PL191989B1 - Starter oligonukleotydowy do powielania kwasu nukleinowego ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1), para starterów oligonukleotydowych, układ starterów oligonukleotydowych, zestawy do wykrywania kwasu nukleinowego ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) i sposób powielania kwasu nukleinowego ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) - Google Patents
Starter oligonukleotydowy do powielania kwasu nukleinowego ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1), para starterów oligonukleotydowych, układ starterów oligonukleotydowych, zestawy do wykrywania kwasu nukleinowego ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) i sposób powielania kwasu nukleinowego ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1)Info
- Publication number
- PL191989B1 PL191989B1 PL324327A PL32432798A PL191989B1 PL 191989 B1 PL191989 B1 PL 191989B1 PL 324327 A PL324327 A PL 324327A PL 32432798 A PL32432798 A PL 32432798A PL 191989 B1 PL191989 B1 PL 191989B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- seq
- hiv
- nucleic acid
- amplification
- skcc3
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
- C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/81—Packaged device or kit
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Virology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Dental Preparations (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
1. Starter oligonukleotydowy do powielania kwasu nukleinowego ludzkiego wirusa niedoboru odporno sci typu 1 (HIV-1), który to starter oligonukleotydowy jest wybrany z grupy z lo zonej z SKCC1 (SEK NR ID: 3) i SKCC3 (SEK NR ID: 4). PL PL PL
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest starter oligonukleotydowy do powielania kwasu nukleinowego ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1), para starterów oligonukleotydowych, układ starterów oligonukleotydowych, zestawy do wykrywania kwasu nukleinowego ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) i sposoby powielania kwasu nukleinowego ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1).
Niniejszy wynalazek dotyczy dziedziny biologii molekularnej i chemii kwasów nukleinowych, a bardziej szczegółowo, odczynników do wykrywania ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) i sposobu powielania kwasu nukleinowego ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1). Wynalazek ma zatem zastosowanie ogólnie w dziedzinie medycyny, a w szczególności w diagnostyce medycznej oraz dziedzinie biologii molekularnej.
Wynalezienie metod powielania specyficznych sekwencji kwasu nukleinowego, a w szczególności reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), umożliwiło szybkie wykrywanie kwasu nukleinowego obecnego w próbce, w której wcześniej nie był wykrywalny ze względu na małą jego ilość (patrz patenty USA Nr 4683195; 4683202; i 4965188). Rozwój i zastosowanie PCR są obszernie opisane w piśmiennictwie. Przykładowo, szeroki zakres tematów związanych z PCR jest omówiony w PCR Technology - principles and applications for DNA amplification, 1989, (wyd. H.A. Erlich) Stockton Press, New York, NY; PCR Protocols: A guide to methods and applications, 1990, (wyd. M.A. Innis i wsp.) Academic Press, San Diego, CA oraz PCR Strategies, 1995, (wyd. M.A. Innis i wsp.) Academic Press, San Diego, CA. Dostawcy handlowi, tacy jak Perkin Elmer (Norwalk, CT) sprzedają odczynniki do PCR i publikują protokoły do PCR.
Zastosowanie PCR i hybrydyzacji z sondą do powielania i wykrywania kwasu nukleinowego HIV-1 jest omówione w Kwok, 1992, Ann. Med. 24:211-214; i Coutlee i wsp., 1991, Mol. Cell. Probes 5:241-259. Testy do wykrywania HIV-1 w oparciu o PCR są opisane, przykładowo, w patentach USA Nr 5008182 i 5176775; Kellogg and Kwok, 1990, w PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, (wyd. Innis i wsp.), Academic Press, San Diego, CA:337-347; Holodniy i wsp., 1991, J. Inf. Dis. 163:802-865; Jackson i wsp., 1991, AIDS 5:1463-1467; i Mulder i wsp., 1994, J. Clin. Microbiol. 32(2):292-300.
Gotowe zestawy do powielania i wykrywania HIV-1 są handlowo dostępne z Hoffmann-La Roche (Nutley, NJ). Test Amplicor HIV-1™ jest testem in vitro do wykrywania prowirusowego DNA HIV-1. Test AMPLICOR HIV-1 MONITOR™ jest testem in vitro do oznaczania ilościowego RNA HIV-1. Obydwa testy Amplicor powielają kwasy nukleinowe HIV-1 przy zastosowaniu pary starterów SK462 (SEK NR ID: 5) i SK431 (SEK NR ID: 6), opisanych w Mulder i wsp., 1994, J. Clin. Microbiol. 32(2):292-300 i określanych tu jako startery Amplicor HIV-1.
HIV-1 wykazuje znaczne zróżnicowanie sekwencji genomowej. Analiza filogenetyczna sekwencji kwasu nukleinowego genów HIV-1 gag i env jest opisana w Myers i wsp., 1993, Human Retrovirus and AIDS 1993, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM, włączonym tu jako odnośnik. W obrębie grupy M, zidentyfikowano podtypy A-J.
Konwencjonalne techniki biologii molekularnej i chemii kwasów nukleinowych, które są dostępne w tej dziedzinie, są objaśnione w piśmiennictwie. Patrz, przykładowo, Sambrook i wsp., 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, wyd., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames i S.J. Higgins. wyd., 1984) oraz seria: Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.).
Zidentyfikowano liczne izolaty ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu pierwszego (HIV-1) z grupy M, które nie dają się powielić lub nie można ich powielić wydajnie przy zastosowaniu wcześniej opisanych starterów dla genu gag, a w szczególności starterów Amplicor HIV-1, SK462 (SEK NR ID: 5) i SK431 (SEK NR ID: 6). Izolaty te wykazują obecność nie obserwowanej wcześniej zmienności sekwencji w obrębie regionu obejmującego miejsca wiązania dla starterów Amplicor HIV-1.
Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie ulepszonych starterów, które umożliwiają wydajne powielanie kwasu nukleinowego z tych nowo odkrytych izolatów, obok wszystkich izolatów, które można powielić przy zastosowaniu starterów Amplicor HIV-1. Ponadto, startery według niniejszego wynalazku umożliwiają powielanie kwasu nukleinowego ze wszystkich znanych izolatów HIV-1 z grupy M z prawie jednakową wydajnością.
Jeden z aspektów niniejszego wynalazku dotyczy ulepszonych starterów oligonukleotydowych, które umożliwiają powielanie w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) regionu genu gag z izolatów
PL 191 989 B1 podtypów A-G HIV-1 z grupy M z prawie jednakową wydajnością i bez jednoczesnego powielania innych sekwencji.
Starter oligonukleotydowy do powielania kwasu nukleinowego ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1), według wynalazku jest wybrany z grupy złożonej z SKCC1 (SEK NR ID: 3) i SKCC3 (SEK NR ID: 4).
Wynalazek obejmuje też parę starterów oligonukleotydowych składającą się z SK145 (SEK NR ID: 1) i SKCC1 (SEK NR ID: 3) lub SK145 (SEK NR ID: 1) i SKCC3 (SEK NR ID: 4).
W zakres wynalazku wchodzi też układ, w którym te pary starterów mogą być w kombinacji ze starterem SK145M2 (SEK NR ID: 2). Zatem układ starterów oligonukleotydowych według wynalazku obejmuje zestaw oligonukleotydowych starterów składający się ze starterów oligonukleotydowych SK145 (SEK NR ID: 1), SKCC1 (SEK NR ID: 3) i SK145M2 (SEK NR ID: 2) lub składa się ze starterów oligonukleotydowych SK145 (SEK NR ID: 1), SKCC3 (SEK NR ID: 4) i SK145M2 (SEK NR ID: 2).
Inny zestaw według wynalazku zawiera starter oligonukleotydowy do powielania kwasu nukleinowego ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1), wybrany z grupy złożonej z SKCC1 (SEK NR ID: 3) i SKCC3 (SEK NR ID: 4).
Ponadto w zakres wynalazku wchodzi zestaw do wykrywania kwasu nukleinowego ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1), zawierający parę starterów oligonukleotydowych składającą się z SK145 (SEK NR ID: 1) i SKCC1 (SEK NR ID: 3) lub SK145 (SEK NR ID: 1) i SKCC3 (SEK NR ID: 4).
Ponadto w zakres wynalazku wchodzi zestaw do wykrywania kwasu nukleinowego ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1), zawierający układ starterów złożony z par starterów SK145 (SEK NR ID: 1) i SKCC1 (SEK NR ID: 3) lub SK145 (SEK NR ID: 1) i SKCC3 (SEK NR ID: 4) oraz z SK145M2 (SEK NR ID:2).
Zestawy te mogą zawierać dodatkowe odczynniki, takie jak sondy do wykrywania lub jeden albo więcej odczynników do powielania, np. polimerazę, bufory i trifosforany nukleozydów.
W zakres wynalazku wchodzi też sposób powielania kwasu nukleinowego ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) obejmujący przeprowadzenie reakcji łańcuchowej polimerazy przy zastosowaniu SKCC1 (SEK NR ID: 3) lub SKCC3 (SEK NR ID: 4) jako „startera 3'. Korzystnie reakcję łańcuchową polimerazy przeprowadza się stosując SK145 (SEK NR ID: 1) i SKCC1 (SEK NR ID: 3) lub stosując SK145 (SEK NR ID: 1) i SKCC3 (SEK NR ID: 4). Bardziej korzystnie reakcję łańcuchową polimerazy przeprowadza się stosując również SK145M2 (SEK NR ID: 2).
Aby pomóc w zrozumieniu wynalazku, zdefiniowano poniżej kilka terminów.
Terminy „kwas nukleinowy i „oligonukleotyd odnoszą się do polideoksyrybonukleotydów (zawierających 2-deoksy-D-rybozę), do polirybonukleotydów (zawierających D-rybozę) oraz do dowolnego innego typu polinukleotydu, który jest N-glikozydem zasady purynowej lub pirymidynowej albo zmodyfikowanej zasady purynowej lub pirymidynowej. Nie jest zamiarem rozróżnienie terminów „kwas nukleinowy i „oligonukleotyd ze względu na długość cząsteczki i będą one stosowane wymiennie. Terminy te odnoszą się jedynie do pierwszorzędowej struktury cząsteczki. A zatem terminy te obejmują dwuniciowy i jednoniciowy DNA, jak również dwuniciowy i jednoniciowy RNA.
Oligonukleotydy mogą być przygotowane według dowolnej odpowiedniej metody, włączając w to między innymi klonowanie i trawienie restrykcyjne odpowiednich sekwencji i bezpośrednią syntezę chemiczną przy zastosowaniu metody takiej jak metoda fosfotriestrowa według Narang i wsp., 1979, Meth. Enzymol. 68:90-99; metoda fosfodiestrowa według Brown i wsp., 1979, Meth. Enzymol. 68:109-151; metoda dietylofosforamiditowa według Beaucage i wsp., 1981, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862 oraz metoda ze stałym nośnikiem według Patentu USA Nr 4458066. Przegląd metod syntezy jest dostarczony w Goodchild, 1990, Bioconjugate Chemistry 1(3):165-187.
Termin „hybrydyzacja oznacza tworzenie się struktury dupleksu przez dwie pojedyncze nici kwasu nukleinowego na skutek komplementarnego parowania zasad. Hybrydyzacja może zajść między w pełni komplementarnymi nićmi kwasu nukleinowego lub pomiędzy „zasadniczo komplementarnymi nićmi kwasu nukleinowego, które zawierają niewielkie regiony niekomplementarne. Warunki, w których będą hybrydyzowały jedynie w pełni komplementarne nici kwasu nukleinowego są określane jako „ostre warunki hybrydyzacji lub „warunki hybrydyzacji specyficzne dla sekwencji. Stabilne dupleksy zasadniczo komplementarnych sekwencji można uzyskać w mniej ostrych warunkach hybrydyzacji; stopień tolerowanego niesparowania może być kontrolowany poprzez dobranie odpowiednich warunków hybrydyzacji. Specjaliści w dziedzinie technologii kwasów nukleinowych mogą określić doświadczalnie stabilność dupleksu biorąc pod uwagę kilka zmiennych, włączając w to między innymi
PL 191 989 B1 długość i zawartość par zasad w oligonukleotydach, siłę jonową i występowanie niesparowanych zasad, zgodnie z publikowanymi wskazówkami (patrz np., Sambrook i wsp., 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, New York oraz Wetmur,
1991, Critical Reviews in Biochem. and Mol. Biol. 26 (3/4): 227-259).
Termin „starter dotyczy oligonukleotydu, bądź naturalnego, bądź syntetycznego, mającego zdolność do działania jako punkt inicjacji syntezy DNA w warunkach, w których indukowana jest synteza produktu wydłużania startera komplementarnego do nici kwasu nukleinowego, tj. w obecności czterech różnych trifosforanów nukleozydów i czynnika do polimeryzacji (tj. polimerazy DNA lub odwrotnej transkryptazy), w odpowiednim buforze i odpowiedniej temperaturze. Korzystnie, starter jest jednoniciowym oligodeoksyrybonukleotydem. Odpowiednia długość startera zależy od zamierzonego zastosowania startera, ale typowo jest w granicach od 15 do 35 nukleotydów. Krótkie cząsteczki startera zwykle wymagają niższych temperatur dla utworzenia wystarczająco stabilnych kompleksów hybrydowych z matrycą. Starter nie musi odpowiadać identycznej sekwencji matrycowego kwasu nukleinowego, ale musi być wystarczająco komplementarny dla hybrydyzacji z matrycą. Startery mogą mieć dodatkowe właściwości, które umożliwiają wykrywanie albo unieruchamianie startera, ale nie zmieniają podstawowych właściwości startera, to jest działania jako miejsce rozpoczęcia syntezy DNA. Przykładowo, startery mogą zawierać dodatkową sekwencję nukleotydową na końcu 5', która nie hybrydyzuje z docelowym kwasem nukleinowym, ale ułatwia klonowanie powielonego fragmentu. Region startera, który jest wystarczająco komplementarny do matrycy, aby nastąpiła hybrydyzacja, jest tu określony jako region hybrydyzujący.
Stosowany tu termin „starter 5' (upstream) oznacza starter, dla którego produkt wydłużania jest częścią sekwencji nici kodującej. „Starter 3' (downstream) oznacza starter dla którego produkt wydłużania jest częścią sekwencji nici niekodującej.
Terminy „sekwencja docelowa, „region docelowy i „docelowy kwas nukleinowy dotyczą regionu kwasu nukleinowego, który ma być powielony, wykryty lub w inny sposób zanalizowany.
Mówi się tutaj, że starter jest „specyficzny dla sekwencji docelowej, jeżeli liczba niesparowanych zasad między starterem i sekwencją docelową jest mniejsza niż liczba niesparowanych zasad między starterem i sekwencjami nie będącymi sekwencjami docelowymi, które mogłyby być obecne w próbce. Można dobrać warunki hybrydyzacji, w których stabilne dupleksy tworzą się jedynie wtedy, gdy liczba obecnych niesparowanych zasad jest nie większa niż liczba niesparowanych zasad między starterem i sekwencją docelową. W takich warunkach starter specyficzny dla sekwencji docelowej może tworzyć stabilne dupleksy jedynie z sekwencją docelową. A zatem zastosowanie starterów specyficznych dla sekwencji docelowej w odpowiednio ostrych warunkach powielania umożliwia specyficzne powielenie takich sekwencji, które zawierają docelowe miejsca wiązania startera. Podobnie, zastosowanie sond specyficznych dla startera w odpowiednio ostrych warunkach hybrydyzacji umożliwia wykrywanie specyficznej sekwencji docelowej.
Termin „mieszanina reakcyjna do powielania oznacza roztwór zawierający odczynniki konieczne do przeprowadzenia reakcji powielania i typowo zawiera startery, termostabilną polimerazę, dNTP i dwuwartościowe kationy metali w odpowiednim buforze. Mieszaninę reakcyjną uważa się za pełną, jeżeli zawiera wszystkie odczynniki konieczne do przeprowadzenia reakcji, a niepełną jeżeli zawiera jedynie część koniecznych odczynników. Specjalista w tej dziedzinie rozumie, że składniki reakcji są rutynowo przechowywane jako odrębne roztwory, każdy zawierający część finalnych składników, ze względu na wygodę, stabilność przechowywania i dla umożliwienia zależnego od zastosowania doboru stężeń składników oraz, że składniki reakcji są mieszane przed reakcją, tak aby wytworzyć pełną mieszaninę reakcyjną. Ponadto, dla specjalisty będzie zrozumiałe, że składniki reakcji są pakowane oddzielnie w celach handlowych i że użyteczne handlowo zestawy mogą zawierać dowolną część składników reakcji, obejmującą startery według niniejszego wynalazku.
Startery do powielania HIV-1
Startery według niniejszego wynalazku umożliwiają powielanie kwasów nukleinowych z podtypów HIV-1 z grupy M. Startery reprezentują znaczny postęp w stosunku do starterów opisywanych poprzednio ze względu na to, że są one zdolne do powielania kwasu nukleinowego z regionu genu gag ze wszystkich izolowanych podtypów A-G należących do grupy M z prawie identyczną wydajnością, włącznie z nowowykrytymi izolatami. Sekwencje nukleotydowe starterów są przedstawione poniżej i są pokazane od lewa do prawa w orientacji od 5' do 3'.
PL 191 989 B1
SK145 (SEK NR ID: 1) SK145M2 (SEK NR ID: 2)
SKCC1 (SEK NR ID: 3) SKCC3 (SEK NR ID: 4)
Startery 5'
AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAAT
AGTGGGGGGACACCAGGCAGCAATGCAAAT
Startery 3'
TACTAGTAGTTCCTGCTATGTCACTTCC
TGAAGGGTACTAGTAGTTCCTGCTAT
Startery 3' według niniejszego wynalazku mogą być użyte z dowolnymi, ujawnionymi tutaj, starterami 5'. Korzystnie startery 3' według obecnego wynalazku stosuje się ze starterem 5' SK145 (SEK NR ID: 1), ewentualnie w połączeniu ze starterem 5' SK145M2 (SEK NR ID: 2). Starter 5' SK145 (SEK NR ID: 1) jest opisany w Kellogg i Kwok, 1990, w PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, (wyd. Innis i wsp.) Academic Press, San Diego, CA:337-347. Drugi starter 5', SK145M2 (SEK NR ID: 2), hybrydyzuje w tym samym regionie, co SK145 (SEK NR ID: 1), ale jest tak zaprojektowany, że bardziej pasuje do sekwencji nukleotydów pewnych izolatów HIV-1 z podtypów A i E. Jak pokazano w przykładach, zastosowanie obu starterów 5' może pomóc w otrzymaniu jednakowej wydajności powielania z poszczególnych podtypów.
Powielanie
Powielanie przeprowadza się w warunkach, które umożliwiają powielanie wszystkich podtypów HIV-1 z grupy M, ale które są wystarczająco ostre do uniknięcia powielania sekwencji niebędących sekwencjami docelowymi. Korzystne warunki reakcji powielania są opisane w przykładach, w Mulder i wsp., 1994, J. Clin. Microbiol. 32 (2):292-300 oraz w instrukcji do testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR. Dokładne warunki nie są krytycznym aspektem wynalazku. Optymalizacja warunków powielania może być wykonana w sposób rutynowy na podstawie dostarczonych tutaj wskazówek.
Startery i sposoby według niniejszego wynalazku mogą być zastosowane do wykrywania bądź prowirusowego DNA HIV-1, bądź RNA HIV-1. Powielanie z RNA przy użyciu transkrypcji/reakcji łańcuchowej polimerazy (RT-PCR) jest dobrze znane specjalistom i opisane w Patentach USA Nr 5322770 i 5310652; Myers i Gelfand, 1991, Biochemistry 30 (31):7661-7666 oraz Young i wsp.,
1993, J. Clin. Microbiol. 31 (4):882-886. Powielanie RT-PCR RNA HIV-1 jest opisane w Mulder i wsp.,
1994, J. Clin. Microbiol. 32 (2):292-300 i Holodniy i wsp., 1991, J. Inf. Dis. 163:802-865.
Metody przygotowywania próbki odpowiednie dla powielania DNA lub RNA HIV-1 są opisane w piśmiennictwie. Konkretna zastosowana metoda nie stanowi krytycznego aspektu obecnego wynalazku. Specjalista może wybrać i zoptymalizować odpowiednie metody otrzymywania próbki na podstawie dostarczonych tutaj wskazówek. Korzystne metody otrzymywania próbki celem użycia dla wykrywania prowirusowego DNA HIV-1 są opisane w Casareale i wsp., 1992, PCR Methods and Applications 2:149-153 i Butcher i Spadoro, 1992, Clin. Immunol. Newsletter 12:73-76. Korzystny zestaw do przygotowania próbki dla wykrywania prowirusowego DNA HIV-1 jest handlowo dostępny jako część testu Amplicor HIV-1. Korzystne metody przygotowania próbki do użycia dla wykrywania RNA HIV-1 w osoczu są opisane w Mulder i wsp., 1994, J. Clin. Microbiol. 32 (2):292-300. Korzystny zestaw do przygotowania próbki dla wykrywania i/lub oznaczania ilościowego RNA HIV-1 jest handlowo dostępny jako część testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR.
Analiza powielonego produktu
Startery do powielania i sposób według niniejszego wynalazku nadają się do dowolnego zastosowania, w którym wykorzystuje się powielanie kwasu nukleinowego. Na przykład, klonowanie i/lub sekwencjonowanie sekwencji HIV-1 jest ułatwione przez użycie przedstawionych starterów. Metody wykrywania powielonych PCR kwasów nukleinowych są dobrze znane w tej dziedzinie. Metody stosowane do analizy powielonego kwasu nukleinowego nie są krytycznym aspektem wynalazku i dowolna odpowiednia metoda może być użyta. Korzystne jest stosowanie powielania RNA HIV-1, tak jak opisano w przykładach dla oznaczania ilościowego zawartości wirusa.
Przykłady metod wykrywania powielonego kwasu nukleinowego obejmują analizę powielonego produktu poprzez elektroforezę na żelu i wykrywanie przez hybrydyzację z komplementarnymi sondami oligonukleotydowymi. Odpowiednie sposoby przeprowadzania testów dla wykrywania hybrydyzacji sondy z sekwencją docelową są dobrze znane w tej dziedzinie i obejmują testy kroplowe (ang. dot blot) i testy kroplowe odwrócone (ang. revers dot-blot).
W testach kroplowych, powielony docelowy DNA jest unieruchamiany na podłożu stałym, takim jak filtr nylonowy. Kompleks filtr-docelowy DNA inkubuje się z wyznakowaną sondą w odpowiednich
PL 191 989 B1 warunkach hybrydyzacji, niezhybrydyzowaną sondę usuwa przez przemywanie w odpowiednio ostrych warunkach i sprawdza się, czy na filtrze obecna jest związana sonda. Wykrywanie kroplowe produktu powielania PCR jest opisane na przykład w Saiki i wsp., 1986, Nature 324:163-166 i Patencie USA Nr 5468613.
W teście kroplowym odwróconym, sondy unieruchamia się na podłożu stałym, takim jak filtr nylonowy, a powielony docelowy DNA jest wyznakowany. Docelowy DNA znakuje się zwykle podczas powielania poprzez włączanie znakowanych starterów. Jeden lub oba startery mogą być wyznakowane. Kompleks filtr-sonda jest inkubowany z wyznakowanym docelowym DNA w odpowiednich warunkach hybrydyzacji, niezhybrydyzowany docelowy DNA usuwa się przez przemywanie w odpowiednio ostrych warunkach, a następnie sprawdza się czy na filtrze obecny jest związany docelowy DNA. Metody kroplowe odwrócone są opisane na przykład w Saiki i wsp., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6230 i Patencie USA Nr 5468613.
Alternatywnie, test kroplowy odwrócony może być przeprowadzany przy użyciu stałego podłoża mającego liczne miejsca hybrydyzacji z sondą lub studzienki. Przykładowo, do klinicznych zastosowań prezentowanej metody na dużą skalę szczególnie przydatna jest płytka z mikrostudzienkami. Sondy mogą być unieruchamiane na płytce z mikrostudzienkami poprzez bierne wiązanie lub przez białko pośredniczące, takie jak albumina z osocza wołu (BSA), które przywiera do mikrostudzienek płytki (patrz Tung i wsp., 1991, Bioconjugate Chem. 2:464-465). Metody kroplowe odwrócone prowadzone w płytkach z mikrostudzienkami są opisane w Patencie USA Nr 5232829; Loeffelholz i wsp., 35 1992, J. Clin. Microbiol. 30(11):2847-2851; Jackson i wsp., 1991, AIDS 5:1463-1467; Mulder i wsp., 1994, J. Clin. Microbiol. 32(2):292-300; instrukcji do testu Amplicor HIV-1 oraz instrukcji do testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR.
Korzystne jest wykrywanie i/lub oznaczanie ilościowe powielonego produktu poprzez hybrydyzację z sondą oligonukleotydową unieruchomioną w płytce z mikrostudzienkami przy zastosowaniu odczynników i protokołów z testu Amplicor HIV-1 lub testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR. Zastosowanie przedstawionych metod do ilościowego oznaczania RNA HIV-1 jest opisane dalej w przykładach.
Alternatywnie, sondy połączone z BSA są przytwierdzane do mikrocząstek magnetycznych. Związane sondy hybrydyzuje się w roztworze z wyznakowanym produktem powielania, to co powstaje usuwa się z roztworu magnetycznie. Magnetycznie unieruchomione dupleksy hybrydyzacyjne są następnie wykrywane tak, jak w metodach opisanych powyżej.
Inna odpowiednia metoda testu, określana jako test nukleazy 5' jest opisana w Patentach USA Nr 5210015 i 5487972 oraz Holland i wsp., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280. W teście nukleazy 5', wyznakowane sondy wykrywające, które zostały tak zmodyfikowane, aby zapobiec działaniu sond jako starterów dla syntezy DNA, są dodawane w czasie powielania do mieszaniny reakcyjnej. Dowolna sonda, która hybrydyzuje do docelowego DNA w czasie każdego etapu syntezy, tj. w czasie wydłużania startera, jest degradowana poprzez aktywność egzonukleazową 5' do 3' polimerazy DNA, np. polimerazy DNA Taq. Produkt degradacji pochodzący z sondy jest wtedy wykrywany. A zatem, obecność produktu rozkładu sondy wskazuje jednocześnie na zajście hybrydyzacji pomiędzy sondą i docelowym DNA oraz na zajście reakcji powielania. Patenty USA Nr 5491063 i 5571673 opisują ulepszone metody wykrywania degradacji sondy, która ma miejsce w trakcie powielania.
Sposoby przeprowadzania testów opisane powyżej zwykle wykorzystują znakowane oligonukleotydy dla ułatwienia wykrywania hybrydowych dupleksów. Oligonukleotydy mogą być znakowane poprzez przyłączenie wykrywalnych znaczników w sposób spektroskopowy, fotochemiczny, biochemiczny, immunochemiczny lub chemiczny. Użyteczne znaczniki obejmują 32P, barwniki fluorescencyjne, odczynniki o dużej gęstości elektronowej, enzymy (jak powszechnie używane w testach ELISA), biotynę lub hapteny i białka dla których dostępna jest surowica lub przeciwciała monoklonalne. Znakowane oligonukleotydy według wynalazku można syntetyzować i znakować przy użyciu technik opisanych powyżej dla syntezy oligonukleotydów.
Alternatywna metoda wykrywania powielonego kwasu nukleinowego HIV-1 poprzez śledzenie zwiększania się całkowitej ilości dwuniciowego DNA w mieszaninie reakcyjnej jest opisana w Higuchi i wsp., 1992, Bio/Technology 10:413-417; Higuchi i wsp., 1993 Bio/Technology 11:1026:-1030 oraz Europejskiej Publikacji Patentowej Nr 512334. Wykrywanie docelowego dwuniciowego DNA polega na pojawianiu się wzrostu fluorescencji po związaniu się bromku etydyny (EtBr) i innych wiążących się znaczników z dwuniciowym DNA. Znacznik wiążący się z DNA dodaje się do mieszaniny reakcyjnej do powielania. W wyniku powielenia sekwencji docelowej wzrasta ilość dwuniciowego DNA, czego rezultatem jest wykrywalny wzrost fluorescencji.
PL 191 989 B1
Startery według wynalazku mogą być też składnikiem zestawów użytecznych do powielania w reakcji PCR kwasu nukleinowego HIV-1, które stanowią jednostki złożone z wielu pojemników zawierających użyteczne składniki do przeprowadzenia przedstawionej metody. Zestaw może także zawierać środki do wykrywania powielonego kwasu nukleinowego HIV-1, takie jak sondy oligonukleotydowe. W niektórych przypadkach sondy są przytwierdzone do odpowiedniego filtru nośnikowego. Inne ewentualne składniki zestawu obejmują, przykładowo, czynnik do katalizy syntezy produktów wydłużania startera, substrat - trifosforany nukleozydów, środki stosowane do znakowania (na przykład, koniugat enzym-awidyna i substrat enzymu oraz chromogen, jeżeli znacznikiem jest biotyna), odpowiednie bufory do PCR lub reakcji hybrydyzacji oraz instrukcje dla wykonywania przedstawionej metody.
Przykłady według niniejszego wynalazku przedstawione poniżej są dostarczone jedynie dla celów ilustracji i nie ograniczają zakresu wynalazku. Liczne zastosowania wynalazku pozostające w zakresie określonym przez zastrzeżenia, które następują po przykładach, będą oczywiste dla specjalisty w tej dziedzinie na podstawie lektury powyższego tekstu i następujących przykładów.
P r z y k ł a d I
Konstrukcja standardu ilościowego
Przy oznaczaniu ilościowym zawartości wirusa, przeprowadzanym przy zastosowaniu testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR, stosuje się standard ilościowy (Quantitation Standard, QS), który powiela się przy użyciu tej samej pary starterów, ale który wykrywa się przy użyciu oddzielnej sondy. QS jest dodawany do próbki testowej w znanym stężeniu celem uzyskania sygnału stanowiącego odnośnik. Dla szerokiego zakresu stężeń sekwencji docelowych, sygnał wytworzony dla powielonej sekwencji docelowej lub powielonego QS jest proporcjonalny do ilości obecnej w próbce. Liczba kopii sekwencji docelowej jest wyliczana z porównania sygnału wytworzonego przy powielaniu nieznanej sekwencji docelowej do sygnału wytworzonego ze znanego QS.
Startery według niniejszego wynalazku powielają region, który nie jest w pełni zawarty w QS włączonym do testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR (Amplicor QS). A zatem, skonstruowano nowy QS do zastosowania ze starterami według obecnego wynalazku. Nowy QS skonstruowano z Amplicor QS poprzez wydłużenie sekwencji Amplicor QS tak, aby objąć miejsca wiązania dla SKCC1 (SEK NR ID: 3) i SKCC3 (SEK NR ID: 4). Otrzymany w rezultacie QS można wykrywać przy użyciu sondy specyficznej dla QS, stosowanej w teście AMPLICOR HIV-1 MONITOR. Konstrukcja plazmidu zawierającego nową sekwencję QS, z której transkrybowany jest RNA QS, może być przeprowadzona przy użyciu standardowych technik, jak opisano poniżej.
Amplicor QS, pochodzący z testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR, powiela się przy użyciu SK145 (SEK NR ID: 1) i SK151 (SEK NR ID: 7) w warunkach zasadniczo takich, jak opisano poniżej, w przykładzie II. W wyniku powielania uzyskuje się produkt DNA, który zawiera miejsca wiążące startery SK145 (SEK NR ID: 1) i SK151 (SEK NR ID: 7) i zachowuje wewnętrzną sekwencję, która zawiera miejsce wiązania sondy specyficznej dla QS.
Następnie uzyskany w rezultacie produkt powielania wydłuża się tak, aby obejmował miejsce wiążące dla startera SKCC1 (SEK NR ID: 3) i dodaje się łącznik celem umożliwienia klonowania produktu. Osiąga się to poprzez powtórne powielenie produktu przy użyciu SK145 (SEK NR ID: 1), wydłużonego na końcu 5' tak, aby zawierał łącznik Hindlll i SKCC1 (SEK NR ID: 3). Odpowiednie warunki powielania są opisane w Kellogg i Kwok, 1990, w PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, (wyd. Innis i wsp.) Academic Press, San Diego, CA):337-347, z tą różnicą, że stosuje się niższą temperaturę przyłączania („annealing)/wydłużanie (np., 42°C) dla umożliwienia hybrydyzacji SKCC1 (SEK NR ID: 3).
Następnie uzyskany w rezultacie powielony produkt wydłuża się dalej tak, aby obejmował miejsca wiązania startera SKCC3 (SEK NR ID: 4) i dodaje się drugi łącznik na drugim końcu dla umożliwienia klonowania produktu. Osiąga się to poprzez powielenie produktu przy użyciu SK145 (SEK NR ID: 1), wydłużonego w końcu 5' tak, aby dodać łącznik Hindlll, jak opisano powyżej, łącznie z SKCC3 (SEK NR ID: 4) wydłużonym na końcu 5' tak, aby dodać łącznik Xbal, przy użyciu tych samych warunków powielania co wyżej.
Następnie powielony produkt wstawia się do plazmidu. Powielony DNA i plazmid pSP64 (Promega, Madison, WI) trawi się oddzielnie Hindlll i Xbal, a następnie poddaje ligacji przy zastosowaniu standardowej procedury. Komórki kompetentne transformuje się zrekombinowanymi plazmidami i otrzymuje się klon, który zawiera prawidłową wstawkę. Sklonowana wstawka w wytworzonym
PL 191 989 B1 zrekombinowanym plazmidzie powinna być zsekwencjonowana dla stwierdzenia, że do startera lub miejsc wiązania sondy nie wprowadzono żadnych mutacji.
RNA QS transkrybuje się ze zrekombinowanego plazmidu, który zawiera sekwencję QS przy użycw zestawu MEGAscript™ SP6 (Amtaoą Inc^ Austin TX).
P r z y k ł a d II
Oznaczanie ilościowe RNA HIV-1
Te przykłady opisują oszacowywanie względnej wydajności powielania z różnych izolatów HIV-1. Dla porównania przeprowadzano również powielanie przy użyciu zestawu testowego AMPLICOR HIV-1 MONITOR.
Izolaty HIV-1 otrzymano z próbek klinicznych pozytywnych pod względem HIV-1. Region genu gag klonowano i sekwencjonowano przy zastosowaniu standardowych technik, a na podstawie sekwencji określano podtypy sklonowanego HIV-1. Wiele z tych izolatów HIV-1 odkryto po raz pierwszy. Do tego przykładu wybrano konkretne izolaty, które, jak można się było tego spodziewać na podstawie sekwencji nukleotydowej, mogłyby stwarzać problemy w teście AMPLICOR HIV-1 MONITOR. Dodatkowo, używano izolatów, które reprezentowały zróżnicowanie sekwencji obecne w podtypach grupy M.
Docelowy kwas nukleinowy
Dla każdego izolatu skonstruowano plazmidy zawierające region genu gag HIV-1 i matryce RNA HIV-1 transkrybowano zasadniczo tak, jak opisano w Holodniy wsp., 1991, J. Inf. Dis. 163:802-865. Przygotowywano roztwory wyjściowe każdej matrycy i oznaczano stężenie matrycy. Roztwory wyjściowe rozcieńczano na podstawie oszacowanego względnego stężenia tak, aby stężenie matrycy dodawanej do każdej reakcji było takie same. Całkowita liczba kopii matrycy dodawanej do reakcji wynosiła około 4000-8000.
Standard ilościowy
Do każdej mieszaniny reakcyjnej dodawano QS, jak opisano w przykładzie I, w znanym stężeniu, zwykle około 100 kopii na reakcję.
Startery
Reakcje A-F przeprowadzano przy użyciu następujących kombinacji starterów.
Porównanie kombinacji starterów
Reakcja Kombinacja starterów
A SK462 (SEK NR ID: 5)
SK431 (SEK NR ID: 6)
B SK145 (SEKNR ID : 1)
SK151 (SEK NR ID: 7)
C SK145 SSEKNR ID : 1)
SKCC1 (SEK NR ID: 3)
D SK145 SSEK NR ID: 1) i SK145M2 SSEK NR ID: 22)
SKCC1 (SEK NR ID: 3)
E SK145 (SEKNR ID : 1)
SKCC3 (SEK NR ID: 4)
F SK145 (SEK NR ID: η : SK145M2 SSEKNR ID: 22)
SKCC3 (SEK NR ID: 4)
Wszystkie startery były biotynylowane w końcu 5' celem umożliwienia wykrycia w teście kroplowym odwróconym, na płytkach z mikrostudzienkami. Sekwencje dodatkowych starterów nieopisanych powyżej są przedstawione poniżej, w orientacji od 5' do 3'.
PL 191 989 B1
Starter 5'
SK462 (SEK NR ID: 5) AGTTGGAGGACATCAAGCAGCCATGCAAAT
Startery 3'
SK431 (SEK NR ID: 6) TGCTATGTCAGTTCCCCTTGGTTCTCT
SK151 (SEK NR ID: 7) TGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCT
Powielanie
Reakcję powielania A przeprowadzano przy użyciu odczynników i warunków z testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR.
Reakcję powielania B przeprowadzano w mieszaninach o objętości 100 μ|, zawierających następujące odczynniki:
matryca RNA HIV-1
RNA QS mM Bicine, pH 8,3
111 mM K (OAc)
3,6 mM Mn (OAc)2
500 μM dUTP
300 μM każdego dATP, dCTP i dGTP μM dTTP
15% gliceryna
0,2 μM każdego biotynylowanego startera jednostki UNG* jednostek polimerazy DNA rTth * * wyprodukowane i wprowadzone przez Hoffmann-La Roche, a sprzedawane przez Perkin Elmer (Norwalk, CT).
Reakcje powielania C i D przeprowadzano zasadniczo w warunkach stosowanych w reakcji B, ale z następującymi zmianami:
100 mM K(OAc)
500 μM każdego dATP, dCTP i dGTP
7,5% gliceryna jednostek UNG
Reakcje powielania E i F wykonywano zasadniczo w warunkach stosowanych w reakcjach C i D, z tą różnicą, że stosowano 10% stężenie gliceryny. Niewielkie różnice w mieszaninach reakcyjnych były wynikiem uprzedniej optymalizacji warunków powielania dla każdej pary starterów.
Reakcje powielania B-F przeprowadzano w urządzeniu do powielania DNA TC9600 (Perkin Elmer, Nowalk, CT) stosując następujące profile temperatury:
Inkubacja przed reakcją: Odwrotna transkrypcja:
cykle: denaturacja: przyłączanie (annealing): wydłużanie:
cykli: denaturacja: przyłączanie (annealing): wydłużanie:
Końcowe wydłużanie:
50°C przez 2 minuty 60°C przez 30 minut; 95°C przez 10 sekund,
55°C przez 10 sekund, i 72°C przez 10 sekund; 90°C przez 10 sekund,
60°C przez 10 sekund, i 72°C przez 10 sekund; 72°C przez 15 minut;
Wykrywanie powielonego produktu poprzez hybrydyzację z sondą
PL 191 989 B1
Powielone produkty wykrywano przy użyciu odczynników i protokołów z testu AMPLICOR HIV-1
MONITOR. Szacunkowe początkowe stężenie sekwencji docelowej obliczano tak, jak tutaj opisano.
Wyniki
W metodzie ilościowej, w teście AMPLICOR HIV-1 MONITOR, początkowe stężenie sekwencji docelowej jest szacowane z porównania sygnału wytworzonego po powielaniu matrycy do sygnału wytworzonego po powieleniu znanego stężenia QS. Ponieważ znane stężenie QS jest wartością przed powieleniem, podczas gdy porównywane sygnały są sygnałami po powieleniu, zmiany w porównywanej wydajności powielenia będą wpływać na szacunek początkowego stężenia nieznanej sekwencji docelowej. Ilościowy test AMPLICOR HIV-1 MONITOR jest kalibrowany w oparciu o wydajność powielania podtypu B HIV-1. Wiadomo, że inne podtypy HIV-1 mogą być powielane z mniejszą wydajnością i że, konsekwentnie, szacunkowe stężenie matrycy będzie zaniżone w stosunku do prawdziwego stężenia.
W obecnym doświadczeniu, docelowy RNA był dodawany do każdej reakcji w znanym stężeniu. A zatem, można określić względną wydajność powielania dla każdego izolatu przez porównanie szacunkowych stężeń sekwencji docelowych. Ponieważ ilościowy test AMPLICOR HIV-1 MONITOR jest kalibrowany na podstawie wydajności powielania podtypu B, szacunkowe stężenie sekwencji docelowej dla podtypu B (klon 105-1) zastosowano jako odniesienie. Aby dokonać oceny względnej wydajności powielenia dla każdego izolatu, szacunkowe stężenie sekwencji docelowej podtypu B (klon 105-1) dzielono przez szacunkowe stężenie sekwencji docelowej dla izolatu. Te względne wydajności powielenia są przedstawione w tabeli poniżej. Zapis „---” wskazuje, że reakcja nie była wykonana.
Względna wydajność do podtypu B
| Klon | Podtyp | A | B | C | D | E | F |
| 113-1 | A | 694,3 | 1,7 | 0,9 | 1,4 | 1,4 | 0,9 |
| 113-2 | A | 19,0 | - | 1,3 | 1,1 | 1,3 | 0,6 |
| 114-1 | A | 12,4 | - | 1,4 | 1,3 | 0,7 | 0,9 |
| 114-2 | A | 9,8 | 1,2 | 1,1 | 1,8 | 1,5 | 0,8 |
| 115-1 | A | 497,6 | - | 0,8 | 1,2 | 1,0 | 1,6 |
| 115-2 | A | 646,4 | 2,4 | 1,0 | 1,5 | 0,9 | 1,4 |
| 105-1 | B | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 |
| 101-15 | C | 7,3 | - | 1,1 | 3,5 | 1,9 | 1,4 |
| 107-6 | D | 0,8 | - | 0,6 | 0,7 | 0,7 | 0,8 |
| 308-1 | D | 0,9 | - | 0,6 | 0,7 | 0,7 | 0,5 |
| 110-5 | E | 520,7 | 465,7 | 3,5 | 1,2 | 4,6 | 0,8 |
| 111-6 | E | 0,8 | - | 1,1 | 1,6 | 0,9 | 1,1 |
| 112-7 | E | 3,3 | 0,8 | 1,5 | 1,9 | 1,2 | 1,4 |
| 106-1 | G | 1,9 | - | 2,3 | 2 | 1,8 | 1,5 |
| 108-3 | G | 0,6 | - | 0,5 | 0,8 | 0,5 | 0,5 |
| 109-1 | G | 32,5 | 1,0 | 0,5 | 0,6 | 0,6 | 0,3 |
PL 191 989 B1
Wyniki pokazują, że test AMPLICOR HIV-1 MONITOR (reakcja A) powielał różne izolaty HIV-1 ze znacznie różniącymi się wydajnościami. Kilka spośród izolatów, włączając w to izolat podtypu E, klon 110-5, był powielany z wydajnością przynajmniej około 500-krotnie niższą niż wydajność powielania podtypu B, klonu 105-1.
Jakkolwiek nie wszystkie izolaty były testowane, użycie pary starterów SK145 (SEK NR ID: 1) i SK151 (SEK NR ID: 7) (reakcja B) wydaje się zwiększać w sposób znaczący jednorodność wydajności powielania. Jednakże izolat podtypu E, klon 110-5, był nadal powielany z wydajnością około 500-krotnie niższą niż wydajność powielania podtypu B, klonu 105-1.
Użycie SK145 (SEK NR ID: 1) i SKCC1 (SEK NR ID: 3) (reakcja C) umożliwiło powielenie wszystkich izolatów, włączając w to izolat podtypu E, klon 110-5, z wydajnością około trzy razy mniejszą od wydajności powielania podtypu B, klonu 105-1. Dodanie SK145M2 (SEK NR ID: 2) (reakcja D) dalej zwiększa wydajność powielania izolatu 110-5, która staje się zasadniczo równa wydajności dla szczepu odnośnikowego, podtypu B.
Podobnie, użycie SK145 (SEK NR ID: 1) i SKCC3 (SEK NR ID: 4) (reakcja E) umożliwia powielanie wszystkich izolatów, włączając w to izolat podtypu E, klon 110-5, z wydajnością około 5-krotnie niższą od wydajności powielania podtypu B, klonu 105-1. Dodanie SK145M2 (SEK NR ID: 2) (reakcja F) dalej zwiększa wydajność powielania izolatu 110-5, która staje się zasadniczo równa wydajności dla szczepu odnośnikowego, podtypu B.
P r z y k ł a d III
Oznaczanie ilościowe HIV-1 w próbkach klinicznych
W tym przykładzie 30 próbek klinicznych otrzymanych od seropozytywnych pacjentów z Senegalu było testowanych pod kątem obecności RNA HIV-1. Podtypy obecne w próbkach klinicznych nie były określane. Jednakże, ponieważ podtypy A i D są powszechne w tych regionach Afryki, oczekiwano, że niektóre z próbek klinicznych bądź nie będą powielane, bądź nie będą powielane wydajnie przy użyciu testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR.
Próbki przygotowywano jak następuje. Próbki osocza (80-250 μΙ) mieszano z 20 μΙ 0,25% (w/v) czerwonych polistyrenowych mikrokulek Estapor (Bangs Laboratories, Inc., Carmel, IN) w 1,5 ml stożkowych probówkach wirowniczych i wirowano przez 1 godzinę przy 25300 x g w 4°C. Supernatant odsysano i osad zawieszano w 250 μl buforu lizującego (50 μl buforu lizującego zawiera 6,7 μl 30 jedn./p^l RNazyny (Promega, Madison, WI); 0,67 μl 100 mM DTT; 2 μl 10% NP40 (Pierce, Rockford, IL); 0,25 μl 4 mg/ml poly-rA RNA oraz 40,4 μl H2O traktowanej DEPC). Osady inkubowano w temperaturze pokojowej przez przynajmniej 15 minut i mieszano dokładnie na worteksie.
Powielanie prowadzono w 100 μl mieszanin reakcyjnych zawierających 50 μl roztworu lizatu wirusowego i 50 μl 2 x stężonych odczynników do powielania dobranych tak, aby końcowe stężenie odczynników było takie, jak opisano powyżej. Do każdej mieszaniny reakcyjnej dodawano około 100 kopii odpowiedniego QS jako część mieszaniny odczynników. Wykrywanie powielonego produktu wykonywano przy użyciu odczynników i protokołów z testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR, tak jak opisano powyżej.
Powielanie każdej próbki przeprowadzano przy użyciu następującej kombinacji starterów.
Porównywane kombinacje starterów
Reakcja Kombinacja starterów
A SK462 (SEK NR ID: 5)
SK431 (SEK NR ID: 6)
B SK145 (SEK NR ID: 1)
SKCC1 (SEK NR ID: 3)
C SK145 (SEK NR ID: 1) i SK145M2 (SEK NR ID: 2)
SKCC1 (SEK NR ID: 3',
Wyniki, wyrażone w ilości kopii matrycy HIV-1 na ml osocza, są zebrane poniżej.
PL 191 989 B1
Szacunkowe stężenie sekwencji docelowej (kopie/ml)
| Izolat | A | B | C | ||
| Powtórzenie | Powtórzenie | ||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| DKN 035 | 0 | 800 | 1860 | 1600 | 1100 |
| DKN 079 | 360 | 30060 | 37240 | 91780 | 152300 |
| DKN 154 | 1140 | 21660 | 54560 | 68820 | 67120 |
| DKN 162 | 0 | 16020 | 25980 | 64340 | 21880 |
| DKN 162 | 0 | 12180 | 10520 | 14300 | 18320 |
| DKN 169 | 0 | 3140 | 7000 | 5651 | 8047 |
| DKN 171 | 1180 | 640 | 500 | 560 | 1040 |
| DKN 282 | 560 | 3400 | 4360 | 5560 | 3460 |
| DKN 402 | 340 | 4260 | 10520 | 7000 | 5060 |
| MBN 26 | 27740 | 16940 | 19220 | 16700 | 18680 |
| MBN 31 | 180 | 1820 | 1820 | 1720 | 2240 |
| MBN 34 | 840 | 2160 | 2200 | 3100 | 3120 |
| MIH 002 | 2320 | 51320 | 121100 | 144180 | 123900 |
| MIH 012 | 2960 | 33620 | 40920 | 40740 | 75840 |
| MIH 013 | 30360 | 31980 | 55360 | 42800 | 71220 |
| MIH 030 | 17625 | 178500 | 273938 | 169750 | 189625 |
| MIH 053 | + | 534960 | 231620 | 530900 | 878340 |
| MIH 055 | 10560 | 43960 | 54220 | 49400 | 37400 |
| MIH 074 | 5700 | 3980 | 6020 | 3640 | 4940 |
| MIH 112 | 30480 | 271980 | 490780 | 423600 | 416140 |
| MIH 157 | 520 | 165480 | 82920 | 169980 | 146320 |
| MIN 003a | 1300 | 57720 | 21620 | 35380 | 34560 |
| MIN 003b | 1760 | 32820 | 30940 | 27760 | 26600 |
| MIN 017 | 540 | 437380 | 375120 | 447740 | 902780 |
| MIN 067 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
PL 191 989 B1
c.d. tabeli
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| MIN 126 | 44320 | 63600 | 38460 | 56680 | 40300 |
| MIN 139 | 460 | 146320 | 142800 | 94520 | 105600 |
| MIN 146 | 200 | 49920 | 32100 | 19900 | 30400 |
| MIN 217 | 0 | 3220 | 1880 | 2320 | 2580 |
| MIN 589 | 154780 | 267740 | 127100 | 144160 | 228040 |
Wyniki wskazują, że startery według niniejszego wynalazku, kombinacje B i C, umożliwiają powielanie z większości próbek klinicznych. Kombinacje starterów B i C umożliwiają powielanie ze wszystkich 30 próbek oprócz 1. W przeciwieństwie do tego, w teście AMPLICOR HIV-1 MONITOR nie udało się powielić 6 z 29 próbek. Powielenie próbki MIH 053 przy użyciu testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR dało silny sygnał sekwencji docelowej, ale nie uzyskano sygnału dla QS. A zatem, próbki nie można było oznaczyć ilościowo i jest ona zaznaczona jako „+” w powyższej tabeli.
Ponadto, dla znacznej liczby próbek, liczba kopii oszacowana przy użyciu kombinacji B lub C była znacznie wyższa od oszacowanej przy użyciu testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR. Biorąc pod uwagę zróżnicowanie wydajności powielania wykazanej w przykładzie 2, powyżej, niższe szacunki stężenia matrycy otrzymane przy użyciu testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR są prawdopodobnie wynikiem znacznie niższych wydajności powielania.
Wirusowy RNA nie został wykryty w próbce MIN 067. Jednakże nie wiadomo, czy to jest spowodowane nie uwidocznionym zróżnicowaniem sekwencji docelowej, które przeszkadza bądź w hybrydyzacji ze starterem, bądź sondą hybrydyzacyjną czy jakimiś innymi przyczynami.
P r z y k ł a d IV
Zestawy do oznaczania ilościowego RNA HIV-1
W przykładzie opisano zestaw do oznaczania ilościowego RNA HIV-1 przy użyciu starterów i wewnętrznego standardu oznaczenia ilościowego według wynalazku w warunkach reakcji opisanych w przykładzie II.
W przykładzie II opisano powielanie i wykrywanie RNA HIV-1 przy użyciu starterów i wewnętrznego standardu oznaczenia ilościowego według wynalazku, ale przy użyciu składników i protokołu dostępnego w handlu zestawu AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test zarówno do przygotowania próbek i wykrywania amplifikowanego kwasu nukleinowego. Podobnie, zestaw przeznaczony jest do stosowania w połączeniu z dostępnym w handlu zestawem AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test i dostarcza składników niezbędnych do powielania przy użyciu starterów i standardu oznaczenia ilościowego według wynalazku w warunkach reakcji opisanych w przykładzie II.
Jak to opisano w ulotce dołączonej do produktu, AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test zawiera odczynniki na 24 oznaczenia dostarczone jako następujące osobno zapakowane składniki:
A. Odczynniki do przygotowania próbek AMPLICOR HIV-1 MONITOR
AMPLICOR HIV-1 MONITOR LYSIS REAGENT * AMPLICOR HIV-1 MONITOR QUANTITATION STANDARD AMPLICOR HIV-1 MONITOR SPECIMEN DILUENT
B. Kontrole AMPUCORHIV-1 MONITOR
NEGATIVE PLASMA (HUMAN)
AMPLICOR HIV-1 MONITOR (-) CONTROL AMPLICOR HIV-1 MONITOR (+) CONTROL AMPLICOR HIV-1 MONITOR HIGH (+) CONTROL
C. Odczyn niki do powielania AMPLKSOR HIV-1 MONITOR * AMPLICOR HIV-1 MONITOR MASTER MIX * AMPLICOR HIV-1 MONITOR MANGANESE SOLUTION
D. Odczynniki do wykrywania AMPLUDOR HIV-1 MONITOR
MONITOR DENATURATION SOLUTION
PL 191 989 B1
MONITOR HYBRIDIZATION BUFFER
AMPLICOR® AVIDIN-HRP CONJUGATE
AMPLICOR SUBSTRATE A
AMPLICOR SUBSTRATE B
AMPLICOR STOP REAGENT
AMPLICOR 10X-WASH CONCENTRATE
AMPLICOR HIV-1 MONITOR MWP * składniki zastąpione przez składniki niniejszego zestawu
Niniejszy zestaw dostarcza zastępczych odczynników do powielania (Master Mix (mieszanina podstawowa) i Manganese Solution (roztwór manganu)) i standard oznaczenia ilościowego, które są stosowane w miejsce składników zestawu AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test. Dla wygody, składniki pakowane są jako bezpośrednio zastępujące odpowiednie składniki zestawu AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test. Tak więc, protokół AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test może być stosowany bez zmian innych niż zastosowanie składników niniejszego testu tam gdzie to konieczne. Składniki zestawu opisano poniżej.
A. Standdrdoonaaczniail ośśioweeg:dwieproobwkizawierająccppo0 ml n astęęująccegrootworu:
100 kopii/μΙ standardu oznaczenia ilościowego opisanego w przykładzie I mM Tris-HCl pH 8,0
0,1 mM EDTA μg/ml poli rA RNA
0,05% azydek sodu (jako konserwant)
B. Mieszanina podstawowa HIV-1: dwie probówki zawierające po 0,5 ml następującego roztworu:
120 mM Bicine pH 8,3
240 mM K(OAc)
1200 μΜ dUTP
1200 μΜ każdego z: dATP, dCTP i dGTP
120 μΜ dTTP
18% gliceryna
0,48 μΜ każdego z biotynylowanych starterów jednostki UNG* jednostki polimerazy DNA rTht*
0,05% azydek sodu jako konserwant * wytwarzana i opracowana przez Hoffmann-La Roche i sprzedawana przez Perkin-Elmer (Norwalk, CT).
C. Roztwór manganowy: jedna probówka zawierająca minimum 200 μΙ 432 mM Mn(OAc)2 z 0,05% azydkiem sodu jako konserwantem.
Stężenia powyższych składników zestawu są takie, że podczas stosowania według protokołu AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, powielanie przeprowadza się w warunkach opisanych w przykładzie II.
Jak to opisano w przykładzie II, wszystkie startery są biotynylowane na końcu 5' w celu umożliwienia wykrywania w formacie płytki mikrostudzienkowej metodą odwróconego dot-blot, z użyciem odczynników do wykrywania AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test. Mieszanina podstawowa opisana wyżej przeznaczona jest do stosowania z SK145 (Identyfikator Sekw. nr 1) i SKCC1 (Identyfikator Sekw. nr 3). Ewentualnie, dodaje się SK145M2 (Identyfikator Sekw. nr 2) w tym samym stężeniu. Podczas stosowania SK145 (Identyfikator Sekw. nr 1) i SKCC3 (Identyfikator Sekw. nr 4) z lub bez dodania SK145M2 (Identyfikator Sekw. nr 2) mieszaninę podstawową przygotowuje się z gliceryną w stężeniu 24%.
Powyższy zestaw dostarcza jedynie składników nie dostarczanych w dostępnym w handlu zestawie AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test. Jednakże, oczywiste jest, że niektóre albo wszystkie składniki zestawu AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test mogą być pakowane wraz z powyższymi składnikami zapewniając alternatywne konfiguracje zestawu. Ponadto, jest oczywiste, że składniki mogą być dostarczone w różnych ilościach i/lub stężeniach wraz z odpowiednią zmianą w protokole do zestawu.
PL 191 989 B1
Lista sekwencji (1) Informacja ogólna:
(i) Zgłaszający:
(A) Nazwisko: F.Hoffmann-La Roche AG (B) Ulica: Grenzacheestrasse 124 (C) Bazylea (E) Państwo: Szwajcaria (F) Kod pocztowy : CH-4070 (G) Telefon: 061 6883782 (H) Telefax: 061 6881395 (I) Telex: 962292/965542 hlr ch (ii) Tytuł zgłoszenia: Startery do wykrywania HIV-1 (iii) Liczba sekwencji: 7 (iv) Sposób odczytu komputerowego:
(A) Typ nośnika: Dyskietka (B) KompuUer: Apple Macintosh (C) System operacyjny: System 7.1 (Maaintosh) (D) Oprogramowanie: Word 5.1 (v) Data poprzedniego zgłoszenia:
(A) Numer zgłoszenia: 60-037744 (B) Data zgłoszenia: 17.01.97 (2) Informacja o SEK NR ID: 1:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 30 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (i±) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis Sekwencji: SEK NR ID: 1:
AGTGGGGGGA CATCAAGCAG CCATGCAAAT (2) Informacja o SEK NR ID: 2:
PL 191 989 B1 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 30 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: lćnówwa (ii.) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis Sekwencji: SEK NR ID: 2:
AGTGGGGGGA CACCAGGCAG CAATGCAAAT (2) Informacja o SEK NR ID: 3:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 28 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: Mniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis Sekweenji: SEK NR ID: 3:
TACTAGTAGT TCCTGCTATG TCACTTCC (2) Informacja o SEK NR ID: 4:
(i) Charakterystyka sekweenji:
(A) Długość: 26 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niei: pojedyncza (D) Topologia: Ma^wa (ii) Typ jząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis Sekweenji: SEK NR ID: 4:
TGAAGGGTAC TAGTAGTTCC TGCTAT
PL 191 989 B1 (2) Informacja o SEK NR ID: 5:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 30 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: lćniwwa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis Sekwennji: SEK NR ID: 5:
AGTTGGAGGA CATCAAGCAG CCATGCAAAT (2) Informacja o SEK NR ID: 6:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 27 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: l^norowa (ii)) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis Sekweenji: SEK NR ID: 6:
TGCTATGTCA GTTCCCCTTG GTTCTCT (2) Informacja o SEK NR ID: 7:
(i) Charakterystyka sekwennji:
(A) Długość: 27 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: lćnówwa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Opis Sekwencji: SEK NR ID: 7:
TGCTATGTCA CTTCCCCTTG GTTCTCT
Claims (9)
1. Starter oligonukleotydowy do powielania kwasu nukleinowego ludzkiego wirusa niedoboru odporności tdps 1 (HIV-1), któtd to uesutot nlionokklonedOnwd jout wyOtsud z otspd złnżnooj z SKCC1 (SEK NR ID: 3) i SKCC3 (SEK NR ID: 4).
2. Parastarteotw oligoouSleotyddwydCsUłandrąccsięz SS144 (SSE NN l D: 11 i SSKC1 (SSE NR ID: 3) IsO SK145 (SEK NR ID: 1) i SKCC3 (SEK NR ID: 4).
3. UkłaSstarterów oligoouSleotyddwydCzłoOżon z post starterów oligoouSleotyddwydCo0ruglOt udch w zruttz. 2 i SK145M2 (SEK NR ID: 2).
4. Zeotaw Po wydłuwysia kwaru nuSIeinnweoo l udoZleoo wirusa nie0o0oru οΟορ™<^ϊ lypo 1 (HIV-1), znamienny tym, żo zswiots utrttot olioousklootddowd oktośloud w zruttz. 1.
5. Zegtew do w^^^łt^d^^r^ić^ kł^^^ui nuSIeinowago luddZiego wht^^^ niegoOoru o0porno0śi typo 1 (HIV-1), znamienny tym, żo zswiots prtę utsttotów olioousklootdoowdch oktoślouą w zruttz. 2.
6. Zegtew do wakłuwasie kwasu nuSIeinowago ludoklego wirusa niegoOoru o0pprno0śi Pt^f^u 1 (HIV-1), znamienny tym, żo zswiots zoutrw utrttotów olioousklootdoowdch oktośloudch w zruttz. 3.
7. Sposób powielania kwasu nukleinowego ludzkiego wirusa niedoborts odporności typu 1 (HIV-1), znamienny tym, żo oOojmsjo ptzoptowsOzouio torkcji łrńcschowoj polimotrzd ptzd zrutouowruis SKCC1 (SEK NR ID: 3) lsO SKCC3 (SEK NR ID: 4) jrko „utrttotr 3'.
8. SppoabwaOłud zzsuz.7, z znmieeny tym, żż reoScjęłaScudhowypplimeraszpuzzouuwaSoa uię utousjąc SK145 (SEK NR ID: 1) i SKCC1 (SEK NR ID: 3) lsO utousjąc SK145 (SEK NR ID: 1) i SKCC3 (SEK NR ID: 4).
9. SppoabwaOłud zzsuz.8, zznn^^^enn yyn^, żż reoScjęłaScudhowypplimerarzpuzzouuwaroa uię utousjąc tówuioż SK145M2 (SEK NR ID: 2).
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US3774497P | 1997-01-17 | 1997-01-17 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL324327A1 PL324327A1 (en) | 1998-07-20 |
| PL191989B1 true PL191989B1 (pl) | 2006-07-31 |
Family
ID=21896067
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL324327A PL191989B1 (pl) | 1997-01-17 | 1998-01-16 | Starter oligonukleotydowy do powielania kwasu nukleinowego ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1), para starterów oligonukleotydowych, układ starterów oligonukleotydowych, zestawy do wykrywania kwasu nukleinowego ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) i sposób powielania kwasu nukleinowego ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5908743A (pl) |
| EP (1) | EP0854197B1 (pl) |
| JP (1) | JP2838084B2 (pl) |
| KR (1) | KR100257438B1 (pl) |
| CN (1) | CN1208469C (pl) |
| AT (1) | ATE345400T1 (pl) |
| AU (1) | AU693066B1 (pl) |
| BR (1) | BRPI9800337B8 (pl) |
| CA (1) | CA2222769C (pl) |
| CZ (1) | CZ288064B6 (pl) |
| DE (1) | DE69836395T2 (pl) |
| DK (1) | DK0854197T3 (pl) |
| ES (1) | ES2276436T3 (pl) |
| HU (1) | HU223384B1 (pl) |
| IL (1) | IL122906A (pl) |
| NO (1) | NO323157B1 (pl) |
| PL (1) | PL191989B1 (pl) |
| RU (1) | RU2186112C2 (pl) |
| TW (1) | TW400386B (pl) |
| UA (1) | UA47432C2 (pl) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19850186A1 (de) * | 1998-10-30 | 2000-05-25 | Roche Diagnostics Gmbh | Neue Primer und Sonden zum Nachweis von HIV |
| DE19900511C2 (de) * | 1999-01-08 | 2001-03-15 | Deutsches Krebsforsch | Molekularbiologische Marker für die analytische Elektronenmikroskopie |
| US6245511B1 (en) * | 1999-02-22 | 2001-06-12 | Vialogy Corp | Method and apparatus for exponentially convergent therapy effectiveness monitoring using DNA microarray based viral load measurements |
| CA2731495C (en) * | 2000-09-01 | 2015-02-03 | Gen-Probe Incorporated | Amplification of hiv-1 sequences for detection of sequences associated with drug-resistance mutations |
| US6582920B2 (en) | 2000-09-01 | 2003-06-24 | Gen-Probe Incorporated | Amplification of HIV-1 RT sequences for detection of sequences associated with drug-resistance mutations |
| US6770752B2 (en) | 2001-01-09 | 2004-08-03 | Becton, Dickinson And Company | Sequences for detection of HIV-1 |
| EP1317960A1 (en) * | 2001-12-06 | 2003-06-11 | PamGene B.V. | System and method for analyzing a blood sample and disposable cartridge for use in this system or method |
| WO2004094986A2 (en) * | 2003-04-16 | 2004-11-04 | Handylab, Inc. | System and method for electrochemical detection of biological compounds |
| EP1792263A2 (en) | 2004-09-02 | 2007-06-06 | Vialogy Corporation | Detecting events of interest using quantum resonance interferometry |
| ES2610781T3 (es) * | 2004-09-14 | 2017-05-03 | Argos Therapeutics, Inc. | Amplificación de patógenos independiente de la cepa y vacunas para estos |
| CN100340673C (zh) * | 2005-02-03 | 2007-10-03 | 上海科华生物工程股份有限公司 | 人类免疫缺陷病毒hiv－1核酸扩增－荧光定量检测试剂盒 |
| RU2350650C2 (ru) * | 2006-04-17 | 2009-03-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Биосинтез" (ООО "Биосинтез") | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pVar15-HIV-LTR, НЕСУЩАЯ КЛОНИРОВАННЫЙ ФРАГМЕНТ ГЕНОМА ВИЧ-1 ТИПА ИЗ КОНСЕРВАТИВНОГО УЧАСТКА 5'-LTR ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pBluKSM-HIV-LTR mod, НЕСУЩАЯ КЛОНИРОВАННЫЙ МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ФРАГМЕНТ ЭТОГО ЖЕ УЧАСТКА ГЕНОМА ВИЧ-1 ТИПА, ТЕСТ-НАБОР ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ЭКСПРЕСС-ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНОМА ВИЧ-1 ЛЮБОГО ТИПА В ПРОБЕ И СПОСОБ С ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ |
| CN101144771B (zh) * | 2006-09-11 | 2012-05-30 | 中山大学达安基因股份有限公司 | 检测人类免疫缺陷病毒的试剂盒 |
| ES2582602T3 (es) | 2007-03-28 | 2016-09-14 | Signal Diagnostics | Sistema y método de análisis de alta resolución de ácidos nucleicos para detectar variaciones de secuencia |
| US8221981B2 (en) * | 2007-07-30 | 2012-07-17 | Argos Therapeutics, Inc. | Primers and probes for the amplification and detection of HIV Gag, Rev and Nef polynucleotides |
| US10669574B2 (en) | 2008-11-18 | 2020-06-02 | XCR Diagnostics, Inc. | DNA amplification technology |
| US10113206B2 (en) * | 2010-02-24 | 2018-10-30 | Grifols Therapeutics Inc. | Methods, compositions, and kits for determining human immunodeficiency virus (HIV) |
| UY34128A (es) * | 2011-06-15 | 2013-01-31 | Grifols Therapeutics Inc | Métodos, composiciones y kits para determinar el virus de la inmunodeficiencia humana (vih)?. |
| KR102323375B1 (ko) | 2013-10-09 | 2021-11-08 | 플루어레센트릭 인코포레이티드 | 다중 프로브 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5386022A (en) * | 1985-03-28 | 1995-01-31 | Hoffman-La Roche Inc. | Primes and probes for the amplification and detection of aids associated nucleic acids |
| US5389512A (en) * | 1988-10-07 | 1995-02-14 | Hoffman-La Roche Inc. | Method for determining the relative amount of a viral nucleic acid segment in a sample by the polymerase chain reaction |
| CA2013317A1 (en) * | 1989-04-17 | 1990-10-17 | Fred T. Oakes | Diagnostic kit, primer composition and their use for replication or detection of nucleic acids |
| US5196305A (en) * | 1989-09-12 | 1993-03-23 | Eastman Kodak Company | Diagnostic and amplification methods using primers having thymine at 3' end to overcome primer-target mismatch at the 3' end |
| CA2031659A1 (en) * | 1990-01-26 | 1991-07-27 | John B. Findlay | Water-insoluble reagent, nucleic acid probe, test kit and diagnostic and purification methods |
| US5695926A (en) * | 1990-06-11 | 1997-12-09 | Bio Merieux | Sandwich hybridization assays using very short capture probes noncovalently bound to a hydrophobic support |
| KR100325554B1 (ko) * | 1993-03-26 | 2002-11-02 | 젠-프로브 인코포레이티드 | 사람의면역결핍 바이러스타입1의검출 |
| WO1995003430A1 (en) * | 1993-07-23 | 1995-02-02 | Gen-Probe Incorporated | Methods for enhancing nucleic acid amplification |
| WO1995014109A1 (en) * | 1993-11-19 | 1995-05-26 | U.S. Department Of The Army | High through-put quantitative polymerase chain reaction for hiv clinical specimens |
| US5665545A (en) | 1994-11-28 | 1997-09-09 | Akzo Nobel N.V. | Terminal repeat amplification method |
| US5599662A (en) * | 1995-02-17 | 1997-02-04 | Hoffmann-La Roche Inc. | Oliconucleotide primers and probes for the detection of HIV-1 |
| US5702926A (en) * | 1996-08-22 | 1997-12-30 | Becton, Dickinson And Company | Nicking of DNA using boronated nucleotides |
-
1997
- 1997-12-17 CA CA002222769A patent/CA2222769C/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-01-08 EP EP98100196A patent/EP0854197B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-08 DK DK98100196T patent/DK0854197T3/da active
- 1998-01-08 DE DE69836395T patent/DE69836395T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-08 AT AT98100196T patent/ATE345400T1/de active
- 1998-01-08 ES ES98100196T patent/ES2276436T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-09 CN CNB981039111A patent/CN1208469C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-09 US US09/004,949 patent/US5908743A/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-12 IL IL12290698A patent/IL122906A/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-01-14 HU HU9800053A patent/HU223384B1/hu active IP Right Grant
- 1998-01-16 UA UA98010265A patent/UA47432C2/uk unknown
- 1998-01-16 RU RU98100921/13A patent/RU2186112C2/ru active
- 1998-01-16 BR BRPI9800337A patent/BRPI9800337B8/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-01-16 KR KR1019980001164A patent/KR100257438B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-16 CZ CZ1998149A patent/CZ288064B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-01-16 PL PL324327A patent/PL191989B1/pl unknown
- 1998-01-16 AU AU52099/98A patent/AU693066B1/en not_active Expired
- 1998-01-16 NO NO19980212A patent/NO323157B1/no not_active IP Right Cessation
- 1998-01-17 TW TW087100609A patent/TW400386B/zh not_active IP Right Cessation
- 1998-01-19 JP JP10007466A patent/JP2838084B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0727497B1 (en) | Primers and probes for the detection of HIV | |
| JP3936798B2 (ja) | Ｒｎａ標的配列の増幅方法 | |
| EP0776981B1 (en) | Oligonucleotide primers for amplifying HCV nucleic acid | |
| EP0887427B1 (en) | Amplification and detection of hiv-1 and/or hiv-2 | |
| US5112734A (en) | Target-dependent synthesis of an artificial gene for the synthesis of a replicatable rna | |
| EP0658212B1 (en) | Method, reagent and kit for the detection and amplification of nucleic acid sequences | |
| EP1002138B1 (en) | Nucleic acid sequences that can be used as primers and probes in the amplification and detection of all subtypes of hiv-1 | |
| PL191989B1 (pl) | Starter oligonukleotydowy do powielania kwasu nukleinowego ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1), para starterów oligonukleotydowych, układ starterów oligonukleotydowych, zestawy do wykrywania kwasu nukleinowego ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) i sposób powielania kwasu nukleinowego ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) | |
| EP1244813B1 (en) | Amplification based polymorphism detection | |
| US5955598A (en) | Primer compositions and kits for detecting hepatitis B virus | |
| US7105318B2 (en) | Specific and sensitive nucleic acid detection method | |
| US6294326B1 (en) | Analyte detection process using dual labeled probes | |
| EP0872561B1 (en) | Neisseria gonorrhoae-specific oligonucleotides | |
| HK1010896B (en) | Primers for the detection of hiv-1 | |
| MXPA98000480A (en) | Cebadores for vi detection |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RECP | Rectifications of patent specification |