PL182089B1

PL182089B1 - Pharmaceutic compositions for treating diseases caused by production of il-6

Info

Publication number: PL182089B1
Application number: PL95319785A
Authority: PL
Inventors: Tadamitsu Kishimoto; Asao Katsume; Hiroyuki Saito
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd; Tadamitsu Kishimoto
Priority date: 1994-10-21
Filing date: 1995-10-20
Publication date: 2001-11-30
Also published as: NO330582B1; FI20115753L; JP4896093B2; FI20105844L; NO324046B1; RU2147442C1; FI122406B; EP2319535A2; CN1535728A; AU689657B2; AU3709995A; CZ118997A3; CN1164194A; EP2319535A3; HU225392B1; HK1067062A1; HU0304064D0; PL319785A1; FI971669A0; NO330588B1

Abstract

1. Srodek farmaceutyczny do zapobiegania lub leczenia choroby powodowanej przez wytwarzanie inter- leukiny-6, w szczególnosci takiej jak nadmierna liczba komórek plazmatycznych we krwi lub tkankach, hiper- immunoglobulinemia, anemia, zapalenie nerek, kacheksja, choroba Castlemana, rozrostowe mazangialne zapalenie nerek, zawierajacy czynnik aktywny i farmaceutycznie dopuszczalny nosnik, znamienny tym, ze jako czynnik aktywny zawiera przeciwcialo skierowane przeciw receptorowi interleukiny-6, korzystnie wybrane sposród przeciwciala MR16-1, przeciwciala PM-1 i ich pochodnych. 2. Srodek farmaceutyczny wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze zawiera rzeczone przeciwcialo w ilosci dawkowej wynoszacej od 1 do 100 mg. ( 1 2 ) OPIS PATENTOWY ( 1 9 ) PL ( 1 1 ) 182089 (13) B1 (51) IntCl7 A61K 39/395 A61P 37/02 PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest środek farmaceutyczny do zapobiegania lub leczenia choroby powodowanej przez wytwarzanie inetrleukiny-6, w szczególności takiej jak nadmierna liczba komórek plazmatycznych we krwi lub tkankach, hiperimmuno-globulinemia, anemia, zapalenie nerek, kocheksja, choroba Castlemana, rozrostowe mazangialne zapalenie nerek, zawierający

182 089 czynnik aktywny i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, charakteryzujący się tym, że jako czynnik aktywny zawiera przeciwciało skierowane przeciw receptorowi interleukiny-6, korzystnie wybrane spośród przeciwciała MR16-1, przeciwciała PM-1 i ich pochodnych. Korzystnie środek farmaceutyczny według wynalazku zawiera rzeczowe przeciwciało w ilości dawkowej wynoszącej od 1 do 100 mg.

Krótki opis rysunków

Figura 1 jest wykresem przedstawiającym zmianę przyrostów masy ciała zwierząt z każdej grupy.

Figura 2 jest wykresem przedstawiającym zmianę dodatkowego wskaźnika białka w moczu w każdej grupie. Dodatni wskaźnik białka w moczu wynosił zero w grupach innych niż grupa 1 i 3.

F igura 3 j est wykresem przedstawiaj ącym zmianę poziomu hemoglobiny w każdej grupie.

Figura 4 jest wykresem przedstawiającym zmianę ilości krwinek czerwonych w każdej grupie.

Figura 5 jest wykresem przedstawiającym zmianę ilości płytek krwi w każdej grupie.

Figura 6 jest wykresem przedstawiającym zmianę ilości krwinek białych w każdej grupie.

Figura 7 jest wykresem przedstawiającym zmianę stężenia IgGl w surowicy w każdej grupie.

Figura 8 jest wykresem przedstawiającym zmianę w stężeniu ludzkiej IL-6 w grupach od 1 do 5.

Figura 9 przestawia wynik sortowania komórek techniką fluorescencyjnych przeciwciał z zastosowaniem IgG przeciwciała kontrolnego oraz przeciwciała Gr-1 w grupach 1 i 2.

Figura 10 przedstawia wynik sortowania komórek techniką fluorescencyjnych przeciwciał z zastosowaniem IgG przeciwciała kontrolnego oraz przeciwciała Gr-1 w grupach 6 i 7.

F igura 11 jest wykresem przedstawiaj ącym masę śledziony zwierząt w każdej grupie po zakończeniu doświadczenia.

Figura 12 jest wykresem przedstawiającym zmianę masy ciała zwierząt z każdej grupy.

Figura 13 jest wykresem przedstawiającym stężenie triglicerydów w krwi myszy w 11 dniu doświadczenia.

Figura 14 jest wykresem przedstawiającym stężenie glukozy we krwi myszy w 15 dniu doświadczenia.

Figura 15 jest wykresem przedstawiającym stężenie zjonizowanego wapnia we krwi myszy w 11 dniu doświadczenia.

Figura 16 jest wykresem przedstawiającym współczynnik przeżycia myszy kontrolnych z nowotworem.

Figura 17 jest wykresem przedstawiającym masę ciała myszy w 10 i 12 dniu po rozpoczęciu doświadczenia.

Figura 18 jest wykresem przedstawiającym stężenie zjonizowanego wapnia we krwi myszy w 10 i 12 dniu po rozpoczęciu doświadczenia.

Szczegółowe wyjaśnienie

Choroby powodowane przez wytwarzanie interleukiny-6 obejmują, na przykład, nadmierną obecność komórek plazmatycznych we krwi lub tkankach, tak jak w przypadku reumatyzmu i choroby Castelmana; hiperimmunoglobulinemię; anemię, zapalenie nerek, takie jak rozrostowe mazangialne zapalenie nerek; wyniszczenie itp.

Przeciwciało skierowane przeciw receptorowi interleukiny-6 przeznaczone do stosowania w niniejszym wynalazku może być dowolnego pochodzenia lub rodzaju (monoklonalne, poliklonalne), o ile może blokować przekazywanie sygnału IL-6 i hamować aktywność biologiczną IL-6. Szczególnie korzystne jest jednak przeciwciało monoklonalne pochodzące z organizmu ssaka. Przeciwciało blokuje przekazywanie sygnału IL-6 i hamuje aktywność biologiczną IL-6 przez hamowanie wiązania IL-6 z IL-6R.

Gatunkiem zwierzęcia, z którego pochodzi komórka wytwarzająca przeciwciało monoklonalne może być każdy gatunek zwierzęcia należący do ssaków i można stosować przeciwciała ludzkie lub przeciwciała pochodzące od ssaka innego niż człowiek. Przeciwciałami

182 089 monoklonalnymi pochodzącymi od ssaka innego niż człowiek sąkorzystnie przeciwciała monoklonalne pochodzące od królików lub gryzoni, z powodu łatwości ich wytwarzania. Korzystnie, gryzonie obejmują, ale nie ograniczają się do myszy, szczurów, chemików itp.

Takie przeciwciała skierowane przeciw receptorowi interleukiny-6 obejmują, na przykład, przeciwciało MR16-1 (Tamura, T. i in., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 11924-11928, 1993), przeciwciało PM-1 (Hirata, Y. i in., J. immunol. 143: 2900-2906, 1989) itp.

Przeciwciała monoklonalne można przygotować zasadniczo, metodami znanymi w nauce w następujący sposób. A mianowicie, można je wytwarzać stosując IL-6Rjako antygen immunizujący, który stosuje się do immunizacji konwencjonalną metodą a następnie otrzymane immunocyty poddaje się fuzji ze znanymi komórkami macierzystymi konwencjonalną metodą fuzji komórek, a komórki wytwarzające przeciwciała monoklonalne przeszukuje się konwencjonalnymi metodami poszukiwania.

Bardziej szczegółowo, przeciwciała monoklonalne wytwarza się następującą metodą. Na przykład, rzeczowy antygen immunizujący można otrzymać wykorzystując sekwencję ludzkiego IL-6R podaną w europejskim zgłoszeniu patentowym numer EP 325474. Po wstawieniu sekwencji ludzkiego IL-6R do znanego układu wektora ekspresyjnego do transformacji odpowiedniej komórki gospodarza, pożądane białko IL-6R oczyszcza się z komórek gospodarza lub z supematantu ich hodowli w celu wykorzystania rzeczowego oczyszczonego białka IL-6R jako antygenu immunizuj ącego.

Ponadto, rzeczony czynnik immunizujący pochodzący od myszy można otrzymać wykorzystując sekwencję genu IL-6R myszy, który opisano w japońskiej niebadanej publikacji patentowej numer 3(1991)-155795, stosując taką samą metodę jak zastosowana dla wymienionej powyżej sekwencji genu IL-6R człowieka.

Jako antygen IL-6R, poza tymi ulegającymi ekspresji na błonie komórkowej, można użyć tych, które mogą odłączyć się od błony komórkowej (sIL-6R). sLI-6R składa się głównie z zewnątrz komórkowej domeny IL-6R związanego z błoną komórkową od związanego z błoną IL-6R różniąc się tym, że pozbawiony jest domeny transbłonowej lub domeny transbłonowej i domeny wewnątrzkomórkowej.

Ssaki immunizowane antygenem immunizuj ącym nie są szczególnie ograniczone, ale korzystnie wybiera się je biorąc pod uwagę ich kompatybilność z komórkami macierzystymi stosowanymi do fuzji komórek, i na ogół stosuje się myszy, szczury, chomiki, króliki itp.

Immunizację zwierząt antygenem uczulającym można prowadzić zgodnie z metodami powszechnie znanymi specjalistom w tej dziedzinie. Ogólna metoda obejmuje, na przykład, dootrzewnową lub podskórną iniekcję antygenu immunizuj ącego ssakowi. Szczegółowo, antygen immunizujący rozcieńczony lub zawieszony w odpowiedniej objętości PBS (soli fizjologicznej zbuforowanej fosforanami), soli fizjologicznej itp. miesza się i emulguje, jeśli jest to pożądane, aż odpowiednią ilością adiuwanta, takiego jak kompletny adiuwant Freunda, a następnie korzystną rzeczoną emulsję podaje się ssakowi kilka razy w odstępach od 4 do 21 dni. Ponadto, podczas immunizacji antygenem immunizuj ącym można stosować odpowiedni nośnik.

Po immunizacji zwierzęcia w opisany powyżej sposób i potwierdzeniu zwiększenia ilości przeciwciała w surowicy do pożądanego poziomu, z ssaka pobiera się immunocyty i poddaje je fuzji komórkowej. Jako korzystny immunocyt wymienia się szczególnie komórkę śledziony.

Korzystne komórki szpiczaka stosowane w niniej szym wynalazku jako komórki macierzyste, które poddaje się fuzji z rzeczowym immunocytem obejmująróżne znane linie komórkowe, na przykład P3 (P3x63Ag8.653)(J. Immunol. 123:1548,1978),p3-Ul (CurrentTopicsinMicrobiology and Immunology 81: 1-7, 1978), NS-1 (Eur. J. Immunol. 6: 511-519, 1976), MPC-11 (Cell, 8: 405-415,1976), SP2/0 (Nature, 276: 269-270,1978), FO (J. Immunol. Meth. 35: 1-21, 1980), S194 (J. Exp. Med. 148: 313-323, 1978), R210 (Nature, 277: 131-133, 1979) itp.

Fuzję komórkową rzeczowego immunocytu z komórką szpiczaka można przeprowadzać zasadniczo zgodnie ze znaną metodą takąjak opisana przez Milsteina i in. (Milstein i in., Methods Enzymol. 73: 3-46, 1981) itp.

182 089

Bardziej szczegółowo, rzeczoną fuzję komórkową przeprowadza się w zwykłym podłożu odżywczym w obecności na przykład czynnika przyspieszającego fuzję komórkową. Jako czynnik przyspieszający fuzję komórkową można zastosować glikol polietylenowy (PEG) lub wirusa Sendai (HVJ) itp., a jeśli jest to pożądane, dla zwiększenia wydajności fuzji komórkowej można bezpośrednio dodać czynnik wspomagający, taki jak dimetylosulfotlenek.

Zastosowaneproporcja immunocytów i komórek szpiczaka korzystnie wynosi 1 do 10 razy więcej immunocytów od komórek szpiczaka. Jako płynne podłoże hodowlane stosowane do powyższej fuzji komórek wymienia się, na przykład, podłoże płynne RPMI 1640 lub podłoże płynne MEM, które są najbardziej odpowiednie do wzrostu linii komórek szpiczaka, i inne zwykłe buliony hodowlane stosowane do hodowli komórek; można również stosować uzupełnienie surowicą, takąjak płodowa surowica cielęca (FCS) itp.

Pożądane fuzje komórkowe (hybrydomy) można tworzyć przez dokładne mieszanie danej ilości wspomnianych powyżej immunocytów z komórkami szpiczaka we wspomnianym powyżej bulionie odżywczym i dodanie roztworu PEG uprzednio ogrzanego do temperatury 37°C, na przykład roztworu PEG o średniej masie cząsteczkowej w zakresie od 1000 do 6000, w stężeniu 30 do 60% (w/v). Następnie, po stopniowym dodawaniu odpowiedniego podłoża hodowlanego i wirowaniu dla usunięcia supematantu, można usunąć czynnik pobudzający fuzję komórek itp., które są niekorzystne dla wzrostu hybrydom.

Rzeczoną hybrydomę można wyselekcjonować przez hodowanie w konwencjonalnym podłożu selekcyjnym, takim jak, na przykład, podłoże do hodowli płynnych HAT (podłoże do hodowli płynnych zawierające hipoksantynę, aminopterynę i tyminę). Hodowlę w rzeczonym podłożu HAT kontynuuje się w ciągu okresu wystarczającego do śmierci komórek innych niż pożądane hybrydomy (komórek, które nie uległy fuzji), zazwyczaj kilku dni do kilku tygodni. Następnie do przeszukiwania i identyfikacji pojedynczych klonów hybrydom wytwarzających pożądane przeciwciała stosuje się konwencjonalną metodę szeregu rozcieńczeń granicznych.

Z przygotowanych w ten sposób hybrydom wytwarzających przeciwciała monoklonalne można założyć hodowlę pochodną w konwencjonalnym podłożu płynnym i przechowywać przez długi czas w ciekłym azocie.

W celu uzyskania przeciwciała monoklonalnego z rzeczonej hybrydomy, wykorzystuje się takie metody, jak ta, w której hybrydomę hoduje się zgodnie z konwencjonalną metodą dla uzyskania supematantu hodowli, lub ta, w której hybrydomę wszczepia się i namnaża w ssaku z nią kompatybilnym, a następnie otrzymuje się przeciwciało w postaci płynu wysiękowego. Pierwsza metoda jest odpowiednia do otrzymywania przeciwciał o wysokiej czystości, podczas gdy druga metoda jest odpowiednia do wytwarzania przeciwciał w dużej ilości.

Otrzymane tymi metodami przeciwciała monoklonalne można ponadto oczyszczać stosując konwencjonalne sposoby oczyszczania, takie jak wysalanie, sączenie molekularne, chromatografia powinowactwa itp.

Zdolność tak przygotowanych przeciwciał monoklonalnych do rozpoznawania antygenu z wysokim powinowactwem i dużą dokładnością można potwierdzić konwencjonalnymi metodami immunologicznymi, takimi jak oznaczenie radioimmunologiczne (RIA), enzymatyczne oznaczenia immunologiczne (EIA, ELISA), technika fluorescencyjnych przeciwciał (analiza immunofluorescencyjna) itp.

Przeciwciało monoklonalne stosowane w niniejszym wynalazku nie ogranicza się do wytworzonego przez hybrydomę przeciwciała monoklonalnego, i może być przeciwciałem, które sztucznie zmieniono w celu obniżeniaheteroantygenowości dla ludzi. Naprzykład, można stosować przeciwciało chimeryczne, które obejmuje zmienne regiony przeciwciała monoklonalnego myszy oraz stałe regiony przeciwciała ludzkiego. Takie przeciwciało chimeryczne można wytworzyć znaną metodą wytwarzania przeciwciał chimerycznych, zwłaszcza metodą inżynierii genetycznej.

Ponadto, w niniejszym wynalazku można stosować przekształcone przeciwciało ludzkie. Jest to przeciwciało, w którym regiony determinujące komplementamość przeciwciała ludzkiego zastąpiono regionami determinującymi komplementamość przeciwciała ssaka nie będącego

182 089 człowiekiem, np. przeciwciała myszy, a ogólne metody ich inżynierii genetycznej są dobrze znane w nauce. Stosując taką znaną metodę można otrzymać przekształcone przeciwciało ludzkie, które jest użyteczne według wynalazku.

Jeśli jest to konieczne, aminokwasy regionów zrębu (FR) zmiennego regionu przeciwciała można podstawić w taki sposób, że region determinujący komplementamość odtworzonego przeciwciała ludzkiego może tworzyć odpowiednie miejsce wiążące antygen przeciwciała (Sato i in., Cancer Res. 53:1 -6,1993). Jako korzystny przykład takiego przekształconego przeciwciała ludzkiego można podać humanizowane przeciwciało PM-1 (hPM-1) (patrz międzynarodowe zgłoszenie patentowe numer WO 9219759).

Do wymienionych powyżej celów można skonstruować geny kodujące fragmenty przeciwciała, na przykład Fab lub Fv, jednołańcuchowy Fv (scFv), w którym Fv łańcuchów H i L są połączone odpowiednim łącznikiem, i uzyskać ich ekspresję w odpowiednich komórkach gospodarza, o ile fragment wiążę się z antygenem i hamuje aktywność IL-6 (patrz, na przykład, Bird i in., TIBTECH, 9:132-137,1991; Hustoni in.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883, 1988). Ponadto, dla przygotowania scFV można zastosować powyższy przekształcony region V przeciwciała można zastosować do Fv łańcuchów H i L.

W niniejszym wynalazku można stosować kompozycje farmaceutyczne do zapobiegania lub leczenia chorób powodowanych przez wytwarzanie IL-6, zawierające jako składnik aktywny przeciwciało skierowane przeciw receptorowi IL-6 według niniejszego wynalazku, o ile blokują one przekazywanie sygnału IL-6 i są skuteczne wobec chorób powodowanych przez wytwarzanie IL-6.

Kompozycje farmaceutyczne do zapobiegania lub leczenia chorób powodowanych przez wytwarzanie IL-6 można korzystnie podawać pozajelitowo, na przykład przez iniekcję dożylną, domięśniową, dootrzewnową, podskórną itp., albo ogólnoustrojowo, albo miejscowo. Ponadto, może mieć ona również postać kompozycji farmaceutycznej lub zestawu z przynajmniej jednym nośnikiem lub rozcieńczalnikiem farmaceutycznym.

Chociaż dawkowanie kompozycj i farmaceutycznych według niniej szego wynalazku może różnić się w zależności od stanów chorobowych i wieku pacjenta oraz metody podawania, konieczne jest wybranie odpowiednich dawek. Na przykład, można podawać ilość w zakresie około od 1 do 1000 mg/pacjenta, podzieloną na do 4 dawek. Alternatywnie, można je podawać w ilości od około 1 do 10 mg/kg/tydzień. Jednakże, kompozycje farmaceutyczne do zapobiegania lub leczenia według niniejszego wynalazku nie są ograniczone do tych dawek.

Kompozycji farmaceutycznej według wynalazku można nadawać postać konwencjonalnymi metodami. Na przykład, preparaty pozajelitowe można przygotowywać przez rozpuszczenie oczyszczonego przeciwciała skierowanego przeciw IL-6R w rozpuszczalniku, np. soli fizjologicznej, roztworze buforu itp., do których dodaje się czynnika przeciwadsorpcyjnego, np. Tween 80, żelatyny, albuminy surowicy ludzkiej (HSA) itp., lub mająpostać zliofilizowaną, którąprzed użyciem można przywrócić do postaci roztworu przez rozpuszczenie. Zarobki stosowane do liofilizacji obejmują, na przykład, alkohol cukrowy, taki jak mannitol, glukoza itp. lub sacharydy.

Wynalazek zostanie wyjaśniony teraz bardziej szczegółowo przez podanie poniższych przykładów odniesienia i przykładów, ale należy je rozumieć jako nie ograniczające zakresu niniejszego wynalazku w żaden sposób.

Przykład odniesienia 1. Konstruowanie myszy transgenicznej B6L⁶-IL-6

Fragment Sphl-XhoI o długości 3,3 kbp (L6-IL-6), posiadający cDNA IL-6 ludzkiej połączony z promotorem H-2L^d (Suematsu i in., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 7547, 1989) wstrzyknięto do przedjądrza zapłodnionej komórki jajowej myszy C57 BL/6J (B6) (Nihon Clea) przez mikroinjekcję zgodnie z metodą opisaną w Yamamura i in., J. Biochem. 96: 357, 1984.

Zapłodnioną komórkę jajową przeszczepiono do jajowodu samicy myszy ICR, którą poddano traktowaniu prowadzącemu do pseudociąży. Następnie noworodki mysie przeszukiwano pod kątem integracji cDNA hIL-6 przez analizę biotów Southerna strawionego EcoRI DNA pobranego z ogona, jako sondę stosując wyznakowany ³²P fragment TaqI-BanII ludzkiego

182 089 cDNA IL-6. Zwierzęta, u których wynik testu pod kątem integracji był dodatni, krzyżowano z myszami B6 dla ustalenia linii myszy posiadjących ten sam genotyp.

Przykład odniesienia 2. Przygotowywanie przeciwciała szczura skierowano przeciw IL-6R

Komórki CHO wytwarzające rozpuszczalny IL-6R myszy przygotowano jak opisali Saito i in., J. Immunol., 147, 168-173,1991). Komórki inkubowano w podłożu aMEM zawierającym 5% płodową surowicę bydlęcą (FBS) w temperaturze 37°C w nawilżonym powietrzu zawierającym 5% CO2. Odzyskano kondycjonowane podłoże i stosowano jako preparat mysiego sIL-6R. Stężenie mysiego sIL-6R w podłożu określono metodąELISA typu „sandwich” z zastosowaniem przeciwciała monoklonalnego RS 15 skierowanego przeciw IL-6R myszy (Saito i in.,

J. Immunol., 147, 168-173,1991) i króliczego przeciwciała poliklonalnego skierowanego przeciw IL-6R myszy.

sIL-6R myszy oczyszczono z preparatu sIL-6R myszy stosując kolumnę powinowactwa, ze związanym przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciw rozpuszczalnemu receptorowi IL-6 myszy (RS 12). Pięćdziesiąt mikrogramów oczyszczonego sIL-6R w kompletnym adiuwancie Freunda iniekowano podskórnie szczurowi Wistar, a następnie, po dwóch tygodniach, cztery razy, raz w tygodniu, prowadzono immunizacj ę przypominaj ącą przez podskórną iniekcj ę 50 pg sIL-6R myszy w niekompletnym adiuwancie Freunda. Po tygodniu od pierwszej iniekcji przypominającej szczurom podawano dożylnie 50 pg sIL-6R myszy w 100 pl soli fizjologicznej zbuforowanej fosforanami (PBS).

Trzy dni później ze szczurów usunięto śledziony i splenocyty poddawano fuzji z komórkami szpiczaka P3U1 myszy w stosunku 10:1. Komórki inkubowano przez noc w temperaturze 37°C w 100 pl podłoża RPMI 1640 zawierającego 10% FBS w studzienkach 96-studzienkowych płytek (Falcon 3075), a następnie dodawano do nich 100 pl podłoża zawierającego hipoksantynę/aminopterynę/tymidynę (HAT). W ciągu czterech dni codziennie połowę podłoża zastępowano podłożem HAT.

Siedem dni później hybrydomy wytwarzające przeciwciała skierowane przeciw sIL-6R myszy wyselekcjonowano w oznaczeniu wiązania sIL-6R myszy (ELISA). Krótko, 100 pl supernatantu hodowli hybrydomy inkubowano w płytce uprzednio opłaszczonej króliczym przeciwciałem skierowanym przeciw IgG szczura o stężeniu 1 pg/ml. Płytkę przemywano, a następnie inkubowano z sIL-6R myszy o stężeniu 100 pg/ml. Po przemyciu, dodawano królicze przeciwciało poliklonalne skierowane przeciw IL-6R myszy do stężenia 2 pg/ml, płytkę przemywano, a następnie inkubowano w ciągu 60 minut ze sprzęgniętym z alkalic:a^<ąfosfa1^in^iąprzeciwciałem poliklonalnym owcy skierowanym przeciw IgG królika (Tago).

Ostatecznie, po przemyciu, płytkę inkubowano z substratem fosfatazy alkalicznej (Sigma 104; fosforan p-nitrofenylu) i odczytywano przy długości fali stosując czytnik płytek (Toso). Hybrydomy, które rozpoznają sIL-6R myszy dwukrotnie sklonowano metodą rozcieńczeń granicznych. W celu przygotowania płynu wysiękowego, myszom BALB/c nu/nu dwukrotnie wstrzykiwano 0,5 ml pristane, a trzy dni później dootrzewnowo wstrzykiwano 3 x 10⁶ komórek ustalonych linii hybrydom. Dziesięć do dwudziestu dni później zbierano płyn wysiękowy i oczyszczono z niego przeciwciało monoklonalne MR16-1 stosując kolumnę białka G (Oncogene Science).

Neutralizujący wpływ przeciwciała wytwarzanego przez MR16-1 testowano przez pomiary inkorporacji ³H-tymidyny do komórek MH60.BSF2 (Matsuda i in., Eur. J. Immunol. 18: 951-956, 1988). Komórki MH60.BSF2 dodawano do 96-studzienkowej płytki w ilości 1 x 10⁴komórek/200 pi/studzienkę, a następnie dodawano IL-6 myszy (10 pg/ml) i przeciwciało .MR16-1 lub przeciwciało RS12 przed inkubacją komórek hodowlą w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2 w ciągu 44 godzin. Następnie do każdej studzienki dodawano 3H-tymidynę (1 pCi/studzienkę) i po 4 godzinach mierzono jej inkorporację.

Przykład 1

Wykorzystano trzydzieści jeden myszy transgenicznych posiadających cDNA IL-6 człowieka, które rozmnożono z myszy transgenicznej B6 IL-6 (B6 IL-6 Tgm) przygotowanej w przykładzie odniesienia 1, oraz 11 myszy z normalnych miotów nie posiadających cDNA IL-6 człowieka (obie grupy w wieku 4 tygodni; samce). B6 IL-6 T gm podzielono na pięć grup (grupy 1

182 089 do 5) po sześć zwierząt na każdą grupę, a tylko grupa 1 składała się z siedmiu zwierząt. Myszy z normalnych miotów podzilono na grupę 6, liczącą 5 myszy, i grupę 7, liczącą sześć myszy.

Schemat podawania był następujący:

Grupa 1 (B6 IL-6 Tgm): W wieku 4 tygodni (pierwszy dzień doświadczenia) dożylnie wstrzykiwano przeciwciało skierowane przeciw IgGl szczura (KH5) (przeciwciało kontrolne) w dawce 2 mg/0,2 ml, a w wieku 5 tygodni (8 dzień doświadczenia) i później dwa razy w tygodniu (co trzy lub cztery dni) podskórnie wstrzykiwano 100 pg przeciwciała kH5.

Grupa 2 (B6 IL-6 Tgm): W wieku 4 tygodni dożylnie wstrzykiwano przeciwciało MR16-1 w dawce 2 mg/0,2 ml, a w wieku 5 tygodni i później dwa razy w tygodniu podskórnie wstrzykiwano 100 pg przeciwciała MR16-1.

Grupa 3 (B6 IL-6 Tgm): W wieku 4 tygodni dożylnie wstrzykiwano 0,2 ml soli fizjologicznej zbuforowanej fosforanami, a w wieku 5 tygodni i później dwa razy w tygodniu podskórnie wstrzykiwano 100 pg MR16-1.

Grupa 4 (B6 IL-6 Tgm): W wieku 4 tygodni dożylnie wstrzykiwano 2 mg/0,2 ml MR16-1, a w wieku 5 tygodni i później raz w tygodniu podskórnie wstrzykiwano 400 pg MR16-1.

Grupa 5 (B6 IL-6 Tgm): W wieku 4 tygodni dożylnie wstrzykiwano 2 mg/0,2 ml MR16-1, a w wieku 5 tygodni i później raz w tygodniu podskórnie wstrzykiwano 1 mg MR16-1.

Grupa 6 (myszy z normalnych miotów B6): W wieku 4 tygodni dożylnie wstrzykiwano 2 mg/0,2 ml przeciwciała kontrolnego KH5, a w wieku 5 tygodni i później dwa razy w tygodniu podskórnie wstrzykiwano 100 pg KH5.

Grupa 7 (myszy z normalnych miotów B6): W wieku 4 tygodni dożylnie wstrzykiwano przeciwciało 2 mg/0,2 ml MR16-1, a w wieku 5 tygodni i później dwa razy w tygodniu podskórnie wstrzykiwano 100 pg MR16-1.

Stosowane tu metody badania były następujące:

Pomiar wagi ciała i oznaczanie białka w moczu: pomiar wagi ciała i oznaczanie białka w moczu papierkami testowymi na białko w moczu (Combistics Sankyo) prowadzono co tydzień. Odczyty białka w moczu +++ (100 do 300 mg/dl) lub wyższe uznawano za dodatnie.

Pobieranie krwi: krew pobierano z zatoki pozaoczodołowej co tydzień od rozpoczęcia doświadczenia (wiek 4 tygodni), a po zakończeniu doświadczenia (wiek 18 tygodni) pobierano całą krew z żyły głównej dolnej.

Liczba komórek krwi: stosując mikrolicznik do komórek (Sysmex F-800), określano liczbę krwinek białych (WBC), krwinek czerwonych (RBC), płytek krwi (PLT), jak również ilość hemoglobiny (HGB). Po zakończeniu doświadczenia przygotowywano rozmazy krwi dla niektórych grup (grupy 1, 2, 6 i 7) i obliczono procent odsetkowego wzoru krwinek białych.

Oznaczanie stężenia IgGl we krwi: mierzono je w oznaczeniu ELISA specyficznym wobec IgGl, jako standard stosując białko szpiczaka.

Oznaczanie stężenia IL-6 we krwi: mierzono je przez w oznaczeniu ELISA specyficznym wobec hIL-6.

Oznaczanie miana przeciwciał skierowanych przeciw IgG szczura (klasa IgG) we krwi: ponieważ podawane przeciwciało jest heterologiczne dla myszy, wytwarzanie przeciwciał skierowanych przeciw podawanemu przeciwciału mierzono w oznaczeniu ELISA stosując IgG szczura jako antygen. Wynik wyrażono w jednostkach wykorzystując jako standard surowicę IL-6 Tgm dorosłego zwierzęcia, któremu podano przeciwciało szczura.

Oznaczanie chemicznych parametrów krwi: Po zakończeniu doświadczenia w surowicach myszy z grup 1, 2, 3, 6 i 7 mierzono stężenie białka całkowitego (TP), albuminy (Alb), glukozy (Glu), triglicerydów (TG), kreatyniny (CRE), azotu mocznika krwi (BUN), wapnia (Ca), aktywność fosfatazy alkalicznej (ALP), transaminazy glutaminowopirogronianowej (GOT) i transaminazy glutaminianopirogronianowej (GPT) wykorzystując automatyczny analizator (COBAS FARA II, Roche).

Analiza FACS szpiku kostnego i splenocyty: po zakończeniu doświadczenia z jednego zwierzęcia z każdej z grup 12,6 i 7 pobrano szpik kostny i splenocyty i poddano analizie antygenów powierzchniowych komórek przez FACScan (Beckton Dickensian). Zastosowanymi prze182 089 ciwciałami były przeciwciała (Pharmingen) skierowane odpowiednio wobec Gr-1 (komórki szpiku kostnego), CD4, CD8 i B220 (splenocyty).

Autopsja: po zakończeniu doświadczenia przeprowadzono autopsję i mierzono wagę śledziony, a głównie narządy oceniono wizualnie.

Wagi ciała: zmiany wag ciała w każdej grupie przedstawiono na Fig. 1. Wzrost wystąpił w grupach 1 i 3. Wśród zwierząt z innych grup nie zaobserwowano żadnych różnic w zmianach wagi ciała.

Białko w moczu: w grupie 1 zwierzęta dodatnie pod względem białka w moczu zaczęły pojawiać się od wieku 13 tygodni (fig. 2), i cztery (dwa w wieku 16 tygodni i dwa w wieku 17 tygodni) zwierzęta z siedmiu zdechły do czasu autopsji. W innych grupach nie obserwowano jednak śmierci. W grupie 3 także dwa z sześciu zwierząt stały się dodatnie pod względem białka w moczu pod koniec doświadczenia, ale brak było wyników dodatnich w innych grupach.

Wyniki hematologiczne: w grupie 1 obserwowano obniżenie poziomu hemoglobiny (fig. 3) i liczby RBC (fig. 4), których stopień stawał się cięższy z wiekiem. Liczby płytek krwi (fig. 5) wykazywały przejściowy wzrost, ale potem szybko opadały. W grupie 3 obserwowano podobną tendencję, chociaż była ona nieznacznie opóźniona w porównaniu z grupą 1. Z drugiej strony, w żadnej z grup 2,4 i 5 nie wystąpiło ani obniżenie poziomu hemoglobiny i RBC, ani wzrost i późniejsze obniżenie liczby płytek krwi. W obserwacji odsetkowego wzoru krwinek białych w rozmazach krwi, grupa 1 wykazała podwyższenie pod względem granulocytów obojętnochłonnych i monocytów oraz obserwowano istotne obniżenia we frakcji limfocytów, choć grupa 2 wykazywała normalne wartości (Tabela 1). Nie było również znaczącej różnicy pomiędzy grupami 6 i 7.

Tabela 1

Grupa		Młode granulocyty obojętno- chłonne	Dojrzałe granulocyty obojętno- chłonne	Granulocyty kwaso- chłonne	Granulocyty zasado- chłonne	Monocyty	Limfocyty	Inne
1	Średnia	2,00	31,33	1,33	0,00	9,33	56,00	0,00
	SD*	2,00	3,79	0,58	0,00	4,93	9,54	0,00
2	Średnia	0,33	13,83	2,33	0,00	2,00	81,00	0,50
	SD*	0,52	4,17	1,03	0,00	2,28	4,82	0,55
	test t	0,0676	0,0000	0,0557	-	0,0129	0,006	0,0676
6	Średnia	0,33	14,10	2,80	0,00	1,30	81,40	0,10
	SD*	0,45	4,60	0,91	0,00	1,04	4,08	0,22
7	Średnia	0,42	10,67	2,42	0,08	0,58	85,75	0,08
	SD*	0,38	2,32	0,97	0,20	0,49	1,92	0,20
	test t	0,6484	0,1406	0,5101	0,3816	0,1644	0,0427	0,8992

SD: odchylenie standardowe

Stężenie IgGl we krwi: w grupie 1 stężenie IgGl we krwi wykazywało znaczny wzrost bezpośrednio po rozpoczęciu doświadczenia, ostatecznie osiągając wartość około 100-krotnie przewyższającą stężenie u myszy normalnych (fig. 7). W grupie 3 wzrosty stężenia IgGl zaobserwowano nieco później niż w grupie 1. W przeciwieństwie, nie występowały wzrosty stężenia IgGl w grupach 2, 4 i 5, pozostając podczas doświadczenia na prawie tym samym poziomie. Z drugiej strony, u myszy normalnych nie obserwowano zmian związanych z podawaniem przeciwciała.

Stężenie hIL-6 we krwi: stężenie hIL-6 we krwi (fig. 8) zróżnicowane było w taki sam sposób jak IgGl, wykazując wzrosty w grupach 1 i 3, a pozostając na prawie tym samym poziomie podczas doświadczenia w innych grupach.

182 089

Miano przeciwciał skierowanych przeciw IgG szczura we krwi: przeciwciała skierowane przeciw IgG szczura wykryto w grupach 1,3 i 6 (Tabela 2). Wszystkie zwierzęta w grupach 1 i 3 wykazywały wysokie miano, podczas gdy w grupie 6 tylko dwa z pięciu zwierząt wykazywało wzrost miana. Z drugiej strony, w innych grupach nie obserwowano znaczącego wzrostu.

Tabela 2

Mysie przeciwciało skierowane przeciw immunoglobulinom szczura (jednostki/ml)

Grupa	Wiek (tygodnie)	4	6	8	10	12	14	16	18
1		0,15	0,78	1,69	7,41	100<	100<	100<	100<
2		0,22	0,34	0,45	0,38	0,43	0,50	0,50	0,30
3		0,14	0,61	0,69	0,67	2,27	4,74	4,74	41,24
4		n.o.	n.o.	n.o.	n.o.	n.o.	n.o.	n.o.	0,57
5		n.o.	n.o.	n.o.	n.o.	n.o.	n.o.	n.o.	0,28
6		n.o.	n.o.	n.o.	n.o.	n.o.	n.o.	n.o.	3,55
7		n.o.	n.o.	n.o.	n.o.	n.o.	n.o.	n.o.	0,20

n.o.: nie oznaczano

Oznaczanie parametrów chemicznych krwi: w grupach 1 i 3 występował wzrost TP i obniżenie Alb. TG i ALP obniżone były w grupach 1 i 3, a w grupie 1 obniżone było nawet Glu. Żadnej z tych zmian nie obserwowano w grupie 2.

Tabela 3

Grupa		TP (g/dl)	Alb (g/dl)	Glu (mg/dl)	TG (mg/dl)	CRE (mg/dl)	BUN (mg/dl)	Ca (mg/dl)	ALP (U/l)	GOT (IU/1)	GTP (U/l)
1	Średnia	14	2,41	77,4	20,7	0,4	34,8	8,6	27,67	33,33	6
	SD	1,33	0,3	14,5	8,33	0,2	23,7	0,35	5,69	5,86	1,73
2	Średnia	5,68	3,31	199	62,3	0,51	28,3	8,67	156,5	37,5	5,6
	SD	0,3	0,2	29,5	10,9	0,22	4,08	0,58	14,31	8,22	1,14
3	Średnia	12,6	2,92	253	41	0,61	26,4	9,82	54,17	27,33	6,83
	SD	2,85	0,64	60,2	16,3	0,17	6,25	0,83	42,62	5,65	1,72
6	Średnia	5,9	3,84	289	105	0,87	27,9	8,9	181	33,2	9,6
	SD	0,65	0,46	98,9	28,8	0,22	6,32	0,74	21,24	8,9	5,81
7	Średnia	5,86	3,63	3,63	94	0,75	26,8	8,98	196,83	34,5	6,5
	SD	0,53	0,34	25,5	20	0,2	5,26	0,82	21,68	4,89	3,08

Analiza FACS; analiza komórek szpiku kostnego (BM) i splenocytów (sp) w grupach 1,2, 6 i 7 ujawniła, że w grupie 1 (fig. 9 i Fig. 10) wśród komórek BM występował skrajny wzrost stosunku komórek dodatnich pod względem Gr-1, które sąkomórkami prekursorowymi granulocytów, ale te komórki w grupie 2 wykazywały podobne wartości, jak u myszy z normalnych miotów. Zasadniczo nie występowały różnice pomiędzy grupami 6 i 7. Co się tyczy stosunku komórek dodatnich pod względem CD4, CD8 i B220 u sp, nie było żadnych różnic pomiędzy grupami, z wyjątkiem tego, że w grupie 1 ilość komórek dodatnich pod względem CD8 i B220 obniżała się w wyniku wzrostu ilości komórek plazmatycznych (Tabela 4).

182 089

Tabela 4

Analiza antygenów powierzchniowych splenocytów

Grupa	CD4+	CD8+	B220+
1	13,2%	5,4%	23,1%
2	18,5%	14,3%	50,0%
3	19,9%	15,0%	53,1%
4	13,9%	10,6%	57,3%

Obserwacje z autopsji: w grupach 1 i 3 wyraźne było obrzmienie węzłów chłonnych organizmu i powiększenie śledziony (fig. 11) oraz odbarwienie nerki. Częściowo, odnotowano również powiększenie wątroby. Zmian tych nie obserwowano w innych grupach i brak było znacznych zmian, z wyjątkiem odnotowania w grupach 2,4 i 5 nieznacznego powiększenia śledziony w porównaniu z myszami z normalnych miotów.

Wyniki tego doświadczenia zostanąteraz wyjaśnione. U IL-6 Tgm (grupa 1), którym podawano przeciwciało kontrolne, obserwowano różnorodne objawy, takie jak nadmierna ilość komórek plazmatycznych wytwarzających IgGl we krwi lub tkankach, anemia, thrombocytoza, małopłytkowość, uszkodzenia nerek, nienormalne parametry chemiczne krwi itp. Jednakże, stało się oczywiste, że objawy te można całkowicie zahamować MR16-1.

Wiadomo, że IL-6 powoduje ostateczne różnicowanie komórek B w komórki osocza [Muraguchi, A. i in., J. Exp. Med. 167: 332-344,1988], a w przypadku IL-6 Tgm, wytwarzanie IL-6 powodowało wzrost stężenia IgGl we krwi oraz wzrost stężenia TP i obniżenie stężenia Alb w surowicy. Fakty te wskazują, że wystąpił przypadek nadmiernej ilości komórek plazmatycznych we krwi.

Powodowane tym znaczne powiększenie tkanki chłonnej organizmu, takiej jak węzłów chłonnych i śledziony może być odpowiedzialne za przyrosty wagi ciała pomimo pogorszenia się ogólnych stanów, powodowanych przez postępy choroby w grupach 1 i 3. MR16-1 nie tylko całkowicie zahamowała te stany, ale również zahamowała wzrost stężenia IL-6 we krwi. A zatem, potwierdzono, że związany z wiekiem wzrost stężenie IL-6 we krwi., jak obserwowany u 11-6 Tgm, jest bezpośrednio powiązany z postępem nadmiernej ilości komórek plazmatycznych we krwi. Dlatego uważano, że namnożone komórki plazmatyczne same aktywnie wytwarzają IL-6, która dalej zwiększa wzrost komórek plazmatycznych, czego wynikiem jest wytwarzanie dużych ilości IL-6.

Jako wpływy IL-6 na komórki krwi znane są wpływ zwiększania liczby płytek krwi [Ishibashi, T. i in., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 5953-5957, 1989; Ishibashi, T. i in., Blood 74: 1241-1244,1989] i wpływ indukowania anemia makrocytowa [Hawley, R.G. i in., J. Exp. Med. 176:1149-1163,1992]. Poza powyższymi, u IL-6 Tgm obserwuje się małopłytkowość związaną z wiekiem, którą uważa się za autoimmunizację związaną z aktywacją poliklonalnych komórek B [Miyai, Tatsuya i in., ibid].

M16-1 całkowicie hamowało bezpośrednie i pośrednie wpływy IL-6 na komórki krwi, ale nie wpływało na liczbę krwinek u myszy z normalnych miotów. A zatem, potwierdzono, że przeciwciało skierowane przeciw receptorowi IL-6 w ogóle nie wpływa na komórki krwi. U IL-6 Tgm obserwowano wzrost stosunku komórek dodatnich pod względem Gr-1, które uważa się za prekursory komórek granulocytowych, oraz stosunku obwodowych granulocytów obojętnochłonnych. Chociaż wiadomo, że IL-6 zwiększa liczbę granulocytów obojętnochłonnych, nie wyjaśniono dotąd szczegółowo mechanizmu jej działania. W badaniach tych stwierdzono, że wpływ ten jest zjawiskiem mającym miejsce na poziomie komórek prekursorowych w szpiku kostnym. W badaniach tych stwierdzono także, że MR16-1 całkowicie hamuje wpływy IL-6, ale nie wpływa na poziom granulocytów obojętnochłonnych w szpiku i krwi obwodowej.

MR16-1 hamuje początek zapalenia nerek obserwowanego u IL-6 Tgm. Donoszono, że IL-6 jest ściśle związana z rozpoczynaniem się rozrostowego mezangialnego zapalenia nerek jako autocrine czynnik wzrostowy komórek mezangium. Chociaż potwierdzono, że zapalenie

182 089 nerek i IL-6 Tgm jest rozrostowym mezangialnym zapaleniem nerek, nie można wykluczyć wzmacnianego przez IL-6 udziału immunologicznego [Katsume, Asao i in., prezentacja na 21 st Meeting of Japan Immunology Society, „Characterization of SCID x (SCID x H-2L^d hIL-6 transgenic mice),” 1991 ]. W każdym razie, ponieważ występowało hamowanie pojawiania się białka w moczu i przypadków śmierci, stało się oczywiste, że przeciwciało skierowane przeciw receptorowi IL-6 jest skuteczne w hamowaniu rozpoczynania się zapalenia nerek powodowanego przez wytwarzanie IL-6.

U IL-6 Tgm obserwowano znaczące obniżenia stężeń Glu i Tg, które są wskaźnikami wyniszczenia. W niniejszym doświadczeniu stwierdzono, że podawanie przeciwciała MR16-1 jest skuteczne do poprawy stanu wyniszczenia, ponieważ wartości Glu i Tg były obniżone w grupie 1, podczas gdy w grupie 2 wartości te powróciły prawie do normalnego poziomu.

Ponieważ MR16-1 jest heterologicznym dla myszy IgGl szczura, łatwo jest przewidzieć, że mogą być wytwarzane przeciwciała skierowane przeciw podanemu przeciwciału, co mogłoby czynić podawanie przeciwciał nieskutecznym.

Podczas próby indukcji w niniejszym doświadczeniu tolerancji immunologicznej przez wystawienie na działanie dużej ilości antygenu podczas pierwszego uczulania, utworzono grupy, którym przy pierwszym podawaniu dożylnie podano 2 mg przeciwciała na mysz . Wśród grup, którym podawano M16-1, grupy poddane temu traktowaniu (grupy 1,4 i 5) nie wytwarzały wykrywalnych przeciwciał skierowanych przeciw IgG szczura bez względu na odstępy podawania i dawki, co prowadziło do całkowitego zahamowania rozpoczynania się choroby. Jednak grupa 3 wykazywała ostatecznie takie same objawy jak grupa 1, której podawano przeciwciało kontrolne, chociaż grupa 3 wykazywała wzrost stężenia przeciwciała skierowanego przeciw IgG szczura i początek choroby był nieznacznie opóźniony w porównaniu grupą 1.

Dlatego też, uważa się, że traktowanie było skuteczne do indukcji tolerancji immunologicznej , ale przeciwciało skierowane przeciw IgG szczura wykryto u wszystkich zwierząt z grupy 1 i 2/5 zwierząt z grupy 6, którym podawano przeciwciało stosując ten sam schemat. Ponieważ rozwój nadmiernej ilości komórek plazmatycznych we krwi lub tkankach indukuje aktywację poliklonalnych komórek B u IL-6 Tgm, nie można wyciągnąć wniosku, że wykryte w grupach 1 i 3 przeciwciało skierowane przeciw IgG szczura jest przeciwciałem specyficznym wobec podanego przeciwciała. Jednakże, wyciągnięto wniosek, że wpływ indukujący tolerancję immunologiczną przez wystawienie na działanie dużej ilości antygenu przy pierwszym uczulaniu w grupach 2,4 i 5, w połączeniu z hamującym wpływem na wytwarzanie specyficznych przeciwciał na skutek podania dużej ilości MR16-1, były przyczyną indukcji pełnej tolerancji.

W niniejszym doświadczeniu wyjaśniono, że przeciwciało skierowane przeciw receptorowi 11-6 jest bardzo skuteczne wobec różnych chorób powodowanych przez wytwarzanie IL-6, bez wpływu na normalny poziom.

Przykład 2

Badano wpływ przeciwciała skierowanego przeciw receptorowi IL-6 myszy w modelu indukowanego colon 26 wyniszczenia. Wykorzystano 6-tygodniowe samce myszy BALB/c, którym pierwszego dnia doświadczenia podskórne implantowano 2 mm blok colon 26. Skierowane przeciw receptorowi IL-6 myszy przeciwciało MR16-1 (patrz Przykład odniesienia 2) podawano dożylnie w dawce 2 mg/mysz bezpośrednio przed implantacją colon 26 pierwszego dnia doświadczenia, a następnie podawano podskórnie w dawce 0,5 mg/mysz w dniach 7,11, 14 i 18 (n = 7). W poprzednim doświadczeniu potwierdzono już, że neutralizujące przeciwciała skierowane przeciw białku heterologicznemu nie pojawiają się łatwo w tej metodzie. Grupie kontrolnej z nowotworem, przeciwciało kontrolne IgGl szczura (KH5) podawano według tego samego schematu (n = 7). Ponadto jako grupę kontrolną bez nowotworu, utworzono grupę, której podawano PBS (n = 7). Po rozpoczęciu doświadczenia wagę ciała mierzono codziennie, a parametry chemiczne krwi i stężenia zjonizowanego wapnia we krwi mierzono 11 i 15 dnia po rozpoczęciu doświadczenia.

Wystąpiło znaczące obniżenie wagi ciała w grupie z nowotworem w dniach 10 i następnych w porównaniu z grupąbez nowotworu, podczas gdy częściowy wpływ hamujący obni182 089 żenią wagi ciała wykazywały zwierzęta w grupie, której podawano MR16-1 (fig. 12). Stężenie triglicerydów we krwi 11 dnia i stężenie glukozy we krwi dnia 15 przedstawiono, odpowiednio, na fig. 13 i fig. 14. Wartości te były znacznie obniżone w grupie kontrolnej z nowotworem, w porównaniu z grupą kontrolną bez nowotworu, podczas gdy w grupie, której podawano MR16-1, obserwowano tendencję znoszenia hamowania dla glukozy i wpływ znoszący hamowanie dla triglicerydów.

Stężenie zjonizowanego wapnia we krwi 11 dnia było znacząco podwyższone w grupie kontrolnej z nowotworem w porównaniu z grupą kontrolną bez nowotworu, podczas gdy w grupie, której podawano MR16-1, obserwowano znaczący hamujący wpływ (fig. 15).

Doświadczenie dla potwierdzenia wpływu na czas przeżycia przeprowadzono stosując podobny schemat jak powyżej (n = 10). W wyniku zaobserwowano wpływ na czas przeżycia w grupie, której podawano MR16-1 (fig. 16).

Przykład 3

Badano wpływ przeciwciała skierowanego przeciw receptorowi IL-6 w modelu wyniszczenia indukowanego occ-1, któremu towarzyszy hiperkalcemia. Wykorzystano 6-tygodniowe samce normalnych myszy. Pierwszego dnia doświadczenia myszom podskórnie implantowano linię komórek raka płaskokomórkowego, occ-1. Skierowane przeciw receptorowi IL-6 myszy przeciwciało MR16-1 (patrz Przykład odniesienia 2) podawano dożylnie w dawce 2 mg/mysz bezpośrednio przed implantacją occ-1 pierwszego dnia doświadczenia, a następnie w dniach 7 i 10 podawano podskórnie 100 pg/mysz (n=6). W poprzednim doświadczeniu potwierdzono już, że neutralizujące przeciwciała skierowane przeciw białku heterologicznemu, przeciwciału szczura nie pojawiają się łatwo w tej metodzie. Grupie kontrolnej z nowotworem, przeciwciało kontrolne IgGl szczura (KH5) podawano według tego samego schematu (n = 6). Ponadto, jako grupę kontrolnąbez nowotworu utworzono grupę, której podawano PBS (n = 7). Po rozpoczęciu doświadczenia wagę ciała i stężenia zjonizowanego wapnia we krwi mierzono 10 i 12 dnia po rozpoczęciu doświadczenia.

Stężenie zjonizowanego wapnia we krwi 11 dnia było znacząco podwyższone w grupie kontrolnej z nowotworem w porównaniu z grupą kontrolną bez nowotworu, podczas gdy w grupie, której podawano MR16-1, podwyższenie było silnie zahamowane (fig. 18).

182 089

Waga ciała (g)

Fig.1

7

Wiek (tygodnie)

182 089

Dodatni wskaźnik białka

Fig.2

Wiek (tygodnie)

182 089

Fig .3

Poziom hemoglobiny

Wiek (tygodnie)

182 089

F i g .4

Liczba krwinek czerwonych (x!0 /mm co

--o- 3 —o— 5 —6

Wiek (tygodnie)

182 089

Fig 5

❖

7

Wiek (tygodnie)

Liczba krwinek białych (xlO —o— 3

--O--5 —a— θ —7

182 089

Stężenie IgGl w surowicy (mg/ml)

Fig.7

Wiek (tygodnie)

182 089

F i g .8

Stężenie ludzkiej IL-6 (Pg/ml)

Wiek (tygodnie)

182 089

co

Ο co

co co <£>

ίβ

CU rt rt o

rt

CU rt rt

O

182 089

Fig .11

Grupa

Waga śledziony (g)

182 089

Fig.12

182 089

Fig.13

Stężenie triglicerydów we krwi (mg/dl)

bez raka p<0.05

Kontrola z rakiem

MR16-1

182 089

Fig. 14

2001

Stężenie glukozy we krwi (mg/dl)

Kontrola Kontrola bez z rakiem raka

182 089

Stężenie zjonizowanego wapnia we krwi (mmol/1)

Fig.15

kontrola bez raka kontrola z rakiem

MR16-1

182 089

Fig.16

Dni po transplantacji

182 089

Waga ciała (g)

Fig.17

LI kontrola bez raka £2 kontrola z rakiem □ MR16-1

182 089

2.5Stężenie zjonizowanego wapnia (nmol/1)

Fig.18

Dni po transplantacji

Q kontrola bez raka £2 kontrola z rakiem □ MR16-1

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Środek farmaceutyczny do zapobiegania lub leczenia choroby powodowanej przez wytwarzanie interleukiny-6, w szczególności takiej jak nadmierna liczba komórek plazmatycznych we krwi lub tkankach, hiperimmunoglobulinemia, anemia, zapalenie nerek, kacheksja, choroba Castlemana, rozrostowe mazangialne zapalenie nerek, zawierający czynnik aktywny i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienny tym, że jako czynnik aktywny zawiera przeciwciało skierowane przeciw receptorowi interleukiny-6, korzystnie wybrane spośród przeciwciała MR16-1, przeciwciała PM-1 i ich pochodnych.
2. Środek farmaceutyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera rzeczone przeciwciało w ilości dawkowej wynoszącej od 1 do 100 mg.

Niniejszy wynalazek dotyczy środków farmaceutycznych do zapobiegania lub leczenia chorób powodowanych przez wytwarzanie interleukiny-6 (IL-6), zawierających przeciwciało (przeciwciało anty-IL-6R) skierowane przeciw receptorowi interleukiny-6 (IL-6).

IL-6 jest wieloczynno ściową cytokiną, która, jak się uważa, działa na różnych etapach reakcji immunologicznych, hematologicznych i ostrej fazy [Taga, t. i in., Critical Reviews in Immunol. 11: 265-280,1992] i odgrywa ważną rolę jako czynnik wzrostowy w szpiczaku mnogim, jak również w chorobach, którym towarzyszy nadmierna ilość komórek plazmatycznych we krwi lub tkankach, takich jak reumatyzm [Hirano, T. i in., Eur. J. Immunol. 18: 1797-1801, 1988; Houssiau, F.A. i in., Arth. Reum. 31: 784-788,1988], w chorobie Castlemana [Yoshizaki, K. i in., Blood 74: 1360-1367, 1989; Brant, SJ. i in., J. Clin. Invest. 86: 592-599, 1990], rozrostowym mezangialnym zapaleniu nerek [Ohta, K. i in., Clin. Nephrol. (Germany) 38: 185-189, 1992; Fukatsu, A. i in. Lab. Invest. 65: 61-66,1991; Horii, Y. i in., J. Immunol. 143: 3949-3955,1989], wyniszczeniu związanym ze wzrostem nowotworu [Strassmann, G. i in., J. Clin. Invest. 89: 1681-1684, 1992] itp.

U myszy transgenicznych H-2 L^d hIL-6 (IL-6 Tgm), u których zachodzi ekspresja IL-6 człowieka (hIL-6) na nadmiernym poziomie uzyskana w wyniku inżynierii genetycznej, obserwowano nadmiemąilość we krwi lub tkankach komórek plazmatycznych wytwarzających IgG1, rozrostowe mezangialne zapalenie nerek, anemię, małopłytkowość, pojawianie się autoprzeciwcialitp. [Miyai,T. iin.,prezentacjana21stMeetingofJapan Immunology Society „Hematological change in H-2 Ld hIL-6 transgenic mice with age”, 1991], co sugeruje udział IL-6 w różnych chorobach. Jednakże, nie wiadomo, czy przeciwciało skierowane przeciw receptorowi interleukiny-6 jest skuteczne w przypadku chorób powodowanych przez wytwarzanie interleukiny.

Wynalazek ujawnia środki farmaceutyczne do zapobiegania lub leczenia chorób powodowanych przez wytwarzanie interleukiny.

W celu rozwiązania powyższych problemów, niniejszy wynalazek ujawnia środki farmaceutyczne do zapobiegania lub leczenia chorób powodowanych przez wytwarzanie interleukiny-6, przy czym rzeczowe środki farmaceutyczne zawierają przeciwciało kierowane przeciw receptorowi interleukiny-6.

Istota wynalazku