PL191497B1 - Wielowarstwowa membrana użyteczna do stosowania w rekonstrukcji kości lub tkanki chrzęstnej in vivo, sposób jej wytwarzania oraz jej zastosowanie - Google Patents

Abstract

1. Wielowarstwowa membrana uzyteczna do stosowania w rekonstrukcji kosci lub tkanki chrzestnej in vivo, znamienna tym, ze zawiera (i) warstwe macierzowa o otwartej, gabczastej budowie zbudowana glównie z kolagenu typu II oraz (ii) co najmniej jedna warstwe graniczna o zamknietej, wzglednie nieprzepuszczalnej budowie zbudowana glównie z kolagenu typu I i III i stanowi warstwe graniczna z naniesiona i liofilizowana zawiesina kolagenu typu II tworzaca warstwe macierzowa o otwartej, gabczastej budowie stabilnie przytwierdzona do tej warstwy. PL PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest wielowarstwowa membrana użyteczna do stosowania w rekonstrukcji kości lub tkanki chrzestnej in vivo, sposób jej wytwarzania oraz jej zastosowanie.

W pracach nad regenerację tkanki szczególne trudności sprawia rekonstrukcja tkanki chrzestnej, np. w ubytkach tkanki chrzestnej. Uszkodzenia tkanki chrzestnej mogą nastąpić w dowolnych stawach, jakkolwiek duże stawy takie jak staw kolanowy czy łokciowy, są najbardziej narażone na uszkodzenia. Uszkodzenia takie mogą być następstwem urazów, schorzeń degeneracyjnych lub zapalenia kości i chrząstki. Uszkodzenia tkanki chrzestnej są głównymi czynnikami patomechanicznymi w rozwoju choroby zwyrodnieniowej stawów. Uwalnianie enzymów prowadzi do powstawania procesów zapalnych w obrębie mazi stawowej, co w rezultacie prowadzi do abrazji tkanki chrzestnej i uszkodzenia powierzchni stawowej. Ostatnio prowadzone próby regeneracji chrząstki stawowej w uszkodzeniach tkanki chrzestnej in vivo obejmowały wstawienie wyhodowanych in vitro, autogennych stawowych chondrocytów (CAC). Technika ta ma jednak ograniczone zastosowania.

Przyjmuje się powszechnie, że do rekonstrukcji tkanki niezbędne jest dostarczenie warstwy macierzowej, która służy do kierowania komórek, wzrastających wzdłuż i pomiędzy włóknami warstwy macierzowej. Ostatnio w celu regeneracji tkanki zaproponowano wykorzystanie komórek CAC umieszczonych w ulegających resorbcji syntetycznych i naturalnych warstwach macierzowych. Jednakże w próbach rekonstrukcji tkanki chrzestnej z wykorzystaniem warstw macierzowych na bazie polikwasu mlekowego, polikwasu glikolowego i kolagenu typu I lub III, koniecznym było nanoszenie chondrocytów in vitro przed wszczepieniem warstw macierzowych. Powodowało to utrudnienia z utrzymaniem sterylności kultury chondrocytów, tzn. istniała możliwość wystąpienia reakcji zapalnej z udziałem komórek olbrzymich i komórek fibroblastowych na powierzchni styku pomiędzy implantem a tkanką.

W zgłoszeniu patentowym WO-A-96/25961 ujawniono wykorzystanie wszczepu opartego na kolagenie typu II, który można wszczepiać w miejsce in vivo i który polega na wzroście natywnych chondrocytów na powierzchni warstwy macierzowej w celu regeneracji tkanki chrzestnej. Jednakże zdolność takiej warstwy macierzowej do spowodowania całkowitej regeneracji tkanki chrzestnej jest ograniczona.

Istnieje zatem potrzeba wszczepu macierzowego, umożliwiającego skuteczne wrastanie natywnych chondrocytów i tym sposobem regenerację tkanki chrzestnej, po wszczepieniu implantu in vivo. W obecnym wynalazku ujawniono, że tkanka chrzestna i całkowicie nowa tkanka kostna mogą zostać zrekonstruowane przez wykorzystanie membrany macierzowej zbudowanej z kolagenu typu II, która in vivo oddzielona jest nie tylko od otaczającej tkanki łącznej, lecz również od uszkodzonych obszarów kostnych lub chrzestnych. Uznano, że można osiągnąć ten cel poprzez wykorzystanie wielowarstwowej membrany wszczepialnej, zdolnej do zapobiegania niekorzystnemu wzrastaniu dowolnej otaczającej tkanki do warstwy macierzowej lub poprzez chirurgiczne wszczepienie do miejsca uszkodzonego, tak by osiągnąć również wspomniany efekt.

Wielowarstwowa membrana użyteczna do stosowania w rekonstrukcji kości lub tkanki chrzestnej in vivo według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera (i) warstwę macierzową o otwartej, gąbczastej budowie zbudowaną głównie z kolagenu typu II oraz (ii) co najmniej jedną warstwę graniczną o zamkniętej, względnie nieprzepuszczalnej budowie zbudowaną głównie z kolagenu typu I i III i stanowi warstwę graniczną z naniesioną i liofilizowaną zawiesiną kolagenu typu II tworzącą warstwę macierzową o otwartej, gąbczastej budowie stabilnie przytwierdzoną do tej warstwy.

Korzystnie, membrana obejmuje pojedynczą warstwę graniczną.

Korzystnie, warstwa macierzowa umieszczona jest pomiędzy dwiema warstwami granicznymi.

Korzystnie, warstwa macierzowa utworzona jest z materiału zawierającego kolagen typu II pochodzącego z naturalnej chrząstki.

Korzystnie, materiał zawierający kolagen typu II pochodzi z chrząstki szklistej świń.

Korzystnie, materiał zawierający kolagen typu II jest usieciowany.

Korzystnie, warstwa graniczna lub warstwy graniczne pochodzą z błony otrzewnowej cieląt lub świń.

Korzystnie, warstwa macierzowa jest impregnowana chondrocytami wyizolowanymi z chrząstki stawowej, okostnej, tkanki okołochrzęstnej lub mezenchymalnymi komórkami macierzystymi ze szpiku kostnego.

Korzystnie, warstwa macierzowa i/lub warstwa graniczna lub warstwy graniczne są impregnowane glikozoaminoglikanem.

PL 191 497B1

Korzystnie, glikozoaminoglikan jest kwasem hialuronowym, chondroityno-6-siarczanem, siarczanem keratyny lub siarczanem dermatanu.

Korzystnie, warstwa macierzowa i warstwa graniczna lub warstwy graniczne są zasadniczo wolne od proteoglikanów.

Korzystnie, warstwa macierzowa i/lub warstwa graniczna lub warstwy graniczne zawierają ponadto chondronektynę, lamininę, fibronektynę, alginian wapnia, anchorynę typu II, czynniki wzrostowe lub czynniki morfogenetyczne kości.

Sposób wytwarzania wielowarstwowej membrany według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiesinę kolagenu typu II nanosi się na powierzchnię warstwy granicznej, a następnie przeprowadza się liofilizację do uzyskania stabilnie przytwierdzonej warstwy macierzowej z kolagenu typu II o otwartej, gąbczastej strukturze.

Zastosowanie membrany według wynalazku polega na wytwarzaniu wszczepu do kierowanej regeneracji tkanki.

Uznaje się, że skuteczna regeneracja tkanki chrzestnej wymaga szybkiego wrastania nie tylko natywnych komórek tkanek takich jak tkanka łączna, naczynia krwionośne itd., lecz również dowolnej nowej tkanki kostnej w miejscu leczonego uszkodzenia. Efekt ten można uzyskać stosując dwuwarstwową membranę według wynalazku, służącą do odgraniczania z jednej strony warstwy macierzowej zbudowanej z kolagenu od wrastających komórek tkanki natywnej. W czasie chirurgicznego wszczepiania efekt ten można uzyskać łącząc technikę przeszczepu tkanki np. przeszczep okostnowy, efektywnie zapobiegający wrastaniu komórek tkanki natywnej z przeciwnej strony wszczepu. Na przykład przeszczep okostnowy może być wstępnie wszyty w takie miejsce, by zapewniał osłonę od strony uszkodzenia kości lub tkanki chrzestnej. Następnie dwuwarstwowa membrana według wynalazku może zostać wszczepiona w miejsce uszkodzenia tak, by kontaktowała się z przeszczepem, w orientacji takiej, by strona wierzchnia membrany znalazła się na miejscu uszkodzenia. Korzystniej, membrana dwuwarstwowa według wynalazku wszczepiana jest wstępnie w miejsce uszkodzone, w takiej orientacji że warstwa graniczna leży na miejscu uszkodzenia kości lub tkanki chrzestnej. Następnie przeszczep okostnowy umieszczany jest w taki sposób, że kontaktuje się z warstwą macierzową. Przeszczep można przyczepić za pomocą klejów biologicznych, takich jak klej fibrynowy, lub przymocować za pomocą ulegających resorbcji polioctanowych przyczepów, lub jeśli jest to konieczne przyszyć w taki sposób, by stanowił nieprzepuszczalną barierę dla wrastających komórek dowolnej otaczającej tkanki łącznej.

W alternatywnym zastosowaniu wynalazku sama membrana może w sposób efektywny zapobiegać wrastaniu komórek dowolnej natywnej tkanki. Zatem, w kolejnym zastosowaniu wynalazek dostarcza membrany co najmniej trójwarstwowej, w której warstwa macierzowa zbudowana jest przede wszystkim z kolagenu typu II i posiada gąbczastą budowę otwartą, i jest umieszczona pomiędzy dwiema warstwami granicznymi, o strukturze względnie nieprzepuszczalnej, zamkniętej.

Warstwa macierzowa zachowuje się jak podłoże do wrastania natywnych chondrocytów, umożliwiając efektywną regenerację tkanki chrzestnej. W celu dalszego wspomożenia regeneracji tkanki łącznej warstwa macierzowa może zostać impregnowana chondrocytami albo przed, albo w trakcie implantacji in vivo. Chociaż warstwę macierzową można impregnować chondrocytami tuż przed wszczepieniem (np. poprzez iniekcję), zasadniczo oczekuje się, że wprowadzenie chondrocytów dokonane będzie bezpośrednio poprzez iniekcję zawiesiny chondrocytów w trakcie implantacji. W ten sposób chondrocyty obecne w warstwie macierzowej membrany zdolne są do efektywnej regeneracji tkanki chrzestnej i zasadniczo nowej tkanki kostnej, podczas gdy membrana zapobiega wrastaniu innych rodzajów komórek z otaczających tkanek.

Chondrocyty do zastosowania według wynalazku można uzyskać z takich źródeł komórek, jak komórki autogeniczne lub allogeniczne wyizolowane z chrząstki stawowej, okostnej lub tkanki okołochrzęstnej i komórki mezenchymalne (zrębowe) komórki pnia ze szpiku kostnego. Ponieważ komórki allogeniczne niosą ze sobą potencjał immunogenny i zapalny, korzystne jest izolowanie chondrocytów ze źródeł autogenicznych, szczególnie z autogenicznych tkanek chrzestnych stawów. Sposoby uzyskiwania komórek są dobrze znane i obejmują enzymatyczne trawienie i hodowanie komórek in vitro. Zebrane komórki są hodowane in vitro przed ponownym wprowadzeniem do organizmu. Ogólnie, co najmniej 10⁶, korzystniej co najmniej 10⁷ komórek należy wprowadzić do warstwy macierzowej membrany w celu uzyskania optymalnej regeneracji tkanki chrzestnej.

Ogólnie korzystne jest, by warstwa macierzowa membrany według wynalazku zawierała glikozo-aminoglikany (GAG), takie jak kwas hialuronowy, chondroityno-6-siarczan, siarczan keratyny, siarczan

PL 191 497 B1 dermatanu itd., które tworzą naturalne warunki wzrostu dla chondrocytów. Możliwe jest wprowadzenie do warstwy kolagenowej glikozoaminoglikanów z różnych źródeł, o składzie niekoniecznie identycznym i różnych co do masy cząsteczkowej i własności fizjologicznych w porównaniu do glikozamino-glikanów z tkanki chrzestnej, to jednak korzystnymi glikozoaminoglikanami są te, wyizolowane z tkanki chrzestnej. Ogólnie, warstwa macierzowa zawiera korzystnie od 1 do10% (wagowo) glikozamino-glikanów, na przykład od 2 do 6% (wagowo). Jakkolwiek warstwa nieprzepuszczalna może zawierać niektóre glikozoaminoglikany, to większa ich część obecna jest w warstwie macierzowej.

W natywnej tkance kolagenowej, GAG występują, co najmniej w jej części, jako składniki proteo-glikanów (PG). Zastosowanie GAG w postaci proteoglikanów jest niepożądane ze względu na możliwe problemy z odpowiedzią immunologiczną, którą mogą wywołać białkowe składniki PG. Korzystnie, warstwa macierzowa jest zatem zasadniczo pozbawiona dowolnych proteoglikanów. Można to łatwo osiągnąć przygotowując warstwę macierzową z mieszaniny oczyszczonego, pozbawionego telopeptydu kolagenu typu II i glikozoaminoglikanów.

W warstwie macierzowej mogą być obecne również inne substancje dodatkowe, na przykład chondronektyna, laminina, fibronektyna, alginian wapnia lub anchoryna typu II, w celu zwiększenia przylegania chondrocytów do włókien kolagenu typu II oraz czynniki wzrostowe, takie jak czynnik indukujący wzrost tkanki chrzestnej (CIF), insulino-podobny czynnik wzrostowy (IGF), czynnik transformujący beta (TGFβ) obecny jako homo- lub heterodimery oraz czynnik morfogenetyczny tkanki kostnej (BMP), taki jak natywny lub rekombinowany ludzki BMP-2, BMP-3 (osteogenina), BMP-4 i BMP-7 (OP-1, białko 1 osteogenetyczne). BMP-2 wpływa niezależnie na dwa szlaki tworzenia kości - bezpośrednie tworzenie kości, jak również tworzenie tkanki chrzestnej, która jest następnie usuwana i zastępowana tkanką kostną. Kompozycje różnych BMP i kolagenu zawierające macierz kostną uzyskaną poprzez ekstrakcję z warstwy korowej różnych kości lub z demineralizowanych kości obejmują 90% kolagenu i 10% białek niekolagenowych (NCP) dla zapewnienia aktywności BMP lub aktywności chondrogennej BMP/NCP. Niektóre czynniki wzrostowe mogą być obecne również w warstwie nieprzepuszczalnej. Jednakże większa ich część obecna jest w warstwie macierzowej.Ogólnie, membrana zawiera od 100 μg do 5 mg czynników wzrostowych.

Jak wskazano powyżej, membrana obejmuje co najmniej dwie warstwy o różnej strukturze. Korzystnie, warstwa graniczna membrany zbudowana jest zasadniczo z kolagenu typu I i III. Alternatywnie może obejmować materiał syntetyczny np. syntetyczny, ulegający resorbcji polimer, fakultatywnie pokryty materiałem kolagenowym, takim jak kolagen typu I i/lub kolagen typu III.

Przykłady użytecznych materiałów syntetycznych obejmują poliestry, polikwasy glikolowy i mlekowy (PLA) w postaci homopolimerów i kopolimerów, kopolimery glikolidowe i laktydowe, poliortoestry i poli-kaprolaktony. Wiele z wymienionych substancji jest łatwo dostępnych np. z firmy Boehringer Ingelheim w zakresie RESOMER. Korzystne jest użycie polimerów PLA, takich jak wosk o użytecznej masie cząsteczkowej ok. 650-1200 i nie ulegających zbyt szybkiej degradacji. Szczególnie użytecznym, ulegającym biodegradacji polimerem jest polikwas D,L-mlekowy, w którym proporcja D-laktydów do L-laktydów wynosi ok. 70:30. Korzystną cechą takich materiałów syntetycznych jest fakt, iż posiadają one wysoką stabilność mechaniczną, umożliwiającą rozciąganie implantu membranowego naokoło uszkodzenia kostnego bez obcierania tkanki. Materiały takie nadają się również do zszywania.

Korzystnie, warstwa graniczna składa się z długich włókien kolagenowych, które przylegają tak mocno, by substancje o dużej masie cząsteczkowej nie mogły przez nie przenikać. Długie włókna nadają ponadto wysoką odporność na rozciąganie i odporność na ścieranie, tak że materiał jest nie tylko membraną rozdzielającą lecz może być łatwo przyszyty. W praktyce chirurgicznej istotne jest by membrana wszczepialna mogła być łatwo przyszyta lub przyczepiona we właściwej pozycji, i wiele z dotychczas zaprojektowanych membran nie spełniało tego warunku. Membrana według wynalazku wykazuje stabilność mechaniczną, wystarczającą do manipulacji chirurgicznych niezbędnych do implantacji.

Warstwa macierzowa jest wysoce porowata i posiada masę specyficzną nawet tak niską jak 0,02, co umożliwia bardzo łatwe wrastanie w nią komórek. Ta warstwa membrany, zawierająca zwykle glikozo-aminoglikany, znacznie pęcznieje i może zgromadzić nawet 5000% płynu. Idealnie, warstwa macierzowa powinna dostarczyć struktury porowatej (stopień porowatości i rozmiary porów), umożliwiającej przyleganie komórek oraz powinna umożliwiać utrzymanie przez zasiedlone chondrocyty właściwego im fenotypu, charakteryzowanego przez zdolność do syntezy białek specyficznych dla tkanki chrzestnej.Wielkość porów zależy od procesu zamrażania i suszenia wykorzystywanego w produkcji kolagenu typu II warstwy macierzowej i można oczekiwać iż zawiera się w zakresie od 10 do 120 μm, np. od 20 do 100 μm. Fakultatywnie wielkość porów powinna wynosić około 85 μm. Taką wielkość porów można

PL 191 497B1 łatwo uzyskać poprzez wolne zamrażanie od -5 do -10°C przez około 24 godziny, a następnie liofilizację lub przez dodanie dwuwęglanu amonowego do papki przed liofilizacją.

Warstwa macierzowa membrany zawiera korzystnie materiał kolagenu typu II uzyskany z chrząstki, korzystnie z chrząstki szklistej świni.

Podczas gdy pożądana grubość warstwy macierzowej zależy od natury kości lub uszkodzenia chrząstki, ogólnie zawiera się pomiędzy 2 a 10 mm, np. od 4 do 6 mm. Grubość warstwy granicznej korzystnie wynosi od 0,2 do 2 mm, np. od 0,2 do 0,7 mm.

Warstwa graniczna może obejmować zwierzęcy materiał naturalny obejmujący kolagen typu I iIII. Ponieważ jest uzyskana z naturalnego źródła, ulega całkowitej resorbcji w organizmie i nie tworzy toksycznych produktów degradacji. Membrany takie wykazują również wysoką odporność na ścieranie, w stanie zarówno mokrym jak i suchym, tak że można je mocować sposobami chirurgicznymi. Materiał wilgotny jest bardzo elastyczny, co umożliwia rozciąganie i pokrywanie powierzchni nieregularnych defektów kostnych.

Oprócz kolagenu, naturalne membrany zwierzęce zawierają inne biomateriały, które należy usunąć. Znane są sposoby traktowania takich membran enzymami, rozpuszczalnikami lub innymi odczynnikami chemicznymi w celu oczyszczenia dla dalszego zastosowania w medycynie. Większość z takich materiałów jest zwykle zbyt cienka i nie zawsze łatwa do użycia. Włókna kolagenowe tracą swój naturalny charakter, tak że wspomniane membrany wykazują niewystarczającą odporność mechaniczną, gdy mają być użyte jako materiał nadający się do szycia chirurgicznego. Ponadto nie wykazują właściwości pęcznienia pod wpływem wody i nie pozwalają na rozróżnienie pomiędzy gładką, granularną powierzchnią, a powierzchnią odkostną, włóknistą. Forma włóknista oczyszczonego, wolnego od telopeptydu kolagenu typu I lub II, jako że mniej rozpuszczalna i ulegająca biodegradacji, jest najkorzystniejszym materiałem nośnikowym.

Membrany tworzące warstwę graniczną według wynalazku obejmują błony otrzewnowe z cieląt lub świni, utrzymujące naturalną strukturę kolagenową. Membrany otrzewnowe z młodych świń w wieku 6-7 tygodni (o masie 60-80 kg) są szczególnie korzystne.

Warstwa graniczna powinna korzystnie obejmować czysty, natywny (nie zdenaturowany) kolagen i może być przygotowana sposobem ujawnionym w zgłoszeniu patentowym WO-A-95/18638. Membrana naturalna może być wpierw potraktowana zasadą, na przykład wodnym roztworem NaOH w stężeniu 0,2 -5% (wagowo). Powoduje to zmydlenie wszystkich tłuszczy i białek wrażliwych na zasady. W drugim etapie materiał traktowany jest kwasem, zwykle nieorganicznym, takim jak HCl, w celu usunięcia rozpuszczalnych w kwasie zanieczyszczeń. Materiał jest następnie przemywany, aż do uzyskania pH w zakresie 2,5-3,5. Membrana posiada na tym etapie powierzchnię gładką lub granularną oraz powierzchnię mniej zwartą, fibrylarną. Niekiedy korzystne jest sieciowanie membrany, poprzez ogrzanie do 100-120°C.

Kolagen typu II stosowany do warstwy macierzowej membrany można uzyskać z chrząstki, w podobny sposób jak podano powyżej dla warstwy granicznej, obejmującej zasadniczo kolagen typu I i III. Korzystne jest usunięcie wody z chrząstki przez potraktowanie jej acetonem, a następnie ekstrakcja tłuszczu rozpuszczalnikiem węglowodorowym, takim jak n-heksan, choć można stosować alkanole, takie jak alkohol etylowy, etery takie jak eter dietylowy lub chlorowane węglowodory, takie jak chloroform lub ich mieszaniny. Odtłuszczony materiał jest następnie traktowany zasadą, zmydlającą pozostałe resztkowe tłuszcze i degradującą niektóre z białek. Ostatecznie materiał traktowany jest kwasem, powodującym dalszą degradację białek. Następnie materiał pęcznieje w wodzie i poddawany jest homogenizacji w młynku do otrzymania jednolitej papki.

W celu wytworzenia wielowarstwowej membrany, miękka papka zawierająca kolagen typu II nakładana jest na powierzchnię włóknistą gładkiej membrany przygotowanej na przykład zgodnie z WO-A-95/18638. Zwykle membrana umieszczana jest na powierzchni gładkiej, powierzchnią granularną do dołu, tak że papka kolagenu typu II może być łatwo nałożona na nią np. poprzez rozprowadzanie i wcieranie w stronę włóknistą membrany. Papka tworzy następnie warstwę o pożądanej grubości, przylegającą ściśle do membrany kolagenowej. Utworzona tak dwuwarstwowa membrana poddawana jest następnie zamrażaniu i liofilizacji w celu uzyskania struktury gąbczastej, posiadającej pory o pożądanej wielkości. Jeżeli jest to konieczne część warstwy macierzowej może zostać usunięta w celu zapewnienia dwuwarstwowej membranie jednolitej grubości. W celu wytworzenia trójwarstwowej membrany, kolejna gładka membrana umieszczana jest na powierzchni warstwy macierzowej, swą stroną włóknistą do warstwy macierzowej.

PL 191 497 B1

Papka kolagenu typu II która nakładana jest na membranę zawiera zasadniczo 1,0-4,0% wagowych kolagenu, korzystnie 2-3% wagowe. Użytecznie, wartość pH tej mieszaniny powinna zostać doprowadzona do 2,5-4,5, korzystnie od 3,0 do 4,0.

Korzystnie, materiał kolagenu typu II można poddać sieciowaniu po etapie liofilizacji w celu stabilizacji warstwy macierzowej. Etap ten służy jednocześnie zwiększaniu stabilności mechanicznej warstwy macierzowej i zmniejszaniu stopnia resorbcji w organizmie. Idealnie stopień sieciowania powinien być taki, by tempo degradacji warstwy macierzowej odpowiadało tempu regeneracji tkanki. Fizyczne, sieciowanie można prowadzić poprzez ogrzewanie, lecz proces ten należy prowadzić ostrożnie w celu uniknięcia niepożądanej utraty zdolności do resorbcji. Korzystne jest ogrzewanie w temperaturze 100-120°C przez okres od 30 minut do 5 godzin. Bardziej korzystnie sieciowanie można prowadzić poprzez naświetlanie UV z wykorzystaniem lampy UV np. przez okres 8 godzin.

Materiał kolagenu typu II zawiera korzystnie glikozoaminoglikany. Glikozoaminoglikany reagują z kolagenem typu II w reakcji częściowego sieciowania, dając nierozpuszczalny w wodzie produkt. Jeżeli jest to konieczne, można poprawić efektywność dalszego sieciowania poprzez ogrzewanie lub naświetlanie światłem UV, jak podano to powyżej. Reakcję pomiędzy glikozoaminoglikanami i kolagenem można prowadzić w temperaturze pokojowej, przy pH w zakresie 2,5-3,5. Ilość glikozoaminoglikanów może wahać się od 1 do 10% wagowych. Materiał można zamrażać i liofilizować bezpośrednio po reakcji.

Alternatywnie, tworzenie papki można prowadzić poprzez zwiększanie pH masy kolagenowej typu II. Ten sposób polega na schłodzeniu masy do około 4°C i powolnym podnoszeniu pH poprzez dodawanie zimnego roztworu NaOH w 4°C do wartości pH 6,5-7,5. Następnie masa przetrzymywana jest w temperaturze pokojowej przez 15-25 godzin. W tym czasie tworzy się papka, a po jej utworzeniu masa może być zamrażana i liofilizowana.

Innym sposobem jest neutralizacja masy kolagenu typu II do pH o wartości od 6,8 do 7,4, a następnie usuwanie powietrza. Mieszanina umieszczana jest w formie i inkubowana przez 15-20 godzin w temperaturze 37°C. Tworzy się delikatna papka która może być następnie zamrażana i liofilizowana.

Zastosowanie jednego z wymienionych wyżej sposobów zależy od właściwości pożądanego produktu. Pierwszy sposób pozwala uzyskać najbardziej stabilny produkt. Jednakże precypitacja może powodować powstawanie zgęstnień materiału, dlatego należy prowadzić ją bardzo ostrożnie. Drugi sposób daje produkt delikatny i jednorodny, jest on jednak bardziej rozpuszczalny niż produkt otrzymany pierwszym sposobem.

W procesie wytwarzania papki możliwe jest dodatkowe wprowadzanie innych pożądanych substancji, takich jak substancji leczniczych np. antybakteryjnych takich jak taurolidyny lub antybiotyków, takich jak gentamycyny.

Po nałożeniu papki na membranę materiał jest zamrażany. W celu uzyskania powtarzalnej wielkości porów proces zamrażania musi być dokładnie kontrolowany, zarówno pod względem szybkości, jak i czasu zamrażania, wartości pH oraz wielkości cząsteczek. W celu uzyskania bardzo małych porów materiał powinien być gwałtownie zamrożony do bardzo niskiej temperatury.

Zamrożona membrana poddawana jest następnie liofilizacji i ogrzewaniu do 110-130°C. W ten sposób dochodzi do sprzęgania. Następnie liofilizowana biomembrana może być doprowadzona do pożądanej grubości, tak by grubość warstwy macierzowej wynosiła zwykle 2 mm. Podwójna membrana jest następnie sterylizowana, na przykład poprzez naświetlenie promieniami gamma lub poprzez działanie tlenkiem etylenu. Sterylizacja poprzez wysokoenergetyczne naświetlenie np. ⁶⁰Co w dawkach 25 kGy może dezaktywować BMP. W takim przypadku wysterylizowaną już membranę można impregnować BMP w sterylnym roztworze przed implantacją.

Membranę według wynalazku można wykorzystywać w medycynie w następujący sposób:

Jako materiał do kierowanej regeneracji tkanek. Wzrost komórek wspierany jest przez warstwę macierzową. Warstwa graniczna hamuje wzrost niepożądanych komórek.

Jako materiał do naprawy uszkodzeń tkanki chrzestnej takich jak ubytki nie penetrujące poniżej warstwy płytki chrzestnej lub w naprawie uszkodzeń kostno-chrzęstnych.

Wynalazek dostarcza również wielowarstwowej membrany kolagenowej jak przedstawiono to powyżej, do kierowanej regeneracji tkanki. Zawartość kolagenu typu II w membranie jest szczególnie użyteczna w regeneracji tkanki chrzęstnej lecz również jest użyteczna w regeneracji innych rodzajów tkanek.

Wynalazek dostarcza w kolejnym aspekcie membrany opisanej powyżej jako wszczep do kierowanej regeneracji tkanek.

Poniższe przykłady stanowią jedynie ilustrację wynalazku. W poniższych przykładach wszystkie etapy wykonywano w warunkach aseptycznych, np. w sterylnych pomieszczeniach.

PL 191 497B1

Przykład 1 (A) Membrany otrzewnowe uzyskane z młodych cieląt czyszczono całkowicie z pozostałości mięsa i tłuszczu sposobami mechanicznymi, przemyto pod bieżącą wodą i traktowano 2% roztworem NaOH przez 12 godzin. Membrany następnie przemyto pod bieżącą wodą i zakwaszano 0,5% HCl. Po zakwaszeniu materiału na całej jego grubości (co trwało około trzech godzin) materiał przemyto do osiągnięcia pH 3,5. Materiał następnie obkurczano w 7% roztworze soli, neutralizowano 1% roztworem NaHCO₃ i przemyto pod bieżącą wodą. Materiał następnie odwodniono acetonem i odtłuszczono n-heksanem.

(B) Zamrożone chrząstki uzyskane ze świeżo zabitych świń moczono w zimnej wodzie, dokładnie opłukano i oczyszczono mechanicznie od pozostałości mięsa, kości i twardych części. Następnie materiał przemywano przez 30 minut pod bieżącą wodą.

Następnie materiał homogenizowano w homogenizatorze. Wielkość cząsteczek po homogenizacji wyniosła około 8 mm.

Fragmenty chrząstki następnie odwadniano przez płukanie 4 razy w acetonie, za każdym razem przez 8 godzin. Chrząstkę następnie odtłuszczano stosując czterokrotną ekstrakcję n-heksanem. Każda ekstrakcja trwała co najmniej 8 godzin. Stosunek heksanu do chrząstki wynosił 1:10.

Po odtłuszczeniu chrząstkę spęczniano w wodzie pitnej. Stosunek wody:materiału wynosił 10:1. Pęcznienie prowadzono przez 24 godziny.

Materiał następnie traktowano przez 32 godziny roztworem NaOH (5% wagowo), gdzie stosunek chrząstki do płynu wynosił 1:4. W czasie traktowania kawałki chrząstki dokładnie mieszano. Wyjściowe pH wynoszące 14, w ten sposób zmniejszyło się do 9-11. Rozpuszczalne zanieczyszczenia przemyto i oddzielono od chrząstki. Płyn powstający w trakcie traktowania zasadą zebrano i odzyskano z niego glikozoaminoglikan.

Zebrany materiał traktowano następnie przez 4-6 godzin silnym kwasem HCl (około 3% wagowo) wstępnie przy pH poniżej 1,0.

Następnie materiał przemywano zimną wodą aż do czasu uzyskania wartości pH w granicach 3-3,5. Wszystkie zanieczyszczenia usunięto, tak że produkt stanowił pozbawioną soli masę kolagenową, użyteczną do produkcji gąbki lub innego materiału kolagenowego. W tym celu, masę chrząstkową można, zależnie od zamierzonych celów, odgazować, zamrozić i liofilizować.

Ekstrakt otrzymany po traktowaniu zasadą jak podano wyżej zawierał glikozoaminoglikan, zasadę, skażone białka i sole. Ekstrakt neutralizowano HCl, tak by wartość pH spadła do około 6. Ekstrakt traktowano następnie pomocniczym materiałem filtracyjnym, a mianowicie ziemią okrzemkową, usuwającą skażone białka. Do ekstraktu wprowadzono 0,5% wagowo ziemi okrzemkowej i następnie oddzielono przez filtrację razem ze skażonymi białkami.

Supernatant poddano następnie ultrafiltracji z wykorzystaniem membrany nieprzepuszczalnej dla cząsteczek o masie powyżej 10,000 daltonów. W ten sposób usunięto sole, a pozostawiono czysty glikozoaminoglikan.

Tak uzyskany roztwór glikozoaminoglikanu zmieszano z materiałem kolagenu przedstawionym powyżej, do utworzenia macierzy kolagenu typu II zawierającej glikozoaminoglikan.

Uzyskano następujące właściwości masy kolagenowej typu II:

TG = 2,8% wagowo

GAG = 3% wagowo (wyliczone na podstawie zawartości kolagenu) pH = 3,5 (C) Świeżo przygotowaną membranę otrzewnową przygotowaną jak podano w punkcie (A) przemyto równomiernie wodą i pozostawiono na równej płytce szklanej stroną włóknistą do góry. Następnie membranę dokładnie zwilżono masą kolagenu typu II przygotowaną jak podano w punkcie (B). Membranę następnie rozciągano równomiernie we wszystkich kierunkach, tak by dokładnie przylegała do płytki. Masę kolagenu typu II następnie dokładnie wcierano w membranę.

Membranę następnie obciążono z góry dużą masą i pozostawiono w ten sposób przez noc w lodówce w temperaturze około 4°C. W tym czasie tworzyła się papka.

Papkę zamrożono w następujących warunkach: temperatura = -12°C czas = 40 minut

Następnie zamrożoną papkę liofilizowano i ogrzewano do 125°C.

Czas liofilizacji = 14 godzin.

Warstwę macierzową kolagenu typu II następnie dzielono na fragmenty grubości 1 mm.

PL 191 497 B1

Przykład 2

Świeżo przygotowaną membranę otrzewnową uzyskaną jak podano w przykładzie 1(A) nałożono na płytkę szklaną i wcierano w nią grubą warstwę masy kolagenu typu II, o własnościach jak podano w przykładzie 1.50 g masy kolagenu typu II rozpuszczono w 100 ml wody destylowanej i dokładnie wymieszano. W czasie mieszania wolno dodawano 100 ml roztworu glikozoaminoglikanu. Kolagen wytrącił się w postaci masy wraz z GAG. Po wytrąceniu masę homogenizowano i zawiesinę rozprowadzano na membranie. Papka wytworzyła się przez noc i membranę traktowano dalej jak podano w przykładzie 1.

Claims (14)

1. Wielowarstwowa membrana użyteczna do stosowania w rekonstrukcji kości lub tkanki chrzestnej in vivo, znamienna tym, że zawiera (i) warstwę macierzową o otwartej, gąbczastej budowiezbudowaną głównie z kolagenu typu II oraz (ii) co najmniej jedną warstwę graniczną o zamkniętej, względnie nieprzepuszczalnej budowie zbudowaną głównie z kolagenu typu I i III i stanowi warstwę graniczną z naniesioną i liofilizowaną zawiesiną kolagenu typu II tworzącą warstwę macierzową o otwartej, gąbczastej budowie stabilnie przytwierdzoną do tej warstwy.

2. Membrana według zastrz. 1, znamienna tym, że obejmujepojedynczą warstwę graniczną.

3. Membrana według zastrz. 1, znamienna tym, że warstwa macierzowa umieszczona jest pomiędzy dwiema warstwami granicznymi.

4. Membrana według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienna tym, że warstwa macierzowa utworzona jest z materiału zawierającego kolagen typu II pochodzącego z naturalnej chrząstki.

5. Membrana według zastrz. 4, znamienna tym, że materiał zawierający kolagen typu II pochodzi z chrząstki szklistej świń.

6. Membrana według zastrz. 4 albo 5, znamienna tym, żemateriał zawierający kolagen typu II jest usieciowany.

7. Membrana według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienna tym, że warstwa graniczna lub warstwy graniczne pochodzą z błony otrzewnowej cieląt lub świń.

8. Membrana według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienna tym, że warstwa macierzowa jest impregnowana chondrocytami wyizolowanymi z chrząstki stawowej, okostnej, tkanki okołochrzęstnej lub mezenchymalnymi komórkami macierzystymi ze szpiku kostnego.

9. Membrana według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienna tym, że warstwa macierzowa i/lub warstwa graniczna lub warstwy graniczne są impregnowane glikozoaminoglikanem.

10. Membrana według zastrz. 9, znamienna tym, że glikozoaminoglikan jest kwasem hialuronowym, chondroityno-6-siarczanem, siarczanem keratyny lub siarczanem dermatanu.

11. Membrana według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienna tym, że warstwa macierzowa i warstwa graniczna lub warstwy graniczne są zasadniczo wolne od proteoglikanów.

12. Membrana według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienna tym, że warstwa macierzowa i/lub warstwa graniczna lub warstwy graniczne zawierają ponadto chondronektynę, lamininę, fibronektynę, alginian wapnia, anchorynę typu II, czynniki wzrostowe lub czynniki morfogenetyczne kości.

13. Sposób wytwarzania wielowarstwowej membrany określonej w zastrz. 1, znamienny tym, że zawiesinę kolagenu typu II nanosi się na powierzchnię warstwy granicznej określonej w zastrz. 1, a następnie przeprowadza się liofilizację do uzyskania stabilnie przytwierdzonej warstwy macierzowej z kolagenu typu II o otwartej, gąbczastej strukturze.

14. Zastosowanie membrany określonej w zastrz. 1 do wytwarzania wszczepu do kierowanej regeneracji tkanki.