PL187544B1 - Wywołujące tolerancję fragmenty naturalnych alergenów - Google Patents
Wywołujące tolerancję fragmenty naturalnych alergenówInfo
- Publication number
- PL187544B1 PL187544B1 PL97340293A PL34029397A PL187544B1 PL 187544 B1 PL187544 B1 PL 187544B1 PL 97340293 A PL97340293 A PL 97340293A PL 34029397 A PL34029397 A PL 34029397A PL 187544 B1 PL187544 B1 PL 187544B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- hmw
- fraction
- allergenic
- melanoidins
- free
- Prior art date
Links
- 239000013566 allergen Substances 0.000 title claims abstract description 68
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 63
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 claims abstract description 55
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 44
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 38
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 26
- 235000018553 tannin Nutrition 0.000 claims abstract description 26
- 229920001864 tannin Polymers 0.000 claims abstract description 26
- 239000001648 tannin Substances 0.000 claims abstract description 26
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims abstract description 11
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 9
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims abstract description 5
- 241000238876 Acari Species 0.000 claims abstract description 4
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 claims abstract description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 29
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 21
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 20
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 16
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 claims description 15
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 claims description 15
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 claims description 15
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 claims description 13
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 claims description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 12
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 8
- 230000035614 depigmentation Effects 0.000 claims description 8
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 6
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 5
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims description 5
- 230000035699 permeability Effects 0.000 claims description 5
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 claims description 4
- 239000000428 dust Substances 0.000 claims description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 4
- 239000000049 pigment Substances 0.000 claims description 4
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 claims description 4
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 3
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 claims description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 2
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 claims description 2
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 claims 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 claims 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 claims 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 abstract description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 31
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 23
- 229960004784 allergens Drugs 0.000 description 22
- 239000000047 product Substances 0.000 description 20
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 14
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 13
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 11
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 11
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 11
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 11
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 11
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 11
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 11
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 11
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 206010003645 Atopy Diseases 0.000 description 9
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 8
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 8
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 7
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 7
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 7
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000017274 T cell anergy Effects 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 6
- 241000721467 Parietaria Species 0.000 description 5
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 5
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 5
- 210000004241 Th2 cell Anatomy 0.000 description 5
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 4
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 235000013824 polyphenols Nutrition 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 241000123966 Blomia tropicalis Species 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 239000008557 Parietaria judaica pollen Substances 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 3
- 238000000586 desensitisation Methods 0.000 description 3
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 3
- 150000008442 polyphenolic compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- 235000003932 Betula Nutrition 0.000 description 2
- 241000219429 Betula Species 0.000 description 2
- 241000536435 Blomia <angiosperm> Species 0.000 description 2
- 108010069112 Complement System Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000000989 Complement System Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102100032768 Complement receptor type 2 Human genes 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000941929 Homo sapiens Complement receptor type 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 2
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 2
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000447 Th1 cell Anatomy 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 description 2
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 description 2
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- VYQNWZOUAUKGHI-UHFFFAOYSA-N monobenzone Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1OCC1=CC=CC=C1 VYQNWZOUAUKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000001603 reducing effect Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 2
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 2
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 2
- PZEUTLIKVUEDLB-UHFFFAOYSA-N 2-[[[2-[[6-amino-2-[[2-[[6-amino-2-[[2-[[2-[[2-[[2-[[2-[2-[[1-[2-[[2-[[2-[[2-[[2-[[2-[[6-amino-2-[[2-[[2-[2-[[2-[[2-[(2-aminoacetyl)amino]-3-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]propanoylamino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]acetyl]amino]-4-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]propanoylamino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]hexanoyl]amino]-3-(carbamoylamino)propanoyl]-(3-amino-3-oxopropyl)carbamoyl]amino]pentanediamide Chemical compound CCC(C)C(NC(=O)CN)C(=O)NCC(=O)NC(C)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)NCC(=O)NC(CC(C)C)C(=O)N1CCCC1C(=O)NC(C)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(CNC(N)=O)C(=O)N(CCC(N)=O)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(N)=O PZEUTLIKVUEDLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004042 4-aminobutyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 208000035285 Allergic Seasonal Rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 235000003129 Ambrosia artemisiifolia var elatior Nutrition 0.000 description 1
- 244000037005 Ambrosia artemisiifolia var. elatior Species 0.000 description 1
- 235000004355 Artemisia lactiflora Nutrition 0.000 description 1
- 235000003261 Artemisia vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 240000006891 Artemisia vulgaris Species 0.000 description 1
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000002992 Betula pubescens Nutrition 0.000 description 1
- 241001520764 Betula pubescens Species 0.000 description 1
- 241000195940 Bryophyta Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 244000281762 Chenopodium ambrosioides Species 0.000 description 1
- 235000000509 Chenopodium ambrosioides Nutrition 0.000 description 1
- 235000005490 Chenopodium botrys Nutrition 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 102000000802 Galectin 3 Human genes 0.000 description 1
- 108010001517 Galectin 3 Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 1
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 108060005987 Kallikrein Proteins 0.000 description 1
- 102000001399 Kallikrein Human genes 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 241000209082 Lolium Species 0.000 description 1
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 1
- 241000795633 Olea <sea slug> Species 0.000 description 1
- 240000007817 Olea europaea Species 0.000 description 1
- 235000002725 Olea europaea Nutrition 0.000 description 1
- 241001465379 Parietaria judaica Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 230000010799 Receptor Interactions Effects 0.000 description 1
- 206010048908 Seasonal allergy Diseases 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 206010040914 Skin reaction Diseases 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 241001532014 Xanthorrhoea Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- 230000002052 anaphylactic effect Effects 0.000 description 1
- RJGDLRCDCYRQOQ-UHFFFAOYSA-N anthrone Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=CC=CC=C3CC2=C1 RJGDLRCDCYRQOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 239000003659 bee venom Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 150000001719 carbohydrate derivatives Chemical group 0.000 description 1
- 230000001364 causal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 108010047295 complement receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000006834 complement receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 235000019621 digestibility Nutrition 0.000 description 1
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000005530 etching Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 229940046528 grass pollen Drugs 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 1
- 235000008216 herbs Nutrition 0.000 description 1
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940066369 honey bee venom Drugs 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 208000030603 inherited susceptibility to asthma Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 235000011929 mousse Nutrition 0.000 description 1
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 230000003950 pathogenic mechanism Effects 0.000 description 1
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-M periodate Chemical compound [O-]I(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010399 physical interaction Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000013573 pollen allergen Substances 0.000 description 1
- 201000004338 pollen allergy Diseases 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 108010082974 polysarcosine Proteins 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 238000004886 process control Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000013777 protein digestion Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000035483 skin reaction Effects 0.000 description 1
- 231100000430 skin reaction Toxicity 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 230000024664 tolerance induction Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 1
- 208000001319 vasomotor rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43513—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae
- C07K14/43527—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae from ticks
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/35—Allergens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/35—Allergens
- A61K39/36—Allergens from pollen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/12—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by hydrolysis, i.e. solvolysis in general
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Mycology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Water Supply & Treatment (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Chemical Or Physical Treatment Of Fibers (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
1. Sposób wytwarzania ekstraktu do zapewniania tolerancji wobec materialu aler gennego u osobnika, znamienny tym, ze a) ekstrahuje sie alergenny material zródlowy; b) usuwa sie material o masie czasteczkowej nizszej niz 3500, prowadzac do otrzy- mania frakcji HMW-N, i ewentualnie liofilizuje sie HMW-N; c) z frakcji HMW-N usuwa sie taniny i melanoidyny, które sa fizycznie polaczone z materialem alergenu w HMW-N, prowadzac do otrzymania pozbawionej pigmentów frakcji HMW-D wolnej od wolnych tanin i melanoidyn oraz nieskoniugowanych tanin i me- lanoidyn, i ewentualnie liofilizuje sie HMW-D; d) degradauje sie obecne w frakcji HMW-D bialka, tworzac fragmenty o masie czasteczkowej pomiedzy 1000 a 10000, przy czym produkt z etapu d) stanowi Fb-D; i przy czym, ponadto przed etapem d) prowadzi sie etap utleniania HMW-D w sposób znany per se, zapewniajac frakcje HMW-Dox, w etapie d) przeprowadzajac zatem raczej degra- dacje HMW-Dox niz HMW-D. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze zródlowy material alergenny wy- biera sie ze znanych srodowiskowych, domowych i pozadomowych materialów alergennych, obejmujacych owady, roztocza, plesnie, pylki traw, chwastów, kwiatów, krzewów i drzew, pyly organiczne w srodowiskach zawodowych. PL PL PL
Description
Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu kontrolowanego enzymatycznego rozszczepiania i oczyszczania pozbawionych pigmentów' fragmentów aktywnych białek alergennych z domowych i pozadomowych materiałów źródłowych, który to sposób zapewnia tworzenie fragmentów alergenów zachowujących naturalne epitopy stymulujące limfocyty T, ale pozbawionych wiążących IgE epitopów dla komórek B i czynników aktywujących dopełniacz. Wynalazek dotyczy również nowych produktów farmaceutycznych. Te fragmenty alergenów nie wykazują wad konwencjonalnych ekstraktów alergennych do immunoterapii i można je bezpiecznie stosować do indukcji stanu specyficznej anergii komórek T i tolerancji immunologicznej u alergików.
Podstawa ogólna.
Wodne ekstrakty różnych substratów środowiskowych, takich jak kurz domowy, pozostałości złuszczonego nabłonka skór zwierzęcych, ziaren pyłku traw, chwastów, drzew oraz kilku innych materiałów powszechnie stosuje się do diagnozy in vivo i in vitro chorób alergicznych, takich jak astma oskrzelowa, naczynioruchowy nieżyt nosa i alergia pyłkowa u predysponowanych osób, tak zwanych pacjentów „atopowych”. Od pierwszych doniesień klinicznych Noona i Freemana w 1991 r., ekstrakty takie stosowano również do leczenia atopowych chorób alergicznych w trybie podskórnych iniekcji w celu „odczulania”, „zmniejszania wrażliwości” Iub „immunoterapii” tych schorzeń. W oparciu o obserwację, że przyczynowe i dominujące składniki alergenne w tych ekstraktach zawierają struktury szkieletu białkowego w zakresie mas cząsteczkowych 10-70 kDa, w procesie produkcji stało się powszechną praktyką dializowanie lub ultrafiltracja wodnych ekstraktów przez membrany o nominalnej granicy przepuszczalności 10 kDa, w celu usuwania mniej istotnych składników o masie cząsteczkowej mniejszej niż 10 kDa, z pozostawianiem tym samym multiwalentych białek antygenowych w zakresie 10-100 kDa w celu poprawy jakości alergennych ekstraktów do stosowania klinicznego. W niektórych przypadkach wybiera się niższą granicę przepuszczalności 3 kDa lub 5 kDa.
Zgodnie z obecną teorią, ekspozycja na alergeny środowiskowe powoduje u człowieka tworzenie specyficznych wobec alergenów przeciwciał o izotypach IgG i IgE. Dlatego tez, w kontekście immunologicznym, alergeny można traktować jako zwykłe indukujące przeciwciała IgG obce antygeny obdarzone właściwościami wspomagającymi - albo z powodu szczególnych właściwości molekularnych, albo jednoczesnej obecności w alergennych ekstraktach odpowiednich modulatorów - dodatkowe pobudzanie biosyntezy przeciwciał z klasy IgE. Kiedyś, antygeny takie dlatego bardziej właściwie nazwano „alergenami atopowymi” [1], Predysponowani genetycznie, tak zwani osobnicy „atopowi” wykazują szczególną skłonność pod tym
187 544 względem do odpowiadania podwyższonymi poziomami specyficznych wobec alergenów przeciwciał IgE. Po początkowej fazie indukcji lub „uczulania”, ponowny kontakt z alergenem uważany jest za prowadzący do miejscowego tworzenia kompleksów alergen-przeciwciało (IgE), które są odpowiedzialne za ostateczne objawy chorobowe. Bardziej szczegółowo, są to oddziaływania alergenów z ich specyficznymi przeciwciałami przytwierdzonymi z klasy IgE, związanymi z receptorami IgE-(e) w błonach komórkowych (tj. komórek tucznych lub leukocytów zasadochłonnych), które, jak się uważa, wyzwalają sekwencję zdarzeń biochemicznych ostatecznie prowadzących do uwalniania substancji mediatorowych, odpowiedzialnych za przejawiające się klinicznie objawy alergii. Opisano liczne podejścia mające na celu zmniejszenia ryzyka anafilaktycznych reakcji ubocznych podczas immunoterapii. Ostatnio opublikowano opis patentowy numer PCT/EP96/01733 (7 listopada 1996 r.), ujawniający nową kompozycję farmaceutyczną do stosowania w terapii odczulającej osób cierpiących na alergię. Kompozycja ta zawiera tyrozynę i spolimeryzowany alergen. Inne podejścia przedstawiono już na początku lat osiemdziesiątych, ale stwierdzono, że były one nieodpowiednie. Brytyjski opis patentowy numer GB-A-1 492 973 opisuje koprecypitat tyrozyny i alergenu, który zmodyfikowano czynnikiem powodującym sieciowanie wewnątrzcząsteczkowe. Europejski opis patentowy numer EP-A-0 367 306 opisuje sposób przygotowywania spolimeryzowanych alergenów, również zapewniający sieciowanie i, co istotne, powodujący obniżoną alergenność. W jeszcze innej dawnej publikacji, europejskim opisie patentowym numer EP-B0 038 154, którą opublikowano już w 1981 r„ opisano działanie na alergen polisarkozyną w celu obniżenia jego alergenności. Według publikacji, w szczególności użyteczna jest polisarkozyna o masie cząsteczkowej 2000-12000. Dokument ten odnosi się także do brytyjskiego opisu patentowego numer 1 282 163, opisującego ulepszoną postać terapii, w której alergenność alergenu obniża się poprzez traktowanie glutaraldehydem, co, jak się sugeruje, prowadzi do zachowania zdolności do wywoływania przeciwciał blokujących, ale wykazywania obniżonej alergenności, czyniąc go zatem bardziej odpowiednim do terapii odczulającej. Alternatywne podejście przedstawiono w brytyjskim opisie patentowym numer 1 578 348, w którym stwierdzono, że koniugaty alergen-glikol polietylenowy są zdolne do wywoływania pożądanego wpływu terapeutycznego polegającego na hamowaniu wytwarzania IgE specyficznych wobec alergenu. Stwierdzono, że materiały te są niealergenne i nieimmunogenne. Produkty wybrane do zamierzonej immunoterapii chorób alergicznych za pomocą wywołujących tolerancję fragmentów alergenów powinny być bardzo podobne do naturalnych epitopów komórek T, tworzonych w tak zwanych „komórkach prezentujących antygen” (APC) przez kwaśne hydrolazy lub inne enzymy w warunkach fizjologicznych. To określone podejście podjęto we wcześniejszych pracach, w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 469 667 oraz europejskim opisie patentowym numer EP 0113712 BI (patrz także odnośniki 6 i 7). Takie elementy naturalne obejmują możliwe związane z peptydami haptenowe struktury chemiczne, i mogą być naśladowane w laboratorium przez poddawanie składników alergennych ekstraktów rozszczepianiu enzymatycznemu w kontrolowanych warunkach. Jedna z wielu dróg badań na tym polu sugeruje, że leczenie alergii u człowieka powinno się prowadzić stosując pochodne alergenów, które nie indukują specyficznych przeciwciał IgE, tj. pochodne alergenów pozbawione ich tak zwanych wiążących IgE „epitopów dla komórek B”.
A zatem, w ciągu ostatnich dwudziestu lat sugerowano liczne odrębne drogi zapewniania kompozycji do odczulania, tj. obniżania alergenności. Znaczące wysiłki podjęto w celu rozwiązana tego problemu w różny sposób, jak dotąd z niewielkimi wynikami. W celu osiągnięcia lepszego zrozumienia wymagań leczenia, konieczne jest określenie, co dzieje się podczas indukcji lub wywoływania odpowiedzi alergicznej.
Indukcja odpowiedzi immunologicznej na obce antygeny wymaga współpracy różnych rodzajów komórek, tj. w najprostszej postaci tak zwanych „komórek prezentujących antygen” (APC) oraz populacji limfocytów T i B. Pierwszy sygnał, a mianowicie pomiędzy APC i limfocytami T, stanowią antygenowe fragmenty peptydowe, które powstają podczas wewnątrzkomórkowej obróbki (przez rozszepianie proteolityczne) obcego antygenu intemalizowanego przez APC, np. makro fagi. Fragmenty antygenowe (obce) (znane również jako „epitopy dla komórek T”) następnie ponownie przenoszone do zewnętrznej błony APC, gdzie zostają eks187 544 ponowane w postaci ligandów połączonych ze związanymi z błoną antygenami klasy II głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC). Spośród populacji limfocytów T (pomocniczych) (komórki Thl i Th2), rozpoznających takie epitopy dla komórek T na APC i współdziałających z wydzielającymi immunoglobuliny limfocytami B, aktywację specyficznych wobec alergenu klonów komórek Th2 uważa się odrywającą szczególnie kluczową rolę w rozwoju atopowych chorób człowieka. W przeciwieństwie do komórek Thl, komórki Th2 aktywowane przez kontakt z APC, w których zachodzi ekspresja właściwych epitopów dla komórek T na ich powierzchni, wytwarzają stosunkowo duże ilości interleukin 4 (IL-4) i 5 (IL-5), które mogą, między innymi, działać jako cytokinowe sygnały pobudzające biosyntezę IgE przez limfocyty B lub komórki plazmatyczne. Opierając się na tym, obecna teoria „wczesnej typu I” (atopowej) alergii twierdzi, że u osobników atopowych występuje względna przewaga Tn2 w stosunku do Thl, czego wynikiem staje się zwiększona synteza IgE, oraz że aktywna terapia powinna dlatego dążyć do przywrócenia równowagi aktywności specyficznych wobec alergenu komórek T z Th2>Thl do Thl>Th2. Rozważana manipulacja specyficznymi wobec alergenu klonami komórek T poprzez epitopy dla komórek T pochodzące z alergennych cząsteczek, sugeruje dlatego samą taką manipulację jako możliwe nowe podejście do uwieńczonej powodzeniem immunoterapii, z zastrzeżeniem, że takie epitopy nie powinny ani wiązać, ani indukować specyficznych wobec alergenu przeciwciał IgE [2, 3]. Jednakże, ostatnie próby kliniczne z niektórymi syntetycznymi peptydowymi epitopami dla komórek T zdefiniowanymi strukturalnie na podstawie sekwencji aminokwasowych wybranych antygenów wiążących IgE, uzyskanymi w wyniku klonowania molekularnego i zastosowania technologii rekombinacyjnej, do tej pory zawiodły pod względem uzyskania pożądanych korzystnych wpływów, tak że ta ostatnio podjęta droga wydaje się nie dawać wyników.
Bez zamiaru ograniczania się teorią, wydaje się być dobrze ustalone, że oddziaływania pomiędzy APC i komórkami Th wymagają czynników kostymulujących, obejmujących kilka receptorów błonowych. Istnieją również dowody, że jeśli występuje tylko pierwszy sygnał, tj. rozpoznawanie epitopów dla komórek T, wynikiem może być anergia komórek T. Po początkowej fazie stymulacji, te komórki Th2 przestają odpowiadać na dalszą stymulację przez APC pobudzane alergenem. Stąd, po stymulacji peptydami pochodzącymi z alergenu w specyficznych wobec alergenu klonach komórek Th2 może być indukowana anergia komórek T. Takie anergiczne komórki Th nie wspomagają wytwarzających IgE komórek B, prowadząc do obniżania poziomów IgE. Istnieją pewne wstępne dane kliniczne podtrzymujące pogląd, że prezentacja lub podawanie wyższych niż optymalne dawek wstępnie utworzonych zgodnych z MHC epitopów dla komórek T może, w nieobecności sygnałów kostymulujących, a być może nawet w już istniejącym stanie odporności, indukować anergię komórek T i tolerancję immunologiczną [6, 7].
Wiadmo, że ekstrakty pojedynczych alergennych materiałów źródłowych wykazują duzą różnorodność odrębnych alergenów białkowych wiążących IgE. Ponadto, każdy indywidualny alergen białkowy z pojedynczego źródła może wykazywać cały zakres różnych nie wiążących IgE epitopów dla komórek T. W świetle obfitości epitopów aktywujących komórki T i trudności w wyborze spośród nich właściwych peptydów wywołujących tolerancję, wydaje się uzasadnione założenie, ze skuteczną, immunoterapię o szerokim spektrum działania z zastosowaniem epitopów dla komórek T najlepiej można osiągnąć stosując zbiory nie wiążących IgE fragmentów naturalnej biblioteki alergenów z materiału źródłowego, a nie kilka wybranych syntetycznych peptydów lub nawet zrekombinowanych alergenów. Staje się to nawet bardziej uderzające w kontekście prawdopodobnej natury chemicznej dominujących epitopów. Zgodnie z obecną opinią, utrzymuje się, że epitopy dla komórek T są peptydami o liniowej sekwencji aminokwasowej, którą można - po zidentyfikowaniu -wytwarzać syntetycznie. Ten punkt widzenia, jednakże, całkowicie zaprzecza, że naturalnie występujące alergeny najczęściej zawierają potranslacyjne łańcuchy boczne złozone z węglowodanów lub innych związków organicznych chemicznie skoniugowanych ze szkieletami białkowymi. Takie chemicznie skoniugowane struktury lub „hapteny” często stanowią miejsca immunodominujące, które są zachowywane w wytwarzanych enzymatycznie fragmentach alergenów, ale nie występują w syntetycznych peptydach lub zrekombinowanych transkryptach alergenów. I, wreszcie, nauka i technologia dotyczące alergenów zachowują całkowite milczenie na temat najważniejszej praktycz6
187 544 nej kwestii, a mianowicie chemicznych i fizycznych oddziaływań zachodzących pomiędzy mnogością składników w nie oczyszczonych ekstraktach alergennych, prowadzących do degradacji produktów i tworzenia niefiżjologicznych kompleksów molekularnych. Z tych powodów, łącznie z brakiem praktycznych wyników dla opisanych powyżej kompozycji, zastosowano alternatywne podejście w celu opracowania bardziej odpowiednich preparatów do leczenia alergii.
Podstawa wynalazku.
Uprzednio zakładano, tak jak to się zazwyczaj czyni, ze układ immunologiczny traktuje alergeny dokładnie w taki sposób, jak zwykłe obce antygeny. Jednakże, założenie to ani nie wyjaśnia, dlaczego alergeny - w przeciwieństwie do zwykłych antygenów białkowych - indukują tworzenie specyficznych przeciwciał IgE równolegle do przeciwciał IgG, ani nie pomaga w zrozumieniu, dlaczego tylko mała część populacji ludzkiej (osobnicy „atopowi”) nie tylko wytwarza podwyższone poziomy takich przeciwciał IgE, ale wykazuje także skłonność do rozwijania klinicznych objawów choroby alergicznej. Jest oczywiste, że należy uwzględnić dodatkowe czynniki przed projektowaniem najbardziej odpowiednich preparatów lub fragmentów do przeciwdziałania patomechanizmowi(om) choroby alergicznej. Jeden z tych czynników dotyczy układu dopełniacza i jego aktywacji przez składniki ekstraktów alergennych.
O wodnych ekstraktach atergennych„domowych” materiałów źródłowych wi dawna wiadomo, że zużywają hemolltyazny dopełniacz w ludzkiej surowicy in vitro [8], BeCenla chemiczne licznych ekstraktów alergennych wykryły prawie uniwersalną obecność organicznych produktów rozkładu, które obejmują produkty o masach cząsteczkowych > 10 kDa reakcji typu Malllαrne białek lub peptydów z węglowodanami (tj. mylanoldyny), jak również rozuszczalne (eu-)melaniny w ekstraktach kurzu domowego i produktów zwierzęcych. Wykazano, ze składniki te są odpowiedzialne za aktywację dopełniacza, a częściowo również za dodatnie reakcje skórne in vivo u et”p”wych osobników alergicznych. Z drugiej strony, w wodnych ekstraktach typowych „p”zad”m”wyrh” alergenów, w rodzaju pyłków roślinnych, główne czynniki uczestniczące w aktywacji dopełniacza zostały ostatni” zidentyfikowane przez autorów wynalazku jak” wolne lub za^o^owane na białkach skondensowane lub hyCr”lizowalne taniny, bądź flawonoidy lub inne polifenole skoniugowane z wysoką gęstością z nośnikowymi cząsteczkami białkowymi w postaci haptenów. Same mylanhidynę, mylenlnę i produkty degradacji tanin opisano juz w 1983 r. jak” nieimmunogenne, chociaż mogą one ulegać prezentacji w fizycznym związku z antygenami białkowymi w ekstraktach, w ten sposób prowadząc do preferencyjnej indukcji przeciwciał z klasy lgE [9],
Mechanizm aktywacji dopełniacza bez pośrednictwa przeciwciał przez te szczególne związki ekstraktów alergennych obejmuje składniki klasycznej drogi Cl, C4, C2 i, w szczególnych warunkach, C3. A zatem, miejscowa aktywacja dopełniacza przez modulujące związki z alergennych ekstraktów może prowadzić d” silnej, uwalniającej histaminę anafilotoksyny C3a i fragmentu C3b, kluczowego czynnika w regulacji komórkowego układu odpornościowego. Wykazano ponadto, że dopełniacz w surowicy osobników „atopowych” wykazuje tendencję do bycia bardziej wrażliwym na czynniki aktywujące, niż obserwowano w surowicach zdrowych osób kontrolnych [8].
Niespodziewanie zaobserwowaliśmy, że taniny i melanoidyny w alergennych ekstraktach są zdolne do aktywacji układu dopełniacza nawet w nieobecności antygenów. Stąd, czynniki te rzeczywiście wykazują właściwości adiuwantów dzięki tworzeniu czynników dopełniacza, takich jak (multiwalyncyjny) C3b, który zapewnia właściwe „wtórne” sygnały do proliferacji limfocytów B i stymulacji syntezy przeciwciał. Receptor tego C3b, CD21 błony zewnętrznej komórek B, sam jest ligandem dla lektyny CD23 na limfocytach B, która z kolei została zidentyfikowana jak” receptor Fc lgE ” niskim powinowactwie. Chociaż szczegóły łańcucha oddziaływań komórka T/komórka B i receptor dopełniacza pozostają poza zakresem tego dokumentu, wydaje się oczywiste, ze bodźce do syntezy przeciwciał lgE specyficznych wobec alergenu oraz do niespecyficznej wobec alergenu aktywacji dopełniacza mogą być ściśle powiązane [10], Ponieważ podwyzszone wytwarzanie lgE skierowanych przeciw alergenowi jest generalnie uważane za wyw”ływujący klinicznie przejαwiający się reakcje alergiczne, implikuje to zatem, że czynniki aktywujące dopełniacz, CD21 i CD23 w ekstraktach aler187 544 gennych przeznaczonych do immunoterapii i indukcji tolerancji są niepożądane i muszą zostać wyeliminowane, zanim w ogóle można próbować zakończonej powodzeniem indukcji anergii komórek T. Świadomość tego wstępnego warunku i jego praktyczne spełnienie są całkowicie nowe i nie mają precedensu we wcześniejszych pracach.
Poznanie co najmniej dwóch funkcjonalnie odrębnych związków organicznych w alergennych ekstraktach, tj. aktywujących dopełniacz tanin i melanoidyn (lub „adiuwantów”) z jednej strony, działających synergistycznie z antygenowymi składnikami (gliko)proteinowymi z drugiej, stanowi nowy i nieoczekiwany przełom w zrozumieniu zależnych od IgE chorób alergicznych u ludzi, co posiada ważne technologiczne reperkusje dla projektowania i wytwarzania nowych lekarstw. Uważa się, na przykład, że do produkcji wywołujących tolerancję kompozycji epitopu dla komórek T nie prowadzących do indukcji przeciwciał IgE, alergenny materiał wyjściowy musi zostać oczyszczony, jak tylko to możliwe, z czynników aktywujących dopełniacz.
Poza swoimi właściwościami aktywacji dopełniacza, taniny i melanoidyny wywierają wiele innych niepożądanych wpływów. Związki te adsorbują silnie do większości białek poprzez liczne wiązania wodorowe i oddziaływania hydrofobowe, w ten sposób ochraniając białka przed atakiem enzymatycznym. Przeciwnie, taniny i melanoidyny hamują szereg różnych enzymów działających w fizjologicznych wartościach pH obojętnego lub nieznacznie zasadowego, włącznie z proteinazami serynowymi trypsyną, chymotrypsyną i kalikreiną [11]. Ponieważ siły fizyczne uczestniczące w oddziaływaniach tanina/melanoidyna-białko odwracalnie spadają do zera przy wartościach pH poniżej 2,5, proteinazą z wyboru do enzymatycznego wytwarzania epitopów dla komórek T z alergennych makrocząsteczek jest enzym żołądkowy pepsyna, który przejawia optimum aktywności w pH 2. Przy tej wartości pH, taniny i melanoidyny (których maksymalna masa cząsteczkowa wynosi około 5 kDa) dysocjują od białek i mogą zostać usunęte przez diallzę lub ullt^rdiiltr^a^ji^. DllUego też, .est bezwzględme konieczne, aby proces trawienia enzymatycznego pepsyną w celu fragmentacji alergenu został poprzedzony przez etap dializy z podłoża kwaśnego (o pH niższym niż 2,5) w nieobecności enzymu, w celu usunięcia zakłócających tanin i/lub melanoidyn bez wpływania na struktury białek alergennych. Gdyby te polihydroksylowe substancje nie zostały usunięte przed procesem trawienia pepsyną, mogłyby one po zobojętnieniu ponownie wiązać się z pożądanymi peptydami dla komórek T i czynić je niedostępnymi w końcowym produkcie farmaceutycznym. Dlatego też, potencjalny materiał wyjściowy do fragmentacji enzymatycznej może zawierać „pozbawione pigmentów” alergeny przygotowane w pH 2 w nieobecności enzymu, a opisane szczegółowo w europejskim opisie patentowym numer Ep 0 662 080 BI. Taniny i/lub melanoidyny można usuwać na etapie dializy przez membrany o granicy przepuszczalności 5 kDa.
Jak opisano szczegółowo w europejskim opisie patentowym numer EP 0 662 080 BI, proces depigmentacji białek alergennych w rozcieńczonym roztworze kwasu solnego lub siarkowego o pH 2,0 ± 0,1 usuwa zasadniczą część (15-60% wagowych, zależnie od materiału źródłowego) rozpuszczonych składników o masie cząsteczkowej >10 kDa z ekstraktów alergennych przez dializę lub ultrafiltrację bezpośrednio z podłoża kwaśnego poprzez membrany o granicy przepuszczalności 10 kDa. Dlatego też, masy cząsteczkowe ulegających desorpcji składników pozostają w zakresie poniżej 10 kDa i obejmują one naturalne taniny, (eu)melaniny i melanoidyny, które normalnie posiadają masę cząsteczkową około 5 kDa. Jeśli tego stanowiącego środek ostrożności etapu kwaśnej dializy nie przeprowadzi się przed fazą trawienia, np. fazą trawienia dodaną pepsyną, tak jak nie wprowadzono go do procedur opisanych w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 469 667 oraz europejskim opisie patentowym numer EP 0113712 BI, zobojętnienie kwaśnego roztworu w przypadku pepsyny po hydrolizie w pH 2 powodować będzie odtwarzanie kompleksów taninapeptyd, jak dyskutowano powyżej, w ten sposób osłaniając pożądane epitopy dla komórek T przed późniejszym rozpoznawaniem przez komórkowy układ odpornościowy. Zaniechanie usuwania tanin i melanoidyn przed trawieniem enzymatycznym będzie również pozostawiać niezmienioną siłę aktywacji dopełniacza produktu końcowego i prowadzić do niepożądanej stymulacji syntezy IgE po zastosowaniu u ludzi.
187 544
Pomimo poprawnie przeprowadzonego procesu depigmentacji, chemicznie związane struktury polifenolowe i typu Maillarda można często nadal identyfikować chemicznie i spektroskopowo nawet na poddanych właściwej depigmentacji białkach alergennych [12]. Takie skoniugowane polifenolowe i węglowodanowe pochodne tworzą integralną część struktury molekularnej alergenów białkowych i nie mogą zostać usunięte w kwaśnym podłożu. Wykazano nawet, że takie niebiałkowe łańcuchy boczne mogą, nawet jako hapteny, tworzyć część miejsc epitopowych dla komórek B rozpoznawanych przez specyficzne przeciwciała IgE i IgG, jak przedstawiono w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 384 395 i europejskim opisie patentowym numer EP A 0 387 952. Rzeczywiście, eliminacja fizycznie zaadsorbowanych tanin i melanoidyn przez proces depigmentacji według europejskiego opisu patentowego numer EP 0 662 080 BI, pomaga w odmaskowywaniu tych skoniugowanych z białkami struktur haptenowych, prowadząc dla większości alergenów do niewielkiego wzrostu wiązania specyficznych przeciwciał IgE. Z drugiej strony, rozmieszczenie i gęstość haptenów na nośniku będącym antygenem białkowym mogą być takie, że określone pozbawione pigmentów preparaty zawierające składniki o masach cząsteczkowych >10 kDa (HMW-D) nie mogą łatwo ulegać hydrolizie enzymatycznej, jak to donoszono dla alergenów z pyłku Parietaria judaica [12]. W przeciwieństwie do tego, co założono w europejskim opisie patentowym numer EP 0113712 BI, stwierdzono, że łatwość enzymatycznego trawienia pepsyną jest różna wśród różnych pozbawionych pigmentów preparatów alergenów zawierających składniki o masach cząsteczkowych >10 kDa, co oznacza, że warunki hydrolizy enzymatycznej muszą zostać dostosowane zależnie od źródła alergenu. Jak przedstawiono w przykładach z Figury 1 niniejszego zgłoszenia patentowego, szybkość pojawiania się wolnych peptydowych grup aminowych, oznaczana z odczynnikiem ninhydrynowym podczas trawienia pepsyną, rzeczywiście wykazuje znaczne zróżnicowanie wśród różnych alergennych preparatów pyłku.
Dominujące struktury haptenowe, które, jak stwierdzono, włączone są do szkieletów białek alergennych, należą do grupy polihydroksylowych flawonoidów i innych polifenoli, które w warunkach utleniających tworzą silne wiązania tioeterowe z resztami cystein w makrocząsteczce białka, bądź stanowią produkty chemicznego przegrupowania heksoz lub pentoz związanych z grupami e-aminowymi łańcuchów bocznych lizyn [1]. Struktury haptenowe połączone poprzez zarówno atom S, jak i atom N(e), absorbują światło ultrafioletowe w zakresie 300-350 nm, gdzie absorpcja czystego białka jest znikoma. Jak zilustrowano w przykładach z Figury 2, rzeczywiście obserwuje się odwrotną zależność pomiędzy gęstością haptenów ocenianą w przybliżeniu przez spektroskopię w UV, a szybkością trawienia alergennych kompleksów hapten-białko pepsyną, jak mierzono poprzez uwalniane, reaktywne wobec ninhydryny, wolne grupy aminowe.
W niektórych przypadkach preparatów HMW-D o wysokiej oporności na pepsynę, metodami elektroforetycznymi można wykazać, że - pomimo małej ilości uwalnianych wolnych grup aminowych (Fig. 1) - fragmentacja jest nie mniej jednak widoczna dzięki utracie wykrywalnych składników białkowych. W przykładzie dotyczącym pyłku Parietaria, wyraźną fragmentację można również wykazać przez utratę siły aktywacji dopełniacza - ale nie wiązania IgE - dla fragmentów enzymatycznych (Fb-D) o współczynnik równy co najmniej 100. W świetle silnych redukujących właściwości elementów strukturalnych polifenol- lub lizyna-cukier, w niektórych przypadkach utlenianie może być warunkiem wstępnym wymaganym do pełnej eliminacji zarówno miejsc wiążących IgE, jak i aktywujących dopełniacz. Utlenianie preparatów HMW-D przed fragmentacją można prowadzić stosując szereg różnych czynników chemicznych, np. sole nadjodowe (patrz niżej). Jednakże, w celu ochrony możliwych węglowodanowych epitopów dla komórek T, metodą z wyboru jest utlenianie za pomocą napromieniowywania ultrafioletem, które, jak wykazano, zmniejsza zarówno siłę aktywacji dopełniacza, jak i wiązania IgE (13). Dlatego też, w przypadku preparatów HMW-D z pyłku niektórych chwastów, drzew i ziół, można wprowadzić dodatkowy etap utleniania po depigmentacji, ale przed fragmentacją (patrz poniżej).
Procedury enzymatycznej fragmentacji i (ewentualnie) utleniania według wynalazku można stosować do wszystkich znanych alergennych materiałów środowiskowych, domowych i pozadomowych, włącznie z roztoczami, owadami, pleśniami, pyłkiem rodzin traw, chwa187 544 stów i drzew, pyłami organicznymi w środowiskach zawodowych itp. Materiały te można ekstrahować i poddawać procesowi depigmentacji w sposób opisany, np., w europejskim opisie patentowym numer EP 0 662 080 BI, którego zawartość włączono w ten sposób do niniejszego opisu poprzez odnośniki literaturowe. Późniejszy właściwy wybór warUnków fragmentacji (wcześniejsze utlenianie, stosunek enzymu do substratu, okres hydrolizy enzymatycznej itp.) dla uzyskania degradacji proteolitycznej substancji alergennej w ekstrakcie może zależeć od wstępnej weryfikacji doświadczalnej stosownie do charakteru materiału źródłowego. Taki wybór jest czynnością rutynową dla specjalisty w tej dziedzinie i można go dokonać bez nadmiernego obciążenia.
Proponowane przygotowywanie naturalnych epitopów dla komórek T obejmuje szereg etapów, które przykładowo przedstawiono w procedurze opisanej w przykładzie. Ogólnie, sposób według wynalazku jest sposobem wytwarzania ekstraktu zapewniającego tolerancję do stosowania u osobnika w celu zapewnienia tolerancji wobec materiału alergennego, przy czym rzeczony sposób obejmuje:
a) ekstrakcję alergennego materiału źródłowego,
b) usuwanie materiału o masie cząsteczkowej niższej od 3,5 kDa, w ten sposób prowadząc do otrzymania frakcji HMW-N, ewentualnie liofilizację HMW-N,
c) usuwanie z frakcji tanin i melanoidyn, które są fizycznie połączone z materiałem alergenu w HMW-N, w ten sposób prowadząc do otrzymania pozbawionej pigmentów frakcji HMW-D wolnej od wolnych tanin i melanoidyn oraz nieskoniugowanych tanin i melanoidyn, ewentualnie liofilizację HMW-D,
d) degradację białka obecnego w HMW-D, w ten sposób tworząc fragmenty o masie cząsteczkowej pomiędzy 1 a 10 kDa, przy czym rzeczony produkt z etapu d) jest Fb-D, gdzie operacje z etapów a-d prowadzi się w sposób znany per se dla rzeczonych etapów.
Wynalazek obejmuje również ekstrakt alergennego materiału źródłowego, zawierający fragmenty alergenów, zachowujące swoje naturalne epitopy stymulujące limfocyty T, ale wolne od epitopów wiążących IgE, w maksymalnym stopniu pozbawione czynników aktywujących dopełniacz oraz bezpieczne do stosowania jako kompozycje do indukcji stanu anergii specyficznych komórek T i tolerancji immunologicznej u alergików. Ekstrakt według wynalazku może pochodzić ze źródeł alergennych wybranych spośród znanych środowiskowych, domowych i pozadomowych, materiałów alergennych, włącznie z owadami, roztoczami, pleśniami, pyłkiem traw, chwastów, kwiatów, krzewów lub drzew oraz materiałów alergennych w środowiskach zawodowych.
Ekstraktem takim jest korzystnie ekstrakt, w którym siła wiązania IgE fragmentów alergenów, wyrażana jako ilość zliofilizowanego materiału wymagana do 50% inhibicji wiązania IgE w warunkach standardowego oznaczenia, jest co najmniej 100 razy niższa, niż siła nietraktowanego ekstraktu w tym samym rozpuszczalniku i w tych samych warunkach.
Ekstraktem według wynalazku w każdym z wymienionych powyżej rozwiązań może być ekstrakt, w którym współczynnik stymulacji limfocytów T fragmentów alergenów wynosi 50150% w stosunku do tego dla nietraktowanego ekstraktu w tym samym rozpuszczalniku i w tych samych warunkach. W szczególności, ekstraktem według wynalazku jest ekstrakt, w którym fragmenty alergenów posiadają masę cząsteczkową pomiędzy 1 kDa a 10 kDa, jak określono przez dializę wodnego roztworu o pH .7,0 przez membrany o takich nominalnych granicach przepuszczalności. Ekstrakt według wynalazku jest pozbawiony wolnych lub zaadsorbowanych na białkach tanin, melanoidyn i innych pigmentów.
W skrócie, preparat możliwy do otrzymania zgodnie ze sposobem według wynalazku, jak ujawniono, również wchodzi w zakres wynalazku. Taki preparat według wynalazku będzie odpowiednio w farmaceutycznie dopuszczalnej postaci dawkowania w celu stosowania u ludzi i/lub zwierząt.
Stosowanie preparatu według wynalazku jako składnika aktywnego lekarstwa do leczenia osobnika z alergią, w celu indukcji tolerancji na naturalną substancję alergemny z której otrzymano preparat, również uważa się za odpowiednie rozwiązanie wynalazku.
Przykład ilustrujący ekstrakcję, depigmentację i fragmentację sposobem według wynalazku.
187 544
A. Przygotowywanie HMW-N.
Wysuszone alergenne materiały źródłowe, takie jak odtłuszczone proszki pyłku roślinnego, produkty zwierzęce, skończone hodowle roztoczy lub suszone ciała czystych roztoczy bądź ciała innych owadów, zawiesza się w roztworze 0,01 M buforu fosforanowego, pH 7,0, zawierającego 0,15 M NaCl (PBS). Ekstrakcję prowadzi się dwukrotnie z mieszaniem w chłodni w temperaturze +4°C, mianowicie najpierw w ciągu 4 godzin, po czym pozostałość po wirowaniu ponownie ekstrahuje się w ciągu 18 godzin i wiruje. Połączone ekstrakty dializuje się wobec 5 objętości wody destylowanej stosując układ Pellicon® wyposażony w membrany o nominalnej granicy przepuszczalności 10 kDa (nr kat. Millipore®, PLBC 000 05). Oddializowaną frakcję zatrzymywanych składników o masach cząsteczkowych >10 kDa suszy się następnie przez liofilizację, otrzymując nieoczyszczony produkt składników alergenu o masach cząsteczkowych >10 kDa, HMW-N. W wybranych przypadkach, mianowicie jeśli wiadomo, że istnieją „mniejsze” alergeny o masach cząsteczkowych niższych niż 10 kDa, membrany o granicy przepuszczalności można zastąpić membranami dializacyjnymi o granicy przepuszczalności 3,5 kDa.
B. Przygotowywanie HMW-D.
Szczegóły procedury depigmentacji sformułowano w europejskim opisie patentowym numer EP 0 662 081 BI. Krótko, zliofilizowany produkt HMW-N z A) rozpuszcza się w temperaturze pokojowej w wodzie destylowanej w stężeniu 10 mg/ml. Do roztworu tego dodaje się w temperaturze pokojowej i przy stałym mieszaniu 2 N HCL i, podczas zbliżania się do punktu końcowego, 0,1 N HC1 w celu obniżenia pH do 2,0 ±0,1; następnie kontynuuje się mieszanie w ciągu co najmniej 15 minut. Substancje chromoforowe lub „pigmenty” ulegające desorpcji w podłożu kwaśnym z HMW-N usuwa się następnie przez powtarzaną dializę lub ultrafiltrację w chłodni w temperaturze 4°C w ciągu co najmniej 17 godzin wobec kilku zmian wody destylowanej przez membrany o granicy przepuszczalności 10 kDa, dzięki czemu pH roztworu zatrzymywanych składników o masach cząsteczkowych >10 kDa wzrasta do wartości około 3,5. Roztwór zatrzymywanych składników po gruntownej dializie doprowadza się do pH 7,0 ±0,1 przez dodawanie 1,0-0,1 N NaOH. Zobojętniony roztwór ostatecznie wiruje się, przepuszcza przez jałowy sączek o średnicy porów 0,2 ąm i suszy przez liofilizację, otrzymując pozbawiony pigmentów alergenny produkt HMW-D.
C. Przygotowywanie HMW-Dox.
W prototypowej procedurze próbkę zlioilizowanego HMW-D rozpuszcza się w 0,05 M (50 mM) meta-nadjodanie sodowym w pH 5,3 i pozostawia z mieszaniem na 1 godzinę w temperaturze otoczenia. Następnie roztwór przepuszcza się w wodzie destylowanej przez małą kolumnę Sephadex® G25 i pierwsze frakcje eluatu wychodzące z kolumny łączy się i liofilizuje, otrzymując utleniony preparat HMW-Dox. Siłę działania utlenionych preparatów określa się przez porównanie z pierwotnymi produktami HMW-D pod względem zużywania hemolitycznego dopełniacza i hamowania wiązania specyficznych przeciwciał IgE, zgodnie z ustalonymi technikami. Przykład przypadku HMW-D z pyłku Parietaria judaica podano w tabeli I. Dla uniknięcia zanieczyszczenia pozostałościami środków chemicznych lub niepożądanymi produktami rozkładu, preferencyjnie jednakże należy traktować utlenianie HMW-D w roztworze wodnym przez napromieniowywanie światłem ultrafioletowym, jak opisano we wcześniejszej pracy (13).
D. Przygotowywanie enzymatycznych fragmentów Fb-D.
W proponowanej procedurze otrzymywania naturalnych peptydowych epitopów dla komórek T lub haptenów-peptydów pochodzących z trawienia białek, materiałami wyjściowymi są pozbawione pigmentów preparaty HMW-D, otrzymywane zgodnie ze sposobami opisanymi w B) oraz europejskim opisie patentowym numer EP 0 662 080 BI, lub HMW-Dox opisane w C). Procedura otrzymywania fragmentów enzymatycznych Fb-D z obu produktów wyjściowych jest identyczna i można jąopisać szczegółowo jak poniżej.
Zliofilizowany pozbawiony pigmentów materiał HMW-D (lub HMW-Dox) rozpuszcza się w 10 objętościach dwukrotnie destylowanej wody i przenosi do naczynia o podwójnych ścianach, umożliwiającego podczas okresu trawienia krążenie wody o temperaturze 37 ± 1°C
187 544 pomiędzy ścianami zewnętrzną i wewnętrzną z wykorzystaniem pompy perystaltycznej. Do roztworu tego dodaje się, z ciągłym mieszaniem, 2 N HCl w celu obniżenia pH do około 2,5. Następnie dodaje się enzym proteolityczny pepsynę w postaci immobiliowanej, sprzęgniętej z 4% usieciowaną Sepharose® (Sepharose-pepsin, Sigma Chemical Co., St. Louis, USA, nr kat. P-3286) w postaci suchego proszku w stosunku 4 jednostek aktywności pepsyny na mg HMW-D (tj. około 1:5 enzym/substrat w/w, bądź w innym, zależnie od źródła alergenu). Zawiesinę doprowadza się następnie do pH 2,0 ±0,1 przez dodawanie kroplami 0,1 N HC1 i mieszanie kontynuuje się w ciągu co najmniej 6 godzin w temperaturze 37 ± 1°C, utrzymując wartość pH mieszaniny na poziomie 2,0 ± 0,1 dzięki kontroli z zastosowaniem automatycznego pH-statu. Po zakończeniu okresu trawienia mieszaninę zobojętnia się do pH 7,0 stosując 2,0-0,1 NaOH, a następnie sączy przez membranę o średnicy porów 0,4 pm w celu usunięcia cząstek enzymu. Następnie dodaje się wodę destylowaną do uzyskania objętości końcowej dwukrotnie większej od tej pierwotnego roztworu, a następnie dializuje w układzie przepływu stycznego Minitan® wyposażonym w membranę Millipore o granicy przepuszczalności 10 kDa. Zbiera się płyn zewnętrzny (masa cząsteczkowa M <10 kDa), a odrzuca się płyn wewnętrzny, zawierający endo-fragmenty Fa-D o masach cząsteczkowych >10 kDa. W celu zilustrowania, w Tabeli I tego dokumentu podano niektóre szczegóły analityczne endo-fragmentów Fa-D o masach cząsteczkowych >10 kDa, w większości złożonych z heteropolisacharydów. Materiał M <10 kDa poddaje się następnie dalszemu etapowi dializy w Minitan z zastosowaniem membrany o granicy przepuszczalności 1 kDa, gdzie zachowuje się frakcję zatrzymywanych składników o masach cząsteczkowych >1 kDa, a odrzuca płyn zewnętrzny. Roztwór składników zatrzymywanych ostatecznie wyjaławia się przez sączenie przez membrany filtracyjne o średnicy porów 0,22 pm i liofilizuje, otrzymując pożądany produkt fragmentów 1 kDa>Fb-D<10 kDa.
Wydajności i właściwości spektroskopowe produktów wyjściowych HMW-N, preparatów pośrednich HMW-D (Iub HMW-Dox), niestrawionych produktów ubocznych Fa-D (w większości heteropolisacharydów o masach cząsteczkowych >10 kDa) oraz pożądanych produktów końcowych Fb-D przedstawiono zbiorczo w tabeli II dla szeregu reprezentatywnych alergennych materiałów źródłowych.
Kontrola procesu.
Przebieg trawienia enzymatycznego monitoruje się poprzez uwalnianie wolnych grup aminowych. W regularnych odstępach podczas procesu hydrolizy enzymatycznej z mieszaniny pepsyna/białko pobiera się próbki o objętości 0,5 ml, doprowadza do stężenia końcowego 0,4 mg/ml w 4 N buforze octanu sodowego, pH 5,5, a następnie ogrzewa w ciągu 15 minut temperaturze 100°C z 50 pl 2% ninhydryny w rozpuszczalnej metylocelulozie zbuforowanej octanem. Po schłodzeniu odczytuje się absorbancję przy długości fali 541 nm wobec próby odczynnikowej. Reprezentatywne przykłady kinetycznych krzywych trawienia opartych na uwalnianiu wolnych grup aminowych przedstawiono zbiorczo na Figurze 1.
Jak widać na Figurze 1, uwalnianie wykrywalnych wolnych grup aminowych dla niektórych preparatów alergennych może być dość niskie (np. Parietaria, Artemisia, Ambrosia). Jednakże, nie musi to oznaczać, że nie występuje fragmentacja pod wpływem pepsyny, ponieważ, z wyjątkiem pyłku Parietaria judaica [12], enzymatyczne fragmenty Fb-D tych alergennych produktów w znaczącym stopniu traciły swoją zdolność wiązania specyficznych przeciwciał IgE, tj. swoje epitopy dla komórek B (tabela II). Można przypuszczać, że odczynnik ninhydrynowy zostaje zablokowany przez fenolowe łańcuchy boczne peptydów·. Jednakże, ważnym punktem w kontroli produktu jest to, ze końcowe produkty fragmentów Fb-D należy sprawdzać pod względem utraty zdolności wiązania IgE i aktywacji dopełniacza, łącznie z nie obniżonymi właściwościami stymulacji komórek T.
Kontrola produktu końcowego.
Wiązanie specyficznych wobec alergenu przeciwciał IgE.
Zdolność końcowych produktów Fb-D do łączenia się ze specyficznymi przeciwciałami klasy IgE in vitro sprawdza się za pomocąjakichkolwiek ustalonych procedur hamowania, z zastosowaniem surowic specyficznie uczulonych pacjentów z alergią. Siła wiązania IgE fragmen12
187 544 tów, wyrażana jako ilość suchego materiału powodującego 50% hamowanie w warunkach standardowego oznaczenia, musi być co najmniej 100 razy niższa, niż siła macierzystego preparatu HMW-D lub HMW-Dox w identycznych warunkach, tj. obniżona do równej lub niższej od 1%o w stosunku do materiału wyjściowego przed fragmentacją. Niektóre reprezentatywne dane otrzymane dla nieutlenianych preparatów HMW-D przedstawiono zbiorczo w tabeli DI.
Aktywacja dopełniacza.
Zdolność końcowych produktów Fb-D do aktywacji układu dopełniacza in vitro ustala się w oznaczeniach hemolitycznych Iub immunoenzymatycznych, zgodnie z opublikowanymi procedurami (8, 13). Siła aktywacji dopełniacza fragmentów, wyrażana na przykład jako ilość suchego materiału powodującego 50% utraty hemolitycznego dopełniacza, musi być co najmniej 100 razy niższa, niż ta macierzystego preparatu HMW-D Iub HMW-Dox przy oznaczaniu w identycznych warunkach, tj. obniżona do równej Iub niższej od 1% w stosunku do materiału wyjściowego przed fragmentacją.
Stymulacja komórek T.
W celu weryfikacji możliwości stosowania końcowych produktów Fb-D jako aktywnych preparatów zachowujących zasadnicze epitopy dla komórek T, fragmenty Fb-D bada się pod względem ich zdolności do indukcji proliferacji limfocytów T wyizolowanych z krwi pacjentów ze specyficzną alergisą zgodnie z ustalonymi procedurami immunologicznymi. Współczynnik stymulacji komórek T przez finalne fragmenty powinien wynosić pomiędzy 50 a 150% w stosunku do macierzystego preparatu HMW-D. Figura 3 podsumowuje niektóre reprezentatywne dane dotyczące peptydowych fragmentów Fb-D otrzymanych przez fragmentację preparatu HMW-D wyizolowanego z hodowli wykazującego wysoką alergenność tropikalnego roztocza Blomia tropicalis.
Metody różne.
Wszystkie produkty końcowe Fb-D rutynowo poddaje się dodatkowym procedurom kontrolnym, na przykład przez ogniskowanie izoelektryczne w żelu poliakryloamidowym w obecności Ampholines® w zakresie pH 3-10, które, w przeciwieństwie do macierzystych preparatów HMW-D - nie ujawnia jakichkolwiek prążków składników wykrywalnych zwyczajnymi czynnikami wybarwiąjącymi białka. Elektroforetyczny rozdział w żelach poliakryloamidowych z zastosowaniem siarczanu sodowego dodecylu (SDS-PAGE) w obecności Tricine (N-2hydroksy-l,l-bis[hydroksymetyloetylo]glicyna) ujawnia wzory rozkładu prążków wybarwialnych błękitem Coomassie'go, które są całkowicie niepodobne do tych obserwowanych dla macierzystych preparatów HMW-D, i które można wykorzystywać do weryfikacji powtarzalności procesu wytwarzania.
Szereg danych analitycznych dla niektórych reprezentatywnych preparatów alergennych podano w tabelach II i III.
DOKUMENTACJA
Opisy patentowe.
* Primary-tcrnc compounds or allergens, which may be isolated from plant material as well as methods for their preparation and application.
Autor wynalazku: Berrens, L. Europejski opis patentowy numer A 0 387 952. Przyznany 1995 r.
* Method for the isolation af primary-traic compounds or allergens from plant material.
Autor wynalazku: Berrens, L. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 384
395. Data patentu: 24 stycznia 1995 r.
* A process for the purification of aqueous extracts containing allergenically active proteins, extracts obtainable according to this process as well their use.
Autor wynalazku: Berrens, L. Europejski opis patentowy numer EP 0 662 080 BI. Data przyznania: 5 lutego 1997 r. Data złozenia: 21.09.92.
* Polypeptide active pollen immunosupresant fraction.
187 544
Michael J.G., Pesce A.J. (autorzy wynalazku). Europejski opis patentowy numer EP 0113712 Bl, w oparciu o zgłoszenie międzynarodowe PCT/US82/00886, data złożenia 30.06.82 r., data publikacji opisu patentowegol5.03.89 r.
Odnośniki literaturowe
[1] Berrens L. The Chemistry of Atopic Allergens. Monographs in Allergy, tom 7 (Karger, Bazylea 1971).
[2] Shakib F. (Red.) Immunological Intervention Strategies in Allergy. Biochem. Soc. Trans. 1997; 25: 383-403.
[3] Van Neervm R.J.J., Ebner C., Yssel H., Kapsenberg M.L., Lamb J.R. T-cell responses to allergens: epitope-specificity and clinical relevance. Immunology Today 1996; 17: 526-32.
[4] Simons F.E.R., Imada M., Li Y., Watson W.T.A., HayGlass K.T. Fel d 1 peptides: Effect on skin tests and cytokine synthesis in cat-allergic human subjects. Int. Immunology 1996; 8: 1937-45.
[5] Nicodemus C., Philip G., Jones N., Hirani S., Norman P. Integrated clinical experience with tolerogenic peptides. Int. Arch. Allery Immunol. 1997; 113: 326-8.
[6] Litwin A., Pesce A., Michael J.G. Regulation of the immune response to allergens by immunosuppresive allergenic fragments. I. Peptide fragments of honeybee venom phospholipaseA2. Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 1988; 87: 361-6.
[7] Litwin A., Pesce A., Fischer, T., Michael M., Michael J.G. Regulation of the human immune response to ragweed pollen by immunotherapy. A controlled trial comparing the effect of immunosuppresive peptic fragments of short ragweed with standard treatment. Clin. Exp. Allergy 1991; 21: 457-65.
[8] Berrens L. The Atopen: A Rehabilitation. Ann. Allergy 1976; 36: 351-61.
[9] Francus T.G., Siskind G.W., Becter C.G. Role of antigen structure in the regulation of IgE isotype expression. Proc. natl. Acad. Sci. USA 1983; 80: 3430-4.
[10] Sutton B.J., Gould HJ. The human IgE network nature 1993; 366: 421-8.
[11] Berrens L. Digestion of atopic allergens with trypsin, a-chymotrypsin and pancreatic kallikrein, and influence of the allergens upon the proteolytic and esterolytic activity of these enzymes. Immunochemistry 1968; 5: 585-605.
[12] Gonzalez Romano M.L., Gallego M.T., berrens L. Extraordinary stability of IgEbinding Parietaria pollen allergens in relation to chemically bound flavonoids. Mol. Immunol. 1996; 33:1287-93.
[13] Barrens L., Henocq E., Radermecker M. Photoinactivated allergens. I. Preparation, physicochemical and biological properties. Clin. Allergy 1973; 3: 449-59.
Tabela I
Wpływ utleniania meta-nadjodanem na siły wiązania IgE i aktywacji dopełniacza pozbawionych pigmentów alergennych preparatów HMW-D z pyłku Parietaria judaica.
| Produkt | Hg w oznaczonych dla 50% hemolizy w oznaczeniu | współczynnik obniżenia |
| HMW-D | 0,49 | |
| HMW-Dox | 12,36 | 25,2 |
| Hg dla 50% hamowania wiązania | współczynnik | |
| IgE w teście | obniżenia | |
| HMW-D | 1,5 | |
| HMW-Dox | 4,12 | 2,7 |
187 544
Tabela II
Analizy peptydowych fragmentów alergenów
| Źródło alergenu | Frakcja (*) | Wydajność z suchego pyłku/hodowli, % w/w | 50% hamowania IgE (krążki) pg w teście | 50% hamowania IgE (EIA) pg w teście |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Ambrosia | HMW-N | 15,03 | n.o. | n.o |
| elatior | HMW-D | 8,59 | 72,04 | 0,2 |
| Fa-D | 4,52 | 1312,06 | brak hamowania | |
| Fb-D | 0,75 | brak hamowania | brak hamowania | |
| Betula | HMW-N | 2,67 | n.o. | 0,009 |
| alba | HMW-D | 1,72 | n.o. | 0,011 |
| Fa-D | 0,87 | n.o. | 0,442 | |
| Fb-D | 0,42 | n.o. | 3,162 | |
| Lolium | HMW-N | 8,88 | n.o. | 0,081 |
| perenne | HMW-D | 5,07 | 0,81 | 0,012 |
| Fa-D | 2,50 | 324,00 | 5,51 | |
| Fb-D | 1,20 | 854,00 | 138,70 | |
| Olea | HMW-N | 8,20 | n.o. | n o. |
| europea | HMW-D | 5,15 | 11,08 | 0,011 |
| Fa-D | 1,70 | 141,30 | 2,54 | |
| Fb-D | 0,80 | 1077,00 | 17,61 | |
| Parietaria | HMW-N | 3,60 | 5,18 | 0,008 |
| judaica | HMW-D | 1,85 | 3,82 | 0,0126 |
| Fa-D | 0,93 | 3,77 | 0,012 | |
| Fb-D | 0,14 | 4,17 | 0,0102 | |
| D. perony- | HMW-N | 14,96 | n o. | n.o. |
| ssinus | HMW-D | 14,51 | 2,84 | n o. |
187 544
c.d.tabeli II
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Fa-D | 6,08 | 52,70 | n.o. | |
| Fb-D | 2,59 | 452,20 | n.o. | |
| Blomia | HMW-N | 9,60 | n.o. | 0,0143 |
| tropicalis | HMW-D | 5,70 | n.o. | 0,0072 |
| Fa-D | 3,40 | n.o. | 0,0085 | |
| Fb-D | 1,20 | n.o. | 2,667 |
(*) Frakcje Fa-D zawierają nie ulegające strawieniu pozostałości o masach cząsteczkowych >10 kDa.
Fragmenty Fb-D o 1 kDa < M <10 kDa zawierają pożądane produkty końcowe.
Tabela II
Analizy peptydowych fragmentów alergenów
| Źródło alergenu | E(1%, 1 cm) (270 nm) pH 7,4 | E(1%, 1 cm) (325-350 nm) pH 7 | materiał ninhydryno-dodatni jako % równow. glicyny | % węglowodanów metoda antronowa jako % galakozy |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Ambrosia | 58,64 | 38,24 | n.o. | n.o. |
| elatior | 50,80 | 38,68 | 1,96 | 41,13 |
| 0,40 | 1,24 | 1,58 | 36,08 | |
| 39,48 | 27,08 | 3,92 | 28,45 | |
| Betula | 10,56 | - | n.o. | n.o. |
| alba | 6,92 | - | n.o. | n.o. |
| 5,13 | - | n.o. | n.o. | |
| 6,83 | - | n.o. | n.o. | |
| Lohum | 7,33 | 2,82 | n.o. | n.o. |
| perenne | 7,95 | 2,90 | 3,70 | 35,41 |
| 1,87 | 0,73 | 2,67 | 56,48 | |
| 7,59 | 1,63 | 7,70 | 8,25 | |
| Olea | 51,04 | 29,02 | n.o. | n o |
| europea | 24,16 | 10,82 | 4,37 | 25,37 |
| 11,14 | 5,62 | 2,97 | 42,09 |
187 544
c.d.tabeli II
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 11,84 | 4,90 | 7,89 | 8,47 | |
| Parietaria | 76,20 | 41,68 | 5,44 | n.o. |
| judaica | 40,64 | 18,92 | 3,35 | 30,07 |
| 30,72 | 15,29 | 3,18 | 30,35 | |
| 38,88 | 24,00 | 4,09 | 38,83 | |
| D perony- | 11,14 | n.o. | n.o. | n.o. |
| ssinus | 10,08 | n.o. | 3,10 | 39,78 |
| 10,70 | n.o. | 1,69 | 64,60 | |
| 8,55 | n.o | 2,02 | 20,27 | |
| Blomia | 26,22 | n.o | 100 | 16,53 |
| tropi ca lis | 25,42 | n.o | 81,00 | 22,49 |
| 30,16 | n.o. | 70,00 | 24,07 | |
| 17,12 | n.o. | 100 | 18,54 |
(*) Frakcje Fa-D zawierają nie ulegające strawieniu pozostałości o masach cząsteczkowych >10 kDa. Fragmenty Fb-D o 1 kDa < M <10 kDa zawierają pożądane produkty końcowe.
Tabela III
Współczynniki obniżenia siły wiązania IgE (reaktywności z epitopami dla komórek B) oznaczone poprzez hamowanie wiązania IgE ze specyficznych surowic ludzkich dla poszczególnych produktów alergenów z HMW-D* skoniugowanymi chemicznie z zastosowaniem bromku cyjanu krążkami bibuły („hamowanie RAST”). Przeliczone wobec względnej siły HMW-D = 1.
| Źródło alergenu | Frakcja | ||
| HMW-D>10 kDa FaD >10 kDa 1 kDa <FaD<10 kDa | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| Ambrosia | |||
| elatior | 1 | 18 | 1500 |
| Betula alba | 1 | 169 | 1123 |
| Lohum perenne | 1 | 400 | 1054 |
| Olea europaea | 1 | 13 | 97 |
| Artemisia | |||
| vulgaris** | 1 | 8 | 61 |
| Parietaria | |||
| judaica | 1 | 1 | 1 |
| D pterony- |
187 544
c.d.tabeli III
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| ss mus | 1 | 19 | 159 |
| Blomia | |||
| tropicalis ** | 1 | 1 | 370 |
* nieutleniane preparaty pozbawione pigmentów ** współczynniki obniżenia obliczone z oznaczeń immunoenzymatycznych w płytkach do mikromiareczkowania z powierzchnią studzienek opłaszczoną HMW-D.
Podpisy do figur
Figura 1: Kinetyka uwalniania reaktywnych wobec ninhydryny wolnych grup aminowych z szeregu reprezentatywnych alergennych preparatów HMW-D poddanych enzymatycznej hydrolizie pepsyną. Warunki: patrz tekst.
Figura 2: Odwrotna zależność pomiędzy podatnością na trawienie preparatów HMW-D pyłku pepsyną (tj. barwą ninhydryny po 6 godzinach hydrolizy w temperaturze 37°C i pH 2) oraz współczynnikami ekstynkcji E(1%, 1 cm) przy długości fali 325 nm na podstawie widm w ultrafiolecie w 0,01 M buforze fosforanowym, pH 7,0.
Figura 3: Proliferacja limfocytów T w hodowlach limfocytów obwodowych (inkorporacja radioaktywnej tymidyny, jednostki względne) z krwi (a) pacjentów ze specyficzną. alergią pacjentów oraz (b) zdrowych osobników kontrolnych z ujemnymi wynikami testów skórnych po stymulacji pozbawionym pigmentów preparatem HMW-D oraz fragmentami Fb-D przygotowanymi z ekstraktów Blomia tropicalis.
Claims (15)
1. Sposób wytwarzania ekstraktu do zapewniania tolerancji wobec materiału alergennego u osobnika, znamienny tym, że
a) ekstrahuje się alergenny materiał źródłowy;
b) usuwa się materiał o masie cząsteczkowej niższej niż 3500, prowadząc do otrzymania frakcji HMW-N, i ewentualnie liofilizuje się HMW-N;
c) z frakcji HMW-N usuwa się taniny i mełanoidyny, które są fizycznie połączone z materiałem alergenu w HMW-N, prowadząc do otrzymania pozbawionej pigmentów frakcji HMW-D wolnej od wolnych tanin i melanoidyn oraz nieskoniugowanych tanin i melanoidyn, i ewentualnie liofilizuje się HMW-D;
d) degradauje się obecne w frakcji HMW-D białka, tworząc fragmenty o masie cząsteczkowej pomiędzy 1000 a 10000, przy czym produkt z etapu d) stanowi Fb-D; i przy czym, ponadto przed etapem d) prowadzi się etap utleniania HMW-D w sposób znany per se, zapewniając frakcję HMW~Dox, w etapie d) przeprowadzając zatem raczej degradację HMWDox niż HMW-D.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że źródłowy materiał alergenny wybiera się ze znanych środowiskowych, domowych i pozadomowych materiałów alergennych, obejmujących owady, roztocza, pleśnie, pyłki traw, chwastów, kwiatów, krzewów i drzew, pyły organiczne w środowiskach zawodowych.
3. Sposób według zastrz. 1, albo 2, znamienny tym, że etap a) obejmuje zawieszanie alergennego materiału źródłowego w buforze fosforanowym, a następnie w etapie b) prowadzi się dializę wobec wody destylowanej z zastosowaniem półprzepuszczalnej membrany o granicy przepuszczalności 3500.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap b) obejmuje usuwanie materiału o masach cząsteczkowych niższych niż 10000, jeśli wiadomo, że tak zwane „mniejsze” alergeny o masach cząsteczkowych poniżej 10000 są nieobecne w alergennym materiale źródłowym, w ten sposób otrzymując frakcję HMW-N.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że etap a) obejmuje zawieszenie alergennego materiału źródłowego w buforze fosforanowym, a następnie w etapie b) ekstrakcję wobec wody destylowanej z zastosowaniem dializy przy granicy przepuszczalności 10000.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap c) obejmuje etap depigmentacji, w którym pH obniża się do poziomu poniżej 2,5, po którym następuje etap zapewniający usuwanie wolnych tanin, melanoidyn i innych pigmentów, w ten sposób otrzymując preparat HMW-D pozbawiony takich związków, np. przez dializę z wykorzystaniem co najmniej jednej półprzepuszczalnej membrany o określonej przepuszczalności mas cząsteczkowych.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie c) przeprowadza się etap depigmentacji, w którym pH obniża się do poziomu poniżej 2,5, po którym następuje etap wystarczający do zapewnienia usunięcia z uzyskanej frakcji wolnych tanin, melanoidyn, otrzymując HMW-D pozbawiony wolnych tanin i melanoidyn, np. przez dializę przez membranę o granicy przepuszczalności 10000, i w ten sposób zachowując frakcję o masach cząsteczkowych poniżej 10000, po której następuje dializa przez membranę o granicy przepuszczalności 1000, zachowując frakcję o masach cząsteczkowych powyżej 1000.
8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie c) prowadzi się końcowy etap doprowadzania wartości pH roztworu HMW-D do pH obojętnego.
9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie d) prowadzi się enzymatyczną degradację białka.
10. SposóS według zastrz. 1, zn amienny tym, że etap d) obejmuje prote olrtyczną degradację kwaśną proteinazą, gdzie wybiera się właściwe warunki fragmentacji, zmienne zaleznie od charakteru materiału źródłowego i wybranej proteinazy.
187 544
11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap d) obejmuje proteolityczną degradację kwaśną hydrolazą pepsyną.
12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap d) obejmuje proteolityczne rozszczepianie kwaśną proteinazą, po którym następuje zatrzymanie frakcji o masie cząsteczkowej niższej niz 10000, co można osiągnąć np. przez dializę przez membranę o granicy przepuszczalności 10000.
13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że po etapie c), a przed etapem d) wprowadza się etap utleniania poprzez naświetlanie roztworu HMW-D światłem ultrafioletowym o długości fali 250 nm lub 360 nm.
14. Sposób według zastrz. 1, albo 2, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, albo 9, albo 10, albo 11, albo 12, albo 13, znamienny tym, że etap utleniania po etapie c), a przed etapem d) obejmuje traktowanie HMW-D metanadjodanem sodowym, po którym następuje oczyszczanie w celu usunięcia nadmiaru czynnika utleniającego, np. przez sączenie molekularne.
15. Ekstrakt możliwy do otrzymania sposobem jak zdefiniowano w zastrz. 1-14, do stosowania jako składnik aktywny leku do leczenia osób z alergią za pomocą indukowania tolerancji wobec naturalnych substancji alergennych, z których pochodzi preparat.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL97340293A PL187544B1 (pl) | 1997-10-30 | 1997-10-30 | Wywołujące tolerancję fragmenty naturalnych alergenów |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/NL1997/000598 WO1999022762A1 (en) | 1997-10-30 | 1997-10-30 | Tolerogenic fragments of natural allergens |
| PL97340293A PL187544B1 (pl) | 1997-10-30 | 1997-10-30 | Wywołujące tolerancję fragmenty naturalnych alergenów |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL340293A1 PL340293A1 (en) | 2001-01-29 |
| PL187544B1 true PL187544B1 (pl) | 2004-07-30 |
Family
ID=19866218
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL97340293A PL187544B1 (pl) | 1997-10-30 | 1997-10-30 | Wywołujące tolerancję fragmenty naturalnych alergenów |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6350590B1 (pl) |
| EP (2) | EP2042192A3 (pl) |
| JP (1) | JP3790099B2 (pl) |
| AT (1) | ATE417626T1 (pl) |
| AU (1) | AU729589C (pl) |
| BR (1) | BR9714899A (pl) |
| CA (1) | CA2307655C (pl) |
| CZ (1) | CZ302352B6 (pl) |
| DE (1) | DE69739174D1 (pl) |
| DK (1) | DK1024829T3 (pl) |
| ES (1) | ES2319341T3 (pl) |
| HU (1) | HUP0004831A3 (pl) |
| IL (1) | IL135881A0 (pl) |
| PL (1) | PL187544B1 (pl) |
| PT (1) | PT1024829E (pl) |
| WO (1) | WO1999022762A1 (pl) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BR9714899A (pt) * | 1997-10-30 | 2000-08-22 | C B F Letti S A | Processo para produzir um extrato provendo tolerância para aplicação a um indivìduo a fim de prover tolerância contra material alergênico, extrato de material de fonte alergênica, preparação, e,uso da mesma |
| WO2003020306A1 (fr) * | 2001-08-29 | 2003-03-13 | Kyogo Itoh | Desensibilisants |
| EP1872792A1 (en) * | 2006-06-29 | 2008-01-02 | Biotech Tools S.A. | A method for the production of hydrolyzed allergen |
| US20100278880A1 (en) * | 2008-01-02 | 2010-11-04 | Biotech Tools S.A. | Pharmaceutical formulation for allergen preparation |
| EA027259B1 (ru) | 2011-04-29 | 2017-07-31 | Селекта Байосайенсиз, Инк. | Наноносители, вырабатывающие иммунную толерантность, для антиген-специфического удаления т-эффекторных клеток |
| CN105263478A (zh) | 2013-05-03 | 2016-01-20 | 西莱克塔生物科技公司 | 用于诱导免疫耐受的具有特定药效学有效持续期之免疫抑制剂与抗原的递送 |
| EA201790534A1 (ru) | 2014-09-07 | 2017-07-31 | Селекта Байосайенсиз, Инк. | Способы и композиции для ослабления иммунных ответов против вирусного вектора для переноса, предназначенного для генной терапии |
| CA3039101A1 (en) | 2016-10-05 | 2018-04-12 | Asit Biotech S.A. | Prevention of allergy |
| US11426451B2 (en) | 2017-03-11 | 2022-08-30 | Selecta Biosciences, Inc. | Methods and compositions related to combined treatment with antiinflammatories and synthetic nanocarriers comprising an immunosuppressant |
| CN114207440A (zh) | 2019-06-04 | 2022-03-18 | 西莱克塔生物科技公司 | 聚乙二醇化尿酸酶的制剂和剂量 |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US150389A (en) | 1874-05-05 | Improvement in combined paper-clips and letter-folders | ||
| GB1282163A (en) | 1969-08-06 | 1972-07-19 | Beecham Group Ltd | Modified allergens and a process for their preparation |
| GB1492973A (en) | 1974-02-16 | 1977-11-23 | Beecham Group Ltd | Process for preparing injectable compositions |
| GB1578348A (en) | 1976-08-17 | 1980-11-05 | Pharmacia Ab | Products and a method for the therapeutic suppression of reaginic antibodies responsible for common allergic |
| US4338297A (en) | 1980-02-19 | 1982-07-06 | Michael Jacob G | Polypeptide active pollen immunosuppressant fraction |
| EP0038154B1 (en) | 1980-04-15 | 1983-09-21 | Beecham Group Plc | Allergens modified with polysarcosines |
| JPS58115120A (ja) | 1981-12-28 | 1983-07-08 | Nippon Oil Co Ltd | ピツチ系炭素繊維の製造方法 |
| ES2013359A6 (es) | 1988-11-04 | 1990-05-01 | Corporacion Biolog Farmaceutic | Procedimiento para la fabricacion de alergenos inmunogenicos polimerizados. |
| NL8900652A (nl) | 1989-03-16 | 1990-10-16 | Leti Lab | Primair-toxische stoffen of allergenen, isoleerbaar uit plantaardig materiaal, alsmede werkwijzen ter bereiding ervan en de toepassing ervan. |
| US5792506A (en) * | 1991-10-12 | 1998-08-11 | The Regents Of The University Of California | Neutralization of food allergens by thioredoxin |
| AU675629B2 (en) * | 1992-09-21 | 1997-02-13 | Laboratorios Leti S.A. | A process for the purification of aqueous extracts containing allergenically active proteins, extracts obtainable according to this process as well as their use |
| WO1994006821A1 (en) * | 1992-09-21 | 1994-03-31 | Laboratorios Leti S.A. | A process for the purification of aqueous extracts containing allergenically active proteins, extracts obtainable according to this process as well as their use |
| FI972443L (fi) * | 1994-12-07 | 1997-06-09 | Novo Nordisk As | Polypeptidi, jonka allergeenisuus on vähentynyt |
| CZ283615B6 (cs) * | 1996-05-31 | 1998-05-13 | Bioveta, A.S. | Způsob výroby vakcín proti dermatofytózám zvířat a dermatofytických alergenů |
| BR9714899A (pt) * | 1997-10-30 | 2000-08-22 | C B F Letti S A | Processo para produzir um extrato provendo tolerância para aplicação a um indivìduo a fim de prover tolerância contra material alergênico, extrato de material de fonte alergênica, preparação, e,uso da mesma |
| WO2004031961A1 (en) | 2002-09-30 | 2004-04-15 | Insignia Solutions Plc | Efficient system and method for updating a memory device |
-
1997
- 1997-10-30 BR BR9714899-7A patent/BR9714899A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-10-30 DE DE69739174T patent/DE69739174D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-30 CA CA002307655A patent/CA2307655C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-10-30 EP EP08171363A patent/EP2042192A3/en not_active Withdrawn
- 1997-10-30 AU AU58833/98A patent/AU729589C/en not_active Ceased
- 1997-10-30 WO PCT/NL1997/000598 patent/WO1999022762A1/en not_active Ceased
- 1997-10-30 DK DK97954496T patent/DK1024829T3/da active
- 1997-10-30 JP JP2000518693A patent/JP3790099B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1997-10-30 US US09/530,277 patent/US6350590B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-30 PL PL97340293A patent/PL187544B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-10-30 PT PT97954496T patent/PT1024829E/pt unknown
- 1997-10-30 AT AT97954496T patent/ATE417626T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-10-30 IL IL13588197A patent/IL135881A0/xx unknown
- 1997-10-30 HU HU0004831A patent/HUP0004831A3/hu unknown
- 1997-10-30 EP EP97954496A patent/EP1024829B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-30 ES ES97954496T patent/ES2319341T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-30 CZ CZ20001529A patent/CZ302352B6/cs not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-12-04 US US10/000,453 patent/US6660495B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6350590B1 (en) | 2002-02-26 |
| EP2042192A2 (en) | 2009-04-01 |
| IL135881A0 (en) | 2001-05-20 |
| AU729589C (en) | 2001-08-30 |
| CZ20001529A3 (cs) | 2000-10-11 |
| JP3790099B2 (ja) | 2006-06-28 |
| US20020086348A1 (en) | 2002-07-04 |
| PT1024829E (pt) | 2009-03-18 |
| AU729589B2 (en) | 2001-02-08 |
| BR9714899A (pt) | 2000-08-22 |
| JP2001521907A (ja) | 2001-11-13 |
| CA2307655C (en) | 2005-05-24 |
| DK1024829T3 (da) | 2009-02-09 |
| WO1999022762A1 (en) | 1999-05-14 |
| ES2319341T3 (es) | 2009-05-06 |
| HUP0004831A2 (hu) | 2001-05-28 |
| HUP0004831A3 (en) | 2001-09-28 |
| CZ302352B6 (cs) | 2011-03-30 |
| AU5883398A (en) | 1999-05-24 |
| EP1024829A1 (en) | 2000-08-09 |
| US6660495B2 (en) | 2003-12-09 |
| DE69739174D1 (de) | 2009-01-29 |
| ATE417626T1 (de) | 2009-01-15 |
| EP2042192A3 (en) | 2009-05-27 |
| EP1024829B1 (en) | 2008-12-17 |
| CA2307655A1 (en) | 1999-05-14 |
| PL340293A1 (en) | 2001-01-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| King | Chemical and biological properties of some atopic allergens | |
| EP2140880B1 (en) | Modification of allergens | |
| EP0113712B1 (en) | Polypeptide active immunosuppressant fraction | |
| EP2853271B1 (en) | Allergen extracts | |
| PL187544B1 (pl) | Wywołujące tolerancję fragmenty naturalnych alergenów | |
| EP1267921B1 (en) | Composition and method for the prevention and/or the treatment of der pii allergy | |
| Ibarrola et al. | Biological characterization of glutaraldehyde‐modified Parietaria judaica pollen extracts | |
| JPH02138130A (ja) | 重合されたアレルゲンの製造方法 | |
| JPH10505356A (ja) | ヒトへの投与のための組成物および方法、抗原特異的免疫応答のダウンレギュレーションを行うことが可能なペプチド | |
| KR100395446B1 (ko) | 펩티드 및 그 용도 | |
| AU682669B2 (en) | Allergenic extracts | |
| RU2279888C1 (ru) | Аллергоид из яда пчел для аллерген-специфической иммунотерапии больных с аллергическими реакциями на ужаление пчелами и способ его получения | |
| US20100086568A1 (en) | Modification of allergens | |
| US20220110983A1 (en) | Methods of purifying an allergen extract | |
| RU2809823C2 (ru) | Способы очистки экстракта аллергена | |
| Alam et al. | Production and properties of histamine-releasing factor of guinea pigs. | |
| SPITZAUER et al. | R. VALENTA,* T. BALL,* M. FOCKE,* B. LINHART,* N. MOTHES,* V. NIEDERBERGER |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20051030 |