CZ288064B6 - Oligonukleotidové primery pro detekci HIV-1, jejich použití a kit, který je obsahuje - Google Patents

Oligonukleotidové primery pro detekci HIV-1, jejich použití a kit, který je obsahuje Download PDF

Info

Publication number
CZ288064B6
CZ288064B6 CZ1998149A CZ14998A CZ288064B6 CZ 288064 B6 CZ288064 B6 CZ 288064B6 CZ 1998149 A CZ1998149 A CZ 1998149A CZ 14998 A CZ14998 A CZ 14998A CZ 288064 B6 CZ288064 B6 CZ 288064B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
seq
hiv
primers
nucleic acid
primer
Prior art date
Application number
CZ1998149A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ14998A3 (cs
Inventor
Cindy Dawn Christopherson
Shirley Yee Kwok
Shi-Da Yu Lu
Original Assignee
F. Hoffmann - La Roche Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=21896067&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ288064(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by F. Hoffmann - La Roche Ag filed Critical F. Hoffmann - La Roche Ag
Publication of CZ14998A3 publication Critical patent/CZ14998A3/cs
Publication of CZ288064B6 publication Critical patent/CZ288064B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
    • C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/81—Packaged device or kit

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Dental Preparations (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Oligonukleotidový primer k zesilování nukleové kyseliny viru lidské imunitní nedostatečnosti typu 1 (HIV-1) zvolený ze souboru, který tvoří SKCC1 (SEQ ID NO:3) a SKCC3 (SEQ ID NO:4). Primery a způsoby zesilování podle vynálezu umožňují detekci všech izolátů HIV-1 skupiny M s téměř rovnoměrnou účinností.ŕ

Description

Oligonukleotidové příměry pro detekci HIV-1, jejich použití a kit, který je obsahuje
Oblast techniky
Vynález se týká oblasti molekulární biologie a chemie nukleových kyselin. Blíže se zabývá způsoby a reakčními činidly k detekci viru lidské imunitní nedostatečnosti typu 1 (HIV-1). Vynález má tedy použití v medicíně všeobecně, v lékařské diagnostice zvláště a v oboru molekulární biologie.
Dosavadní stav techniky
Vynález způsobů zesilování specifických sekvencí nukleových kyseliny, zejména polymerázová 15 řetězová reakce („polymerase chain reaction“ PCR), umožňuje rychlou detekci nukleových kyselin obsažených ve vzorku tak malého množství, jež bylo dosud považováno za nezjistitelně malé (americké patentové spisy číslo 4 683 195, 4 683 202 a 4 965 188). Rozvoj a aplikace PCR jsou bohatě popsány v literatuře (například PCR Technology - Principles and aplications for DNA amplification, 1989, vydavatel H.A. Erlich, Stockton Press, New York, NY; PCR 20 Protocols: A guide to methods and applications, 1990, M.A. Innis a kol., Academie Press, San
Diego, CA; a PCR Strategies, 1995, vydavatel M.A. Innis a kol., Academie Press, San Diego CA. Obchodní společnosti jako Perkin Elmer (Norwalk, CT) obchodují s reagenciemi PCR a publikují návody pro PCR.
Použití PCR a sondy hybridizace k zesilování a k detekci nukleové kyseliny HTV-1 jsou přehledně popsány v literatuře (například Kwok, Ann. Med. 24, str. 211 až 214, 1992, a Coutlee a kol. Mol. Cell. Probes 5, str. 241 až 259 1991). Zkoušky detekce HIV-1, založené na PCR, jsou popsány v literatuře rovněž (například americké patentové spisy číslo 5 008182 a 5 176775; Kellogg a Kwok, Protocols PCR: A Guide to Methods and Applications, vydavatel Innis a kol., 30 Academie Press, San Diego, CA: 337 až 347, 1990,; Holodnyi a kol., J. Inf. Dis. 163, str. 802 až
865, 1991; Jackson a kol., AIDS 5, str. 1463 až 1467, 1991; a Mulder a kol., J. Clin. Microbiol.
(2), str. 292 až 300, 1994.
Komerční kity k zesilování a k detekci HIV-1 jsou obchodně dostupné (společnost Hoffmann-La 35 Roche, Nutley, NJ). Test Aplicor(tm) HIV-1 je zkoušku in vitro k detekci provirální DNA HTV-1.
Test AMPLICOR HTV-1 MONITOR(,m) je zkouškou in vitro pro kvantifikaci RNA HTV-1. Obě zkoušky Amplicor zesilují nukleové kyseliny HIV-1 pomocí příměrového páru SK462 (SEQ ID NO:5) a SK431 (SEQ ID NO:6) a popsal je Nulder a kol. (J. Clin. Microbiol. 32 (2), str. 292 až 300, 1994) a označil jako Amplicor HTV-1 primery.
HIV-1 vykazuje značnou proměnlivost genomické sekvence. Phylogenetickou analýzu sekvencí nukleových kyselin HTV-1 gag a env genů popsal Myers a kol. (Human Retrovirus and AIDS 1993, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM). Ve skupině M jsou identifikovány subtypy A-J.
Běžné techniky molekulární biologie a chemie nukleových kyselin odpovídající dnešnímu stavu techniky jsou vysvětleny v literatuře (například Sambrok a kol., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 1989; Oligonuckleotide Synthesis, vydavatel M. J. Gait, 1984; Nucleic Acid Hybridization, vyd. B.D.
Hames a S. J. Higgins, 1984; a serie Methods in Enzymology, Academie Press, lne.).
Byla identifikována řada izolátů viru lidské imunitní nedostatečnosti typu I (HIV-1) skupiny M, které jsou nebo nejsou účinně zesilitelné pomocí dříve popsaných primerů GAG genu, zejména primerů Amplicor HTV-1, SK462 (SEQ ID NO:5) a SK431 (SEQ ID NO:6). Tyto izoláty
-1 CZ 288064 B6 vykazují dříve nepozorovanou proměnlivost sekvencí uvnitř oblasti zahrnující primemí vazební místa primerů Amplicor HIV-1.
Úkolem vynálezu je poskytnout zlepšené primery, které umožní účinné zesílení nově objevených izolátů vedle všech izolátů zesílitelných primerů Amplicor HIV-1. Kromě toho primery podle vynálezu by měly umožňovat zesílení všech známých M izolátů známé HTV-1 skupiny s téměř rovnoměrnou účinností.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je oligonukleotidový primer k zesilování nukleové kyseliny viru lidské imunitní nedostatečnosti typu 1 (HIV-1), přičemž oligonukleotidový primer je volen ze souboru, který tvoří SKCC1 (SEQ ID NO:3) a SKCC3 (SEQ ID NO:4).
Vynález se týká zlepšených oligonukleotidových primerů, které umožňují zesílit PCR oblasti genu gag ze skupiny izolátů HTV-1 skupiny M ze subtypů A-G s téměř rovnoměrnou účinností a bez současného zesílení necitových sekvencí.
Zejména se vynález týká oligonukleotidových primerů k zesilování nukleové kyseliny viru lidské imunitní nedostatečnosti typu 1 (HTV-1), přičemž oligonukleotidový primer je volen ze souboru zahrnujícího SKCC1 (SEQ ID NO:3) a SKCC3 (SEW ID NO:4).
S výhodou je každý z těchto primerů kombinován v páru oligonukleotidových primerů, který tvoří SK145 (SEQ ID NO:1) a SKCC1 (SEQ ID NO:3) nebo v páru oligonukleotidových primerů tvořeného SK145 (SEQ ID NO:1) a SKCC3 (SEQ ID NO:4).
V dalším provedení mohou být tyto páry primerů kombinovány s primerem SK145M2 (SEQ ID NO:2) v souboru oligonukleotidových primerů SK145 (SEQ ID NO:1), SKCC1 (SEQ ID NO:3) a SK145M2 (SEQ ID NO:2) nebo v souboru oligonukleotidových primerů tvořených oligonukleotidovými primery SK145 (SEQ ID NO:1), SKCC3 (SEQ ID NO:4) a SK145M2 (SEQ ID NO:2).
Vynález se dále týká zlepšených způsobů zesilování oblasti genu gag ze subtypů HTV-1 skupiny M, které představují vynesení PCR pomocí primerů podle vynálezu.
Vynález se dále týká kitů, které obsahují zesilovací primer podle vynálezu. Tyto kity mohou obsahovat přídavná reakční činidla, jako jsou detekční sondy nebo jedno nebo několik zesilujících reakčních činidel, například polymerázu, pufry a nukleosidtrifosfáty.
Pro usnadnění pochopení vynálezu, je dále podána definice některých pojmů.
Pojmy „nukleová kyselina“ a „oligonukcleotid“ se týkají polydeoxyribunukleotidů (obsahujících 2-deoxy-D-ribosu) a polyribonukleotidů (obsahujících D-ribósu) a polynukleotidu jakéhokoli typu, který je N glykosidem purinové nebo pyrimidinové báze nebo modifikované purinové nebo pyrimidinové báze. Není záměrem rozlišovat délku nukleové kyseliny a oligonukleotidu a těchto pojmů se používá zaměnitelně. Tyto pojmy informují pouze o primární struktuře molekuly. Tyto pojmy tudíž zahrnují DNA s dvojitým nebo jednoduchým řetězcem stejně jako RNA s dvojitým nebo jednoduchým řetězcem.
Oligonukleotidy lze připravovat jakýmkoli vhodným způsobem, včetně například klonování, restrikce příslušných sekvencí nebo přímou chemickou syntézou jako je fosfotriesterový způsob (Narang a kol., Meth. Enzymol. 68, str. 90 až 99, 1979), fosfodiesterový způsob (Brown a kol., Meth. Enzymol. 68, str. 109 až 151 1979), diethylfosforamiditový způsob (Beaucage a kol., Tetrahedron Lett, 22, str. 1859 až 1862, 1981) a způsob pevného nosiče (americký patentový spis
-2CZ 288064 B6 číslo 4 458 066. Přehled způsobů přípravy podává Goodchild (Bioconjugate Chemistry. 1 (3), str. 165 až 187, 1990).
Pojem „hybridizace“ popisuje formování duplexní struktury dvěma jednořetězcovými nukleovými kyselinami komplementárním párováním báze. K hybridizaci může docházet mezi plně komplementárními řetězci nukleových kyselin nebo mezi v podstatě komplementárními řetězci nukleových kyselin, které obsahují minoritní oblasti chybného párování (mismatch). Podmínky, za kterých se hybridizují pouze plně komplementární řetězce nukleových kyselin se označují jako přísně hybridizační podmínky nebo sekvenčně specifické hybridizační podmínky. Stabilní duplexní nebo v podstatě komplementární sekvence lze získat za méně přísných hybridizačních podmínek; stupeň tolerovaného chybného párování („mismatch“) se dá řídit vhodným nastavením hybridizačních podmínek. Pracovníci v oboru technologie nukleových kyselin mohou určovat duplexní stabilitu empiricky, když vezmou v úvahu počet proměnných, kterými jsou například délka a koncentrace páru bází oligonukleotidů, iontová pevnost, výskyt chybného párování bází při sledování návodů poskytovaných stavem techniky (například Sambrook a kol., Molecular Cloning A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 1989; a Wetmur, Critical Reviews in Biochem. and Mol. Bio. 26 (3/4), str. 227 až 259, 1991).
Pojem „primer“ znamená oligonukleotid, přírodní nebo syntetický, schopný působit jako místo iniciace syntézy DNA za podmínek, při kterých je vyvolána syntéza extensního produktu komplementárního k řetězci nukleové kyseliny, tedy v přítomnosti čtyř různých nukleosidových trifosfátů a činidla pro polymeraci (například polymerázy DNA nebo reverzní transkriptázy) v příslušném pufru za vhodné teploty. Primerem je s výhodou jednořetězcový oligodeoxyribonukleotid. Příslušná délka primeru závisí na zamýšleném použití primeru, avšak obvykle je 15 až 35 nukleotidů. Krátké molekuly primeru obecně vyžadují nižší teploty k vytvoření dostatečně stabilních hybridních komplexů s matricí. Primer nemusí zobrazovat přesnou sekvenci matrice nukleové kyseliny, musí však být dostatečně komplementární k hybridizaci s matricí. Primery mohou zahrnovat přídavné význaky, které umožní detekci nebo znehybnění primeru, avšak nemění základní vlastnost primeru působit jako místo iniciace syntézy DNA. Například mohou primery obsahovat přídavnou sekvenci nukleové kyseliny na 5' konci, která se nehybriduje na cílovou nukleovou kyselinu, avšak usnadňuje klonování zesíleného produktu. Oblast primeru, která je dostatečně komplementární k matrici aby se hybridizovala, se nazývá hybridizující oblast.
Zde používaný termín „protisměrný primer“ označuje primer, jehož extensní produkt je subsekvencí kódujícího řetězce. Pojem „posměmý primer“ (po směru) znamená primer, jehož extensní produkt je subsekvencí komplementárně nekódujícího řetězce.
Pojme „cílová sekvence“, „cílová oblast“, „cílová nukleová kyselina“ znamenají nukleovou kyselinu, která má být zesílena, detekována nebo jinak analyzována.
Hovoří-li se o tom, že primer je „specifický“ pro cílovou sekvenci, znamená to, že počet chybných párů (mismatch) mezi primerem a cílovou sekvencí je menší než počet chybných párů mezi primerem a necitovými sekvencemi, které mohou být ve vzorku obsaženy. Lze volit hybridizační podmínky, za kterých se vytvářejí stabilní duplexy pouze tehdy, jestliže počet obsažených chybných párů není větší než počet chybných párů mezi primerem a cílovou sekvencí. Za takových podmínek může cílově specifický primer („target specific primer“) vytvářet stálé duplexy pouze s cílovou sekvencí. Použití primerů specifických pro cílovou sekvenci za vhodně přísných zesilovacích podmínek tedy umožňuje specifické zesílení takových sekvencí, které obsahují vazební místa pro cílový primer. Podobně použití cílových specifických nukleotidových sond za vhodně přísných hybridizačních podmínek umožňuje detekci specifické cílové sekvence.
Pojem „zesilovací reakční směs“ se vztahuje k roztoku obsahujícímu reakční činidla potřebná k vyvolání zesilovací reakce, který obsahuje zpravidla primery, tepelně stálou polymerázu DNA,
-3CZ 288064 B6 dNTP a dvojmocný kovový kationt ve vhodném pufru. Za úplnou se označuje reakční směs, která obsahuje všechna reakční činidla nutná k uskutečnění reakce a za neúplnou se označuje reakční směs obsahující pouze část (subset) potřebných reakčních činidel. Pracovníkům v oboru je zřejmé, že reakční složky se běžně skladují jako separátní roztoky, z nichž každý obsahuje část 5 (subset) celkových složek z důvodů pohodlnosti, stálosti při skladování nebo aby se umožnilo nastavovat koncentraci složek v závislosti na aplikaci a reakční složky se spojují před reakcí k vytvoření úplné reakční směsi. Pracovníkům v oboru je dále známo, že reakční složky jsou k obchodování baleny odděleně, a že obchodně dostupné kity mohou obsahovat všechny složky reakčních sloučenin, které zahrnují primery podle vynálezu.
Zesilovací primery HIV-1
Primery podle vynálezu umožňují zesilovat nukleovou kyselinu subtypů HIV-1 skupiny M. Primery představují významné zlepšení oproti shora popsaným primerům vtom, že umožňují 15 zesilovat nukleovou kyselinu od oblasti genu gag od všech izolátů subtypů AA-D patřících skupině M s téměř rovnoměrnou účinností, včetně nové objevených izolátů. Nukleotidové sekvence primerů jsou uvedeny dále, zcela doprava v orientaci 5' k 3'.
Protisměrné primery
SK145(SEWIDNO:1)
SK145M2 (SEQ IDNO:2)
Posměmé primery
SKCC1 (SEQ IDNO:3)
SKCC3 (SEQIDNO:4)
AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAAT AGTGGGGGGACACCAGGCAGCAATGCAAAT
TACTAGTAGTTCCTGCTATGTCACTTCC TGAAGGGTACTAGTAGTTCCTGCTAT
Posměmé primery podle vynálezu se mohou používat s kterýmikoli protisměrnými primery.
Posměmé primery podle vynálezu se používají s výhodou s protisměrným primerem SK 145 (SEQ ID NO:1), případně s protisměrným primerem SK145M2 (SEQ ID NO:2). Protisměrný primer SK145 (SEQ ID NO:1) je popsal Kellog a Kwok (PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, vydavatel Innic a kol., Academia Press, San Diego CA, str. 337 až 347, 1990). Druhý protisměrný primer SK145M2 (SEQ ID NO:2), hybriduje ve stejné oblasti jako SK 145 (SEQ ID NO:1, je však určen k těsnějšímu sledování nukleotidové sekvence určitých izolátů HIV-1 subtypu A a E. Jak je ukázáno v příkladech, může použití obou protisměrných primerů napomáhat ke shodě účinnosti zesílení příslušných subtypů.
Zesilování
Zesilování se provádí za podmínek, které umožňují zesílení všech skupin HTV-1 subtypů M, avšak které jsou dostatečně přísné, aby zabránily zesílení necitových sekvencí. Výhodné zesilovací podmínky popsal Mulder a kol. (J. Clin. Microbiol. 32(2), str. 292 až 300, 1994 a ve včleňování produktu testu AMPLICOR HTV-1 MONITOR. Přísné podmínky nejsou rozhodu45 jícím hlediskem vynálezu. Zesilovací podmínky lze optimalizovat obvykle na základě zde podaného návodu.
Primerů a způsobů vynálezu lze použít k detekci jak provirové DNA HTV-1 nebo RNA HTV-1. Zesilování RNA pomocí systému reverzní transkripce/polymerázová řetězcová reakce (RT-PCR) 50 je v oboru dobře známo a je popsáno (americké patentové spisy číslo 5 322770 a 5 310652;
Myers a Gelfand, Biochemistry 30 (32) str. 7661 až 7666, 1991 a Young a kol., J. Clin. Microbiol. 31(4), str. 882 až 886, 1993). Zesilování RT-PCR RNA HIV-1 je popsal Mulder a kol., (J. Cli. Microbiol. 32(2), str. 292 až 300, 1994 a Holodniy a kol. J. Inf. Dis. 163, str. 802 až 865,1991.
-4CZ 288064 B6
Způsoby přípravy sondy k zesilování DNA a RNA HIV-1 jsou popsány v literatuře. Příslušný použitý způsob není pro vynález rozhodující. Pracovník v oboru může zvolit a optimalizovat vhodné způsoby přípravy sond na základě pokynů literatury. Vhodné způsoby přípravy sond k detekci provirální DNA HTV-1 popisuje Casareale a kol. (PCR Methods and Applications 2, str. 149 až 153, 1992 a Butcher a Spadoro, Clin. Immunol. Newsletter 12, str. 73 až 76, 1992). Výhodný kit k přípravě sondy k detekci provirální DNA HTV-1 je obchodně dostupná jako součást testu Amplicor HTV-1. Vhodné způsoby přípravy sond k detekci RNA HIV-1 v plazmě popisuje Mulder a kol. (J. Clin. Microbiol. 32, str. 2992 až 300, 1994). Výhodný kit k přípravě sond k detekci a/nebo kvantifikaci RNA HTV-1 je obchodně dostupný jako součást k testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test.
Analýza zesíleného produktu
Zesilovací primery a způsob podle vynálezu se hodí pro jakoukoli aplikaci používající zesílenou nukleovou kyselinu. Například klonování a/nebo sekvencování sekvencí HTV-1 je těmito primery usnadněno. Způsoby detekce zesílených nukleových kyselin jsou v oboru dobře známy. Způsob použitý k analyzování zesílené nukleové kyseliny není pro vynález rozhodující a lze použít jakékoli vhodné metody. S výhodou se používá způsob zesilování RNA HTV-1, jak je popsán v příkladech kvantifikování virového zatížení.
Příklady způsobů detekce zesílených nukleových kyselin zahrnují analýzu zesíleného produktu gelovou elektroforézou a detekce hybridizací s komplementárními oligonukleotidovými sondami.
Výhodné zkušební soustavy k detekci hybridizace cílové sondy jsou v oboru dobře známé a zahrnují tečkovou a (dot blot) a reverzní (reverze dot-blot) tečkovou zkušební soustavu.
V tečkové soustavě dot-blot se zesílená cílová DNA znehybní na pevném podkladě, jako je nylonová membrána. Cílový komplex na membráně se inkubuje se značenou sondou za vhodných hybridizačních podmínek, nehybridizovaná sonda se odstraní promytím za vhodně přísných podmínek a membrána se monitoruje na přítomnost vázané sondy. Detekci soustavou dot-blot zesílených produktů popsal například v Saiki a kol. (Nátuře 324, str. 163 až 166, 1986 a americký patentový spis číslo 5 468613.
V reverzní tečkové soustavě dot-blot se sondy znehybní na pevném podkladě jako je nylonová membrána a zesílená cílová DNA se označkuje. DNA se obvykle značkuje během zesilování začleněním značených primerů. Značit se může jeden nebo oba primery. Komplex membránasonda se inkubuje se značenou zesílenou cílovou DNA za vhodných podmínek hybridizace, nehybridizovaná cílová DNA se odstraní promytím za vhodně přísných podmínek a filtr se pak monitoruje na přítomnost vázané cílové DNA. Způsoby reverzní tečkové soustavy dob-blot popsal například Saiki a kol. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86, str. 6230, 1988 a americký patentový spis číslo 5 468 613.
Alternativně se může tečková zkouška dot-blot provádět za použití pevné podložky mající řadu míst nebo důlků s hybridizační sondou. Například je velmi výhodná při klinických aplikacích těchto metod ve velkém měřítku mikrodůlková destička. Sondy se mohou znehybnit na mikrodůlkové destičce buď pasivní vazbou, nebo proteinovým prostředím jako je albumin hovězího séra (BSA), který ulívá na mikrodůlkových destičkách (Tung a kol., Bioconjugate Chem. 2, str. 464 až 465, 1991). Reverzní tečkové metody prováděné na mikrodůlkových destičkách jsou v literatuře popsány (americký patentový spis číslo 5 232 829; Loeffelholz a kol., J., Clin. Microbiol. 30 (11), str. 2847 až 2851, 1992; Jackson a kol. AIDS R, str. 1463 až 1467, 1991; Mulder a kol., J. Clin. Microbiol. 32 (2), str. 192 až 300, 1994; The Amplicor HTV-1 Test product insert; a AMPLICOR HTV-1 MONITOR Test product insert.
S výhodou se detekce a/nebo kvantifikace zesíleného produktu provádí hybridizace oligonukleitidovou sondou znehybněnou na mikrodůlkové destičce pomocí reakčních činidel a protokolů testu
-5CZ 288064 B6
Amplior HIV-1 nebo testem AMPLICOR HIV-1 MONITOR. Použití způsobů kvantifikování RNA HIV-1 je popsáno dále v příkladech.
Alternativně se sondy spojené BSA vážou na magnetické mikročástice. Vázané sondy se hybridi5 zují v roztoku na značkovaný zesilovací produkt a výsledné se z roztoku dostávají magneticky.
Magneticky znehybněné hybridizační duplaxy se pak detekují jako při shora popsaných způsobech.
Ještě jiný vhodný způsob nazývaný zkouška 5-nukleázy je rovněž popsán v literatuře (americký 10 patentový spis číslo 5 210015 a 5 487972 a Holland a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, str.
7276 až 7280, 1988). Při zkoušce 5-nukleázy se přidávají během zesilovací reakce směsi značených detekčních sond modifikované k předcházení působení sond jako primery pro DNA syntézu. Každá sonda, která hybridizuje na cílové DNA během každého syntesního kroku, tedy v průběhu extense primeru, je degradována 5' až 3' exonukleázovou aktivitou polymerázy DNA, 15 například Taq DNA polymerázou. Detekuje se pak produkt degradace sondou. Přítomnost produktu rozpadu sondou tedy indikuje, že jednak došlo k hybridizaci mezi sondou a cílovou DNA, jednak že nastala zesilovací reakce. Americké patentové spisy číslo 5 491063 a 5571673 popisují zlepšené způsoby detekce a degradace sondy, které nastávají současně se zesílením.
Shora popsané formy zkoušek používají zpravidla značených oligonukleotidů k usnadnění detekce hybridních duplexů. Oligonukleotidy mohou být značeny vnesením značky detekovatelné spektroskopicky, fotochemicky, biochemicky, imunochemicky nebo chemickými prostředky. Vhodnými značkami jsou 32P, fluorescenční barviva, elektrony hustá reakční činidla, enzymy (běžně používanými jsou ELISA), biotin nebo hapteny a proteiny, pro které jsou k disposici 25 antisera nebo monoklonální protilátky. Značené oligonukleotidy podle vynálezu mohou být syntetizovány a značeny popsanými způsoby k syntetizování oligonukleotidů.
Alternativní způsob detekce a zesilování nukleových kyselin HIV-1 monitorováním nárůstu celkového množství dvouřetězových DNA v reakční směsi je popsán v literatuře (Higuchi a kol., 30 Bio/Technology 10, str. 413 až 417, 1992; Higuchi a kol. Bio/Technology 11, str. 1026 až 1030, 1993; a evropský patentový spis číslo 512334). Detekce dvouřetězových cílových DNA je založena na zvýšení fluorescenci, kterou vykazují ethidiumbromid (EtBr) a jiné vazební značky DNA, jsou-li vázány na dvouřetězovou DNA. Značka vázající DNA se přidává do zesilovací reakční směsi. Výsledkem zesílení cílové sekvence je nárůst množství dvouřetězové DNA, což se 35 projeví zjistitelným nárůstem fluorescence.
Vynález se týká také kitů, jednotek s mnoha nádobkami obsahujícími užitečné složky k provádění tohoto způsobu. Užitečný kit obsahuje primery pro zesílení PCR nukleové kyseliny HTV-1. Kit může obsahovat také prostředky k detekci zesílených nukleových kyseliny HTV-1, jako jsou 40 oligonukleotidové sondy. V některých případech jsou sondy fixovány na vhodné nosné membráně. Jinými případnými součástmi kitů jsou například činidlo ke katalýze syntézy produktů primerové extense, substrát nukleosidových trifosfátů, značkovací prostředky (například avidinenzymový konjugát a enzymový substrát a chromogen je-li značkou biotin), vhodné pufřy pro PCR nebo hybridizační reakce a instrukce k provádění způsobu podle vynálezu.
Vynález objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení. Četná provedení vynálezu v rozsahu patentových nároků následující po příkladech jsou pracovníkům v oboru zřejmá z popisu a následujících příkladů. Díly a procenta jsou míněny vždy hmotnostně, pokud není uvedeno jinak.
-6CZ 288064 B6
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Konstrukce kvantitačního standardu
Kvantifikace virového zatížení se provádí testem AMPLICOR HIV-1 MONITOR pomocí kvantitačního standardu (Quantitation Standard - QS), který je zesílen pomocí stejného páru primerů, je však detekován separátní sondou. QS se přidává do zkoušeného vzorku ve známé koncentraci k vytvoření známého referenčního signálu. Pro široké rozmezí cílových koncentrací je signál generovaný ze zesíleného cíle nebo zesílených QS úměrný přítomnému množství. Číslo cíle se vypočte z porovnání signálu generovaného od zesílení neznámého cíle se signálem generovaným QS.
Primery podle vynálezu zesilují úsek, který není plně postižen uvnitř QS začleněného v testu APMLICOR HIV-1 MONITOR (Amplicor QS). Pro použití s primery podle vynálezu je tudíž zkonstruován nový QS. Nový QS je zkonstruován z Amplicor QS rozšířením sekvence Amplicor QS k postižení vazebních míst (SKCC1 (SEQ ID NO:3) a (SKCC3 (SEQ ID NO:4). Výsledný QS je zjistitelný použitou specifickou sondou v testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR. Konstrukce plazmidu obsahujícího novou sekvenci QS, ze které se transkribuje QS RNA, se provádí dále popsanou standardní technikou.
Amplicor QS získaný testem AMPLICOR HIV-1 MONITOR se zesílí pomocí SK145 (SEQ IDNO:1) s SK151 (SEQ ID NO:7) za podmínek v podstatě stejných, jako jsou popsány v následujícím příkladě 2. Zesílení poskytne produkt DNA, který obsahuje primerová vazební místa SK145 (SEQ ID NO:1) a SK151 (SEQ ID NO:7) a ponechá si interní sekvenci, která obsahuje vazební místo specifické sondy QS.
Nato se výsledný zesílený produkt rozšíří, aby obsáhl vazební místo primerů SKCC1 (SEW ID NO:3) a přidá se linker, aby bylo umožněno klonování produktu. Toho se dosáhne novým zesílením produktu pomocí SK145 (SEQ ID NO:1) rozšířeného na konci 5' k začlenění linkeru HindlII a SKCC1 (SEQ ID NO:3). Vhodné zesilovací podmínky jsou popsány v literatuře (Kellogg a Kwok, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, vydavatel Innis a kol., Academia Press, San Diego CA, str. 337 až 347, 1990) s tou výjimkou, že k docílení hybridizace SKCC1 (SEW ID NO:3) se použije nižší teploty systému teplotní hybridizace/nastavení (například 42 °C).
Výsledný rozšířený produkt se pak dále rozšíří k postižení vazebního místa primerů SKCC3 (SEQ ID NO:4) a přidá se druhý linker na druhém konci, aby bylo umožněno klonování produktu. Toho se dosáhne zesílením produktu pomocí SK145 (SEQ ID NO:1) rozšířeného na konci 5' k začlenění linkeru HindlII, jak shora popsáno, spolu s SKCC3 (SEQ ID NO:4) rozšířeného na konci 5' k začlenění linkeru XBal za použití stejných zesilovacích podmínek jako shora popsáno.
Nato se zesílený produkt vsadí do plazmidu. Zesílená DNA a plazmid pSP64 (Promega, Madison, WI) se odděleně zpracují Hind III a XBal a pak se standardním způsobem váží. Příslušné buňky se transformují rekombinantními plazmidy a získá se klon, který obsahuje správný inzert. Klonovaný inzert ve výsledném rekombinantním plazmidu se má sekvencovat k zajištění, že do vazebních míst primerů nebo sondy nejsou vloženy žádné mutace.
QS RNA se transkribuje z rekombinantního plazmidu, který obsahuje sekvenci QS kitem MEGAscript(tm) SP6 (Ambion, lne., Austin, TX).
Příklad 2
Kvantitace RNA HIV-1
Tento příklad popisuje posouzení relativní účinnosti zesílení z různých izolátů HTV-1. Pro porovnání je provedeno také zesílení pomocí testovacího kitu AMPLICOR HTV-1 MONITOR.
Izoláty HIV-1 se získají z pozitivních klinických vzorků. Úsek genu gag se klonuje a sekvencuje pomocí standardních technik a subtyp klonovaného HIV-1 se stanoví v závislosti na sekvenci. Byla objevena řada nových těchto izolátů HIV-1. Pro tento příklad se volí zvláštní izoláty založené na nukleotidové sekvenci, u nichž se očekává, že budou problematické pro test AMPLICOR HIV-1 MONITOR. Vedle toho se použije izolátů reprezentativních pro variaci sekvencí přítomnou ve subtypech skupiny M.
Cílová nukleová kyselina
Zkonstruují se plazmidy obsahující úsek gag genu HTV-1 z každého izolátu a matrice RNA HTV-1 se transkribují v podstatě způsobem, který popsal Holodnyi a kol. (I. Inf. Dis. 163, str. 802 až 865, 1991). Pořídí se zásobní roztoky každé matrice a vyzkouší se koncentrace každé matrice. Zásobní roztoky se zředí na základě určených relativních koncentrací, takže koncentrace matrice, předané do každé reakční směsi, je stejná. Absolutní počet kopií přidaných matric do reakcí je přibližně 4000 až 8000.
Kvantitační standard
QS popsaný u příkladu 1, se zavede do každé reakční směsi při známé koncentraci, zpravidla 100 kopií na reakci.
Primery
Reakce A až F se provedou pomocí následujících kombinací primerů:
Porovnávané kombinace primerů
Reakce Kombinace primerů
A SK462 (SEQ ID NO:5)
SK431 (SEQIDNO:6)
B SK145 (SEQ ID NO: 1)
SKI 51 (SEQ IDNO:7)
C SK 145 (SEQ ID NO: 1)
SKCC1 (SEQIDNO:3)
D SKI 45 (SEQ ID NO: 1) a SK145M2 (SEQIDNO:2)
SKCC1 (SEQIDNO:3)
E SK145 (SEQIDNO:1)
SKCC3 (SEQIDNO:4)
F SK145 (SEQ ID NO:1) a SK145M2 (SEW ID NO:2)
SKCC3 (SEQIDNO:4)
Všechny primery se biotinylují na konci 5' k usnadnění detekce v reverzním tečkovém formátu dot-blot mikrodůlové destičky. Sekvence přídavných primerů, jež nejsou shora uvedeny, jsou dále v orientaci 5' a 3'.
-8CZ 288064 B6
SK462 (SEQIDNO:5)
SK431 (SEQIDNO:6)
SKI 51 (SEQIDNO:7)
Zesilování
Protiproudové primery AGTTGGAGGACATCAAGCAGCCATGCAAAT
Poproudové primery
TGCTATGTCAGTTCCCCTTGGTTCTCT
TGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCT
Zesilovací reakce A se provede s použitím reakčních činidel a za podmínek testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR.
Zesilovací reakce B se provede v objemech 100 μΐ obsahujících následující reakční činidla:
matrici RNA HIV-1
QSRNA mM bicinu, pH 8,3
111 mMK(OAc)
3,6 mM Mn(OAc)2
500 μΜ dUTP
300 μΜ každého dATP, dCTP a dGTP μΜ dTTP % glycerolu
0,2 μΜ každého biotinylovaného primeru jednotky UNG* jednotek rTth polymerázy DNA* * vyrobeno a vyvinuto firmou Hoffman La Roche, obchodní produkt firmy Perkin Elmer (Norwalk, CT).
Zesilovací reakce C a D se provedou za podmínek v podstatě stejných jako v reakci B, avšak s následujícími změnami:
100 mMK(OAc)
500 μΜ každého dATP, dCTP s dGTP
7,5 % glycerolu jednotek UNG.
Zesilovací reakce E a F se provedou za podmínek v podstatě stejných jako v reakcích C a D, avšak s použitím 10% koncentrace glycerolu. Nepatrné rozdíly v reakčních směsích jsou způsobeny dřívější optimalizací zesilovacích podmínek pro každý pár primerů.
Zesilovací reakce B až F se provedou v tepelném cyklovači TC9600 DNA (Perkin Emler, Norwalk, CT) za použití následujícího teplotního profilu:
Inkubace před reakcí: 50 °C 2 minuty
Reverzní transkripce 60 °C 30 minut
-9CZ 288064 B6
4 cykly: denaturace teplotní hybridizace rozšíření 95 °C 10 sekund 55 °C 10 sekund 72 °C 10 sekund
26 cyklů: denaturace teplotní hybridizace rozšíření 90 °C 10 sekund 60 °C 10 sekund 72 °C 10 sekund
Konečné rozšíření: 72 °C 15 minut
Detekce zesíleného produktu hybridizaci sondy
Zesílené produkty se detekují použitím reakčních činidel a protokolů testu AMPLICOR HTV-1 MONITOR. Stanovená počáteční cílová koncentrace se vypočte jako shora uvedeno.
Výsledky
Při kvantitativním způsobu testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR se počáteční cílová koncentrace stanoví z porovnání signálu generovaného po zesílení cíle se signálem generovaným po zesílení známé koncentrace QS. Jelikož známá koncentrace QS je hodnotou před zesílením, zatímco porovnávané signály jsou signály po zesílení, ovlivní změny relativní účinnosti zesílení určení počáteční koncentrace neznámého cíle. Kvantitace testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR je cejchována na základě zesilovací účinnosti subtypu B HIV-1. Je známo, že ostatní subtypy HTV1 mohou být zesíleny s nižší účinností a tudíž, že stanovená cílová koncentrace by byla podhodnocením skutečné koncentrace.
V tomto pokusu byla cílová koncentrace RNA přidána ke každé reakci při známé koncentraci. Relativní účinnost zesílení pro každý izolát může být jistě porovnáním stanovených cílových koncentrací. Jelikož kvantitace testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR je cejchována na základě zesilovací účinnosti subtypu B HIV-1, použije se stanovená cílová koncentrace subtypu B (klon 105-1) jako referenční. Pro každý izolát se stanovená cílová koncentrace pro subtyp B (klon 105-1) podělí stanovenou cílovou koncentrací pro izolát k poskytnutí míry relativní účinnosti zesílení. Tyto relativní účinnosti zesílení jsou uvedeny v následující tabulce. Označení „ znamená, že reakce nebyla provedena.
Relativní účinnost k subtypu B
Klon Subtyp A B c D E F
113-1 A 694,3 1,7 0,9 1,4 1,4 0,9
113-2 A 19 — 1,3 1,1 1,3 0,6
114-1 A 12,4 — 1,4 1,3 0,7 0,9
114-2 A 9,8 1,2 1,1 1,8 1,5 0,8
115-1 A 497,6 0,8 1,2 1 1,6
115-2 A 646,4 2,4 1 1,5 0,9 1,4
105-1 B 1 1 1 1 1 1
101-15 C 7,3 — 1,1 3,5 1,9 1,4
107-6 C 0,8 — 0,6 0,7 0,7 0,8
308-1 D 0,9 — 0,6 0,7 0,7 0,5
110-5 E 520,7 465,7 3,5 1,2 4,6 0,8
111-6 E 0,8 — 1,1 1,6 0,9 1,1
112-7 E 3,3 0,8 1,5 1,9 1,2 1,4
106-1 G 1,9 — 2,3 2 1,8 1,5
108-3 G 0,6 — 0,5 0,8 0,5 0,5
109-1 G 32,5 1 0,5 0,6 0,6 0,3
-10CZ 288064 B6
Výsledky ukazují, že AMPLICOR HIV-1 MONITOR test (reakce A) zesiluje různé izoláty HIV-1 ve významně kolísající účinnosti. Několik izolátů včetně izolátu subtypu E, klon 110-5, bylo zesíleno s účinností nejméně 500-násobně nižší než účinnost zesílení subtypu B, klon 105—
1.
Ačkoli nebyly testovány všechny izoláty, ukazuje se, že použití příměrového páru SK 145 (SEQ ID NO:1) a SKI 51 (SEQ ID NO:7) (reakce b), zlepšuje významně rovnoměrnost zesilovací účinnosti. Avšak subtyp izolátu E, klon 110-5 byl stále zesílen s účinností přibližně 500-násobně nižší, než je účinnost zesílení subtypu B, klon 105-1.
Použití SK145 (SEQ ID NO:1) a SKCC1 (SEQ IDNO:3) (reakce C), umožnilo zesílení všech izolátů, včetně izolátu subtypu E, klon 110-5, s účinností až trojnásobnou oproti účinnosti zesílení subtypu B, klon 105-1. Přidání SK145M2 (SEQ ID NO:2) (reakce D) dále zlepšilo účinnost zesílení izolátu 110-5 na v podstatě stejnou hodnotu jako u referenčního kmene subtypu
B.
Podobně použití SK145 (SEQ ID NO:1) a SKCC3 (SEQ ID NO:4) (reakce E), umožnilo zvýšení všech izolátů, včetně izolátu subtypu E, klon 110-5 s účinností až pětinásobnou oproti zesílení subtypu B, klon 105-1. Přidání SK145M2 (SEQ ID NO:2) (reakce F) dále zlepšilo účinnost zesílení izolátu 110-5 na v podstatě stejnou hodnotu jako u referenčního kmen subtypu B.
Příklad 3
Kvantitace HIV-1 v klinických vzorcích
V tomto příkladu se zkoušelo 30 klinických vzorků získaných od seropozitivních pacientů ze Senegalu na přítomnost RNA HIV-1. Subtypy přítomné v klinických vzorcích se nestanovily. Avšak jelikož jsou subtypy A a D běžné v tomto africkém regionu, očekávalo se, že několik klinických vzorků se buď nezesílí, nebo nebudou testem AMPLICOR HIV-1 MONITOR zesíleny účinně.
Vzorky se připravily takto: Plazmové druhy (80 až 250 μΐ) se spojily s 20 μΐ 0,25% (hmotnost k oběmu) červených polystyrénových mikrokuliček Estapor (Bangs Laboratories, lne., Carmel, IN) v 1,5 ml kuželovité odstředivé zkumavce a při teplotě 4 °C se 1 hodinu odstřeďovaly při 25 300x g. Supematant se odsál a pelety se resuspendovaly ve 250 μΐ lysovém pufru (50 μΐ lysového pufru se rovná 6,7 μΐ 30 U/μΙ RNasinu (Promega, Madison, WI); 0,67 μΐ 100 mM DTT, 2 μΐ 10% NP40 (Pierce, Rockford, IL); 0,25 μΐ 4 mg/ml poly-rA RNA; a 40,4 μΐ Depc-upravené H2O). Pelety se inkubovaly při teplotě místnosti po nejméně 15 minutovém víření k zaručenému promísení.
Zesilování se provádělo ve 100 μΐ reakčních dávkách obsahujících 50 μΐ 2X směsi zesilovacích reakčních činidel formulovaných tak, aby konečná koncentrace byla jak shora uvedeno. Do každé reakční směsi se přidalo přibližně 100 kopií příslušné QS jako součást reakční směsi. Detekce zesíleného produktu se provedla testem AMPLICOR HIV-1 MONITOR, jak shora popsáno.
Zesílení každého vzorku se provedlo s následující kombinací primerů
Porovnání kombinací primerů
Reakce Kombinace primerů
A SK462 (SEQ ID NO:5)
SK431 (SEQ IDNO:6)
-11CZ 288064 B6
B SK145 (SEQ IDNO:1)
SKCC1 (SEQIDNO:3)
C SK145 (SEQ ID NO: 1) a SK145M2 (SEQ ID NO:2)
SKCC1 (SEQIDNO:3)
Výsledky vyjádřené v kopiích matrice HIV-1 na ml plazmy jsou sestaveny dále.
Stanovené cílové koncentrace (kopie/ml)
Izolát A B Duplikát C Duplikát
DKN035 0 800 1860 1600 1100
DKN079 360 30060 37240 91780 152300
DKN 154 1140 21600 54560 68820 67120
DKN 162 0 16020 25980 64340 21880
DKN 162 0 12180 10520 14300 18320
DKN 169 0 3140 7000 5651 8047
DKN 171 1180 640 500 560 1040
DKN 282 560 3400 4360 5560 3460
DKN 402 340 4260 10520 7000 5060
MBN26 27740 16940 19220 16700 18680
MBN31 180 1820 1820 1720 2240
MBN34 840 2160 2200 3100 3120
MIH 002 2320 51320 121100 144180 123900
MIH 012 2960 33620 40920 40740 75840
MIH 013 30360 31980 55360 42800 71220
MIH 030 17625 178500 273938 169750 189625
MIH 053 + 534960 231620 530900 878340
MIH 055 10560 43960 54220 49400 37400
MIH 074 5700 3980 6020 3640 4940
MIH 112 30480 271980 490780 423600 416140
MIH 157 520 165480 82920 169980 146320
MIN 003a 1300 57720 21620 35380 34560
MIN 003b 1760 32820 30940 27760 26600
MIN 017 540 437380 375120 447740 902780
MIN 067 0 0 0 0 0
MIN 126 44320 63600 38460 56680 40300
MIN 139 460 146320 142800 94520 105600
MIN 146 200 49920 32100 19900 30400
MIN 217 0 3220 1880 2320 2580
MIN 589 154780 267740 127100 144160 228040
Výsledky ukazují, že primery podle vynálezu, kombinace B a C, umožňují zesílit více klinických vzorků. Kombinace primerů B a C umožňují zesílení všech až na 1 ze 30 vzorků. Na rozdíl od toho test AMPLICOR HIV-1 MONITOR selhal v zesílení 6 ze 29 vzorků. Zesílení vzorku MIH 053 testem AMPLICOR HIV-1 MONITOR vedl k silnému cílovému signálu, selhal však 15 z generování signálu QS. Vzorek tudíž nemohl být kvantitovatelný, jak označeno znaménkem „+“ v tabulce.
Kromě toho je u výsledného počtu vzorků počet kopií stanovený kombinací primerů B nebo C významně vyšší než stanovený pomocí testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR. Na základě 20 proměnlivosti účinnosti zesílení představované vzorkem 2, vyplývají nižší stanovení koncentrace matric získané testem AMPLICOR HIV-1 MONITOR pravděpodobně z významně nižších zesilovacích účinností.
-12CZ 288064 B6
Virová RNA nebyla zjištěna ve vzorku MIN 067. Není však známo, zda je to způsobeno nezpozorovanou proměnlivostí cílové sekvence, která interferovala buď s hybridizací primeru, nebo s hybridizací sondy nebo z nějakého jiného důvodu.
Průmyslová využitelnost
Vynález se zabývá způsoby a reakčními činidly k detekci viru lidské imunitní nedostatečnosti typu 1 (HTV-1) a má proto použití v medicíně všeobecně, v lékařské diagnostice zvláště a v oboru molekulární biologie.
Seznam sekvencí (1) Obecné informace iv) Přihlašovatel
A. Jméno: F. Hoffman-La Roche Ag
B. Ulice: Grenzacherstrasse 124
C. Město: Basle
D. Stát: BS
E. Země: Švýcarsko
F. Zip: CH-4070
G. Telefon: 061 -688 13 95
H. Telefax: 061 -688 13 95
I. Telex. 962292/965542 hlr ch ii) Název vynálezu: Způsob detekce HIV-1 iii) Počet sekvencí: 7 iv) Forma pro počítač
A. Typ média: Floppy disk
B. Počítač. Apple Macintosh
C. Operační systém: Systém 7.1 (Macintosh)
D. Software: Word 5.1
v) Platné přihlašovací údaje
A. Číslo přihlášky: 60-037744
B. Datum podání: 17.01.1997 (2) Informace o SEQ ID. Č. 1:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 30 páru bází
B. Typ: nukleová kyselina
C. Retězcovitost: jeden řetězec
D. topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA (genomická) xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:
AGTGGGGGGA CATCAAGCAG CCATGCAAAT (2) Informace o SEQ ID. Č. 2:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 30 páru bází
B. Typ: nukleová kyselina
C. Řetězcovitost: jeden řetězec
D. topologie: lineární
-13CZ 288064 B6 ii) Typ molekuly: DNA (genomická) xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:
AGTGGGGGGA CACCAGGCAG CAATGCAAAT (2) Informace o SEQ ID. Č. 3:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 28 páru bází
B. Typ: nukleová kyselina
C. Řetězcovitost: jeden řetězec
D. topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA (genomická) xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:
TACTAGTAGT TCCTGCTATG TCACTTCC (2) Informace o SEQ ID. Č. 4:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 26 páru bází
B. Typ: nukleová kyselina
C. Řetězcovitost: jeden řetězec
D. topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA (genomická) xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:
TGAAGGGTAC TAGTAGTTCC TGCTAT (2) Informace o SEQ ID. Č. 5:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 30 páru bází
B. Typ: nukleová kyselina
C. Řetězcovitost: jeden řetězec
D. topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA (genomická) xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:
AGTTGGAGGA CATCAAGCAG CCATGCAAAT (2) Informace o SEQ ID. Č. 6:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 27 páru bází
B. Typ: nukleová kyselina
C. Řetězcovitost: jeden řetězec
D. topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA (genomická) xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 6:
TGCTATGTCAGTTCCCCTTG GTTCTCT
-14CZ 288064 B6 (2) Informace o SEQ ID. Č. 7:
i) Charakteristiky sekvence
A. Délka: 27 páru bází
B. Typ: nukleová kyselina
C. Řetězcovitost: jeden řetězec
D. topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA (genomická) xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:
TGCTATGTCA CTTCCCCTTG GTTCTCT

Claims (15)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Oligonukleotidový primer k zesilování nukleové kyseliny viru lidské imunitní nedostatečnosti typu 1, (HIV-1), zvolený ze souboru, kteiý tvoří SKCC1 (SEQ ID NO:3) a SKCC3 (SEQ IDNO:4).
  2. 2. Pár oligonukletidových primerů tvořený SK145 (SEQ ID NO: 1) a SKCC1 (SEQ ID NO:3).
  3. 3. Sada oligonukleotidových primerů sestávající z páru oligonukleotidových primerů podle nároku 2 a z SK145M2 (SEQ ID NO:2).
  4. 4. Pár oligonukleotidových primerů tvořený SK145 (SEQ ID NO:1) a SKCC3 (SEQ ID NO:4).
  5. 5. Sada oligonukleotidových primerů sestávající z páru oligonukleotidových primerů podle nároku 4 a SK145M2 (SEQ ID NO:2).
  6. 6. Kit k detekci nukleové kyseliny viru lidské imunitní nedostatečnosti typu 1, HTV-1, vyznačující se tím, že obsahuje oligonukleotidový primer podle nároku 1.
  7. 7. Kit k detekci nukleové kyseliny viru lidské imunitní nedostatečnosti typu 1, HTV-1, vyznačující se tím, že obsahuje pár oligonukleotidových primerů podle nároku 2.
  8. 8. Kit k detekci nukleové kyseliny viru lidské imunitní nedostatečnosti typu 1, HTV-1, vyznačující se tím, že obsahuje sadu oligonukleotidových primerů podle nároku 3.
  9. 9. Kit k detekci nukleové kyseliny viru lidské imunitní nedostatečnosti typu 1, HTV-1, vyznačující se tím, že obsahuje pár oligonukleotidových primerů podle nároku 4.
  10. 10. Kit k detekci nukleové kyseliny viru lidské imunitní nedostatečnosti typu 1, HIV-1, vyznačující se tím, že obsahuje sadu oligonukleotidových primerů podle nároku 5.
  11. 11. Způsob zesilování nukleové kyseliny viru lidské imunitní nedostatečnosti typu 1, HTV-1, vyznačující se tím, že se provádí polymerázová řetězová reakce za použití SKCC1 (SEQ ID NO:3) nebo SKCC3 (SEQ ID NO:4).
  12. 12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že se provádí polymerázová řetězová reakce za použití SK145 (SEQ ID NO:1) a SKCC1 (SEQ ID NO:3).
    -15CZ 288064 B6
  13. 13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že se provádí polymerázová řetězová reakce za použití SK145M2 (SEQ ID NO:2).
  14. 14. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že se provádí polymerázová
    5 řetězová reakce za použití SK 145 (SEQ ID NO: 1) a SKCC3 (SEQ ID NO:4).
  15. 15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že se provádí polymerázová řetězová reakce za použití SK145M2 (SEQ ID NO:2).
CZ1998149A 1997-01-17 1998-01-16 Oligonukleotidové primery pro detekci HIV-1, jejich použití a kit, který je obsahuje CZ288064B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US3774497P 1997-01-17 1997-01-17

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ14998A3 CZ14998A3 (cs) 1998-08-12
CZ288064B6 true CZ288064B6 (cs) 2001-04-11

Family

ID=21896067

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ1998149A CZ288064B6 (cs) 1997-01-17 1998-01-16 Oligonukleotidové primery pro detekci HIV-1, jejich použití a kit, který je obsahuje

Country Status (20)

Country Link
US (1) US5908743A (cs)
EP (1) EP0854197B1 (cs)
JP (1) JP2838084B2 (cs)
KR (1) KR100257438B1 (cs)
CN (1) CN1208469C (cs)
AT (1) ATE345400T1 (cs)
AU (1) AU693066B1 (cs)
BR (1) BRPI9800337B8 (cs)
CA (1) CA2222769C (cs)
CZ (1) CZ288064B6 (cs)
DE (1) DE69836395T2 (cs)
DK (1) DK0854197T3 (cs)
ES (1) ES2276436T3 (cs)
HU (1) HU223384B1 (cs)
IL (1) IL122906A (cs)
NO (1) NO323157B1 (cs)
PL (1) PL191989B1 (cs)
RU (1) RU2186112C2 (cs)
TW (1) TW400386B (cs)
UA (1) UA47432C2 (cs)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19850186A1 (de) * 1998-10-30 2000-05-25 Roche Diagnostics Gmbh Neue Primer und Sonden zum Nachweis von HIV
DE19900511C2 (de) * 1999-01-08 2001-03-15 Deutsches Krebsforsch Molekularbiologische Marker für die analytische Elektronenmikroskopie
US6245511B1 (en) * 1999-02-22 2001-06-12 Vialogy Corp Method and apparatus for exponentially convergent therapy effectiveness monitoring using DNA microarray based viral load measurements
CA2731495C (en) * 2000-09-01 2015-02-03 Gen-Probe Incorporated Amplification of hiv-1 sequences for detection of sequences associated with drug-resistance mutations
US6582920B2 (en) 2000-09-01 2003-06-24 Gen-Probe Incorporated Amplification of HIV-1 RT sequences for detection of sequences associated with drug-resistance mutations
US6770752B2 (en) 2001-01-09 2004-08-03 Becton, Dickinson And Company Sequences for detection of HIV-1
EP1317960A1 (en) * 2001-12-06 2003-06-11 PamGene B.V. System and method for analyzing a blood sample and disposable cartridge for use in this system or method
WO2004094986A2 (en) * 2003-04-16 2004-11-04 Handylab, Inc. System and method for electrochemical detection of biological compounds
EP1792263A2 (en) 2004-09-02 2007-06-06 Vialogy Corporation Detecting events of interest using quantum resonance interferometry
ES2610781T3 (es) * 2004-09-14 2017-05-03 Argos Therapeutics, Inc. Amplificación de patógenos independiente de la cepa y vacunas para estos
CN100340673C (zh) * 2005-02-03 2007-10-03 上海科华生物工程股份有限公司 人类免疫缺陷病毒hiv－1核酸扩增－荧光定量检测试剂盒
RU2350650C2 (ru) * 2006-04-17 2009-03-27 Общество с ограниченной ответственностью "Биосинтез" (ООО "Биосинтез") РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pVar15-HIV-LTR, НЕСУЩАЯ КЛОНИРОВАННЫЙ ФРАГМЕНТ ГЕНОМА ВИЧ-1 ТИПА ИЗ КОНСЕРВАТИВНОГО УЧАСТКА 5'-LTR ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pBluKSM-HIV-LTR mod, НЕСУЩАЯ КЛОНИРОВАННЫЙ МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ФРАГМЕНТ ЭТОГО ЖЕ УЧАСТКА ГЕНОМА ВИЧ-1 ТИПА, ТЕСТ-НАБОР ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ЭКСПРЕСС-ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНОМА ВИЧ-1 ЛЮБОГО ТИПА В ПРОБЕ И СПОСОБ С ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
CN101144771B (zh) * 2006-09-11 2012-05-30 中山大学达安基因股份有限公司 检测人类免疫缺陷病毒的试剂盒
ES2582602T3 (es) 2007-03-28 2016-09-14 Signal Diagnostics Sistema y método de análisis de alta resolución de ácidos nucleicos para detectar variaciones de secuencia
US8221981B2 (en) * 2007-07-30 2012-07-17 Argos Therapeutics, Inc. Primers and probes for the amplification and detection of HIV Gag, Rev and Nef polynucleotides
US10669574B2 (en) 2008-11-18 2020-06-02 XCR Diagnostics, Inc. DNA amplification technology
US10113206B2 (en) * 2010-02-24 2018-10-30 Grifols Therapeutics Inc. Methods, compositions, and kits for determining human immunodeficiency virus (HIV)
UY34128A (es) * 2011-06-15 2013-01-31 Grifols Therapeutics Inc Métodos, composiciones y kits para determinar el virus de la inmunodeficiencia humana (vih)?.
KR102323375B1 (ko) 2013-10-09 2021-11-08 플루어레센트릭 인코포레이티드 다중 프로브

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5386022A (en) * 1985-03-28 1995-01-31 Hoffman-La Roche Inc. Primes and probes for the amplification and detection of aids associated nucleic acids
US5389512A (en) * 1988-10-07 1995-02-14 Hoffman-La Roche Inc. Method for determining the relative amount of a viral nucleic acid segment in a sample by the polymerase chain reaction
CA2013317A1 (en) * 1989-04-17 1990-10-17 Fred T. Oakes Diagnostic kit, primer composition and their use for replication or detection of nucleic acids
US5196305A (en) * 1989-09-12 1993-03-23 Eastman Kodak Company Diagnostic and amplification methods using primers having thymine at 3' end to overcome primer-target mismatch at the 3' end
CA2031659A1 (en) * 1990-01-26 1991-07-27 John B. Findlay Water-insoluble reagent, nucleic acid probe, test kit and diagnostic and purification methods
US5695926A (en) * 1990-06-11 1997-12-09 Bio Merieux Sandwich hybridization assays using very short capture probes noncovalently bound to a hydrophobic support
KR100325554B1 (ko) * 1993-03-26 2002-11-02 젠-프로브 인코포레이티드 사람의면역결핍 바이러스타입1의검출
WO1995003430A1 (en) * 1993-07-23 1995-02-02 Gen-Probe Incorporated Methods for enhancing nucleic acid amplification
WO1995014109A1 (en) * 1993-11-19 1995-05-26 U.S. Department Of The Army High through-put quantitative polymerase chain reaction for hiv clinical specimens
US5665545A (en) 1994-11-28 1997-09-09 Akzo Nobel N.V. Terminal repeat amplification method
US5599662A (en) * 1995-02-17 1997-02-04 Hoffmann-La Roche Inc. Oliconucleotide primers and probes for the detection of HIV-1
US5702926A (en) * 1996-08-22 1997-12-30 Becton, Dickinson And Company Nicking of DNA using boronated nucleotides

Also Published As

Publication number Publication date
DK0854197T3 (da) 2007-03-19
US5908743A (en) 1999-06-01
BRPI9800337A (pt) 1999-06-29
DE69836395D1 (de) 2006-12-28
CZ14998A3 (cs) 1998-08-12
HK1010896A1 (en) 1999-07-02
HUP9800053A2 (hu) 1998-08-28
CN1208469C (zh) 2005-06-29
NO980212L (no) 1998-07-20
NO323157B1 (no) 2007-01-08
HUP9800053A3 (en) 1999-11-29
ES2276436T3 (es) 2007-06-16
IL122906A (en) 2000-11-21
EP0854197A3 (en) 1999-04-07
ATE345400T1 (de) 2006-12-15
TW400386B (en) 2000-08-01
HU9800053D0 (en) 1998-03-30
CA2222769A1 (en) 1998-07-17
EP0854197B1 (en) 2006-11-15
UA47432C2 (uk) 2002-07-15
RU2186112C2 (ru) 2002-07-27
HU223384B1 (hu) 2004-06-28
JPH10210990A (ja) 1998-08-11
AU693066B1 (en) 1998-06-18
IL122906A0 (en) 1998-08-16
EP0854197A2 (en) 1998-07-22
CA2222769C (en) 2001-06-12
DE69836395T2 (de) 2007-09-27
CN1191975A (zh) 1998-09-02
BRPI9800337B8 (pt) 2023-05-02
PL324327A1 (en) 1998-07-20
JP2838084B2 (ja) 1998-12-16
PL191989B1 (pl) 2006-07-31
KR19980070560A (ko) 1998-10-26
BRPI9800337B1 (pt) 2014-04-08
KR100257438B1 (ko) 2000-05-15
NO980212D0 (no) 1998-01-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0727497B1 (en) Primers and probes for the detection of HIV
JP2846018B2 (ja) 核酸配列の増幅および検出
EP0887427B1 (en) Amplification and detection of hiv-1 and/or hiv-2
CZ288064B6 (cs) Oligonukleotidové primery pro detekci HIV-1, jejich použití a kit, který je obsahuje
JP3936798B2 (ja) Ｒｎａ標的配列の増幅方法
KR100189229B1 (ko) 핵산 증폭을 강화하는 방법
US5837442A (en) Oligonucleotide primers for amplifying HCV nucleic acid
AU736503B2 (en) Nucleic acid sequences that can be used as primers and probes in the amplification and detection of all subtypes of HIV-1
EP0566670A4 (en) Nucleic acid sequence detection by triple helix formation
CA2312779A1 (en) Specific and sensitive nucleic acid detection method
JP2001512301A (ja) 核酸増幅のための内部陽性対照
CN114317690B (zh) 预扩增多靶核酸结合荧光定量pcr检测的方法
EP0418960A2 (en) Nucleic acid detection method using unequal primer concentrations in polymerase chain reaction
MXPA98000480A (en) Cebadores for vi detection
HK1010896B (en) Primers for the detection of hiv-1
Sweden et al. Lizardi et al.
JP2002522047A (ja) 限界まで非弁別的なハイブリダイゼーションを調節する方法及び組成

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20180116