PL193489B1

PL193489B1 - Cząsteczka DNA, białko, mikroorganizm Comamonas acidovorans, sposób wytwarzania roślin oraz roślinytransformowane genem deacetylazy N-acetylofosfinotricyny

Info

Publication number: PL193489B1
Application number: PL97377650A
Authority: PL
Inventors: Klaus Bartsch; Guido Kriete; Inge Broer; Alfred Pühler
Original assignee: Hoechst Schering Agrevo Gmbh
Priority date: 1996-12-16
Filing date: 1997-12-03
Publication date: 2007-02-28
Also published as: ES2296318T3; CN1171993C; PL193522B1; CZ216699A3; BR9714513A; ATE377072T1; CA2275134A1; US6177616B1; ZA9711146B; DE59712890D1; EP0942965A2; JP2001506130A; WO1998027201A3; EP0942965B1; NZ335852A; HUP0000396A2; TR199901332T2; HUP0000396A3; AU727831B2; WO1998027201A2

Abstract

1. Czasteczka DNA kodujaca bialko o aktywnosci biologicznej deacetylazy N-acetylofosfi- notricyny, która jest wyizolowana z Comamonas acidovorans, zdeponowanego pod numerem DSM 11070. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest cząsteczka DNA, białko, mikroorganizm Comamonas acidovorans, sposób wytwarzania roślin oraz rośliny transformowane genem deacetylazy N-acetylo-fosfinotricyny.

Koncepcja chemicznie indukowalnej, odwracalnej męskiej sterylności u roślin poprzez specyficzną dla pylników ekspresję deacetylazy N-acetylofosfinotricyny (N-acetylo-PTT) jest opisana w Europejskim Zgłoszeniu Patentowym EP 531 716. Stosowany przy tym gen deacetylazy ze Streptomyces viridiochromogenes (deacetylaza N-acetylo-L-fosfinotricylo-alanylo-alaniny (N-acetylo PTT, dea) lub argE z Escherichia coli (deacetylaza N-acetylo-L-ornityny) kodują białka o specyficzności dla N-acetylo-L-PTT. Wykazano, że oba geny przy ekspresji specyficznej dla warstwy wyścielającej (tapetum) u roślin powodują występowanie męskosterylnych kwiatów po działaniu N-acetylo-L-PPT na pojedyncze pąki. Dla skutecznego zastosowania tego systemu szczególnie przy traktowaniu całych roślin N-acetylo-PTT, korzystne jest w warunkach praktycznych użycie deacetylaz o wyższym powinowactwie w stosunku do substratu.

Tak więc poszukiwano innych deacetylaz z wyższymi powinowactwem w stosunku do N-acetylo PPT.

Celem wynalazku jest dostarczenie cząsteczek DNA, które kodują białko o aktywności deacetylazy. Wykorzystując takie cząsteczki DNA kodujące deacetylazy można e wytworzyć rośliny o częściach, które można celowo zniszczyć. Szczególnie interesująca jest produkcja męsko- lub żeńskosterylnych roślin.

Wynalazek dotyczy cząsteczki DNA kodującej białko o aktywności biologicznej deacetylazy N-acetylo-fosfinotricyny, która jest wyizolowana z Comamonas acidovorans, zdeponowanego pod numerem DSM 11070.

Korzystnie cząsteczka DNA według wynalazku koduje białko obejmujące sekwencję aminokwasową o Id. Sekw. Nr 4 lub fragmenty tego białka posiadające aktywność biologiczną deacetylazy N-acetylo-fosfinotricyny. Korzystnie cząsteczka ta obejmuje nukleotyd o Id. Sekw. Nr 3 lub sekwencję, która różni się od tej sekwencji ze względu na degenerację kodu genetycznego.

Wynalazek dotyczy również białka kodowanego przez cząsteczkę DNA według wynalazku.

Właściwości enzymatyczne tych białek opisano w przykładach. W zakres wynalazku wchodzi mikroorganizm Comamonas acidovorans zdeponowany pod numerem DSM 11070.

Zakresem wynalazku objęty jest również sposób wytwarzania roślin mających wybiórczo zniszczalne części, który obejmuje:

a) transformowanie komórek roślinnych genem deacetylazy N-acetylo-fosfinotricyny obejmującym cząsteczkę DNA według wynalazku, pod kontrolą promotora kierującego ekspresją w określonych częściach roślinny, i

b) regenerowanie roślin z komórek roślinnych otrzymanych w etapie (a), przy czym rośliny te mają części, które mogą być wybiórczo zniszczone przez traktowanie N-acetylo-fosfinotricyną (N-acetyl-PPT).

W korzystnym sposobie według wynalazku specyficzna ekspresja genu deacetylazy N-acetylofosfinotricyny jest pod kontrolą promotora specyficznego dla warstwy wyścielającej, korzystniej promotora genu tap1 z Antirrhinum majus.

Wynalazek dotyczy także roślin transformowanych genem deacetylazy N-acetylo-fosfinotricyny obejmującym cząsteczkę DNA według wynalazku, pod kontrolą promotora kierującego ekspresją w określonych częściach rośliny, przy czym te określone części mogą być wybiórczo zniszczone przez traktowanie N-acetylo-fosfinotricyną (N-acetyl-PPT).

Transgeniczne rośliny mogą być uzyskane za pomocą znanych technik z komórek roślinnych, które zostały stransformowane cząsteczkami DNA według wynalazku i regenerowane do całych roślin.

Szczególnie interesujące są sposoby produkcji roślin mających części, które można celowo zniszczyć przez specyficzną ekspresję genu deacetylazy jak i sposoby produkcji roślin męsko- lub żeńskosterylnych, poprzez specyficzną ekspresję genu deacetylazy.

Rozwiązania według wynalazku umożliwiają:

(1) celowe wzbogacanie w mikroorganizmy z wysoką aktywnością deacetylazy N-acetylo-PPT;

(2) izolację odpowiednich genów deacetylazy (3) oczyszczenie i charakterystykę kodowanych przee te geny białek o wysokiej aktywności deacetylazy N-acetylo-PPT (4) ekspresję genu deacetylazy u roślin.

PL 193 489 B1

Stosując pożywkę mineralną z chityną jako jedynym źródłem węgla można było namnożyć bakterie z próbek gleby, które są w stanie rozszczepiać z wysoką skutecznością N-acetylo-PPT. W ten sposób możliwe było wyizolowanie dwóch szczepów bakterii jako czystych kultur: Stenotrophomonas sp. (nr. depozytu DSM 9734) i Comamonas acidovorans (Nr depozytu DSM 11070).

Jednak dla wymaganych w preparatyce przemysłowej warunków jest znacznie bardziej korzystne stosowanie oczyszczonego enzymu.

Poniżej opisano nowe deacetylazy specyficzne w stosunku do L-N-acetylo-PPT, i nowy i skuteczny sposób oczyszczania i charakterystyki tych enzymów ze wzbogaconej kultury tych mikroorganizmów gleby jak i zastosowanie tych deacetylaz. Opisano również:

1. Deacetylazy z

- masą cząsteczkową 20000 do 100000 daltonów

- o optimum pH 6,5-10,0

- specyficzności substratowej w stosunku do L-N-acetylo-fosfinotricyny.

2. Sppsóó przzygtowania ddeactylaaz, który ppleeg na tym,żż hoduje się mikroorggnizm nie twprzący spór w pożywce zawierającej chitynę z kraba, i deacetylazę izoluje się z tego mikroorganizmu.

3. Zastpspwanie deace1:ylazy scharakkeryzowanej w 1. do rpślln nych jak i do stereospecyficznego przygotowania L-fosfinotricyny.

Białko według wynalazku o aktywności enzymatycznej ma optimum temperatury leżące między 30°C i 50°C.

Sposób wytwarzania deacetylaz korzystnie przeprowadza się z mikroorganizmami, wybranymi z grupy, która składa się z organizmów opisanych powyżej.

Chitynę z kraba można otrzymać jak opisali Shimara, Kenzo i Takiguchi, Yasuyuki (Methods in Enzymology, tom 161, str. 417-423, 1988) lub jest do nabycia w firmie Sigma.

W celu oczyszczenia deacetylazy mikroorganizm hoduje się w pożywce odżywczej optymalnej dla jego wzrostu. Hodowanie mikroorganizmu przebiega w warunkach tlenowych, na przykład w hodowli zanurzeniowej przy wytrząsaniu lub mieszaniu w kolbach do wytrząsania lub fermentorach, ewentualnie przy wprowadzaniu powietrza lub tlenu. Fermentacja może zachodzić w temperaturze od około 20 do 40°C, korzystnie około 25 do 37°C, a szczególnie korzystnie przy 30 do 37°C. Hodowlę prowadzi się w zakresie pH między 5 i 8,5, korzystnie między 5,5 i 8.

W tych warunkach hodowli na ogół mikroorganizmy wykazują po 1 do 3 dni godną uwagi akumulację enzymu. Synteza deacetylazy zaczyna się z fazą logarytmiczną. Produkcję enzymu można śledzić za pomocą testu aktywności poprzez analizę HPLC lub fotometrycznie. Stosowana do produkcji pożywka płynna zawiera 0,2 do 5%, korzystnie 0,5 do 2% chityny z kraba i sole nieorganiczne.

Jako sole nieorganiczne pożywka płynna może zawierać na przykład chlorki, węglany, siarczany lub fosforany metali alkalicznych lub metali ziem alkalicznych, żelaza, cynku i manganu, ale także sole amonowe i azotany.

Do deacetylacji mogą być stosowane skuteczne ilości deacetylazy w postaci wolnej lub immobilizowanej, korzystnie wprowadzane do roślin, które wyrażają gen deac.

W celu unieruchomienia stosować można znane sposoby, takie jak opisano w niemieckich opisach wyłożeniowych 32 37 341 i 32 43 591.

Izolację i oczyszczanie enzymu można prowadzić według klasycznych procedur przez rozerwanie za pomocą ultradźwięków i prasy Frencha, strącanie siarczanem amonu, wymianę jonową, chromatografię powinowactwa i sączenie na żelu.

Preparat enzymatyczny można scharakteryzować za pomocą masy cząsteczkowej od 20000 do 100000 daltonów, korzystnie 30000 do 80000, szczególnie korzystnie 40000 do 70000 daltonów. Optimum pH enzymu leży w zakresie pH od 6,0 do 10,0, szczególnie 7,0 do 8,0. Optimum temperatury enzymu leży między 30 i 50°C, szczególnie między 35 i 45°C.

Kodujący deacetylazę gen sklonowano w E. coli. Dla genu deac-1 ze Stenotrophomonas sp. przygotowano fagmidowy bank ekspresyjny z genomowego DNA w E. coli i przeszukiwano pod kątem aktywności deacetylazy specyficznej w stosunku do N-acetylo-PTT. Gen deac2 z Comamonas acidovorans sklonowano poprzez komplementację mutanta E. coli argE za pomocą banku genomowego.

Sekwencje aminokwasów wyprowadzone z sekwencji DNA obu genów są do siebie podobne i posiadają ponadto homologię do hydrolaz hipuranowych, znanych z banków danych białek.

Rośliny transgeniczne mają wysoką wrażliwość tkanki na N-acetylo-PPT, co świadczy o wysokim powinowactwie w stosunku do substratu białka deac1 (K_m = 670 μΜ). Tak więc, możliwe jest przy konstytutywnej ekspresji genu deac uzyskanie roślin, których liście są wrażliwe na stężenia do

PL 193 489 B1

0,4 mg/ml N-acetylo-D,L-PPT (= 0,2 mg/ml L-enancjomeru). Przy ekspresji specyficznej w stosunku do tapetum uzyskano sterylność męskich kwiatów przez działanie na pąki 2 mg/ml N-acetylo-D,L-PPT (= 1 mg/ml L-enancjomeru). Opisane wyniki dotyczą roślin szklarniowych. Ze względu na niskie stężenia substratu w razie potrzeby w warunkach otwartej przestrzeni możliwe jest bez problemu stosowanie dawki 5-10 razy wyższej.

Przedstawione przykłady służą do dalszego wyjaśnienia wynalazku. Procenty, o ile nie podano inaczej, są procentami wagowymi. Wynalazek jest dalej definiowany w zastrzeżeniach patentowych.

P r z y k ł ad 1. Izolacja i identyfikacja mikroorganizmów gleby ze specyficzną aktywnością deacetylazy N-acetylo-PPT

Po 1 g gleby (piaszczysta glina, Schwanheimer Duene) mieszano z 10 mM NaCl, 10 mM buforem Na-fosforan, pH = 7,0 i ekstrahowano przez 1 godz. w temperaturze pokojowej. Do selekcji poszczególnych grup mikroorganizmów resztki gleby zaszczepiano do następujących pożywek płynnych.

(1) Pożywka MS-1 (dla eubakterii): 5 mM glukoza mM bursztynian 10 mM gliceryna g/l NH4Cl 50 ml/l roztworu A 50 ml/l roztworu B roztwór A: 50 g/l K2HPO4 roztwór B: 2,5 g/l MgSO4 0,5 g/l NaCl ml/l elementów śladowych (2) pożywka chitynowa dla Actinomycetes i Streptomycetes, jak i bakterii chitynożernych g/l chityny z kraba 1 g/l (NH4)2SO4 0,5 g/l MgSO4 50 ml/l roztworu A ml/l elementów śladowych (3) Pożywka z antybiotykami (dla grzybów wyższych):

g/l ekstraktu słodowego 10 g/l glukozy g/l ekstraktu z drożdży 0,5 g/l (NH4)2SO4 mg/ml tetracykliny

Wszystkie pożywki zawierały 5 mM N-acetylo-PPT i były inkubowane po zaszczepieniu przez 3-5 dni w 28°C.

Wzbogacone kultury następnie testowano pod kątem aktywności deacetylacji N-acetylo-PPT. W tym celu komórki zwirowywano przy 10000 obr/min i w supernatancie badano wiązanie PPT w analizatorze aminokwasów (Biotronic LC 5001). Wyłącznie kultury chitynowe okazały się deacetylazododatnie. Po wysianiu na agar z chityną z tych kultur wyizolowano w sumie 40 kolonii pojedynczych, ponownie hodowano je w chitynowej pożywce płynnej i znowu badano aktywność deacetylazy. Znaleziono 6 dodatnich izolatów, z których przez ponowne wysianie na płytki agarowe i dalszą hodowlę kolonii pojedynczych uzyskano aktywne kultury czyste. Szczep z najwyższą aktywnością deacetylazy został zidentyfikowany jako Stenotrophomonas sp. (numer depozytu DSM 9743).

P r z y k ł a d 2: Klonowanie i sekwencjonowanie genu deacetylazy N-acetylo-PPT ze Stenotrophomonas sp.

Stosowane przy pracy standardowe metody biologii molekularnej opisano w Maniatis i wsp. 1982: Molecular Cloning: a Laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.

Genomowy DNA ze Stenotrophomonas sp. przygotowano według metody Meade i wsp., 1982, J.Bacteriol. 149:114-122. Po częściowym trawieniu Sau3A wyizolowano frakcję o wielkości 5-10 kb i ligowano ją ze strawionym BamHI wektorem lambda-ZAP-Express z firmy Stratagene (ZAP Express vector kit, nr. Katalogu 239201; opis zestawu). Za pomocą pakowanej próbki ligacji uzyskano pierwotny bank fagów lambda, i następnie poddano go amplifikacji. W ten sposób sporządzono za pomocą systemu fagmidowego pBK-CMV firmy Stratagene (nr katalogu 212209, instrukcja stosowania) fagmidowy bank ekspresyjny w Escherichia coli. W tym banku genomowym poszukiwano genu deacetylazy poprzez badanie aktywności z [ C]-N-acetylo-L-PPT jako substratem.

PL 193 489 B1

W tym celu zaszczepiono 2000 pojedynczych klonów w płytkach mikrotitracyjnych i inkubowano przez noc w pożywce LB w 37°C z 0,2 mM izopropylotiogalaktozydem (IPTG) jako induktorem i 50 mg/ml kanamycyny jako markerem oporności. Komórki odwirowano i inkubowano każdą próbkę przez noc w 28°C 10 ml 1 mM [ C]-N-acetylo-L-PPT. Następnie próbki zbierano po osiem i poddawano chromatografii cienkowarstwowej i autoradiografii pod kątem analizy przekształcenia N-acetylo-PPT do PPT (patrz EP 531 716, przykład 8) i przy pozytywnym wyniku badano pojedyncze klony. Za pomocą tej procedury udało się zidentyfikować dodatni klon ze wstawką 6 kb pośród 1920 transformantów. Ten fragment DNA poddano dokładniejszej analizie poprzez mapowanie restrykcyjne. Poprzez subklonowanie fragmentów restrykcyjnych wstawki w pUC18/19 i transformację zrekombinowanych plazmidów do E. coli udało się zlokalizować za pomocą opisanego powyżej testu aktywności gen struktury deac w fragmencie 2,5 kb (2487 par zasad) SalI/Smal (Fig. 1). Aktywność była zależna od orientacji fragmentu w stosunku do promotora lac wektora.

Fragment 2,5 kb poddano sekwencjonowaniu na obu niciach za pomocą metody Sangera (Sanger i wsp., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci USA 74:5463-5466). Cały fragment ma łączną długość 2487 nukleotydów (p. SEK NR ID. 1). Otwarta ramka odczytu o długości 1494 nukleotydów rozpoczyna się przy nukleotydzie Nr 367 i kończy się przy Nr. 1860.

Badania ekspresji z użyciem subfragmentów PCR w tym obszarze u E. coli wykazały, że aktywne białko deacetylazy jest kodowane przez obszar o długości 1365 nukleotydów od kodonu start w pozycji 496 do kodonu stop TGA w pozycji 1860. Wywiedziona z sekwencji DNA sekwencja aminokwasów stanowi polipeptyd złożony z 454 aminokwasów (SEQ NR ID 2) z obliczoną masą cząsteczkową 48,1 kDa.

Poszukiwanie homologii w bankach danych EMBL białek i DNA wykazało podobieństwa z opisaną po raz pierwszy w tym zgłoszeniu sekwencją deacetylazy N-acetylo-PPT z Comamonas acidovorans (37,4% identycznych aminokwasów), hydrolazy hipuranowej z Campylobacter jejuni (33,9%) i N-acetylo-L-amidohydrolazy z Bacillus stearothermophilus (33,7%). Dalej gen wyizolowany ze Stenotrophomonas będzie określany jako deac1. Ze względu na homologię można założyć, że także wymienione hydrolazy hipuranowej i amidohydrolazy w połączeniu ze specyficznymi tkankowo promotorami i po dalszej obróbce korzystnie mogą być wykorzystane do przygotowania roślin z tkankami, które można selektywnie niszczyć, szczególnie roślin męsko- i/lub żeńskosterylnych.

P r z y k ł a d 3: Charakterystyka białka Deac1

W celu nadekspresji i oczyszczenia deacetylazy ze Stenotrophommonas sp. (deac1) zastosowano system fuzji genowej z S-transferazą glutationu firmy Pharmacia (Nr Katalogu 27-4581-01, Nr katalogu 27-4570-01). Metoda opisana jest w Smith i Johnson, 1988, Gene 67:31. Oczyszczanie fuzji białkowej przeprowadza się za pomocą chromatografii powinowactwa na glutationylo-Sepharose-4B.

Funkcjonalny gen deac przeklonowano do wektora fuzyjnego GST pGEX-4T-2 pod kontrolą promotora lac. Ekspresję zrekombinowanego białka fuzyjnego indukowano przez dodanie 0,1 mM IPTG. Białko fuzyjne jako prążek o wielkości 74 kDa można było wykazać w surowych ekstraktach transformantów E. coli za pomocą elektroforezy SDS/poliakryloamid.

W celu oczyszczania białek komórki pochodzące z 2 l kultury indukowanej dodatniej pod względem ekspresji transformanta E. coli otwierano za pomocą ultradźwięków i następnie rozpuszczano ekstrakt przez dodanie 1% Tritonu X 100. Supernatant wiązano z glutationylo-4B-Sepharose. Po wielokrotnym płukaniu buforem PBS (140 mM NaCl, 3 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4 pH = 7,3) rozszczepiano związane z macierzą Sepharose białko fuzyjne za pomocą trombiny. Eluat zawierał jako jedyny prążek białka produkt rozszczepienia o wielkości 48 kDa (po denaturującej elektroforezie SDS/poliakryloamid), który w oznaczeniu enzymatycznym (patrz poniżej) można było zidentyfikować jako deacetylazę N-acetylo-PPT. Za pomocą opisanej metody udało się oczyścić 200 mg białka deacetylazy do homogenności.

Aktywność białka deacetylazy mierzono za pomocą dwóch następujących oznaczeń:

(1) Test radioaktywny: po 2,5 mg oczyszczonego enzymu inkubowano w porcjach po 10 ml w buforze PBS z 0,1 mM [¹⁴C]-N-acetylo-L-PPT przez 15 minut w 37°C. Następnie próbki rozcieńczano 1:6 w 5 mM K2HPO4, 10% metanolu, pH = 1,92 i analizowano w HPLC z detektorem radioaktywności (kolumna do rozdziału: Spherisorb SAX; roztwór do rozwijania 5 mM KH2PO4, 10% metanol, pH 1,92. Tempo przepływu: 0,5 ml/min. W tych warunkach [ C]-L-PPT eluuje się przy 4,5 min i [ C]-N-acetlo-L-PPT przy 6,5 min. Specyficzne aktywności deacetylazy podawano w [ C]-N-acetylo-L-PPT/min/mg białka. W celu ustalenia optimum pH przyrządzono próbki w układzie buforującym z 40 mM Bis-Tris,

PL 193 489 B1

Tris i Caps między pH 6 i 9. Dla oznaczenia wartości K_m trzykrotnie prowadzono oznaczenia z [ C]-N-acetylo-L-PPT między 0,01 mM i 1 mM przy pH 8,0 w obecności 1 mM CoCh (2) Test nieradioaktywny: W celu badania specyficzności substratowej po 5 mg oczyszczonego enzymu w próbkach po 20 ml w buforze PBS zawierającym 25 mM określonego N-acetylo lub N-acyloaminokwasu inkubowano przez 60 minut w 28°C. Następnie w próbkach mierzono wytwarzanie wolnych aminokwasów w analizatorze aminokwasów (Biotronic LC 5001). Specyficzne aktywności podano w nmolach aminokwasów/min/mg białka. Dla deacetylazy N-acetylo-PPT ustalono optimum pH = 8 (patrz Tabela 1) i optimum temperatury 37°C (p. Tabela 2). Kinetyczne pomiary dały wartość K_m 670 mM. Przez dodatek 1 mM CoCh udało się podwyższyć aktywność enzymatyczną o 20%.

Tabel a 1

Optimum pH deacetylazy N-acetylo-PPT

Wartość pH	Aktywność specyficzna [mol/min/mg białka]
6	2,4
7	7,2
8	12,0
9	8,5

T a b ela 2

Optimum temperatury deacetylazy N-acetylo-PPT

Temperatura [°C]	Aktywność specyficzna [mol/min/mg białka]
28	9,6
37	16,8
50	14,9
60	4,3

Wyniki pomiarów specyficzności substratowej są podane w tabeli 3.

Enzym posiada stosunkowo szerokie spektrum substratowe. Najwyższe przetwarzanie stwierdzono z kwasem hipurowym (N-benzoilo-glicyna) i N-acetylo-L-glutaminianem. Powinowactwo w stosunku do N-acetylo-L-PPT wynosi około 50% poziomu stwierdzonego dla obu wymienionych substratów. Deacetylaza posiada wyłączną specyficzność dla N-acetylo-L-aminokwasów. Dla odpowiednich D-enancjomerów nie udało się zaobserwować żadnych reakcji.

Tabel a 3

Specyficzność substratowa deacetylazy N-acetylo-PPT

^bsfraf	Względna aktywność2 [%]
Kwas hipurowy (N-benzoilo-glicyna)	100
N-Ac-fosfinotricyna	43
N-Ac-ornityna	37
N-Ac-metionina	0
N-Ac-tryptofan	0,4
N-Ac-fenyloalaniana	24
N-Ac-tyrozyna	11
kwas N-Ac-glutaminowy	100
N-Ac-glutamina	30
N-Ac-glicyna	59
N-Ac-histydyna	43
N-Ac-leucyna	33
N-Ac-walina	2
N-ac-seryna	4
N-ac-prolina	0

¹ Przy wszystkich wiązaniach chodzi o L-enancjomery ²Aktywność specyficzna mierzona z kwasem hipurowym została określona jako 100% i inne wartości odnoszono do niej

PL 193 489 B1

P r z y k ł a d 4: Konstytutywna ekspresja genu deacl w tytoniu

Gen struktury deac1 przeklonowano jako fragment 1,4 kb BamHI/Sall-PCT do binarnego wektora pPCV801 (Koncz i Schell, 1986, Mol. Gen. Genet. 204: 383-396). Powstały plazmid pPCVK-DEAC (fig. 2) z wektorem ekspresyjnym promotor 35S-gen struktury deac1-terminator 35S wtransformowano za pomocą standardowych metod do Agrobacterium tumefaciens (szczep ATHV). Kawałeczki liści tytoniu (Nicotiana tabacum) transformowano zrekombinowanym Agrobacterium według metody Horsch i wsp., 1985, Science 227:1229-1231 i selekcjonowano na pożywce z kanamycyną, zregenerowano 18 niezależnych transformantów tytoniu i badano w nich ekspresję deacetylazy w liściach. W przypadku aktywności białka w transgenicznych roślinach należało liczyć się z wrażliwością liści na N-acetylo-PPT, jako że związek jest w roślinie przerabiany na działający jako herbicyd związek czynny fosfinotricynę.

W próbie kroplowej liście transgenicznych roślin jak i szeregu nietransgenicznych roślin kontrolnych traktowano po 5 ml następujących stężeń N-acetylo-D,L-PPT: 4 mg/ml (=15 mM), 1 mg/ml (=3,75 mM), 0,4 mg/ml (=1,5 mM), 0,1 mg/ml (=0,38 mM). Miejsca traktowane badano po 1-2 tygodniach sprawdzając rozjaśnienie lub tworzenie nekrozy. Równocześnie mierzono aktywność deacetylazy specyficznej w stosunku do PPT w transformantach jak i roślinach kontrolnych w surowych ekstraktach. W tym celu homogenizowano po 100 mg materiału liści w 200 ml buforu PBS, odwirowano resztki komórek i dializowano zawierające białka supernatanty przez noc w 4°C. Po 10 ml tych próbek inkubowano 37°C przez noc z 0,1 mM [ C]-N-acetylo-L-PPT. Próbki następnie analizowano w HPLC jak opisano powyżej z badaniem wytwarzania [ C]-L-PPT.

Wyniki badań prób kropli i testu aktywności podano dla wybranych roślin w Tabeli 4. Okazało się, że około 60% transformantów wyraża funkcjonalne białko deacetylazy i wykazuje odpowiedni fenotyp.

T a b e l a 4

Wrażliwość roślin pPCYKDEACl na N-acetylo-PPT i aktywność deacetylazy w surowych ekstraktach

Rośliny	Próba kroplowa z' AktywnośćDEAC w surowym esstrakcie N^-Ac^-D,L^-PPT ⁴mg/^ml 1 mg/^m 1 0,4 mg/m 1 0,1 mg/m 1 [%L-PPT]¹
	Obserwacje (liście)
Kontrola		-	-	-	-	0
pPCVK9		+++	+	-	-	14,2
pPCVK14	zwiędły	+	+	-	-	12,1
pPCVK15	zwiędły	++	+	+	-	36,0
pPCVK16	zwiędły	+	+	-	-	4,7
pPCVK16	zwiędły	+	+	-	-	4,3

¹ w stosunku do wprowadzonej radioaktywności [¹⁴C]-N-acetylo-L-PPT) + + +: silna nekroza ++ : wyraźne uszkodzenia +: słabe rozjaśnienie -: brak objawów

P r z y k ł a d 5: Specyficzna w stosunku do tapetum ekspresja genu deac1 u tytoniu

Za pomocą standardowych metod połączono specyficzny w stosunku do tapetum promotor genu tap-1 z lwiej paszczy (Antirrhinum majus) jako fragment 2,2 kb EcoRI/BamHI z genem struktury deac1 (fragment PGR 1,4 kb BamHI/SalI) i terminatorem 35S w wektorze pUC18. W ten sposób powstałą kasetę ekspresyjną promotor tap-1-gen struktury deac-terminator 35S wklonowano jako fragment 3,8 kb EcoRI w miejsce regionu promotor 35S/terminator 35S w wektorze binarnym pPCV801 (plazmid pPCVTDEAC1, fig. 3). Transformację tytoniu przeprowadzono jak opisano w Przykładzie 4.

Przy ekspresji deacetylazy specyficznej w stosunku do tapetum powinny po traktowaniu pączków kwiatów N-acetylo-PPT powstawać męskosterylne kwiaty. Przekształcenie pochodnej PPT w czynny związek herbicydu fosfinotricynę prowadzi do selektywnego uszkodzenia tkanki tapetum, przez co zahamowane jest wytwarzanie funkcjonalnego pyłku.

PL 193 489 B1

Tylko jeden bok kwiatostanu (całego obszaru tworzących się pąków kwiatowych) traktowano N-acetylo-PPT, druga połowa kwiatostanów nie była traktowana aby upewnić się, że obserwowane zjawiska nie są wynikiem zniekształceń roślin. Traktowanie przeprowadzano w momencie, w którym pojedyncze pąki nie były większe od 5 mM (faza czynna promotora tapetum). Transformanty tytoniu jak i szereg roślin kontrolnych NT Sam NN w ciągu tygodnia poddawano 3x działaniu 0,2% N-acetylo-D,L-PPT (7,5 mM)/0,1% Genapol (środek sieciujący). Po zakwitnięciu pąków (ok. 9-11 dni po zakończeniu traktowania) badano rośliny pod kątem występowania męskosterylnych kwiatów.

Równocześnie badano specyficzną w stosunku do N-acetylo-PPT aktywność deacetylazy w niedojrzałych pylnikach transformantów jak i w roślinach kontrolnych. W tym celu niedojrzałe pylniki preparowano z pąków kwiatowych o wielkości około 5 mM i inkubowano przez noc każdy w 50 mM roztworze [ C]-N-acetylo-L-PPT. Następnie pylniki płukano w 1 x 500 ml buforu PBS i homogenizowano w 50 ml buforu PBS. Po odwirowaniu resztek komórek supernatanty zatężono w Speed-Vac a osady podnoszono w 30 ml buforu HPLC (5 mM KH2PO4, 10% metanol, pH = 1,92). Próbki analizowano w HPLC jak opisano powyżej pod kątem wytwarzania [ C]-L-PPT.

Wyniki traktowania kwiatów i testu aktywności podano dla wybranych roślin w tabeli 5. U prawie wszystkich transformantów udało się stwierdzić obecność specyficznej w stosunku do pylników aktywności deacetylazy. W 3 transformantach ze strony traktowanej N-acetylo-PPT w gronach kwiatów kwiaty męskie stawały się męskosterylne tzn. nie tworzył się pyłek lub też obserwowano kwiaty, o znacznie zmniejszonej ilości pyłku. Działanie na nowe, dojrzewające pąki pozostawało przez okres około trzech tygodni. Nietraktowane kwiaty transformantów jak i traktowane kwiaty roślin kontrolnych były we wszystkich wypadkach płodne. W męskosterylnych kwiatach nie stwierdzono powstawania plemników. Było jednak możliwe zapłodnienie krzyżowe męskosterylnych kwiatów, przez co wykazano, że żeńskie części kwiatów w pełni zachowały swoją funkcjonalność (Nacken i wsp., 1991, Mol. Gen. Genet. 229:129-136).

Tabel a 5

Indukowana męska sterylność u roślin pPCVTDEAC1 przez traktowanie kwiatów N-acetylo-PPT i aktywność deacetylazy w pylnikach

Roślina	Liczba kwiatów sterylnych lub o kwiatach Aktywność deacetylazy ze zmniejszoną ilością pyłku w pylnikach [% L-PPT1¹
	traktowane	nietraktowane
Kontrola	0	0	0
pPCVT14	18	0	70,0
pPCVT15	0	0	13,8
pPCVT16	10	0	20,4

¹W stosunku do wprowadzonej aktywności ( [¹4C]-N-acetylo-L-PPT)

P r z y k ł a d 6: Izolacja i identyfikacja deacetylazy ze specyficznością w stosunku do N-acetylofosfinotricyny z Comamonas acidovorans

Próbkę gleby z Bangkoku rozprowadzono w pożywce z soli mineralnych (0,5 g K2HPO4, 0,2 g MgSO4, 2 g (NH4)2SO4, 0,01 g FeSO4 w 980 ml H2O), która zawierała chitynę (2 g/l) jako jedyne źródło węgla i następnie inkubowano w 30°C przez 48 godzin. Następnie przeprowadzono przeszczepienie do świeżej pożywki z solami mineralnymi i po kolejnych 48 godzinach inkubacji wysiewano szeregi rozcieńczeń na pożywce LB (Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Wśród rosnących kolonii znalazły się też kolonie szczepu bakterii, który się wyróżniał bardzo dobrym wykorzystaniem N-acetylo-glutaminianu jako jedynego źródła węgla (wysianie na pożywkę minimalną z solami mineralnymi z N-acetyloglutaminianem (2 g/l, dodawać jako sterylizowany przez filtrowanie roztwór do autoklawowanej pożywki minimalnej z 14 g/l agaru) prowadzi w czasie inkubacji przez 12 godzin w 30°C do tworzenia wyraźnie widocznych kolonii). Deacetylację N-acetylo-PPT wykazano jak opisano powyżej. Szczep określony w laboratorium jako B6 został zidentyfikowany przez DSM jako Comamonas acidovorans (DSM 11070).

PL 193 489 B1

P r z y k ł a d 7: Klonowanie genu deacetylazy Comamonas acidovorans

Izolowano całkowity DNA z Comamonas acidovorans, strawiono EcoRI i zligowano ze strawionym EcoRI DNA wektora pA-CYC184 (Cang i Cohen, J. Bacteriol. 134, 1141-1156). Mieszaninę ligacyjną wykorzystano do elektroporacji mutanta argE E. coli XSID2 (Mountain i wsp., 1984, Mol. Gen. Genet. 187, 82-89). Poprzez selekcję na komplementację auksotrofa argininowego udało się wyizolować fragment EcoRI o wielkości 8,9 kb z genomu C. acidovorans, który wystarcza do komplementacji. Poprzez subklonowanie możliwe było ograniczenie obszaru komplementującego do wielkości 1,4 kb. Leży on w określonej jako pGK83 pochodnej wektora do sekwencjonowania pSVB30 (Arnold i Puehler, 1989, Gene 70, 172-173).

P r z y k ł a d 8: Sekwencjonowanie genu deacetylazy z Comamonas acidovorans

Komplementujący fragment 1,4 kb (1387 par zasad) zsekwencjonowano całkowicie z obu nici stosując znane metody.

P r z y k ł a d 9. Analiza obszaru kodującego i porównanie homologii sekwencjonowanego obszaru

Analiza obszaru kodującego pokazała otwartą ramkę odczytu od pozycji 1 do 1206 (SEK NR ID 3), która koduje białko o wielkości 402 aminokwasów (SEK NR ID 4).

Porównanie homologii ze znanymi genami z baz danych wykazuje wyraźną homologię do N-acyloamidohydrolazy z Bacillus stearothermophilus (ama, Sakanyan i wsp., 1993, Appl. Environ. Microbiol. 59, 3878-3888) i hydrolazy hipuranowej z Campylobacter jejuni (dotychczas nieopublikowanej). W porównaniu białek hydrolaza hipuranowa wykazuje 43% identycznych aminokwasów (tabela 6). Ponadto gen wykazuje na poziomie DNA i białka bardzo wyraźną homologię do genu deacetylazy wyizolowanego ze Stenotrophomonas sp. W oparciu o określenie genu ze Stenotrophomonas gen wyizolowany z C. acidovorans określono jako deac2.

T ab ela 6

Porównanie homologii ze znanymi sekwencjami

Gen	Organizm	Funkcja	Identyczne aminokwasy	Konserwatywne aminokwasy
n. n.	Campylobacter jejuni	hydrolaza hipuranowa (383 AS)	43,1%	60,0%
deac2	Bacillus stearothermophilus	N-acylo-L-amidohydrolaza	37,0%	49,5%

P r z y k ł a d 10. Nadekspresja genu deac2 z Comamonas acidovorans - konstrukty roślinne

W celu analizy specyficzności substratowej produktu genu deac2 z Comamonas acidovorans uzyskano jego nadekspresję. W tym celu wklonowano gen do wektora o wysokiej liczbie kopii pod kontrolą promotora lacz. Jednak ekspresja była ograniczona przez równoczesną, zachodzącą w innej ramce odczytu translację lacz-alfa. Dlatego przerwano ją przez wprowadzenie kodonu stop, aby wektor pGK18 umożliwiał nadekspresję genu deac2, na którą nie miała wpływu ekspresja genu lacz. Można było wykazać także fenotypowo, że ten konstrukt wykazuje wyraźnie silniejszą komplementację mutanta argE E. coli.

W celu transformacji roślin gen struktury deac2 przeklonowano z zastosowaniem wektora binarnego pROKl (Baulcombe i wsp. 1986, Nature, 321:446-449) za konstytutywnym promotorem 35S lub specyficznym w stosunku do tapetum promotorem TA-29. Uzyskany plazmid ekspresyjny pGK83 i pMF9 przedstawiono na Figurach.

P r z y k ł a d 11: Badanie specyficzności substratowej produktu genu deac2 z Comamonas acidovorans

W celu zbadania specyficzności substratowej produktu genu deac2 z Comamonas acidovorans zastosowano komórki szczepu E. coli XL1-Blue permeabilizowane za pomocą toluenu/etanolu z i bez wektora pGK81. Permeabilizowane komórki inkubowano przez 3 godziny w 30°C z różnymi N-acetylowanymi aminokwasami (stężenie końcowe 25 mM) i badano supernatanty za pomocą analizatora aminokwasów. Okazało się, że ponad 20% dostarczonej N-acetyloornityny było przekształcane. Także dla N-acetylofosfinotricyny dała się wykazać wzrastająca deacetylacja do fosfinotricyny zależna od stężenia wprowadzonej N-acetylofosfinotricyny (Tabela 7).

PL 193 489 B1

N-acetyloornityna (25 mM)	N-acetylofenyloalanina (25 mM)	N-acetylofosfinotricyna
(12,5 mM)	(25 mM)	(50 mM)
5860 nM	<5 nM	8,0 nM	20,0 nm	44,7 nM

Podano stężenia wprowadzonych N-acetyloaminokwasów i powstałych przez acetylację aminokwasów

Figura 1. Mapa restrykcyjna fragmentu 2,5 kb SalI/BamHI, który jest odpowiedzialny za specyficzną aktywność deacetylazy N-acetylo-PPT. Pozycja i orientacja genu struktury deac1 są zaznaczone za pomocą strzałki (bp - pary zasad)

Figura 2 Mapa plazmidu pPVCKDEAC1 do konstytutywnej ekspresji genu deac u roślin

Figura 3 Mapa plazmidu pPCVTDEAC1 do specyficznej w stosunku do tapeteum ekspresji genu deac u roślin

Figura 4 Mapa plazmidu pGK83

Figura 5 Mapa plazmidu pMF9

Protokół sekwencji (1) Informacja ogólna (i) ZGŁASZAJĄCY (A) NAZWA: Hoechst Schering AgrEvo GmbH (B) ULICA:(C) MIEJSCE: Frankfurt (D) LAND: (E) KRAJ: Niemcy (F) KOD POCZTOWY: 65926 (G) TELEFON: 069-305-5596 (H) TELEFAKS: (+69) 357175 (I) TELEX:(ii) TYTUŁ ZGŁOSZENIA: Nowe geny kodujące deacetylazy aminokwasów ze specyficznością w stosunku do N-acetylo-L-fosfinotricyny, ich izolacja i zastosowanie (iii) LICZBA SEKWENCJI: 4 (iv) FORMA CZYTELNA KOMPUTEROWO (A) NOŚNIK DANYCH: dyskietka (B) KOMPUTER: Kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentin Release #1.0, wersja #1.25 (EPA) (2) INFORMACJA O SEK NR ID 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 1365 par zasad (B) RODZAJ: Kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (ix) CECHY CHARAKTERYSTYCZNE:

(A) NAZWA/KLUCZ: egzon (B) POŁOŻENIE: 1...1365 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID 1:

PL 193 489 B1

ATGATCCGCA AGACCGTTCT GTTGACTGCG CTGTCCTGCG CCCTGGCCTC CGCGACAGCC 60

ACCGCCGCCG AAGGCCAGCG GCCCGAGGTG GAGGCCGCCG CCGCGCGCCT GCAGCGGCAG 120

GTGGTGGAGT GGCGCCGCGA TTTCCACCAG CATCCGGAGC TGTCCAACCG CGAGGTGCGC IBO

ACCGCCGCCA AGGTGGCCGA GCGCCTGCGC GCGATGGGCC TGCAACCGCA GACCGGCGTC 240

GCCGTGCACG GCGTGGTGGC GATCATCAAG GGCGCCCTGC CGGGGCCGAA GATCGCCCTG 300

CGCGCGGACA TGGACGCGCT GCCCGGTACC GGALCCGACCC GGCTGCCCGT CGCCTCCACC 360

GCCACGGCCG AGGACCGCCG OGACJ^CCGO GAGGGTACGC CCGGCΊ'GCCG COfcCGACGCC 420

CATACCGCCA CCCTCCTCCG CGT<T3CCGAC GCGCCGGGTA CCACGCGCCA CACGCTGCCC 480

AGCGAAGTAA GCCGCATCTG CCAGCCCC3CC GACCAACGCC GC^G^G^ CCACCACCGC 54 0

CCTCCCCAGC GCATCCTCCA GGAGCGACTG TGGAAGGACA TGACCGCGGA CCGCCAGGGG 600

CACCGCCACA	GCGTCTCCCC	CCTCCAGACC	CCGCAGATCG	CCGGACCCGG	CGGCCCCCGC	660
CTCCCCACCT	CCCACCACGG	TOCCA^ACC	CGCACCCGCC	GCCAGACCCA	TCCCGCCGCC	720
CCCGCCACCC	GCAGCGAGCC	GAT^TCG^	^CT^GA^	GCAGCACCAC	CCCGCACACC	780
AT^TCM^	GCCGCCCCCA	CCTCTCCCAG	CAGCCCGCCC	GCCGACCCTT	CGACCCCATC	840
CACCCCCCCA	GCCCCTCCAA	CATCATCCCC	GACTCCCGGG	CCAGGAGCCG	CAC^TC^O	900
	CCCACAGCCG	CACCCAGAGC	TGCCCCCACT	GCCACCCCCG	CCCCCACCCC	960
ACCCCGACCG	CAGCACGCCA	CCGCCACC^C	CGACATCTAC	CACCAACACC	GC^Crc^C	1020
□AG^TCKAC	GACCCCGCAC	GCCCCCCGCC	CAraeT^^	CCCCTCCCCG	C^T^T^G	1080
CCACGCCACC	CGCGACACGC		CATCCCCTCG	ACCCACGGCG	CGCGCGCGCC	1140
^A^A^TG	CCCACCAGAT	GCGGCGTCAG	CGCCGCCACC	CCCCCGGACC	T^ACCC^C	1200
GA^GC^CC	^CA^CA^	CGCCGAACGG	CCGCCTCGAC	CACACCCCCC	GCCACCGCAA	1260

CCT^^G^ CGCCTCCCCG TCGCCCGACA CTATO^OAC GGGACCACGG CGCCGGGACC 1320

CCGCCCAAGC TCG^^^C GAGCCGGACG CAAGACCGCC CATGA

1365

PL 193 489 Β1 (2) INFORMACJA O SEK NR ID 2 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 454 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (ix) CECHY CHARAKTERYSTYCZNE:

(A) NAZWA/KLUCZ: białko (B) POŁOŻENIE: 1...454 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID 2:

Met Ile 1

Arg

Lys Thr Val Leu 5

Leu Thr Ala Leu Ser 10

Cys

Ala

Leu 15

Ala

Ser

Ala

Thr

Ala

Thr

Ala

Glu

Gly

Gln

Arg

Pro

Glu

Val

Glu

Ala

20

25

30

Ala

Arg

Leu

Gln

Arg

Gln

Val

Glu

Trp

Arg

Asp

Phe

35

40

45

His

Gln

His

Pro

Glu

Leu

Ser

Asn

Arg

Glu

Val

Arg

Thr

Ala

Lys

50

55

60

•

Val

Ala

Glu

Arg

Leu

Arg

Ala

Met

Gly

Leu

Gln

Pro

Gln

Thr

Gly

Val

65

70

75

80

Ala

Val

His

Gly

Val

Ala

Ile

Lys

Gly

Ala

Leu

Pro

Gly

Pro

90 95

Lys Ile Ala Leu Arg Ala Asp Met Asp Ala Leu Pro Val Thr Glu Gln 100 105 110

PL 193 489 B1

Thr

Gly

Leu Pro

» Phe

Ala

Ser

Thr

Ala

Thr

Ala

Glu

Tyr

Arg

Gly Glu

115

120

125

Lys

Val

Gly Val

Met

His

Ala

Cys

Gly

His

Asp

Ala

His

Thr

Ala

Thr

130

135

140

Leu

Gly Val

Ala

Asp

Ala

Leu

Val

Ala

Met

Arg

Asp

Thr

Leu

Pro

145

150

155

·

160

Gly

Glu

Val Met

Leu

Ile

Phe

Gin

Pro

Ala

Glu

Gly

Ala

Pro

165

170

175

Pro

Glu

Gin Gly

Gly

Ala

Glu

Leu

Met

Leu

Lys

Glu

Gly

Leu

Phe

Lys

ISO

185

190

Olu

Phe

Lys Pro

Glu

Ala

Val

Pha

Gly .

Leu

His

Val

Phe

Ser

Val

195 200 205

Gin Ala Gly Gin He Ala Val Arg Gly Gly Pro Leu Met Ala Ala Ser 210 215 220

Asp Arg Phe 225

Ala

Ile Thr 230

Val Asn Gly Arg

Gin Thr 235

His

Gly Ser Ala 240

Pro

Trp

Asn

Gly

Ile

Asp

Pro

Ile

Val

Ala

Ser

Asp

Leu

Ile

Gly

245

250

255

Thr

Ala

Gin

Thr

Ile

Val

Ser

Arg

Ala

Asn

Leu

Ser

Lys

Gin

Pro

260

265

270

Ala

Val

Leu

Thr

phe

Gly

Ala

Ile

Ly3

Gly

Ile

Arg

Tyr

Asn

Ile

275

280

295

Ile

Pro

Asp

Ser

Val

GlU

Met

Val

Gly

Thr

Ile

Arg

Thr

Phe

Asp

Pro

290

295

300

Asp

Met

Arg

Lys

Gin

Ile

Phe

Ala

Asp

Leu

Arg

Asn

Val

Ala

Glu

His

305

310

315

320

Thr

Ala

Trp

Arg

His

Arg

His

Arg

His

Leu

Arg

Glu

Gly

325

330

335

Arg

Gin

Pro

Gly

His

Gly

Gin

Arg

Pro

Gly .

Ala ,

Asp

Arg

Ala

His

Ala

340

345

350

PL 193 489 B1

Ala Gln Pro Ala Gly Arg Gly Arg Gln Gly Gln Arg Leu Arg ALa Ala

355 360 365

Ala

Asp

Gly

Leu

Gly

Leu

Ala

Val

Cys

Ala Ala

Gly

Ala

370

375

380

Gly Asp

Val

Leu

Arg

Leu

His

Arg

Gly

His Arg

Pro

Gly

385

390

395

400

His

Arg

Ala

Gln

Pro

Leu

ALa

Glu

Val

Pro

Ala

Arg Arg

Glu

Gly

405

410

415

Ala

Gly

Arg

Gly

Pro

Ala

Arg

ALa

Ala

Gly

Val

ALa Gly

Leu

Ser

420

425

430

Ala

Arg

Trp

Gln

Gly

V^i

Thr

Pro

Ala

Ser

Ile

Val Pro

Pro

Ile

435 440 445

Arg Lys Lys Asp Leu Pro.

450 (2) INFORMACJA O SEK NR ID 3 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 1273 par zasad (B) RODZAJ: Kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (ix) CECHY CHARAKTERYSTYCZNE:

(A) NAZWA/KLUCZ: egzon (B) POŁOŻENIE: 1...1273 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID 3:

atggccttgc tgcaggagct gctggacagc GCACCCGAGA TCACCGCGCT GCGCCGCGAC 60

ATACATGCCC ATCCCGAACT GTGCTTCGAG GAACTGCGCA CCGCCGACCT GGTGGCCCGG 120

CAGCTCGAAG GCTGGGGCAT TGCCGTGCAC CGCGGCCTGG GCCGCACGGG CGTGGTGGGC

180

PL 193 489 Β1

ACCATCCACG GCCGTGACGG CGGCGCCAGC GGCCGGGCCA TCGGGCTGCG CGCCGACATG 240

GACGCCCTGC CCATGCAGGA GTTCAACACC TTCGAGCACG CCAGCCGCCA CGCCGGAAAA 300

ATGCATGCCT GCGGACATGA CGGCCATGTC GCCATGCTGC TGGCCGCCGC GCAGTACCTG 360

GCCGTGCACC GCGACAGCTT CGAGGGCACG GTGCACCTGA TCTTCCAGCC GGCCGAAGAG 420

GGCGGCGGCG GGGCGCGCGA GATGGTCGAG GACGGCCTGT TCACCCAGTT CCCCATGCAG 480

GCCGTGTTCG GCATGCACAA CTGGCCGGGC ATGAAGGCCG GCACCATGCC GTGGGCCCCG 540

GGCCCGGCCA TGGCGTCGAG CAACGAGTTC CGCATCGTCG TGCGCGGCAA GGGCGGCCAC 600

GCGGCCATGC CGCACATGGT GATCGACCCG CTGCCCGTGG CGGCCCAGCT CATCCTGGGC 660

CTGCAGACCA TCGTCAGCCG CAACGTCAAG CCCATCGAGG CGGGCGTGGT CTCGGTCACC 720

ATGGTCCATG CGGGGGAGGC CACGAACGTG GTGCCCGACA GCGTGGAGCT GCAGGGCACG 780

GTGCGCACCT TCACGCTGGA GGTGCTGGAC CTGATCGAGC GGCGCATGAA GGCCCTGGCC 840

GAGAGCATCT GCGCGGCGCA TGACACGCGC TGCGAGTTCG AGTTCGTGCG CAACTACCCG 900

CCCACCATCA ACTCCGCCCC GGAGGCCGAG TTCGCACGCC GCGTCATGGC CGAGGTCGTG 960

GGCGAGGCCA ACGTGCTGCC CCAGGAGCCG TCCATGGGCG CCGAGGACTT CGCCTTCATG 1020

CTGCTGGAAA AGCCCGGCGC CTACTGCTTC ATCGCCAATG GCGACGGCGA CCACCGCGCC 1080

ATCGGCCACG GCGGCGGTCC CTGCACGCTG CACAACCCCA GCTACGACTT CAACGACCAG 1140

CTGATTCCGC AGGGCGCCAC GTTCTGGGTG AAGCTGGCCC AGCGCTGGCT GAGCGAGCCC 1200

ACGCGCTGAG GCCTTGCGGG GTCCGGCCGA CACCGGCATG TCACACACCG CACCTAGCAT 1260

GCGGTCCCTG TGA 1273 (2) INFORMACJA O SEK NR ID 4 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 402 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko

PL 193 489 B1 (ix) CECHY CHARAKTERYSTYCZNE:

(A) NAZWA/KLUCZ: białko (B) POŁOŻENIE: 1...402 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID 4:

Met

Ala

Leu

Gln

Glu

Leu

Asp

Ser

Ala

Pro

Glu

Ile

Thr

Ala

1

5

10

15'

Leu

Arg

Asp

. He

His

Ala

His

Pro

Glu

Leu

Cys

Phe

Glu

Leu

20

25

30

Arg

Thr

Ala

Asp

Leu

Val

Ala

Arg

Gln

Leu

Glu

Gly

Trp

Gly

Ile

Ala

35

40

45

Val

His

Arg

Gly

Leu

Gly

Arg

Thr

Gly

Val

Gly

Thr

Ile

His

Gly

55 60

Arg

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly

Arg

Ala

Ile

Gly

Leu

Arg

Ala

Asp

Met

65

70

75

80

Asp

Ala

Leu

Pro

Met

Gln

Glu

Phe

Asn

Thr

Phe

Glu

His

Ala

Ser

Arg

85

90

95

His

Ala

Gly

Lys

Met

His

Ala

Cys

Gly

His

Asp

Gly

His

Val

Ala

Met

100

105

110

Leu

Ala

Gln

Tyr

Leu

Ala

Val

His

Arg

Asp

Ser

Phe

Glu

115

120

125

Gly

Thr

Val

His

Leu

Ile

Phe

Gln

Pro

Ala

Glu

Gly

130 135 140

PL 193 489 Β1

Ala 145

Arg

1 Glu Met

: Val

Glu 150

Asp

Gly Leu

i Phe

Thr 155

Gin

i Phe

t Pro Met

Gin 160

Ala

Val

Phe

Gly

Met 165

His

Asn

Trp

Pro

Gly 170

Met

Lys

Ala

Gly Thr 175

Met

Pro

Trp

Ala

Pro 180

Gly

Pro

Ala

Met

Ala 185

Ser

Asn

Glu

Phe 190

Arg

Ile

Val

val

Arg 195

Gly

Lys

Gly

His 200

Ala

Met

Pro

His 205

Met

Val

Ile

Asp

Pro 210

Leu

Pro

Val

Ala

Ala 215

Gin

Leu

Ile

Leu

Gly 220

Leu

Gin

Thr

Ile

Val 225

Ser

Arg

Asn

Val

Lys 230

Pro

Ile

Glu

Ala

Gly 235

Val

Ser

Val

Thr 240

Mec

Val

His

Ala

Gly 245

Glu

Ala

Thr

Asn

Val 250

Val

Pro

ASP

Ser

Val 255

Glu

Leu

Gin

Gly

Thr

Val .

Arg

Thr

Phe

Thr

Leu ¹

Glu

Val

Leu

Asp

Leu

Ile

260 265 270

Glu Arg Arg Met Lys Ala Leu Ala Glu Ser Ile Cys Ala Ala His Asp 275 260 285

Thr Arg Cys Glu Phe Glu Phe Val Arg Asn Tyr Pro Pro Thr Ile Asn 290 295 300

Ser Ala Pro Glu Ala Glu Phe Ala Arg Arg Val Met Ala Glu Val Val

30S 310 315 320

Gly Glu Ala Asn Val Leu Pro Gin Glu Pro Ser Met Gly Ala Glu Asp

325 330 335

Phe Ala Phe Met Leu Leu Glu Lys Pro Gly Ala Tyr Cys Phe Ile Ala 340 345 350

Asn Gly Asp Gly Asp His Arg Ala Ile Gly His Gly Gly Gly Pro Cys 355 360 365

Thr Leu His Asn Pro Ser Tyr Asp Phe Asn Asp Gin Leu Ile Pro Gin 370 375 380

Gly Ala Thr Phe Trp Val Lys Leu Ala Gin Arg Trp Leu Ser Glu Pro 305 390 395

Thr Arg

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Cząsteczka DNA kodująca białko o aktywności biologicznej deacetylazy N-acetylofosfinotricyny, która jest wyizolowana z Comamonas acidovorans, zdeponowanego pod numerem DSM 11070.
2. CząsteeczaDDA wedłuu zastrz.1 , z znmieenntym, że koddjebiałkoobbjmująccsekwencję aminokwasową o Id. Sekw. Nr 4 lub fragmenty tego białka posiadające aktywność biologiczną deacetylazy N-acetylo-fosfinotricyny.
3. CząsteezaoDDA wedłuugastrz. . a Ibb2 ^znmieenntym, żee dbjmujen nuieetyd o Id. Seek. Nr 3 lub sekwencję, która różni się od tej sekwencji ze względu na degenerację kodu genetycznego.
4. Białko kodowane przez cząsteczkę DNA określoną w zastrz. 3.
5. Mikroorganizm Comamonas acidovorans zdeponowany pod numerem DSM 11070.
6. Seoisb wetwerzasia roślin mająccyh wwbiórczo części, znnmieenn tym, że obejmuje:

a) transformowanie komórek roślinnych genem deacetylazy N-acetylo-fosfinotricyny obejmującym cząsteczkę DNA określoną w zaostrz. 3, pod kontrolą promotora kierującego ekspresją w określonych częściach roślinny, i

b) regenerowanie roślin z komórek roślinnych otrzymanych w etapie (a), przy czym rośliny te mają części, które mogą być wybiórczo zniszczone przez traktowanie N-acetylo-fosfinotricyną (N-acetyl-PPT).
7. Spooób we^dłł^u] 6, znamienny tym, żee speccficznc eks^re^j genu deacejylasa

N-acetylo-fosfinotricyny jest pod kontrolą promotora specyficznego dla warstwy wyścielającej.
8. Seodebwedług zastrz.7,zznmieenytym, że promutorseoecbczacdlawełstwewebcielałącej jest promotorem genu tap1 z Antirrhinum majus.
9. Rodlinctrasnefrmuwescgencm doeacjylasaN-aacjyloOΌdSnctriccbcodejmująccm cząsteezkę DNA określoną w zastrz. 3, pod kontrolą promotora kierującego ekspresją w określonych częściach rośliny, przy czym te określone części mogą być wybiórczo zniszczone przez traktowanie N-acetylofosfinotricync (N-acetyl-PPT).