PL191258B1 - Sposób wytwarzania zakaźnego klonu wirusa, rekombinowany kwas nukleinowy, cząsteczka kwasu nukleinowego, modyfikowany wirus, szczepionka i komórka zakażona modyfikowanym wirusem - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania zakaznego klonu wirusa w oparciu o genom wirusa PRRS, zna- mienny tym, ze wytwarza sie technikami klonowania rekombinowany kwas nukleinowy obejmuja- cy, co najmniej jedna pelnej dlugosci kopie DNA albo transkrybowana in vitro kopie RNA albo ich pochodna, za pomoca którego rekombinowany kwas nukleinowy zawiera pelna sekwencje genomu wirusa i za pomoca którego wytwarzania wlacza sie, co najmniej zakonczenie 5' sekwencji genomu wirusa w kwas nukleinowy, a nastepnie dostarcza sie komórke gospodarza nie wrazliwa na zaka- zenie przez dziki typ wirusa, transfekuje sie komórke gospodarza rekombinowanym kwasem nukle- inowym i wybiera sie klony zakazne. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze komórka gospodarza jest komórka BHK-21. 3. Rekombinowany kwas nukleinowy obejmujacy zakazny klon wirusa zawierajacy, co naj- mniej jedna pelnej dlugosci kopie DNA albo transkrybowana in vitro kopie RNA albo ich pochod- na, przy czym rekombinowany kwas nukleinowy zawiera pelna sekwencje genomu wirusowego z wlaczonym, co najmniej zakonczeniem 5' wspomnianej sekwencji genomu wirusowego w kwas nukleinowy. PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania zakaźnego klonu wirusa, rekombinowany kwas nukleinowy, cząsteczka rekombinowanego kwasu nukleinowego, modyfikowany wirus, szczepionka i komórka zakażona modyfikowanym wirusem.

Technologia rekombinowanego DNA obejmuje niezwykle zróżnicowane i sprawne techniki biologii molekularnej ukierunkowane na modyfikowanie kwasów nukleinowych na poziomie DNA, oraz umożliwia analizę i modyfikację genomów na poziomie cząsteczkowym. Wtym sensie, z powodu niewielkiego wymiaru swych genomów, wirusy są szczególnie podatne na takie manipulacje. Jednakże, technologia rekombinowanego DNA nie jest możliwa do bezpośredniego zastosowania wobec wirusów RNA innych niż retrowirusy, ponieważ wirusy te nie obejmują w swej replikacji etapu pośredniego DNA. Dla takich wirusów trzeba opracować klony zakaźne (przykładowo jako kopia DNA albo kopia RNA przepisanego in vitro, albo jako ich pochodna) zanim można będzie zastosować technologię rekombinowanego DNA w stosunku do ich genomów w celu wytworzenia zmodyfikowanego wirusa. Zakaźne klony można otrzymać przez skonstruowanie cDNA (tu zastosowane w szerszym znaczeniu kopii DNA z RNA, nie zaś w wąskim znaczeniu kopii DNA z mRNA) pełnej długości (długość genomowa) badanego wirusa, po czym zakaźny transkrypt syntetyzuje się in vivow komórkach transfekowanych cDNA pełnej długości, ale transkrypty zakaźne można również otrzymać przez transkrypcję in vitro z fragmentów cDNA częściowej długości połączonych przez ligację in vitro i obejmujących pełny genom wirusa. We wszystkich przypadkach, przepisany RNA niesie wszystkie modyfikacje, które wprowadzono do cDNA i można go zastosować do dalszego pasażowania tak zmodyfikowanego wirusa.

Zakaźne klony cDNA i zakaźne transkrypty in vitro wytworzono dla wielu nici sensownych wirusów RNA (patrz, Boyer i Haenni, Virology 198:415-426) o genomach dochodzących do 12 kb albo nieco większych. Długość genomu Pestiwirusów wydaje się być największą do tej pory sensowną nicią genomu wirusa RNA, z której wytworzono klony zakaźne (Moorman i in., J. Virol. 70:763-770). Problemy związane z długością genomu nie polegają tylko na trudności w otrzymaniu i utrzymaniu długich i stabilnych klonów cDNA w bakteriach, ale również na zakaźności początkowego transkryptu RNA, którego replikacja w komórce gospodarza ma być osiągnięta bez pomocy normalnie towarzyszących białek wirusowych związanych z replikacją wirusa. Wcelu osiągnięcia pomyślnego zakażenia, transkrypty wirusowe muszą oddziaływać z białkami kodowanymi przez wirusa, szczególnie z replikazą wirusową, oraz ze składnikami komórki gospodarza takimi jak mechanizmy translacyjne; stąd, budowa transkryptów wirusowych musi naśladować budowę wirionu RNA najściślej jak to możliwe. Dodatkowe problemy można spotkać w przypadku wirusów RNA, które replikują na drodze mechanizmu subgenomowego posłańcowego mRNA przepisywanego od końca 3' genomu oraz takich wirusów RNA, które podczas replikacji wytwarzają defektywne cząsteczki zakłócające, takie jak puste kapsydy albo puste cząsteczki pokrywy, obejmujące kilka białek strukturalnych, ale tylko część genomu. Obecność niekompletnych fragmentów wirusowego RNA albo np. białek matrycowych albo nukleokapsydu oddziałujących albo interferujących z przepisywanym wirusowym RNA albo z replikacyjnym pośrednim RNA i niszczącym jego strukturę uwalnia syntezę nici RNA pełnej długości i powstawanie zakaźnego wirusa obejmującego RNA genomowej długości.

Wirus Lelystad (LV) zwany również świńskim wirusem zespołu rozrodczo-oddechowego (PRRSV, długość genomowa 15,2 kb) jest członkiem rodziny Arteriviridae, która obejmuje również końskiego wirusa zapalenia tętnic (EAV, długość genomowa 12,7 kb), wirusa podnoszącego poziom dehydrogenazy mleczanowej (LDV, długość genomowa przynajmniej 14,2 kb) i małpiego wirusa gorączki krwotocznej (SHFV, długość genomowa około 15 kb) (Meulenberg i in., 1993a, Plagemann i Moening, 1993).

Ostatni Międzynarodowy Komitet Taksonomii Wirusów zadecydował o włączeniu tej rodziny do nowego rzędu wirusów, Nidovirales, wraz z Coronaviridae (długość genomowa 28-30 kb) i Toroviridae (długość genomowa 26-28 kb). Rząd Nidovirales obejmuje otoczkowe wirusy RNA, które zawierają genom RNA w postaci nici sensownej i syntetyzują podczas replikacji zagnieżdżony na końcu 3' zestaw subgenomowych RNA. Subgenomowe RNA coronawirusów i arteriwirusów zawiera sekwencję liderową, która pochodzi z końca 5' genomu wirusowego (Spaan i in., 1988; Plagemann i Moennig, 1993). Subgenomowe RNA torowirusów pozbawione są sekwencji liderowej (Snijder i Horzinek, 1993). Podczas gdy ORF 1a i 1b, kodujące polimerazę RNA zależną od RNA, ulegają ekspresji

PL 191 258 B1 z genomowego RNA, mniejsze ORF na końcu 3' genomów Nidovirales, kodujące białka strukturalne, ulegają ekspresji z subgenomowych RNA.

PRRSV (wirus Lelystad) został po raz pierwszy wyizolowany w 1991 roku przez Wensvoorta i in. (1991) i dowiedziono, że jest czynnikiem przyczynowym nowej choroby znanej obecnie jako zespół rozrodczo-oddechowy świń (PRRS), Głównymi objawami choroby są problemy oddechowe u świń i poronienia u macior. Jakkolwiek większe epidemie, jak obserwowana po raz pierwszy w USA w 1987 roku i w Europie w 1991 zmniejszyły się, wirus wciąż powoduje straty ekonomiczne w hodowlach w USA, Europie i Azji. PRRSV rośnie w makrofagach pęcherzyków płucnych (Wensvoort i in., 1991). Kilka linii komórkowych, takie jak CL2621 i inne sklonowane z linii komórkowej nerki małpiej MA-104 (Benfield i in., 1992; Collins i in., 1992; Kim i in., 1993) są również podatne na wirusa. Niektóre dobrze znane szczepy PRRSV są znane pod numerami dostępu CNCM I-1102, I-1140, I-1387, I-1388, ECACC V93070108 albo ATCC VR 2332, VR 2385, VR 2386, VR 2429, VR 2474 i VR 2402. Genom PRRSV został całkowicie albo częściowo sekwencjonowany (Conzelmann i in., 1993; Meulenberg i in., 1993a, Murthaugh i in., 1995) i koduje, oprócz zależnej od RNA polimerazy RNA (ORF 1ai 1b), sześć białek strukturalnych, wśród których są cztery gliko-proteiny otoczkowe zwane GP2 (ORF2), GP3 (ORF3), GP4 (ORF4) i GP5 (ORF5), nie glikozylowane białko błonowe M (ORF6) i białko nukleokapsydu N (ORF7) (Meulenberg i in., 1995; van Neuwstadt i in., 1996). Charakterystyka immunologiczna i sekwencjonowanie nukleotydów szczepów EP i US PRRSV wykazało niewielkie różnice antygenowe pomiędzy szczepami PRRSV zlokalizowane w strukturalnych białkach wirusa (Nelson i in., 1993; Wensvoort i in., 1992; Murtaugh i in., 1995).

Świnie mogą się zarażać PRRSV drogą ustno-nosową. Wirus w płucach jest pobierany przez makrofagi pęcherzyków płucnych, zaś w tych komórkach replikacja wirusa zachodzi w ciągu 9 godzin. PRRSV podróżuje z płuc do węzłów chłonnych płuc w ciągu 12 godzin, zaś do obwodowych węzłów chłonnych, szpiku i śledziony w ciągu 3 dni. W tych miejscach jedynie nieliczne komórki znakują się pozytywnie na antygen wirusowy. Wirus występuje we krwi w ciągu, co najmniej 21 dni, a często jeszcze znacznie dłużej. Po 7 dniach, we krwi można znaleźć przeciwciała przeciwko PRRSV. Równoczesna obecność wirusa i przeciwciał w organizmie zakażonych świń świadczy o tym, że zakażenie wirusem może przetrwać przez czas dłuższy, chociaż na niskim poziomie, mimo obecności przeciwciał. W ciągu przynajmniej 7 tygodni populacja komórek płuc jest różna od normalnych płuc SPF.

PRRSV wymaga swojej otoczki do zakażenia świń drogą ustno-nosową, zaś normalna reakcja odpornościowa świń obejmuje m.in. wytwarzanie przeciwciał neutralizujących skierowanych przeciwko jednemu albo wielu białkom otoczki; takie przeciwciała mogą wirusa uczynić niezakaźnym. Jednakże, w makrofagu pęcherzykowym wirus wytwarza również puste kapsydy, skonstruowane z RNA obudowanego białkiem M i/lub N, czasami częściowo zawierające dowolną ilość białek wybranych spośród glikoprotein. Obecność wewnątrz- i zewnątrzkomórkowa tych niekompletnych cząstek wirusa albo (częściowo) nagich kapsydów można wykazać mikroskopią elektronową. Niekiedy, można spotkać nagie kapsydy bez zawartości kwasu nukleinowego. Nagie kapsydy rozmieszczane są w organizmie przez układ krążenia i pobierane z krwi przez makrofagi w śledzionie, węzłach chłonnych i szpiku. Owe nagie, ale zakaźne kapsydy nie mogą być zneutralizowane przez przeciwciała wytworzone przez świnię, co tłumaczy przetrwanie zakażenia wirusowego w obecności przeciwciał. W ten sposób, potomstwo makrofagów z zakażonych komórek szpiku rozsiewa zakażenie wirusem do nowych miejsc w organizmie. Ponieważ nie wszystkie komórki linii makrofagalnej szpiku są zarażone, jedynie mała liczba makrofagów w miejscach obwodowych jest zarażona i wytwarza wirusa. Kapsydy PRRSV, zawierające jedynie białko ORF7, mogą być wytwarzane pod nieobecność innych białek wirusa, przez, przykładowo, zakażenie makrofagów chimerycznym wektorem wirusowym pseudowścieklizny-ORF7. Wirus PRV manipuluje się w taki sposób, że zawiera on informację genetyczną ORF7 PRRSV. W 18 godzin po zakażeniu, cytoplazma zakażonych komórek zawiera znaczną liczbę małych pustych struktur sferycznych o wielkości nukleokapsydu wirusa PRRS.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania zakaźnego klonu wirusa w oparciu o genom wirusa PRRS, polegający na tym, że wytwarza się technikami klonowania rekombinowany kwas nukleinowy obejmujący, co najmniej jedną pełnej długości kopię DNA albo transkrybowaną in vitro kopię RNA albo ich pochodną, za pomocą, którego rekombinowany kwas nukleinowy zawiera pełną sekwencję genomu wirusa i, za pomocą, którego wytwarzania włącza się co najmniej zakończenie 5' sekwencji genomu wirusa w kwas nukleinowy, a następnie dostarcza się komórkę gospodarza nie wrażliwą na zakażenie przez dziki typ wirusa, transfekuje się komórkę gospodarza rekombinowanym kwasem nukleinowym i wybiera się klony zakaźne.

PL 191 258 B1

Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się komórką gospodarza, którą jest komórka BHK-21.

Przedmiotem wynalazku jest także rekombinowany kwas nukleinowy obejmujący zakaźny klon wirusa zawierający, co najmniej jedną pełnej długości kopię DNA albo transkrybowaną in vitro kopię RNA albo ich pochodną, przy czym rekombinowany kwas nukleinowy zawiera pełną sekwencję genomu wirusowego z włączonym, co najmniej zakończeniem 5' wspomnianej sekwencji genomu wirusowego w kwas nukleinowy.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest także cząsteczka rekombinowanego kwasu nukleinowego jak zdefiniowano powyżej, charakteryzująca się tym, że co najmniej jedna sekwencja kwasu nukleinowego kodująca znacznik wirulencji i/lub znacznik serologiczny została zmodyfikowana tak, aby sekwencja kwasu nukleinowego kodująca znacznik była usytuowana w jednej z otwartych ramek odczytu kodujących białka strukturalne.

Korzystnie, w cząsteczce według wynalazku otwarta ramka jest ramką ORF7.

Korzystnie jedna otwarta ramka odczytu jest podstawiona przez ORF7 Arteriviridae.

Również korzystnie cząsteczka według wynalazku charakteryzuje się tym, że włączona jest do niej, co najmniej jedna dodatkowa sekwencja heterologicznego kwasu nukleinowego, a bardziej korzystnie ta heterologiczna sekwencja kwasu nukleinowego koduje antygen.

W kolejnym korzystnym rozwiązaniu, cząsteczka wynalazku charakteryzuje się tym, że otwarta ramka odczytu została zmodyfikowana.

Następnym przedmiotem wynalazku jest modyfikowany wirus RNA obejmujący rekombinowany kwas nukleinowy obejmujący zakaźny klon wirusa zawierający, co najmniej jedną pełnej długości kopię DNA albo transkrybowaną in vitro kopię RNA albo ich pochodną, przy czym rekombinowany kwas nukleinowy zawiera pełną sekwencję genomu wirusowego z włączonym, co najmniej zakończeniem 5' wspomnianej sekwencji genomu wirusowego w kwas nukleinowy.

Przedmiotem wynalazku jest także szczepionka obejmująca antygen wirusowy i dopuszczalne farmaceutycznie substancje dodatkowe, charakteryzująca się tym, że jako antygen zawiera zmodyfikowany wirus RNA obejmujący rekombinowany kwas nukleinowy obejmujący zakaźny klon wirusa zawierający, co najmniej jedną pełnej długości kopię DNA albo transkrybowaną in vitro kopię RNA albo ich pochodną, przy czym rekombinowany kwas nukleinowy zawiera pełną sekwencję genomu wirusowego z włączonym, co najmniej zakończeniem 5' wspomnianej sekwencji genomu wirusowego w kwas nukleinowy.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest komórka zakażona modyfikowanym wirusem RNA obejmującym rekombinowany kwas nukleinowy zawierający zakaźny klon wirusa, o co najmniej jednej pełnej długości kopii DNA albo transkrybowanej in vitro kopii RNA albo ich pochodnej, przy czym rekombinowany kwas nukleinowy zawiera pełną sekwencję genomu wirusowego z włączonym, co najmniej zakończeniem 5' wspomnianej sekwencji genomu wirusowego w kwas nukleinowy.

Wynalazek dostarcza zakaźnego klonu wirusa o długości genomowej znacznie przekraczającej maksymalną wielkość genomową wirusów RNA o nici sensownej, z których zakaźne klony dotąd otrzymano. Część doświadczalna niniejszego zgłoszenia opisuje wytworzenie zakaźnego klonu opartego na, i pochodzącego od PRRSV o długości genomowej rzędu 15,2 kb, ale klony takie można obecnie otrzymać z LDV i SPHV, które również mają długość genomową rzędu 15 kb oraz z EAV, jakkolwiek jego genom jest nieco mniejszy, oraz z wirusów o większej długości genomowej, takich jak Coronaviridae albo Toroviridae.

Wynalazek dostarcza również sposobu wytworzenia zakaźnych klonów przez przezwyciężenie problemów napotkanych przy syntezie wirusowej nici RNA, związanych z obecnością niekompletnych fragmentów wirusowego RNA albo np. białek matrycowych albo nukleokapsydu oddziałujących albo interferujących z przepisywanym wirusowym RNA albo z replikacyjnym pośrednim RNA i niszczącym jego strukturę uwalniając syntezę nici RNA pełnej długości i powstawanie zakaźnego wirusa. Wynalazek dostarcza sposobu tworzenia zakaźnych klonów przez transfekowanie komórki gospodarza, która zasadniczo nie jest podatna na zakażenie wirusem typu dzikiego, rekombinowanym kwasem nukleinowym opartym na genomie wirusa, a następnie przez ratowanie zakaźnego potomstwa wirusa z komórki gospodarza przez pasażowanie albo równoczesną hodowlę z komórkami, które są podatne na wirusa. Komórki, które w zasadzie nie są podatne, w porównaniu z komórkami, które są rutynowo stosowane do replikacji badanego wirusa, mogą być nieco podatne albo nie podatne na badanego wirusa, ale mogą być w pełni podatne na inne szczepy wirusa. Wynalazek dostarcza sposobu tworzenia zakaźnych klonów przez transfekowanie komórek gospodarza, które nie są podatne na zakażenie

PL 191 258 B1 wirusem typu dzikiego, co pozwala uniknąć wytwarzania pustych kapsydów albo niekompletnych cząstek wirusa zawierających fragmenty RNA i białka matrycowe albo nukleokapsydu, które zakłócają syntezę nici RNA wirusa. Zakaźny wirus jest ratowany z zakażonych komórek gospodarza przez pasażowanie na komórki, które są podatne na wirusa. W części doświadczalnej opisano, jak otrzymać w ten sposób zakaźny klon PRRSV, ale sposób można zastosować również wobec innych wirusów o nici sensownej RNA.

Wynalazek dostarcza również możliwości wytworzenia zmodyfikowanego klonu zakaźnego przez dalsze zastosowanie technologii rekombinowanego DNA. Takimi modyfikacjami mogą być pojedyncze albo liczne mutacje, zastąpienia, delecje albo insercje albo ich kombinacje, które można osiągnąć dowolną znaną metodą technologii rekombinowanego DNA. Wynalazek dostarcza również zmodyfikowanych wirusów RNA, które można zastosować do badania wirusów RNA oraz do wytwarzania szczepionek.

Wynalazek dostarcza również klonów zakaźnych, przykładowo pochodzących z Arterioviridae, takiego jak PRRSV, który można zastosować jako pojedynczą szczepionkę przeciwko chorobie wywołanej przez wirusa, na którym oparty jest zakaźny klon. Przykładowo, zakaźny klon oparty na PRRSV można zastosować do badania znaczników zjadliwości albo znaczników serologicznych PRRSV. Znane znaczniki serologiczne PRRSV położone są, przykładowo, na jednym z białek strukturalnych PRRSV kodowanym przez ORF2 do 7, ale można je również znaleźć na białkach kodowanych przez ORF 1a i 1b. Znaczniki zjadliwości obecne są na ORF 1a i 1b kodujących białka nie-strukturalne PRRSV, ale można je również znaleźć na dowolnym z białek kodowanych przez ORF2 do 7. Przez modyfikowanie genomu klonu zakaźnego w odniesieniu do tych znaczników, możliwe jest otrzymanie PRRSV, który nie jest, albo jest znacznie mniej zjadliwy w porównaniu ze szczepem rodzicielskim i/lub jest zmodyfikowany przez delecję albo wprowadzenie znaczników serologicznych umożliwiających różnicowanie serologiczne pomiędzy świniami szczepionymi i zakażonymi wirusem typu dzikiego. Modyfikacje takie dostarczone są, przykładowo, przez zakaźne klony PRRSV, w których sekwencja kwasu nukleinowego kodująca białko N ORF7 jest zastąpiona przez białko ORF7 ATCC VR2332 albo LDV.

Niniejszy wynalazek dostarcza również klonów zakaźnych, przykładowo, pochodzących z Arteriviridae takiego jak PRRSV, które można zastosować jako układ dostarczania albo szczepionkę oparta na wektorze wirusowym dla różnych antygenów. W takich klonach, wprowadza się heterologiczne sekwencje kwasu nukleinowego, które nie odpowiadają sekwencji badanego wirusa. Takie heterologiczne sekwencje kwasu nukleinowego mogą, przykładowo, pochodzić z sekwencji kodujących dowolny wybrany antygen. Antygenem tym jest białko albo peptyd, który może wywołać odporność przeciwko patogenowi. Ponieważ wirus zakaża makrofagi i komórki linii makrofagalnej w szpiku i rozprzestrzenia wirusa zawierającego antygen wśród komórek potomnych, taka szczepionka oparta na wektorze wirusowym zakaża komórki centralne układu odpornościowego i może prezentować antygeny do dalszej obróbki. Szczepionka wirusowa zakaża komórki prezentujące antygen, takie jak makrofagi dendrytyczne albo komórki Kupfera albo inne komórki układu odpornościowego i może to robić jako (niekompletnie) opłaszczona cząstka wirusowa albo jako naga cząstka kapsydu. Ponieważ zakażenie nagim kapsydem albo niekompletną cząstką wirusa zapewnia przetrwanie zakażenia, efekt przypominania odporności spowoduje długotrwałą odporność (z powodu ciągłego pobudzania na słabym poziomie) przeciwko patogenom, których antygeny wybrano. Można zastosować wirusa jako nośnik antygenu przez wbudowanie informacji dla epitopów innych organizmów albo substancji patogennych. Kilka takich szczepionek wirusowych niosących informację dla obcych epitopów można zmieszać i podać w tym samym czasie. Umożliwia to czynną odporność przeciwko kilku różnym antygenom jednego patogenu albo czynną odporność przeciwko kilku różnym patogenom.

Wynalazek dostarcza również zakaźnych klonów, przykładowo pochodzących z Arteriviridae takiego jak PRRSV, które można zastosować jako szczepionka diwalentna. Przykładowo, klon zakaźny oparty na PRRSV można zastosować do skonstruowania szczepionki chroniącej przed PRRSV oraz przed innym patogenem, przez połączenie opracowania szczepionki wirusowej z opracowaniem skierowanym na opracowanie szczepionki monowalentnej skierowanej przeciwko PRRS. Konkretną szczepionkę diwalentną można opracować w taki sposób, że chroni ona świnie przed chorobą oddechową przez wprowadzenie do szczepionki PRRS antygenów pochodzących z dowolnego spośród innych patogenów oddechowych, o których wiadomo, że zakażają świnie.

Wynalazek dostarcza również szczepionek monowalentnych, diwalentnych albo szczepionek opartych na wektorze, które są bezpieczne w tym sensie, że szczepionki nie są uwalniane do otoczenia. Bezpieczeństwo stosowania szczepionki (nie uwalniającej się) można zapewnić przez usunięcie

PL 191 258 B1 informacji tych białek wirusowych, które są konieczne do wytworzenia opłaszczonego, zakaźnego wirusa. Wirus taki namnaża się na linii komórkowej, która konstytutywnie wyraża białko. Wirus replikując w takiej dopełniającej linii komórkowej posiada kompletną otoczkę i jest zdolny do zakażania makrofagów świń. Po jednym cyklu replikacji potomstwo wirusa pozbawione informacji dotyczącej białek otoczki nie jest zdolne do zakażania innych komórek jak czyni to wirus z otoczką. Zakażenie makrofagów w organizmie jest wciąż możliwe w postaci nagiego kapsydu albo niekompletnej cząstki wirusowej.

Wynalazek dostarcza również antygenów i białek wirusowych, które można zebrać z hodowli komórkowych zakażonych wirusami RNA według wynalazku. Antygeny takie można zastosować w testach diagnostycznych znanych specjalistom. Takie testy można zastosować jako osobne testy do wstępnej diagnostyki albo jako testy towarzyszące do zastosowania w populacji zwierząt, która ma być szczepiona szczepionką dyskryminującą albo znacznikową opartą na zmodyfikowanych wirusach RNA według wynalazku.

Część doświadczalna

Wytwarzanie klonów cDNA, z których można przepisać in vitro zakaźny RNA staje się zasadniczym narzędziem w analizie metodą genetyki molekularnej wirusów o sensownej nici RNA. Technologia ta jest możliwa do zastosowania wobec wirusów o sensownej nici RNA, których genomy RNA mogą działać jako mRNA i zapoczątkowywać kompletny cykl zakaźny po wprowadzeniu do odpowiedniej komórki gospodarza. Opisano klony zakaźne dla wielu wirusów, co ułatwia badania nad ekspresją, replikacją, funkcją białek wirusowych i rekombinacją wirusów RNA (patrz, Boyer i Haenni, 1994). Oprócz tego, klony te można uwzględnić podczas opracowywania nowych wektorów wirusowych i szczepionek. W przypadku Arteriviridae, zakaźny klon cDNA nie został dotąd opisany. Opisuje się tu wytworzenie zakaźnego klonu PRRSV i jego pierwsze zastosowanie w wytwarzaniu chimerycznych wirusów PRRSV.

Materiały i metody

Komórki i wirusy

Szczep PRRSV (albo LV) Ter Huurne (zdeponowany w CNCM, Paryż, pod numerem dostępu I-1102) wyizolowany w 1991 roku (wensvoort i in., 1991) hodowano w hodowli pierwotnej makrofagów pęcherzykowych albo na komórkach CL2621. W badaniu tym zastosowano pasaż 6 szczepu Ter Huurne (TH) jak również pochodną tego szczepu LV4.2.1, którą zaadaptowano do hodowli na komórkach CL2621 przez kolejne pasaże. Makrofagi pęcherzykowe hodowano w pożywce hodowlanej RPMI 1640 (Flow), podczas, gdy komórki CL2621 hodowano w minimalnej niezbędnej pożywce Hanksa (Gibco/BRL/Life Technologies). Komórki BHK-21 hodowano w minimalnej niezbędnej pożywce Dulbecco. Do transfekcji, komórki BHK-21 hodowano w minimalnej niezbędnej pożywce Glasgow (Gibco/BRL/Life Technologies), metodą Liljestrom i Garoff (1993).

Izolowanie wirusowych RNA

Wewnątrzkomórkowy RNA izolowano z makrofagów pęcherzykowych albo komórek CL2621 w 24 godziny po zakażeniu PRRSV w wielokrotności zakażenia równej 1, jak to opisano wcześniej (Muelenberg iin., 1993a). W celu wyizolowania genomowego RNA wirionów, wiriony oczyszczano na gradiencie sacharozy, jak to opisano przez van Nieuwstadt i in., (1996) i zawieszono w TNE (0,01 M Tris-HCl, pH 7,2, 0,1 M NaCl, 1 mM EDTA). 1 ml buforu proteinazy K (100 mM Tris-HCl, pH 7,2, 25 mM EDTA, 300 mM NaCl, 2% (wag/obj) SDS) i 0,4 mg proteinazy K (Boehringer Mannheim) dodano do1 ml oczyszczonych wirionów PRRSV (10⁸ TCID50). Mieszaninę reakcyjną inkubowano w 37°C przez 30 minut. RNA ekstrahowano raz mieszaniną fenol/chloroform (1:1) i precypitowano etanolem. RNA przechowywano w etanolu w -20°C. 1/10 tego preparatu RNA zastosowano w reakcji odwrotnej transkrypcji (RT).

Klonowanie końców 5' i 3' genomu PRRSV

Koniec 5' genomu wirusowego PRRSV klonowano przy użyciu modyfikowanej procedury ligacji pojedynczej nici do jednoniciowego cDNA (SLIC; Edwards i in., 1991). 1/10 RNA wironów, preparowanego jak wyżej, zastosowano w reakcji RT ze starterem 11U113 (5'TACAGGTGCCTGATCC-AAGA3'), który jest komplementarny do nukleotydów 1232 do 1251 genomu. Reakcję RT przeprowadzono w objętości końcowej 20 ml, jak to opisano wcześniej (Meulenberg i in., 1993b). Następnie, do reakcji RT dodano 2 ml6 M NaOH i hydrolizowano RNA przez 30 minut w 37°C. Pojedynczą nić cDNA oczyszczono stosując wysokiej czystości zestaw PCR Product Purification Kit firmy Boehringer Mannheim. Oczyszczony cDNA strącono etanolem, zawieszono w TE i poddano ligacji ze starterem kotwiczącym ALG3 (5'CACGAATTCACTATCGATTCTGGATCCTTC3'). Starter ten zawierał miejsce EcoRI, ClaIi BamHI i koniec 3' zmodyfikowany blokującą grupą aminową w celu zapobieżenia samoligacji. Jednoniciowy produkt cDNA poddano ligacji

PL 191 258 B1 z 4 pmolami ALG3 w 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM MgCl2, 10 mg/ml BSA, 25% PEG, 1,0 mM solą kobaltową chlorku heksaminy, 40 mM ATP i 0,5 ml (10 U) ligazy RNA T4 (New England Biolabs) przez noc w temperaturze pokojowej. 1/3 reakcji ligacji zastosowano jako matrycę w PCR ze starterami LV69 (5'AGGTCGTCGACGGG-CCCCGTGATCGGGTACC3') i AALG4 (5'GAAGGATCCAGAATCGATAG3'). Starter LV69 jest komplementarny do nukleotydów 594 do 615 genomu LV, podczas gdy ALG4 jest komplementarny do startera kotwiczącego ALG3. Warunki PCR opisano w Meulenberg i in., (1993b), zaś otrzymany produkt trawiono EcoRI i SalIi klonowano w pGEM-4Z. Podobną strategię zastosowano w celu klonowania końców 5' genomu LV z wewnątrzkomórkowego RNA LV. Do tego doświadczenia zastosowano 10 mg całkowitego komórkowego RNA wyizolowanego z komórek CL2621 zakażonych LV. Klony 5' cDNA sekwencjonowano, zaś do dalszych doświadczeń zastosowano jeden z klonów pABV387, zawierający wydłużenie 10 nukleotydów w porównaniu z opublikowaną sekwencją PRRSV (Meulenberg i in., 1993a).

Klon 3' cDNA zawierający długi ogon poli(A) skonstruowano przez odwrotną transkrypcję RNA LV przy użyciu startera LV76 (5'TCTAGGAATTCTAGACGATCG(T)403'), który zawierał miejsca EcoRI, Xbal i Pvul. Po reakcji odwrotnej transkrypcji przeprowadzono PCR ze starterami LV75 (5'TCTAGGAATTCTAGACGATCG3'), który jest identyczny z LV76 z wyjątkiem ciągu poli(T) i 39U70R (5'GGAGTGGTTAACCTCGTCAA3'), starterem sensownym odpowiadającym nukleotydom 1456614585 genomu LV i zawierającym miejsce Hpal. Powstały produkt PCR trawiono Hpal i EcoRI i klonowano w klonie cDNA pABV39 trawionym tymi samymi enzymami (fig. 1). Dwa klony cDNA zawierające ciągi poli(A) po 45 A (pABV382) i 109 A (pABV392) oraz prawidłową sekwencję genomową, jak oceniono przez sekwencjonowanie oligonukleotydowe, zastosowano do konstruowania genomowego klonu cDNA pełnej długości.

Analiza sekwencji

Sekwencje oligonukleotydowe określono przy użyciu zestawu PRISM™ Ready Reaction Dye Deoxy™ Terminator Cycle Sequencing Kit i automatycznego sekwenatora Applied Biosystems.

Konstruowanie genomowych klonów cDNA pełnej długości PRRSV

Klony cDNA wytworzone wcześniej w celu sprawdzenia sekwencji genomowej LV (Meulenberg i in., 1993a) poddano ligacji ze sobą w dogodnych miejscach restrykcyjnych jak to pokazano na figurze 1. Plazmid pABV254 skonstruowano z klonów 25, 11, 12 i 100 pABV i zastosowano w poprzednim badaniu (den Boon i in., 1996). Standardowe procedury klonowania przeprowadzono w oparciu o Sambrook i in. (1989). Pozwoliło to uzyskać trzy plazmidy zawierające nakładające się sekwencje cDNA LV w plazmidzie o dużej liczbie kopii pGEM-4Z. Plazmidy pABV331 i pABV369 obejmowały nukleotydy od 5 do 6015 genomu LV. Stwierdzono różnicę nukleotydową w pozycji 3462 w stosunku 1:1 w zestawie 6 niezależnych klonów cDNA, które sekwencjonowano w tym regionie. Różnica ta powodowała zastąpienie aminokwasowe w pozycji 1084 ORF1A (Leu zamiast Pro). Ponieważ nie można było przewidzieć wpływu tego aminokwasu na zakaźność, klonowano fragment cDNA kodujący Leu w pABV331 przez wymianę w miejscu EcoRV (nukleotyd 3403) i SacII (nukleotyd 3605), co dało pABV369. Plazmid PABV384 obejmował nukleotydy 5168 do 9825 genomu LV. Ponieważ nie było dostępnego odpowiednim klonem cDNA, który nakładał się z plazmidami pABV20 i pABV5 i który mógł być poddany fuzji z sekwencjami cDNA pABV331 i pABV369, wytworzono przez RT-PCR dwa nowe fragmenty cDNA. W jednej reakcji PCR zastosowano starter sensowny LV59 (5'TCGGAATCTAGATCTCACGTGGTGCAGCTGCTG3') odpowiadał nukleotydom 5169-5186, zaś starter antysensowny 61U303 (5'CATCAACACCTGTGCAGACC3'), który był komplementarny do nukleotydów 6078 do 6097. W innej reakcji PCR zastosowano starter sensowny 61U526R (5'CATCAACACCTGTGCAGACC3') położony w nukleotydzie 5936 do 5955 i LV60 (5'GTACTGGTACCGGATCCGTGAGGATGTTGC3') komplementarny do nukleotydów 6727 do 6745. Te dwie fragmenty PCR poddano ligacji ze sobą w pABV20 przy użyciu miejsca Xbal włączonego do LV59, wewnętrznego miejsca Apol (nukleotyd 6006) i miejsca BamHI na nukleotydzie 6740, które również włączono do LV60. Nowy fragment cDNA całkowicie sekwencjonowano i nie zawierał on żadnych mutacji, które powodowałyby zmianę aminokwasu w stosunku do opublikowanej sekwencji (Muellenberg i in., 1993a). Plazmid pABV368 obejmował nukleotydy 8274 do 13720 genomu PRRSV. Ponieważ dalsza ligacja fragmentów cDNA w pGEM-4Z dawała niestabilne klony, wstawki pABV331/369, PABV384 i pABV368 poddano ligacji z fragmentami cDNA 5' i 3' pOK12 (Viera i Messing, 1991). Wektor plazmidowy pOK12 jest, jak się oczekuje, bardziej przydatny do klonowania znacznych sekwencji obcego cDNA, ponieważ ma mniejszą liczbę kopii niż pGEM-4Z. Plazmidy transformowano do szczepu DH5a Escherichia coli, hodowano w 32°C w obecności 15 mg/ml kanamycyny, aby utrzymać możliwie niską liczbę kopii. Najpierw, fragmenty cDNA pABV382 ((A)45) i pABV392 ((A)109) wycięto przez trawienie EcoRI

PL 191 258 B1 i modyfikowano miejsce cięcia polimeraza Klenowa (Pharmacia) doprowadzając do tępego zakończenia, a następnie trawiono BamHI. Fragmenty te klonowano do pOK12 trawionego BamHI i Fspl, przy czym to ostatnie miejsce modyfikowano do tępego zakończenia otrzymując pABV394 i pABV395. W ten sposób usunięto promotor polimerazy RNA T7 obecny w pOK12. Następnie, fragmenty cDNA pABV368 i pABV384 poddano ligacji z klonami cDNA końca 3' stosując miejsce Bell (nukleotyd 13394), miejsce Scal (nukleotyd 8657) oraz miejsca BamHI i Bglll w sekwencjach flankujących albo sekwencjach wektora. Dało to plazmid pABV401 i pABV402 (fig. 1).

Klon cDNA 5', zawierający promotor polimerazy RNA T7 poddany fuzji bezpośrednio z końcem 5' genomu LV poddano amplifikacji przez PGR z pABV387 przy użyciu starterów LV83 (5'GAATCACTAGTTAATACGACTCACTATAGATGATGTGTAGGGTATTCC3') i LV69. LV83 jest zbudowany z, w kierunku od 5' do 3', miejsca EcoRI i Spel, sekwencji promotora polimerazy RNA T7, pojedynczego G dla zapoczątkowania transkrypcji i nukleotydów 1 do 19 genomu LV. Fragment PGR klonowano w miejsce EcoRI i SalI pOK12, otrzymując pABV396. Prawidłową sekwencję pABV396 oceniono przez sekwencjonowanie oligonukleotydem. Następnie, fragmenty cDNA LV z pABV331 i pABV369 wycięto Apal i BamHI, po czym poddano ligacji z pABV396, trawionym Apal i BamHI. Na koniec, powstałe fragmenty cDNA 5' klonowano do pABV401 i pABV402, stosując miejsce Spel powyżej promotora polimerazy RNA T7 i unikalnego miejsca Pm1I w pozycji 5168 genomu wirusowego. W ten sposób otrzymano klony genomowego cDNA pełnej długości jako odpowiadające wirusom przypominającym szczep rodzicielski oraz chimeryczne wirusy obejmujące obce otwarte ramki odczytu.

Wytwarzanie zmutowanych wirusów zawierających miejsce PacI i/lub Swal

W celu wprowadzenia unikalnego miejsca PacI do klonu cDNA genomowej długości bezpośrednio poniżej genu ORF7, nukleotydy T i A w pozycji 14987 i 14988 zastąpiono na A metodą PCR z użyciem startera sensownego LV108 (5'GGAGTGGTTAACCTCGTCAAGTATGGCCGGTAAAAACCAGAGCC3') i startera antysensownego LV112 (5'CCATTCACCTGACTGTTTAATTAACTTGCACCCTGA3') oraz startera sensownego LVIII (5'TCAGGGTGCAAGTTAATTAAACAGTCAGGTGAATGG3') i startera LV75. Podobnie, unikalne miejsce Swal wytworzono przez zmianę G w pozycji 14980 na T, oraz T w pozycji 14985 na A przez PCR ze starterami LV108 i LV110 (5'CCTGACTGTC-AATTTAAATTGCACCCTGAC3' i starterów LV109 (3'GTCAGGGTGCAATTTAAATTGACAGTC-AGG3') i LV111. Fragmenty PCR poddano ligacji w pABV395 stosując wytworzone miejsce PacI i Swal oraz flankujące miejsca Hpal i Xbal, otrzymując, odpowiednio, pABV427 i pABV426. Fragment ten wprowadzono do pABV414 stosując te same unikalne miejsca Hpal i Xbal, otrzymując pABV437 i pABV442 (patrz, fig. 4). W celu wykrywania mutacji znacznikowej w wirusie odzyskanym z transkryptów pABV437 i pABV422, RNA wyizolowano z nadsączu zakażonych świńskich makrofagów pęcherzykowych. RNA zastosowano w reakcji odwrotnej transkrypcji-PCR w celu amplifikacji fragmentu wielkości około 0,6 kb (obejmującego nukleotydy 14576-ogon poli(A) różnej długości) starterami LV76, LV75 i 39U70R. 0becność znacznika genetycznego wykrywano przez trawienie fragmentów PCR PacI i Swal.

Transkrypcja in vitro i transfekcja RNA

Plazmidy pABV414, pABV416 zawierające fragment cDNA pełnej długości genomowej LV linearyzowano trawiąc Pvul, w miejscu które jest położone bezpośrednio poniżej ciągu poli(A). Plazmid pABV296, który obejmował ORF4 w wektorze wirusa puszczy Semliki (SFV) pSFV1 (Meulenberg i in., 1987) linearyzowano przy użyciu Spel i służył on jako kontrola doświadczeń transkrypcji in vitro i transfekcji. Linearyzowane plazmidy precypitowano etanolem i 1,5 mg tych plazmidów zastosowano do transkrypcji in vitro przy użyciu polimerazy RNA T7 (plazmidy pABV414, pABV416) albo polimerazy RNA Sp6 (pABV296) według metody opisanej dla SFV przez Liljestroma i Garoffa (1991 i 1993). Przepisany in vitro RNA strącano izopropanolem, płukano 70% etanolem i przechowywano w -20°C do zastosowania. Komórki BHK-21 wysiano w studzienkach M6 (około 10⁶ komórek/studzienkę) i transfekowano 2,5 m g RNA zmieszanego z 10 m l lipofectin w optimem, jak to opisali Liljestrom i Garoff (1993). Alternatywnie, RNA wprowadzono do komórek BHK-21 przez elektroporację. W tym przypadku, 10 mg RNA przepisanego in vitro albo 10 mg wewnątrzkomórkowego RNA LV poddano transfekcji do około 10⁷ komórek BHK-21 stosując warunki elektroporacji opisane przez Liljestroma i Garoffa (16). Pożywkę zebrano w 24 godziny po transfekcji i przeniesiono do komórek CL2621 w celu ratowania zakaźnego wirusa. Transfekowane i zakażone komórki badano w kierunku ekspresji białek swoistych dla LV przez jednowarstwowy test immuno-peroksydazowy (IPMA), zasadniczo jak to opisano w Wensvoort i in., (1986). Przeciwciała monoklonalne (mAbs) 122.13, 122.59, 122.9 i 122.17, skierowane przeciwko białku GP3, GP4, M i N (van Nieuwstadt i in., 1996) zastosowano do znakowania w IPMA.

PL 191 258 B1

Wyniki

Rekonstrukcja sekwencji końca 5' genomowego RNA LV

Jakkolwiek opisano zakaźność RNA przepisywanego in vitro z okrojonymi końcami 5' (Davis i in., 1989, Klump i in., 1990) ogólnie uznaje się, że do otrzymania klonów zakaźnych konieczna jest kompletna sekwencja wirusowa, obejmująca końce 5' i 3'. W celu klonowania końca 5' genomu LV, zastosowano zmodyfikowaną procedurę ligacji pojedynczej nici z jednoniciowym DNA (SLIC; Edwards i in., 1991). Wewnątrzkomórkowy RNA wyizolowany z komórek CL2621 zakażonych LV, jak i RNA LV z oczyszczonych wirionów poddano odwrotnej transkrypcji stosując starter LV69, który był komplementarny końca 5' ORF1A. Produkt stanowiący pierwszą nić cDNA poddano ligacji ze starterem kotwiczącym ALG3, którego koniec 3' zablokowano przez samoligacją. Produkt poddano amplifikacji PGR i klonowano. Sekwencjonowano 12 klonów pochodzących z wewnątrzkomórkowego RNA LV i powstałych w wyniku dwóch niezależnych reakcji PGR i 14 klonów pochodzących z RNA wirionów i powstałych w dwóch niezależnych reakcjach PGR. Spośród tych 26 klonów cDNA, 22 klony zawierały wydłużenie o 10 nukleotydów (5'ATGATGTGTA3') w porównaniu z sekwencją cDNA opublikowaną uprzednio (Meulenberg i in., 1993a), podczas gdy 4 klony pozbawione były trzech nukleotydów na końcu 5' tej dodatkowej sekwencji (tabela 1). Doprowadziło to do konkluzji, że te 10 nukleotydów stanowi koniec 5' genomu, a wiec włączono je do klonu cD-NA genomowej długości.

Konstruowanie klonów cDNA LV genomowej długości

W celu skonstruowania klonu cDNA LV genomowej długości uprzednio wyizolowane i sekwencjonowane cDNA (Meulenberg i in., 1993a) połączono przez wspólne miejsca restrykcyjne, w oparciu o strategię opisaną na figurze 1. Oprócz tego, wytworzono nowe fragmenty cDNA w celu połączenia klonów cDNA genomowej długości. Jeden fragment cDNA obejmujący nukleotydy 5168 do 6740 wytworzono przez RT-PCR w celu umożliwienia ligacji sekwencji z klonów pABV5 i pABV20. Promotor polimerazy RNA T7 do transkrypcji in vitro połączono bezpośrednio z końcem 5' genomu LV przez PGR, i ten nowy fragment cDNA klonowany do pABV396 wprowadzono do klonu cDNA genomowej długości. Ponowne sekwencjonowanie nukleotydów 3420 do 3725 na sześciu nowych i niezależnych klonach cDNA wykazało, że aminokwas 1084 w ORF1a Leu i Pro są obecne w stosunku 1:1. Ponieważ nie można było przewidzieć wpływu tego aminokwasu na zakaźność przepisanego RNA z końcowego klonu cDNA genomowej długości zastosowano oba do konstruowania tego klonu. Na końcu 3' zastosowano dwa różne klony cDNA. Uprzednio wyizolowano koniec 3' klonów cDNA zawierających ogony poli(A) o maksymalnej długości 20 A (Meulenberg i in., 1993a). Jednakże, w świetle opisanych badań dotyczących długości ogonów poli(A) w spokrewnionych wirusach takich jak LDV (Chen i in., 1994) cały ogon poli(A) powinien być znacznie dłuższy. Stąd, wytworzono nowe klony cDNA końca 3' stosując starter LV76, który zawierał ciąg 40 reszt T. Te klony cDNA sekwencjonowano i zawierały one ciągi reszt od 40 do 109 A. Klon cDNA zawierający najdłuższy ciąg poli(A) (109 reszt A, pABV392) zastosowano do klonu cDNA genomowej długości. Ponieważ długie ciągi homo-polimeryczne mogą zakłócać replikację plazmidów w E. coli (Deng i Wu, 1981), wyselekcjonowano również drugi klon pABV382 zawierający 45 reszt A do zastosowania w kolejnych etapach klonowania. Uprzednio obserwowano, że utrzymywanie klonów cDNA genomowej długości w plazmidach o dużej liczbie kopii prowadzi do gromadzenia się mutacji albo delecji, które powodują utratę zakaźności transkryptów syntetyzowanych z takich klonów (Lai i in., 1991; Rice i in., 1987; Sumiyoshi i in., 1992). Obserwowano również niestabilność plazmidów, gdy próbowano poddać ligacji większy fragment cDNA klonów pABV 331/369, 384 i 386 z końcem 3' albo 5' w pGEM-4Z, a stad poddano fuzji wszystkie klony ze sobą w wektorze o niskiej liczby kopii pOK12 (Viera i Messing, 1991). Dało to klony cDNA genomowej długości pABV414/415 i 416, które można stabilnie namnażać w E. coli w stosowanych warunkach hodowli. Nie obserwowano żadnej różnicy w stabilności klonów cDNA zawierających 45 albo 109 reszt A.

Zakaźność RNA LV

LV wybiórczo rośnie na makrofagach pęcherzykowych świni. Jak dotąd, linia komórkowa CL2621 albo inne klony pochodzące z linii komórkowej nerki małpiej MA104 są liniami komórkowymi, na których namnaża się LV (Benfield i in., 1992; Collins i in., 1992; Kim i in., 1993). Stąd, komórki CL2621 zastosowano do określenia optymalnych warunków do transfekcji RNA LV. RNA wyizolowany z komórek CL2621 zakażonych LV transfekowano do komórek CL2621 w różnych dawkach przy użyciu różnych metod takich jak lipofectin, lipofectamine, dekstran DEAE i elektroporacja. Komórki badano przesiewowo w kierunku efektu cytopatycznego i łysinek przez 7 dni po transfekcji, ale objawy zakaźnego wirusa nie występowały. Oprócz tego, nie można było wykryć antygenów swoistych dla LV w IPMA, stosując przeciwciała swoiste wobec LV. RNA przepisany in vitro z pABV296 zastosowano

PL 191 258 B1 jako kontrolę do tego doświadczenia. Plazmid pABV296 obejmował gen ORF4 kodujący GP4 wprowadzoną w wektorze ekspresyjnym pSFV1 (Meulenberg i in., 1997). Skuteczność transfekowania RNA pABV296 badano przez znakowanie transfekowanych komórek w IPMA przeciwciałami swoistymi wobec GP4. Najwyższą skuteczność transfekcji, powodującą około 0,01% komórek pozytywnych uzyskano przez elektroporację, natomiast 80-90% komórek pozytywnych uzyskano w komórkach BHK-21. Wyniki te wskazują, że komórki CL2621 nie będą przydatne do doświadczeń nad transfekcją podczas, gdy komórki BHK-21 (nie podatne na zakażenie wirusem typu dzikiego) nieoczekiwanie okazały się bardzo przydatne. Stąd, komórki BHK-21 zastosowano do badania RNA LV. 2 mg RNA wyizolowanego z komórek CL2126 zakażonych LV transfekowano do około 10^b komórek przy użyciu lipofectin w oparciu o warunki opisane dla SFV (Liljestrom i Garoff, 1993). 24 godziny po transfekcji komórki znakowano mAb swoistym wobec LV 122.17, skierowanym przeciwko białku N LV. Około 3-10 pojedynczych klonów barwiło się pozytywnie, ale brak było zakaźnych ośrodków albo łysinek wskazujących na rozsiew między komórkami. Transfekcją kontrolnego RNA przepisanego z pABV296 dała 60-70% pozytywnych komórek BHK-21 przy wykorzystaniu tych warunków. Nadsącz z komórek BHK-21 transfekowanych wewnątrzkomórkowym RNA LV i RNA pABV296 przeniesiono na komórki CL2621. Po 3-4 dniach, obserwowano łysinki w komórkach, które były inkubowane z nadsączem komórek BHK-21 transfekowanych wewnątrzkomórkowym RNA LV, ale nie z nadsączem z komórek BHK-21 transfekowanych RNA pABV296. Łysinki znakowały się pozytywnie przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko LV w teście IPMA. Podobne wyniki otrzymano, gdy stosowano RNA wyizolowany z oczyszczonych wirionów LV. Ponadto, liczba komórek barwiących się pozytywnie zwiększała się 2-4-krotnie, gdy komórki transfekowano przez elektroporację. Dane te wskazują, że LV nie może zakażać komórek BHK-21, prawdopodobnie, dlatego że nie posiadają one receptora dla LV. Jednakże, po wprowadzeniu genomowego RNA do komórek BHK-21 wytwarzane są nowe zakaźne cząstki wirusa i wydzielane do pożywki. Ponowne zakażenie już transfekowanych komórek BHK-21 tymi cząstkami, czy są to nagie kapsydy albo w pełni albo w części opłaszczone cząsteczki ponownie nie jest możliwe.

Synteza in vitro zakaźnego RNA

Ponieważ komórki BHK-21 są w zasadzie niewrażliwe na PRRSV typu dzikiego, są one szczególnie odpowiednie do ratowania wirusa z wewnątrzkomórkowego RNA LV, w przeciwieństwie do podatnych komórek CL2621, Komórki BHK-1 zastosowano do zbadania, czy RNA przepisany z klonów cDNA długości genomowej był zakaźny. Plazmidy pABV414/416 linearyzowano Pvul i poddano transkrypcji in vitro stosując polimerazę RNA T7. Miejsce Pvul jest położone bezpośrednio poniżej ciągu poli(A) tak, że przepisywany RNA zawiera 2 nie wirusowe nukleotydy na końcu 3' (fig. 2). Oprócz tego, transkrypty powinny zawierać nie wirusową G na końcu 5', która jest miejscem rozpoczęcia transkrypcji przez polimerazę RNA 11. Około 2,5 mg RNA przepisanego in vitro transfekowano do komórek BHK-21 wraz z 2 mg wewnątrzkomórkowego RNA LV jako kontrola pozytywna do ratowania wirusa z komórek CL2621 i RNA pABV296 jako kontrola pozytywna transfekcji RNA do komórek BHK-21 i negatywna kontrola do późniejszego ratowania komórek CL2621. W 24 godziny później nadsącz z transfekowanych komórek zebrano, zaś komórki utrwalono i barwiono w IPMA przeciwciałem swoistym wobec N 122.17. Podczas gdy obserwowano tylko kilka komórek pozytywnych w studzienkach z komórkami BHK-21, które transfekowano wewnątrzkomórkowym RNA LV, w studzienkach z komórkami BHK-21 transfekowanymi RNA przepisanym z pABV414/416 obserwowano od 800 do 2700 komórek pozytywnych. W celu sprawdzenia, czy zakaźny wirus był uwalniany z komórek, nadsącze zastosowano do zakażania komórek CL2621. W hodowlach komórek CL2621, które zakażono nadsączem z komórek BHK-21 transfekowanych wewnątrzkomórkowym RNA LV i transkryptami pABV414/415. Łysinki znakowały się pozytywnie w IPMA przy użyciu przeciwciał swoistych wobec białka M, N, GP4 i GP3, co wskazuje, że białka te ulegały prawidłowej ekspresji. Nie obserwowano łysinek ani znakowania w IPMA w hodowlach inkubowanych z nadsączem komórek BHK-21 transfekowanych RNA przepisanym z PABV296. Stąd, wyniki te jasno pokazują, że transfekowanie RNA przepisanego z klonów cDNA genomowej długości pABV414 i pABV416 do komórek BHK-21 powoduje wyniki w produkcji i uwalnianiu zakaźnego LV. Ponadto, gdy transkrypty pABV414 i pABV416 transfekowano do komórek BHK-21 przez elektroporację zamiast lipofectin, obserwowano dwu- do czterokrotnego wzrost liczby komórek barwiących się pozytywnie przeciwciałami swoistymi wobec LV. Miano rekombinowanego wirusa w nadsączu tych elektroporowanych komórek BHK-21 wynosiło około 10⁵ TCID50/ml.

PL 191 258 B1

Krzywe wzrostu zakaźnych kopii wirusa w porównaniu z Ter Huurne i LV4.2.1:

Charakterystyka wzrostu ratowanego wirusa

Początkowe doświadczenia transfekcji i zakażania wskazywały, że ratowane wirusy rekombinowane oznaczone vABV414 i vABV416 zakażają i rosną równie dobrze na świńskich makrofagach pęcherzykowych, ale rosną wolniej na komórkach CL2621 niż wirus uratowany z komórek BHK-21 transfekowanych wewnątrzkomórkowym RNA LV. Ten wewnątrzkomórkowy RNA LV wyizolowano z komórek CL2621 zakażonych LV4.2.l., który zaadaptowano do wzrostu na komórkach CL2621. W celu bardziej dokładnego zbadania zdolności wzrostu vABv414 i vABV416 określone krzywe wzrostu komórek CL2621 i świńskich makrofagów pęcherzykowych i porównano je z LV typu dzikiego, który pasażowano tylko na makrofagach pęcherzykowych (TH) i LV4.2.l hodowanym na komórkach CL2621. Tempa wzrostu dwóch rekombinowanych wirusów nie różniły się, rosnąc równie dobrze niezależnie czy pobrano je bezpośrednio z BHK-21 czy dalej pasażowano na świńskich makrofagach pęcherzykowych (fig. 3). Miana (7,1-7,9 TCID50/ml) w makrofagach pęcherzykowych osiągały szczyt około 32 godzin po zakażeniu, podczas gdy miana w komórkach CL2621 były wolniejsze i nie osiągnęły szczytu nawet po 96 godzinach. Wirus miał podobną charakterystykę wzrostu co rekombinanty. W przeciwieństwie, zaadaptowany do CL2621 wirus LY4.2.1 rósł szybciej na komórkach CL2621 niż wirusy vABV141 i vBAV416 i TH (fig. 3). Podsumowując, wyniki pokazują, że właściwości wzrostu rekombinowanych wirusów są podobne do wirusa TH. Oczekiwano tego, ponieważ sekwencja cDNA zastosowana do konstruowania klonów zakaźnych pochodziła od rodzicielskiego „nie zaadaptowanego” wirusa TH.

Wprowadzenie znacznika genetycznego do zakaźnego klonu LV

W celu wykazania, że klon cDNA genomowej długości można zastosować do wytwarzania zmutowanych wirusów LV, wprowadzono unikalne miejsca PacI i Swal bezpośrednio poniżej genu ORF7 ukierunkowaną mutagenezą przez PGR (fig. 4). Gdy RNA przepisany z klonu cDNA genomowej długości pABV437 zawierający miejsce PacI i pABV442 zawierający miejsce Swal transfekowano do komórek BHK-21, zaś nadsącz przeniesiono do makrofagów pęcherzykowych i komórek CL2621 w 24 godziny po transfekcji, wytwarzając zakaźnego wirusa. Uratowane wirusy vABV437 i vABV442 miały podobną charakterystykę wzrostu w świńskich makrofagach pęcherzykowych i komórkach CL2621co rodzicielski wirus vABV414 (dane nie pokazane). Swoisty region, wielkości około 0,6 kb (nukleotydy 14576-ogon (poliA) amplifikowano przez odwrotną transkrypcję i PCR wirusowego RNA wyizolowanego z nadsączu świńskich makrofagów pęcherzykowych zakażonych vABV414 i vABV416. Trawienie PacI wykazało, że miejsce restrykcyjne rzeczywiście występowało we fragmencie pochodzącym od vABV437, ale był nieobecny we fragmencie pochodzącym z vABV414. Podobnie, wykazano obecność miejsca Swal w vABV442 (dane nie pokazane) Tak więc, można było wykluczyć możliwość zanieczyszczenia wirusem typu dzikiego i w ten sposób potwierdzić tożsamość vABV437 i vBAV442.

Dyskusja

Nowoczesna technologia rekombinowanego DNA umożliwia analizowanie i modyfikowanie genomu na poziomie cząsteczkowym i w ten sposób sięganie głębiej w jego organizację i ekspresję. W przypadku wirusów RNA wymaga to wytworzenia klonów cDNA genomowej długości, z których możliwe jest wytworzenie zakaźnych transkryptów. W większości przypadków, wstępnym wymogiem dla konstruowania klonów zakaźnych jest identyfikacja sekwencji na końcach odpowiedniego genomu wirusowego, które są prawdopodobnie kluczowe dla replikacji wirusowego RNA. W poprzednim badaniu wykazano, że LV zawiera ogon poli(A) na końcu 3' (Meulenberg i in., 1993a). W niniejszej pracy określono dokładnie koniec 5' genomu LV. O ile opisano kilka sposobów określenia końca 5' genomowego wirusowego RNA albo mRNA, większość z nich ma istotne ograniczenia. Dla flaviwirusów i pestiwirusów zastosowano sposób, który jest oparty na cyrkularyzacji genomowego RNA. Jednakże, metoda ta wymaga towarzyszących analiz w celu określenia granicy pomiędzy końcem 5' i 3' genomu. Metoda szybkiej amplifikacji końca 5' cDNA (5'RACE) oparta jest na dodaniu homopolimerowego ogona przez końcową transferazę dezoksyrybonukleotydową (TdT) do pierwszej nici cDNA. Jednakże dodawanie ogona jest raczej niewystarczające i metoda ta wymaga również dodatkowych analiz, ponieważ nie można wywnioskować, czy pierwszy nukleotyd ogona odpowiada sekwencji wirusowej, czy też jest już częścią enzymatycznie dodanego ogona. W badaniu tym określono skrajny koniec 5' genomu wirusowego przez poddanie ligacji oligonukleotydu o swoistej sekwencji z pierwszą nicią pierwotnie wydłużonego produktu i amplifikację metodą PCR. Wydłużenie 10 nukleotydowe (ATGATGTGTA) w odniesieniu do opublikowanej sekwencji znaleziono w wielu niezależnych klonach i przez to sądzi się, że odpowiada nukleotydom skrajnego końca 5' genomu wirusowego. Wspólnym rezultatem jest sekwencja liderowa 221 nukleotydów, której długość jest podobna do sekwencji liderowej EAV

PL 191 258 B1 (207 nukleotydów; den Boot i in., 1991), SHFV (208 nukleotydów; Zeng i in., 1995), lecz dłuższa niż LDV (155 nukleotydów; Chen i in., 1995). Jednakże nie występuje żadna istotna homologia pomiędzy sekwencjami liderowymi tych arteriwirusów.

Skrajny koniec 5' włączono do cDNA o długości równej długości genomu w celu stworzenia klonu zakaźnego. Podstawowe problemy związane z tworzeniem tych klonów zakaźnych koncentrują się na stabilności sekwencji wirusowych, podczas klonowania w bakterii jak również tworzenia prawidłowych końców 5' i 3'. Mimo, że początkowe próby magazynowania cDNA o długości genomu w pGEM4Z skończyły się niepowodzeniem, fragment genomowego cDNA LV o długości 15207 pozostał stabilny w niewielkiej liczbie kopii plazmidu pOK12 i jak dotąd jest najdłuższym wytworzonym klonem infekcyjnym sensownej nici RNA wirusa. Transkrypty klonów cDNA o długości genomu zawierały strukturę czapeczki 5' i dodane nie-wirusowe G na końcu 5' i nie-wirusowe CG na końcu 3', lecz te wydłużenia nie zniszczyły ich zakaźności. Wielu badaczy donosiło o zmniejszonej początkowej zakaźności RNA, który był transkryptem klonów cDNA pełnej długości cDNA co zależało od obcych, nieprawdziwych sekwencji na obu końcach 5' i 3' albo od niekompletnego czapeczkowania. Transkrypty cDNA LV pełnej długości nie posiadające struktury czapeczki nie były zakaźne. Podczas gdy zakaźność transkryptów zakaźnych klonów cDNA zawsze badano na liniach komórkowych wrażliwych na dany wirus, nie można wykazać zakaźności transkryptów klonów cDNA o pełnej długości albo RNA LV izolowanych z komórek CL2621 przez transfekcję tych RNA do komórek CL2621. Zależne to jest od niewielkiej sprawności transfekcyjnej w komórkach CL2621, gdzie synteza nici wirusowego RNA jest prawdopodobnie zaburzana prze interferencje albo oddziaływania z niepełnymi fragmentami RNA, albo białkami kapsydu powstającymi z powtórnych zakażeń komórek CL2621 defektywnie interferującymi cząsteczkami takimi jak, nagie kapsydy zawierające jedynie fragmenty genomu wirusowego. Ponieważ transfekcja do BHK-21 transkryptów klonów cDNA pełnej długości i RNA wewnątrzkomórkowego LV powoduje wytwarzanie i uwalnianie zakaźnego wirusa, może być to ratunkiem dla komórek CL2621. Nie występuje ponowne zakażenie komórek BHK-21 nagimi kapsydami i przez to nie zaburza to syntezy wirusowego RNA pełnej długości. Swoista zakaźność wynosiła z grubszą 400-1500 dodatnich komórek na mg RNA transkrybowanego in vitro, podczas gdy uzyskano 2 do 5 dodatnich komórek na mg RNA wewnątrzkomórkowego LV. Jednakże, te swoiste zakaźności nie mogą być porównywane jedynie ze względu na bardzo niską frakcje wewnątrzkomórkowego RNA izolowanego z komórek zakażonych LV reprezentującego genomowe RNA LV. Następnie ilość genomowego RNA izolowanego z wirionów, które wykorzystano do transfekcji jest zbyt mała by pozwolić na dokładne policzenie.

Dodatkowo, komórki BHK-21 oceniano w kierunku produkcji antygenu w IPMA z MAb swoistymi w stosunku do LV, który nie koniecznie koreluje z wytwarzaniem zakaźnego wirusa. Było to oczywiste ze względu na to, że supernatant komórek BHK-21 transfekowanych 2 mgRNA wewnątrzkomórkowego LV zawierał większe miano jednostek łysinkowych, badanych na komórkach CL2621, następnie supernatant komórek BHK-21 transfekowano 2,5 mg transkryptu klonów cDNA pełnej długości. Mimo że, zostało wykazane wcześniej dla pewnej liczby wirusów, że długość ogona poli(A) wpływa na zakaźność transkryptów wirusowych (Holy i Adouhaidar, 1993; Sarow, 1989), tutaj nie obserwowano żadnej różnicy w zakaźności pomiędzy transkryptami klonów genomowego cDNA zawierającymi ogon 45 reszt albo 109 reszt. Jest możliwe, że ogon 45 reszt A jest powyżej progu długości poniżej, którego stabilność odpowiednich transkryptów zostanie zmieniona. Znaleziono klon różniący się aminokwasem 1084 w ORF1a, dający Pro i Leu w stosunku 1:1. Ten aminokwas nie wpływa na zakaźność, ponieważ transkrypty klonów cDNA pełnej długości zawierające ten kodon Leu albo Pro nie wykazują żadnej różnicy w zakaźności komórek BHK-21.

Klony zakaźne o długości genomu wykorzystano do wytworzenia wirusa chimerycznego wyrażającego białko nukleokapsydu PRRSV szczepu ATCC VR2332. Dodatkowo klony zakaźne o długości genomu wykorzystano do wytworzenia wirusa chimerycznego wyrażającego białko nukleokapsydu mysiego wirusa LDV. Wirusy chimeryczne można odróżnić od wirusów rodzicielskich MAb swoistym w stosunku do szczepu, nie przyłączają przeciwciał monoklonalnych swoiście reagujących z białkiem N (ORF7) szczepu Ter Huurne PRRSV. Następnie, wirus chimeryczny, w którym białko N PRRSV jest podstawione białkiem N LDV nie jest reaktywny z przeciwciałami rekonwalescentnymi świni reagującymi z białkiem N PRRSV. Ponieważ wszystkie świnie zakażone PRRSV wytwarzają przeciwciała skierowane przeciwko białku N PRRSV, wirusy chimeryczne będą wykorzystane w przyszłych projektach nowych, żywych szczepionek przeciwko PRRSV i wykorzystujących ten wirus jako układ wektorowy, który jest swoiście kierowany do swoich komórek docelowych, makrofagów pęcherzyków płucnych. W odniesieniu do tego należy wspomnieć, że początkowe próby zapewnienia ochrony

PL 191 258 B1 z wykorzystaniem zabitych wirusów albo rekombinowanych podjednostek były niezadowalające. Jak dotąd jedyna skuteczna szczepionka przeciwko PRRS jest modyfikowana, żywa szczepionka oparta o szczep US (Gorcyca i in., 1995). Jednakże świń szczepionych tym modyfikowanym, żywym produktem można nie odróżnić od świń zakażonych wirusem dzikim. Tak więc, klon zakaźny PRRSV dostarcza tak zwanego znacznika szczepionki dzięki kierowanej mutagenezie genomu, tak że szczepione świnie można odróżnić od świń zakażonych wirusem dzikim na podstawie różnicy w przeciwciałach surowicy.

Klon zakaźny LV, opisany tutaj jest najdłuższym klonem zakaźnym uzyskanym z sensownej nici wirusowego RNA i pierwszym z rodziny arteriwirusów. Wytworzenie tego zakaźnego klonu PRRSV otworzyło nowe możliwości badań nakierowanych na patogenezę, tropizm docelowy i replikację i transkrypcje tego wirusa. Arteriwirusy i koronawirusy posiadają swoisty mechanizm transkrypcyjny, zwany również jako transkrypcja rozpoczynana liderem, która obejmuje wytwarzanie tak zwanego zestawu zagnieżdżonego subgenomowych RNA zawierających zwykły lideer 5' (Spaan i in., 1988; Plegemann i Moennig, 1991). Transkrypcja rozpoczynana liderem, jest złożonym procesem, który nie jest do końca poznany. Badania wirusologiczne nad koronawirusami wyjaśniające mechanizmy leżące u podstawy transkrypcji rozpoczynanej liderem są ograniczone do analiz i kierowanej mutagenezy cDNA defektywnych interferujących RNA, ponieważ wielkość genomu (28-30 kb) uniemożliwia konstruowanie klonów zakaźnych. Klon zakaźny PRRSV jest przydatny jako układ modelowy do badania i odkrywania intrygującego mechanizmu transkrypcji i replikacji arteriwirusów i coronawirusów.

Klony zakaźne pochodzące z PRRSV można również zastosować jako układ dostarczania albo szczepionkę opartą na wektorze wirusowym dla obcych antygenów wprowadzonych do genomu PRRSV ponieważ wirus zakaża makrofagi i linie komórek makrofagalnych w szpiku oraz inne komórki układu odpornościowego i rozprowadza wirusa zawierającego antygen wśród komórek potomnych. W konkretnych przypadkach antygenów zawierających fragmenty ORF7 albo białka N Arteriwirusów albo PRRSV, antygeny te będą (nadmiernie) wyrażane na zewnętrznej powierzchni błony komórkowej zakażonych komórek, dalej zwiększając w ten sposób reakcję odpornościową. Taki efekt przypominania odporności powoduje długotrwałą (z powodu ciągłego pobudzania na słabym poziomie) odporność na patogeny. Można zastosować wirusa jako nośnik antygenu przez wbudowanie informacji dla epitopów innych organizmów patogennych albo substancji. Kilka modyfikowanych wirusów PRRS niosących informację o obcych epitopach można zmieszać i podawać równocześnie. Umożliwia to czynną odporność wobec kilku różnych epitopów jednego patogenu albo czynną odporność wobec kilku patogenów. Bezpieczeństwo modyfikowanych szczepionek PRRSV (takich jak nie uwalniające się) można zapewnić przez usuniecie informacji tych białek wirusowych, które są konieczne do wytworzenia opłaszczonego, zakaźnego wirusa. Wirus taki namnaża się na linii komórkowej, która konstytutywnie wyraża białko. Wirus replikując w takiej dopełniającej linii komórkowej posiada kompletną otoczkę i jest zdolny do zakażania makrofagów świń. Po jednym cyklu replikacji potomstwo wirusa pozbawione informacji dotyczącej białek otoczki nie jest zdolne do zakażania innych komórek jak wirus z otoczką. Zakażenie makrofagów w organizmie jest wciąż możliwe w postaci nagiego kapsydu. W ten sposób szczepionka będzie zatrzymywana w organizmie jednego zwierzęcia, które zostało zaszczepione i nie rozsiewa się na inne zwierzęta.

Legenda do figur.

Figura 1. Konstruowanie klonu cDNA genomowej długości LV. Część górna (A) pokazuje fuzję klonów cDNA, które uprzednio sekwencjonowano (Muelenberg i in., 1993a) w pGEM-4Z. Numery pABV klonów i miejsca restrykcyjne zastosowano w oznaczony sposób. Czarne ramki oznaczają te części klonów cDNA, które poddano fuzji w następnym etapie klonowania. Jasno szare ramki, zaznaczone R.T., oznaczają klony cDNA wytworzone na nowo przez RT-PCR, ciemnoszare ramki oznaczają nowy klon cDNA wytworzony przez PCR. Część dolna (B) pokazuje połączenie większych klonów cDNA pABV331/369, pABV384 i pABV368 z końcem 5' klonu pABV396, zawierającym promotor polimerazy T7 i końcem 3' klonu pABV395, zawierającym ogon poli(A) w wektorze o niskiej liczbie kopii pOK12, Miejsca restrykcyjne wewnątrz i na zewnątrz wielokrotnych miejsc klonowania pOK12 są zaznaczone. Miejscami endonukleaz restrykcyjnych są: A, Apal; Ap, Apol; B, BamHI; Bg, Bg1ll; Bs, BspE1; Bc, Bc1I; E, EcoRI; Ec, EcoRV; H, Hindlll; K, KpnI; N, NarI; Nc, Ncol; S, SacII; Sp, Spel; Sa, SalI; Sc, Scal; P, Pstl; Pm, PmlI; X, Xbal; Xh, Xhol.

Figura 2. Sekwencje końcowe klonowanego cDNA pełnej długości LV i zakaźny RNA przepisywany z tego klonu cDNA. Klony cDNA genomowej długości linearyzowano Pvul i poddawano transkrypcji w obecności syntetycznego analogu „czapeczki” m⁷D(5')ppp(5')G przy użyciu polimerazy RNA T7. Powstały RNA powinien zawierać jeden dodatkowy nukleotyd (G) na końcu 5' i dwa dodatkowe

PL 191 258 B1 nukleotydy (GC) na końcu 3'. Strzałki w RNA odpowiadają nukleotydom końcowym 5' 13' odpowiadającym oryginalnej sekwencji RNA LV.

Figura 3. Krzywe wzrostu wirusa LV typu dzikiego TH, LV4.2.1 i rekombinowanych wirusów vABV414 i vABV416 w makrofagach pęcherzyków płucnych świń (A) i komórkach CL2621 (B). Rekombinowane wirusy vABV414 i vBAV416 wytworzone w komórkach BHK-21 zastosowano bezpośrednio (BHK) albo po namnożeniu w makrofagach pęcherzykowych świń (PAM). Wirus TH wytworzono w makrofagach pęcherzyków płucnych świń (PAM), zaś LV4.2.1 wytworzono w komórkach CL2621 (CL). Hodowle komórkowe zakażono oznaczonym wirusem w MOI równej 0,05 i zebrano w oznaczonym czasie. Miana wirusów (TCID50/ml) oznaczono na makrofagach pęcherzyków płucnych świń albo CL2621 przez skrajne rozcieńczenia.

Figura 4. Wprowadzenie unikalnego miejsca PacI i Swal do zakaźnych klonów cDNA LV. Miejsce PacI i Swal wytworzono przez mutagenezę kierowaną PGR, jak to opisano szczegółowo w Materiałach i Metodach. Fragmenty cDNA zawierające miejsce PacI i Swal wymieniono w pABV414 stosując unikalne miejsca Hpal i Xbal, które zaznaczono. Dało to, odpowiednio, pABV437 i pABV442.

Tabe l a 1

Sekwencja nukleotydowa końca 5' klonów LV

Sekwencja1)	Liczba klonów
ATGATGTGTAGGG.....	22
TGATGTGTAGGG.......	1
GATGTGTAGGG.........	2
ATGTGTAGGG............	1

¹ Podkreślone nukleotydy reprezentują dodatkowe sekwencje, które nie występują w cDNA klonów, wcześniej izolowanych i sekwencjonowanych (Meulenberg i in., 1993a).

Claims (11)

1. '. Sposób wytwarzania zakaźnego klonu wirusa w oparciu o genom wirusa PRRS, znamienny tym, że wytwarza się technikami klonowania rekombinowany kwas nukleinowy obejmujący, co najmniej jedną pełnej długości kopię DNA albo transkrybowaną in vitro kopię RNA albo ich pochodną, za pomocą którego rekombinowany kwas nukleinowy zawiera pełną sekwencję genomu wirusa i za pomocą którego wytwarzania włącza się, co najmniej zakończenie 5' sekwencji genomu wirusa w kwas nukleinowy, a następnie dostarcza się komórkę gospodarza nie wrażliwą na zakażenie przez dziki typ wirusa, transfekuje się komórkę gospodarza rekombinowanym kwasem nukleinowym i wybiera się klony zakaźne.
2. 2. Sposób według zastrz. ', znamienny tym, że komórką gospodarza jest komórka BHK-2'.
3. 3. Rekombinowany kwas nukleinowy obejmujący zakaźny klon wirusa zawierający, co najmniej jedną pełnej długości kopię DNA albo transkrybowaną in vitro kopię RNA albo ich pochodną, przy czym rekombinowany kwas nukleinowy zawiera pełną sekwencję genomu wirusowego z włączonym, co najmniej zakończeniem 5' wspomnianej sekwencji genomu wirusowego w kwas nukleinowy.
4. 4. Cząsteczka rekombinowanego kwasu nukleinowego jak zdefiniowano w zastrz. 4, znamienna tym, że co najmniej jedna sekwencja kwasu nukleinowego kodująca znacznik wirulencji i/lub znacznik serologiczny została zmodyfikowana tak aby sekwencja kwasu nukleinowego kodująca znacznik była usytuowana w jednej z otwartych ramek odczytu kodujących białka strukturalne.
5. 5. Cząsteczka według zastrz. 4, znamienna tym, że jedną otwartą ramką odczytu jest ORF7.
6. 6. Cząsteczka według zastrz. 4, znamienna tym, że jedna otwarta ramka odczytu jest podstawiona przez ORF7 Arteriviridae.
7. 7. Cząsteczka według zastrz 4, znamienna tym, że włączona jest do niej, co najmniej jedna dodatkowa sekwencja heterologicznego kwasu nukleinowego.
8. 8. Cząsteczka według zastrz. 7, znamienna tym, że heterologiczna sekwencja kwasu nukleinowego koduje antygen.
9. 9. Cząsteczka według zastrz. 3 albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, znamienna tym, że otwarta ramka odczytu została zmodyfikowana.

   '0. Modyfikowany wirus RNA obejmujący rekombinowany kwas nukleinowy obejmujący zakaźny klon wirusa zawierający, co najmniej jedną pełnej długości kopię DNA albo transkrybowaną in vitro

   PL 191 258 B1 kopię RNA albo ich pochodną, przy czym rekombinowany kwas nukleinowy zawiera pełną sekwencję genomu wirusowego z włączonym, co najmniej zakończeniem 5' wspomnianej sekwencji genomu wirusowego w kwas nukleinowy.
10. 11. Szczepionka obejmująca antygen wirusowy i dopuszczalne farmaceutycznie substancje dodatkowe, znamienna tym, że jako antygen zawiera zmodyfikowany wirus RNA obejmujący rekombinowany kwas nukleinowy obejmujący zakaźny klon wirusa zawierający, co najmniej jedną pełnej długości kopię DNA albo transkrybowaną in vitro kopię RNA albo ich pochodną, przy czym rekombinowany kwas nukleinowy zawiera pełną sekwencję genomu wirusowego z włączonym, co najmniej zakończeniem 5' wspomnianej sekwencji genomu wirusowego w kwas nukleinowy.
11. 12. Komórka zakażona modyfikowanym wirusem RNA obejmującym rekombinowany kwas nukleinowy zawierający zakaźny klon wirusa, o co najmniej jednej pełnej długości kopii DNA albo transkrybowanej in vitro kopii RNA albo ich pochodnej, przy czym rekombinowany kwas nukleinowy zawiera pełną sekwencję genomu wirusowego z włączonym, co najmniej zakończeniem 5' wspomnianej sekwencji genomu wirusowego w kwas nukleinowy.