ES2276436T3 - Cebadores para la deteccion de vih-1. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION APORTA CEBADORES MEJORADOS PARA LA AMPLIFICACION POR LA REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) DE UNA SECUENCIA DE ACIDO NUCLEICO DEL GEN GAG DEL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA TIPO 1 (VIH-1). LOS CEBADORES Y LOS METODOS DE AMPLIFICACION DE LA INVENCION PERMITEN LA DETECCION DE TODOS LOS VIRUS AISLADOS DE VIH-1 DEL GRUPO 1 CON EFICIENCIA CASI UNIFORME.
Description
Cebadores para la detección de
VIH-1.
La presente invención se refiere al campo de la
biología molecular y a la química de los ácidos nucleicos. Más
específicamente se refiere a los métodos y reactivos para detectar
el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1
(VIH-1). La invención por lo tanto tiene
aplicaciones en el campo de la medicina en general, de los
diagnósticos médicos en particular, y en el campo de la biología
molecular.
La invención de métodos para amplificar las
secuencias específicas de los ácidos nucleicos, en particular, la
reacción en cadena de la polimerasa (RCP), hace posible la rápida
detección de los ácidos nucleicos presentes en una muestra en lo
que previamente era una cantidad indetectablemente baja (ver
patente americana nr. 4.683.195; 4.683.202 y 4.965.188). El
desarrollo y la aplicación de la RCP se han descrito ampliamente en
la literatura. Por ejemplo, una gama de temas relacionados con la
RCP se comenta en PCR Technology - Principles and applications for
DNA amplification, 1989, (ed. H.A. Erlich) Stockton Press, New
Cork, NY; PCR Protocols: A guide to methods and applications, 1990;
(ed. M.A. Innis et al) Academic Press, San Diego, CA; and
PCR Strategies, 1995 (ed. M.A.Innis et al.) Academic Press,
San Diego, CA. Comercial vendors, como Perkin Elmer (Norwalk, CT),
market PCR reagents and publish PCR protocols.
El uso de la RCP y de la hibridación de muestras
para amplificar y detectar el ácido nucleico del
VIH-1 se ha revisado en Kwok, 1992, Ann. Med.
24:211-214 y Coutlee y cols., 1991, Mol. Cell.
Probes 5:241-259. Los ensayos de detección del VIH
basados en la RCP se han descrito en, por ejemplo, las patentes
americanas nr. 5.008.182 y 5.176.775; Kellogg y Kwok, 1990, en los
protocolos de la RCP: A guide to methods and applications, (ed.
Innis et al) Academic Press, San Diego,
CA:337-347; Holodniy y cols., 1991. J. Inf. Dis.
163:802-865; Jackson y cols., 1991, AIDS
5:1463-1467; y Mulder y cols., 1994, J.
Clin.Microbiol.32(2): 292-300.
Los estuches comerciales para la amplificación y
detección del VIH-1 se encuentran disponibles en el
comercio en Hoffmann-La Roche (Nutley, NJ). La
prueba Amplicor^{TM} VIH-1 es un ensayo in
vitro para la detección del ADN provírico del
VIH-1. La prueba AMPLICOR HIV-1
MONITORTM es un ensayo in vitro para la cuantificación del
ARN del VIH-1. Ambos ensayos Amplicor amplifican
los ácidos nucleicos del VIH-1 usando el primer par
SK462 (SEQ ID NO:5) y SK431 (SEQ ID NO:6), descritos en Mulder y
cols., 1994, J.Clin.Microbiol.32(2):292-300,
y a los que se hace referencia aquí como cebadores Amplicor
HIV-1.
El VIH-1 muestra una
variabilidad de la secuencia genómica considerable. Se ha descrito
el análisis filogenético de las secuencias de ácidos nucleicos de
los genes gag y env de VIH-1 en Myers
y cols., 1993, Human retrovirus y AIDS 1993, Los Alamos Nacional
Laboratory, Los Alamos, NM, a los que se hace aquí referencia.
Dentro de los grupos M se han identificado los subtipos
A-J. La WO 96/17079 describe el método de
amplificación de la repetición terminal. Para la amplificación de un
VIH-1 determinado artificial se utiliza un cebador
que tenga una secuencia que se solape a los cebadores SKCC1 y SKCC3
descritos en la solicitud actual.
Las técnicas convencionales de biología
molecular y de química de los ácidos nucleicos que se conocen en la
actualidad se explican en la literatura. Ver, por ejemplo,
Sambrook y cols. 1989, Molecular Cloning - A laboratory Manual,
Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbor, New Cork;
Oligonucleotide Síntesis (M.J.Gait, ed., 1984); Nucleic Acid
Hybridization (B.D. Hames y S.J. Higgins. eds., 1984); and a
series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc).
Una serie de cepas del grupo M del virus de
inmunodeficiencia adquirida tipo 1 han sido identificadas. Se trata
de cepas amplificables y no amplificables eficazmente usando
cebadores del gen gag descritos con anterioridad, en
particular, los cebadores Amplicor HIV-1, SK462 (SEQ
ID NO:5) y SK431 (SEQ ID NO:6). Estas cepas exhiben una
variabilidad de secuencia previamente no vista en la región que
encierra los lugares de enlace del cebador de los cebadores
Amplicor HIV-1.
Un objetivo de la presente invención es
conseguir unos pares de cebadores mejorados que permitan una
amplificación eficaz de estas cepas recién descubiertas, además de
todas las cepas amplificables con los cebadores Amplicor
HIV-1. Además, los primeros pares de la presente
invención permiten la amplificación de todas las cepas conocidas
del grupo M de VIH-1 con una eficacia casi
uniforme.
Un aspecto de la presente invención se refiere a
pares de cebadores de oligonucleótidos mejorados que permitirán la
amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (RCP) de
una región del gen gag de las cepas del grupo M de
VIH-1 de los subtipos A-G con casi
una eficacia uniforme y sin la amplificación simultánea de las
secuencias no correspondientes.
En particular, la presente invención se refiere
a pares de cebadores de oligonucleótidos para la amplificación del
ácido nucleico del virus de inmunodeficiencia adquirida tipo 1
(VIH-1), de forma que dicho cebador de nucleótido
sea el SK145 (SEQ ID NO:1) y SKCC1 (SEQ ID NO:3) o bien SK145 (SEQ
ID NO:1) y SKCC3 (SEQ ID NO:4).
En una configuración adicional estos pares de
cebadores se podrán combinar con el cebador SK145M2 (SEQ ID NO:2)
en un grupo de cebadores de oligonucleótidos formado por cebadores
de oligonucleótidos SK145 (SEQ ID NO:1), SKCC1 (SEQ ID NO:3) y
SK145M2 (SEQ ID NO:2) o bien en un grupo de cebadores de
oligonucleótidos formado por los cebadores de oligonucleótidos
SK145 (SEQ ID NO:1), SKCC3 (SEQ ID NO:4) y SK145M2 (SEQ ID
NO:2).
Otro aspecto de la invención se refiere a los
métodos mejorados para amplificar una región del gen gag de
los subtipos del grupo M del VIH-1 que comprendan
llevar a cabo una RCP usando los pares de cebadores de la
invención.
Otro aspecto de la invención se refiere a los
estuches que contengan un par de cebadores de amplificación de la
presente invención. Estos estuches pueden incluir unos reactivos
adicionales, como las muestras de detección o bien uno o más
reactivos de amplificación, por ejemplo, la polimerasa, los
tampones y los trifosfatos de nucleósido.
Para comprender mejor la invención se definen
varios términos a continuación.
Los términos "ácido nucleico" y
"oligonucleótido" se refieren a los polideoxirribonucleótidos
(que contienen
2-deoxi-D-ribosa), a
los polirribonucleótidos (que contienen D-ribosa) y
a cualquier otro tipo de polinucleótido que sea un glucósido N de
una base de purina o pirimidina, o base de purina o pirimidina
modificada. No existe una distinción clara en la longitud entre los
términos "ácido nucleico" y "oligonucleótido", y estos
términos se usarán sin intercambiarse. Estos términos se refieren
únicamente a la estructura primaria de la molécula. Por
consiguiente, estos términos incluyen el ADN de ramificación simple
y doble, así como el ARN de ramificación doble y simple.
Los oligonucleótidos pueden prepararse mediante
un método adecuado, que incluya la clonación y restricción de las
secuencias apropiadas y la síntesis química directa por un método
como el método del fosfotriéster de Narang y cols., 1979, Meth.
Enzymol. 68:90-99; el método del fosfodiéster de
Brown y cols., 1979, Meth. Enzymol. 69:109-151; el
método de la dietilfosforamidita de Beaucage y cols., 1981,
Tetrahedron Lett.22: 1859-1862; y el método del
soporte sólido de la patente americana nr. 4.458.066. Una revisión
de los métodos de síntesis se obtiene en Goodchild, 1990,
Bioconjugate Chemistry 1(3):165-187.
El término "hibridación" se refiere a la
formación de una estructura dúplex o de duplicidad por dos ácidos
nucleicos de ramificación simple debida a pares de bases
complementarias. La hibridación puede ocurrir entre ramas de ácido
nucleico totalmente complementarias o bien entre ramas de ácido
nucleico "sustancialmente complementarias" que contengan
regiones mínimas de emparejamiento incorrecto o incompatibilidad.
Las condiciones en las cuales únicamente ramas de ácido nucleico
totalmente complementarias hibridarán se conocen como
"condiciones de hibridación astringentes" o "condiciones de
hibridación específicas de la secuencia". Las duplicidades
estables de secuencias sustancialmente complementarias se pueden
conseguir en unas condiciones de hibridación menos astringentes; el
grado de emparejamiento incorrecto o incompatibilidad tolerado se
puede controlar mediante el ajuste apropiado de las condiciones de
hibridación. Los expertos en el tema de la tecnología del ácido
nucleico pueden determinar la estabilidad de la duplicidad de forma
empírica, considerando una serie de variables que incluirán, por
ejemplo, la longitud y la concentración del par de base de los
oligonucleótidos, la resistencia iónica, y la incidencia de pares
de bases incompatibles, siguiendo las directrices según el modelo
(ver, por ejemplo, Sambrook y cols., 1989, Molecular Cloning - A
laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, New Cork; y Wetmur, 1991, Critical Reviews in Biochem and
Mol. Biol. 26(3/4):227-259).
El término "cebador" se refiere a un
oligonucleótido, natural o sintético, capaz de actuar como un punto
de inicio de la síntesis del ADN en unas condiciones en las que se
induce la síntesis de un producto de extensión del cebador
complementario a una rama de ácido nucleico, por ejemplo, en
presencia de cuatro trifosfatos de nucleósido distintos y un agente
de polimerización (es decir, polimerasa de ADN o transcriptasa
invertida) en un tampón apropiado y a una temperatura apropiada. Un
cebado es preferiblemente un oligodeoxirribonucleótido de rama
única. La longitud apropiada de un cebador depende del uso previsto
del cebador pero oscila típicamente entre 15 y 35 nucleótidos. Las
moléculas de cebador cortas generalmente requieren temperaturas más
frías para formar unos complejos híbridos suficientemente estables
con el patrón. Una primera necesidad no refleja la secuencia exacta
del ácido nucleico modelo, pero debe ser suficientemente
complementaria para formar un híbrido con el patrón. Los cebadores
pueden incorporar unas características adicionales que permitan la
detección o inmovilización del cebador pero no alteren la propiedad
básica del cebador, la de actuar como punto de inicio de la
síntesis del ADN. Por ejemplo, los cebadores pueden contener una
secuencia de ácido nucleico adicional en el extremo 5' que no forme
híbridos con el ácido nucleico de referencia, pero que facilite la
clonación del producto amplificado. La región del cebador que es
suficientemente complementaria con el modelo para formar híbridos
se conoce aquí como región de hibridación.
Tal como aquí se usa, el cebador "corriente
arriba" se refiere al cebador cuyo producto de extensión es una
subsecuencia de la rama de codificación. El cebador "corriente
abajo" se refiere al cebador cuyo producto de extensión es una
subsecuencia de la rama no codificada complementaria.
Los términos "secuencia de referencia",
"región de referencia" y "ácido nucleico de referencia"
se refieren a una zona de un ácido nucleico que ha de ser
amplificada, detectada o bien analizada de otro modo.
Tal como se utiliza aquí, un cebador es
"específico" para una secuencia de referencia si el número de
emparejamientos incorrectos o incompatibilidades presentes entre el
cebador y la secuencia de referencia es menor al número de
emparejamientos incorrectos entre el cebador y las secuencias que
no son de referencia que podrían estar presentes en una muestra.
Las condiciones de hibridación en las que se forman duplicidades
estables se pueden elegir únicamente si el número de
incompatibilidades presente no es superior al número de
incompatibilidades presente entre el cebador y la secuencia de
referencia. En dichas condiciones, el cebador específico de
referencia puede formar una duplicidad estable solamente con una
secuencia de referencia. Por consiguiente, el uso de cebadores
específicos de referencia en unas condiciones de amplificación
suficientemente astringentes permite la amplificación específica de
aquellas secuencias que contienen los puntos de enlace del cebador
de referencia. Del mismo modo, el uso de muestras específicas de
referencia en unas condiciones de hibridación suficientemente
astringentes permite la detección de una secuencia de referencia
específica.
El término "mezcla de reacción de
amplificación" se refiere a una solución que contiene los
reactivos necesarios para llevar a cabo una reacción de
amplificación y contiene típicamente cebadores, una polimerasa de
ADN termoestable, dNTP, y un catión metálico divalente en un tampón
adecuado. Una mezcla de reacción se considera completa si contiene
todos los reactivos necesarios para llevar a cabo la reacción, e
incompleta si contiene únicamente un subgrupo de los reactivos
necesarios. Un experto en el tema considerará que los componentes
de la reacción son almacenados de forma rutinaria como soluciones
distintas, conteniendo cada una de ellas un subgrupo del total de
componentes, por cuestiones de conveniencia, estabilidad en el
almacenamiento, o para permitir el ajuste dependiente de la
aplicación de las concentraciones de componentes, y que los
componentes de reacción se combinen previamente a la reacción para
completar una mezcla de reacción. Además, un experto en el tema
entenderá que los componentes de la reacción se empaqueten por
separado para su comercialización y que los estuches comerciales
útiles puedan contener cualquier subgrupo de componentes de
reacción que incluya cebadores de la presente invención.
Los pares de cebadores de la presente invención
permiten la amplificación de ácidos nucleicos de los subtipos del
grupo M de VIH-1. Los pares de cebadores representan
una mejoría significativa respecto a los cebadores descritos con
anterioridad ya que permiten la amplificación del ácido nucleico de
una región del gen gag de todas las cepas de subtipos
A-G que pertenecen al grupo M con una eficacia casi
uniforme, incluyendo las cepas recién descubiertas. Las se-
cuencias de nucleótidos de los cebadores se indican a continuación, de izquierda a derecha en una orientación 5' a 3'.
cuencias de nucleótidos de los cebadores se indican a continuación, de izquierda a derecha en una orientación 5' a 3'.
| SK145 (SEQ ID NO:1) | AGTGGGGGACATAAGCAGCCATGCAAAT |
| SK145M2 (SEQ ID NO:2) | AGTGGGGGACACAGGCAGCAATGCAAAT |
\vskip1.000000\baselineskip
| SKCC1 (SEQ ID NO:3) | TACTAGTAGTTCCTGCTATGTCACTTCC |
| SKCC3 (SEQ ID NO:4) | TGAAGGGTAGTAGTTCCTGCTAT |
Los cebadores corriente abajo se puede usar con
cualquier cebador corriente arriba que aquí se indique. Los
cebadores corriente abajo se utilizan preferiblemente con el
cebador corriente arriba SK145(SEQ ID NO:1), opcionalmente
junto con el cebador corriente arriba SK145M2(SEQ ID NO:2).
El cebador corriente arriba SK145(SEQ ID NOR:1)se ha
descrito en Kellogg y Kwok, 1990, en Protocolos de la RCP: A guide
to Methods and Applications (ed. Innis et al.), Academic
Press, San Diego, CA:337-347. El segundo cebador
corriente arriba, SK145M2 (SEQ ID NO:2), forma híbridos en la
misma región que el SK145 (SEQ ID NO:1), pero ha sido diseñado para
compatibilizar más estrechamente con la secuencia de nucleótidos de
ciertas cepas de VIH-1 de los subtipos A y E. Tal
como se muestra en los ejemplos, el uso de ambos cebadores
corriente arriba puede ayudar a equilibrar la eficacia de
amplificación de subtipos especiales.
Las amplificaciones se llevan a cabo en unas
condiciones que permitan la amplificación de todos los subtipos M
del grupo HIV-1, pero que sean suficientemente
astringentes como para evitar la amplificación de secuencias que no
sean de referencia. Las condiciones de reacción de amplificación
preferidas se describen en los ejemplos, en Mulder y cols., 1994,
J.Clin. Microbiol. 32(2):292-300, y en el
producto adicional de la prueba AMPLICOR HIV-1
MONITOR. Las condiciones exactas no son un aspecto crítico de la
invención. La optimización de las condiciones de amplificación se
puede realizar de forma rutinaria en base a las directrices aquí
propuestas.
Los pares y métodos de cebadores de la presente
invención se pueden usar para detectar tanto el ADN provírico del
VIH-1 como el ARN del VIH-1. La
amplificación del ARN usando una trascripción invertida/reacción en
cadena de la polimerasa (TI/RCP) es bien conocida y se ha descrito
en las patentes americanas nr. 5.322.770 y 5.310.652; Myers y
Gelfand, 1991, Biochemistry 30(31):7661-7666;
y Young y cols.,1993, J.Clin.Microbiol.
31(4):882-886. La amplificación
TI-RCP del ARN del VIH-1 se describe
en Mulder y cols.,1994, J.Clin.Microbiol.
32(2):292-300 y Holodniy y cols., 1991,
J.Inf.Dis. 163:802-865.
Los métodos para la preparación de muestras
adecuados para la amplificación del ADN y del ARN del
VIH-1 se describen en la literatura. El método
especial usado no es un aspecto crítico de la presente invención.
Un experto en la materia puede seleccionar y optimizar los métodos
de preparación de muestras adecuados en base a las directrices que
aquí se indican. Los métodos de preparación de muestras preferidos
para utilizar en la detección del ADN provírico del
VIH-1 se han descrito en Casareale y cols., 1992,
PCR Methods and Applications 2:149-153 and Butcher
and Spadoro, 1992, Clin. Immunol. Newsletter
12:73-76. Un estuche de preparación de
muestras preferido para la detección del ADN provírico del
HIV-1 se encuentra disponible en el comercio como
parte de la prueba Amplicor HIV-1. Los métodos de
preparación de muestras preferidos para utilizar en la detección
del ARN del HIV-1 en plasma se han descrito en
Mulder y cols., 1994, J. Clin. Microbiol.
32(2):292-300. Un estuche de preparación de
muestras preferido para la detección y/o cuantificación del ARN del
HIV-1 se encuentra disponible como parte de la
prueba AMPLICOR HIV-1 MONITOR.
Los pares de cebadores de amplificación y los
métodos de la presente invención son adecuados para cualquier
aplicación que utilice ácido nucleico amplificado. Por ejemplo, la
clonación y/o la secuenciación de las secuencias de
HIV-1 vienen facilitadas por el uso de los
cebadores actuales. Los métodos para detectar los ácidos nucleicos
amplificados de la RCP son bien conocidos. El método utilizado para
analizar el ácido nucleico amplificado no es un aspecto crítico de
la invención y se puede utilizar cualquier método adecuado.
Preferiblemente, la amplificación del ARN del HIV-1
se utiliza tal como se ha descrito en los ejemplos para cuantificar
la carga vírica.
Ejemplos de métodos para detectar los ácidos
nucleicos amplificados incluyen el análisis del producto de
amplificación mediante electroforesis del gel y la detección por
hibridación con muestras complementarias de oligonucleótidos. Los
formatos de valoración adecuados para detectar la hibridación de la
muestra de referencia son bien conocidos e incluyen los formatos de
valoración Dot-blot y Dot-blot
reverso.
En un formato Dot-blot o de
transferencia puntual, el ADN de referencia amplificado se
inmoviliza sobre un soporte sólido, tal como una membrana de nylon.
El complejo de referencia de la membrana es incubado con la muestra
etiquetada en unas condiciones de hibridación adecuadas, se retira
la muestra no hibridizada lavando en unas condiciones
suficientemente astringentes y se controla la presencia de la
muestra enlazada en la membrana. La detección
Dot-blot de los productos de amplificación de la
RCP se ha descrito, por ejemplo, en Saiki y cols, 1986, Nature
324:163-166 y en la patente americana nr.
5.468.613.
En un formato dot-blot reverso,
las muestras son inmovilizadas sobre un soporte sólido, como una
membrana de nylon y se etiqueta el ADN de referencia amplificado.
El ADN de referencia se marca típicamente durante la amplificación
mediante la incorporación de los cebadores marcados. Uno o ambos
cebadores pueden ser etiquetados. El complejo
membrana-muestra se incuba con el ADN de referencia
amplificado en unas condiciones de hibridación adecuadas se retira
la muestra no hibridizada lavando en unas condiciones
suficientemente astringentes y se controla la presencia de la
muestra enlazada en la membrana. La detección
Dot-blot reversa de los productos de amplificación
de la RCP se ha descrito, por ejemplo, en Saiki y cols, 1989, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 86:6230 y en la patente americana nr.
5.468.613.
Alternativamente, la valoración
dot-blot reversa puede ser realizada usando un
soporte sólido que tenga una pluralidad de puntos o pocillos de
hibridación de la muestra. Por ejemplo, una microplaca es
especialmente útil en aplicaciones clínicas a gran escala de los
métodos actuales. Las muestras pueden ser inmovilizadas a una
microplaca mediante una unión pasiva o a través de un producto
intermedio proteínico como la albúmina de suero bovino (ASB), que
se adhiere a la microplacas (ver Tung y cols, 1991,
Bioconjugate Chem. 2:464-465). Los métodos
dot-blot inversos o reversos llevados a cabo en una
microplaca se han descrito en la patente americana nr. 5.232.829;
Loeffelholz y cols., 1992, J.Clin. Microbiol.
30(11):2847-2851; Jackson y cols., 1991,
AIDS 5:1463-1467; Mulder y cols., 1994, J.
Clin. Microbiol. 32(2):292-300; la prueba
AMPLICOR HIV-1 producto insertado; y la prueba
AMPLICOR HIV-1 MONITOR producto insertado.
Preferiblemente, la detección y/o cuantificación
del producto amplificado se realiza mediante la hibridación con
una muestra de oligonucleótido inmovilizada en una microplaca
usando los reactivos y protocolos de la prueba Amplicor
HIV-1 o de la prueba AMPLICOR HIV-1
MONITOR. El uso de los métodos actuales para cuantificar el ARN del
HIV-1 se ha descrito más adelante en los
ejemplos.
De forma alternativa, las muestras de
BSA-conjugado se enlazan a las micropartículas
magnéticas. Las muestras enlazadas son hibridizadas en solución al
producto de amplificación marcado, y lo que resulta es retirado de
la solución de forma magnética. Los duplicados de hibridación
inmovilizados magnéticamente son luego detectados tal como se ha
descrito en los métodos.
Otro método de valoración adecuado, al que se
hace referencia como una valoración de la
5'-nucleasa se ha descrito en las patentes nr.
5.210.015 y 5.487.972 y Holland y cols., 1988, proa. Nati. Acad.
Sci. USA 88<.7276-7280. En la valoración
de las 5'-nucleasas, las muestras de detección
marcadas que se han modificado para impedir que las muestras actúen
como cebadores para la síntesis del ADN se añaden durante la mezcla
de reacción de amplificación. Cualquier muestra que forme híbridos
con el ADN de referencia durante cada etapa de síntesis, es decir,
durante la extensión del cebador, es degradada por la actividad de
la 5' a 3' exonucleasa de la polimerasa del ADN, por ejemplo, Taq
ADN polimerasa. Luego se detecta el producto de degradación de la
muestra. Así pues, la presencia del producto de descomposición o
degradación de la muestra indica que se ha producido la hibridación
entre la muestra y el ADN de referencia y que también se ha
producido la reacción de amplificación. Las patentes americanas
números 5.491.063 y 5.571.673 describen métodos mejorados para
detectar la degradación de la muestra que se produce al mismo
tiempo que la amplificación.
Los formatos de valoración descritos antes
utilizan típicamente oligonucleótidos marcados para facilitar la
detección de los duplicados híbridos. Los oligonucleótidos pueden
ser marcados incorporando una etiqueta detectable por un medio
espectroscópico, fotoquímico, bioquímico, inmunoquímico o químico.
Las etiquetas útiles incluyen ^{32}P, colorantes fluorescentes,
reactives densos en electrones, enzimas (utilizadas frecuentemente
en ELISAS), biotina o haptenos y proteínas para las cuales se
dispone de antisueros o anticuerpos monoclonales. Los
oligonucleótidos marcados de la invención se pueden sintetizar y
marcar usando las técnicas descritas antes para sintetizar
oligonucleótidos.
Un método alternativo para detectar la
amplificación del ácido nucleico del VIH-1
controlando el aumento en la cantidad total de ADN doblemente
ramificado en la mezcla de reacción se ha descrito en Higuchi y
cols., 1992, Bio/Technology 10: 413-417;
Higuchi y cols., 1993, Bio/Technology
11:1026-1030; y European Patent Publication
Nr. 512.334. La detección del ADN de referencia doblemente
ramificado se basa en la elevada fluorescencia que el bromuro de
etidio (EtBr) y otros marcadores de enlace del ADN exhiben cuando
están enlazados al ADN doblemente ramificado. El marcador de enlace
del ADN se añade a la mezcla de reacción de amplificación. La
amplificación de la secuencia de referencia dará lugar a un
incremento en la cantidad de ADN doblemente ramificado, que dará
lugar a un aumento detectable de la fluorescencia.
La presente invención se refiere también a los
estuches, unidades multirecipiente que comprenden componentes
útiles para llevar a la práctica el método actual. Un estuche útil
contiene cebadores para la amplificación de la RCP del ácido
nucleico del VIH-1. Un estuche puede contener
también un medio para detectar el ácido nucleico del
VIH-1 amplificado, como las muestras de
oligonucleótidos. En algunos casos, las muestras se fijarán a una
membrana de soporte apropiada. Otros componentes opcionales del
estuche incluyen, por ejemplo, un agente para catalizar la síntesis
de los productos de extensión del cebador, los trifosfatos de
nucleósido del sustrato, los medios utilizados para marcar (por
ejemplo, un conjugado de enzima de avidina y un sustrato de enzima
y el cromógeno si la etiqueta es la biotina), los tampones
apropiados para la RCP o las reacciones de hibridación, e
instrucciones para llevar a cabo el método actual.
Los ejemplos de la presente invención que se
indican a continuación son para fines ilustrativos y no para
limitar el alcance de la invención. Numerosas versiones de la
invención dentro del alcance de las reivindicaciones que siguen a
los ejemplos serán evidentes para los expertos en este campo a
partir de la lectura del texto anterior y de los ejemplos
siguientes.
La cuantificación de la carga vírica, llevada a
cabo usando la prueba AMPLICOR HIV-1 MONITOR
utiliza un patrón o estándar cuantitativo (QS) que es amplificado
usando el mismo par de cebadores, pero que es detectado usando una
muestra distinta. El QS se añade a la muestra de prueba en una
concentración conocida para dar una señal de referencia conocida.
Para una gama amplia de concentraciones de referencia, la señal
generada de la referencia amplificada o del QS amplificado es
proporcional a la cantidad presente. El número de copias de
referencia se calcula a partir de una comparación de la señal
generada de la amplificación de la referencia desconocida respecto
a la señal generada del QS conocido.
Los pares de cebadores de la presente invención
amplifican una región que no se adapta completamente al QS incluido
en la prueba AMPLICOR HIV-1 MONITOR (el Amplicor
QS). Por consiguiente, se construía un nuevo QS para ser utilizado
con los cebadores de la presente invención. El QS nuevo se
construía a partir del Amplicor QS ampliando la secuencia del
Amplicor QS para encerrar los puntos de enlace del SKCC1 (SEQ ID
NO:3) y SKCC3 (SEQ ID NO:4). El QS resultante se detecta usando la
muestra específica de QS empleada en la prueba AMPLICOR
HIV-1 MONITOR. La construcción de un plasmida que
contiene la nueva secuencia QS, a partir de la cual se transcribe
el ARN del QS, puede efectuarse utilizando técnicas estándar tal
como se describe a continuación.
El Amplicor QS obtenido de la prueba AMPLICOR
HIV-1 MONITOR se amplifica usando el SK145 (SEQ ID
NO:1) y el SK151 (SEQ ID NO:7) en unas condiciones como las
descritas en el ejemplo 2 siguiente. La amplificación dará lugar a
un producto de ADN que contendrá unos puntos de enlace del cebador
para SK145 (SEQ ID NO:1) y SK151(SEQ ID NO:7) y retendrá la
secuencia interna que contenga el punto de enlace de la muestra
específica del QS.
Seguidamente, el producto amplificado resultante
se extiende para rodear el lugar de enlace del cebador del SKCC1
(SEQ ID NO:3) y se añade un elemento de enlace para permitir la
clonación del producto. Esto se consigue reamplificando el producto
usando SK145(SEQ ID NO:1) extendido en el extremo 5' para
incluir un elemento de enlace HindIII y el SKCC1 (SEQ ID NO:3). Las
condiciones de amplificación adecuadas se describen en Kellogg y
Kwok, 1990, en los protocolos de la RCP: A Guide to Methods and
Applications, (ed. Innis y cols.), Academia Press, San Diego, CA):
337-347, con la excepción de que una temperatura de
recocido/extensión inferior (por ejemplo, 42°C) se utiliza para
permitir la hibridación del SKCC1 (SEQ ID NO:3).
A continuación, el producto amplificado
resultante se extiende todavía más para rodear el punto de enlace
del cebador del SKCC3 (SEQ ID NO:4) y se añade un segundo elemento
de enlace en el otro extremo para conseguir la clonación del
producto. Esto se consigue amplificando el producto usando
SK145(SEQ ID NO:1) extendido en el extremo 5' para incluir
un elemento de enlace HindIII, tal como se ha descrito antes, junto
con el SKCC3 (SEQ ID NO:4) extendido en el extremo 5' para incluir
un elemento de enlace XBaI, usando las mismas condiciones de
amplificación que antes.
Seguidamente, el producto amplificado se inserta
en un plásmido. El ADN amplificado y el plásmido pSP64 (Promega,
Madison, WI) se digieren por separado con HindI y XBaI y luego se
unen usando procedimiento estándar. Las células competentes son
transformadas con los plásmidos recombinantes y se obtiene un clon
que contiene el inserto correcto. El inserto clonado en el plásmido
resultante debería tener una secuencia que determinara que no se
introducen mutaciones en los puntos de enlace del cebador o de la
muestra.
El ARN QS se transcribe del plásmido
recombinante que contiene la secuencia QS usando el estuche
MEgascript^{TM} SP6 (Ambion, Inc., Austin, TX).
Este ejemplo describe una valoración de la
eficacia relativa de las amplificaciones de varias cepas de
VIH-1. Para comparación, las amplificaciones
también se realizaban usando el estuche de prueba AMPLICOR
HIV-1 MONITOR.
Las cepas HIV-1 se obtenían de
las muestras clínicas positivas de VIH-1. Se
clonaba una zona del gen gag y se secuenciaba usando
técnicas estándar y el subtipo de VIH-1 clonado se
determinaba en base a la secuencia. Una serie de estas cepas de
VIH-1 resultaba que eran nuevas. Para este ejemplo,
se elegían unas cepas las cuales, en base a las secuencias de
nucleótidos, se esperaba que fueran problemáticas para la prueba
AMPLICOR HIV-1 MONITOR. Además, se utilizaban cepas
que fueran representativas de la variación de la secuencia presente
en los subtipos M del grupo.
Se construían los plásmidos que contienen una
zona del gen gag del VIH-1 de cada cepa y
los modelos se transcribían esencialmente tal como se describe en
Holodniy y cols., 1991, .J.Inf.Dis. 163:802-865. Se
preparaban las soluciones madre de cada modelo y se analizaban las
concentraciones modelo o patrón. Las soluciones madre se diluían en
base a las concentraciones relativas estimadas de manera que la
concentración del patrón añadida a cada reacción era la misma. El
número absoluto de copias del modelo que se añadía a las reacciones
era de aproximadamente 4000-8000.
Un QS tal como se ha descrito en el ejemplo 1 se
introducía en cada mezcla de reacción a una concentración conocida,
que solía ser de unas 100 copias por reacción.
Las reacciones A-F se llevaban a
cabo usando las siguientes combinaciones de cebador.
Combinaciones de cebadores
comparadas
| Reacción | \hskip1cm Combinación de cebador | ||
| A | SK462 | (SEQ ID NO:5) | |
| SK431 | (SEQ ID NO:6) | ||
| B | SK145 | (SEQ ID NO:1) | |
| SK151 | (SEQ ID NO:7) | ||
| C | SK145 | (SEQ ID NO:1) | |
| SKCC1 | (SEQ ID NO:3) | ||
| D | SK145 | (SEQ ID NO:1) y SK145M2 (SEQ I NO:2) | |
| SKCC1 | (SEQ ID NO:3) | ||
| E | SK145 | (SEQ ID NO:1) | |
| SKCC3 | (SEQ ID NO:4) | ||
| F | SK145 | (SEQ ID NO:1) y SK145M2 (SEQ I NO:2) | |
| SKCC3 | (SEQ ID NO:4) |
Todos los cebadores eran biotinilados en el
extremo 5' para permitir la detección en un formato de microplaca
dot-blot inverso. Las secuencias de los cebadores
adicionales no descritas antes se indican a continuación en una
orientación 5' a 3'.
| SK462(SEQ ID NO:5) | AGTTGGAGGACATCAAGCAGCCATGCAAAT |
\vskip1.000000\baselineskip
| SK431 (SEQ ID NO:6) | TGCTATGTCAGTTCCCCTTGGTTCTCT |
| SK151 (SEQ ID NO:7) | TGCTATGTCACTTCCCCTGGTTCTCT |
La reacción de amplificación A se llevaba a cabo
usando los reactivos y las condiciones de la prueba AMPLICOR
HIV-1 MONITOR.
La reacción de amplificación B se llevaba a cabo
en volúmenes de 100 \mul que contenían los reactivos
siguientes:
- ARN del patrón del VIH-1
- ARN QS
- Bicine 50 mM, ph 8,3
- 111 mM K(OAc)
- Mn(OAc)_{2} 3,6 mM
- dUTP 500 pM
- 300 \muM de cada dATP, dCTP y dGTP
- 50 \muM dTTP
- 15% de glicerina
- 0,2 \muM de cada cebador biotinilado
- 2 unidades de UNG*
- 10 unidades de polimerasa de ADN rT
* fabricado y desarrollado por
Hoffmann-La Roche y comercializado por Perkin Elmer
(Norwalk, CT)
Las reacciones de amplificación C y D se
llevaban a cabo en unas condiciones como las usadas en la reacción
B, pero con los cambios siguientes:
- 100 mM K(OAc)
- 500 \muM de cada dATP, dCTP y dGTP
- 7,5% de glicerina
- 10 unidades de UNG
Las reacciones de amplificación E y F se
llevaban a cabo en unas condiciones como las usadas en las
reacciones C y D pero con la excepción de que se utilizaba una
concentración de glicerina del 10%. Las diferencias mínimas en las
mezclas de reacción eran el resultado de una optimización previa de
las condiciones de amplificación para cada par de cebadores.
Las reacciones de amplificación
B-F se llevaban a cabo en un ciclador térmico TC9600
DNA (Perkin elmer, Norwalk, CT) usando el perfil de temperatura
siguiente:
- Incubación pre-reacción:
- 50°C durante 2 minutos
Transcripción reversa 60°C durante 30
minutos:
- 4 ciclos:
- desnaturalizado: 95°C durante 10 segundos
- \quad
- Recocido: 55°C durante 10 segundos, y
- \quad
- Extensión: 72°C durante 10 segundos;
\vskip1.000000\baselineskip
- 26 ciclos:
- desnaturalizado: 90°C durante 10 segundos
- \quad
- Recocido: 60°C durante 10 segundos, y
- \quad
- Extensión: 72°C durante 10 segundos;
\vskip1.000000\baselineskip
- Extensión final:
- 72°C durante 15 minutos;
Los productos amplificados se detectaban usando
los reactivos y protocolos de la prueba AMPLICOR
HIV-1 MONITOR. La concentración de referencia
inicial estimada se calculaba tal como se ha descrito antes.
En el método de cuantificación de la prueba
AMPLICOR HIV-1 MONITOR, la concentración de
referencia inicial se calcula a partir de una comparación de las
señales generadas después de la amplificación de la referencia
respecto a la señal generada después de la amplificación de una
concentración conocida de QS. Puesto que la concentración conocida
de QS es el valor de pre-amplificación, mientras que
las señales comparadas son señales
post-amplificación, los cambios en la eficacia
relativa de la amplificación afectarán al valor aproximado de la
concentración inicial de la referencia desconocida. La
cuantificación AMPLICOR HIV-1 MONITOR se calibra en
base a la eficacia de amplificación del subtipo B de
VIH-1. Se sabe que los subtipos
VIH-1 pueden ser amplificados con una menor
eficacia y, como consecuencia de ello, la concentración de
referencia estimada sería un valor inferior a la verdadera
concentración.
En el experimento actual, el ARN de referencia
se añadía en una concentración conocida a cada reacción. Por
consiguiente, la eficacia de amplificación relativa para cada cepa
se puede determinar comparando las concentraciones de referencia
estimadas. Puesto que la prueba de cuantificación AMPLICOR
HIV-1 MONITOR se calibra en base a la eficacia de
amplificación del subtipo B del VIH-1, la
concentración de referencia aproximada del subtipo B (clon
105-1) se utilizaba como una referencia. Para cada
cepa, la concentración de referencia estimada para el subtipo B
(clon 105-1) se dividía ponla concentración de
referencia aproximada para la cepa para dar una medida de la
eficacia de amplificación relativa. Estas eficacias de
amplificaciones relativas se indican en la tabla siguiente. Una
entrada de "-" indica que no se realizó la reacción.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa página
siguiente)
\newpage
Eficacia relativa al subtipo
B
Los resultados demuestran que la prueba AMPLICOR
HIV-1 MONITOR (reacción A) amplificaba las
diferentes cepas de VIH-1 con una variación
significativa en la eficacia. Algunas de las cepas, que incluyen la
cepa del subtipo E, el clon 110-5, se amplificaban
con una eficacia al menos 500 veces menor que la eficacia de
amplificación del subtipo B, clon 105-1.
Aunque no se comprobaban todas las cepas, el uso
del par de cebadores SK145 (SEQ ID N0:1) y SK151 (SEQ ID
NO:7)(reacción B) parecía mejorar la uniformidad de la eficacia de
amplificación de una forma significativa. Sin embargo, la cepa del
subtipo E, clon 110-5, todavía se amplificaba con
una eficacia unas 500 veces menor que la eficacia de amplificación
del subtipo B, clon 105-1.
El uso de SK145 (SEQ ID NO:1) y SKCC1 (SEQ ID
NO:3)(reacción C) permitía la amplificación de todas las cepas,
incluyendo la cepa del subtipo E, el clon 110-5, con
una eficacia de unas 3 veces la eficacia de amplificación del
subtipo B, clon 105-1. La adición de SK145M2 (SEQ ID
NO:2)(reacción D) mejoraba además la eficacia de amplificación del
subtipo B, clon 105-1. La adición de SK145M2 (SEQ
ID NO:2)(reacción F) mejoraba además la eficacia de amplificación
de la cepa 110-5, básicamente equivalente a la de
la cepa de referencia del subtipo B.
En este ejemplo, 30 muestras clínicas obtenidas
de pacientes seropositivos del Senegal se analizaban en busca de
la presencia de ARN de VIH-1. No se determinaban los
subtipos presentes en las muestras clínicas. Sin embargo, como los
subtipos A y D son frecuentes en esta región de Africa, se esperaba
que algunas muestras clínicas no fueran amplificadas o no fueran
amplificadas eficazmente usando la prueba AMPLICOR
HIV-1 MONITOR.
Las muestras se preparaban tal como sigue. Las
muestras de plasma (80-250 \mul) se combinaban
con 20 \mul de un 0,25% (p/v) de microesferas de poliestireno
rojas Estapor (Bangs Laboratorios, Inc. Carmel, IN) en un tubo de
centrífuga cónico de 1,5 ml y se centrifugaban durante 1 hora a
25,300 X g a 4°C. El sobrenadante se aspiraba y los gránulos se
volvían a suspender en 250 \mul de tampón (50 \mul de tampçón
de lisis es igual a 6,7 \mul de RNasin 30 U/\mul (Promega,
Madison, WI) ; 0,67 \mul de DTT 100 mM; 2 \mul de NP40 al 10%
(Pierce, Rockford, IL); 0,25 \mul de poly-rA ARN 4
mg/ml; y 40,4 \mul de Depc-treated H_{2}O). Los
gránulos se incubaban a temperatura ambiente durante al menos 15
minutos y se agitaban para garantizar la mezcla.
Las amplificaciones se llevaban a cabo en
reacciones de 100 \mul que contenían 50 \mul de solución de
lisado vírica y 50 \mul de una mezcla 2X de reactivos de
amplificación formulada de manera que la concentración final del
reactivo era tal como se ha descrito antes. Aproximadamente 100
copias del QS apropiado se añadían a cada reacción como parte de
la mezcla de reacción. La detección del producto amplificado se
llevaba a cabo usando los reactivos y protocolos de la prueba
AMPLICOR HIV-1 MONITOR, tal como se ha descrito
antes.
Las amplificaciones de cada muestra se llevaban
a cabo usando las siguientes combinaciones de cebadores.
Combinaciones de cebadores
comparadas
| Reacción | \hskip1cm Combinación de cebador | ||
| A | SK462 | (SEQ ID NO:5) | |
| SK431 | (SEQ ID NO:6) | ||
| B | SK145 | (SEQ ID NO:1) | |
| SKCC1 | (SEQ ID NO:3) | ||
| C | SK145 | (SEQ ID NO:1) y SK145M2 (SEQ ID NO:2) | |
| SKCC1 | (SEQ ID NO:3) |
Los resultados, expresados en copias del patrón
VIH-1 por ml de plasma se resumen a
continuación.
Concentración de referencia
estimada
(copias/ml)
Los resultados indican que los pares de
cebadores de la presente invención, combinaciones B y C, permitían
la amplificación de más de las muestras clínicas. Las combinaciones
de cebadores B y C permitían la amplificación de todas las 20
muestras. En contraste con ello, la prueba AMPLICOR
HIV-1 MONITOR fallaba a la hora de amplificar 6 de
las 29 muestras. La amplificación de la muestra MIH 053 usando la
prueba AMPLICOR HIV-1 MONITOR daba lugar a una
señal de referencia fuerte, pero no podía generar una señal QS.
Por consiguiente, la muestra no era
cuantificable y se marcaba como "+" en la tabla.
Además, para un número significativo de
muestras, el número de copias estimado usando tanto la combinación
de cebadores B como la C era significativamente superior a la
estimada usando la prueba AMPLICOR HIV-1 MONITOR. En
base a la variabilidad de la eficacia de amplificación demostrada i
en el ejemplo 2 anterior, los valores estimados inferiores de la
concentración de plasma obtenida usando el AMPLICOR
HIV-1 MONITOR eran el resultado de unas eficacias de
amplificación significativamente inferiores.
El ARN vírico no se detectaba en la muestra MIN
067. Sin embargo, se sabe que esto es debido a una variabilidad no
observada en la secuencia de referencia que interfería con la
hibridación del cebador o de la muestra, o bien por cualquier otra
causa.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A):
- F. HOFFMANN-LA ROCHE AG
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Grenzacherstrasse 124
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Basle
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: BS
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Suiza
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: CH-4070
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 061-688 37 82
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 061-688 13 95
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- TELEX: 962292 /965542 hlr ch
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TITULO DE LA INVENCIÓN: Cebadores para la detección de VIH-1
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 7
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE DEL ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: floppy disk
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: Apple Macintosh
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERACIONAL: Sistema 7.1 (Macintosh)
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARES: Word 5.1
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- DATOS DE SOLICITUD PREVIOS:
\vskip0.500000\baselineskip
- NÚMERO DE SOLICITUD: 60-037744
\vskip0.500000\baselineskip
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 17.01.97
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- RAMIFICACIÓN: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGTGGGGGGA CATCAAGCAG CCATGCAAAT
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- RAMIFICACIÓN: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGTGGGGGGA CACCAGGCAG CAATGCAAAT
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3:
\vskip0.500000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- RAMIFICACIÓN: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTACTAGTAGT TCCTGCTATG TCACTTCC
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- RAMIFICACIÓN: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGAAGGGTAC TAGTAGTTCC TGCTAT
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) IMFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- RAMIFICACIÓN: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGTTGGAGGA CATCAAGCAG CCATGCAAAT
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- RAMIFICACIÓN: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGCTATGTCA GTTCCCCTTG GTTCTCT
\hfill27
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- RAMIFICACIÓN: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGCTATGTCA CTTCCCCTTG GTTCTCT
\hfill27
Claims (8)
1. Un par de cebadores de oligonucleótidos para
la amplificación del ácido nucleico del virus de inmunodeficiencia
humana tipo 1 (VIH-1), de manera que dicho par de
cebadores de oligonucleótidos es el SK145 (SEQ ID NO:1) y SKCC1
(SEQ ID NO:3) o bien SK145 (SEQ ID NO:1) y SKCC3 (SEQ ID NO:4).
2. Un grupo de cebadores de oligonucleótidos
formado por un par de cebadores de oligonucleótidos de la
reivindicación 1 y el SK145M2 (SEQ ID NO:2).
3. Un estuche para detectar el ácido nucleico
del virus de inmunodeficiencia humana tipo 1
(VIH-1) de forma que dicho estuche comprenda un par
de cebadores de oligonucleótidos de la reivindicación 1.
4. Un estuche para detectar el ácido nucleico
del virus de inmunodeficiencia humana tipo 1
(VIH-1) de forma que dicho estuche comprenda un par
de cebadores de oligonucleótidos de la reivindicación 2.
5. Un método para amplificar el ácido nucleico
del virus de inmunodeficiencia humana tipo 1
(VIH-1) de forma que dicho método comprenda llevar
a cabo una reacción en cadena de la polimerasa usando el par de
cebadores SK145 (SEQ ID NO:1) y el SKCC1(SEQ ID NO:3).
6. Un método de la reivindicación 5, en el que
dicha reacción en cadena de la polimerasa se realiza usando el
SK145M2 (SEQ ID NO:4).
7. Un método para amplificar el ácido nucleico
del virus de inmunodeficiencia humana tipo 1
(VIH-1) de forma que dicho método comprenda llevar
a cabo una reacción en cadena de la polimerasa usando el par de
cebadores SK145 (SEQ ID NO:1) y el SKCC3(SEQ ID NO:4).
8. Un método de la reivindicación 7, en el que
dicha reacción en cadena de la polimerasa se realiza usando el
SK145M2(SEQ ID NO:2).
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|---|---|---|---|---|
| US5386022A (en) * | 1985-03-28 | 1995-01-31 | Hoffman-La Roche Inc. | Primes and probes for the amplification and detection of aids associated nucleic acids |
| US5389512A (en) * | 1988-10-07 | 1995-02-14 | Hoffman-La Roche Inc. | Method for determining the relative amount of a viral nucleic acid segment in a sample by the polymerase chain reaction |
| CA2013317A1 (en) * | 1989-04-17 | 1990-10-17 | Fred T. Oakes | Diagnostic kit, primer composition and their use for replication or detection of nucleic acids |
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| CA2031659A1 (en) * | 1990-01-26 | 1991-07-27 | John B. Findlay | Water-insoluble reagent, nucleic acid probe, test kit and diagnostic and purification methods |
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| WO1995003430A1 (en) * | 1993-07-23 | 1995-02-02 | Gen-Probe Incorporated | Methods for enhancing nucleic acid amplification |
| WO1995014109A1 (en) * | 1993-11-19 | 1995-05-26 | U.S. Department Of The Army | High through-put quantitative polymerase chain reaction for hiv clinical specimens |
| US5665545A (en) | 1994-11-28 | 1997-09-09 | Akzo Nobel N.V. | Terminal repeat amplification method |
| US5599662A (en) * | 1995-02-17 | 1997-02-04 | Hoffmann-La Roche Inc. | Oliconucleotide primers and probes for the detection of HIV-1 |
| US5702926A (en) * | 1996-08-22 | 1997-12-30 | Becton, Dickinson And Company | Nicking of DNA using boronated nucleotides |
-
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