PL185919B1 - Sposób otrzymywania estrogenów z moczu klaczySposób otrzymywania estrogenów z moczu klaczy - Google Patents

Abstract

1. Sposób otrzymywania naturalnej mieszaniny sprzezonych estrogenów z moczu zrebnych klaczy, o zubozonej zawartosci substancji fenolowych zawartych w moczu za pomoca ekstrakcji w fazie stalej obejmujacej adsorpcje estrogenów na polimerowej zywicy adsorpcyjnej, mycie obciazonej polimerowej zywicy adsorpcyjnej i eluowanie estrogenów z polimerowej zywicy adsorpcyjnej, znamienny tym, ze a) ciecz z moczu, która stanowi mocz uwolniony ze sluzu i substancji stalych, zate- zony koncentrat moczu lub zatezony przesacz otrzymany przez filtracje membranowa tego moczu, kontaktuje sie z niejonowa semipolarna polimeryczna zywica adsorbujaca, w ilosci wystarczajacej do adsorbcji mieszaniny sprzezonych estrogenów zawartych w cieczy z moczu i oddziela sie semipolarna, polimeryczna zywice adsorbcyjna, nasycona miesza- nina sprzezonych estrogenów od pozostalej cieczy z moczu, b) niejonowa semipolarna, polimeryczna zywice adsorbcyjna nasycona mieszanina sprzezonych estrogenów myje sie wodnym roztworem myjacym nastawionym na pH w zakresie przynajmniej 12,0, c) wymyta zywice adsorbcyjna kontaktuje sie z ciecza eluujaca, w ilosci wystarczaja- cej do desorbcji zaadsorbowanej na niej mieszaniny sprzezonych estrogenów, stanowiaca mieszajacy sie z woda organiczny rozpuszczalnik z grupy mieszajacych sie z woda eterów, nizszych alkanoli i nizszych alifatycznych ketonów lub mieszanine mieszajacego sie z w o- da organicznego rozpuszczalnika i ewentualnie wody o pH nastawionym w alkalicznym zakresie i od zywicy adsorbujacej oddziela sie eluat, zawierajacy naturalna mieszanine sprzezonych estrogenów i ewentualnie zateza sie go. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest otrzymywanie naturalnych mieszanin sprzężonych estrogenów z moczu źrebnych klaczy.

Estrogeny stosowane są w medycynie do wspomagającego leczenia hormonami. W szczególności, mieszaniny estrogenów stosowane są w leczeniu i profilaktyce dolegliwości

185 919 okresu przekwitania występujących u kobiet po naturalnej lub sztucznej menopauzie. Tu jako wyjątkowo skuteczne i dobrze tolerowane okazały się naturalne mieszaniny sprzężonych estrogenów, znajdujących się w moczu źrebnych klaczy.

Rozpuszczona zawartość substancji stałych w moczu źrebnych klaczy (=pregnant mares urine, następnie w skrócie określanego jako „PMU”) może oczywiście wahać się w szerokich granicach i na ogół leży w zakresie od 40-90 g suchej substancji na litr. Obok mocznika i pozostałych zwykle znajdujących się w moczu substancji, w substancji stałej PMU zawarte są fenolowe części składowe w ilości około 2-5 % w przeliczeniu na suchą substancję. Pod tymi fenolowymi składnikami kryją się krezole i dihydro-3,4-bis[(3-hydroksyfenylo)metylo]-2(3H)-furanon znany jako HPMF. Mogą one znajdować się w postaci wolnej lub sprzężonej. W PMU zawarta jest naturalna mieszanina estrogenów, które występują w postaci w dużym stopniu sprzężonej, n.p. jako sól sodowa półestru kwasu siarkowego (dalej w skrócie określana jako „sól siarczanowa”). Zawartość sprzężonych estrogenów (obliczana jako sól siarczanowa estrogenów) może wynosić między 0,3 a 1% wag. w przeliczeniu na suchą substancję.

Zwykle ekstrakty z PMU, zawierające sprzężone estrogeny uzyskuje się przez ekstrakcję polarnym, organicznym rozpuszczalnikiem, nie mieszającym się lub tylko niewiele mieszającym się z wodą takim, jak przykładowo octan etylu, n-butanol lub cykloheksanol. Przy tego rodzaju ekstrakcjach ciecz-ciecz występują liczne problemy takie, jak silne tworzenie się piany, rozwarstwianie, tworzenie emulsji i złe rozdzielanie się faz. Potrzebne jest ogólnie wiele etapów ekstrakcji, co prowadzi do strat i tylko częściowego odzysku zawartości estrogenów.

H.L. Bradlow proponował w roku 1968 (patrz Steroids, 11, (1968), str. 265-272), stosowanie Amberlite XAD-2® - obojętnej, niepolamej, hydrofobowej żywicy polistyrenowej firmy Rohm & Haas, do ekstrakcji sprzężonych estrogenów z moczu. Deklarowana zdolność adsorbcyjna tej żywicy jest mała. Według Bradlow'a mocz, ewentualnie rozcieńczony, przepuszcza się z niewielką szybkością przez kolumnę, zawierającą żywicę. Estrogeny eluuje się metanolem lub etanolem. Nie podano jednak żadnych danych na temat dalszych substancji zawartych w eluacie zawierającym estrogeny.

W opisie patentowym CS nr 224 881 opisano sposób wydzielania wszystkich 17-oxosteroidów z biologicznego materiału, w którym stosowano nowy środek do wydzielania steroidów na bazie sorbentu typu polimeru, a mianowicie makroporowaty kopolimer z 90 do 10% wagowych hydroksymetakrylanu i 10 do 90% wagowych etylenodimetakrylanu o granicy dyspersyjności masy cząsteczkowej 1,7 · 10'²³ do 1,6 · 10¹* kg i wielkości ziarna 20-60 pm.

Celem tego sposobu, który jest sposobem czysto analitycznym jest wydzielanie wszystkich 17-oxosteroidów w wolnej postaci i ich zastosowanie w celach diagnostycznych. Sposób ten obejmuje następujące etapy postępowania

1) kwaśną hydrolizę próbki moczu

2) naniesienia tak obrobionej próbki moczu na kolumnę z makroporowatym kopolimerem

3) mycie obciążonej kolumny roztworem wodorotlenku i wodą aż do zneutralizowania eluatu

4) eluowanie wolnych 17-oxosteroidów za pomocą metanolu.

Opis ten nie zawiera żadnych danych na temat dalszych substancji w eluacie zawierającym estrogeny.

Celem niniejszego wynalazku było wynalezienie technicznego sposobu otrzymywania naturalnej mieszaniny sprzężonych estrogenów z PMU, z uniknięciem wcześniej znanych, zwykłych wad ekstrakcji ciecz-ciecz, który dostarczyłby produktu zubożonego w fenolowe substancje z moczu i w dużym stopniu uwolnionego od krezolu i HPMF.

Obecnie znaleziony został sposób, w którym na drodze ekstrakcji w fazie stałej na niejonowej, semipolamej, polimerowej żywicy adsorbującej można uzyskać, zubożoną w fenolowe substancje z moczu i w dużym stopniu uwolnioną od krezolu i HPMF, mieszaninę zawierającą jednak praktycznie całkowitą ilość zawartości naturalnyeh estrogenów z PMU, która może służyć jako surowiec do wytwarzania leków, zawierających naturalną mieszaninę sprzężonych estrogenów z PMU, jako substancję czynną.

185 919

Sposób otrzymywania naturalnej mieszaniny sprzężonych estrogenów z PMU, o zubożonej zawartości substancji fenolowych zawartych w moczu, według wynalazku, znamienny jest tym, że

a) ciecz z moczu, którą stanowi mocz uwolniony ze śluzu i substancji stałych, zatężony koncentrat moczu lub zatężony przesącz otrzymany przez filtrację membranową tego moczu, kontaktuje się z semipolamą, polimerową żywicą adsorbującą, w ilości wystarczającej do adsorbcji mieszaniny sprzężonych estrogenów zawartych w cieczy z moczu i oddziela się semipolamą, polimeryczną żywicę adsorbcyjną, nasyconą mieszaniną sprzężonych estrogenów od pozostałej cieczy z moczu,

b) semipolarną, polimerową żywicę adsorbującą, nasyconą mieszaniną sprzężonych estrogenów, myje się wodnym roztworem myjącym, nastawionym na pH w zakresie przynajmniej 12,0, w szczególności 12,5-14,

c) wymytą żywicę adsorbującą kontaktuje się z cieczą eluującą, w ilości wystarczającej do desorbcji zaadsorbowanej mieszaniny sprzężonych estrogenów, stanowiącą mieszający się z wodą organiczny rozpuszczalnik z grupy mieszających się z wodą eterów, niższych alkanoli i niższych alifatycznych ketonów lub mieszaniną mieszającego się z wodą organicznego rozpuszczalnika i ewentualnie wody o pH nastawionym w alkalicznym zakresie i od żywicy adsorbującej oddziela się eluat, zawierający naturalną mieszaninę sprzężonych estrogenów i ewentualnie zatęża się go.

Do wykorzystania w sposobie według wynalazku może służyć sam PMU jako taki, koncentrat uzyskany przez zatężanie lub pozostałość z filtracji membranowej. Zebrany mocz uwalnia się najpierw w znany sposób od śluzu i substancji stałych. Celowo pozostawia się go do osadzenia się śluzu i substancji stałych i oddziela się je znanymi metodami rozdzielania, przykładowo przez dekantację, wirowanie i/lub odsączenie. Tak więc można przepuścić PMU przykładowo przez znane jako takie, urządzenie do oddzielania n.p. wirówkę, urządzenie do filtrowania lub urządzenie do sedymentacji. Jako urządzenie do oddzielania może służyć n.p. złoże piaskowe, lub też można zastosować handlowe urządzenia do rozdzielania, n.p. separatory dyszowe lub komorowe. Pożądane może być zastosowanie także urządzenia do mikrofiltracji lub do ultrafiltracji, przy zastosowaniu którego równocześnie można uzyskać daleko idące oddzielenie zarazków i wirusów·' z filtrowanego PMU.

O ile jest to pożądane można do moczu dodawać środki konserwujące, środki zarodnikobójcze, środki bakteriobójcze i/lub środki przeciwczerwiowe.

Jeśli zamiast PMU stosuje się zatężoną pozostałość PMU z ultrafiltracji, można ją uzyskać z PMU znanymi metodami filtracji membranowej. Zawartość pozostałości substancji stałej i jej skład może zmieniać się w zależności od wprowadzonego PMU i membrany stosowanej do filtracji membranowej, przykładowo wielkości jej porów, jak też warunków filtracji. Przykładowo przy zastosowaniu membrany do nanofiltracji można uzyskać w pozostałości stężenie zawartości estrogenów prawie bez strat, przy równoczesnym usunięciu z PMU do 50% wag. zawartości niskocząsteczkowych substancji. W przypadku sposobu według wynalazku można stosować pozostałości PMU, które zatężone zostały w stosunku do około 1:10, przykładowo w stosunku około 1:7 i których objętość zatężona została do około 1/10, przykładowo około 1/7 pierwotnej objętości PMU.

Stosowane w etapie a) semipolame, polimeryczne żywice adsorbujące stanowią porowate, organiczne, niejonowe polimery, które w przeciwieństwie do niepolamych hydrofobowych, polimerowych żywic adsorbujących posiadają pośrednią polamość (n.p. o momencie dipolowym aktywnej powierzchni żywicy w zakresie od 1,0 do 3,0, w szczególności 1,5 do 2,0 debaja) i trochę bardziej hydrofilową strukturę, przykładowo żywice estrów poli(kwasów karboksylowych). Celowo stosuje się makroporowate, semipolame żywice zwłaszcza o budowie makroporowatej i przeciętnej średnicy porów w zakresie 50 do 150, korzystnie 70 do 100 angstremów i powierzchni właściwej w zakresie 300 do 900, korzystnie 400 do 500 m²/g. Jako szczególnie odpowiednie okazały się makroporowate, poprzecznie usieciowane alifatyczne żywice estrów poli(kwasów karboksylowych), w szczególności poprzecznie usieciowane żywice estrów poliakrylanowych takie jak n.p. Amberlite XAD-7® firmy Rohm & Haas.

185 919

Według wynalazku można prowadzić adsorbcję sprzężonych estrogenów na semipolarnej żywicy adsorbującej przez kontaktowanie PMU lub jego pozostałości po filtracji na żywicy adsorbującej, na drodze wprowadzania cieczy z moczu do reaktora zawieraj ącego żywicę adsorbującąi utrzymywania jej w kontakcie z żywicą adsorbującą przez czas wystarczający do adsorbcji zawartości estrogenów. Po zajściu adsorbcji sprzężonych estrogenów na semipolarnej żywicy adsorbującej można żywicę adsorbującą nasyconą mieszaniną sprzężonych estrogenów oddzielić w znany sposób od pozostałej cieczy z moczu. Celowo można przepuszczać ciecz z moczu przez kolumnę zawierającą żywicę adsorbującą z taką szybkością, żeby czas kontaktu wystarczał do adsorbcji zawartości estrogenów. Odpowiednie są przykładowo szybkości odpowiadające przepływowi 3 do 10, korzystnie 5 do 7 części objętościowych PMU na 1 część objętościową żywicy adsorbującej na godzinę. Adsorbcję prowadzi się korzystnie w temperaturze pokojowej. Celowo można sterować szybkością przepływu cieczy z moczu przez reaktor pracując pod niewiele zwiększonym lub zmniejszonym ciśnieniem. Ilości zastosowanej semipolamej żywicy adsorbującej mogą zmieniać się w zależności od typu zastosowanej żywicy adsorbującej i ilości zawartości substancji stałych w cieczy z moczu. Przy zastosowaniu PMU można nasycić przykładowo jedną część objętościową żywicy adsorbującej, n.p. poprzecznie usieciowanej alifatycznej żywicy w postaci estru poli(kwasu karboksylowego) ilością do 80 części objętościowych obrobionego PMU, bez wystąpienia znaczniejszych ilości estrogenów w odpływającej cieczy z moczu. Przy zastosowaniu koncentratu PMU lub pozostałości PMU z filtracji obciążalność żywicy adsorbującej zmniejsza się naturalnie w takim stopniu, w jakim są one zatężone. Tak więc, przykładowo, 1 część objętościową poprzecznie usieciowanej, alifatycznej żywicy w postaci estrów poli(kwasu karboksylowego) można nasycić 20 do 80, korzystnie 30 do 50 częściami objętościowymi cieczy z moczu, w ilości odpowiadającej PMU.

Semipolamą żywicę adsorbującą nasyconą mieszaniną sprzężonych estrogenów myje się w etapie b) wodą myjącą o pH nastawionym na zakres przynajmniej 12,0, w szczególności od

12,5 do 14, korzystnie około 12,5 do 13,5. Jako wodne ciecze myjące mogą być stosowane wodne roztwory substancji zasadowych, obojętnych chemicznie, rozpuszczalnych w cieczy z moczu, o wystarczającej mocy, aby uzyskać wartość pH przynajmniej 12,5. Jako obojętne chemicznie wobec semipolarnych żywic adsorbuj ących, rozpuszczalne w wodzie substancje zasadowe nadają się korzystnie zasady nieorganiczne rozpuszczalne w wodzie, takie jak wodorotlenki metali alkalicznych i metali ziem alkalicznych, w szczególności wodorotlenek sodu. Celowo do wody myjącej dodaje się tylko taką ilość zasadowych substancji, która potrzebna jest do uzyskania pożądanego zakresu pH, korzystnie pH około 13. Ilość wody myjącej wybiera się tak, aby wystarczyła do oddzielenia fenolowych substancji, zawartych w moczu, bez wymywania przy tym znaczniejszych ilości sprzężonych estrogenów. Jako celowe okazało się przykładowo zastosowanie cieczy myjącej w ilości 2 do 10, w szczególności 4 do 6 objętości złoża na 1 objętość złoża żywicy adsorbującej. Wodę myjącą przepuszcza się przy tym przez reaktor zawierający żywicę adsorbującą celowo z szybkością przepływu od 3 do 10, korzystnie 5 do 7 części objętościowych wody myjącej na 1 część objętościową żywicy adsorbującej na godzinę.

Następnie w etapie c), wymytą żywicę adsorbującą. wysyconą mieszaniną sprzężonych estrogenów obrabia się cieczą eluującą w ilości wystarczającej do wymycia mieszaniny sprzężonych estrogenów i uzyskuje się eluat zawierający naturalną, mieszaninę sprzężonych estrogenów z PMU. Ciecz eluująca stosowana według wynalazku stanowi mieszający się z wodą organiczny rozpuszczalnik z grupy mieszających się z wodą eterów, niższych alkanoli i/lub niższych alifatycznych ketonów lub mieszanina tego rodzaju rozpuszczalnika mieszającego się z wodą i ewentualnie wody o odczynie alkalicznym. Jaiko składnik eterowy cieczy eluującej nadają się mieszające się z wodą etery cykliczne takie, jak tetrahydrofuran lub dioksan jak też etery o otwartym łańcuchu, mieszające się z wodą takie, jak przykładowo eter dimetylowy glikolu etylenowego (=Monoglyme), eter dimetylowy glikolu dietylenowego (=Diglyme) lub etyloksyetyloksyetanol (=Carbitol). Jako niższe alkanole nadają się mieszające się z wodą alkohole alkilowe o 1-4, korzystnie 1-3 atomach węgla, korzystnie etanol lub izopropanol. Jaiko niższe ketony alifatyczne nadają się ketony mieszające się z wodą o 3-5 atomach węgla,

185 919 w szczególności aceton. Jako szczególnie korzystne okazały się te ciecze eluujące, w których organiczny rozpuszczalnik stanowi etanol. Celowe jest stosowanie jako cieczy eluujących, mieszaniny z wymienionego organicznego rozpuszczalnika mieszającego się z wodą i ewentualnie wody o odczynie alkalicznym. Wartość pH tego rodzaju środków eluujących, zawieraj ących wodę, leży w zakresie od neutralnego do alkalicznego, do pH 13 i korzystnie może wynosić około 10 do 12. Jako składnik rozpuszczalnikowy w cieczy eluującej, zawierającej wodę, wybiera się rozpuszczalnik trwały w tym zakresie pH. Jako składniki rozpuszczalnikowe w alkalicznych cieczach eluujących, zawierających wodę, o pH około 10 do 12, nadają się niższe alkanole, korzystnie etanol. Pożądaną wartość pH środka eluującego, zawierającego wodę, nastawia się przez dodawanie odpowiedniej ilości rozpuszczalnej w wodzie, obojętnej chemicznie substancji zasadowej, korzystnie nieorganicznej zasady, przykładowo wodorotlenku metalu alkalicznego lub metalu ziem alkalicznych, w szczególności wodorotlenku sodu. Stosunek objętościowy rozpuszczalnika organicznego mieszającego się z wodą do wody w cieczy eluującej może wynosić w zakresie od 40:60 do 20:80, korzystnie około 30:70. Zastosowane ilości środka eluującego mogą wynosić około 3 do 10, w szczególności 4 do 6 objętości złoża na objętość złoża żywicy adsorbującej. Celowo przepuszcza się ciecz eluującą przez reaktor zawierający żywicę adsorbującą wysyconą mieszaniną estrogenów z taką szybkością przepływu, aby czas kontaktu wystarczył do pełnego wymycia mieszaniny sprzężonych estrogenów. Przy zastosowaniu mieszaniny etanolu z wodą o stosunku objętościowym 30:70 odpowiednie są szybkości przepływu cieczy eluującej od 3 do 10, korzystnie 5 do 7 części objętościowych cieczy eluującej na 1 część objęt<^:^(^^i^ową żywicy adsorbującej na godzinę. Celowo pro wadzi się wymywanie w zakresie temperatur od temperatury pokojowej do około 60°C, korzystnie w zakresie około 40 do 50°C. Jeżeli jest to pożądane reguluje się szybkość przepływu pracując przy lekko podwyższonym ciśnieniu, n.p. przy nadciśnieniu do 0,2 bara (0,2 · 10⁵Pa) aeluat odbiera się w postaci wielu frakcji. Zawartość sprzężonych estrogenów i fenolowych substancji zawartych w moczu, jak krezole i HPMF w poszczególnych frakcjach może być oznaczona w znany sposób na drodze wysokosprawncj chromatografii cieczowej (= high performance liquid chromatography, w skrócie „HPLC”). Podczas elucji otrzymuje się najpierw słabo zabarwioną, do bezbarwnej, praktycznie nie zawierającą estrogenów frakcję przedgonu, której ilość odpowiada ogólnie około jednej objętości złoża. Główna ilość sprzężonych estrogenów, przykładowo między 80 a 99 % sprzężonych estrogenów istniejących w wyjściowym PMU znajduje się w następujących dalej, ciemnożółto-brązowo zabarwionych frakcjach głównych eluatu, których ilość obejmuje ogólnie 2 do 4 objętości złoża. W dalszych frakcjach pogonu zawarte są w zasadzie tylko ślady sprzężonych estrogenów. O ile otrzymuje się frakcje pogonu, które zawierają jeszcze powyżej 10% w przeliczeniu na suchą substancję sprzężonych estrogenów i mniej niż 0,6% krezoli i HPMF w przeliczeniu na suchą substancję sprzężonych estrogenów, do dalszej przeróbki można je też poddać oczyszczeniu wraz z głównym eluatem bogatym w estrogeny.

Główny eluat, oddzielony od żywicy adsorbującej w powyżej opisany sposób, zawiera występującą w PMU naturalną mieszaninę sprzężonych estrogenów obok niewielkich tylko ilości pierwotnie znajdującej się w PMU zawartości fenolowych substancji zawartych w moczu.

Ten eluat może służyć jako surowiec wyjściowy do wytwarzania leków, zawierających naturalną mieszaninę sprzężonych estrogenów.

O ile jest to pożądane eluat ten można w znany sposób dalej zatężyć, w celu otrzymania zatężonego koncentratu, uwolnionego w dużym stopniu od organicznego rozpuszczalnika,, nadającego się do dalszej obróbki galenowej. O ile jest to pożądane można wytworzyć mieszaninę substancji stałych bez rozpuszczalnika na drodze suszenia rozbryzgowego. Jeśli naturalna mieszanina sprzężonych estrogenów powinna być stosowana do wytwarzania leków o postaci stałej, może być celowe dodanie stałego nośnika do eluatu zawierającego skoniugowane estrogeny jeszcze przed zatężaniem lub suszeniem rozbryzgowym, dla otrzymania w ten sposób mieszaniny w postaci stałej, zawierającej skoniugowane estrogeny i nośnik. Zarówno eluat, zawierający mieszaninę estrogenów', jak też wytworzony z niego koncentrat lub produkt stały suszony rozbryzgowo można przetworzyć w znany sposób w stałe lub ciekłe preparaty galenowe takie, jak przykładowo tabletki, drażetki, kapsułki lub emulsje. Te preparaty gale185 919 nowe mogą być wytwarzane znanymi metodami, z zastosowaniem zwykłych stałych lub ciekłych materiałów nośnikowych takich, jak n.p. skrobia, celuloza, cukier mlekowy łub talk czy ciekła parafina i/lub z zastosowaniem zwykłych farmaceutycznych środków pomocniczych, przykładowo substancji rozsadzających tabletki, środków solubizujących lub konserwujących. Tak więc można produkt, zawierający skoniugowane estrogeny, zmieszać w zwykły sposób z farmaceutycznymi nośnikami i środkami pomocniczymi i mieszaninę przetworzyć w odpowiednią postać dozowania leku.

Następujące przykłady powinny bliżej objaśnić wynalazek, nie ograniczając jego zakresu.

Przykładyl-III

Ogólny sposób postępowania przy otrzymywaniu z PMU ekstraktu naturalnej mieszaniny zawartych w PMU sprzężonych estrogenów z dalece idącym zubożeniem w fenolowe substancje znajdujące się w moczu.

A) Adsorbcja zawartości estrogenów z PMU na semipolamej żywicy adsorbującej z estru poliakrylowego

Kolumnę o wysokości 30 cm i średnicy około 2,4 cm napełnia się spęcznioną w 65 ml wody, semipolamą żywicą adsorbującą z estru poliakrylowego (= Amberlite XAD-7 firmy Rohm & Haas, średnica ziaren 0,3 do 1,2 mm, moment dipolowy 1,8 debaja, przeciętna średnica porów 80 angstremów (8 nm), powierzchnia właściwa około 450 m²/g na sucho). 2 l cieczy z moczu PMU w postaci przefiltrowanej przez urządzenie do mikrofiltracji lub oczyszczonej przez przepuszczenie przez wirówkę (zawartość suchej substancji (=TS) oraz określone metodą HPLC zawartości soli siarczanowych estrogenów, krezolu i HPMF - patrz tabela po przykładach) przepuszcza się w temperaturze pokojowej przez kolumnę z szybkością 6 ml/minutę (= około 5,5 objętości złoża na godzinę). Cała ilość estrogenów z PMU jest zaadsorbowana na żywicy adsorbującej wypełniającej kolumnę. Odciekającą ciecz z moczu bada się na zawartość sprzężonych estrogenów (wyliczona jako sole siarczanowe estrogenów) metodą HPLC i okazuje się, że jest ona praktycznie wolna od estrogenów. Odciek odrzuca się.

B) Mycie kolumny z wysyconą żywicą adsorbującą

Kolumnę z wysyconą żywicą adsorbującą myje się 300 ml wodnego roztworu wodorotlenku sodowego o pH podanym w tabeli. W tym celu przepuszcza się przez kolumnę alkaliczną wodę myjącą z szybkością przepływu 6 ml/min (= około 5,5 objętości złoża na godzinę). Odciekającą ciecz myjącą poddaje się analizie metodą HPLC na zawartość soli siarczanowej estrogenów, krezolu i HPMF. Badania pokazują, że podczas fazy mycia wymyte zostało mniej niż 5% zawartości estrogenów znajdujących się na kolumnie.

C) Desorbcja sprzężonych estrogenów z wymytej kolumny z żywicą adsorbcyjną

315 ml cieczy eluującej (mieszanina woda/rozpuszczalnik o alkalicznym pH, nastawionym przez dodatek wodorotlenku sodowego, o składzie i pH podanym dalej w tabeli) przepuszcza się przez kolumnę ogrzaną do temperatury wymywania, podaną w tabeli z przykładami, z szybkością przepływu około 6 ml/min. Odciekąjący eluat zbiera się w 6 frakcji. Pierwsza frakcja posiada objętość około 65 ml (= około 1 objętość złoża), pozostałe wynoszą każdorazowo po około 50 ml. W poszczególnych frakcjach bada się metodą HPLC zawartość soli siarczanowej estrogenów, krezolu i HPMF. Pierwszą frakcję zbiera się tak długo, jak długo eluat pozostaje bezbarwny do lekko żółtego. Ta frakcja zawiera tylko ślady soli siarczanowej estrogenów.

Gdy tylko przepłynie pierwsza objętość złoża eluatu, następuje zmiana barwy eluatu do odcienia ciemnobrązowego. W następnych frakcjach 2 do 4 zawarte jest około 80 do 98% łącznej ilości soli siarczanowej estrogenów zaadsorbowanej na kolumnie. Pozostałe frakcje zawierają tylko niewielkie ilości soli siarczanowej estrogenów. Widoczne jest to wyraźnie poprzez zmniejszenie intensywności barwy. Końcowe frakcje mogą one być ewentualnie po oddestylowaniu zawartości rozpuszczalnika jeszcze raz poddane etapowi A).

Dla frakcji, zawierających główne ilości skoniugowanych estrogenów podane są w tabeli, oznaczane każdorazowo zawartości substancji stałej (TS) w % i określone metodą HPLC zawartości soli siarczanowej estrogenów, krezolu i HPMF. Te frakcje stanowią ekstrakt nadający się do dalszej obróbki galenowej.

185 919

D) Regeneracja kolumny z żywicą adsorbującą

W celu regeneracji, kolumnę myje się najpierw 100 ml mieszaniny etanol/woda, o pH nastawionym na 12, zawierającej 50% etanolu, następnie 150 ml 10% roztworu wodnego cytrynianu sodu i jeszcze raz 150 ml mieszaniny etanol/woda a na koniec 100 ml wody destylowanej. Całą regenerację prowadzi się w temperaturze 45°C. Kolumnę można wielokrotnie, przykładowo do 40 razy, nasycać i ponownie regenerować.

r- oo cn Η <Ό H

Ν’ ΟΊ (D CN to CO r-l CN o o £ ΓΙΟ ··

JJ o Φ CO cn o co t—I rH m co to CN to oo rfi cn o

§ ··

JJ o φ CO

Lf) CN O Η (Ο H ίο H O c— o¹ o cn ro o o

CO r-l r-l O tO to

NP r-| oo —. —. Γ- Lf) o L0 O

NT - m μ o o r- cn o «fi 00 CN CN cn o co o cd o o CN *fi —' r-l cn o o m CN CN

CO O O Γ* o o o o CN — «fi O O ro

ΓO Ci LO CO CN O

CN o CN ul

ΟΟ o in <n o r—I 00 o o V CN —

O — in <n o oo

CN cd <D

X>

Cd

O CJ T «fi CO Γ«fi CN cd w Ό Cb § \ o r-l Γ o

ci ··

Cd

JJ o 0) co «fi CN O Np «fi o to cn i-i «fi co o

CN rfi O O CN — — o o o to r-l

O O O O to co

H d o CN —' — o —

CN

CN in CN CN CN to o to CO «fi

CN

___

___

___

__v

ca

ca

ca

ca

ca

ca

ca

ca

cn

ca

ca

ca

Eh

H

Eh

H

Eh

H

H

H

Eh

H

in

tn

tn

tn

in

in

in

en

in

in

in

tn

ni

(0

<d

ffl

(0

(0

fi

(d

<d

<d

(d

cd

2

2

S

5

2

2

£

oP

oP

oP

cP

<#>

«Ρ

«#»

oP

«Ρ

oP

dP

oP

—·

—·

'—

—·

—'

rfi

<—i

i

rfi

i—l

r-1

i—ł

rfi

r—i

i-H

rfi

r—i

\

-X.

\

in

in

in

in

en

in

in

in

in

in

Cn

Cn

g

β

β

fi

fi

fi

fi

fi

fi

fi

fi

fi

5

S

2

Ό

O

Ό

Ό

fi

fi

fi

fi

Φ

<D

Φ

Φ

tn

en

in

tn

0

0

0

0

fi

K

fi

fi

fi

P

O

P

jj

jj

01

cd

01

tn

m

a)

£

a)

d)

a)

><

s <#>

•n

fi

-m

Ό

m

•o

(1)

Ό

U

Φ

d)

Φ

Z

X

fi

X

X

X

0

JJ

rfi

0

0

0

s

N O

Φ

fi cd

Si

s

N

fi

cd

•

tj

•

U

•

64

υ

•fi

in

ϋ

tn

u

en

ϋ

fi

>1

a

id

fi

cd

fi

(d

fi

(d

fi

id

X

cd

X

cd

X

cd

•rl

fi

X

-fi

fi

•fi

fi

•fi

fi

01

rfi

O

fi

<#>

01

i—i

fi

eto

0]

rfi

fi

oP

01

»—1

0

X

w

JJ

n

P

0

P

0

-fi

N

Ph

id

Pl

<d

X

•fi

N

Ph

<d

£

•fi

N

Łj

(d

X

-fi

N

r—i

Φ

il

o

Jj

fi

t—i

Φ

fi

r—i

Φ

V

fi

<—i

Φ

0

fi

ta

cd*

r—i

ca

0

fi

04

ffi

ca

0

fi

04

rfi

ca

0

fi

n

44

W

<d

•n

cd

Φ

EH

01

44

W

Φ

Eh

0)

44

K

d)

Eh

01

44

o

fi

fi

Ό

'0

Ό

(tf

fi

fi

CN

Ό

Ό

'0

Ό

ro

O

Ό

'0

Ό

'Śfl

Ό

Ό

Ό

'01

'01

'01

f”i

«—i

P

'01

'01

'01

'01

'01

Ό1

'01

Ό1

'01

'01

'01

0

0

0

>

d)

cd

cd

0

0

0

0

(d

0

0

0

0

cd

0

0

0

P

JJ

P

fci

fi

•n

JJ

P

JJ

P

•n

P

P

P

P

•n

P

P

P

fi

fi

fi

N

d)

<J

fi

fi

fi

fi

U

fi

fi

fi

fi

ϋ

fi

fi

fi

<d

(d

irt

<d

U

o,

44

irt

(fl

irt

rfl

Λί

cd

(rt

(rt

(rt

44

fd

(rt

<d

2

X

X

τΐ

d)

id

X

X

X

X

id

X

X

X

X

(d

X

X

X

(d

(d

id

o

-fi

Φ

fi

cd

id

id

cd

fi

fd

(0

id

(0

fi

<d

(d

(d

CN

CN

CN

s

u

H

ta

N

CN

CN

CN

ta

N

CN

CN

CN

ta

N

CN

CN

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz.

Cena 2,00 zł.

Claims (8)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób otrzymywania naturalnej mieszaniny sprzężonych estrogenów z moczu źrebnych klaczy, o zubożonej zawartości substancji fenolowych zawartych w moczu za pomocą ekstrakcji w fazie stałej obejmującej adsorpcję estrogenów na polimerowej żywicy adsorpcyjnej, mycie obciążonej polimerowej żywicy adsorpcyjnej i eluowanie estrogenów z polimerowej żywicy adsorpcyjnej, znamienny tym, że

   a) ciecz z moczu, którą stanowi mocz uwolniony ze śluzu i substancji stałych, zatężony koncentrat moczu lub zatężony przesącz otrzymany przez filtrację membranową tego moczu, kontaktuje się z niejonową semipolarną. polimeryczną żywicą adsorbującą, w ilości wystarczającej do adsorbcji mieszaniny sprzężonych estrogenów zawartych w cieczy z moczu i oddziela się semipolarną, polimeryczną żywicę adsorbcyjną, nasyconą mieszaniną sprzężonych estrogenów od pozostałej cieczy z moczu,

   b) niejonową semipolamą, polimeryczną żywicę adsorbcyjną nasyconą mieszaniną sprzężonych estrogenów myje się wodnym roztworem myjącym nastawionym na pH w zakresie przynajmniej 12,0,

   c) wymytą żywicę adsorbcyjną kontaktuje się z cieczą eluującą, w ilości wystarczającej do desorbcji zaadsorbowanej na niej mieszaniny sprzężonych estrogenów, stanowiącą mieszający się z wodą organiczny rozpuszczalnik z grupy mieszających się z wodą eterów, niższych alkanoli i niższych alifatycznych ketonów lub mieszaninę mieszającego się z wodą organicznego rozpuszczalnika i ewentualnie wody o pH nastawionym w alkalicznym zakresie i od żywicy adsorbującej oddziela się eluat, zawierający naturalną mieszaninę sprzężonych estrogenów i ewentualnie zatęża się go.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie a) jako niejonową semipolarną żywicę adsorbującą stosuje się makroporowatą żywicę estru poli(kwasu karboksylowego).
3. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako żywicę estru poli(kwasu karboksylowego) stosuje się usieciowaną poprzecznie alifatyczną, żywicę estru poli(kwasu karboksylowego), korzystnie usieciowaną poprzecznie żywicę w postaci estru poli(kwasu akrylowego), korzystnie o strukturze makroporowatej.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie a) 1 część objętościową niejonowej semipolarnej żywicy adsorbującej wysyca się cieczą z moczu, odpowiadającą 20 do 80, korzystnie 30 do 50 części objętościowych moczu.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie a) przez reaktor zawierający niejonową, semipolarną żywicę adsorbującą przepuszcza się ciecz z moczu z szybkością przepływu, która odpowiada przepływowi 3 do 10, korzystnie 5 do 7 części objętościowych moczu/l część objętościową żywicy adsorbującej/godzinę.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie b) stosuje się jako ciecz myjącą, wodny roztwór wodorotlenku sodowego o pH około 12,5 do 13,5.
7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie c) stosuje się jako ciecz eluującą mieszaninę wody i mieszającego się z wodą organicznego rozpuszczalnika o stosunku objętościowym organicznego rozpuszczalnika do wody w zakresie 20:80 do 40:60, w szczególności 30:70.
8. 8. Sposób według zastrz. 1 albo 7, znamienny tym, że w etapie c) stosuje się ciecz eluującą zawierającą etanol.

   * * *