CZ14998A3 - Způsob detekce HIV-1 - Google Patents
Způsob detekce HIV-1 Download PDFInfo
- Publication number
- CZ14998A3 CZ14998A3 CZ98149A CZ14998A CZ14998A3 CZ 14998 A3 CZ14998 A3 CZ 14998A3 CZ 98149 A CZ98149 A CZ 98149A CZ 14998 A CZ14998 A CZ 14998A CZ 14998 A3 CZ14998 A3 CZ 14998A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- seq
- hiv
- nucleic acid
- primers
- primer
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
- C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/81—Packaged device or kit
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Virology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Dental Preparations (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
Oblast techniky
Vynález se týká oblasti molekulární biologie a chemie nukleových kyselin. Blíže se zabývá způsoby a reakčními činidly k detekci viru lidské imunitní nedostatečnosti typu 1 (HIV-1). Vynález má tedy použití v medicíně všeobecně, v lékařské diagnostice zvláště a v oboru molekulární biologie.
Dosavadní stav techniky
Vynález způsobů zesilování specifických sekvencí nukleových kyselin, zejména polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction PCR), umožňuje rychlou detekci nukleových kyselin obsažených ve vzorku tak malého množství, jež bylo dosud považováno za nezjistitelně malé (americké patentové spisy číslo 4 683 195, 4 683 202 a 4 965 188). Rozvoj a aplikace PCR jsou bohatě popsány v literatuře (například PCR Technology principles and aplications for DNA amplification, 1989, vydavatel H.A. Erlich, Stockton Press, New York, NY; PCR Protocols: A guide to methods and applications, 1990, M.A.Innis a kol., Academie Press, San Diego, CA; a PCR Strategies, 1995, vydavatel M.A.Innis a kol., Academie Press, San Diego CA. Obchodní spolčenosti jako Perkin Elmer (Norwalk, CT) obchodují s reagenciemi PCR a publikují návody pro PCR.
Použití PCR a sondy hybridizace k zesilováni a k detekci nukleové kyseliny HIV-1 jsou přehledně popsány v literatuře (například Kwok, Ann. Med 24, str. 211 až 214, 1992, a Coutlee a kol. Mol. Cell. Probes 5, str. 241 až 259 1991). Zkoušky detekce HIV-1, založené na PCR, jsou popsány v litratuře rovněž (například americké patentové spisy číslo 5 008182 a 5 176775; Kellogg a Kwok, Protocols PCR; A Guide to Methods and Applications, vydavatel Innis a kol., Academie Press, San Diego, CA: 337 až 347, 1990,; Holodnyi a kol., J.Inf.Dis. 163, str. 802 až 865, 1991; Jackson a kol., AIDS 5, str. 1463 až 1467, 1991;
a Mulder a kol., J. Clin. Microbiol. 32 (2), str. 292 až 300, 1994.
Komerční kity k zesilování a k detekci HIV-1 jsou obchodně dostupné (společnost Hoffmann-La Roche, Nutley, NJ) . Test Amplicor™ HIV-1 je zkouškou in vitro k detekci provirální DNA HIV-1. Test AMPLICOR HIV-1 MONITOR™ je zkouškou in vitro pro kvantifikaci RNA HIV-1. Obě zkoušky Amplicor zesilují nukleové kyseliny HIV-1 pomocí příměrového páru SK462 (SEQ ID NO=5) a SK431 (SEQ ID N0 = 6) a popsal je Mulder a kol. (J. Clin. Microbiol 32 (2), str. 292 až 300, 1994) a označil jako Amplicor HIV-1 primery.
HIV-1 vykazuje značnou proměnlivost genomické sekvence. Phylogenetickou analysu sekvencí nukleových kyselin HIV-1 gag a env genu popsal Myers a kol. (Human Retrovirus and AIDS 1993, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM) . Ve skupině M jsou identifikovány subtypy A-J.
Běžné techniky molekulární biologie a chemie nukleových kyselin odpovídající dnešnímu stavu techniky jsou vysvětleny v literatuře (například Sambrok a kol., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 1989; 01igonucleotide Synthesis, vydavatel M. J. Gait, 1984; Nucleic Acid Hybridization, vyd. B.D. Hames a
S.J. Higgins, 1984; a serie Methods in Enzymology, Academie Press, lne.).
Byla identifikována řada isolátů viru lidské imunitní nedostatečnosti typu I (HIV-1) skupiny M, které jsou nebo nejsou účinně zesil i tel né pomocí dříve popsaných primerů gag genu, zejména primerů Amplicor HIV-1, SK462 (SEQ ID NO:5) a SK431 (SEQ ID N0:6). Tyto izoláty vykazují dříve nepozorovanou proměnlivost sekvencí uvnitř oblasti zahrnující primerní vazební místa primerů Amplicor HIV-1.
Úkolem vynálezu je poskytnout zlepšené primery, které umožní účinné zesílení nově objevených izolátu vedle všech i zolátů zesí1 i telných primery Amplicor HIV-1.
Kromě toho pr i mery podle vynálezu by měly umožňovat zesílení všech známých
M izollátů známé HIV-1 skupiny s téměř rovnoměrnou úč i nností.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je oligonuk1eotidový primer k zesilování nukleové kyseliny viru lidské imunitní nedostatečnosti typu 1 (HIV-1), přičemž oligonukleotidový primer je volen ze souboru, který tvoří SKCCI (SEQ ID NO:3) a SKCC3 (SEQ ID NO:4)
Vynález se týká zlepšených oligonukleotidových primerů, které umožňují zesílit PCR oblasti genu gag ze skupiny izolátů HIV-1 skupiny M ze subtypů A-G s téměř rovnoměrnou účinností a bez současného zesílení necílových sekvencí.
Zejména se vynález týká oligonukleotidových primerů k zesilování nukleové kyseliny viru lidské imunitní nedostatečnosti typu 1 (HIV-1), přičemž oligonukleotidový primer je volen ze souboru zahrnujícího SKCCI (SEQ ID NO = 3) a SKCC3 (SEQ ID NO:4).
S výhodou je každý z těchto primerů kombinován v páru oligonukleotidových primerů, který tvoří SK145 (SEQ ID NO:1) a SKCCI (SEQ ID N0:3) nebo v páru oligonukleotidových primerů tvořeného SKI45 (SEQ ID NO:1) a SKCC3 (SEQ ID NO=4).
V dalším provedení mohou být tyto páry primerů kombinovány s primerem SK145M2 (SEQ ID NO:2) v souboru oligonukleotidových primerů SKI45 (SEQ ID NO:1), SKCCI (SEQ ID NO:3) a SK145M2 (SEQ ID NO:2) nebo v souboru oligonukleotidových primerů tvořených oligonukleotidovými primery SKI45 (SEQ ID NO:1), • ·
SKCC3 (SEQ ID NO:4) a SK145M2 (SEQ ID NO:2).
Vynález se dále týká zlepšených způsobů zesilování oblas ti genu gag ze subtypů HIV-1 skupiny M, které představují vynesení PCR pomocí primerů podle vynálezu.
Vynález se dále týká kitů, které obsahují zesilovací pri mer podle vynálezu. Tyto kity mohou obsahovat přídavná reakční činidla, jako jsou detekční sondy nebo jedno nebo několik ze silujících reakčních činidel, například polymerázu, pufry a nukleosidtri fosf áty.
Pro usnadnění pochopení vynálezu, je dále podána definice některých pojmů.
Pojmy nukleová kyselina a oligonukcleotid se týkají polydeoxyribonukleotidů (obsahujících 2-deoxy-D- ribosu) a polyribonukleotidů (obsahujících D-ribósu) a polynukleotidu jaké hokoli typu, který je N glykosidem purinové nebo pyrimidinové báze nebo modifikované purinové nebo pyrimidinové báze. Není
Tyto pojmy informují pouzáměrem rozlišovat délku nukleové kyseliny a oligonukleotidu a těchto pojmů se používá zaměnitelně.
ze o primární struktuře molekuly.
DNA s dvojitým nebo jednoduchým
Tyto pojmy tudíž zahrnují řetězcem stejně jako RNA s dvojitým nebo jednoduchým řetězcem.
igonukleotidy lze připravovat jakýmkoli vhodným způso bem, včetně například klonování, restrikce příslušných sekvencí nebo přímou chemickou synthesou způsob (Narang a kol., Meth. Enzymol.
fosfodiesterový způsob (Brown a kol., jako je fosfotriesterový
68, str.90 až 99, 1979),
Meth. Enzymol. 68, str.
109 až 151 1979), diethylfosforamiditový způsob (Beaucage a kol., Tetrahedron Lett. 22, str. 1859 až 1862, 1981) a způsob pevného nosiče (americký patentový spis číslo 4 458 066. Pře hled způsobů přípravy podává Goodchild (Bioconjugate Chemistry (3), str. 165 až 187, 1990).
• »
Pojem hybridizace popisuje formování duplexní struktury dvěma jednořetězcovými nukleovými kyselinami komplementárním párováním bází. K hybridizaci může docházet mezi plně komplementárními řetězci nukleových kyselin nebo mezi v podstatě komplementárními řetězci nukleových kyselin, které obsahují minoritní oblasti chybného párování (mismatch). Podmínky, za kterých se hybridizují pouze plně komplementární řetězce nukleových kyselin se označují jako přísně hybridizační podmínky nebo sekvenčně specifické hybridizační podmínky. Stabilní duplexní nebo v podstaatě komplementární sekvence lze získat za méně přísných hybridizačnich podmínek; stupeň tolerovaného chybného párování (mismatch) se dá řídit vhodným nastavením hybridizačních podmínek. Pracovníci v oboru technologie nukleových kyselin mohou určovat duplexní stabilitu empiricky, když vezmou v úvahu počet proměnných, kterými jsou například délka a koncentrace páru bází oligonuk1eotidů, iontová pevnost, výskyt chybného párování bází při sledování návodů poskytovaných stavem techniky (například Sambrook a kol., Molecular CloningA Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 1989; a Wetmur, Critical Reviews in Biochem. and Mol. Biol. 26 (3/4), str. 227 až 259, 1991).
Pojem primer” znamená oligonukleotid, přírodní nebo syntetický, schopný působit jako místo iniciace synthesy DNA za podmínek, při kterých je vyvolána synthesa extensního produktu komplementárního k řetězci nukleové kyseliny, tedy v přítomnosti čtyř různých nuk1eosidovách tri fosfátů a činidla pro polymeraci (například polymerázy DNA nebo reversní transkriptázy) v příslušném pufru za vhodné teploty. Primerem je s výhodou jednořetězcový oligodeoxyribonukleotid. Příslušná délka primeru závisí na zamýšleném použití primeru, avšak obvykle je 15 až 35 nukleotidů. Krátké molekuly primeru obecně vyžadují nižší teploty k vytvoření dostatečně stabilních hybridních komplexů s matricí. Primer nemusí zobrazovat přesnou sekvenci matrice nukleové kyseliny, musí však být dostatečně komplemen-
tární k hybridizaci s matricí. Příměry mohou zahrnovat přídavné význaky, které umožní detekci nebo znehybnění primeru, avšak nemění základní vlastnost primeru působit jako místo iniciace synthesy DNA. Například mohou primery obsahovat přídavnou sekvenci nukleové kyseliny na 5 konci, která se nehybriduje na cílenou nukleovou kyselinu, avšak usnadňuje klonování zesíleného produktu. Oblast primeru, která je dostatečně komplementární k matrici aby se hybridizovala, se nazývá hybridizující oblast.
Zde používaný termín protisměrný primer označuje přiměř, jehož extensní produkt je subsekvencí kódujícího řetězce. Pojem posměrný primer (po směru) znamená primer, jehož extensní produkt je subsekvencí komplementárně nekódujícího řetězce .
Pojmy cílová sekvence“, cílová oblast, “cílová nukleová kyselina znamenají nukleovou kyselinu, která má být zesílena, detekována nebo jinak analyzována.
Hovoří-li se o tom, že primer je “specifický pro cílovou sekvenci, znamená to, že počet chybných párů (mismatch) mezi primerem a cílovou sekvencí je menší než počet chybných párů mezi primerem a necílovými sekvencemi, které mohou být ve vzorku obsaženy. Lze volit hybridizační podmínky, za kterých se vytvářejí stabilní duplexy pouze tehdy, jestliže počet obsažených chybných párů není větší než počet chybných párů mezi primerem a cílovou sekvencí. Za takových podmínek může cílově specifický primer (target spécific primer”) vytvářet stálé duplexy pouze s cílovou sekvencí. Použití primerů specifických pro cílovou sekvenci za vhodně přísných zesilovacích podmínek tedy umožňuje specifické zesílení takových sekvencí, které obsahují vazební místa pro cílový primer. Podobně použití cílových specifických nukleotidových sond za vhodně přísných hybridizačnich podmínek umožňuje detekci specifické cílové • ·· sekvence .
Pojem “zesilovací reakční směs se vztahuje k roztoku obsahujícímu reakční činidla potřebná k vyvolání zesilovací reakce, který obsahuje zpravidla příměry, tepelně stálou polymerázu DNA, dNTP a dvojmocný kovový kationt ve vhodném pufru. Za úplnou se označuje reakční směs, která obsahuje všechna reakční činidla nutná k uskutečnění reakce a za neúplnou se označuje reakční směs obsahující pouze část (subset) potřebných reakčních činidel. Pracovníkům v oboru, že reakční složky se běžně skladují jako separátní roztoky, z nichž každý obsahuje část (subset) celkových složek z důvodů pohodlnosti, stálosti při skladování nebo aby se umožnilo nastavovat koncentraci složek v závislosti na aplikaci a reakční složky se spojují před reakcí k vytvoření úplné reakční směsi. Pracovníkům v oboru je dále známo, že reakční složky jsou k obchodování baleny odděleně, a že obchodně dostupné kity mohou obsahovat všechny složky reakčních sloučenin, které zahrnují primery podle vynálezu.
Zesilovací primery HIV-1
Primery podle vynálezu umožňují zesilovat nukleovou kyselinu subtypů HIV-1 skupiny M. Primery představují význame zlepšení oproti shora popsaným primerům v tom, že umožňují zesilovat nukleovou kyselinu od oblasti genu gag od všech izolátů subtypů AA-D patřících skupině M s téměř rovnoměrnou účinností, včetně nově objevených izolátů. Nukleotidové sekvence priffierú jsou uvedeny dále, zleva doprava v orientaci 5 ' k 3 ' .
Protisměrné primery
SK145 (SEQ ID NO: 1) AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAAT
SK145M2 (SEQ ID NO: 2) AGTGGGGGGACACCAGGCAGCAATGCAAAT • · • ·
Posměrné primery
SKCC1 (SEQ ID NO: 3)
SKCC3 (SEQ ID NO: 4)
Posměrné primery
TACTAGTAGTTCCrGCTATGTCACTTCC
TGAAGGGTACTAGTAGTTCCTGCTAT podle vynálezu se mohou používat s kterýmikoli protisměrnými primery. Posměrné primery podle vynálezu se používají s výhodou s protisměrným primerem SKI45 (SEQ TD NO:1), případně s protisměrným primerem SK145M2 (SEQ ID N0:2) . Protisměrný pritner SK145ÍSEQ ID NO’ 1) je popsal Kel log a Kwok (PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, vydavatel Tnnis a kol., Academia Press, San Diego CA, sir. 337 až 347, 1990). Druhý protisměrbý primer SKI45M2 (SEQ
TD NO:2), hybriduie ve stejné oblasti jako SK145(SEQ ID NO:1 , je však určen k těsnějšímu sledování nukleotidové sekvence ur čitých izolátú HIV-1 subtypu A a E. Jak je ukázáno v příkla dech, může použití obou protisměrných primerů napomáhat ke shodě účinnosti zesílení příslušných subtypu.
Zes i 1 ován í
Zesilování se provádí za podmínek, které umožňují zesílení všech skupin HIV-1 subtypu M, avšak které jsou dostatečně přísné, aby zabránily zesílení necílových sekvencí. Výhodné zesilovací podmínky popsal Mul der a kol.(J. Clin. Microbiol. 32(2), sir. 292 až 300, 1994 a ve včleňování produktu testu AMPLICOR HTV-1 MONITOR. Přesné podmínky nejsou rozhodujícím hlediskem vynálezu. Zesilovací podmínky lze optimalizovat obvykle na základě zde podaného návodu.
Primerů a způsobů vynálezu lze použít k detekci jak provirové DNA HIV-1 nebo RNA HIV-1. Zesilováni RNA pomocí systému reverzní transkripce/polymerázová řetězcová reakce (RT-PCR) je v oboru dobře známo a je popsáno (americké patentové spisy číslo 5 322770 a 5 310652; Myers a Gelfand, Bioche- 9 mistry 30 (31) str. 7661 až 7666, 1991 a Young a kol., J. Clin.
Microbiol 31(4), str. 882 až 886, 1993). Zesilování RT-PCR
RNA HIV-1 je popsal Mulder a kol., (J. Cli. Microbiol. 32(2), str. 292 až 300, 1994 a Holodniy a kol. J.Inf.Dis. 163, str.
802 až 865, 1991.
Způsoby přípravy sondy k zesilování DNA a RNA HIV-1 jsou popsány v literatuře. Příslušný použitý způsob není pro vynález rozhodující. Pracovník v oboru může zvolit a optimalizovat vhodné způsoby přípravy sond na základě pokynů literatury. Vhodné způsoby přípravy sond k detekci provirální DNA HIV-1 popisuje Casareale a kol. (PCR Methods and Applications 2, str.149 až 153, 1992 a Butcher a Spadoro, Clin. Immunol. Newsletter 12, str. 73 až 76, 1992). Výhodný kit k přípravě sondy k detekci provirální DNA HIV-1 je obchodně dostupná jako součást testu Amplicor HIV-1. Vhodné způsoby přípravy sond k detekci RNA HIV-1 v plasmě popisuje Mulder a kol. (J. Clin. Microbiol. 32, str. 292 až 300, 1994). Výhodný kit k přípravě sond k detekci a/nebo kvantifikaci RNA HIV-1 je obchodně dostupný jako součást k testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test.
Analysa zesíleného produktu
Zesilovací primery a způsob podle vyhálezu se hodí pro jakoukoli aplikaci používající zesílenou nukleovou kyselinu. Například klonování a/nebo sekvencování sekvencí HIV-1 je těmito primery usnadněno. Způsoby detekce zesílených nukleových kyselin jsou v oboru dobře známy. Způsob použitý k analyzování zesílené nukleové kyseliny není pro vynález rozhodující a lze použít jakékoli vhodné metody. S výhodou se používá způsobu zesilování RNA HIV-1, jak je popsán v příkladech kvantifikování virového zatížení.
Příklady způsobů detekce zesílených nukleových kyselin zahrnují analysu zesíleného produktu gelovou e1ektroforézou ·
- 10 a detekce hybridizací s komplementárními oligonukleotideovými sondám i .
Výhodné zkušební soustavy k detekci hybridi2ace cílové sondy jsou v oboru dobře známé a zahrnují tečkovou a ( dot blot) a reversní (reverse dot-blot) tečkovou zkušební soustavu.
V tečkové soustavě dot-blot se zesílená cílová DNA znehybní na pevném podkladě, jako je nylonová membrána. Cílový komplex na membráně se inkubuje se značenou sondou za vhodných hybridizačních podmínek, nehybridizovaná sonda se odstraní promytím za vhodně přísných podmínek a membrána se monitoruje na přítomnost vázané sondy. Detekci soustavou dot-blot zesílených produktů popsal například v Saiki a kol. (Nátuře 324, str. 163 až 166, 1986 a americký patentový spis číslo 5 468613
V reversní tečkové soustavě dot-blot se sondy znehybní na pevném podkladě jako je nylonová membrána a zesílená cílová DNA se označkuje. DNA se obvykle značkuje během zesilování začleněním značených primerů. Značit se může jeden nebo oba primery. Komplex membrána-sonda se inkubuje se značenou zesílenou cílovou DNA za vhodných podmínek hybridizace, nehybridizovaná cílová DNA se odstraní promytím za vhodně přísných podmínek a filtr se pak monitoruje na přítomnost vázané cílové DNA. Způsoby reversní tečkové soustavy dot-blot jsou popsal například Saiki a kol. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86, str. 6230, 1988 a americký patentový spis číslo 5 468 613.
Alternativně se může tečková zkouška dot-blot provádět 2a použití pevné podložky mající řadu míst nebo důlků s hybridizačni sondou. Například je velmi výhodná při klinických aplikacích těchto metod ve velkém měřítku mikrodůlková destička. Sondy se mohou znehybnit na mikrodůlkové destičce buď pasivní vazbou nebo proteinovým prostředím jako je albumin hovězího • · ·· ♦ · · ♦
séra (BSA), který ulpívá na mikrodůlkových destičkách (Tung a kol., Bioconjugate Chem. 2, str. 464 až 465, 1991). Reversní tečkové metody prováděné na mikrodůlkových destičkách jsou v literatuře popsány (americký patentový spis číslo 5 232 829;
Loef fe1 hol 2 a kol., J. , Clin. Mi crob i ol. 30 (11), str. 2847 až 2851, 1992; Jackson a kol. AIDS R, str. 1463 až 1467, 1991; Mulder a kol., J. Clin. Microbiol. 32 (2), str. 192 až 300, 1994; The Amplicor HIV-1 Test product insert; a AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test product insert.
S výhodou se detekce a/nebo kvantifikace zesíleného pro duktu provádí hybridizací oligonukleitodovou sondou znehybněnou na mikrodůlkové destičce pomocí reakčních činidel a protokolů testu Amplior HIV-1 nebo testem AMPLICOR HIV-1 MONITOR. Použití způsobů kvantifikování RNA HIV-1 je popsáno dále v příkladech.
Alternativně se sondy spojené BSA vážou na magnetické mikročástice. Vázané sondy se hybridizují v roztoku na značkovaný zesilovací produkt a výsledné se z roztoku dostávají magneticky. Magneticky znehybněné hybridizační duplexy se pak detekují jako při shora popsaných způsobech.
Ještě jiný vhodný způsob nazývaný zkouška 5 -nukleázy je rovněž popsán v literatuře (americký patentový spis číslo 5 210015 a 5 487972 a Holland a kol., Proč. Nati. Acad, Sci. USA 88, str. 7276 až 7280, 1988). Při zkoušce 5 -nukleázy se přidávají během zesilovací reakce směsi značených detekčních sond modifikované k předcházení působení sond jako primery pro DNA syntézu. Každá sonda, která hybridizuje na cílové DNA během každého syntesníbo kroku, tedy v průběhu extense primeru, je degradována 5 až 3 exonukleázovou aktivitou polymerázy DNA, například Taq DNA polymerázou. Detekuje se pak produkt degradace sondou. Přítomnost produktu rozpadu sondou tedy indikuje, že jednak došlo k hybridizací mezi sondou a cílovou
- 12 DNA, jednak že nastala zesilovací reakce. Americké patentové spisy číslo 5 491063 a 5 571673 popisují zlepšené způsoby detekce a degradace sondy, které nastávají současně se zesílením.
Shora popsané formy zkoušek používají zpravidla značených oligonukleotidů k usnadnění detekce hybridních duplexů. Oligonukleotidy mohou být značeny vnesením značky detekovatelné spektroskopicky, fotochemicky, biochemicky, imunochemicky nebo chemickými prostředky. Vhodnými značkami jsou 32P, fluorescenšní barviva, elektrony hustá reakční činidla, enzymy (běžně používanými jsou ELISA), biotin nebo hapteny a proteiny, pro které jsou k disposici antisera nebo monoklonální protilátky. Značené oligonukleotidy podle vynálezu mohou být syntetizovány a značeny popsanými způsoby k syntetizování oligonukleotidů.
Alternativní způsob detekce a zesilování nukleových kyselin HTV-1 monitorováním nárůstu celkového množství dvouřetězových DNA v rekční směsi je popsán v literatuře (Higuchi a kol., Bio/Technology 10, str. 413 až 417, 1992: Higuchi a kol. Bio/Technology 11, str.1026 až 1030, 1993: a evropský patentový spis číslo 512334). Detekce dvouřetězových cílových DMA je založena na zvýšené fluorescenci, kterou vykazují ethidiumbromid (EtBr) a jiné vazební značky DNA, jsou-li vázány na dvouřetězovou DNA. Značka vázající DNA se přidává do zesilovací reakční směsi. Výsledkem zesílení cílové sekvence je nárůst množství dvouřetězové DNA, což se projeví zjistitelným nárůstem fluorescence.
Vynález se týká také kitů, jednotek s mnoha nádobkami obsahujícími užitečné složky k provádění tohoto způsobu. Užitečný kit obsahuje primery pro zesílení PCR. nukleové kyseliny HIV-1. Kit může obsahovat také prostředky k detekci zesílených nuleových kyselin HIV-1, jako jsou oligonukleotidové sondy. V některých případech jsou sondy fixovány na vhodné nosné membráně. Jinými případnými součástmi kitů jsou například činidlo
· ke katalyse synthesy produktů příměrové extense, substrát nukleosidových tri fosfátů, značkovací prostředky (například avidin-enzymový konjugát a enzymový substrát a chromogen je-li značkou biotin), vhodné pufry pro PCR nebo hybridizační reakce a instrukce k provádění způsobu podle vynálezu.
Vynález objasňují, nijak však neomezují následující pří klady praktického provedení. Četná provedení vynálezu v rozsahu patentových nároků následující po příkladech jsou pracovníkům v oboru zřejmá z popisu a následujících příkladů. Díly a procenta jsou míéněny vždy hmotnostně, pokud není uvedeno jinak .
Př íJí ljldv Proveden í . vynál ezu
Příklad 1
Konstrukce kvant itačního standardu
Kvantifikace virového zatížení se provádí testem AMPLICOR HIV-1 MONITOR pomocí kvant itačního standardu (Quantitation Standard -QS), který je zesílen pomocí stejného páru primerů, je však detekován separátní sondou. QS se přidává do zkoušeného vzorku ve známé koncentraci k vytvoření známého referenčního signálu. Pro široké rozmezí cílových koncentrací je signál generovaný ze zesíleného cíle nebo zesílený QS úměrný přítomnému množství. Číslo cíle se vypočte z porovnání signálu generovaného od zesílení neznámého cíle se signálem generovaným
QS.
Primery podle vynálezu zesilují úsek, který není plně postižen uvnitř QS začleněného v testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR (Amplicor QS). Pro použití s primery podle vynálezu je tudíž zkonstruován nový QS. Nový QS je zkonstruován z Amplicor QS rozšířením sekvence Amplicor QS k postižení vazebních míst
- 14 (SKCC1 (SEQ ID N0 = 3) a (SKCC3 (SEQ ID NO:4). Výsledný QS je zjistitelný použitou specifickou sondou v testu AMPLICOR HIV-1
MONITOR. Konstrukce plasmidu obsahujícího novou sekvenci QS, ze které se transkribuje QS RNA, se provádí dále popsanou standardní technikou.
Amplicor QS získaný testem AMPLICOR HIV-1 MONITOR se zesílí pomocí SKI45 (SEQ ID NOU) a SK151 (SEQ ID NO = 7) za podmínek v podstatě stejných, jako jsou posány v následujícím příkladě 2. Zesílení poskytne produkt DNA, který obsahuje primerová vazební místa SKI 45 (SEQ ID NO·1) a SK151 (SEQ ID N0:7) a ponechá si interní sekvenci, která obsahuje vazební místo specifické sondy QS.
Nato se výsledný zesílený produkt rozšíří, aby obsáhl vazební místo primeru SKCC1 (SEQ ID N0:3) a přidá se linker, aby bylo umožněno klonování produktu. Toho se dosáhne novým zesílením produktu pomocí SKI45 (SEQ ID NO:1) rozšířeného na konci 5 k začlenění 1inkeru HindlII a SKCC1 (SEQ ID Ν0=3). Vhodné zesilovací podmínky jsou popsány v literaruře (Kellogg a Kwok, PCR Protocols: A Guide to Methods and Appli cations, vydavatel Innis a kol., Academia Press, San Diego CA, str. 337 až 347, 1990) s tou výjimkou, že k docílení hybridizace SKCC1 (SEQ ID N0:3) se použije nižší teploty systému teplotní hybridizace/nastavení (například 42 C).
Výsledný rozšířený produkt se pak dále rozšíří k postižení vazebního místa primeru SKCC3 (SEQ ID NO:4) a přidá se druhý linker na druhém konci, aby bylo umožněno klonování produktu. Toho se dosáhne zesílením produktu pomocí SKI45 (SEQ ID NO=1) rozšířeného na konci 5 k začlenění 1inkeru HindlII, jak shora popsáno, spolu s SKCC3 (SEQ ID NO:4) rozšířeného na konci 5 k začlenění 1inkeru XBal za použití stejných zesilovacích podmínek jako shora popsáno.
Nato se zesílený produkt vsadí do plasmidu. Zesílená DNA
- 15 * »· «« » ·♦ ♦ t « · • · ♦ « ♦ · ♦ · · ···« ♦ » » · » · •·· ·» «· a plasmid pSP64 (Promega, Madison, WT) se odděleně zpracují Hind III a XBaT a pak se standardním způsobem váží. Příslušné buňky se transformují rekombinantními plasmidy a získá se klon, který obsahuje správný inzert. Klonovaný inzert ve výsledném rekombinantním plasmidu se má sekvencovat k zajištění, že do vazebních míst příměru nebo sondy nejsou vloženy žádné mutace.
QS RNA se transkribuje z rekombinantního plasmidu, který obsahuje sekvenci QS kitem MEGAscript™ SP6 (Ambion, lne., Austin, TX).
Příklad 2
Kvant i táce RNA HIV-1
Tento příklad popisuje posouzení relativní účinnosti zesílení z různých izolátů HIV-1. Pro porovnání je provedeno také zesílení pomocí testovacího kitu AMPLICOR HIV-1 MONITOR.
Tzoláty HIV-1 se získají z pozitivních klinických vzorků.
Usek genu gag se klonuje a sekvencuje pomocí standardních technik a subtyp klonovaného HIV-1 se stanoví v závislosti na sekvenci. Byla objevena řada nových těchto izolátů HIV-1. Pro tento příklad se volí zvláštní izoláty založené na nukleotidové sekvenci, u nichž se očekává, že budou problematické pro test AMPLICOR HIV-1 MONITOR. Vedle toho se použije izolátů reprezentativních pro variaci sekvencí přítomnou ve subtypech skupiny M.
Cílová nukleová kyselina
Zkonstruují se plasmidy obsahující úsek gag genu HIV-1 z každého izolátů a matrice RNA HIV-1 se transkribují v podstatě způsobem, který popsal Holodnyi a kol. (I. Inf. Dis.
163, str. 802 až 865,
19911. Pořídí se zásobní roztoky každé matrice a vyzkouší se koncentrace každé matrice. Zásobní roz-
- 16 toky se zředí na základě určených relativních koncentrací, takže koncentrace matrice, předané do každé reakční směsi, je stejná. Absolutní počet kopií přidaných matric do reakcí je přibližně 4000 až 8000.
Kvantitační standard
QS popsaný u příkladu 1, se zavede do každé reakční směsi při známé koncentraci, zpravidla 100 kopií na reakci.
Primery
Reakce A až F se provedou pomocí následujících kombinací pr i merů:
Porovnávané kombinace prinerú
Reakce
Kombi nace pri merú
A SK462 (SEQ ID NO: 5)
SK431 (SEQ ED NO: 6)
B SK145 (SEQ ID NO: 1)
SK151 (SEQ ID NO: 7)
C SK145 (SEQ ED NO: 1)
SKCC1 (SEQ ID NO: 3)
D SK 145 (SEQ ID NO: 1) a.. SK145M2 (SEQ ID NO· 2)
SKCC1 (SEQ ED NO: 3)
SK145 (SEQ ID NO: 1)
SKCC3 (SEQ ID NO: 4)
SK145 (SEQ ID NO: 1) a
SKCC3 (SEQ ID NO: 4)
SK145M2 (SEQ ID NO: 2) ♦· • ··· •· · · •· ·
• ··· · ♦ • · · ·· ··
Všechny primery se biotinylují na konci 5 k usnadnění detekce v'reversním tečkovém formátu dot-blot mikrodůlové destičky. Sekvence přídavných primerů, jež nejsou shora uvedeny, jsou dále v orientaci 5 a 3 .
Protiproudové primery
SK462 (SEQ ID NO: 5) AGTTGGAGGACATCAAGCAGCCATGCAAAT
Poproudové primery
SK431 (SEQ ID NO: 6) TGCrATGTCAGTTCCCCITGGTTCrcr
SK151 (SEQ ID NO: 7) TGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCT
Zesi1 ování
Zesilovací reakce A se provede s použitím reakčních čini del a za podmínek testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR.
Zesilovací reakce B se provede v objemech 100 ul obsahujících následující reakční činidla:
matrici RNA HIV-1
QSRNA
50mM biči nu, pH 8,3
111 mM K(OAc)
3,6 mM Mn(0Ac)s
500 uM dUTP
300 uM každého dATP, dCTP a dGTP uM dTTP % glycerolu
0,2 uM každého biotinylovaného primeru jednotky UNG* jednotek rTth polymerázy DNA* x vyrobeno a vyvinuto firmou Hoffmann La Roche, obchodní pro-
- 18 dukt firmy Perkin Elmer (Norwalk,CT).
Zesilovací reakce C a D se provedou 2a podmínek v podstatě stejných jako v reakci B, avšak s následujícími změnami: 100 mM K(OAc)
500 uM každého dATP, dCTP s dGTP
7,5 % glycerolu jednotek UNG.
Zesilovací reakce E a F se provedou za podmínek v podstatě stejných jako v reakcích C a D, avšak s použitím 10% koncentrace glycerolu. Nepatrné rozdíly v reakčních směsích jsou způsobeny dřívější optimizací zesilovacích podmínek pro každý pár primeru.
Zesilovací reakce B až F se provedou v tepelném cyklovači TC9600 DNA (Perkin Emler, Norwalk,CT) za použití následujícího teplotního profilu:
| Inkubace před reakcí: | 50 | C | 2 | minuty |
| Reversní transkripce | 60 | a c | 30 | m i nut |
| 4 cykly:denaturace | 95 | 0 c | 10 | sekund |
| teplotní hybridizace | 55 | 0 c | 10 | sekund |
| rozšíření | 72 | 0 c | 10 | sekund |
| 26 cyklů:denaturace | 90 | 0 c | 10 | sekund |
| teplotní hybridizace | 60 | 0 c | 10 | sekund |
| rozš í řen í | 72 | 0 c | 10 | sekund |
| Konečné rozšíření: | 72 | 0 c | 15 | ni nut |
Detekce zesíleného produktu hybridizací sondy
Zesílené produkty se detekují použitím reakčních činidel a protokolů testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR. Stanovená počáteční cílová koncentrace se vypočte jak shora uvedeno.
Výsledky
Při kvantitativním způsobu testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR se počáteční cílová koncentrace stanoví z porovnání signálu generovaného po zesílení cíle se signálem generovaným po zesílení známé koncentrace QS. Jelikož známá koncentrace QS je hodnotou před zesílením, zatímco porovnávané signály jsou signály po zesílení, ovlivní změny relativní účinnosti zesílení určení počáteční koncentrace neznámého cíle. Kvantitace testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR je cejchována na základě zesilovací účinnosti subtypu B HIV-1. Je známo,· že ostatní subtypy HIV-1 mohou být zesíleny s nižší účinností a tudíž, že stanovená cílová koncentrace by byla podhodnocením skutečné koncentrace.
V tomto pokusu byla cílová koncentrace RNA přidána ke každé reakci při známé koncentraci. Relativní účinnost zesílení pro každý izolát může být tedy jištěna porovnáním stanovených cílových koncentrcí. Jelikož kvantitace testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR je cejchována na základě zesilovací účinnosti subtypu B HIV-1, použije se stanovená cílová koncentrace sub typu B (klon 105-1) jako referenční. Pro každý izolát se stanovená cílová koncenztrace pro subtyp B (klon 105-1) podělí stanovenou cílovou koncentrací pro izolát k poskytnutí míry relativní účinnosti zesílení. Tyto relativní účinnosti zesíle ní jsou uvedeny v následující tabulce.
Označení že reakce nebyla peovedena.
| Re 1at i vn í | úč i nnost | k subtypu | B | ||||
| K1 on | SubtVD | A | B | c | D | E | F |
| 113-1 | A | 694 3 | >,7 | 0,9 | V4 | 1/4 | 0/9 |
| 113-2 | A | 1 9 | 1,3 | 1/1 | 1/3 | 0,6 | |
| 114-1 | A | 12,4 | — | 1/4 | 1.3 l | 0z7 | 0,9 |
| 114-2 | A | 9,8 | 1,2 | 1/1 | 1,3 | 1/5 | 0,8 |
| 115-1 | A | 497,6 | 0z8 | 1/2 | 1 | lf6 | |
| 115-2 | A | 646,4 | v | 1 | 1/5 | 0,9 | 1,4 |
• ·
| 105-1. | B | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 101-15 | C | V | — | 1/1 | 3,5 | l/9 | 1/4 |
| 107-6 | D | 0.8 | — | 0,6 | 0,7 | 0.7 | 0,8 |
| 308-1 | D | 0,9 | — | 0,6 | 0,7 | 0,7 | 0,5 |
| 110-5 | E | 520,7 | 465,7 | 3,5 | l/2 | 4,6 | 0,8 |
| 111-6 | E | 0,8 | — | 1/1 | 1,6 | O,9 | 1,1 |
| 112-7 | E | 3,3 | 0,8 | 1/5 | l/9 | 1,2 | 1,4 |
| 106-1 | G | 1,9 | — | 2,3 | 2 | 1.8 t | 1.5 t |
| 108-3 | G | 0,6 | — | 0,5 | 0,8 | 0,5 | 0,5 |
| 109-1 | G | 32,5 | 1 | 0.5 j | 0;6 | 0z6 | 0z3 |
| Výsledky | ukazuj í, že | AMPLICOR | HIV- | 1 MONITOR | test | (reakce | |
| A) zesiluje různé izoláty | HIV-1 ve | významně kolísající účin- | |||||
| nost i. Několi k | izolátů včetně izolátu subtypu E, | klon | 110-5, | ||||
| bylo zesíleno | s | účinností | nejméně | 500- | násobně | nižší | než ú- |
činnost zesílení subtypu B, klon 105-1.
Ačkoli nebyly testovány všechny izoláty, ukazuje se, že použití příměrového páru SKI 45 (SEQ ID NO: 1 ) a SKI51 (SEQ ID N0:7) (reakce Β) , zlepšuje významně rovnoměrnost zesilovvací účinnosti. Avšak subtyp izolátu E, klon 110-5 byl stále zesílen s účinností přibližně 500-násobně nižší, než je účinnost zesílení subtypu B, klon 105-1.
Použití SKI45 (SEQ ID NO:1) a SKCC1 (SEQ ID NO:3) (reakce C), umožnilo zesílení všech izolátů, včetně izolátu subtypu E, klon 110-5, s účinností až trojnásobnou oproti účinnosti zesílení subtypu B, klon 105-1. Přidání SK145M2 (SEQ ID N0:2) (reakce D) dále zlepšilo účinnost zesílení izolátu 110-5 na v podstatě stejnou hodnotu jako u referenčního kmene subtypu B
Podobně použití SKI45 (SEQ ID NO:1) a SKCC3 (SEQ ID NO:4) (reakce E) , umožnilo zvýšení všech izolátů, včetně izolátu subtypu E, klon 110-5 s účinnosti až pětinásobnou oproti zesí·· • 4
• · ··· · • · 9 · ·· ·· • ♦ ·
999 9 • · ·· ·· lení subtypu B, klon 105-1. Přidání SK145M2 (SEQ ID N0:2) (reakce F) dále zlepšilo účinnost zesílení izolátu 110-5 na v podstatě stejnou hodnotu jako u referenčního kmen subtypu B.
Příklad 3
Kvant i táce HIV-1 v klinických vzorcích
V tomto příkladu se zkoušelo 30 klinických vzorků získaných od seropozitivních pacientů ze Senegalu na přítomnosal RNA HIV-1. Subtypy přítomné v klinických vzorcích se nestanovily. Avšak jelikož jsou subtypy A a D běžné v tomto africkém regionu, očekávalo se, že několik klinických vzorků se buď nezesílí nebo nebudou testem AMPLICOR HIV-1 MONITOR zesíleny účinně.
Vzorky se připravily takto: Plasmové druhy (80 až 250 ul) se spojily s 20 ul 0,25% (hmotnost k oběmu) červených polystyrénových mikrokuliček Estapor (Bangs Laboratořies, lne., Carmel, IN) v 1,5 ml kuželovité odstředivé zkumavce a při teplotě 4 C se 1 hodinu odstřeďovaly při 25 300x g. Supernatant se odsál a pelety se resuspendovaly ve 250 ul lysovém pufru (50 ul lysového pufru se rovná 6,7 ul 30 U/ul RNasinu (Promega, Madison, WI); 0,67 ul 100 mM DTT, 2 ul 10% NP40 (Pierce, Rockford, IL) >' 0,25 ul 4 mg/ml poly-rA RNA; a 40,4 ul Depc-upravené H2O). Pellety se inkubovaly při teplotě místnosti po nejméně 15 minutovém víření k zaručenému promísení.
Zesilování se provádělo ve 100 ul reakčních dávkách obsahujících 50 141 2X směsi zesilovacích reakčních činidel formulovaných tak, aby konečná koncentrace byla jak shora uvedeno. Do každé reakční směsi se přidalo přibližně 100 kopií příslušné QS jako součást reakční směsi. Detekce zesíleného produktu se provedla testem AMPLICOR HIV-1 MONITOR, jak shora popsáno.
- 22 Zesílení každého vzorku se provedlo s následující kombinací primérů
Porovnání kombinací primeru
Reakce Kombinace primeru
A SK462 (SEQ ID NO: 5)
SK431 (SEQ ID NO: 6)
B SK145 (SEQ ID NO: 1)
SKCC1 (SEQ ID NO: 3)
C SK145 (SEQ ID NO: 1) a. SK145M2 (SEQ ID NO: 2)
SKCC1 (SEQ ID NO: 3)
Výsledky vyjádřené v kopiích matrice HIV-1 jsou sestaveny dále.
na ml plasmy
Stanovené cílové koncentrace (kopie/ml)
| Ižolát . | A | B Duplikát | Duplikát | ||
| DKN 035 | 0 | 800 | 1860 | 1600 | 1100 |
| DKN 079 | 360 | 30060 | 37240 | 91780 | 152300 |
| DKN 154 | 1140 | 21660 | 54560 | 68820 | 67120 |
| DKN 162 | 0 | 16020 | 25980 | 64340 | 21880 |
| DKN 162 | 0 | 12180 | 10520 | 14300 | 18320 |
| DKN 169 | 0 | 3 140 | 7000 | 5651 | 8047 |
| DKN 171 | 1180 | 640 | 500 | 560 | 1040 |
| DKN 282 | 560 | 3400 | 4360 | 5560 | 3460 |
| DKN 402 | 340 | 4260 | 10520 | 7000 | 5060 |
| MBN 26 | 27740 | 16940 | 19220 | 16700 | 18680 |
| MBN 31 | 180 | 1820 | 1820 | 1720 | 2240 |
| MBN 34 | 840 | 2160 | 2200 | 3100 | 3120 |
| MIH 002 | 2320 | 51320 | 121100 | 144180 | 123900 |
| MIH 012 | 2960 | 33620 | 40920 | 40740 | 75840 |
| MIH 013 | 30360 | 31980 | 55360 | 42800 | 71220 |
| MIH 030 | 17625 | 178500 | 273938 | 169750 | 189625 |
| MIH | 053 | + | 534960 | 231620 | 530900 | 878340 |
| MIH | 055 | 10560 | 43960 | 54220 | 49400 | 37400 |
| MIH | 074 | 5700 | 3980 | 6020 | 3640 | 4940 |
| MIH | 112 | 30480 | 271980 | 490780 | 423600 | 416140 |
| MIH | 157 | 520 | 165480 | 82920 | 169980 | 146320 |
| MIN | 003a | 1300 | 57720 | 21620 | 35380 | 34560 |
| MIN | 003b | 1760 | 32820 | 30940 | 27760 | 26600 |
| MIN | 017 | 540 | 437380 | 375120 | 447740 | 902780 |
| MIN | 067 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MIN | 126 | 44320 | 63600 | 38460 | 56680 | 40300 |
| MIN | 139 | 460 | 146320 | 142800 | 94520 | 105600 |
| MIN | 146 | 200 | 49920 | 32100 | 19900 | 30400 |
| MIN | 217 | 0 | 3220 | 1880 | 2320 | 2580 |
| MIN | 589 | 154780 | 267740 | 127100 | 144160 | 228040 |
Výsledky ukazují, že primery podle vynálezu, kombinace Ba C, umožňují zesílit více klinických vzorků. Kombinace primerů B a C umožňují zesílení všech až na 1 ze 30 vzorků. Na rozdíl od toho test AMPLICOR HIV-1 MONITOR selhal v zesílení 6 ze 29 vzorků. Zesílení vzorku MIH 053 testem AMPLICOR HIV-1 MONITOR vedl k silnému cílovému signálu, selhal však v generování signálu QS. Vzorek tudíž nemohl být kvant itovate1ný, jak označeno znaménkem + v tabulce.
Kromě toho je u významného počtu vzorků počet kopií stanovený kombinací primerů B nebo C významně vyšší než stanovený pomocí testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR. Na základě proměnlivosti účinnosti zesílení představované vzorkem 2, vyplývají nižší stanovení koncentrace matric získané testem AMPLICOR HIV-1 MONITOR pravděpodobně z významně nižších zesilovacích účinností.
Virová RNA nebyla zjištěna ve vzorku MIN 067. Není však známo, zda je to způsobeno nezpozorovanou proměnlivostí cílové sekvence, která interferovala buď s hybridizací primerů nebo s hybridizací sondy nebo z nějakého jiného důvodu.
| * ·· | ·· | • ·· | • 4 | ||
| ·· · | » · | ·· | • · | • | • |
| • ··· | • · | • | • · | • · | |
| • · · | • · · | • | • ··· | • | • |
| 4 · · | • · | • | • | • | • |
| *·· 44 | ·· | ··· | ·· | 44 |
Průmyslová využitelnost
Vynález se zabývá způsoby a reakčními činidly k detekci viru lidské imunitní nedostatečnosti typu 1 (HIV-1) a má proto použití v medicíně všeobecně, v lékařské diagnostice zvláště a v oboru molekulární biologie.
Seznam sekvencí
| ( 1) | Obecné informace | |||
| iv) | Př i hlašovate1 | |||
| A. | Jméno: F. Hoffmann~La | Roche AG | ||
| B. | Ulice: Grenzacherstrasse | 124 | ||
| C. | Město: Basle | |||
| D. | Stát: BS | |||
| E. | Země: Švýcarsko | |||
| F. | ZIP: CH-4070 | |||
| G. | Telefon: 061 - 688 13 | 95 | ||
| H. | Telefax: 061 - 688 13 | 95 | ||
| I : | Telex: 962292/965542 hlr | ch | ||
| i i) | Název vynálezu: Způsob detekce HIV- | |||
| iii)Počet sekvencí: 7 | ||||
| iv) | Forma pro počítač |
A. Typ média: Floppy disk
B. Počítač: Apple Macintosh
C. Operační systém: Systém 7.1 (Macintosh)
D. Software: Word 5.1
v) Platné přihlašovací údaje
A. Číslo přihlášky· 60-037744
B. Datum podání: 17.01.1997 (2) Informace o SEQ ID. Č.l:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 30 páru bází
B. Typ: nukleová kyselina
C. Řetězcovítost: jeden řetězec
D. topologie: lineární
- 25 i i) Typ molekuly: DNA (genomická) xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:1: AGTGGGGGGA CATCAAGCAG CCATGCAAAT (2) Informace pro SEQ ID NO:2:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 30 páru bází
B. Typ: nukleová kyselina
C. Řetězcovítost: jeden řetězec
D. topologie: lineární i i) Typ molekuly: DNA (genomická) xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:2: AGTGGGGGGA CACCAGGCAG CAATGCAAAT (2) Informace o SEQ ID. Č.3=
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 28 páru bází
B. Typ: nukleová kyselina
C. Řetězcovítost: jeden řetězec
D. topologie: lineární i i) Typ molekuly: DNA (genomická) xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:3: TACTAGTAGT TCCTGCTATG TCACTTCC (2) Informace pro SEQ ID NO:4:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 26 páru bází
B. Typ: nukleová kyselina
C. Řetězcovitost: jeden řetězec
D. topologie: lineární i i) Typ molekuly: DNA (genomická) xi) Popis sekvence: SEQ ID NO '4'·
TGAAGGGTAC TAGTAGTTCC TGCTAT
(2) Informace o SEQ ID. Č.5:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 30 páru bází
B. Typ: nukleová kyselina
C. Řetězcovítost: jeden řetězec
D. topologie: lineární i i) Typ molekuly: DNA (genomická) xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:5: AGTTGGAGGA CATCAAGCAG CCATGCAAAT (2) Informace pro SEQ ID NO:6:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 27 páru bází
B. Typ: nukleová kyselina
C. Řetězcovitost: jeden řetězec
D. topologie: lineární i i) Typ molekuly: DNA (genomická) xi) Popis sekvence·' SEQ ID NO: 6: TGCTATGTCAGTTCCCCTTG GTTCTCT (2) Informace o SEQ ID. Č.7=
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka·' 27 páru bází
B. Typ: nukleová kyselina
C. Řetězcovitost: jeden řetězec
D. topologie: lineární i i) Typ molekuly: DNA (genomická) xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:7:
TcrTaTHTrn γττπππγττπ λττγτπτ
Claims (16)
1 (HIV-1) , vyznač u j ící použi t í í m , že se provádí polymerázového řetězová reakce za
SKCC1 (SEQ ID NO:3) nebo SKCC3 (SEQ ID
NO:4).
1. Ol igonuk1eotidový primer k zesilování nukleové kyseliny viru lidské imunitní nedostatečnosti typu 1 (HIV-1)Zvoleiwný ze souboru, který tvoří SKCCI (SEQ ID NO:3) a SKCC3 (SEQ ID NO:4).
2. Pár oligonukleotidových primerů tvořený SKI45 (SEQ ID NO:1) a SKCCI (SEQ ID NO=3).
3. Sada oligonukleotidových primerů podle nároku 2 tvořená SK145M2 (SEQ ID NO:2).
4. Pár oligonukleotidových primerů tvořený SK145 (SEQ ID NO:1) a SKCC3 (SEQ ID NO:4).
5. Sada oligonukleotidových primerů sestávající z páru oligonukleotidových primerů podle nároku 4 a SK145H2 (SEQ ID
Kit k detekci viru lidské imunitní nedostatečnosti 1 (HIV-1) nukleové kyseliny, vyznačující se , že obsahuje oligonukleotidový primer podle nároku 1.
Kit k detekci viru lidské imunitní nedostatečnosti 1 (HIV-1) nukleové kyseliny, vyznačující se že obsahuje pár oligonukleotidových primerů podle nároKit k detekci viru lidské imunitní nedostatečnosti (HIV-1) nukleové kyseliny .vyznačující se , že obsahuje sadu oligonukleotidových primerů podle ná roku 3.
6.
typu t í m
7.
typu tím, ku 2.
8.
typu 1 tím »
tím, še obsahuje pár oligonukleotidových primerú podle nároku 4.
9. Kit k detekci viru lidské imunitní nedostatečnosti typu 1 (HIV-1) nukleové kyseliny, vyznačující se
NO:2).
10. Kit k detekci viru lidské imunitní nedostatečnosti typu 1 (HIV-1) nukleové kyseliny, vyznačující se t í m , še obsahuje sadu oligonukleotidových primerú podle ná- roku 5.
11 .
Způsob zesilování nukleové kyseliny viru lidské imun i tn í nedostatečnosti typu
12.
Způsob podle nároku 11, vyznač tím že se provádí polymerázového řetězová reakce za použití SKI 45 (SEQ ID NO:1) nebo SKCC1 (SEQ ID NO:3).
13. Způsob podle nároku 12, vyznačuj ící se tím , že se provádí polymerázového řetězová reakce za použití SK145M2 (SEQ ID N0=2).
14. Způsob podle nároku 11, vyznačuj ící se tím , že se provádí polymerázového řetězová reakce za použití SKI 45 (SEQ ID NO 1) a SKCC3 (SEQ ID NO = 4).
15. Způsob podle nároku 11, vyznačuj ící se tím , že se provádí polymerázového řetězová reakce za použití SK145M2 (SEQ ID NO:2).
16.
Primery, způsoby a kity podle popisu.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US3774497P | 1997-01-17 | 1997-01-17 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ14998A3 true CZ14998A3 (cs) | 1998-08-12 |
| CZ288064B6 CZ288064B6 (cs) | 2001-04-11 |
Family
ID=21896067
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ1998149A CZ288064B6 (cs) | 1997-01-17 | 1998-01-16 | Oligonukleotidové primery pro detekci HIV-1, jejich použití a kit, který je obsahuje |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5908743A (cs) |
| EP (1) | EP0854197B1 (cs) |
| JP (1) | JP2838084B2 (cs) |
| KR (1) | KR100257438B1 (cs) |
| CN (1) | CN1208469C (cs) |
| AT (1) | ATE345400T1 (cs) |
| AU (1) | AU693066B1 (cs) |
| BR (1) | BRPI9800337B8 (cs) |
| CA (1) | CA2222769C (cs) |
| CZ (1) | CZ288064B6 (cs) |
| DE (1) | DE69836395T2 (cs) |
| DK (1) | DK0854197T3 (cs) |
| ES (1) | ES2276436T3 (cs) |
| HU (1) | HU223384B1 (cs) |
| IL (1) | IL122906A (cs) |
| NO (1) | NO323157B1 (cs) |
| PL (1) | PL191989B1 (cs) |
| RU (1) | RU2186112C2 (cs) |
| TW (1) | TW400386B (cs) |
| UA (1) | UA47432C2 (cs) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19850186A1 (de) * | 1998-10-30 | 2000-05-25 | Roche Diagnostics Gmbh | Neue Primer und Sonden zum Nachweis von HIV |
| DE19900511C2 (de) | 1999-01-08 | 2001-03-15 | Deutsches Krebsforsch | Molekularbiologische Marker für die analytische Elektronenmikroskopie |
| US6245511B1 (en) * | 1999-02-22 | 2001-06-12 | Vialogy Corp | Method and apparatus for exponentially convergent therapy effectiveness monitoring using DNA microarray based viral load measurements |
| US6582920B2 (en) | 2000-09-01 | 2003-06-24 | Gen-Probe Incorporated | Amplification of HIV-1 RT sequences for detection of sequences associated with drug-resistance mutations |
| DE60045932D1 (de) * | 2000-09-01 | 2011-06-16 | Gen Probe Inc | HIV-1-Sequenzverstärkung zur Erkennung von Sequenzen in Zusammenhang mit Wirkstoffresistenz-Mutationen |
| US6770752B2 (en) | 2001-01-09 | 2004-08-03 | Becton, Dickinson And Company | Sequences for detection of HIV-1 |
| EP1317960A1 (en) * | 2001-12-06 | 2003-06-11 | PamGene B.V. | System and method for analyzing a blood sample and disposable cartridge for use in this system or method |
| US7820030B2 (en) * | 2003-04-16 | 2010-10-26 | Handylab, Inc. | System and method for electrochemical detection of biological compounds |
| WO2006130165A2 (en) | 2004-09-02 | 2006-12-07 | Vialogy Corp. | Detecting events of interest using quantum resonance interferometry |
| US9085807B2 (en) | 2004-09-14 | 2015-07-21 | Argos Therapeutics, Inc. | Strain-independent amplification of pathogens and vaccines thereto |
| CN100340673C (zh) * | 2005-02-03 | 2007-10-03 | 上海科华生物工程股份有限公司 | 人类免疫缺陷病毒hiv－1核酸扩增－荧光定量检测试剂盒 |
| RU2350650C2 (ru) * | 2006-04-17 | 2009-03-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Биосинтез" (ООО "Биосинтез") | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pVar15-HIV-LTR, НЕСУЩАЯ КЛОНИРОВАННЫЙ ФРАГМЕНТ ГЕНОМА ВИЧ-1 ТИПА ИЗ КОНСЕРВАТИВНОГО УЧАСТКА 5'-LTR ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pBluKSM-HIV-LTR mod, НЕСУЩАЯ КЛОНИРОВАННЫЙ МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ФРАГМЕНТ ЭТОГО ЖЕ УЧАСТКА ГЕНОМА ВИЧ-1 ТИПА, ТЕСТ-НАБОР ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ЭКСПРЕСС-ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНОМА ВИЧ-1 ЛЮБОГО ТИПА В ПРОБЕ И СПОСОБ С ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ |
| CN101144771B (zh) * | 2006-09-11 | 2012-05-30 | 中山大学达安基因股份有限公司 | 检测人类免疫缺陷病毒的试剂盒 |
| EP2140033B1 (en) | 2007-03-28 | 2012-10-10 | Signal Diagnostics | System and method for high resolution analysis of nucleic acids to detect sequence variations |
| WO2009017743A2 (en) * | 2007-07-30 | 2009-02-05 | Argos Therapeutics, Inc. | Improved primers and probes for the amplification and detection of hiv gag, rev and nef polynucleotides |
| US10669574B2 (en) | 2008-11-18 | 2020-06-02 | XCR Diagnostics, Inc. | DNA amplification technology |
| US10113206B2 (en) * | 2010-02-24 | 2018-10-30 | Grifols Therapeutics Inc. | Methods, compositions, and kits for determining human immunodeficiency virus (HIV) |
| BR112013032223A2 (pt) * | 2011-06-15 | 2016-12-20 | Grifols Therapeutics Inc | molécula de ácido nucleico isolada, e, composição |
| RU2016117929A (ru) | 2013-10-09 | 2017-11-15 | Флюоресентрик, Инк. | Мультиплексные зонды |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5386022A (en) * | 1985-03-28 | 1995-01-31 | Hoffman-La Roche Inc. | Primes and probes for the amplification and detection of aids associated nucleic acids |
| US5389512A (en) * | 1988-10-07 | 1995-02-14 | Hoffman-La Roche Inc. | Method for determining the relative amount of a viral nucleic acid segment in a sample by the polymerase chain reaction |
| CA2013317A1 (en) * | 1989-04-17 | 1990-10-17 | Fred T. Oakes | Diagnostic kit, primer composition and their use for replication or detection of nucleic acids |
| US5196305A (en) * | 1989-09-12 | 1993-03-23 | Eastman Kodak Company | Diagnostic and amplification methods using primers having thymine at 3' end to overcome primer-target mismatch at the 3' end |
| CA2031659A1 (en) * | 1990-01-26 | 1991-07-27 | John B. Findlay | Water-insoluble reagent, nucleic acid probe, test kit and diagnostic and purification methods |
| US5695926A (en) * | 1990-06-11 | 1997-12-09 | Bio Merieux | Sandwich hybridization assays using very short capture probes noncovalently bound to a hydrophobic support |
| WO1994023069A1 (en) * | 1993-03-26 | 1994-10-13 | Gen-Probe Incorporated | Detection of human immunodeficiency virus type 1 |
| WO1995003430A1 (en) * | 1993-07-23 | 1995-02-02 | Gen-Probe Incorporated | Methods for enhancing nucleic acid amplification |
| WO1995014109A1 (en) * | 1993-11-19 | 1995-05-26 | U.S. Department Of The Army | High through-put quantitative polymerase chain reaction for hiv clinical specimens |
| US5665545A (en) | 1994-11-28 | 1997-09-09 | Akzo Nobel N.V. | Terminal repeat amplification method |
| US5599662A (en) * | 1995-02-17 | 1997-02-04 | Hoffmann-La Roche Inc. | Oliconucleotide primers and probes for the detection of HIV-1 |
| US5702926A (en) * | 1996-08-22 | 1997-12-30 | Becton, Dickinson And Company | Nicking of DNA using boronated nucleotides |
-
1997
- 1997-12-17 CA CA002222769A patent/CA2222769C/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-01-08 DE DE69836395T patent/DE69836395T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-08 DK DK98100196T patent/DK0854197T3/da active
- 1998-01-08 AT AT98100196T patent/ATE345400T1/de active
- 1998-01-08 EP EP98100196A patent/EP0854197B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-08 ES ES98100196T patent/ES2276436T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-09 CN CNB981039111A patent/CN1208469C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-09 US US09/004,949 patent/US5908743A/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-12 IL IL12290698A patent/IL122906A/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-01-14 HU HU9800053A patent/HU223384B1/hu active IP Right Grant
- 1998-01-16 RU RU98100921/13A patent/RU2186112C2/ru active
- 1998-01-16 PL PL324327A patent/PL191989B1/pl unknown
- 1998-01-16 BR BRPI9800337A patent/BRPI9800337B8/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-01-16 AU AU52099/98A patent/AU693066B1/en not_active Expired
- 1998-01-16 NO NO19980212A patent/NO323157B1/no not_active IP Right Cessation
- 1998-01-16 KR KR1019980001164A patent/KR100257438B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-16 CZ CZ1998149A patent/CZ288064B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-01-16 UA UA98010265A patent/UA47432C2/uk unknown
- 1998-01-17 TW TW087100609A patent/TW400386B/zh not_active IP Right Cessation
- 1998-01-19 JP JP10007466A patent/JP2838084B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0727497B1 (en) | Primers and probes for the detection of HIV | |
| CZ14998A3 (cs) | Způsob detekce HIV-1 | |
| JP2846018B2 (ja) | 核酸配列の増幅および検出 | |
| US5837442A (en) | Oligonucleotide primers for amplifying HCV nucleic acid | |
| AU736503B2 (en) | Nucleic acid sequences that can be used as primers and probes in the amplification and detection of all subtypes of HIV-1 | |
| US5389512A (en) | Method for determining the relative amount of a viral nucleic acid segment in a sample by the polymerase chain reaction | |
| JP2002505117A (ja) | チモーゲン性核酸検出方法、および関連分子およびキット | |
| JP2001512301A (ja) | 核酸増幅のための内部陽性対照 | |
| JPH04141099A (ja) | 増幅捕捉アッセイ | |
| CN114317690B (zh) | 预扩增多靶核酸结合荧光定量pcr检测的方法 | |
| JPH03119999A (ja) | 核酸を増幅して検出するための方法及び診断試験キット | |
| HK1010896B (en) | Primers for the detection of hiv-1 | |
| JP2024506277A (ja) | 脱塩基核酸を有する配列変換及びシグナル増幅ｄｎａ、並びにそれを使用する検出方法 | |
| MXPA98000480A (en) | Cebadores for vi detection | |
| Sweden et al. | Lizardi et al. | |
| JP2002522047A (ja) | 限界まで非弁別的なハイブリダイゼーションを調節する方法及び組成 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20180116 |