeśli wymagana jest większa liczba przeciwciał wobec różnorodnych epitopów na antygenie, lub jeśli potrzebne są przeciwciała skierowane wobec bardzo nieciągłego i ewentualnie mniej immunogennego epitopu, wówczas technika fag-przeciwciało może być sposobem z wyboru. Także jeśli przewiduje się dalszą przeróbkę genetyczną przeciwciała, technika fag-przeciwciał jest korzystna, ponieważ geny przeciwciała są już sklonowane.

Takie podejście łączenia immunizacji in vitro cząstkowym antygenem i technika klonowania PCR pozwala na wytworzenie fragmentów scFv, które reagowały z EGFR i nie reagowały krzyżowo z innymi antygenami. Podany tu protokół immunizacji zależy od prezentacji antygenu, który nie jest rozpuszczalny, ale stanowi preparat pęcherzyka błony w pożywce hodowli pozbawionej FCS. Obie metodologie opisano jako środki zwiększenia skuteczności immunizacji in vitro dzięki udostępnieniu antygenu prezentującym antygenem komórkom (np. Brams, P. i in.; J. Immunol. Methods, 1987, 98:11).

Wyniki otrzymane z MTC zgadzają się z poprzednimi pracami (np. Borrebaeck, C A.K. i Moeller, S.A.; J. Immunol., 1986,136: 3710; Moeller, S.A. i Borrebaeck, C.A.K, w Borrebaeck, C.A.K. (wyd.), In Witro Immunization in Hybridoma Technology, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam 1988, str. 3.), które proponują stosowanie supermatantów MTC jako źródła limfokm do polepszenia immunizacji in vitro. Preparat pęcherzyka błony powinien być uważany za poliantygen, ponieważ wiele różnych antygenowych determinantów mieści się w takich pęcherzykach. Z tego powodu wydaje się, że indukująone pewien poziom aktywacji poliklonalnej. Zostało to wykluczone, ponieważ specyficzna odpowiedź anty-EGFR była wyraźnie różna od odpowiedzi otrzymanej po standardowej poliklonalnej aktywacji.

Zamiast unieśmiertelnienia komórki B po immunizacjach in vitro, zastosowano molekularną strategię unieśmiertelnienia genów przeciwciała V_H i V_L. Te monoklonalne fragmenty przeciwciał poddano ekspresji i wytwarzano w bakteriach. Układ wyjawiania faga jest potężnym sposobem wydzielania fragmentów przeciwciał wobec specyficznych antygenów. Obecność kodonu stopu pomiędzy fragmentem przeciwciała i białkiem powłoki g3p pozwala na przełączenie pomiędzy wyjawianiem powierzchniowym i sekrecjąjako rozpuszczalny fragment scFv przez stosowanie supresorowych lub niesupresorowych szczepów (Hoogenboom i in., Nuci. Acids Res. 1991, 19: 4133).

Dzięki wzrostowi specyficznych odpowiedzi i poziomów mRNA w stymulowanych antygenem in vitro komórkach B, immunizacja in vitro daje wkład do wydzielania fragmentów przeciwciał o wysokiej specyficzności do antygenu. Po dwu rundach selekcji 100% klonów reagowało pozytwnie na wiązanie EGFR. W przeciwieństwie do tego, klony pochodzące z procesów immunizacji in vivo reagowały w 100% pozytywnie tylko po czterech rundach selekcji (Kettleborough, i m., EP 94104160 i Eur. J. Immunol. 1994,24: 952).

Stosowanie biblioteki ujawniania faga z naiwnych genów przeciwciała może pozwolić na wytwarzanie specyficznych ludzkich fragmentów przeciwciał bez immunizacji lub po immunizacji in vitro. Fragmenty przeciwciał można wytwarzać bezpośrednio w bakterii, a więc w prosty, szybki i ekonomiczny sposób.

Materiały biologiczne i ogólne sposoby

Mikroorganizmy, linie komórek, plazmidy fagemidy, promotory, znaczniki oporności, początki replikacji lub inne fragmenty wektorów, które są wspomniane w zgłoszeniu, są handlowo lub inaczej ogólnie dostępne. Jeśli w zgłoszeniu nie powiedziano inaczej, stosuje się je tylko przykładowo i nie są one istotne według wynalazku, i można je zastąpić innymi odpowiednimi narzędziami i biologicznymi materiałami.

Bakterie-gospodarze stosuje się korzystnie do klonowania scFv i do wytwarzania białek scFv. Przykłady tych gospodarzy to: E. coli lub Bacillus.

181 342

Eukariotyczni gospodarze jak np. COS, CHO lub drożdże, są korzystne w celu wytwarzania pełnego antyprzeciwciała EGFR według wynalazku.

Techniki istotne dla wynalazku opisano szczegółowo w opisie. Inne techniki, nie opisane szczegółowo odpowiadają znanym standardowym sposobom, które są dobrze znane fachowcowi, lub są opisane bardziej szczegółowo w cytowanych odnośnikach i zgłoszeniach patentowych oraz standardowej literaturze.

Krótki opis rysunków:

Figura 1. Aminokwasowe sekwencje scFv izolowane z biblioteki fag-przeciwciało. (A) scFv z biblioteki z węzła limfatycznego. (B) scFv z biblioteki ze śledziony. Określające komplementamość regiony (CDR) i regiony ramki (FR) zaznaczono.

Figura 2. Wiązanie scFv do EGFR. Oceniano stężenia scFv w bakteryjnych supematantach i scFv przetestowano metodą ELISA na wiązanie z oczyszczonym EGFR. (A) scFv z biblioteki z węzła limfatycznego. (B) scFv z biblioteki ze śledziony. Pl (kontrola pozytywna) to scFv pochodzące z Mab 425. LI i SI (kontrole pozytywne) są niewiążącymi scFv ze wstępnie wybranej biblioteki z węzła limfatycznego i śledziony.

Figura 3. Pośrednie wektory stosowane do rekonstrukcji zmiennych regionów do ekspresji w komórkach ssaka. (A) wektor V_H. (B) wektor V_K.

Figura 4. Wiązanie chimerycznego pełnego przeciwciała do EGFR. Stężenia przeciwciał w supematantach komórek COS określono metodą ELISA i przeciwciała przetestowano metodą ELISA na wiązanie z oczyszczonym EGFR.

Figura 5. DNA i aminokwasowa sekwencja scFv nr L2 11C (A): lekkiego łańcucha; (B): ciężkiego łańcucha.

Pozycje aminokwasowe:

(A)	FR-1: 1-23,	CDR-1: 24-34,
	FR-2: 35-49,	CDR-2: 50-56,
	FR-3: 57-88,	CDR-3: 89-97,
	FR-4: 98-109.
(B)	FR-1: 1-30,	CDR-1: 31-35,
	FR-2: 36-49,	CDR-2: 50-66,
	FR-3: 67-98,	CDR-3: 99-108,
	FR-4: 109-119

Figura 6. DNA i aminokwasowa sekwencja scFv nr L2 12B (A): lekkiego łańcucha; (B): ciężkiego łańcucha.

Pozycje aminokwasowe:

(A)	FR-1: 1-23,	CDR-1:24-38,
	FR-2: 39-49,	CDR-2: 50-56,
	FR-3: 57-88,	CDR-3: 89-97,
	FR-4: 98-109.
(B)	FR-1: 1-30,	CDR-1: 31-35,
	FR-2: 36-49,	CDR-2: 50-66,
	FR-3: 67-98,	CDR-3: 99-108,
	FR-4: 109-119

Figura 7. DNA i aminokwasowa sekwencja scFv nr L3 12B. (A): lekkiego łańcucha; (B): ciężkiego łańcucha.

Pozycje aminokwasowe FR i CDR odpowiadają tym podanym na fig. 6.

Figura 8. DNA i aminokwasowa sekwencja scFv nr S4 2D (A): lekkiego łańcucha; (B): ciężkiego łańcucha.

Pozycje aminokwasowe:

(A) FR-1: 1-23, CDR-1:24-34,

FR-2: 35-49, CDR-2: 50-57,

FR-3: 58-89, CDR-3: 90-98,

FR-4: 99-110.

181 342 (B) FR-1: 1-30, CDR-1:31-35,

FR-2: 36-49, CDR-2: 50-66,

FR-3: 67-98, CDR-3: 99-107,

FR-4: 108-118

Sekwencje z fig. 5-8 podano także w załączonych listingach sekwencji, które są częścią opisu wynalazku.

Szczegółowy opis wynalazku (1) Konstrukcja i przesiewanie biblioteki fag-przeciwciało

Skonstruowano trzy biblioteki fag-przeciwciało, jedną ze śledziony myszy immunizowanej ludzką linią komórek raka A431 (8,8xl0⁵ komórek), jedną z podkolanowego węzła limfatycznego myszy immunizowanej w stopę z oczyszczonego EGFR (6,5x10⁶ komórek), i jedną z mysich limfocytów immunizowanych in vitro pęcherzykami A431 (Ι,ΙχΙΟ⁵ komórek), szczegóły konstrukcji pęcherzyków A431 i immunizacj i in vitro podano w przykładach 1,2). Przed selekcją zanalizowano co najmniej 46 klonów z każdej biblioteki metodą fingerprintingu BstNI. (Clackson i in., Naturę 1991,352: 624) w celu określenia rozmaitości repertuarów. Zaobserwowano szeroki zakres wzorców fermentacji. Także przed selekcjąscFvs z 96 klonów z każdej biblioteki przetestowano metodą ELISA na wiązanie z EGFR. Żadne z scFv z bibliotek ze śledziony i węzła hmfatycznego nie wiązało się z EGFR. Jedno z scFv z biblioteki immunizowanej in vitro wiązało się z EGFR. Po jednej rundzie selekcji, stosując immunoprobówki powlekane EGFR, zaobserwowano wyraźne wzbogacenie we wiążące się z EGFR scFv z biblioteki z węzła limfatycznego i z biblioteki immunizowanej in vitro. Druga runda selekcji była konieczna przed wykryciem jakichkolwiek wiążących się z FGFR scFv z biblioteki ze śledziony. Po trzeciej rundzie selekcji, większość scFv z biblioteki z węzła limfatycznego i z biblioteki immunizowanej in vitro dała wyniki pozytywne wiązania z EGFR. Po czwartej rundzie selekcji z biblioteką ze śledziony większość scFv dała wynik pozytywny wiązania z EGFR (tabela 1)

Tabela 1

Procent klonów wiążących EGFR po każdej rundzie selekcji

	Biblioteka z węzła limfatycznego	Biblioteka ze śledziony	Biblioteka komórek immunizowanych m vitro
Preselekcja	0	0	1
Pierwsza runda	77	0	84
Druga runda	86	26	100
Trzecia runda	90	77	100
Czwarta runda	bez testu	97	bez testu

(2) Analiza sekwencji klonów wiążących EGFR

Po każdej rundzie selekcji inserty scFv z klonów wiążących EGFR zanalizowano metodą fingerprintingu BstNI (Clackson i in., Naturę 1991,352:624). Okazało się, że nastąpiło wzbogacenie dla pewnych wzorów fermentacji. Klony z różnych fingerprintingów BstNI wybrano z drugiej i trzeciej rundy selekcji biblioteki z węzła limfatycznego i z trzeciej i czwartej rundy selekcji biblioteki ze śledziony na sekwencjonowanie DNA of V_H i V_K. Klony z późniejszych rund selekcji zanalizowano, ponieważ spodziewano się przeciwciał o wyższym powinowactwie przeciwciała w późniejszych rundach (Clackson i m., Naturę 1991, 352: 624). 16 klonów z biblioteki z węzła hmfatycznego sekwencjonowano i otrzymano 6 różnych scFv (fig. 1). 5 z nich było parami unikalnych V_H i V_K. 6 było odmianami wcześniej występujących V_H z 6 zmianami aminokwasowymi, z których 5 było w regionie ramki (FR) 1. Dwie ze zmian można przypisać stosowaniu zdegenerowanego primera VH1BACKSFI (Hoogenboom i in., Nuci. Acids Res. 1991,19:4133). Inne mogą być wynikiem błędów PCR. V_H sklasyfikowano w dwie podgrupy, V_H2b i V_H3d, pod

181 342 czas gdy V_K trafiły w cztery podgrupy, V_K3, V_K4, V_K5 i V_K6 (Kabat i in., Seąuences of proteins of immunological interest, 5 wyd., U.S. Dept. of Helth and Humań Services, Bethesda 1991). Te indywidualne klony z biblioteki ze śledziony sekwencjonowano i znaleziono cztery różne scFv. Trzy z nich były parami unikalnych V_H i V_K, a czwarte było podobne do jednej z poprzednich par z tylko dwoma różnicami aminokwasowymi w V_H, z których jedna wystąpiła w regionie determinującym komplementamość (CDR) 2 i dwie w V_K. Klasyfikacja w podgrupy odkryła V_H z podgrupy V_H2a, V_h2c i V_H3d i V_K z podgrupy V_K3 i V_K4. Porównanie scFv otrzymanych z bibliotek z węzła limfatycznego i śledziony wykazało, że tylko jeden scFv był wspólny dla obu bibliotek, scFv L3 10A/scFv S4 10H (fig. 1). Klon ten wydawał się wiązać silnie z EGFR w teście metodą ELISA. Choć postarano się wyeliminować wszelkie zanieczyszczenia pomiędzy bibliotekami, trudne jest wykluczenie niewielkich zanieczyszczeń dla silnie wiążącego EGFR klonu. Jednak, uwzględniając wsobnąnaturę myszy Balb/c, jest możliwe, że takie same scFv powstały niezależnie z dwu różnych bibliotek.

(3) Analiza powinowactwa i specyficzności wiązania z EGFR

W oparciu o dobre wiązanie z antygenem i różnorodność w sekwencjach DNA, kilka scFv pochodzących biblioteki z węzła limfatycznego i śledziony wybrano dla dalszej analizy. Te scFv zanalizowano metodąELISA na wiązanie z oczyszczonym EGFR, wiązanie z obcymi antygenami i wiązanie z nowotworowymi liniami komórek dającymi lub nie dającymi ekspresji EGFR. Jako pozytywną kontrolę, wytworzono scFv z mysiego 425 MAb (Pl). Jako negatywne kontrole wytworzono scFv z przeciwciała faga izolowane z biblioteki z węzła limfatycznego i śledziony przed selekcją (odpowiednio L1 i S1). Stężenie scFv określono porównując rozcieńczenia badanego scFvs z rozcieńczenia oczyszczonego scFv o znanym stężeniu metodą analizy Western.

scFv przetestowano metodą ELISA na wiązanie z oczyszczonym EGFR i wyniki wykreślono (fig. 2). Możliwe było uszeregowanie scFv pod względem ich wiązania z EGFR. Uszeregowania te powtarzały się pomiędzy eksperymentami. scFvs wiążącymi się najsilniej z EGFR były L2 1C i L3 10A z biblioteki z węzła limfatycznego i S4 1 OH z biblioteki ze śledziony. Jak opisano powyżej, scFv L3 10A i S4 10H mająte same sekwencje DNA. scFv (S4 5 A), bardzo podobne do scFv S4 10H, z dwoma aminokwasowymi różnicami w V_H i dwoma w V_k, spójnie dawało niższą ocenę niż S4 10H. W przeciwieństwie do tego, różnice w sekwencjach obserwowane pomiędzy L2 12B i L3 1 ID nie zdawały się mieć głębszego wpływu na wiązanie. Z izolowanych scFv tylko dwa, L2 8C i L2 11C, wydawały się wiązać słabiej niż scFv 425.

scFv przetestowano metodąELISA na wiązanie z plastykiem i z zestawem nie spokrewnionych białek (albumina jaja, lizozym jaja kurzego, cytochrom c, dehydrogeneza 3-fosforanu gliceraldehydu, albumina CBA i BSA). Żadne z scFv nie dało sygnału powyżej tła.

scFv przetestowano metodą ELISA na wiązanie z trzema nowotworowymi liniami komórek. Linia komórek A431 i MDA MB 468 jest niosącymi EGFR nowotworowymi komórkami izolowanymi odpowiednio ze sromu i piersi. Linia komórek SK-MEL-23 jest niosącymi gangliozyd melanomowymi liniami komórek, dołączonymi jako negatywna kontrola. Z 10 testowych scFv tylko cztery wiązały się z oczyszczonym EGFR i niosącymi EGFR nowotworowymi komórkami (L2 12B, L3 11D, L2 11C i S4 2D, fig. 5-8). Nie wykryto wiązania z komórkami SK-MEL-23. Istnieje kilka możliwych wyjaśnień tego zaskakującego wyniku. Jednym z nich może być to, że EGFR użyte do immunizacji, selekcji i testu ELISA wydzielało związane z EGFR białko (Weber i in., Science 1984,224-294). Białko to ma dodatkowe 17 aminokwasów na końcuC(Guntheriin., J. Biol. Chem. 1990,265:22082). scFvs przetestowano metodąELISA na wiązanie do tego 17-aminokwasowego peptydu i nie zaobserwowano wiązania. Jest możliwe, że wydzielane związane z EGFR białko i EGFR na powierzchni komórki nowotworowej wykazują różnice w konformacji lub glikolizacji.

W celu dalszego zbadania wiązania z nowotworowymi komórkami, trzy scFv (L2 11 A, L3 11D i S4 2D) oczyszczono i analizowano na wiązanie z nowotworowymi komórkami A431 metodą cytometni przepływowej. scFv 425 zastosowano jako pozytywną kontrolę. Z trzech testowanych scFv tylko L3 1 ID i S4 2D wiązały się z komórkami A431. Te dwa scFv miały podobne profile wiązań, jak scFv 425.

181 342

Oczyszczone scFv wytworzone z dwu izolatów, które wiązały się z RGFR i niosącymi EGFR nowotworowymi komórkami (L3 1 ID i S4 2D) przetestowano w teście kompetytywnego wiązania z mysim Mab 425. Podczas gdy oczyszczony 425 scFv był w stanie inhibitować mysi MAb 425 od wiązania z EGFR w danym zakresie stężeń, scFvs L3 1 ID i S4 2D nie inhibitowały mysiego Mab 425 od wiązania z EGFR w tych stężeniach. Oba scFv wydają się rozpoznawać epitop na EGFR, który jest różny od rozpoznawanego przez mysi Mab 425.

(4) Chimeryczne pełne przeciwciała pochodzące z scFv.

Dwa scFv (L3 11D i S4 2D) wybrano do konwersji w cząsteczkę pełnego przeciwciała. Kod DNA dla mysiego V_H i V_K klonowano w pośrednie wektory zawierające sekwencje DNA kodujące immunoglobulinowe sekwencje wiodące i sygnały donora rozszczepienia (fig. 3). Pozycja miejsc klonowania w pośrednim wektorze V_H oznacza, że pierwsza reszta V_H zmieniła się z kwasu aspartowego w kwas glutamowy. Z pośrednich wektorów fragmenty DNA zawierające V_H ¹V_K, teraz połączone z sekwencjami wiodącymi i sygnałami donora rozszczepienia klonowano w wektory ekspresji komórek ssaka zawierające kod DNA albo dla stałego regionu ludzkiego gamma-1 lub ludzkiego kappa (Maeda i in., Hum. Antibod. Hybridomas 1991,2:124). Dla każdego chimerycznego przeciwciała, wektory ekspresji ciężkiego łańcucha i lekkiego łańcucha kotransfekowano w komórki COS. Jako pozytywną kontrolę komórki kotransfekowano także wektorami ekspresji ciężkiego i lekkiego łańcucha kodującego chimeryczne przeciwciało 425 (Kettleborough i in., Protein Eng. 1991,4: 773). Pożywkę zebrano z komórki i analizowano metodą ELISA w celu określenia stężenia przeciwciała i zdolności przeciwciała do wiązania z EGFR (fig. 4). Gdy porównano stężenie przeciwciała konieczne do osiągnięcia połowy maksymalnego wiązanie z antygenem, chimeryczne przeciwciało S4 2D wiązało się z EGFR tak jak chimeryczne przeciwciało 425. Chimeryczne przeciwciało L3 1 ID, wiązało się jednak z EGFR około czterokrotnie gorzej niż chimeryczne przeciwciało 425. Powinowactwo chimerycznego przeciwciała 425 (Kettleborough i in., Protein Eng. 1991,4:773) określono metodą analizy kompetytywnego wiązania na 1,9 χ 10⁸ M¹. Wyniki te były zaskakujące, ponieważ analiza poprzednich danych wskazała, że scFv S4 2D i L3 1 ID wiązały się z EGFR lepiej niż scFv 425 (fig. 2). Oczyszczone białkiem A próbki chimerycznego przeciwciała L3 1 ID i S4 2D zanalizowano metodą SDS-PAGE w redukujących i meredukujących warunkach. Chimeryczne przeciwciała L3 1 ID i S4 2D przetestowano także metodą cytometrii przepływowej na wiązanie z komórkami A4311SK-MEL-23. Oba chimeryczne przeciwciała wiązały się dobrze z wydzielającymi EGFR komórkami A431 i nie wiązały się z EGFR-negatywnymi komórkami SK-MEL-23.

(5) Terapeutyczne i diagnostyczne zastosowanie

Fragmenty przeciwciał i pełne przeciwciała według wynalazku można podawać ludziom w celu leczenia. Tak więc, przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca jako składnik aktywny co najmniej jedno przeciwciało lub fragment przeciwciała jak zdefiniowano powyżej i w zastrzeżeniach, w połączeniu z jednym lub wieloma farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, zaróbką lub rozcieńczalnikiem.

Typowo przeciwciało według wynalazku będzie się wstrzykiwać dożylnie lub pozajelitowo. Zwykle, dawki podawane fragmentów przeciwciała sąna tyle duże, aby powodować żądane tłumienie i rozpuszczanie nowotworu. Dawka będzie zależała od wieku, stanu, płci i zakresu choroby pacjenta i może się zmieniać od 0,1 mg/kg do 200 mg/kg, korzystnie od 0,1 mg/kg to 100 mg/kg/dawkę w jednej lub wielu porcjach podawanych dziennie, przez jeden lub kilka dni.

Preparaty do podawania pozajelitowego obejmują sterylne wodne lub niewodne roztwory, zawieśmy i emulsje. Przykładami niewodnych rozpuszczalników są glikol propylenowy, glikol polietylenowy, oleje roślinne takie jak oliwa i nadająca się do zastrzyków estry organiczne takie jak oleinian etylu i inne znane rozpuszczalniki, które nadają się do tych celów. Przeciwciała według wynalazku można stosować w kompozycji zawierającej fizjologicznie dopuszczalny nośnik. Przykładami takich odpowiednich nośników jest solanka, PBS, roztwór Ringera lub mleczanowany roztwór Ringera. W kompozycji farmaceutycznej mogą być także obecne środki konserwujące i inne dodatki, takie jak antybiotyki, antyutleniacze i środki chelatujące.

181 342

Przeciwciało (fragment) można także sprzęgać w znany sposób z cytokinami takimi jak IL-2 w celu wzmacniania ich cytotoksyczności.

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku nadają się do leczenia wszystkich rodzajów nowotworów, w tym czerniaków, glejaków i raków, jak też nowotworów układu krążenia i stałych nowotworów.

Do celów diagnostycznych przeciwciało można sprzęgać np. z barwnikiem nie przepuszczającym promieniowania lub radioznacznikiem. Korzystnym sposobem znaczenia jest metoda lodogenowa. Korzystnie przeciwciało będzie się podawać jako F^b^ lub fragmenty scFv do celów diagnostycznych. Osiąga się tak doskonałe wyniki, że niepotrzebne jest odejmowanie tła.

Przykład 1: Pęcherzyki A431

Preparaty pęcherzyków odrzuconej błony otrzymano jak opisano wcześniej (Cohen i in., J. Biol. Chem. 1982,257:1523; Yeaton i in., J. Biol. Chem. 1983,258:9254) z pewnymi modyfikacjami. Połączone kolby zawierające komórki A431 przemyto PBS zawierającym wapń i magnez. Dodano hipotoniczny PBS i kolby wytrząsano przez 15 minut. Komórki przemyto następnie buforem pęcherzykowym (100 mMNaCl), 50mMNa₂HPO₄,5 mMKCI, 0,5 mM MgSO₂, pH 8,5). Dodano bufor pęcherzykowy i kolby poddawano mieszaniu w temperaturze pokojowej i 37°C. Następnie bufor zdekantowano przez metalowe sito do 50 ml probówek na lodzie i odwirowano przez 5 minut pod przyspieszeniem 150 g w temperaturze 4°C. Osad odrzucono i supematant ultraodwirowano przy 39000 obrotów na minutę przez 90 minut. Końcowy osad umieszczono w zawiesinie w 10 mM bufora Hepes (pH 7,4). Aby zanalizować EGFR z pęcherzyków, próbki strącono 9 objętościami etanolu, umieszczono w zawiesinie w 0,08 M Tris, pH 6,8, i następnie przeprowadzono SDS-PAGE z 425 MAb jako wzorcem.

Zawartość białka w preparatach obliczono zmodyfikowaną metodą Coomassie Plus stosując BSA jako wzorzec i odczytując przy 595 nm. W celu zanalizowania EGFR z pęcherzyków próbki wytrącono 9 objętościami etanolu (przez noc w temperaturze 4°C). Osad was umieszczono w zawiesinie w Tris (0,08 M, pH 6,8) i następnie przeprowadzono SDS-PAGE (5% żel stojący; 1 godz., 35 mA; 10% żel biegnący; 2.5 godz.; 40 mA). Próbki i wzorce duplikowano. Jedne z nich zabarwiono Coomassie Blue a inne położono jako plamy na nitrocelulozowe arkusze (12 V;16 godz. w temperaturze 4°C) i potraktowano mysim mAb 425 (anty-EGFR) i anty-mysim przeciwciałem IgG sprzężonym z alkaliczną fosfatazą.

Trzy pożywki zastosowano w immunizacjach in vitro, Medium-1 (Ml), Medium-2 (M2) i Mixed Thymocyte Culture medium (MTC). Ml zawierało HL1 (Ventrex Laboratories, USA) uzupełnione 50 mM 2-merkaptoetanolu i 2 mM L-glutaminy (Gibco). M2 zawierało HL1 uzupełnienie 50 mM 2-merkaptoetanolu, 40 U/ml IL-2 (Genzyme), 20 mg/ml adiuwanta peptydowego (Sigma), 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny (Gibco), 100 mg/ml streptomycyny (Gibco). 4% lub 20% FCS (Biological Industries) dodano do M2 MTC wytworzono w sposób opisany przez Vaux (1). W skrócie pojedynczokomórkowe zawiesiny z grasic trzytygodniowych myszy Balb/c i C57/BL-1 wytworzono przetłaczając grasice przez sterylne sito o 50 oczkach. Zawiesinę komórkową zebrano, przemyto dwa razy w HBSS i określono liczbę żywych komórek metodą wykluczania błękitu trypanowego. Tymocyty hodowano następnie przy gęstości 2,5 χ 10⁶ tymocytów z każdego szczepu na 1 ml na pożywce HL1 zawierającej 4% FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny. Po 48 godzinach supematant odzyskano, przesączono przez filtr 0,22 mm i przechowywano w temperaturze -70°C.

Zawiesinę splenocytów z nieimmunizowanych ośmiotygodniowych myszy Balb/c otrzymano jak opisano dla tymocytów. Żywotność określono metodą wykluczania błękitu trypanowego.

Przykład 2: Immunizacja i przesiewanie in vitro

Trzy pożywki zastosowano w immunizacjach in vitro, Medium-1 (Ml), Medium-2 (M2) i Mixed Thymocyte Culture medium (MTC). Ml zawierało HL1 (Ventrex Laboratories, USA) uzupełniono 50 mM 2-merkaptoetanolu i 2 mM L-glutaminy (Gibco). M2 zawierało HL1 uzupełnione 50 mM 2-merkaptoetanolu, 40 U/ml IL-2 (Genzyme), 20 mg/ml adiuwanta peptydowego (Sigma), 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny (Gibco), 100 mg/ml streptomycyny (Gibco). 4% lub 20% FCS (Biological Industries) dodano do M2. MTC wytworzono w sposób

181 342 opisany przez Vaux (1). W skrócie pojedynczo komórkowe zawiesiny z grasic trzytygodniowych myszy Balb/c i C57/BL-1 wytworzono przetłaczając grasice przez sterylne sito 50 mesh. Zawiesinę komórkową zebrano, przemyto dwa razy w HBSS i określono liczbę żywych komórek metodą wykluczania błękitu trypanowego. Tymocyty hodowano następnie przy gęstości 2,5 χ 10⁶ tymocytów z każdego szczepu na 1 ml na pożywce HL1 zawierającej 4% FCS, 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny. Po 48 godzinach supematant odzyskano, przesączono przez filtr 0,22 mm i przechowywano w temperaturze -70°C.

Zawiesinę splenocytów z nieimmunizowanych ośmiotygodniowych myszy Balb/c otrzymano jak opisano dla tymocytów. Żywotność określono metodą wykluczania błękitu trypanowego.

Pojedynczo komórkowe zawiesiny z grasic trzytygodniowych myszy Balb/c i C57/BL-1 wytworzono przetłaczając grasice przez sterylne sito °50 oczkach. Zawiesinę komórkową zebrano, przemyto dwa razy w HBSS i określono liczbę żywych komórek metodą wykluczania błękitu trypanowego. Tymocyty hodowano następnie przy gęstości 2,5 χ 10⁶ tymocytów z każdego szczepu na 1 ml na pożywce HL1 zawierającej 4% FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicyliny i 100 pg/ml streptomycyny. Po 48 godzinach supematant odzyskano, przesączono przez filtr 0,22 mm i przechowywano. Zawiesinę splenocytów z nieimmunizowanych ośmiotygodniowych myszy Balb/c otrzymano jak opisano dla tymocytów. Żywotność określono metodą wykluczania błękitu trypanowego.

Immumzację in vitro prowadzono w 6-studzienkowych płytkach (Costar). Studzienki zawierające 10⁷ splenocytów w 3,5 ml of pożywki Ml (złożonej z HL1, Ventrex Laboratories, USA, uzupełnionej 50 pM 2-merkaptoetanolu i 2 mM L-glutaminy (Gibco)) inkubowano (37°C, 5% CO₂) z niosącym pęcherzyki EGFR w żądanym stężeniu. Pęcherzyki z komórki nie wydzielającej EGFR lub PBS dodano do kontrolnych studzienek. Po kilku godzinach dodano do każdej studzienki 3,5 ml of pożywki M2 (złożonej z HL1 uzupełnionego 50 pM 2-merkaptoetanolu, 40 U/ml IL-2 (Genzyme), 20 pg/ml adiuwanta peptydowego (Sigma), 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny (Gibco), 100 pg/ml streptomycyny (Gibco) 14% lub 20% FCS (Biological Industries). W pewnych eksperymentach M2 zastępowano pożywką MTC (mieszana tymocytowa pożywka hodowlana (Vaux i in., Naturę 1988,336:36) uzupełnioną adiuwantempeptydowym (20 pg/ml) i IL-2 (40 U/ml) (należy zauważyć, ze końcowe stężenie FCS, IL2 i adiuwanta peptydowego w kulturze jest mniejsze o 50%). Komórki inkubowano przez 72, 96,120 lub 144 godziny w tych samych warunkach i na koniec przetestowano na obecność specyficznej immunoglobuliny lub przetworzono na RNA do wydzielania.

Przesiewanie przeprowadzono z oczyszczonymi antygenami lub ustalonymi komórkami A431. Procedura wyglądała zasadniczo jak opisano poprzednio (Carrołl i in., Hybridoma 1990, 9: 81) z pewnymi modyfikacjami. W skrócie sterylne 96-studzienkowe płytki (Nunc, Maxisorb) powleczono przez noc oczyszczonym EGFR (2,5 pg/ml), gangliozydem GD₃ (2 pg/ml) lub RNase (10 pg/ml) w PBS. Gdy komórki A431 zastosowano jako antygen, hodowano je na 96-studzienkowych płytkach aż do płynności i utrwalono 0,1% aldehydem glutarowym. Immunizowane in vitro limfocyty przemyto i umieszczono w zawiesinie na pożywce HL1 uzupełnionej 2% FCS i 2 mM of L-glutaminy w ilości 5 χ 10⁵ komórki/ml, 1 χ 10⁵ komórek dodano do każdej studzienki i inkubowano (37°C, 5% CO^ przez 48 godzin. Wykonano 16 duplikatów każdej grupy. Limfocyty usunięto następnie przemywając 5 razy PBS zawierającym 0,1% Tween-20. Specyficzne immunoglobuliny wykryto stosując znaczoną peroksydazą króliczą immunoglobulinę antymysią(Dako) (1 godz., 37°C). Jako substrat użyto sól diammoniowąkwasu 2,2'-azyno-bis(3-etylobenzotiazolino-6-siarkowego) (ABTS) (Sigma) w buforze cytryniano-fosforanowym (0,55 mg/ml).

Przykład 3: Konstrukcja biblioteki

Trzy biblioteki skonstruowano z RNA wytworzonego ze śledziony myszy immunizowanej dootrzewnowe komórkami A431 (Murthy i in., Arch. Biochem. Biophys. 1987,252: 549), z podkolanowego węzła hmfatycznego myszy immunizowanej w stopę oczyszczonym EGFR i z mysiej komórki immunizowanej in vitro pęcherzykami A431. Zsyntetyzowano pierwszy łańcuch cDNA. Geny V_H i V_K wzmocniono PCR i złożono (Clackson i in., Naturę 1991, 352: 624). Stosując PCR dołączono miejsca restrykcji Notl i Sfil i klonowano scFv w fagemidowy wektor

181 342 pHENl (Hoogenboom i in., Nuci. Acids Res. 1991, 19: 4133). Ligacyjne mieszaniny elektroporowano w komórki E. coli i powstałe kolonie zdrapano do pożywki do wytwarzania płynów bibliotecznych (Marks i in., J. Mol. Biol. 1991, 222: 581).

Przykład 4: Przesiewanie bibliotek

Przeciwciała fagowe odzyskano z biblioteki stosując fag pomocniczy M13K07 (Promega, Madison, WI) (Marks i in., J. Mol. Biol. 1991,222: 581). Immunoprobówki (Nunc, Life Sciences, Paisley, UK) powleczono 4 ml 2,5 pg/ml EGFR w PBS przez noc. Po trzech przemyciach PBS, probówki inkubowano w temperaturze 37°C przez co najmniej 1 godz. w PBS zawierającym 2% proszku mleka (PBSM). Faga (10¹² do 10¹³) umieszczono w zawiesinie w 4 ml PB SM i inkubowano w probówce powleczonej EGFR przez 1 godz. w temperaturze pokojowej. Probówkę przemyto 20 razy PBS, 0,1% Tween i 20 razy PBS. Związany fag eluowano po 10 min. inkubacji w 1 ml 0,1 M trietyloaminy z ciągłym mieszaniem. Eluowanego faga zobojętniono dodatkiem 0,5 ml 1 M Tris-HCl, pH 7,5 i stosowano do infekowania wstępnej fazy komórek TG1E. coli. Infekowane komórki umieszczono na płytkach i indywidualne kolonie pobrano do małoskalowej indukcji scFv. Pozostałe kolonie zdrapano do pożywki i próbki stosowano do wytwarzania fagów do następnej rundy przesiewania.

Przykład 5: Wytwarzanie i analizascFv

Rozpuszczalne scFv wytwarzano w E. coli H82151 jak opisano poprzednio (np. Kettleborough i in., I. c.). Stężenia scFv w bakteryjnych supematantach oceniono stosując oczyszczony preparat scFv o znanym stężeniu jako wzorzec. Supematanty przesączono i dodano azydek sodu do 0,1 %. Seryjne rozcieńczenia supematantów i wzorca wykonano na filtrach Immobilon-PVDF (Millipore, Watford, UK) stosując 96-studzienkową podstawę. Filtry potraktowano jak w analizie Western (Towbin i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1979, 76: 4350). scFvs wykryto stosując przeciwciało (9E10) wobec C-terminalnego znacznika (Munro i Pelham, Celi 1986, 46: 291), a następnie sprzężone z peroksydazą kozie przeciwciało antymysie IgG i IgM (Jackson ImmunoResearch Lab Inc., West Grove, PA). Reakcje rozwijano stosując system ECL (Amersham, Ayłesbury, UK). Wstępnie naświetlone autoradiogramy skanowano stosując densytometr. Standardową krzywą wytworzono i stosowano do estymacji stężenia scFv w supematantach.

Testy wiązania antygenu ELISA prowadzono z powleczonymi EGFR płytkami (2,5 pg/ml). Supematanty zawierające scFv rozcieńczano PBSM i podawano na płytki. Związany scFv wykryto stosując przeciwciało 9E10 opisane powyżej. Supematanty testowano także wiązanie z zestawem niezwiązanych białek i plastykiem. Płytki ELISA powleczono przez noc 100 pg/ml albuminy jaja, hzozymu jaja kurzego, cytochromu c, dehydrogenazy 3-fosforanu gliceraldehydu, mysiej albuminy (szczep CB A) i BSA. Nierozcieńczone supematanty zawierające 2% mleka w proszku dodano w duplikacie na powleczone płytki i związane scFv wykryto jak opisano powyżej.

Test wiązania komórki ELISA prowadzono stosując nowotworowe linie komórek A431 (ATCC CRL 1555), MDA MB 468 (ATCC HTB 132) i SK-MEL-23 (negatywna kontrola). Komórki hodowano do płynności w poli-D-lizynie w 96-studzienkowych szalkach hodowli kultur tkankowych (Nunc). Komórki przemyto DMEM u blokowano w temperaturze 37°C przez 2 godz. PBS zawierającym 2,5% BSA. Po wchłonięciu supematanty dodano do każdej studzienki wraz z równąobjętościąpożywki 2 x YT zawierającej 4% mleka w proszku i inkubowano w temperaturze 4°C przez 1 godz. Związany scFvs wykryto w sposób opisany powyżej.

Test współzawodniczący ELISA przeprowadzono inkubując wstępnie powleczone EGFR płytki ELISA z 50 μΐ oczyszczonych scFv (100 pg/ml) przez 10 min. Mysie MAb 425 (50 μΐ) dodano następnie otrzymując stężenia od 3,13 to 200 ng/ml. Po inkubacji i przemyciu, związany mysi MAb 425 wykryto stosując sprzężone z peroksydaząkozie przeciwciało antymysie IgG i IgM.

Przykład 6: Analiza DNA

Do celów fingerpnntingu BstNI, wzmocniono PCR inserty scFv z indywidualnych klonów i produkty trawiono BstNI (Clackson i in., Naturę 1991,352: 624). DNA sekwencjonowano stosując zestaw Seąuenase (United States Biochemical, Cleveland, OH).

181 342

Przykład 7: Oczyszczanie scFv

Bakteryjne supematanty oczyszczano przez odwirowanie i sączenie przez filtry 0,2 pm przed załadowaniem na 1 ml kolumnę oczyszczonego EGFR (5 mg) sprzężonego z aktywowaną bromocyjanem Sepharose 4B (Pharmacia, Uppsala, Sweden). Kolumnę przemyto 30 ml PBS, a następnie 5 ml 0,2 M glicyną pH 5,0. scFv eluowano 0,2 M glicynąz HCl, pH 2,8. Eluat zobojętniono 10 x PBS. Frakcje zawierające białko zebrano i bufor ultrasączono (Amicon, Stonehouse, UK) do PBS zawierającego 1% BSA i 0,05% azydku sodu.

Przykład 8: Analiza FACS oczyszczonych scFv

Komórki A431 trypsynowano i inkubowano w DMEM zawierającym 10% FCS. Komórki przemyto dwukrotnie zimnym DMEM i przesączono prze 45 pm sito. Komórki (10⁶) inkubowano na lodzie przez 30 min. w 50 pl PBS, 1% BSA, z oczyszczonymi scFv. Po dwu przemyciach zimnym PBS związane scFv wykryto stosując 50 pl sprzężonego z FITC przeciwciała 9E10 (100 pg/ml). Po 30 minutach na lodzie, komórki przemyto raz PBS, utrwalono w PBS zawierającym 1 % formaldehydu i analizowano stosując FACSCAN (Becton-Dickinson, Cowley, UK).

Przykład 9: Konstrukcja, analiza i ekspresja pełnego chimerycznego przeciwciała

Stosując miejsca Pstl i BstEII, kody DNA dla V_H wybranych scFv subklonowano w pośredni wektor V_H zawierający eukariotyczną sekwencję początkową pochodzącą z ludzkiego przeciwciała HG3 CL (Rechavi i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1983,80: 855) i miejsce donora rozszczepienia (fig. 3). Kod DNA dla V_k adaptowano do insercji w pośredni wektor V_k stosując pnmery PCR w celu wprowadzenia miejsc Xhol i Sstl na końcach 5' - i 3 (V_kFor: 5'-CCG TTT CAG CTC GAG CTT GGT CCC-3'

VkBack: 5'-GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA-3').

Fragmenty Sstl-Xhol klonowano w pośredni wektor V_k zawierający eukariotyczną sekwencję początkową pochodzącą z przekształconego ludzkiego lekkiego łańcucha CAMPATH-l (Riechmann i in., Naturę 1988,332: 21) i miejsce donora rozszczepienia (fig. 3). Kody DNA dla zmiennych regionów i eukariotyczne regiony boczne klonowano jako fragmenty HindlH-BamHI do wektorów ekspresji komórki ssaka zawierających genomowy kod DNA ludzkiego stałego regionu gamma-1 lub ludzkiego stałego regionu kappa (Maeda i in., Hum. Antibod. Hybridomas 1991, 2: 124). Wektory ekspresji ciężkiego i lekkiego łańcucha elektroporowano do komórek COS. Po 72 godz. pożywkę zebrano i chimeryczne przeciwciała anty-EGFR analizowano metodą ELISA (kettleborough i in., Protein Eng. 1991, 4 773).

Przykład 10: Wytwarzanie scFv pochodzących z komórek immunizowanych in vitro

Sposoby opisane poniżej są nieznacznymi modyfikacjami sposobów opisanych powyżej. Immunizację, konstrukcję biblioteki i przesiewanie podano w przykładach 1-4, następujące etapy opisano szczegółowo poniżej:

Po przesianiu pierwotnej biblioteki i klonów pochodzących z trzech rund przeglądu, wybrano pewne pojedyncze oporne na ampicylinę kolonie. Fagemid DNA wytworzono przez alkaliczną lizę i zastosowano do transfekcji E. coli H82151, niesupresyjnego szczepu, metodą wstrząsu cieplnego. Kolonie zaszczepiono w 2 x TY-Amp-Glu i hodowano przez noc w temperaturze 30°C. Próbkę 5 ml zastosowano do zaszczepienia 50 ml pożywki 2 x TY zawierającej 100 mg ampicyliny/ml i 0,1% glukozy i hodowano z wytrząsaniem w temperaturze 30°C przez 1 godz. (do fazy logarytmicznej). Komórki zebrano i indukowano ekspresję rozpuszczalnego scFv dodatkiem β-D-tiogalaktopiranozydu izopropylu (IPTG) do końcowego stężenia 1 mM (De Bellis, D. i Schwartz, L; Nucleic Acids Res. 1990,18:1311). Kultury hodowano przez noc w temperaturze 30°C z wytrząsaniem. Supematanty zawierające scFv pobrano, odwirowano i przesączono przez filtry 0,22 mm i zbadano. Bakteryjne supematanty przetestowano na wiązanie z EGFR metodą ELISA, zgodnie z opisami (Kettleborough i in., EP 94104160 i Eur. J. Immunol. 1994,24: 952). Specyficzność wybranych fragmentów scFv stwierdzono metodąELISA stosując płytki powleczone różnymi białkami związanymi i niezwiązanymi z EGFR, jak też innymi antygenami i plastykami. Zastosowanymi antygenami były: RNase, BSA, OVA, gangliozyd GD3, receptor witronektyny (VNR), płytka glikoproteiny Hbllla (GPIIblUa) i disialilo-lakto-N-tetroza (DSLNT). Powlekano przez noc w optymalnym stężeniu dla każdego antygenu. Powleczone

181 342

ELISA płytki zablokowano na 1 godzinę w temperaturze 37°C 1.5% chudym mlekiem w PBS (w/v). Po przemyciu 100 ml supematanta scFv dodano do studzienek do mikromiareczkowania i inkubowano przez 2 godz. w temperaturze 37°C. Związany scFv wykryto stosując przeciwciało anty-c-myc 9E10 (zużyta pożywka kultury z hybrydy Myc 1-9E10.2) i sprzężone z alkaliczną fosfatazą królicze przeciwciało antymysie (Dako).

Trzy niosące EGFR nowotworowe linie komórek, A431, adenokarcynoma ludzkiej piersi MDA MB 231 (ATCC, HTB 26), adenokarcynoma ludzkiej okrężnicy HT29 (ATCC, HTB 38) i jedna nie wydzielająca EGFR linia komórek WM 164, zastosowano do testowania zdolności scFv do wiązania EGFR na komórkach metodą analizy FACS i immunofluorescencji z nieutrwalonych komórek. Do pośredniej immunofluorescencyjnej analizy komórki umieszczono na płytkach Terasaki (2 x 10⁴ komórek/studzienka) i hodowano przez 24 godziny. Komórki inkubowano następnie z 20 ml surowego bakteryjnego supematanta zawierającego fragmenty scFv przez 90 minut w temperaturze pokojowej. Inkubację z pierwotnym przeciwciałem (anty-c-myc) i wtórnym przeciwciałem prowadzono przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Wtórne przeciwciało, sprzężone z FICT królicze przeciwciało antymysie (Dako) rozcieńczono 1:20.

Do analizy FACS 5 χ 10⁵ komórek przemyto PBS z 1% BSA i 0,1% azydku sodu (PBS-BSA) i inkubowano w temperaturze 4°C przez 20 min. z 50 ml surowego bakteryjnego supematanta. Po dwu przemyciach zimnym PBS-BSA, związany scFv wykryto stosując przeciwciało anty-c-myc i sprzężone z FICT kozie przeciwciało antymysie (Becton-Dickinson) rozcieńczono 1:25 w PBS-BSA. Dodano jodek propidiowy (PI) z końcowym stężeniem 5 mg/ml. Cytometrię przepływu prowadzono w EPICS Profle II wyposażonym w chłodzony powietrzem laser argonowy. Do wzbudzania użyto linię 488 nm (15 mV). Filtr pasma 530 nm stosowany w celu zebrania emisji FITC i filtr pasma 625 nm stosowano w celu zebrania emisji PI. Żywe komórki wybrano ustawiając bitmapę na przednie i boczne rozproszenie i metodą wykluczenia zabarwionych PI komórek.

Różnorodność pierwotnej i wybranej biblioteki określono metodą wzmocnienia PCR klonowanych fragmentów (Gussow, D. Clackson, T; Nucleic Acids Res. 1989,17:4000) i analizy wzoru trawienia BstNI (8). Niektóre klony sekwencjonowano stosując zestaw Sequenase (USB) metodą terminacji dideoksy łańcucha (Sanger, F i in.; Proc. Nat. Acad. Sci., U.S.A. 1977, 74: 5463).

Nie obrobione bakteryjne supematanty (10 ml) poddano analizie SDS-PAGE stosując 12,5% żel. Analizę Western przeprowadzono zasadniczo tak jak opisuje Towbin (Towbin i in. J. Proc. Nat. Acad. Sci., U.S.A. 1979,76: 4350). Białka transferowano metodąelektroblotingu no Immobilon-P (Millipore) lub nitrocelulozę (Bio-Rad). Plamkę blokowano PBS zawierającym 2% chudego mleka (w/v). Fragmetny scFv wykryto stosując przeciwciało anty-c-myc (9E10), sprzężone z peroksydazą przeciwciało antymysie (Jackson) i ulepszony układ chemiluminescencyjny (ECL, Amersham).

Ilościowa analiza pęcherzyków odrzuconej błony określiła łączne stężenie białka na 2,5 mg/ml, przy czym tylko 10-14% odpowiadało EGFR (Sato i in., J. Natl. Cancer Inst. 1989, 21:1601; Yeaton, R. i in., J. Biol. Chem., 1983. 258: 9254), 250 to 350 ng/ml. Elektroforetyczna analiza z zastosowaniem PAGE-SDS, a następnie barwienia Coomassie-blue wykazała, że pęcherzyki zawierają złożoną mieszaninę białek. Nie wykryto degradacji białka. Analiza Western wyjawiła, że w warunkach eksperymentu kompletne cząsteczki receptora EGF były obecne w preparacie pęcherzyków membrany.

W celu określenia wymagań na FCS i limfokiny porównano MTC i M2 zawierające 20% lub 4% FCS. Pęcherzyki niosące EGFR i PBS zastosowano odpowiednio jako antygen i kontrolę. Splenocyty inkubowano w sześciostudzienkowych płytkach z lub bez antygenu przez 3 godziny w Ml (bez surowicy). Następnie dodano MTC lub M2 i po 72, 96,120 lub 144 godz., przesiano stosując utrwalone komórki A431. We wszystkich eksperymentach liczba żywych odzyskanych komórek wynosiła pomiędzy 20 i 40% zgodnie z opublikowanymi wynikami (Ga vilondo-Cowley, J. i in.; In Vitro Immunization in Hybridoma Technology, Elsevier Science Publishers B.V, Amsterdam 1988, str. 131). Maksimum specyficznych odpowiedzi otrzymano w dniu czwartym z MTC; podczas gdy M2 przy stężeniu 4% lub 20% FCS (2% lub 10% końcowego stężenia) opó181 342 źnia maksimum odpowiedzi do szóstego dnia (tabela 2). Jednak MTC i 10% FCS uruchomiły niespecyficzną odpowiedź, prawdopodobnie przez poliklonalnąaktywację, jak widać po wyrażeniu wyników jako stosunku odpowiedź specyficzna/niespecyficzna. Dla dalszych testów zdecydowaliśmy stosować M2 uzupełnione 4% FCS i 6 dni hodowli.

Obecność EGFR na powierzchni pęcherzyków silnie polepsza odpowiedzi na ten antygen. W podobnych protokołach jak opisano powyżej, porównano pęcherzyki z wydzielających i niewydzielających EGFR linii komórek. Limfocyty hodowano z pęcherzyków w Ml przez 3 godziny. Następnie dodano M2 zawierające 4% FCS. Po 6 dniach limfocyty z każdej grupy hodowano przez 48 godzin w 96-studzienkowej płytce powleczonej EGFR, utrwalonymi A431 komórkami, RNase lub GD3. Zgodnie z oczekiwaniem, wyniki testów wykazały multispecyficzny wzór odpowiedzi (tabela 3). Reaktywność wobec EGFR wyraźnie wzrosła w kategoriach gęstości optycznej gdy jako antygen zastosowano wydzielające EGFR pęcherzyki.

Wzięte razem wyniki sugerują, że chociaż niedojrzałe, pojawiły się mierzalne zależne od antygenu odpowiedzi po immunizacji in vitro, które generowały kilka serii immunizowanych wobec EGFR limfocytów odpowiednich do klonowania PCR zmiennych regionów. Bibliotekę 1,1 x 10⁵ klonów otrzymano po klonowaniu fragmentów scFv pochodzących z immunizacj i in vitro w fagemid pHENl. Tę bibliotekę utworzono równolegle z dwoma innymi bibliotekami dającymi immumzację in vivo. Konstrukcję tych bibliotek fagów opisano uprzednio (Kettleborough, i m., EP 94104160 i Eur. J. Immunol. 1994, 24: 952).

W celu wybrania fragmentów scFv wiążących się z EGFR, fagi panoramowano stosując powleczone EGFR immunoprobówki. Eluowany fag stosowano do reinfekcji szczepu SupE E.coli. Łącznie przeprowadzono trzy rundy selekcji. W każdej rundzie probówkę bez antygenu testowano równolegle dla obliczenia tła. W pierwszym panoramowaniu 1,5 χ 10¹⁰ cząsteczek faga umieszczono w immunoprobówce i 6,6 χ 10⁴ eluowano z powleczonej immunoprobówki, podczas gdy tylko 200 kolonii otrzymano z populacji tła. Po trzecim panoramowaniu 1 χ 10¹¹ fagów nałożono i 5,6 χ 10¹⁰ eluowano.

Dla dalszego scharakteryzowania fragmentów scFv wybrano 22 klony z populacji faga przed selekcją i po każdej rundzie selekcji.

Zróżnicowanie biblioteki zanalizowano badając wzory trawienia BstNI klonowanych fragmentów. Przed selekcją biblioteka wydawała się być wyjątkowo zróżnicowana. Fingerprinting wiążących klonów pochodzących z pierwszej rundy selekcji wskazał na obecność kilku grup z takim samym wzorcem restrykcji.

Klony wybierano z różnych rund selekcji w oparciu o ich wzorzec trawienia. Sekwencjonowame DNA wykryło obecność różnych sekwencji w większości wybranych klonów. Długość i skład regionów determinujących komplementamość (CDR) klonów 10D2,5D3,10E2, 1B3,4B3 i 5E2 były różne. Największą zmienność zaobserwowano w CDR3 sekwencji V_H i V_L. Klony 5D3 i 1E3 pochodziły z trzeciej rundy selekcji. Wiązały się silnie z EGFR zgodnie z analizą metodą ELISA i cytometrią przepływową i miały taką samą sekwencję.

Rozpuszczalne fragmenty scFv otrzymano w hodowli niesupresyjnego szczepu E. coli HB 2151 w obecności IPTG.

Dla zweryfikowania wytwarzani scFv bakteryjne pożywki z indywidualnych klonów zanalizowano metodą elektroforezy żelowej. Analiza Western ujawniła wyraźne pasmo wokół 35000 kD.

Klony z aktywnością wiązania z EGFR zidentyfikowano metodą ELISA. W celu zbadania reaktywności krzyżowej wybranych klonów prowadzono testy ELISA stosując różne antygeny. Antygeny (EGFR, RNase, BSA, KLH, OVA, gangliozyd GD3, receptor witronektyny, płytkę glikoproteiny Ilbllla i disililo-lakto-N-tetraozy) nałożono na płytki ELISA w optymalnym stężeniu (tabela 4). Nie wykryto wiązania z antygenami nie-EGFR. scFvs przetestowano także na wiązanie z trzema niosącymi EGFR nowotworowymi liniami komórek (ludzki epidermoidalny rak A431, ludzka adenokarcynoma piersi MD A MB 231 i ludzka adenokarcynoma okrężnicy HT 29). WM 164, ludzki czerniak nie wydzielający EGFR zastosowano jako negatywną kontrolę. Wiążące się z nowotworowymi liniami komórek testowano metodą pośredniej immunofluores

181 342 cencji stosując nieutrwalone komórki i analizowano ilościową metodą analizy FACS. Stosowanie meutrwalonych komórek gwarantuje naturalną konformację receptorów błony. Pozytywne klony wykazały wyraźną fluorescencję przy stosowaniu komórek A431. Fluorescencja dla innych niosących EGFR nowotworowych linii komórek była słaba. Nie wykryto wiązania z negatywnymi liniami komórek. Wyniki potwierdziła cytometria przepływowa. 17 pozytywnych klonów i 3 negatywne klony zanalizowano na wiązanie z komórkami A431, MD A MB 231 i HT 29 metodą cytometrii przepływowej. WM 164 zastosowano jako negatywną linię komórek. 425 scFv (klon PI) zastosowano jako pozytywną kontrolę i wektor klonowania (HEN) jako negatywną kontrolę. Wyniki podsumowano w tabeli 5. Dwa klony, 4B2 i 5E2, były pozytywne na wiązanie z EGFR analizowane metodą ELISA, ale negatywne na wiązanie z wydzielającymi EGFR nowotworowymi liniami komórek.

Tabela 2

Działanie różnych pożywek na immumzajcę in vitro^

	Dni przesiewania wobec A431
dzień 3	dzień 4	dzień 5	dzień 6
Test Antygen	O.D.c) stosunekd>	O.D. stosunek	O.D. stosunek	O.D. stosunek
1 pęcherzyki	0,393 2,11	0,801 3,76	0,784 3,90	0,951 10,3
PBS	0,186	0,213	0,201	0,092
2 pęcherzyki	0,527 2,50	0,852 1,76	0,863 2,75	1,168 3,94
PBS	0,210	0,482	0,313	0,296
3 pęcherzyki	0,763 1,48	1,169 2,01	1,089 2,07	1,115 1,91
PBS	0,513	0,581	0,525	0,581

Test 1 · Ml plus M2,4% FCS (końcowe FCS 2%)

Test 2 Ml plus M2, 20% FCS (końcowe FCS 10%)

Test 3 A-medium plus MTC, 4% FCS (końcowe FCS 2%)

a) komórkiśledzionymyszyBALB/c(10⁷)mkubowanow3,5mlMl z pęcherzykami z komórek A431 lubPBS przez 3 godziny w 6-studzienkowychpłytkach. Następnie dodano 3,5 ml MTC lub Μ1 z 4% FCS i inkubowano płytki. W 3,4,5 lub 6 dniu immunizowane m vitro limfocyty usunięto z hodowli, przemyto HBSS dla usunięcia pęcherzyków i zaszczepiono na 96-studzienkowych płytkach powleczonych utrwalonymi komórkami A431 i inkubowano 48 godzin (patrz sposoby).

b) końcowe stężenie FCS w pożywce hodowli

c) O.D - gęstość optyczna przy 405 nm. Oznacza średnią, z 16 studzienek.

d) Stosunek specyficznej odpowiedzi (pęcherzyki jako antygen) do niespecyficznej odpowiedzi (PBS jako antygen)

Tabela 3

Multispecyficzność odpowiedzi po immunizacji in vitro

Przesiewanie wobec
	Grupa antygenu	komórki A431	EGFR	GD3	RNase
test 1	EGFR+	0,512^	0,326	0,140	0,249
	EGFR-	0,427	0,070	0,123	0,304
test 2	EGFR+	1,430	0,730	0,233	0,670
	EGFR-	0,789	0,195	0,118	0,561

a) Limfocyty immumzowano in vitro stosując albo pęcherzyki wydzielające EGFR (EGFR+), albo mewydzielające EGFR (EGFR-). Po 6 dniach inkubacji komórki usunięto i przesiano wobec wymienionych antygenów.

b) Odpowiedź jest gęstością optyczną (405 nm).

181 342

Tabela 4

Reaktywność krzyżowa wybranych fragmentów scFv wobec kilku antygenów

Antygen(b)	Powłoka [mg/ml]	Wynik
EGFR	2,5	+
RNase	10	-
BSA	10	-
KLH	10	-
OVA	10	-
gangliozyd GD3	2	-
VNR	1	-
DSLNT	5	-

a) testy ELISA prowadzone jak w opisie

b) receptory witronektyny (VNR), płytka glikoproteiny Ilbllla (GPIIbllla) i disihlo-lakto-N-tetraoza (DSLNT).

Tabela 5

Reaktywność klonów scFv wobec EGFR Wyniki porównawcze pomiędzy metodą ELISA z oczyszczonym rozpuszczalnym antygenem i cytometryczną analizą linii komórek

KLONY	CYTOMETR. ANALIZA LINII KOMÓREK NOWOTW.(a) (średnia arbitralnych jednost. fluorescencji)	ELISA (O.D.)
1	2	3	4	5	6
Pozytywne	WM164	A431	MDAAMB231	HT29	EGFR
7H1	1,5	112,9	16,4	2,6	1,2
4B2	1,2	5,3	4,2	0,6	2
10D2	1,5	145,3	36,3	4,8	2
12D2	1,8	129,5	29,3	5,7	2
5E2	1,4	2,5	7,1	0,5	1,8
8E2	1,5	134,5	47,7	5,1	1,9
5F2	1,3	146,3	40,6	5,7	1,9
11H2	1,9	152,2	25,3	2	1,9
1B3	0,6	105,1	36,4	5,2	>2
4B3	0,5	78	15,8	2,3	2
3D3	1,2	94,3	25,1	4,8	1,9
5D3	0,5	112	22,2	5,5	>2
4F3	0,4	110,3	32,3	6,2	>2
4G3	0,4	76,5	20,4	2	>2
1E3	0,4	76,5	20,4	2	>2
3H3	0,6	76,3	20,4	2	>2

181 342 cd. tabeli 5

1	2	3	4	5	6
Negatywne
5F1	2,4	2,3	3,6	1,8	0,2
7G1	1,4	10,2	4	2,8	0,2
1H1	0,5	5	4	0,75	0,2
Kontrola^*
HEN	0,4	4,1	3,7	1	0,2
PI	0,6	85,5	21,3	2,5	1,9

a) trzy linie niosące EGFR (A431, MDAAMB2311HT29) oraz jednąnie wydzielającą linię komórek (WM164) zastosowano w teście zdolności scFv do wiązania linii komórek nowotworowych metodą cytometrycznej analizy, jak opisano.

b) wektor bez fragmentu (HEN) i fragment scFv z 425 mAb (P1) zastosowano odpowiednio jako próby negatywne i pozytywne.

181 342

LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJA OGÓLNA:

(1) ZGŁASZAJĄCY (A) NAZWA: Merck Patent GmbH (B) ULICA: Frankfurter Str. 255 (C) MIASTO: Darmstadt (E) COUNTRY: Germany (F) KOD POCZTOWY (ZIP): 64271 (G) TELEFON: 49-6151-127022 (H) TELEFAX: 49-6151-727191 (n) TYTUŁ WYNALAZKU: Jednołańcuchowe anty-EGFR Fv i przeciwciała anty-EGFR (iii) LICZBA SEKWENCJI: 32 (iv) POSTAĆ DLA KOMPUTERA:

(A) NOŚNIK: dysk elastyczny (B) KOMPUTER: zgodny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patent In Release #1.0, Version #1.30 (EPO) (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID. 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 327 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (lii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) BEZSENSOWNA: NIE

181 342 (ν) TYP FRAGMENTU: N-terminal (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: mysz (B) SZCZEP: Balb/c (D) STOPIEŃ ROZWOJU: dorosłe (F) TYP TKANKI: węzeł limfatyczny (vil) BEPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: L211C (lekki łańcuch) (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) MIEJSCE: 1..327 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID. 1:

GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA GCC TCC CTG GCT GCA TCT GTG GGA 48

Asp Ile Glu Leu Tre Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Ala Ser Wal Gli

1015

GAA ACT GTC ACC ATC ACA TGT CGA GCA AGT GAG AAC ATT TAC TAT AGT96

Glu Tre Wal Tre Ile Tre Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr TyrSer

2530

TTA GCA TGG TAT CAG CAG AAG CAA GGG AAA TCT CCT CAG CTC CTG ATC144

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Liz Gin Gli Liz Ser Pro Gin Leu LeuIle

4045

TAT AGT GCA AGC GCC TTG GAA GAT GGT GTC CCA TCG AGG TTC AGT GGC192

Tyr Ser Ala Ser Ala Leu Glu Asp Gli Wal Pro Ser Arg Fen SerGli

5560

AGT GGA TCT GGG ACA CAG TAT TCT TTA AAG ATC AAC AAC ATG CAG CCT240

Ser Gli Ser Gli Tre Gin Tyr Ser Leu Liz Ile Asn Asn Met Gin Pro

181 342

GAA GAT ACC GCT ACT

Glu Asp Tre Ala Tre

ACG TTC GGT GGA GGG

Tre Fen Gli Gli Gli

TAC TTC TGT AAA CAG ACT

Tyr Fen Cys Liz Gin Tre

ACC AAG CTG GAA ΑΤΑ AAA

Tre Liz Leu Glu Ile Liz

TAT GAC GTT CCG TGG

Tyr Asp Wal Pro Trp

CGG GCG 327

Arg Ala

100 105 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID. 2:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 109 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (Xl) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID. 2:

Asp Ile Glu Leu Tre Gin

5

Glu Tre Wal Tre Ile Tre

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin

Tyr Ser Ala Ser Ala Leu

Ser Gli Ser Gli Tre Gin

70

Glu Asp Tre Ala Tre Tyr

Tre Fen Gli Gli Gli Tre

Ser Pro Ala Ser Leu

Cys Arg Ala Ser Glu

Liz Gin Gli Liz Ser

Glu Asp Gli Wal Pro 55

Tyr Ser Leu Liz Ile

Fen Cys Liz Gin Tre

Liz Leu Glu Ile Liz

Ala Ala Ser Wal Gli

Asn Ile Tyr Tyr Ser

Pro Gin Leu Leu Jle 45

Ser Arg Fen Ser Gli 60

Asn Asn Met Gin Pro

Tyr Asp Wal Pro Trp

Arg Ala

181 342

100

105 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID. 3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 357 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (li) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ni) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) BEZSENSOWNA: NIE (v) TYP FRAGMENTU: N-terminal (Vl) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: mysz (B) SZCZEP: Balb/c (D) STOPIEŃ ROZWOJU: dorosłe (F) TYP TKANKI: węzeł limfatyczny (vii) BEPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: L211C (ciężki łańcuch) (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) MIEJSCE:1..357 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID. 3:

CAG GTG CAA CTG CAG GAG TCA GGG CCT GAG CTG GTG AGG CCT GGG GCT48

Gin Wal Gin Leu Gin Glu Ser Gli Pro Glu Leu Wal Arg Pro GliAla

110 115 120125

TCA GTG AAG ATG TCC TGC AAG GCT TCA GGC TAT ACC TTC ACT ACC TAC96

Ser Wal Liz Met Ser Cys Liz Ala Ser Gli Tyr Tre Fen Tre Tre Tyr

181 342

130
TGG	ATA	CAC	TGG	ATG	AAA	CAG	AGG	CCT
Trp	Ile	His	Trp	Met	Liz	Gin	Arg	Pro
			145					150
GGC	ATG	ATT	GAT	CCT	TCC	AAT	AGT	GAA
Gli	Met	Ile	Asp	Pro	Ser	Asn	Ser	Glu
		160					165
AGG	GAC	AAG	GCC	ACA	TTG	AGT	GTA	GAC
Arg	Asp	Liz	Ala	Tre	Leu	Ser	Wal	Asp
	175					180
ATG	CAG	CTC	AGC	AGC	CTG	ACA	TCT	GAG
Met	Gin	Leu	Ser	Ser	Leu	Tre	Ser	Glu
190					195
GCA	AGA	TGG	GAC	TAC	GGT	AGT	GGC	CAC
Ala	Arg	Trp	Asp	Tyr	Gli	Ser	Gli	His
				210
ACC	ACG	GTC	ACC	GTC	TCC	TCA
Tre	Tre	Wal	Tre	Wal	Ser	Ser
			225

140

CAA GGC CTT CAG TGG ATT 144

Gin Gli Leu Gin Trp Ile

155

AGG TTA AAT CAG AAT TTC 192

Arg Leu Asn Gin Asn Fen

170

TCC TCC AAT AAA GCC TAC 240

Ser Ser Asn Liz Ala Tyr

185

TCT GCA ATC TAT TAC TGT 288

Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys

200 205

GAC	TAC	TGG	GGC	CAA	GGG 336
Asp	Tyr	Trp	Gli	Gin	Gli
				220

357 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 119 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (X1) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.

Gin Wal Gin Len Gin Glu Ser Gli Pro

Leu Wal Arg Pro Gli Ala

181 342

5

Ser Wal Liz Met Ser

Trp Ile His Trp Met

Gli Met Ile Asp Pro

Arg Asp.Liz Ala Tre 65

Met Gin Leu Ser Ser

Ala Arg Trp Asp Tyr

100

Tre Tre Wal Tre Wal

Cys Liz Ala Ser Gli Tyr

Liz Gin Arg Pro Gli Gin

Ser Asn Ser Glu Tre Arg

Leu Ser Wal Asp Liz Ser

75

Leu Tre Ser Glu Asp Ser

Gli Ser Gir His Fen Asp

105

Ser Ser

Tre Fen Tre Tre Tyr

Gli Leu Gin Trp Ile

Leu Asn Gin Asn Fen

Ser Asn Liz Ala Tyr

Ala Ile Tyr Tyr Cys

Tyr Trp Gli Gin Gli

110

115 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID. 5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 339 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (il) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (IV) BEZSENSOWNA: NIE (v) TYP FRAGMENTU: N-terminal (VI) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: mysz (B) SZCZEP: Balb/c

181 342 (D) STOPIEŃ ROZWOJU: dorosłe (F) TYP TKANKI: węzeł limfatyczny (vii) BEPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: L212B (lekki łańcuch) (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) MIEJSCE:1..339 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID. 5:

GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA GCT TCT TTG GCT GTG TCT CTA GGG48

Asp Ile Glu Leu Tre Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Wal Ser LeuGli

120 125 130135

CAG AGG GCC ACC ATC TCC TGC AGA GCC AGC GAA AGT GTT GAT AAT TTT96

Gin Arg Ala Tre Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Wal Asp AsnFen

140 145150

GGC ATT AGT TTT ATG AAC TGG TTC CAA CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC144

Gli Ile Ser Fen Met Asn Trp Fen Gin Gin Liz Pro Gli Gin ProPro

155 160165

AAA CTC CTC ATC TAT GGT GCA TCC AAC CAA GGA TCC GGG GTC CCT GCC192

Liz Leu Leu Ile Tyr Gli Ala Ser Asn Gin Gli Ser Gli Wal ProAla

170 175 180.

AGG TTT AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC AGC CTC AAC ATC CAT2 40

Arg Fen Ser Gli Ser Gli Ser Gli Tre Asp Fen Ser Leu Asn IleHis

185 190195

CCT GTG GAG GAG GAT GAT ACT GCA ATG TAT TTC TGT CAG CAA AGT AAG2 88

Pro Leu Glu Glu Asp Asp Tre Ala Met Tyr Fen Cys Gin Gin SerLiz

200 205 210215

GAG GTT CCG CTC ACG TTC GGT GCT GGG ACC AAG CTG GAA ATA AAA CGG336

Glu Wal Pro Leu Tre Fen Gil Ala Gli Tre Liz Leu Glu Ile Liz Arg

181 342

220

225

230

GCG

Ala

339 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID. 6:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 113 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID. 6:

Asp Ile Glu Leu 1

Gin Arg Ala Tre

Gli Ile Ser Fen

Liz Leu Leu Ile

Arg Fen Ser Gli 65

Pro Leu Glu Glu

Glu Wal Pro Leu

100

Ala

Tre Gin Ser Pro 5

Ile Ser Cys Arg

Met Asn Trp Fen 40

Tyr Gli Ala Ser

Ser Gli Ser Gli

Asp Asp Tre Ala 85

Tre Fen Gli Ala

Ala Ser Leu Ala

Ala Ser Glu Ser 25

Gin Gin Liz Pro

Asn Gin Gli Ser

Tre Asp Fen Ser

Met Tyr Fen Cys 90

Gli Tre Liz Leu

105

Wal Ser Leu Gli

Wal Asp Asn Fen

Gli Gin Pro Pro 45

Gli Wal Pro Ala

Leu Asn Ile His

Gin Gin Ser Liz

Glu Ile Liz Arg

110 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID. 7:

181 342 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 357 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ni) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) BEZSENSOWNA: NIE (v) TYP FRAGMENTU: N-terminal (Vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: mysz (B) SZCZEP: Balb/c (D) STOPIEŃ ROZWOJU: dorosłe (F) TYP TKANKI: węzeł limfatyczny (vil) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: L212B (ciężki łańcuch) (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) MIEJSCE:1..357 (XI) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID. 7:

CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCT GGA CCT GAG CTG GTG AAG CCT GGG GCT

Gin Wal Gin Leu Gin Glu Ser Gli Pro Glu Leu Wal Liz Pro Gli Ala

115 120 125

TTA GTG AAG ATA TCC TGC AAG GCT TCT GGT TAC ACC TTC ACC AGC TAC

Leu Wal Liz Ile Ser Cys Liz Ala Ser Gli Tyr Tre Fen Tre Ser Tyr

130 135 140 145

TGG ATG CAC TGG GTG AAG CAG AGG CCT GGA CAA GGC CTT GAG TGG ATC

144

Trp Met His Trp Wal Liz Gin Arg Pro Gli Gin Gli Leu Glu Trp Ile

181 342

150 155 160

GGA

GAG

ATT GAT

CCT TCT

GAT

AGT

TAT

ACT

AAC

TAC

AAT

CAA

AAG

TTG

192

Gli

Glu

Ile

Asp 165

Pro

Ser

Asp

Ser

Tyr 170

Tre

Asn

Tyr

Asn

Gin 175

Liz

Fen

AAG

GGC

AAG

GCC

ACA

TTG

ACT

GTA

GAC

ΆΑΑ

TCC

TCC

AAC

ACA

GCC

TAC

240

Liz

Gli

Liz 180

Ala

Tre

Leu

Tre

Wal 185

Asp

Liz

Ser

Ser

Asn 190

Tre

Ala

Tyr

ATG

CAG

CTC

AGC

AGC

CTG

ACA

TCT

GAG

GAC

TCT

GCG

GTC

TAT

TAC

TGT

288

Met

Gin 195

Leu

Ser

Ser

Leu

Tre 200

Ser

Glu

Asp

Ser

Ala 205

Wal

Tyr

Tyr

Cys

GCA

AGA

TCG

GAC

TAC

GGT

AGT

AGC

CAC

TTT

GAC

TAC

TGG

GGC

CAA

GGG

336

Ala 210 ACC Tre (2)

Arg Ser Asp Tyr Gli Ser Ser His 215 ACG GTC ACC GTC TCC TCA Tre Wal Tre Wal Ser Ser 230 INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID. (1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 119 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID

Fen 8: . 8:

Asp 220

Tyr

Trp

Gli

Gin

Gli 225

Gin 1

Wal

Gin

Leu

Gin 5

Glu

Ser

Gli

Pro

Glu 10

Leu

Wal

Liz

Pro

Gli 15

Ala

Leu

Wal

Liz

Ile

Ser

Cys

Liz

Ala

Ser

Gli

Tyr

Tre

Fen

Tre

Ser

Tyr

181 342

Trp Met His Trp Wal Liz Gin Arg

3540

Gli Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser

5055

Liz Gli Liz Ala Tre Leu Tre Wal

6570

Met Gin Leu Ser Ser Leu Tre Ser

Ala Arg Ser Asp Tyr Gli Ser Ser

100

Tre Tre Wal Tre Wal Ser Ser

115

Pro Gli Gin Gli Leu Glu Trp Ile

Tyr Tre Asn Tyr Asn Gin Liz Fen

Asp Liz Ser Ser Asn Tre Ala Tyr

7580

Glu Asp Ser Ala Wal Tyr Tyr Cys

9095

His Fen Asp Tyr Trp Gli Gin Gli

105110 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID. 9:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 339 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) BEZSENSOWNA: NIE (v) TYP FRAGMENTU: N-terminal (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: mysz (B) SZCZEP: Balb/c (D) STOPIEŃ ROZWOJU: dorosłe (F) TYP TKANKI: węzeł limfatyczny

181 342 (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: L311D (lekki łańcuch) (1X) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) MIEJSCE:!. .339 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID. 9:

GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA GCT TCT TTG GCT GTG TCT CTA GGG48

Asp Ile Glu Leu Tre Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Wal Ser LeuGli

120 125 130135

CAG AGG GCC ACC ATC TCC TGC CGA GCC AGC GAA AGT GTT GAT AAT TTT9 6

Gin Arg Ala Tre Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Wal Asp AsnFen

140 145150

GGC ATT AGT TTT ATG AAC TGG TTC CAA CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC144

Gli Ile Ser Fen Met Asn Trp Fen Gin Gin Liz Pro Gli Gin ProPro

155 160165

AAA CTC CTC ATC TAT GGT GCA TCC AAC CAA GGA TCC GGG GTC CCT GCC192

Liz Leu Leu Ile Tyr Gli Ala Ser Asn Gin Gli Ser Gli Wal ProAla

170 175180

AGG TTT AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC AGC CTC AAC ATC CAT240

Arg Fen Ser Gli Ser Gli Ser Gli Tre Asp Fen Ser Leu Asn IleHis

185 190195

CCT TTG GAG GAG GAT GAT ACT GCA ATG TAT TTC TGT CAG CAA AGT AAG288

Pro Leu Glu Glu Asp Asp Tre Ala Met Tyr Fen Cys Gin Gin SerLiz

200 205 210215

GAG GTT CCG CTC ACG TTC GGT GCT GGG ACC AAG CTG GAG CTG AAA CGG336

Glu Wal Pro Leu Tre Fen Gli Ala Gli Tre Liz Leu Glu Leu LizArg

220 225230

GCG

339

181 342

Ala (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID. 10:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 113 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID. 10:

Asp Ile Glu Leu Tre Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Wal Ser Leu Gli

5 1015

Gin Arg Ala Tre Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Wal Asp Asn Fen

2530

Gli Ile Ser Fen Met Asn Trp Fen Gin Gin Liz Pro Gli Gin Pro Pro

4045

Liz Leu Leu Ile Tyr Gli Ala Ser Asn Gin Gli Ser Gli Wal Pro Ala

5560

Arg Fen Ser Gli Ser Gli Ser Gli Tre Asp Fen Ser Leu Asn IleHis

70 7580

Pro Leu Glu Glu Asp Asp Tre Ala Met Tyr Fen Cys Gin Gin SerLiz

9095

Glu Wal Pro Leu Tre Fen Gli Ala Gli Tre Liz Leu Glu Leu Liz Arg

100 105110

Ala (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID. 11:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 357 par zasad

181 342 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (lii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) BEZSENSOWNA: NIE (v) TYP FRAGMENTU: N-termmal (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: mysz (B) SZCZEP: Balb/c (D) STOPIEŃ ROZWOJU: dorosłe (F) TYP TKANKI: węzeł limfatyczny (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: L3 11D (ciężki łańcuch) (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) MIEJSCE:1..357 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID. 11:

GAG GTG CAG CTG CAG CAG TCT GGG GCT GAG CTT GTG AAG CCT GGG GCT48

G1U Wal Gin Leu Gin GIN Ser Gli aLA Glu Leu Wal Liz Pro GliAla

115 120125

TCA GTG AAG CTG TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTC ACC AGC TAC96 ser Wal Liz Leu Ser Cys Liz Ala Ser Gli Tyr Tre Fen Tre SerTyr

130 135 140145

TGG ATG CAC TGG GTG AAG CAG AGG CCT GGA CAA GGC CTT GAG TGG ATC144

Trp Met His Trp Wal Liz Gin Arg Pro Gli Gin Gli Leu Glu TrpIle

150 155160

GGA GAG ATT GAT CCT TCT GAT AGT TAT ACT AAC TAC AAT CAA AAG TTG 192

181 342

Gli

Glu

Ile

Asp 165

Pro

Ser

Asp

Ser

Tyr 170

Tre

Asn

Tyr

Asn

Gin 175

Liz

Fen

AAG

GGC

AAG

GCC

ACA

TTG

ACT

GTA

GAC

AAA

TCC

TCC

AGC

ACA

GCC

TAC

240

Liz

Gli

Liz 180

Ala

Tre

Leu

Tre

Wal 185

Asp

Liz

Ser

Ser

Ser 190

Tre

Ala

Tyr

ATG

CAG

CTC

AGC

AGC

CTG

ACA

TCT

GAG

GAC

TCT

GCG

GTC

TAT

TAC

TGT

288

Met

Gin 195

Leu

Ser

Ser

Leu

Tre 200

Ser

Glu

Asp

Ser

Ala 205

Wal

Tyr

Tyr

Cys

GCA

AGA

TCG

GAC

TAC

GGT

AGT

AGC

CAC

TTT

GAC

TAC

TGG

GGC

CAA

GGG

336

Ala 210 ACC Tre

Arg ACG Tre

Ser GTC Wal

Asp ACC Tre

Tyr GTC Wal

Gli 215 TCC Ser

Ser TCA Ser

Ser

His

Fen

Asp 220

Tyr

Trp

Gli

Gin

Gli 225

230 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID. 12:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 119 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI:

(xi) OPIS SEKWENCJI:

Glu Wal Gin Leu Gin Gin 1 5

Ser Wal Liz Leu 5er Cys

Trp Met His Trp Wal Liz białko

SEKW. NR ID. 12:

Ser Gli Ala Glu Leu

Liz Ala Ser Gli Tyr

Gin Arg Pro Gli Gin

Wal Liz Pro Gli Ala

Tre Fen Tre Ser Tyr

Gli Leu Glu Trp Ile

181 342

Gli Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Tre Asn Tyr Asn Gin Liz Fen

5560

Liz Gli Liz Ala Tre Leu Tre Wal Asp Liz Ser Ser Ser Tre AlaTyr

70 7580

Met Gin Leu Ser Ser Leu Tre Ser Glu Asp Ser Ala Wal Tyr TyrCys

9095

Ala Arg Ser Asp Tyr Gli Ser Ser His Fen Asp Tyr Trp Gli Gin Gli

100 105110

Tre Tre Wal Tre Wal Ser Ser

115 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID. 13:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 327 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) BEZSENSOWNA: NIE (v) TYP FRAGMENTU: N-terminal (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: mysz (B) SZCZEP: Balb/c (D) STOPIEŃ ROZWOJU: dorosłe (F) TYP TKANKI: węzeł limfatyczny (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: S4 2D (lekki łańcuch)

181 342 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) MIEJSCE:1..327 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID. 13:

GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA ACC ACC ATG GCT GCA TCT CCC GGG4 8

Asp Ile Glu Leu Tre Gin Ser Pro Tre Tre Met Ala Ala Ser ProGli

120 125 130135

GAG AAG ATC ACT ATC ACC TGC AGT GCC AGC TCA AGT ATA AGT TCC AAT96

Glu Liz Ile Tre Ile Tre Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser SerAsn

140 145150

TAC TTG CAT TGG TAT CAG CAG AAG CCA GGA TTC TCC CCT AAA CTC TTG144

Tyr Leu His Trp Tyr Gin Gin Liz Pro Gli Fen Ser Pro Liz LeuLeu

155 160165

ATT TAT AGG AC A TCC AAT CTG GCT TCT GGA GTC CCA GCT CGC TTC AGT192

Ile Tyr Arg Tre Ser Asn Leu Ala Ser Gli Wal Pro Ala Arg FenSer

170 175180

GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATT GGC ACC ATG GAG2 40

Gli Ser Gli Ser Gli Tre Ser Tyr Ser Leu Tre Ile Gli Tre MetGlu

185 190195

GCT GAA GAT GTT GCC ACT TAC TAC TGC CAG CAG GGT AGT AGT ATA CCA288

Ala Glu Asp Wal Ala Tre Tyr Tyr Cys Gin Gin Gli Ser Ser IlePro

200 205 210215

CGC ACG TTC GGA GGG GGC ACC AAG CTG GAA ATC AAA CGG327

Arg Tre Fen Gli Gli Gli Tre Liz Leu Glu Ile Liz Arg

220225 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID. 14:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

181 342 (A) DŁUGOŚĆ: 109 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (Xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID. 14:

Asp Ile Glu Leu Tre Gin Ser Pro Tre Tre Met Ala Ala Ser Pro Gli

1015

Glu Liz Ile Tre Ile Tre Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ser Asn

2530

Tyr Leu His Trp Tyr Gin Gin Liz Pro Gli Fen Ser Pro Liz Leu Leu

4045

Ile Tyr Arg Tre Ser Asn Leu Ala Ser Gli Wal Pro Ala Arg Fen Ser

5560

Gli Ser Gli Ser Gli Tre Ser Tyr Ser Leu Tre Ile Gli Tre MetGlu

70 7580

Ala Glu Asp Wal Ala Tre Tyr Tyr Cys Gin Gin Gli Ser Ser IlePro

9095

Arg Tre Fen Gil Gli Gli Tre Liz Leu Glu Ile Liz Arg

100105 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID. 15:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 354 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (11) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (111 ) HIPOTETYCZNA: NIE

181 342 (iv) BEZSENSOWNA: NIE (V) TYP FRAGMENTU: N-terminal (VI) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: mysz (B) SZCZEP: Balb/c (D) STOPIEŃ ROZWOJU: dorosłe (F) TYP TKANKI: węzeł limfatyczny (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: 542D (ciężki łańcuch) (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) MIEJSCE:1..354 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID. 15:

GAG GTC AAG CTG CAG CAG TCA GGA CCT GAG CTG GTA AAG CCT GGG GCT48

Glu Wal Liz Leu Gin Gin Ser Gli Pro Glu Leu Wal Liz Pro GliAla

110 115 120125

TCA GTG AAG ATG TCC TGC AAG GCT TCT GGA TAC GCA TTC ATA AGT TTT96

Ser Wal Liz Met Ser Cys Liz Ala Ser Gli Tyr Ala Fen Ile SerFen

130 135140

GTT ATG CAC TGG GTG AAG CAG AAG CCT GGG CAG GGC CTT GAG TGG ATT144

Wal Met His Trp Wal Liz Gin Liz Pro Gli Gin Gli Leu Glu TrpIle

145 150155

GGA TTT ATT AAT CCT TAC AAT GAT GGT ACT AAG TAC AAT GAG AAG TTC192

Gli Fen Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gli Tre Liz Tyr Asn Glu LizFen

160 165170

AAA GAC AAG GCC ACA CTG ACT TCA GAC AAA TCC TCC AGC ACA GCC TAC240

Liz Asp Liz Ala Tre Leu Tre Ser Asp Liz Ser Ser Ser Tre Ala Tyr

175

180

185

181 342

ATG GAG CTC AGC AGC CTG ACC TCT

Met Glu Leu Ser Ser Leu Tre Ser

190 195

GCA AGT GGG GAT TAC GAC AGG GCT

Ala Ser Gli Asp Tyr Asp Arg Ala

210

ACG GTC ACC GTC TCC TCA

GAG GAC TCT GCG GTC TAT TAC TGT288

Glu Asp Ser Ala Wal Tyr TyrCys

200205

ATG GAC TAC TGG GGC CAA GGG ACC336

Met Asp Tyr Trp Gli Gin GliTre

215220

354

Tre Wal Tre Wal Ser Ser

225 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID. 16:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 118 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (Xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID. 16:

Glu Wal Liz Leu Gin Gin Ser Gli

Ser Wal Liz Met Ser Cys Liz Ala

Wal Met His Trp Wal Liz Gin Liz

3540

Gli Fen Ile Asn Pro Tyr Asn Asp

5055

Liz Asp Liz Ala Tre Leu Tre Ser

6570

Met Glu Leu Ser Ser Leu Tre Ser

Pro Glu Leu Wal Liz Pro Gli Ala

1015

Ser Gli Tyr Ala Fen Ile Ser Fen

2530

Pro Gli Gin Gli Leu Glu Trp Ile

Gli Tre Liz Tyr Asn Glu Liz Fen

Asp Liz Ser Ser Ser Tre Ala Tyr

80

Glu Asp Ser Ala Wal Tyr Tyr Cys

181 342

	85	90	95
Ala Ser Gli Asp	Tyr Asp Arg Ala Met	Asp Tyr Trp Gli Gin	Gli Tre
100	105	110
Tre Wal Tre Wal	Ser Ser
115

(2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID. 17:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 717 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) BEZSENSOWNA: NIE (v) TYP FRAGMENTU: N-terminal (VI) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: mysz (B) SZCZEP: Balb/c (D) STOPIEŃ ROZWOJU: dorosłe (F) TYP TKANKI: splenocyty (Vli) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: 4 B 2 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) MIEJSCE:1..717 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID. 17:

181 342

GAG GTG AAG CTG CAG GAG TCT GGG GGA GAC TTA GTG AAG CCT GGA GGG 48

Glu Wal Liz Leu Gin Glu Ser Gli Gli Asp Leu Wal Liz Pro Gli Gli

120 125130

TCC CTG AAA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACT TTC AGT AGC TAT96

Ser Leu Liz Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gli Fen Tre Fen Ser SerTyr

135 140 145150

GGC ATG TCT TGG GTT CGG CAG ACT CCA GAC AAG AGG CTG GAG TCT GTC144

Gli Met Ser Trp Wal Arg Gin Tre Pro Asp Liz Arg Leu Glu SerWal

155 160165

GCA ACC ATT AGT AGT GGT GGT GCT TAC ATC TAC TAT CCA GAC AGT GTG192

Ala Tre Ile Ser Ser Gli Gli Ala Tyr Ile Tyr Tyr Pro Asp SerWal

170 175180

AAG GGG CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT GCC AAG AAC ACC CTG TAC240

Liz Gli Arg Fen Tre Ile Ser Arg Asp Asn Ala Liz Asn Tre LeuTyr

185 190195

CTG CAA ATG AGC AGT CTG AAG TCT GAG GAC ACA GCC ATG TAT TAC TGT2 88

Leu Gin Met Ser Ser Leu Liz Ser Glu Asp Tre Ala Met Tyr TyrCys

200 205210

GCA AGA CTT GAA ACC GGG GAC TAT GCT TTG GAC TAC TGG GGC CAA GGG336

Ala Arg Leu Glu Tre Gli Asp Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gli GinGli

215 220 225230

ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGC GGT GGC TCG GGC GGT GGT GGG384

Tre Tre Wal Tre Wal Ser Ser Gli Gli Gli Gli Ser Gli Gli GliGli

235 240245

TCG GGT GGC GGC GGA TCT GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA GCT TCT432

Ser Gli Gli Gli Gli Ser Asp Ile Glu Leu Tre Gin Ser Pro Ala Ser

250

255

260

181 342

TTG

GCT

GTC

TCT

CTA GGG

CAG

AGG

GCC

ACC

ATA TTC

TGC

AAG

GAC

AGC

480

Leu

Ala

Wal 265

Ser

Leu

Gli

Gin

Arg 270

Ala

Tre

Ile

Fen

Cys 275

Liz

Asp

Ser

CAA

AGT

GTT

GAT

TAT

GAT

GGT

GAT

AGT

TAT

ATG

AAC

TGG

TAC

CAA

CAG

528

Gin

Ser 280

Wal

Asp

Tyr

Asp

Gli 285

Asp

Ser

Tyr

Met

Asn 290

Trp

Tyr

Gin

Gin

AAA

CCA

GGA

CAG

CCA

CCC

AAA

CTC

CTC

ATC

TAT

GCT

CGA

TCC

AAT

CTA

576

Liz 295

Pro

Gli

Gin

Pro

Pro 300

Liz

Leu

Leu

Ile

Tyr 305

Ala

Arg

Ser

Asn

Leu 310

GAA

TCT

GGG

GTC

CCT

GCC

AGG

TTT

AGT

GGC

AGT

GGG

TCT

GGG

ACA

GAC

624

Glu

Ser

Gli

Wal

Pro 315

Ala

Arg

Fen

Ser

Gli 320

Ser

Gli

Ser

Gli

Tre 325

Asp

TTC

AGC

CTC

AAC

ATC

CAT

CCT

GTG

GAG

GAG

GAT

GAT

ATT

GCA

ATG

TAT

672

Fen

Ser

Leu

Asn 330

Ile

His

Pro

Wal

Glu 335

Glu

Asp

Asp

Ile

Ala 340

Met

Tyr

TTC Fen (2)

TGT CAG CAA AGT AGG AAG GTT CCG TGG TCG TTC GGT GGA Cys Gin Gin Ser Arg Liz Wal Pro Trp Ser Fen Gli Gli 345 350 355 INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID. 18: (1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 239 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (li) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID. 18:

GGG Gli

717

Glu 1

Wal

Liz

Leu

Gin 5

Glu

Ser

Gli

Gli

Asp 10

Leu

Wal

Liz

Pro

Gli 15

Gli

Ser

Leu

Liz

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gli

Fen

Tre

Fen

Ser

Ser

Tyr

181 342

25 30

Gli

Met

Ser 35

Trp Wal

Arg

Gin

Tre 40

Pro

Asp

Liz

Arg

Leu 45

Glu

Ser

Wal

Ala

Tre

Ile

Ser

Ser

Gli

Gli

Ala

Tyr

Ile

Tyr

Tyr

Pro

Asp

Ser

Wal

Liz

50 Gli

Arg

Fen

Tre

Ile

55 Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

60 Liz

Asn

Tre

Leu

Tyr

65 Leu

Gin

Met

Ser

Ser

70 Leu

Liz

Ser

Glu

Asp

75 Tre

Ala

Met

Tyr

Tyr

80 Cys

Ala

Arg

Leu

Glu

85 Tre

Gli

Asp

Tyr

Ala

90 Leu

Asp

Tyr

Trp

Gli

95 Gin

Gli

Tre

Tre

Wal

100 Tre

Wal

Ser

Ser

Gli

105 Gli

Gli

Gli

Ser

Gli

110 Gli

Gli

Gli

Ser

Gli

115 Gli

Gli

Gli

Ser

Asp

120 Ile

Glu

Leu

Tre

Gin

125 Ser

Pro

Ala

Ser

Leu

130 Ala

Wal

Ser

Leu

Gli

135 Gin

Arg

Ala

Tre

Ile

140 Fen

Cys

Liz

Asp

Ser

145 Gin

Ser

Wal

Asp

Tyr

150 Asp

Gli

Asp

Ser

Tyr

155 Met

Asn

Trp

Tyr

Gin

160 Gin

Liz

Pro

Gli

Gin

165 Pro

Pro

Liz

Leu

Leu

170 Ile

Tyr

Ala

Arg

Ser

175 Asn

Leu

Glu

Ser

Gli

180 Wal

Pro

Ala

Arg

Fen

185 Ser

Gli

Ser

Gli

Ser

190 Gli

Tre

Asp

Fen

Ser

195 Leu

Asn

Ile

His

Pro

200 Wal

Glu

Glu

Asp

Asp

205 Ile

Ala

Met

Tyr

Fen

210 Cys

Gin

Gin

Ser

Arg

215 Liz

Wal

Pro

Trp

Ser

220 Fen

Gli

Gli

Gli

225

230

235

181 342 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID. 19:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 732 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) BEZSENSOWNA: NIE (vii) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: mysz (B) SZCZEP: Balb/c (F) TYP TKANKI: splenocyty (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: 10 D 2 (jednołańcuchowe Fv, ciężki i lekki łańcuch plus linker) (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) MIEJSCE:!..732 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID GAG GTG CAG CTG CAG CAG TCT GGG GCT

Glu Wal Gin Leu Gin Gin Ser Gli Ala

240 245

TCA GTG AAG TTG TCC TGC AAG GCT TCC

Ser Wal Liz Leu Ser Cys Liz Ala Ser

260

TGG ATG CAC TGG GTG AAG CAG AGG GCT

Trp Met His Trp Wal Liz Gin Arg Ala :

GAA CTG GTG AAG CCT GGG GCT 48

Glu Leu Wal Liz Pro Gli Ala

250 255

GGC TAC ACC TTC ACC AGC CAC 96

Gli Tyr Tre Fen Tre Ser His

265 270

GGA CAA GGC CTT GAG TGG ATC 144

Gli Gin Gli Leu Glu Trp Ile

181 342

275280

GGA GAG TTT AAT CCC AGC AAC GGC CGT

Gli Glu Fen Asn Pro Ser Asn Gli Arg

290295

AAG AGC AAG GCC ACA CTG ACT GTAGAC

Liz Ser Liz Ala Tre Leu Tre WalAsp

305310

ATG CAA CTC AGC AGC CTG ACA TCTGAG

Met Gin Leu Ser Ser Leu Tre SerGlu

320325

GCC AGT CGG GAC TAT GAT TAC GACGGA

Ala Ser Arg Asp Tyr Asp Tyr AspGli

340

CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCCTCA

Gin Gli Tre Tre Wal Tre Wal SerSer

355360

GGT GGG TCG GGT GGC GGC GGA TCTGAC

Gli Gli Ser Gli Gli Gli Gli SerAsp

370375

GCA ATC ATG TCT GCA TCT CCA GGGGAG

Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro GliGlu

385390

GCC AGC TCA AGT GTA AGT TAC ATGTAC

Ala Ser Ser Ser Wal Ser Tyr MetTyr

400405

TCC TCC CCC AGA CTC CTG ATT TAT GAC

Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp

285

AAC TAC AAT GAG AAA TTC 192

Asn Tyr Asn Glu Liz Fen

300

TCC TCC AGC ACA GCC TAC 240

Ser Ser Ser Tre Ala Tyr

315

TCT GCG GTC TAT TAC TGT 288

Ser Ala Wal Tyr Tyr Cys

330 335

TAC TTT GAC TAC TGG GGC 336

Tyr Fen Asp Tyr Trp Gli

350

GGC GGT GGC TCG GGC GGT 384

Gli Gli Gli Ser Gli Gil

365

GAG CTC ACC CAG TCT CCA 432

Glu Leu Tre Gin Ser Pro

380

GTC ACC ATG ACC TGC AGT 480

Wal Tre Met Tre Cys Ser

395

TAC CAG CAG AAA CCA GGA 528

Tyr Gin Gin Liz Pro Gli

410 415

TCC AAC CTG GCT TCT GGA 576

Ser Asn Leu Ala Ser Gli

420

425

430

181 342

GTC CCT GTT CGC TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG AGC TCT TAC TCTCTC

Wal Pro Wal Arg Fen Ser Gli Ser Gli Ser Gli Tre Ser Tyr SerLeu

435 440445

ACA ATC AGC CGA ATG GAG GCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGCCAG

Tre Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Tre Tyr Tyr CysGin

450 455460

CAG TGG AGT AGT TAC CCA CCC ATG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACCAAG

Gin Trp 5er 5er Tyr Pro Pro Met Tyr Tre Fen Gli Gli Gli TreLiz

465 470475

CTG GAA ΑΤΑ AAA

Leu Glu Ile Liz

480

624

672

720

732 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID. 20:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 244 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (li) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID. 20:

Glu Wal Gin Leu Gin Gin Ser Gli

Ser Wal Liz Leu Ser Cys Liz Ala

Trp Met His Trp Wal Liz Gin Arg

3540

Gli Glu Fen Asn Pro Ser Asn Gli

Ala Glu Leu Wal Liz Pro Gli Ala

1015

Ser Gli Tyr Tre Fen Tre Ser His

2530

Ala Gli Gin Gli Leu Glu Trp Ile

Arg Tre Asn Tyr Asn Glu Liz Fen

181 342

Liz Ser Liz Ala Tre Leu Tre Wal

70

Met Gin Leu Ser Ser Leu Tre Ser

Ala Ser Arg Asp Tyr Asp Tyr Asp

100

Gin Gli Tre Tre Wal Tre Wal Ser

115120

Gli Gli Ser Gli Gli Gli Gli Ser

130135

Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gli

145150

Ala Ser Ser Ser Wal Ser Tyr Met

165

Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

180

Wal Pro Wal Arg Fen Ser Gli Ser

195200

Tre Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu

210215

Gin Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Met

225230

Leu Glu Ile Liz

Asp Liz Ser Ser Ser Tre Ala Tyr

7580

Glu Asp Ser Ala Wal Tyr Tyr Cys

9095

Gli Arg Tyr Fen Asp Tyr Trp Gli

105110

Ser Gli Gli Gli Gli Ser Gli Gli

125

Asp Ile Glu Leu Tre Gin Ser Pro

140

Glu Liz Wal Tre Met Tre Cys Ser

155160

Tyr Trp Tyr Gin Gin Liz Pro Gli

170175

Asp Tre Ser Asn Leu Ala Ser Gli

185190

Gli Ser Gli Tre Ser Tyr Ser Leu

205

Asp Ala Ala Tre Tyr Tyr Cys Gin

220

Tyr Tre Fen Gli Gli Gli Tre Liz

235 240 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID. 21:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 732 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy

181 342 (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (IV) BEZSENSOWNA: NIE (v) TYP FRAGMENTU: N-terminal (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: mysz (B) SZCZEP: Balb/c (F) TYP TKANKI: splenocyty (Vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: 3 D 3 (jednołańcuchowe Fv, ciężki i lekki łańcuch plus linker) (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) MIEJSCE:1..732 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID. 21:.

GAG GTC CAA CTG CAG CAG TCA GGG GCT GAA CTG GTG AAG CCT GGG GCT48

Glu Wal Gin Leu Gin Gin Ser Gli Ala Glu Leu Wal Liz Pro GliAla

245 250 255260

TCA GTG AAG TTG TCC TGC AAG GCT TCC GGC TAC ACC TTC ACC AGC CAC96

Ser Wal Liz Leu Ser Cys Liz Ala Ser Gli Tyr Tre Fen Tre SerHis

265 270275

TGG ATG CAC TGG GTG AAG CAG AGG GCT GGA CAA GGC CTT GAG TGG ATC144

Trp Met His Trp Wal Liz Gin Arg Ala Gli Gin Gli Leu Glu TrpIle

280 285290

GGA GAG TTT AAT CCC AGC AAC GGC CGT ACT AAC TAC AAT GAG AAA ATC192

Gli Glu Fen Asn Pro Ser Asn Gli Arg Tre Asn Tyr Asn Glu LizIle

181 342

295300

AAG AGC AAG GCC ACA CTG ACT GTAGAC

Liz Ser Liz Ala Tre Leu Tre WalAsp

310315

ATG CAA CTC AGC AGC CTG ACA TCTGAG

Met Gin Leu Ser Ser Leu Tre SerGlu

325330

GCC AGT CGG GAC TAT GAT TAC GACGGA

Ala Ser Arg Asp Tyr Asp Tyr AspGli

345

CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCCTCA

Gin Gli Tre Tre Wal Tre Wal SerSer

360365

GGT GGG TCG GGT GGC GGC GGA TCTGAC

Gli Gli Ser Gli Gli Gli Gli SerAsp

375380

ACA ATC ATG TCT GCA TCT CCA GGGGAG

Tre Ile Met Ser Ala Ser Pro GliGlu

390395

GAC AGC TCA AGT GTA AGT TAC ATGTAC

Asp Ser Ser Ser Wal Ser Tyr MetTyr

405410

TCC TCC CCC AGA CTC CTG ATT TAT GAC

Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp

425

GTC CCT GTT CGC TTC AGT GGC AGT GGG

Wal Pro Wal Arg Fen Ser Gli Ser Gli

305

TCC TCC AGC ACA GCC TAC 240

Ser Ser Ser Tre Ala Tyr

320

TCT GCG GTC TAT TAC TGT 288

Ser Ala Wal Tyr Tyr Cys

335 340

TAC TTT GAC TAC TGG GGC 336

Tyr Fen Asp Tyr Trp Gli

355

GGC GGT GGC TCG GGC GGT 384

Gli Gli Gli Ser Gli Gli

370

GAG CTC ACC CAG TCT CCA 432

Glu Leu Tre Gin Ser Pro

385

GTC ACC ATG ACC TGC AGT 480

Wal Tre Met Tre Cys Ser

400

TAC CAG CAG AAG ACA GGA 528

Tyr Gin Gin Liz Tre Gli

415 420

TCC AAC CTG GCT TCT GGA 576

Ser Asn Leu Ala Ser Gli

435

GGG ACC TCT TAC TCT CTC 624

Gli Tre Ser Tyr Ser Leu

440

445

450

181 342

ACA

ATC

AGC

CGA

ATG

GAG

GCT

GAA

GAT

GCT

GCC

ACT

TAT

TAC

TGC

CAG

672

Tre

Ile

Ser

Arg

Met

Glu

Ala

Glu

Asp

Ala

Ala

Tre

Tyr

Tyr

Cys

Gin

455

460

465

CAG

TGG

AGT

AGT

TAC

CCA

CCC

ATG

TAC

ACG

TTC

GGA

GGG

GGG

ACC

AAG

720

Gin

Trp

Ser

Ser

Tyr

Pro

Pro

Met

Tyr

Tre

Fen

Gli

Gli

Gli

Tre

Liz

470

475

480

CTG

GAA

ATA

AAA

732

Leu

Glu

Ile

Liz

485 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID. 22:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 244 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID. 22:

Glu Wal Gin Leu Gin Gin Ser Gli

Ser Wal Liz Leu Ser Cys Liz Ala

Trp Met His Trp Wal Liz Gin Arg

3540

Gli Glu Fen Asn Pro Ser Asn Gli

5055

Liz Ser Liz Ala Tre Leu Tre Wal

6570

Met Gin Leu Ser Ser Leu Tre Ser

Ala Glu Leu Wal Liz Pro Gli Ala

1015

Ser Gli Tyr Tre Fen Tre Ser His

2530

Ala Gli Gin Gli Leu Glu Trp Ile

Arg Tre Asn Tyr Asn Glu Liz Ile

Asp Liz Ser Ser Ser Tre Ala Tyr

80

Glu Asp Ser Ala Wal Tyr Tyr Cys

181 342

Ala Ser Arg Asp Tyr Asp Tyr

100

Gin Gli Tre Tre Wal Tre Wal

115

Gli Gli Ser Gli Gli Gli Gli

130 135

Tre Ile Met Ser Ala Ser Pro

145 150

Asp Ser Ser Ser Wal Ser Tyr

165

Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile

180

Wal Pro Wal Arg Fen Ser Gli

195

Tre Ile Ser Arg Met Glu Ala

210 215

Gin Trp Ser Ser Tyr Pro Pro

225 230

Leu Glu Ile Liz

9095

Asp Gli Arg Tyr Fen Asp Tyr Trp Gli

105110

Ser Ser Gli Gli Gli Gli Ser Gli Gli

120125

Ser Asp Ile Glu Leu Tre Gin Ser Pro

140

Gli Glu Liz Wal Tre Met Tre Cys Ser

155160

Met Tyr Trp Tyr Gin Gin Liz Tre Gli

170175

Tyr Asp Tre Ser Asn Leu Ala Ser Gli

185190

Ser Gli Ser Gli Tre Ser Tyr Ser Leu

200205

Glu Asp Ala Ala Tre Tyr Tyr Cys Gin

220

Met Tyr Tre Fen Gli Gli Gli Tre Liz

235240 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID. 23:

( i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 738 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (O) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA

181 342 (lii) HIPOTETYCZNA: NIE (IV) BEZSENSOWNA: NIE (v) TYP FRAGMENTU: N-terminal (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: mysz (B) SZCZEP: Balb/c (F) TYP TKANKI: splenocyty (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: 1 E 3 (jednołańcuchowe Fv, ciężki i lekki łańcuch plus linker) (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) MIEJSCE:1..738 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID. 23:

GAG GTG CAG CTG CAG CAG TCT GGG GCT GAA CTG GTG AAG CCT GGG GCT48

Glu Wal Gin Leu Gin Gin Ser Gli Ala Glu Leu Wal Liz Pro GliAla

245 250 255260

TCA GTG AAG TTG TCC TGC AAG GCT TCC GGC TAC ACC TTC ACC AGC CAC96

Ser Wal Liz Leu Ser Cys Liz Ala Ser Gli Tyr Tre Fen Tre SerHis

265 270275

TGG ATG CAC TGG GTG AAG CAG AGG GCT GGA CAA GGC CTT GAG TGG ATC144

Trp Met His Trp Wal Liz Gin Arg Ala Gli Gin Gli Leu Glu TrpIle

280 285290

GGA GAG TTT AAT CCC AGC AAC GGC CGT ACT AAC TAC AAT GAG ΆΆΆ TTC192

Gli Glu Fen Asn Pro Ser Asn Gli Arg Tre Asn Tyr Asn Glu LizFen

295 300305

AAG AGC AAG GCC ACA CTG ACT GTA GAC AAA TCC TCC AGC ACA GCT TAC240

Liz Ser Liz Ala Tre Leu Tre Wal Asp Liz Ser Ser Ser Tre Ala Tyr

181 342

310 315320

ATG CAA CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCG GTC TAT TAC TGT288

Met Gin Leu Ser Ser Leu Tre Ser Glu Asp Ser Ala Wal Tyr TyrCys

325 330 335340

GCC AGT CGG GAC TAT GAT TAC GAC GGA CGG TAC TTT GAC TAC TGG GGC336

Ala Ser Arg Asp Tyr Asp Tyr Asp Gli Arg Tyr Fen Asp Tyr TrpGli

345 350355

CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGC GGT GGC TCG GGC GGT384

Gin Gli Tre Tre Wal Tre Wal Ser Ser Gli Gli Gli Gli Ser GliGli

360 365370

GGT GGG TCG GGT GGC GGC GGA TCT GGA TCT GAC ATT GAG CTC ACC CAG432

Gli Gli Ser Gli Gli Gli Gli Ser Gli Ser Asp Ile Glu Leu TreGin

375 380'385

TCT CCA ACA ATC ATG TCT GCA TCT CCA GGG GAG AAG GTC ACC ATG ACC480

Ser Pro Tre Ile Met Ser Ala Ser Pro Gli Glu Liz Wal Tre MetTre

390 395400

TGC AGT GAC AGC TCA AGT GTA AGT TAC ATG TAC TGG TAC CAG CAG AAG528

Cys Ser Asp Ser Ser Ser Wal Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gin GinLiz

405 410 415420

CCA GGA TCC TCC CCC AGA CTC CTG ATT TAT GAC ACA TCC AAC CTG GCT576

Pro Gli Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Tre Ser Asn LeuAla

425 430435

TCT GGA GTC CCT GTT CGC TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC624

Ser Gli Wal Pro Wal Arg Fen Ser Gli Ser Gli Ser Gli Tre SerTyr

440 445450

TCT CTC ACA ATC AGC CGA ATG GAG GCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAC672

Ser Leu Tre Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Tre Tyr Tyr

455

460

465

181 342

TGC CAG CAG TGG AGT AGT TAC CCA CCC

Cys Gin Gin Trp Ser Ser Tyr Pro Pro

470 475

ACC AAG CTG GAA ATA AAA

Tre Liz Leu Glu Ile Liz

485 490

ATG TAC ACG TTC GGA GGG GGG 720

Met Tyr Tre Fen Gli Gli Gli

480

738 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID. 24:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 246 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID. 24:

Glu

Wal

Gin

Leu

Gin

Gin

Ser

Gli Ala

Glu

Leu

Wal

Liz

Pro

Gli

Ala

1

5

10

15

Ser

Wal

Liz

Leu

Ser

Cys

Liz

Ala Ser

Gli

Tyr

Tre

Fen

Tre

Ser

His

20

25

30

Trp

Met

His

Trp

Wal

Liz

Gin

Arg Ala

Gli

Gin

Gli

Leu

Glu

Trp

Ile

35

40

45

Gli

Glu

Fen

Asn

Pro

Ser

Asn

Gli Arg

Tre

Α·η

Tyr

Asn

Glu

Liz

Fen

50

55

60

Liz

Ser

Liz

Ala

Tre

Leu

Tre

Wal Asp

Liz

Ser

Ser

Ser

Tre

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Gin

Leu

Ser

Ser

Leu

Tre

Ser Glu

Asp

Ser

Ala

Wal

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Ser

Arg

Asp

Tyr

Asp

Tyr

Asp Gli

Arg

Tyr

Fen

Asp

Tyr

Trp

Gli

100

105

110

181 342

Gin Gli Tre Tre Wal Tre

115

Gli Gli Ser Gli Gli Gli

130

Ser Pro Tre Ile Met Ser

145 150

Cys Ser Asp Ser Ser Ser

165

Pro Gli Ser Ser Pro Arg

180

Ser Gli Wal Pro Wal Arg

195

Ser Leu Tre Ile Ser Arg

210

Cys Gin Gin Trp Ser Ser

225 230

Wal Ser Ser Gli Gli

120

Gli Ser Gli Ser Asp 135

Ala Ser Pro Gli Glu

155

Wal Ser Tyr Met Tyr

170

Leu Leu Ile Tyr Asp

185

Fen Ser Gli Ser Gli

200

Met Glu Ala Glu Asp 215

Tyr Pro Pro Met Tyr

235

Gli Gli Ser Gli Gli

125

Ile Glu Leu Tre Gin

140

Liz Wal Tre Met Tre

160

Trp Tyr Gin Gin Liz

175

Tre Ser Asn Leu Ala

190

Ser Gli Tre Ser Tyr

205

Ala Ala Tre Tyr Tyr

220

Tre Fen Gli Gli Gli

240

Tre Liz Leu Glu Ile Liz

245 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID. 25:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 726 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) BEZSENSOWNA: NIE

181 342 (ν) TYP FRAGMENTU: N-terminal (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: mysz (B) SZCZEP: Balb/c (F) TYP TKANKI: splenocyty (VII) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: 5 F 1 (jednołańcuchowe Fv, ciężki, lekki łańcuch, linker) (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) MIEJSCE:1..726 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID. 25:

CAG

GTG

AAA

CTG

CAG

GAG

TCT

GGG

GCT

GAA

CTG

GTG

AAG

CCT

GGG

GCT

48

Gin

Wal

Liz

Leu

Gin

Glu

Ser

Gli

Ala

Glu

Leu

Wal

Liz

Pro

Gli

Ala

250

255

260

TCA

GTG

AAG

TTG

TCC

TGC

AAG

GCT

TCC

GGC

TAC

ACC

TTC

ACC

AGC

CAC

96

Ser

Wal

Liz

Leu

Ser

Cys

Liz

Ala

Ser

Gli

Tyr

Tre

Fen

Tre

Ser

His

265

270

275

TGG

ATG

CAC

TGG

GTG

AAG

CAG

AGG

GCT

GGA

CAA

GGC

CTT

GAG

TGG

ATC

144

Trp

Met

His

Trp

Wal

Liz

Gin

Arg

Ala

Gli

Gin

Gli

Leu

Glu

Trp

Ile

280

285

290

GGA

GAG

ATT

AAT

CCC

AGA

ACG

GCG

CCT

ACT

AAC

TAC

AAT

GAG

AAA

TTC

192

Gli

Glu

Ile

Asn

Pro

Arg

Tre

Ala

Pro

Tre

Asn

Tyr

Asn

Glu

Liz

Fen

295

300

305

310

AAG

AGC

AAG

GCC

ACA

CTG

ACT

GTA

GAC

AAA

TCC

TCC

AGC

ACA

GCC

TAC

240

Liz

Ser

Liz

Ala

Tre

Leu

Tre

Wal

Asp

Liz

Ser

Ser

Ser

Tre

Ala

Tyr

315

320

325

181 342

ATG CAA CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG

Met Gin Leu Ser Ser Leu Tre Ser Glu

330335

GCC AGT CGG GAC TAT GAT TAC GACGGA

Ala Ser Arg Asp Tyr Asp Tyr AspGli

345350

CAA GGG ACA ACG GTC ACC GTC TCCTCA

Gin Gli Tre Tre Wal Tre Wal SerSer

360365

GGT GGG TCG GGT GGC GGC GGA TCTGAC

Gli Gli Ser Gli Gli Gli Gli SerAsp

375380

ACA ATC ATG TCT GCA TCT CCA GGG GAG

Tre Ile Met Ser Ala Ser Pro Gli Glu

395

GAC AGC TCA AGT GTA AGT TAC ACG TAC

Asp Ser Ser Ser Wal Ser Tyr Tre Tyr

410415

TCC TCC CCC AGA CTC CTG ATT TATGAC

Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile TyrAsp

425430

GTC CCT GTT CGC TTC AGT GGC AGTGGG

Wal Pro Wal Arg Fen Ser Gli SerGli

440445

ACA ATC AGC CGA ATG GAG GCT GAA GAT

Tre Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp

TCT GCG GTC TAT TAC TGT 288

Ser Ala Wal Tyr Tyr Cys

340

TAC TTT GAC TAC TGG GGC 336

Tyr Fen Asp Tyr Trp Gli

355

GGC GGT GGC TCG GGC GGT 384

Gli Gli Gli Ser Gli Gli

370

GAG CTC ACC CAG TCT CCA 432

Glu Leu Tre Gin Ser Pro

385 390

GTC ACC ATG ACC TGC AGT 480

Wal Tre Met Tre Cys Ser

405

TAC CAG CAG AAG ACA GGA 528

Tyr Gin Gin Liz Tre Gli

420

TCC AAC CTG GCT TCT GGA 576

Ser Asn Leu Ala Ser Gli

435

GGG ACC TCT TAC TCT CTC 624

Gli Tre Ser Tyr Ser Leu

450

GCC ACT TAT TAC TGC CAG 672

Ala Tre Tyr Tyr Cys Gin

455

460

465

470

181 342

CAG TGG AGT AGT TAC CCG CTC ACG

Gin Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Tre

475

ΑΤΑ AAA

Ile Liz

TTC GGT GCT GGG ACC /LAG CTG GAA 72 0

Fen Gli Ala Gli Tre Liz Leu Glu

480 485

726 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID. 26:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 242 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa

	(ii) (XI)	TYP CZĄSTECZKI: OPIS SEKWENCJI:	białko
SEKW. NR ID.	26:
Gin 1	Wal	Liz Leu Gin Glu 5	Ser Gli Ala	Glu Leu Wal Liz Pro Gli Ala 10 15
Ser	Wal	Liz Leu Ser Cys 20	Liz Ala Ser 25	Gli Tyr Tre Fen Tre Ser His 30
Trp	Met	His Trp Wal Liz 35	Gin Arg Ala 40	Gli Gin Gli Leu Glu Trp Ile 45
Gli	Glu 50	Ile Asn Pro Arg	Tre Ala Pro 55	Tre Asn Tyr Asn Glu Liz Fen 60
Liz 65	Ser	Liz Ala Tre Leu 70	Tre Wal Asp	Liz Ser Ser Ser Tre Ala Tyr 75 80
Met	Gin	Leu Ser Ser Leu 85	Tre Ser Glu	Asp Ser Ala Wal Tyr Tyr Cys 90 95
Ala	Ser	Arg Asp Tyr Asp 100	Tyr Asp Gli 105	Arg Tyr Fen Asp Tyr Trp Gli i 110

Gin Gli Tre Tre Wal Tre Wal Ser Ser Gli Gli Gli Gli Ser Gli Gli

181 342

115

Gli Gli Ser Gli Gli Gli Gli

130 135

Tre Ile Met Ser Ala Ser Pro

145 150

Asp Ser Ser Ser Wal Ser Tyr

165

Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile

180

Wal Pro Wal Arg Fen Ser Gli

195

Tre Ile Ser Arg Met Glu Ala

210215

Gin Trp Ser Ser Tyr Pro Leu

225230

Ile Liz

120125

Ser Asp Ile Glu Leu Tre Gin Ser

140

Gli Glu Liz Wal Tre Met Tre Cys

155

Tre Tyr Trp Tyr Gin Gin Liz Tre

170175

Tyr Asp Tre Ser Asn Leu Ala Ser

185190

Ser Gli Ser Gli Tre Ser Tyr Ser

200205

Glu Asp Ala Ala Tre Tyr Tyr Cys

220

Tre Fen Gli Ala Gli Tre Liz Leu

235

Pro

Ser 160 Gli

Gli

Leu

Gin

Glu 240 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID. 27:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 726 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ill) HIPOTETYCZNA: NIE (IV) BEZSENSOWNA: NIE (v) TYP FRAGMENTU: N-terminal (VI) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

181 342 (A) ORGANIZM: mysz (B) SZCZEP: Balb/c (F) TYP TKANKI: splenocyty (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(A) BIBLIOTEKA: 7 G 1 (jednołańcuchowe Fv, ciężki, lekki łańcuch, linker) (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) MIEJSCE:1..726 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID. 27:

GAG

GTC

AAG

CTG

CAG

CAG

TCA

GGG

GCT

GAA

CTG GTG

AAG

CCT

GGG

GCT

48

Glu

Wal

Liz

Leu

Gin

Gin

Ser

Gli

Ala

Glu

Leu

Wal

Liz

Pro

Gli

Ala

245

250

255

TCA

GTG

AAG

TTG

TCC

TGC

AAG

GCT

TCC

GGC

TAC

ACC

TTC

ACC

AGC

CAC

96

Ser

Wal

Liz

Leu

Ser

Cys

Liz

Ala

Ser

Gli

Tyr

Tre

Fen

Tre

Ser

His

260

265

270

TTG

GAT

CAC

TGG

GTG

AAG

CAG

AGG

GGC

TGG

CAA

GGC

CTT

GAG

TGG

ATC

144

Leu

Asp

His

Trp

Wal

Liz

Gin

Arg

Gli

Trp

Gin

Gli

Leu

Glu

Trp

Ile

275

280

285

290

GGA

CAG

TTT

AAT

CCC

AGC

AAC

GGC

CGT

ACT

AAC

TAC

AAT

GAG

AAA

TTC

192

Gli

Gin

Fen

Asn

Pro

Ser

Asn

Gli

Arg

Tre

Asn

Tyr

Asn

Glu

Liz

Fen

295

300

305

AAG

AGC

AAG

GCC

ACA

CTG

ACT

GTA

GAC

AAA

TCC

TCC

AGC

ACA

GCC

TAC

240

Liz

Ser

Liz

Ala

Tre

Leu

Tre

Wal

Asp

Liz

Ser

Ser

Ser

Tre

Ala

Tyr

310

315

320

ATC

GAA

CTC

AGC

AGC

CTG

ACA

TCT

GAG

GAC

TGC

TCG

GTC

TAT

TAC

TGT

288

Ile

Glu

Leu

Ser

Ser

Leu

Tre

Ser

Glu

Asp

Cys

Ser

Wal

Tyr

Tyr

Cys

325

330

335

181 342

GCC

AGT

CGG

GAC

TAT

GAT

TAC

GAC

GGA

CGG

TAC

TTT

GAC

TAC

TGG

GGC

336

Ala

Ser

Arg

Asp

Tyr

Asp

Tyr

Asp

Gli

Arg

Tyr

Fen

Asp

Tyr

Trp

Gli

CAA

340 GGG

ACC

ACG

GTC

ACC

345 GTC

TCC

TCA

GGT

GGC

350 GGT

GGC

TCG

GGC

GGT

384

Gin

Gli

Tre

Tre

Wal

Tre

Wal

Ser

Ser

Gli

Gli

Gli

Gli

Ser

Gli

Gli

355 GGT

GGG

TCG

GGT

GGC

360 GGC

GGA

TCT

GAC

ATT

365 GAG

CTC

ACC

CAG

TCT

370 CCA

432

Gli

Gli

Ser

Gli

Gli

Gli

Gli

Ser

Asp

Ile

Glu

Leu

Tre

Gin

Ser

Pro

ACA

ATC

ATG

TCT

375 GGA

TCT

CCA

GGG

GAG

380 AAG

GTC

ACC

ATG

ACC

385 TGC

AGT

480

Tre

Ile

Met

Ser

Ala

Ser

Pro

Gli

Glu

Liz

Wal

Tre

Met

Tre

Cys

Ser

GAC

AGC

TCA

390 AGT

GTA

AGT

TAC

ATG

395 TAC

TGG

TAC

CAG

CAG

400 AAG

ACA

GGA

528

Asp

Ser

Ser

Ser

Wal

Ser

Tyr

Met

Tyr

Trp

Tyr

Gin

Gin

Liz

Tre

Gli

TCC

TCC

405 CCC

AGA

CTT

CTG

ATT

410 TAT

GAC

ACA

TCC

AAC

415 CTG

GCT

TCT

GGA

576

Ser

Ser

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

Asp

Tre

Ser

Asn

Leu

Ala

Ser

Gli

GTC

420 CCT

GTT

CGC

TTC

AGT

425 GGC

AGT

GGG

TCT

GGG

430 ACC

TCT

TAC

TCT

CTC

624

Wal

Pro

Wal

Arg

Fen

Ser

Gli

Ser

Gli

Ser

Gli

Tre

Ser

Tyr

Ser

Leu

435 ACA

ATC

AGC

CGA

ATG

440 GAG

GCT

GAA

GAT

GCT

445 GCC

ACT

TAT

TAC

TGC

450 CAG

672

Tre

Ile

Ser

Arg

Met

Glu

Ala

Glu

Asp

Ala

Ala

Tre

Tyr

Tyr

Cys

Gin

CAG

TGG

AGT

AGT

455 TAC

CCG

CTC

ACG

TTC

460 GGT

GCT

GGG

ACC

AAG

465 CTG

GAA

720

Gin

Trp

, Ser

Ser

Tyr

Pro

Leu

Tre

Fen

Gli

Ala

Gli

Tre

Liz

Leu

Glu

470 475 480

ΑΤΑ ΑΆΑ

726

181 342

Ile Liz (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID. 28:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 242 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID. 28:

Glu Wal Liz Leu Gin Gin Ser Gli Ala Glu Leu Wal Liz Pro Gli

1015

Ser Wal Liz Leu Ser Cys Liz Ala Ser Gli Tyr Tre Fen Tre Ser

2530

Leu Asp His Trp Wal Liz Gin Arg Gli Trp Gin Gli Leu Glu Trp

4045

Gli Gin Fen Asn Pro Ser Asn Gli Arg Tre Asn Tyr Asn Glu Liz

5560

Liz Ser Liz Ala Tre Leu Tre Wal Asp Liz Ser Ser Ser Tre Ala

7075

Ile Glu Leu Ser Ser Leu Tre Ser Glu Asp Cys Ser Wal Tyr Tyr

9095

Ala Ser Arg Asp Tyr Asp Tyr Asp Gli Arg Tyr Fen Asp Tyr Trp

100 105110

Gin Gli Tre Tre Wal Tre Wal Ser Ser Gli Gli Gli Gli Ser Gli

115 120125

Gli Gli Ser Gli Gli Gli Gli Ser Asp Ile Glu Leu Tre Gin Ser

130 135140

Ala

His

Ile

Fen

Tyr 80

Cys

Gli

Gli

Pro

Tre Ile Met Ser Ala Ser Pro Gli Glu Liz Wal Tre Met Tre Cys Ser

181 342

145 150 155160

Asp Ser Ser Ser Wal Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gin Gin Liz Tre Gli 165 170175

Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Tre Ser Asn Leu Ala Ser Gli 180 185190

Wal Pro Wal Arg Fen Ser Gli Ser Gli Ser Gli Tre Ser Tyr Ser Leu 195 200205

Tre Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Tre Tyr Tyr Cys Gin 210 215220

Gin Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Tre Fen Gli Ala Gli Tre Liz Leu Glu

225 230 235240

Ile Liz (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID. 29:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 726 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii)· HIPOTETYCZNA: NIE (iv) BEZSENSOWNA: NIE (v) TYP FRAGMENTU: N-terminal (Vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: mysz (B) SZCZEP: Balb/c (D) STOPIEŃ ROZWOJU: dorosłe (F) TYP TKANKI: splenocyty

181 342 (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: 11 Η 1 (jednołańcuchowe Fv, ciężki i lekki łańcuch plus linker) (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) MIEJSCE:1..726 (X1) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID. 29:

GAG GTC AAG CTG CAG CAG TCA GGG GCT GAA CTG GTG AAG CCT GGG GCT48

Glu Wal Liz Leu Gin Gin Ser Gli Ala Glu Leu Wal Liz Pro GliAla

245 250255

TCA GTG AAG TTG TCC TGC AAG GCT TCC GGC TAC ACC TTC ACC AGC CAC96

Ser Wal Liz Leu Ser Cys Liz Ala Ser Gli Tyr Tre Fen Tre SerHis

260 265270

TGG ATG CAC TGG GTG AAG CAG AGG GCT GGA CAA GGC TTG GAG TGG ATC144

Trp Met His Trp Wal Liz Gin Arg Ala Gli Gin Gli Leu Glu TrpIle

275 280 285290

GGA GAG TTT AAT CCC AGC AAC GGC CGT ACT AAC TAC AAT GAG AAA TTC192

Gli Glu Fen Asn Pro Ser Asn Gli Arg Tre Asn Tyr Asn Glu LizFen

295 300305

AAG AGC AAG GCC ACA CTG ACT GTA GAC AAA TCC TCC AGC ACA GCC TAC240

Liz Ser Liz Ala Tre Leu Tre Wal Asp Liz Ser Ser Ser Tre AlaTyr

310 315320

ATG CAA CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCG GTC TAT TAC TGT288

Met Gin Leu Ser Ser Leu Tre Ser Glu Asp Ser Ala Wal Tyr TyrCys

325 330335

GCC AGT CGG GAC TAT GAT TAC GAC GGA CGG TAC TTT GAC TAC TGG GGC33 6

Ala Ser Arg Asp Tyr Asp Tyr Asp Gli Arg Tyr Fen Asp Tyr TrpGli

340

345

350

181 342

CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA

Gin Gli Tre Tre Wal Tre Wal Ser Ser

355 360

GGT GGG TCG GGT GGC GGC GGA TCT GAC

Gli Gli Ser Gli Gli Gli Gli Ser Asp

375

TCA ATC ATG TCT GCA TCT CCA GGG GAG

Ser Ile Met Ser Ala Ser Pro Gli Glu

390395

GAC AGC TCA AGT GTA AGT TAC ATGTAC

Asp Ser Ser Ser Wal Ser Tyr MetTyr

405410

TCC TCC CCC AGA CTC CTG ATT TATGAC

Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile TyrAsp

420425

GTC CCT GTT CGC TTC AGT GGC AGTGGG

Wal Pro Wal Arg Fen Ser Gli SerGli

435440

ACA ATC AGC CGA ATG GAG GCT GAA GAT

Tre Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp

455

CAG TGG AGT AGT TAC CCA CAC ACG TTC

Gin Trp Ser Ser Tyr Pro His Tre Fen

470 475

ΑΤΑ AAA

Ile Liz

GGC GGT 384

Gli Gli

370

TCT CCA 432

Ser Pro

385

TGC AGT 480

Cys Ser

ACA GGA 528

Tre Gli

TCT GGA 576

Ser Gli

TCT CTC 624

Ser Leu

450

TGC CAG 672

Cys Gin

465

CTG GAA 720

Leu Glu

GGT GGC GGT GGC TCG Gli Głi Gli Gli 5er 365

ATT GAG CTC ACC CAG Ile Glu Leu Tre Gin 380

AAG GTC ACC ATG ACC Liz Wal Tre Met Tre

400 TGG TAC CAG CAG AAG Trp Tyr Gin Gin Liz

415

ACA TCC AAC CTG GCT Tre Ser Asn Leu Ala 430

TCT GGG ACC TCT TAC Ser Gli Tre Ser Tyr 445

GCT GCC ACT TAT TAC Ala Ala Tre Tyr Tyr 460 GGT GCT GGG ACC AAG Gli Ala Gli Tre Liz

480

726 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID. 30:

181 342 (i ) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 242 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID. 30:

Glu Wal Liz Leu Gin Gin Ser Gli Ala Glu Leu Wal Liz Pro Gli Ala

1015

Ser Wal Liz Leu Ser Cys Liz Ala Ser Gli Tyr Tre Fen Tre Ser His

2530

Trp Met His Trp Wal Liz Gin Arg Ala Gli Gin Gli Leu Glu Trp Ile

4045

Gli Glu Fen Asn Pro Ser Asn Gli Arg Tre Asn Tyr Asn Glu Liz Fen

5560

Liz Ser Liz Ala Tre Leu Tre Wal Asp Liz Ser Ser Ser Tre AlaTyr

70 7580

Met Gin Leu Ser Ser Leu Tre Ser Glu Asp Ser Ala Wal Tyr TyrCys

9095

Ala Ser Arg Asp Tyr Asp Tyr Asp Gli Arg Tyr Fen Asp Tyr Trp Gli

100 105110

Gin Gli Tre Tre Wal Tre Wal Ser Ser Gli Gli Gli Gli Ser Gli Gli

115 120125

Gli Gli Ser Gli Gli Gli Gli Ser Asp Ile Glu Leu Tre Gin Ser Pro

130 135140

Ser Ile Met Ser Ala Ser Pro Gli Glu Liz Wal Tre Met Tre CysSer

145 150 155160

Asp Ser Ser Ser Wal Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gin Gin Liz TreGli

165 170 175

181 342

Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Tre Ser Asn Leu Ala Ser Gli 180 185190

Wal Pro Wal Arg Fen Ser Gli Ser Gli Ser Gil Tre Ser Tyr Ser Leu 195 200205

Tre Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Tre Tyr Tyr Cys Gin 210 215220

Gin Trp Ser Ser Tyr Pro His Tre Fen Gli Ala Gli Tre Liz Leu Glu

225 230 235240

Ile Liz (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID. 31:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 732 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (IV) ANTięSENSE: NIE (v) TYP FRAGMENTU: N-terminal (Vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: mysz (B) SZCZEP: Balb/c (F) TYP TKANKI: splenocyty (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO:

(B) KLON: 1 A 1 (jednołańcuchowe Fv, ciężki i lekki łańcuch plus linker) (1X) CECHA:

181 342 (A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) MIEJSCE:1..732 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID. 31:

GAG GTG CAG CTG CAG CAG TCT GGG GCT GAA CTG GTG AAG CCT GGG GCT 48

Glu Wal Gin Leu Gin Gin Ser Gli Ala Glu Leu Wal Liz Pro Gli Ala

245 250255

TCA GTG AAG TTG TCC TGC AAG GCT TCC GGC TAC ACC TTC ACC AGC CAC96

Ser Wal Liz Leu Ser Cys Liz Ala Ser Gli Tyr Tre Fen Tre SerHis

260 265270

TGG ATG CAC TGG GTG AAG CAG AGG GCT GGA CAA GGC CTT GAG TGG ATC144

Trp Met His Trp Wal Liz Gin Arg Ala Gli Gin Gli Leu Glu TrpIle

275 280 285290

GGA GAG TTT AAT CCC AGC AAC GGC CGT ACT AAC TAC AAT GAG AAA TTC192

Gli Glu Fen Asn Pro Ser Asn Gli Arg Tre Asn Tyr Asn Glu LizFen

295 300305

AAG AGC AAG GCC ACA CTG ACT GTA GAC AAA TCC TCC AGC ACA GCT TAC240

Liz Ser Liz Ala Tre Leu Tre Wal Asp Liz Ser Ser Ser Tre AlaTyr

310 315320

ATG CAA CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCG GTC TAT TAC TGT2 88

Met Gin Leu Ser Ser Leu Tre Ser Glu Asp Ser Ala Wal Tyr TyrCys

325 330335

GCC AGT CGG GAC TAT GAT TAC GAC GGA CGG TAC TTT GAC TAC TGG GGC33 6

Ala Ser Arg Asp Tyr Asp Tyr Asp Gli Arg Tyr Fen Asp Tyr TrpGli

340 345350

CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGC GGT GGC TCG GGC GGT384

Gin Gli Tre Tre Wal Tre Wal Ser Ser Gli Gli Gli Gli Ser GliGli

355

360

365

370

181 342

GGT GGG TOG GGT GGC GGC GGA TCT GAC

Gli Gli Ser Gli Gli Gli Gli Ser Asp

375

ACA ATC ATG TCT GCA TCT CCA GGG GAG

Tre Ile Met Ser Ala Ser Pro Gli Glu

390395

GAC AGC TCA AGT GTA AGT TAC ATGTAC

Asp Ser Ser Ser Wal Ser Tyr MetTyr

405410

TCC TCC CCC AGA CTC CTG ATT TATGAC

Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile TyrAsp

420425

GTC CCT GTT CGC TTC AGT GGC AGTGGG

Wal Pro Wal Arg Fen Ser Gli SerGli

435440

ACA ATC AGC CGA ATG GAG GCT GAA GAT

Tre Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp

455

CAG TGG AGT AGT TAC CCA CCC ATG TAC

Gin Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Met Tyr

470 475

TTG GAA ΑΤΑ AAA

Leu Glu Ile Liz 485 (2) INFORMACJA DLA SEKWENCJI NR ID.

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 244 aminokwasy

GAG CTC ACC CAG TCT CCA 432

Glu Leu Tre Gin Ser Pro

385

GTC ACC ATG ACC TGC AGT 480

Wal Tre Met Tre Cys Ser

400

TAC CAG CAG AAG ACA GGA 528

Tyr Gin Gin Liz Tre Gli

415

TCC AAC CTG GCT TCT GGA 576

Ser Asn Leu Ala Ser Gli

430

GGG ACC TCT TAC TCT CTC 624

Gli Tre Ser Tyr Ser Leu

445 450

GCC	ACT	TAT	TAC	TGC	CAG	672
Ala	Tre	Tyr	Tyr	Cys	Gin
				465
TTC	GGA	GGG	GGG	ACA	AAG	720
Fen	Gli	Gli	Gli	Tre	Liz

480

732

181 342 (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID. 32:

Glu Wal Gin Leu Gin Gin Ser Gli Ala Glu Leu Wal Liz Pro Gli Ala

1015

Ser Wal Liz Leu Ser Cys Liz Ala Ser Gli Tyr Tre Fen Tre Ser His

2530

Trp Met His Trp Wal Liz Gin Arg Ala Gli Gin Gli Leu Glu Trp Ile

4045

Gli Glu Fen Asn Pro Ser Asn Gli Arg Tre Asn Tyr Asn Glu Liz Fen

5560

Liz Ser Liz Ala Tre Leu Tre Wal Asp Liz Ser Ser Ser Tre AlaTyr

70 7580

Met Gin Leu Ser Ser Leu Tre Ser Glu Asp Ser Ala Wal Tyr TyrCys

9095

Ala Ser Arg Asp Tyr Asp Tyr Asp Gli Arg Tyr Fen Asp Tyr Trp Gli

100 105110

Gin Gli Tre Tre Wal Tre Wal Ser Ser Gli Gli Gli Gli 5er Gli Gli

115 120125

Gli Gli Ser Gli Gli Gli Gli Ser Asp Ile Glu Leu Tre Gin Ser Pro

130 135140

Tre Ile Met Ser Ala Ser Pro Gli Glu Liz Wal Tre Met Tre CysSer

145 150 155160

Asp Ser Ser Ser Wal Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gin Gin Liz TreGli

165 170175

Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Tre Ser Asn Leu Ala Ser Gli

180

185

190

181 342

Wal Pro Wal Arg Fen Ser Gir Ser

195200

Tre Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu

210215

Gin Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Met

225230

Gli Ser Gli Tre Ser Tyr Ser Leu

205

Asp Ala Ala Tre Tyr Tyr Cys Gin

220

Tyr Tre Fen Gli Gli Gli Tre Liz

235 240

Leu Glu Ile Liz

181 342

VH: scFv

L3 11D

L2 12B L3 10A L2 1C

L2 BC L2 11C scFv

L3 11D

LZ 12B

L3 10A

L2 1C

L2 BC L2 11C scFv

L3 11D

L2 12B

L3 10A

L2 1C

L2 BC

L2 11C

VK: scFv

L3 11D

L2 128 L3 10A L2 1C

L2 BC L2 11C scFv

L3 11D

L2 12B

L3 10A

L2 1C

L2 BC L2 11C

L3 11D

L2 12B

L3 10A

L2 1C L2 BC L2 11C

FR 1

EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFT QVQLQESGPELVKPGALVKISCKASGYTFT QVKLQESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFS EVKLQQSGAELVRPEASVKLSCKTSGYIFT QVQLQESGAELVRPGASVKLSCKTSGYIFT QVQLQESGPELVRPGASVKMSCKASGYTFT

CDR2

EIDPSDSYTNYNQKFKG EIDPSDSYTNYNQKFKG TlSSGGAYIYYPDSVKG RIYPGNGSTYYNEKFKG KDLSWNGSYYNEKFKG MIDPSNSETRLNQNFRD CDR3

SDYGSSHFDY SDYGSSHFDY LETGDYALDY STSDSSLPYWYFDV STSDSSLPYWYFDV WDYGSGHFDY

CDR 1	FR2
SYWMH	WVKQRPGQGLEWIG
SYWMH	WVKQRPGQGLEWIG
SYGMS	WVRQTPDKRLESVA
NYWIH	WVKQRSGQGLEWIA
NYWIH	WVKQRSGQGLEWIA
TYWIH	WMKQRPGQGLQWIG

FR3

KATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAR KATLTVDKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAR RFTISRDNAKNTLYLOMSSLKSEDTAMYYCAR KATLTADKSSSTAYMQLSSLKSEDSAVYFCAR KATLTADKSSSTAYMQLSSLKSEDSAVYFCAR KATLSVDKSSNKAYMQLSSLTSEDSAIYYCAR

FR4

WGQGTTVTVSS

WGQGTTVTVSS

WGQGTTVTVSS

WGQGTTVTVSS

WGQGTTVTVSS

WGQGTTVTVSS

FR 1	CDR 1	FR2
Dl ELTQSPASLAVSLGQRATISC	RASESVDNFGISFMN	WFQQKPGQPPKLLIY
DIELTQSPASLAVSLGQRATISC	RASESVDNFGISFMN	WFQQKPGQPPKLLIY
DIELTQSPASLAVSLGQRATISC	RASESVEYYGTSLMQ	WFQQKPGQPPKLLIY
DIELTQSPTILSTSPGEKVTVTC	RATLGVSYMH	WYQQKPGSSPKPWIY
DIELTQSPAIMSASPGEKVTITC	SASSSVSYMH	WFQQKPGTSPKLWIY
DIELTQSPASLAASVGETVTITC	RASENIYYSLA	WYQQKQGKSPQLUY
CDR 2	FR3
GASNQGS	GVPARFSGSGSGTDFSLNIHPLEEDDTAMYFC
GASNOGS	GVPARFSGSGSGTDFSLNIHPLEEDDTAMYFC
AASNVES	GVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFC
ATSNLAS	GVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYC
STSNLAS	GYPARFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYC
SASALED	GVPSRFSGSGSGTQYSLKINNMQPEDTATYFC
CDR 3	FR4
QQSKEVPLT	FGAGTKLELKRA
QQSKEVPLT	FGAGTKLEIKRA
QQSRKVPWT	FGGGTKLEIKRA
QQWISNPPT	FGGGTKLEIKRA
QQRNSYPHT	FGAGTKLELKRA
KQTYDVPWT	FGGGTKLEIKRA

Fig. 1(A)

181 342

VH:

scFv	FR 1	CDR 1	FR2
S4 2D	EVKLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYAR	SFVMH	VWKQKPGQGLEWIG
S4 10H	EVKLQESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFS	SYGMS	WVRQTPDKRLESVA
S4 5A	EVKLQESGGDSVKPGGSLKLSCAASGFTFS	SYGMS	WVRQTPDKRLESVA
S3 12D	EVKLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIK	DTYMH	WVKQRPEQGLEWIG

scFv	CDR 2	FR3
S4 2D	FINPYNDGTKYNEKFKD	KATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCAS
S4 10H	TISSGGAYIYYPDSYKG	RFTISRDNAKNTLYLOMSSLKSEDTAMYYCAR
S4 54	TISSGGAYIYYPDSYKG	RFTISRDNAKNTLYLGMSSLKSEDTAMYYCAR
S3 12D	RIDPANGNTKYDPKFOD	RASITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCAS
scFv	CDR 3	FR4
S4 2D	GDYDRAMDY	WGQGTTVTVSS
S4 10H	LETGDYALDY	WGQGTTVTVSS
S4 5A	LETGDYAMDY	WGQGTTVTVSS
S3 12D	DYYGYEAWF-AY	WGQGTTVTVSS

VK:

scFv	FR 1	CDR1	FR2
S4 2D	DIELTQSPTTMAASPGEKITlTC	SASSSISSNYLH	WYQQKPGFSPKLUY
S4 10H	DIELTQSPASLAVSLGQRATlSC	RASESVEYYGTSLMQ	WYQQKPGQAPKLLIY
S4 5A	DIELTQSPASLAVSLGQRATISC	RASESVEYYGTSLMQ	WYQQKPGQPPKLLIY
S312D	DIELTQSPASLAVSLGQRAT1SC	RASESVDNYGISFMN	WYQQKPGQPPKLUY

scFv	CDR 2	FR3
S4 2D	RTSNLAS	GVPARFSGSGSGTSYSLTIGTMEAEDVATYYC
S4 10H	AASNVES	EVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFC
S4 5A	AASNVES	GVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFC
S3 12D	AASNOGS	GVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFC
scFv	CDR 3	FR4
S4 2D	QQGSSIPRT	FGGGTKLEiKRA
S4 10H	QQSRKVPWT	FGGGTKLEIKRA
S4 5A	QQSRKVPWT	FGGGTKLEIKRA
S3 12D	QQSKEVPWT	FGGGTKLEIKRA

Fig. 1 (Β)

181 342

IgG (ng/ml)

181 342

KindM sekwencja początkowa

AAGCTTGCCGCCACCATGGACTGGACCTGGCGCGTGTTTTGCCTGCTCBCCGTGGCTCCTG R U W T W I V F C l l A U F

Pstl BstE8

GGGCCCACAGCCAGGTGCAACTGCAGCAGTIIGGTGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCC

GAHSQVQLQ V T V S

BamHI EcoRI TCAGGTGAGTGGATCCGAATTC

S

Hindlll sekwencja początkowa intron

AAGCTTCGCCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCT7GGTAGCAACAGCTACAGGTA MGWSC1ILFLVATAT

AGGGGCTCACAGTAGCAGGCTTGAGGTCTGGACATATATATGGGTGACAAIGACATCCACTT sekwencja początkowa Ssti Xhd

T GC CTT7CTCT CCACAGGTGTCCACICCGACATTGA GCTCACCCAGTC TCCAGACAAAGCTC

G V H S 0 I E L

BamHI EcoRI

GAGCTGAAAGGTGAGTAGAATTTAAACTTTGCTTCCTCAATTGGATCCGAATTC

E L K

181 342 (A)

GAC Asp 1

ATT Ile

GAG Glu

CTC Leu

ACC CAG TCT

CCA GCC TCC

CTG Leu

GCT Ala

GCA Ala

TCT Ser

GTG Val 15

GGA Gly

48

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ala

Ser 10

GAA

ACT

GTC

ACC

ATC

ACA

TGT

CGA

GCA

AGT

GAG

AAC

ATT

TAC

TAT

AGT

96

Glu

Thr

Val

Thr 20

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala 25

Ser

Glu

Asn

Ile

Tyr 30

Tyr

Ser

TTA

GCA

TGG

TAT

CAG

CAG

AAG

CAA

GGG

AAA

TCT

CCT

CAG

CTC

CTG

ATC

144

Leu

Ala

Trp 35

Tyr

Gin

Gin

Lys

Gin 40

Gly

Lys

Ser

Pro

Gin 45

Leu

Leu

Ile

TAT

AGT

GCA

AGC

GCC

TTG

GAA

GAT

GGT

GTC

CCA

TCG

AGG

TTC

AGT

GGC

192

Tyr

Ser 50

Ala

Ser

Ala

Leu

Glu 55

Asp

Gly

Val

Pro

Ser 60

Arg

Phe

Ser

Gly

AGT

GGA

TCT

GGG

ACA

CAG

TAT

TCT

TTA

AAG

ATC

AAC

AAC

ATG

CAG

CCT

240

Ser 65

Gly

Ser

Gly

Thr

Gin 70

Tyr

Ser

Leu

Lys

Ile 75

Asn

Asn

Met

Gin

Pro 80

GAA

GAT

ACC

GCT

ACT

TAC

TTC

TGT

AAA

CAG

ACT

TAT

GAC

GTT

CCG

TGG

288

Glu ACG Thr

Aisp TTC Phe

Thr GGT Gly

Ala GGA Gly 100

Thr 85 GGG Gly

Tyr ACC Thr

Phe AAG Lys

Cys CTG Leu

Lys GAA Glu 105

Gin 90 ATA Ile

Thr AAA Lys

Tyr CGG Arg

Asp GCG Ala

Val

Pro 95

Trp

327

(B):

CAG

GTG

CAA

CTG

CAG

GAG

TCA

GGG

CCT

GAG

CTG

GTG

AGG

CCT

GGG

GCT

48

Gin 1

Val

Gin

Leu

Gin 5

Glu

Ser

Gly

Pro

Glu 10

Leu

Val

Arg

Pro

Gly 15

Ala

TCA

GTG

AAG

ATG

TCC

TGC

AAG

GCT

TCA

GGC

TAT

ACC

TTC

ACT

ACC

TAC

96

Ser

Val

Lys

Met 20

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser 25

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr 30

Thr

Tyr

TGG

ATA

CAC

TGG

ATG

AAA

CAG

AGG

CCT

GGA

CAA

GGC

CTT

CAG

TGG

ATT

144

Trp

Ile

His 35

Trp

Met

Lys

Gin

Arg 40

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu 45

Gin

Trp

Ile

GGC

ATG

ATT

GAT

CCT

TCC

AAT

AGT

GAA

ACT

AGG

TTA

AAT

CAG

AAT

TTC

192

Gly

Met 50

Ile

Asp

Pro

Ser

Asn 55

Ser

Glu

Thr

Arg

Leu 60

Asn

Gin

Asn

Phe

AGG

GAC

AAG

GCC

ACA

TTG

AGT

GTA

GAC

AAA

TCC

TCC

AAT

AAA

GCC

TAC

240

Arg 65

Asp

Lys

Ala

Thr

Leu 70

Ser

Val

Asp

Lys

Ser 75

Ser

Asn

Lys

Ala

Tyr 80

ATG

CAG

CTC

AGC

AGC

CTG

ACA

TCT

GAG

GAC

TCT

GCA

ATC

TAT

TAC

TGT

288

Met

Gin

Leu

Ser

Ser 85

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp 90

Ser

Ala

Ile

Tyr

Tyr 95

Cys

GCA

AGA

TGG

GAC

TAC

GGT

AGT

GGC

CAC

TTT

GAC

TAC

TGG

GGC

CAA

GGG

336

Ala ACC Thr

Arg ACG Thr

Trp GTC Val

Asp 100 ACC Thr

Tyr GTC Val

Gly TCC Ser

Ser TCA Ser

Gly

His 105

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly 110

Gin

Gly

357

115

Fig. 5

181 342 (A)

GAC Asp 1

ATT Ile

GAG CTC ACC CAG TCT

CCA GCT TCT TTG

GCT Ala

GTG Val

TCT Ser

CTA Leu 15

GGG Gly

48

Glu

Leu Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ala

Ser 10

Leu

CAG

AGG

GCC

ACC ATC

TCC

TGC

AGA

GCC

AGC

GAA

AGT

GTT

GAT

AAT

TTT

96

Gin

Arg

Ala

Thr Ile

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Glu

Ser

Val

Asp

Asn

Phe

20

25

30

GGC

ATT

AGT

TTT ATG

AAC

TGG

TTC

CAA

CAG

AAA

CCA

GGA

CAG

CCA

CCC

144

Gly

Ile

Ser

Phe Met

Asn

Trp

Phe

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Pro

Pro

35

40

45

AAA

CTC

CTC

ATC TAT

GGT

GCA

TCC

AAC

CAA

GGA

TCC

GGG

GTC

CCT

GCC

192

Lys

Leu

Leu

Ile Tyr

Gly

Ala

Ser

Asn

Gin

Gly

Ser

Gly

Val

Pro

Ala

50

55

60

AGG

TTT

AGT

GGC AGT

GGG

TCT

GGG

ACA

GAC

TTC

AGC

CTC

AAC

ATC

CAT

240

Arg

Phe

Ser

Gly Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Ser

Leu

Asn

Ile

His

65

70

75

80

CCT

CTG

GAG

GAG GAT

GAT

ACT

GCA

ATG

TAT

TTC

TGT

CAG

CAA

AGT

AAG

288

Pro

Leu

Glu

Glu Asp

Asp

Thr

Ala

Met

Tyr

Phe

Cys

Gin

Gin

Ser

Lys

85

90

95

GAG

GTT

CCG

CTC ACG

TTC

GGT

GCT

GGG

ACC

AAG

CTG

GAA

ATA

AAA

CGG

336

Glu

Val

Pro

Leu Thr

Phe

Gly

Ala

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

100

105

110

GCG 339

Ala (B)

CAG Gin 1

GTG Val

CAG CTG

CAG Gin 5

GAG Glu

TCT GGA CCT

GAG Glu 10

CTG GTG Leu Val

AAG Lys

CCT Pro

GGG Gly 15

GCT Ala

48

Gin

Leu

Ser

Gly

Pro

TTA

GTG

AAG

ATA

TCC

TGC

AAG

GCT

TCT

GGT

TAC ACC

TTC

ACC

AGC

TAC

96

Leu

Val

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr Thr

Phe

Thr

Ser

Tyr

20

25

30

TGG

ATG

CAC

TGG

GTG

AAG

CAG

AGG

CCT

GGA

CAA GGC

CTT

GAG

TGG

ATC

144

Trp

Met

His

Trp

Val

Lys

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

35

40

45

GGA

GAG

ATT

GAT

CCT

TCT

GAT

AGT

TAT

ACT

AAC TAC

AAT

CAA

AAG

TTC

192

Gly

Glu

Ile

Asp

Pro

Ser

Asp

Ser

Tyr

Thr

Asn Tyr

Asn

Gin

Lys

Phe

50

55

60

AAG

GGC

AAG

GCC

ACA

TTG

ACT

GTA

GAC

AAA

TCC TCC

AAC

ACA

GCC

TAC

240

Lys

Gly

Lys

Ala

Thr

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser Ser

Asn

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

ATG

CAG

CTC

AGC

AGC

CTG

ACA

TCT

GAG

GAC

TCT GCG

GTC

TAT

TAC

TGT

288

Met

Gin

Leu

Ser

Ser

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Ser Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

GCA

AGA

TCG

GAC

TAC

GGT

AGT

AGC

CAC

TTT

GAC TAC

TGG

GGC

CAA

GGG

336

Ala

Arg

Ser

Asp

Tyr

Gly

Ser

Ser

His

Phe

Asp Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

100

105

110

ACC

ACG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

357

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser .

115 Fig. 6

181 342

GAC Asp 1

ATT Ile

(A) GAG CTC Glu Leu

ACC Thr 5

CAG Gin

TCT Ser

CCA Pro

GCT Ala

TCT Ser 10

TTG Leu

GCT Ala

GTG Val

TCT Ser

CTA Leu 15

GGG Gly

48

CAG

AGG

GCC ACC

ATC

TCC

TGC

CGA

GCC

AGC

GAA

AGT

GTT

GAT

AAT

TTT

96

Gin

Arg

Ala Thr 20

Ile

Ser

cys

Arg

Ala 25

Ser

Glu

Ser

Val

Asp 30

Asn

Phe

GGC

ATT

AGT TTT

ATG

AAC

TGG

TTC

CAA

CAG

AAA

CCA

GGA

CAG

CCA

CCC

144

Gly

Ile

Ser Phe 35

Met

Asn

Trp

Phe 40

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly 45

Gin

Pro

Pro

AAA

CTC

CTC ATC

TAT

GGT

GCA

TCC

AAC

CAA

GGA

TCC

GGG

GTC

CCT

GCC

192

Lys

Leu 50

Leu Ile

Tyr

Gly

Ala 55

Ser

Asn

Gin

Gly

Ser 60

Gly

Val

Pro

Ala

AGG

TTT

AGT GGC

AGT

GGG

TCT

GGG

ACA

GAC

TTC

AGC

CTC

AAC

ATC

CAT

240

Arg 65

Phe

Ser Gly

Ser

Gly 70

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe 75

Ser

Leu

Asn

Ile

His 80

CCT

TTG

GAG GAG

GAT

GAT

ACT

GCA

ATG

TAT

TTC

TGT

CAG

CAA

AGT

AAG

288

Pro

Leu

Glu Glu

Asp 85

Asp

Thr

Ala

Met

Tyr 90

Phe

Cys

Gin

Gin

Ser 95

Lys

GAG

GTT

CCG CTC

ACG

TTC

GGT

GCT

GGG

ACC

AAG

CTG

GAG

CTG

AAA

CGG

336

Glu GCG Ala

Val

Pro Leu 100

Thr

Phe

Gly

Ala

Gly 105

Thr

Lys

Leu

Glu

Leu 110

Lys

Arg

339

(B)

GAG

GTG

CAG CTG

CAG

CAG

TCA

GGG

GCT

GAG

CTT

GTG

AAG

CCT

GGG

GCT

48

Glu 1

Val

Gin Leu

Gin 5

Gin

Ser

Gly

Ala

Glu 10

Leu

Val

Lys

Pro

Gly 15

Ala

TCA

GTG

AAG CTG

TCC

TGC

AAG

GCT

TCT

GGC

TAC

ACC

TTC

ACC

AGC

TAC

96

Ser

Val

Lys Leu 20

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser 25

Gly Tyr

Thr

Phe

Thr 30

Ser

Tyr

TGG

ATG

CAC TGG

GTG

AAG

CAG

AGG

CCT

GGA

CAA

GGC

CTT

GAG

TGG

ATC

144

Trp

Met

His Trp 35

Val

Lys

Gin

Arg 40

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu 45

Glu

Trp

Ile

GGA

GAG

ATT GAT

CCT

TCT

GAT

AGT

TAT

ACT

AAC

TAC

AAT

CAA

AAG

TTC

192

Gly

Glu 50

Ile Asp

Pro

Ser

Asp 55

Ser

Tyr

Thr

Asn

Tyr 60

Asn

Gin

Lys

Phe

AAG

GGC

AAG GCC

ACA

TTG

ACT

GTA

GAC

AAA

TCC

TCC

AGC

ACA

GCC

TAC

240

Lys 65

Gly

Lys Ala

Thr

Leu 70

Thr

Val

Asp

Lys

Ser 75

Ser

Ser

Thr

Ala

Tyr 80

ATG

CAG

CTC AGC

AGC

CTG

ACA

TCT

GAG

GAC

TCT

GCG

GTC

TAT

TAC

TGT

288

Met

Gin

Leu Ser

Ser 85

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp 90

Ser

Ala

Val

Tyr

Tyr 95

Cys

GCA

AGA

TCG GAC

TAC

GGT

AGT

AGC

CAC

TTT

GAC

TAC

TGG

GGC

CAA

GGG

336

Ala ACC Thr

Arg ACG Thr

Ser Asp 100 GTC ACC Val Thr 115

Tyr GTC Val

Gly TCC Ser

Ser TCA Ser

Ser

His 105

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly 110

Gin

Gly

357

Fig. 7

181 342 (A)

GAC Asp 1

ATT Ile

GAG Glu

CTC ACC CAG TCT

CCA ACC ACC ATG

GCT GCA TCT

CCC GGG

48

Leu

Thr 5

Gin Ser

Pro

Thr

Thr 10

Met

Ala

Ala

Ser

Pro 15

Gly

GAG

AAG

ATC

ACT

ATC

ACC TGC

AGT

GCC

AGC

TCA

AGT

ATA

AGT

TCC

AAT

96

Glu

Lys

Ile

Thr 20

Ile

Thr Cys

Ser

Ala 25

Ser

Ser

Ser

Ile

Ser 30

Ser

Asn

TAC

TTG

CAT

TGG

TAT

CAG CAG

AAG

CCA

GGA

TTC

TCC

CCT

AAA

CTC

TTG

144

Tyr

Leu

His 35

Trp

Tyr

Gin Gin

Lys 40

Pro

Gly

Phe

Ser

Pro 45

Lys

Leu

Leu

ATT

TAT

AGG

ACA

TCC

AAT CTG

GCT

TCT

GGA

GTC

CCA

GCT

CGC

TTC

AGT

192

Ile

Tyr 50

Arg

Thr

Ser

Asn Leu 55

Ala

Ser

Gly

Val

Pro 60

Ala

Arg

Phe

Ser

GGC

AGT

GGG

TCT

GGG

ACC TCT

TAC

TCT

CTC

ACA

ATT

GGC

ACC

ATG

GAG

240

Gly 65

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr Ser 70

Tyr

Ser

Leu

Thr 75

Ile

Gly

Thr

Met

Glu 80

GCT

GAA

GAT

GTT

GCC

ACT TAC

TAC

TGC

CAG

CAG

GGT

AGT

AGT

ATA

CCA

288

Ala CGC Arg

Glu ACG Thr

Asp TTC Phe

Val GGA Gly 100

Ala 85 GGG Gly

Thr Tyr GGC ACC Gly Thr

Tyr AAG Lys

Cys CTG Leu 105

Gin 90 GAA Glu

Gin ATC Ile

Gly AAA Lys

Ser CGG Arg

Ser

Ile 95

Pro

327

(B)

GAG

GTC

AAG

CTG

CAG

CAG TCA

GGA

CCT

GAG

CTG

GTA

AAG

CCT

GGG

GCT

48

Glu 1

Val

Lys

Leu

Gin 5

Gin Ser

Gly

Pro

Glu 10

Leu

Val

Lys

Pro

Gly 15

Ala

TCA

GTG

AAG

ATG

TCC

TGC AAG

GCT

TCT

GGA

TAC

GCA

TTC

ATA

AGT

TTT

96

Ser

Val

Lys

Met 20

Ser

Cys Lys

Ala

Ser 25

Gly

Tyr

Ala

Phe

Ile 30

Ser

Phe

GTT

ATG

CAC

TGG

GTG

AAG CAG

AAG

CCT

GGG

CAG

GGC

CTT

GAG

TGG

ATT

144

Val

Met

His 35

Trp

Val

Lys Gin

Lys 40

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu 45

Glu

Trp

Ile

GGA

TTT

ATT

AAT

CCT

TAC AAT

GAT

GGT

ACT

AAG

TAC

AAT

GAG

AAG

TTC

192

Gly

Phe 50

Ile

Asn

Pro

Tyr Asn 55

Asp

Gly

Thr

Lys

Tyr 60

Asn

Glu

Lys

Phe

AAA

GAC

AAG

GCC

ACA

CTG ACT

TCA

GAC

AAA

TCC

TCC

AGC

ACA

GCC

TAC

240

Lys 65

Asp

Lys

Ala

Thr

Leu Thr 70

Ser

Asp

Lys

Ser 75

Ser

Ser

Thr

Ala

Tyr 80

ATG

GAG

CTC

AGC

AGC

CTG ACC

TCT

GAG

GAC

TCT

GCG

GTC

TAT

TAC

TGT

288

Met

Glu

Leu

Ser

Ser 85

Leu Thr

Ser

Glu

Asp 90

Ser

Ala

Val

Tyr

Tyr 95

Cys

GCA

AGT

GGG

GAT

TAC

GAC AGG

GCT

ATG

GAC

TAC

TGG

GGC

CAA

GGG

ACC

336

Ala ACG Thr

Ser GTC Val

Gly ACC Thr

Asp 100 GTC Val

Tyr TCC Ser

Asp Arg TCA Ser

Ala

Met 105

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin 110

Gly

Thr

354

Fig. 8

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 70 egz

Cena 6,00 zł.

Claims (8)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Jednołańcuchowy fragment Fv przeciwciała anty-EGF-R, otrzymywany z biblioteki fag-przeciwciało konstruowanej z komórek immunizowanego ssaka, znamienny tym, że łańcuch lekki i łańcuch ciężki zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z sekwencji oznaczonych jako SEQ ID nr 1 - SEQ nr 32.
2. 2. Jednołańcuchowy fragment Fv przeciwciała anty-EGF-R według zastrz. 1, znamienny tym, że biblioteka jest konstruowana z komórek immunizowanej myszy.
3. 3. Jednołańcuchowy fragment Fv przeciwciała anty-EGF-R według zastrz. 1, znamienny tym, że biblioteka jest konstruowana z komórek (i) węzła limfatycznego, (ii) śledziony, lub (iii) komórek immunizowanych in vitro.
4. 4. Cząsteczka DNA kodująca chimeryczne przeciwciało anty-EGF-R zawierająca sekwencję DNA wybranąz sekwencji oznaczonych jako SEQ ID nr 1- SEQ nr 32, kodującą łańcuch ciężki i łańcuch lekki regionu zmiennego scFv przeciwciała anty-EGF-R i sekwencję DNA kodującą region stały ludzkiej immunoglobuliny.
5. 5. Chimeryczne przeciwciało anty-EGF-R zawierające region zmienny z sekwencjami aminokwas owymi łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego oznaczonymi jako SEQ ID nr 1 SEQ ID nr 32, region stały ludzkiego ciężkiego łańcucha gamma-1 i stały region ludzkiego lekkiego łańcucha kappa.
6. 6. Sposób wytwarzania jednołańcuchowego fragmentu Fv przeciwciała anty-EGF-R, znamienny tym, że (i) wydziela się RNA z immunizowanych komórek ssaka, korzystnie myszy, (ii) syntetyzuje się pierwszy łańcuch cDNA, (iii) wzmacnia się geny Vg i V_K w cDNA z immunizowanych komórek, (iv) klonuje się geny z odpowiednimi miejscami restrykcji w wektorze fagemidowym, (v) transformuje się prokariotyczne komórki mieszaninami ligacyjnymi, (vi) przesiewa się biblioteki przeciwciał fagowych wobec EGF-R stosując oczyszczony EGF-R, oraz (vii) wytwarza się żądany jednołańcuchowy Fv w prokariotycznych komórkach gospodarza, korzystnie E. coli.
7. 7. Sposób wytwarzania pełnego przeciwciała anty-EGF-R, znamienny tym, że klonuje się DNA kodujący zmienne regiony fragmentów Fv przeciwciała anty-EGFR wytworzonych w co najmniej jednym eukariotycznym wektorze ekspresji zawierającym genomowy DNA kodujący stałe regiony ludzkich immunoglobulin, transformuje się eukariotyczne komórki wektorem lub wektorami, oraz poddaje się ekspresji i wydziela przeciwciało.
8. 8. Farmaceutyczna kompozycja zawierająca fragmenty przeciwciał lub całe przeciwciało oraz farmaceutycznie akceptowalny nośnik, znamienna tym, że jako fragment przeciwciała zawiera jednołańcuchowy fragment Fv przeciwciała anty-EGF-R, otrzymany z biblioteki fag-przeciwciało konstruowanej z komórek immunizowanego ssaka, przy czym łańcuch lekki i łańcuch ciężki zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z sekwencji oznaczonych jako SEQ ID nr 1 SEQ ID nr 32, lub jako pełne przeciwciało, zawiera chimeryczne przeciwciało anty-EGF-R zawierające region zmienny z sekwencjami aminokwasowymi łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego oznaczonymi jako ID nr 1 - SEQ nr 32, region stały ludzkiego ciężkiego łańcucha gamma-1 i region stały ludzkiego lekkiego łańcucha kappa oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

   181 342