PL193522B1 - Cząsteczka DNA, białko, mikroorganizm Stenotrophomonas sp., sposób wytwarzania roślin oraz rośliny transformowane genem deacetylazy N-acetylofosfinotricyny - Google Patents

Cząsteczka DNA, białko, mikroorganizm Stenotrophomonas sp., sposób wytwarzania roślin oraz rośliny transformowane genem deacetylazy N-acetylofosfinotricyny

Info

Publication number
PL193522B1
PL193522B1 PL97334530A PL33453097A PL193522B1 PL 193522 B1 PL193522 B1 PL 193522B1 PL 97334530 A PL97334530 A PL 97334530A PL 33453097 A PL33453097 A PL 33453097A PL 193522 B1 PL193522 B1 PL 193522B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
ala
deacetylase
plants
gly
acetyl
Prior art date
Application number
PL97334530A
Other languages
English (en)
Other versions
PL334530A1 (en
Inventor
Klaus Bartsch
Guido Kriete
Inge Broer
Alfred Pühler
Original Assignee
Hoechst Schering Agrevo Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst Schering Agrevo Gmbh filed Critical Hoechst Schering Agrevo Gmbh
Publication of PL334530A1 publication Critical patent/PL334530A1/xx
Publication of PL193522B1 publication Critical patent/PL193522B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
    • C12N15/8289—Male sterility
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

1. Czasteczka DNA pochodzaca z Stenotrophomonas sp., który jest zdeponowany pod nr. DSM 9734, znamienna tym, ze koduje bialko o aktywnosci biologicznej deacetylazy N-acetylo- fosfinotricyny. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest cząsteczka DNA, białko, mikroorganizm Stenotrophomonas sp., sposób wytwarzania roślin oraz rośliny transformowane genem deacetylazy N-acetylo-fosfinotricyny.
Koncepcja chemicznie indukowalnej, odwracalnej męskiej sterylności u roślin przez specyficzną dla pylników ekspresję deacetylazy N-acetylofosfinotricyny (N-acetylo-PTT) jest opisana w Europejskim Zgłoszeniu Patentowym EP 531 716. Stosowany przy tym gen deacetylazy ze Streptomyces viridiochromogenes (deacetylaza N-acetylo-L-fosfinotricylo-alanylo-alaniny (N-acetylo PTT, dea) lub argE z Escherichia coli (deacetylaza N-acetylo-L-ornityny) kodują białka o specyficzności dla N-acetylo-L-PTT. Wykazano, że oba geny przy ekspresji specyficznej dla warstwy wyścielającej (tapetum) u roślin powodują występowanie męskosterylnych kwiatów po działaniu N-acetylo-L-PPT na pojedyncze pąki. Dla skutecznego zastosowania tego systemu, szczególnie przy traktowaniu całych roślin N-acetylo-PTT, korzystne jest w warunkach praktycznych użycie deacetylaz o wyższym powinowactwie w stosunku do substratu. Tak więc, poszukiwano innych deacetylaz z wyższym powinowactwem w stosunku do N-acetylo PPT.
Celem wynalazku jest dostarczenie cząsteczek DNA, które kodują białko o aktywności deacetylazy. Wykorzystując takie cząsteczki DNA kodujące deacetylazy można wytworzyć rośliny o częściach, które można celowo niszczyć. Szczególnie interesująca jest produkcja męsko- lub żeńskosterylnych roślin.
Wynalazek dotyczy cząsteczki DNA pochodzącej z Stenotrophomonas sp., który jest zdeponowany pod nr. DSM 9734, kodującej białko o aktywności biologicznej deacetylazy N-acetylofosfinotricyny.
Korzystnie cząsteczka DNA według wynalazku koduje białko obejmujące sekwencję aminokwasową o Id. Sekw. Nr 2 lub fragmenty tego białka posiadające aktywność biologiczną deacetylazy N-acetylo-fosfinotricyny. Korzystnie cząsteczka ta obejmuje sekwencję nukleotydową o Id. Sekw. Nr 1 lub sekwencję, która różni się od tej sekwencji ze względu na degenerację kodu genetycznego.
Wynalazek dotyczy również białka kodowanego przez cząsteczkę DNA według wynalazku. Właściwości enzymatyczne tych białek opisano w przykładach.
W zakres wynalazku wchodzi mikroorganizm Stenotrophomonas sp zdeponowany pod numerem DSM 9734.
W zakres wynalazku wchodzi też sposób wytwarzania roślin mających wybiórczo zniszczalne części, który obejmuje:
a) transformowanie komórek roślinnych genem deacetylazy N-acetylo-fosfinotricyny obejmującym cząsteczkę DNA według wynalazku, pod kontrolą promotora kierującego ekspresją w specyficznych częściach roślinnych, i
b) regenerowanie roślin z komórek roślinnych otrzymanych w etapie (a), przy czym rośliny te mają części, które mogą być wybiórczo zniszczone po potraktowaniu N-acetylo-fosfinotricyną (N-acetyl-PPT).
W korzystnym sposobie według wynalazku specyficzna ekspresja genu deacetylazy N-acetylofosfinotricyny jest pod kontrolą promotora specyficznego dla warstwy wyścielającej, korzystniej promotora genu tapl z Antirrhinum majus.
Wynalazek dotyczy także roślin transformowanych genem deacetylazy N-acetylo-fosfinotricyny obejmującym cząsteczkę DNA według wynalazku, będącą pod kontrolą promotora specyficznego dla ekspresji w określonych częściach roślin, w których to roślinach specyficzne części roślin mogą być wybiórczo zniszczone po potraktowaniu N-acetylo-fosfinotricyną (N-acetyl-PPT). Transgeniczne rośliny mogą być uzyskane za pomocą znanych technik z komórek roślinnych, które były transformowane cząsteczkami DNA według wynalazku i regenerowane do całych roślin.
Szczególnie interesujące są sposoby produkcji roślin mających części, które można celowo zniszczyć przez specyficzną ekspresję genu deacetylazy jak i sposoby produkcji roślin męsko- lub żeńskosterylnych, poprzez specyficzną ekspresję genu deacetylazy.
Rozwiązania według wynalazku umożliwiają:
(1) celowe wzbogacanie w mikroorganizmy z wysoką aktywnością deacetylazy N-acetylo-PPT;
(2) izolację odpowiednich genów deacetylazy (3) oczyszczenie i charakterystykę kodowanych przez te geny białek o wysokiej aktywności deacetylazy N-acetylo-PPT (4) ekspresję genu deacetylazy u roślin.
PL 193 522 B1
Stosując pożywkę mineralną z chityną jako jedynym źródłem węgla można było namnożyć bakterie z próbek gleby, które są w stanie rozszczepiać z wysoką skutecznością N-acetylo-PPT. W ten sposób możliwe było wyizolowanie dwóch szczepów bakterii jako czystych kultur: Stenotrophomonas sp. (nr. depozytu DSM 9734) i Comamonas acidovorans (Nr depozytu DSM 11070).
Jednak dla wymaganych w preparatyce przemysłowej warunków jest znacznie bardziej korzystne stosowanie oczyszczonego enzymu.
Poniżej opisano nowe deacetylazy specyficzne w stosunku do L-N-acetylo-PPT, i nowy i skuteczny sposób oczyszczania i charakterystyki tych enzymów ze wzbogaconej kultury tych mikroorganizmów gleby jak i zastosowanie tych deacetylaz.
Opisano również:
1. Deacetylazy z
- masą cząsteczkową 20000 do 100000 daltonów
- o optimum pH 6,5-10,0
- specyficzności substratowej w stosunku do L-N-acetylo-fosfinotricyny.
2. Sposób przygotowania deacetylazy, który polega na tym, że hoduje się mikroorganizm nie tworzący spór w pożywce zawierającej chitynę z kraba, i deacetylazę izoluje się z tego mikroorganizmu.
3. Zastosowania deacetylazy scharakteryzowanej w 1. do przygotowania roślin męskosterylnych jak i do stereospecyficznego przygotowania L-fosfinotricyny.
Białko według wynalazku o aktywności enzymatycznej ma optimum temperatury leżące między 30°C i 50°C.
Sposób wytwarzania deacetylaz korzystnie przeprowadza sięz mikroorganizmami, wybranymi z grupy, która składa się z organizmów opisanych powyżej.
Chitynę z kraba można otrzymać jak opisali Shimara, Kenzo i Takiguchi, Yasuyuki (Methods in Enzymology, tom 161, str. 417-423, 1988) lub jest do nabycia w firmie Sigma.
W celu oczyszczenia deacetylazy mikroorganizm hoduje się w pożywce odżywczej optymalnej dla jego wzrostu. Hodowanie mikroorganizmu przebiega w warunkach tlenowych, na przykład w hodowli zanurzeniowej przy wytrząsaniu lub mieszaniu w kolbach do wytrząsania lub fermentorach, ewentualnie przy wprowadzaniu powietrza lub tlenu. Fermentacja może zachodzić w temperaturze od około 20 do 40°C, korzystnie około 25 do 37°C, a szczególnie korzystnie przy 30 do 37°C. Hodowlę prowadzi się w zakresie pH między 5 i 8,5, korzystnie między 5,5 i 8.
W tych warunkach hodowli mikroorganizmu na ogół mikroorganizmy wykazują po 1 do 3 dni godną uwagi akumulację enzymu. Synteza deacetylazy zaczyna się w fazie logarytmicznej. Produkcję enzymu można śledzić za pomocą testu aktywności poprzez analizę HPLC lub fotometrycznie. Stosowana do produkcji pożywka płynna zawiera 0,2 do 5%, korzystnie 0,5 do 2% chityny z kraba i sole nieorganiczne.
Jako sole nieorganiczne pożywka płynna może zawierać na przykład chlorki, węglany, siarczany lub fosforany metali alkalicznych lub metali ziem alkalicznych, żelaza, cynku i manganu, ale także sole amonowe i azotany.
Do deacetylacji mogą być stosowane skuteczne ilości deacetylazy w postaci wolnej lub immobilizowanej, korzystnie wprowadzane do roślin, które wyrażają gen deac.
W celu unieruchomienia stosować można znane sposoby, takie jak opisano w niemieckich opisach wyłożeniowych 32 37 341 i 32 43 591.
Izolację i oczyszczanie enzymu można prowadzić według klasycznych procedur przez rozerwanie za pomocą ultradźwięków i prasy Frencha, strącanie siarczanem amonu, wymianę jonową, chromatografię powinowactwa i sączenie na żelu.
Preparat enzymatyczny można scharakteryzować za pomocą masy cząsteczkowej od 20000 do 100000 daltonów, korzystnie 30000 do 80000, szczególnie korzystnie 40000 do 70000 daltonów. Optimum pH enzymu leży w zakresie pH od 6,0 do 10,0, szczególnie 7,0 do 8,0. Optimum temperatury enzymu leży między 30 i 50°C, szczególnie między 35 i 45°C.
Kodujący deacetylazę gen sklonowano w E. coli. Dla genu deac-1 ze Stenotrophomonas sp. przygotowano fagmidowy bank ekspresyjny z genomowego DNA w E. coli i przeszukiwano pod kątem aktywności deacetylazy specyficznej w stosunku do N-acetylo-PTT. Gen deac2 z Comamonas acidovorans sklonowano poprzez komplementację mutanta E. coli argE za pomocą banku genomowego.
Sekwencje aminokwasów wyprowadzone z sekwencji DNA obu genów są do siebie podobne i posiadają ponadto homologię do hydrolaz hipuranowych, znanych z banków danych białek.
PL 193 522 B1
Rośliny transgeniczne mają wysoką wrażliwość tkanki na N-acetylo-PPT, co świadczy o wysokim powinowactwie w stosunku do substratu białka deac1 (Km =670 mM). Tak więc możliwe jest przy konstytutywnej ekspresji genu deac uzyskanie roślin, których liście są wrażliwe na stężenia do 0,4 mg/ml N-acetylo-D,L-PPT (= 0,2 mg/ml L-enancjomeru). Przy ekspresji specyficznej w stosunku do tapetum uzyskano sterylność męskich kwiatów przez działanie na pąki 2 mg/ml N-acetylo-D,L-PPT (= 1 mg/ml L-enancjomeru). Opisane wyniki dotyczą roślin szklarniowych. Ze względu na niskie stężenia substratu w razie potrzeby w warunkach otwartej przestrzeni możliwe jest bez problemu stosowanie dawki 5-10 razy wyższej.
Przedstawione przykłady służą do dalszego wyjaśnienia wynalazku. Procenty, o ile nie podano inaczej, są procentami wagowymi. Wynalazek jest dalej definiowany w zastrzeżeniach patentowych.
Przykład 1.
Izolacja i identyfikacja mikroorganizmów gleby ze specyficzną aktywnością deacetylazy N-acetylo-PPT
Po1g gleby (piaszczysta glina, Schwanheimer Duene) mieszano z 10 mM NaCl, 10 mM buforem Na-fosforan, pH = 7,0i ekstrahowano przez 1 godz. w temperaturze pokojowej. Do selekcji poszczególnych grup mikroorganizmów resztki gleby zaszczepiano do następujących pożywek płynnych.
(1) Pożywka MS-1 (dla eubakterii): 5 mM glukoza mM bursztynian 10 mM gliceryna 1 g/l NH4Cl ml/l roztworu A 50 ml/l roztworu B roztwór A: 50 g/l K2HPO4 roztwór B: 2,5 g/l MgSO4 0,5 g/l NaCl ml/l elementów śladowych (2) pożywka chitynowa dla Actinomycetes i Streptomycetes, jak i bakterii chitynożernych 10 g/l chityny z kraba 1 g/l (NH4)2SO4
0,5 g/l MgSO4 ml/l roztworu A ml/l elementów śladowych (3) Pożywka z antybiotykami (dla grzybów wyższych):
g/l ekstraktu słodowego 10 g/l glukozy g/l ekstraktu z drożdży 0,5 g/l (NH4)2SO4 50 mg/ml tetracykliny
Wszystkie pożywki zawierały 5 mM N-acetylo-PPT i były inkubowane po zaszczepieniu przez 3-5 dni w 28°C.
Wzbogacone kultury następnie testowano pod kątem aktywności deacetylacji N-acetylo-PPT. W tym celu komórki zwirowywano przy 10000 obr/min i w supernatancie badano wiązanie PPT wanalizatorze aminokwasów (Biotronic LC 5001). Wyłącznie kultury chitynowe okazały się deacetylazododatnie. Po wysianiu na agar z chityną z tych kultur wyizolowano w sumie 40 pojedynczych kolonii, ponownie hodowano je w chitynowej pożywce płynnej i znowu badano aktywność deacetylazy. Znaleziono 6 dodatnich izolatów, z których przez ponowne wysianie na płytki agarowe i dalszą hodowlę kolonii pojedynczych uzyskano aktywne kultury czyste. Szczep z najwyższą aktywnością deacetylazy został zidentyfikowany jako Stenotrophomonas sp. (numer depozytu DSM 9743).
Przykład 2:
Klonowanie i sekwencjonowanie genu deacetyalzy N-acetylo-PPT ze Stenotrophomonas sp.
Stosowane przy pracy standardowe metody biologii molekularnej opisano w Maniatis i wsp. 1982: Molecular Cloning: a Laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.
Genomowy DNA ze Stenotrophomonas sp. przygotowano według metody Meade i wsp., 1982, J.Bacteriol. 149:114-122. Po częściowym trawieniu SauSA wyizolowano frakcję o wielkości 5-10 kb i ligowano ją ze strawionym BamHI wektorem lambda-ZAP-Express z firmy Stratagene (ZAP Express vector kit, nr. Katalogu 239201; opis zestawu). Za pomocą pakowanej próbki ligacji uzyskano pierwotPL 193 522 B1 ny bank fagów lambda, i następnie poddano go amplifikacji. W ten sposób sporządzono za pomocą systemu fagmidowego pBK-CMV firmy Stratagene (nr katalogu 212209, instrukcja stosowania) fagmidowy bank ekspresyjny w Escherichia coli. W tym banku genomowym poszukiwano genu deacetylazy 14 poprzez badanie aktywności z [14-C] N-acetylo-L-PPT jako substratem. W tym celu zaszczepiono 2000 pojedynczych klonów w płytkach mikrotitracyjnych i inkubowano przez noc w pożywce LB w 37°C z 0,2 mM izopropylotiogalaktozydem (IPTG) jako induktorem i 50 m g/ml kanamycyny jako markerem 14 oporności. Komórki odwirowano i inkubowano każdą próbkę przez noc w 28°C 10 ml mM [14-C] N-acetylo-L-PPT. Następnie próbki zbierano po osiem i poddawano chromatografii cienkowarstwowej i autoradiografii pod kątem analizy przekształcenia N-acetylo-PPT do PPT (patrz EP 531 716, przykład 8) i przy pozytywnym wyniku badano pojedyncze klony. Za pomocą tej procedury udało się zidentyfikować dodatni klon ze wstawką 6 kb pośród 1920 transformantów. Ten fragment DNA poddano dokładniejszej analizie poprzez mapowanie restrykcyjne. Poprzez subklonowanie fragmentów restrykcyjnych wstawki w pUC18/19 i transformację zrekombinowanych plazmidów do E. coli udało się zlokalizować za pomocą opisanego powyżej testu aktywności gen struktury deac w fragmencie 2,5 kb (2487 par zasad) Sa1I/Smal (Fig. 1). Aktywność była zależna od orientacji fragmentu w stosunku do promotora lać wektora.
Fragment 2,5 kb poddano sekwencjonowaniu na obu niciach za pomocą metody Sangera (Sanger i wsp., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci USA 74:5463-5466). Cały fragment ma łączną długość 2487 nukleotydów (p. SEK NR ID. 1). Otwarta ramka odczytu o długości 1494 nukleotydów rozpoczyna się przy nukleotydzie Nr 367 i kończy się przy Nr. 1860.
Badania ekspresji z użyciem subfragmentów PCR w tym obszarze u E. coli wykazały, że aktywne białko deacetylazy jest kodowane przez obszar o długości 1365 nukleotydów od kodonu start w pozycji 496 do kodonu stop TGA w pozycji 1860. Wywiedziona z sekwencji DNA sekwencja aminokwasów stanowi polipeptyd złożony z 454 aminokwasów (SEQ NR ID 2) z obliczoną masą cząsteczkową 48,1 kDa.
Poszukiwanie homologii w bankach danych EMBL białek i DNA wykazało podobieństwa z opisaną po raz pierwszy w tym zgłoszeniu sekwencją deacetylazy N-acetylo-PPT z Comamonas acidovorans (37,4% identycznych aminokwasów), hydrolazy hipuranowej z Campylobacter jejuni (33,9%) i N-acetylo-L-amidohydrolazy z Bacillus stearothermophilus (33,7%). Dalej gen wyizolowany ze Stenotrophomonas będzie określany jako deac1. Ze względu na homologię można założyć, że także wymienione hydrolazy hipuranowe i amidohydrolazy w połączeniu ze specyficznymi tkankowo promotorami i po dalszej obróbce korzystnie mogą być wykorzystane do przygotowania roślin z tkankami, które można selektywnie niszczyć, szczególnie roślin męsko- i/lub żeńskosterylnych.
Przykład 3:
Charakterystyka białka Deac-1
W celu nadekspresji i oczyszczenia deacetylazy ze Stenotrophommonas sp. (deac1) zastosowano system fuzji genowej z S-transferazą glutationu firmy Pharmacia (Nr Katalogu 27-4581-01, Nr katalogu 27-4570-01). Metoda opisana jest w Smith i Johnson, 1988, Gene 67:31. Oczyszczanie fuzji białkowej przeprowadza się za pomocą chromatografii powinowactwa na glutationylo-Sepharose-4B.
Funkcjonalny gen deac przeklonowano do wektora fuzyjnego GST pGEX-4T-2 pod kontrolą promotora lać. Ekspresję zrekombinowanego białka fuzyjnego indukowano przez dodanie 0,1 mM IPTG. Białko fuzyjne jako prążek o wielkości 74 kDa można było wykazać w surowych ekstraktach transformantów E. coli za pomocą elektroforezy SDS/poliakryloamid.
W celu oczyszczania białek komórki pochodzące z 2 l kultury indukowanej dodatniej pod względem ekspresji transformanta E. coli otwierano za pomocą ultradźwięków i następnie rozpuszczano ekstrakt przez dodanie 1% Tritonu X 100. Supernatant wiązano z glutationylo-4B-Sepharose. Po wielokrotnym płukaniu buforem PBS (140 mM NaCl, 3 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4 pH= 7,3) rozszczepiano związane z macierzą Sepharose białko fuzyjne za pomocą trombiny. Eluat zawierał jako jedyny prążek białka produkt rozszczepienia o wielkości 48 kDa (po denaturującej elektroforezie SDS/poliakryloamid), który w oznaczeniu enzymatycznym (patrz poniżej) można było zidentyfikować jako deacetylazę N-acetylo-PPT. Za pomocą opisanej metody udało się oczyścić 200 mg białka deacetylazy do homogenności.
Aktywność białka deacetylazy mierzono za pomocą dwóch następujących oznaczeń:
(1) Test radioaktywny: po 2,5 mg oczyszczonego enzymu inkubowano w porcjach po 10 ml w buforze PBS z 0,1 mM [14C]-N-acetylo-L-PPT przez 15 minut w 37°C. Następnie próbki rozcieńczano 1:6 w 5 mM K2HPO4, 10% metanolu, pH = 1,92 i analizowano w HPLC z detektorem radioaktywności (ko6
PL 193 522 B1 lumna do rozdziału: Spherisorb SAX; roztwór do rozwijania 5 mM KH2PO4, 10% metanol, pH 1,92. 14 14
Tempo przepływu: 0,5 ml/min. W tych warunkach [14C]-L-PPT eluuje się przy 4,5 min. i [14C]-N14
-acetylo-L-PPT przy 6,5 min. Specyficzne aktywności deacetylazy podawano w [14C]-N-acetylo-L-PPT/min/mg białka. W celu ustalenia optimum pH przyrządzono próbki w układzie buforującym z40mM Bis-Tris, Tris i Caps między pH 6 i 9. Dla oznaczenia wartości Km trzykrotnie prowadzono 14 oznaczenia z [14C]-N-acetylo-L-PPT między 0,01 mM i 1 mM przy pH 8,0 w obecności 1 mM CoCl2.
(2) Test nieradioaktywny: W celu badania specyficzności substratowej po 5 mg oczyszczonego enzymu w próbkach po 20 ml w buforze PBS zawierającym 25 mM określonego N-acetylo lub N-acyloaminokwasu inkubowano przez 60 minut w 28°C. Następnie w próbkach mierzono wytwarzanie wolnych aminokwasów w analizatorze aminokwasów (Biotronic LC 5001). Specyficzne aktywności podano w nmolach aminokwasów/min/mg białka. Dla deacetylazy N-acetylo-PPT ustalono optimum pH = 8 (patrz Tabela 1) i optimum temperatury 37°C (p. Tabela 2). Kinetyczne pomiary dały wartość Km 670 mM. Przez dodatek 1 mM CoCl2 udało się podwyższyć aktywność enzymatyczną o 20%.
Tabela 1 Optimum pH deacetylazy N-acetylo-PPT
wartość pH aktywność specyficzna [mol/min/mg białka]
6 2,4
7 7,2
8 12,0
9 8,5
Tabela 2 OptimumtemperaturydeacetylazyN-acetylo-PPT
temperatura [°C] aktywność specyficzna [mol/min/mg białka]
28 9,6
37 16,8
50 14,9
60 4,3
Wyniki pomiarów specyficzności substratowej są podane w tabeli 3.
Enzym posiada stosunkowo szerokie spektrum substratowe. Najwyższe przetwarzanie stwierdzono z kwasem hipurowym (N-benzoilo-glicyna) i N-acetylo-L-glutaminianem. Powinowactwo w stosunku do N-acetylo-L-PPT wynosi około 50% poziomu stwierdzonego dla obu wymienionych substratów. Deacetylaza posiada wyłączną specyficzność dla N-acetylo-L-aminokwasów. Dla odpowiednich D-enancjomerów nie udało się zaobserwować żadnych reakcji.
PL 193 522 B1
T ab el a 3
Specyficzność substratowa deacetylazy N-acetylo-PPT
Substrat1 Względna aktywność [%]
Kwas hipurowy (N-benzoilo-glicyna) 100
N-Ac-fosfinotricyna 43
N-Ac-ornityna 37
N-Ac-metionina 0
N-Ac-tryptofan 0,4
N-Ac-fenyloalaniana 24
N-Ac-tyrozyna 11
kwas N-Ac-glutaminowy 100
N-Ac-glutamina 30
N-Ac-glicyna 59
N-Ac-histydyna 43
N-Ac-leucyna 33
N-Ac-walina 2
N-ac-seryna 4
N-ac-prolina 0
1 Przy wszystkich wiązaniach chodzi o L-enancjomery 2 Aktywność specyficzna mierzona z kwasem hipurowym została określona jako 100% i inne wartości odnoszono do niej
P r zyk ł a d 4: Konstytutywna ekspresja genu deac-1 w tytoniu
Gen struktury deac-1 przeklonowano jako fragment 1,4kb BamHI/Sa1l-PCT do binarnego wektora pPCV801 (Koncz i Schell, 1986, Mol. Gen. Genet. 204: 383-396). Powstały plazmid pPCVK-DEAC (fig. 2) z wektorem ekspresyjnym promotor 35S-gen struktury deac1-terminator 35S wtransformowano za pomocą standardowych metod do Agrobacterium tumefaciens (szczep ATHV). Kawałeczki liści tytoniu (Nicotiana tabacum) transformowano zrekombinowanym Agrobacterium według metody Horsch i wsp., 1985, Science 227:1229-1231 i selekcjonowano na pożywce z kanamycyną, zregnerowano 18 niezależnych transformantów tytoniu i badano w nich ekspresję deacetylazy w liściach. W przypadku aktywności białka w transgenicznych roślinach należało liczyć się z wrażliwością liści na N-acetylo-PPT, jako że związek jest w roślinie przerabiany na działający jako herbicyd związek czynny fosfinotricynę.
W próbie kroplowej liście transgenicznych roślin jaki szeregu nietransgenicznych roślin kontrolnych traktowano po 5 ml następujących stężeń N-acetylo-D,L-PPT: 4 mg/ml (= 15 mM), 1 mg/ml (= 3,75 mM), 0,4 mg/ml (= 1,5 mM), 0,1 mg/ml (=0,38 mM). Miejsca traktowane badano po 1-2 tygodniach sprawdzając rozjaśnienie lub tworzenie nekrozy. Równocześnie mierzono aktywność deacetylazy specyficznej w stosunku do PPT w transformantach jak i roślinach kontrolnych w surowych ekstraktach. W tym celu homogenizowano po 100 mg materiału liści w 200 ml buforu PBS, odwirowano resztki komórek i dializowano zawierające białka supernatanty przez noc w 4°C. Po 10 ml tych próbek 14 inkubowano 37°C przez noc z 0,1 mM [14C]-N-acetylo-L-PPT. Próbki następnie analizowano w HPLC 14 jak opisano powyżej z badaniem wytwarzania [14-C]-L-PPT.
Wyniki badań prób kropli i testu aktywności podano dla wybranych roślin w Tabeli 4. Okazało się, że około 60% transformantów eksprymuje funkcjonalne białko deacetylazy i wyrażają odpowiedni fenotyp.
PL 193 522 B1
Tabel a 4
Wrażliwość roślin pPCVKDEAC1 na N-acetylo-PPT i aktywność deacetylazy w surowych ekstraktach
Rośliny Próba kroplowa z: Aktywność DEAC w surowym ekstrakcie N-Ac-D,L-PPT
4mg/ml 1mg/ 0,4mg/ml 0 1 mg/ml[%L-PPT]1
Obserwacje (liście)
Kontrola - - - - 0
pPCVK9 +++ + - - 14,2
pPCVK14 zwiędły + + - - 12,1
pPCVK15 zwiędły ++ + + - 36,0
pPCVK16 zwiędły + + - - 4,7
pPCVK16 zwiędły + + - - 4,3
1 w stosunku do wprowadzonej radioaktywności [14C]-N-acetylo-L-PPT) + + +: silna nekroza ++ : wyraźne uszkodzenia +: słabe rozjaśnienie
-: brak objawów
P r zyk ł a d 5: Specyficzna w stosunku do tapetum ekspresja genu deac-1 u tytoniu
Za pomocą standardowych metod połączono specyficzny w stosunku do tapetum promotor genu tap-1 z lwiej paszczy (Antirrhinum majus) jako fragment 2,2 kb EcoRI/BamHI z genem struktury deac-1 (fragment PCR 1,4 kb BamHI/Sa1l) i terminatorem 35S w wektorze pUC18. W ten sposób powstałą kasetę ekspresyjną promotor tap-1-gen struktury deac-terminator 35S wklonowano jako fragment 3,8 kb EcoRI w miejsce regionu promotor 35S/terminator 35S w wektorze binarnym pPCV801 (plazmid pPCVTDEAC1, fig. 3). Transformację tytoniu przeprowadzono jak opisano w Przykładzie 4.
Przy ekspresji deacetylazy specyficznej w stosunku do tapetum powinny po traktowaniu pączków kwiatów N-acetylo-PPT powstawać męskosterylne kwiaty. Przekształcenie pochodnej PPT w czynny związek herbicydu fosfinotricynę prowadzi do selektywnego uszkodzenia tkanki tapetum, przez co zahamowane jest wytwarzanie funkcjonalnego pyłku.
Tylko jeden bok kwiatostanu (całego obszaru tworzących się pąków kwiatowych) traktowano N-acetylo-PPT, druga połowa kwiatostanów nie była traktowana aby upewnić się, że obserwowane zjawiska nie są wynikiem zniekształceń roślin. Traktowanie przeprowadzano w momencie, w którym pojedyncze pąki nie były większe od 5 mM (faza czynna promotora tapetum). Trans-formanty tytoniu jaki szereg roślin kontrolnych NT Sam NN w ciągu tygodnia poddawano 3x działaniu 0,2% N-acetylo-D,L-PPT (7,5 mM)/0,1% Genapol (środek sieciujący). Po zakwitnięciu pąków (ok. 9-11 dni po zakończeniu traktowania) badano rośliny pod kątem występowania męskosterylnych kwiatów.
Równocześnie badano specyficzną w stosunku do N-acetylo-PPT aktywność deacetylazy w niedojrzałych pylnikach transformantów jak i w roślinach kontrolnych. W tym celu niedojrzałe pylniki preparowano z pąków kwiatowych o wielkości około 5 mM i inkubowano przez noc każdy w 50 mM 14 roztworze [14C]-N-acetylo-L-PPT. Następnie pylniki płukano w1 x 500 ml buforu PBSi homogenizowano w 50 ml buforu PBS. Po odwirowaniu resztek komórek supernatanty zatężono w Speed-Vac a osady podnoszono w 30 ml buforu HPLC (5 mM KH2PO4, 10% metanol, pH = 1,92). Próbki analizowano w HPLC jak opisano powyżej pod kątem wytwarzania [14C]-L-PPT.
Wyniki traktowania kwiatów i testu aktywności podano dla wybranych roślin w Tabeli 5. U prawie wszystkich transformantów udało się stwierdzić obecność specyficznej w stosunku do pylników aktywności deacetylazy. W 3 transformantach ze strony traktowanej N-acetylo-PPT w gronach kwiatów kwiaty męskie stawały się męskosterylne tzn. nie tworzył się pyłek lub też obserwowano kwiaty o znacznie zmniejszonej ilości pyłku. Działanie na nowe, dojrzewające pąki pozostawało przez okres około trzech tygodni. Nietraktowane kwiaty transformantów jak i traktowane kwiaty roślin kontrolnych były we wszystkich wypadkach płodne. W męskosterylnych kwiatach nie stwierdzono powstawania plemników. Było jednak możliwe zapłodnienie krzyżowe męskosterylnych kwiatów, przez co wykazaPL 193 522 B1 no, że żeńskie części kwiatów w pełni zachowały swoją funkcjonalność (Nacken i wsp., 1991, Mol. Gen. Genet. 229:129-136).
Tabela 5
Indukowana męska sterylność u roślin pPCVTDEAC1 przez traktowanie kwiatów N-acetylo-PPT iaktywnośćdeacetylazywpylnikach
Roślina Liczba kwiatów sterylnych lub o kwiatach ze zmniejszoną ilością pyłku Aktywność deacetylazy w pylnikach [% L-PpT]1
traktowane nietraktowane
Kontrola 0 0 0
pPCVT14 18 0 70,0
pPCVT15 0 0 13,8
pPCVT16 10 0 20,4
1 W stosunku do wprowadzonej aktywności ([14C]-N-acetylo-L-PPT)
Przykład 6:
Izolacja i identyfikacja deacetylazy ze specyficznością w stosunku do N-acetylo-fosfinotricyny z Comamonas acidovorans
Próbkę gleby z Bangkoku rozprowadzono w pożywce z soli mineralnych (0,5 g K2HPO4, 0,2 g MgSO4, 2 g (NH4)2SO4, 0,01 g FeSO4 w 980 ml H2O), która zawierała chitynę (2 g/l) jako jedyne źródło węgla i następnie inkubowano w 30°C przez 48 godzin. Następnie przeprowadzono przeszczepienie do świeżej pożywki z solami mineralnymi i po kolejnych 48 godzinach inkubacji wysiewano szeregi rozcieńczeń na pożywce LB (Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Wśród rosnących kolonii znalazły się też kolonie szczepu bakterii, który się wyróżniał bardzo dobrym wykorzystaniem N-acetylo-glutaminianu jako jedynego źródła węgla (wysianie na pożywkę minimalną z solami mineralnymi z N-acetylo-glutaminianem (2 g/l, dodawać jako sterylizowany przez filtrowanie roztwór do autoklawowanej pożywki minimalnej z 14 g/l agaru) prowadzi w czasie inkubacji przez 12 godzin w 30°C do tworzenia wyraźnie widocznych kolonii). Deacetylację N-acetylo-PPT wykazano jak opisano powyżej. Szczep określony w laboratorium jako B6 został zidentyfikowany przez DSM jako Comamonas acidovorans (DSM 11070).
Przykład 7:
Klonowanie genu deacetylazy Comamonas acidovorans
Izolowano całkowity DNA z Comamonas acidovorans, strawiono EcoRI i zligowano ze strawionym EcoRI DNA wektora pA-CYC184 (Cang i Cohen, J. Bacteriol. 134, 1141-1156). Mieszaninę ligacyjną wykorzystano do elektroporacji mutanta argE E. coli XSID2 (Mountain i wsp., 1984, Mol. Gen. Genet. 187, 82-89). Poprzez selekcję na komplementację auksotrofa argininowego udało się wyizolować fragment EcoRI o wielkości 8,9 kb z genomu C. acidovorans, który wystarcza do komplementacji. Poprzez subklonowanie możliwe było ograniczenie obszaru komplementującego do wielkości 1,4 kb. Leżyonw określonej jako pGK83 pochodnej wektora do sekwencjonowania pSVB30 (Arnold i Puehler, 1989, Gene 70, 172-173).
Przykład 8:
Sekwencjonowanie genu deacetylazy z Comamonas acidovorans
Komplementujący fragment 1,4 kb (1387 par zasad) zsekwencjonowano całkowicie z obu nici stosując znane metody.
Przykład 9.
Analiza obszaru kodującego i porównanie homologii sekwencjonowanego obszaru
Analiza obszaru kodującego pokazała otwartą ramkę odczytu od pozycji 1 do 1206 (SEK NR ID 3), która koduje białko o wielkości 402 aminokwasów (SEK NR ID 4).
Porównanie homologii ze znanymi genami z baz danych wykazuje wyraźną homologię do N-acyloamidohydrolazy z Bacillus stearothermophilus (ama, Sakanyan i wsp., 1993, Appl. Environ. Microbiol. 59, 3878-3888) i hydrolazy hipuranowej z Campylobacter jejuni (dotychczas nieopublikowanej). W porównaniu białek hydrolaza hipuranowa wykazuje 43% identycznych aminokwasów (Tabela
PL 193 522 B1
6). Ponadto gen wykazuje na poziomie DNA i białka bardzo wyraźną homologię do genu deacetylazy wyizolowanego ze Stenotrophomonas sp. W oparciu o określenie genu ze Stenotrophomonas gen wyizolowany z C. acidovorans określono jako deac2.
Tabel a 6
Porównanie homologii ze znanymi sekwencjami
Gen Organizm funkcja identyczne aminokwasy konserwatywne aminokwasy
n. n. Campylobacter jejuni hydrolaza hipuranowa (383 AS) 43,1% 60,0%
deac2 Bacillus stearothermophilus N-acylo-L-amidohydrolaza 37,0% 49,5%
P r z y k ł a d 10.
Nadekspresja genu deac2 z Comamonas acidovorans - konstrukty roślinne
W celu analizy specyficzności substratowej produktu genu deac2 z Comamonas acidovorans uzyskano jego nadekspresję. W tym celu wklonowano gen do wektora o wysokiej liczbie kopii pod kontrolą promotora lacz. Jednak ekspresja była ograniczona przez równoczesną, zachodzącą w innej ramce odczytu translację lacz-alfa. Dlatego przerwano ją przez wprowadzenie kodonu stop, aby wektor pGK81 umożliwiał nadekspresję genu deac2, na którą nie miała wpływu ekspresja genu lacz. Można było wykazać także fenotypowo, że ten konstrukt wykazuje wyraźnie silniejszą komplementację mutanta argE E. coli.
W celu transformacji roślin gen struktury deac2 przeklonowano z zastosowaniem wektora binarnego pROK1 (Baulcombe i wsp. 1986, Nature, 321:446-449) za konstytutywnym promotorem 35S lub specyficznym w stosunku do tapetum promotorem TA-29. Uzyskany plazmid ekspresyjny pGK83 i pMF9 przedstawiono na Figurach.
P r z y k ł a d 11:
Badanie specyficzności substratowej produktu genu deac2 z Comamonas acidovorans
W celu zbadania specyficzności substratowej produktu genu deac2 z Comamonas acidovorans zastosowano komórki szczepu E. coli XL1-Blue permeabilizowane za pomocą toluenu/etanolu z i bez wektora pGK81. Permeabilizowane komórki inkubowano przez 3 godziny w 30°C z różnymi N-acetylowanymi aminokwasami (stężenie końcowe 25 mM) i badano supernatanty za pomocą analizatora aminokwasów. Okazało się, że ponad 20% dostarczonej N-acetyloornityny było przekształcane. Także dla N-acetylofosfinotricyny dała się wykazać wzrastająca deacetylacja do fosfinotricyny zależna od stężenia wprowadzonej N-acetylofosfinotricyny (Tabela 7)
T a b e l a 7
N-acetyloornityna (25 mM) N-acetylofenyloalanina (25 mM) N-acetylofosfinotricyna
(12,5 mM) (25mM) (50 mM)
5860 nM <5 nM 8,0 nM 20,0 nm 44,7 nM
Podano stężenia wprowadzonych N-acetyloaminokwasów i powstałych przez acetylację aminokwasów
Figura 1. Mapa restrykcyjna fragmentu 2,5 kb SalI/BamHI, który jest odpowiedzialny za specyficzną aktywność deacetylazy N-acetylo-PPT. Pozycja i orientacja genu struktury deac1 są zaznaczone za pomocą strzałki (bp - pary zasad)
Figura 2 Mapa plazmidu pPVCKDEAC1 do konstytutywnej ekspresji genu deac u roślin
Figura 3 Mapa plazmidu pPCVTDEAC1 do specyficznej w stosunku do tapeteum ekspresji genu deac u roślin
Figura 4 Mapa plazmidu pGK83
Figura 5 Mapa plazmidu pMF9
PL 193 522 B1
Traktat budapeszteński o międzynarodowym uznawaniu depozytu drobnoustrojów dla celów postępowania patentowego
Formularz międzynarodowy
Hoechst Schering Agravo GmbH
Forschung Biochemie H 672N
65926 Frankfurt/Main
Potwierdzenie otrzymania przy pierwszym depozycie wydane według par. 7 przez podane poniżej międzynarodowy organ depozytowy
I. Opis mikroorganizmu
Oznaczenie podane Oznaczenie podane przez przez deponującego międzynarodowy organ depozytowy
3010 DSM 9734
II. Opis naukowy i/lub proponowane określenie taksonomiczne
Z opisanym podl mikroorgainzmem załączono
() opis naukowy
() proponowane określenie taksonomiczne zaznaczyć co dotyczy
III. Złożenie i przyjęcie
Niniejszy międzynarodowy organ depozytowy przyjmuje podany w I mikroorganizm, który został otrzymany dn. 1995-02-14 (data pierwszego depozytu)
IV. Otrzymanie prośby o przekształcenie
Określony w I mikroorganizm został przyjęty przez niniejszy międzynarodowy organ depozytowy dn. (data pierwszego depozytu) a prośbę o przekształcenie tego depozytu w depozyt według Traktatu Budapeszteńskiego otrzymano w dn. (data otrzymania prośby o przekształcenie)
V. Międzynarodowy organ depozytowy
Nazwa: DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismem und Zellkulturen GmBh Adres: Massenroder Weg 1b D-38124 Braunschweig
Podpis(y) osoby(osób) upoważnionych do reprezentowania międzynarodowego organu depozytowego lub upoważnionego(ych) urzędnika(ów)
Data: 1995-02-21 w której uzyskano status międzynarodowego organu
Jeżeli dotyczy Reguła 6.4.c jest to data, depozytowego
Traktat budapeszteński o międzynarodowym uznawaniu depozytu drobnoustrojów dla celów postępowania patentowego
Formularz międzynarodowy Prof. dr A. Puehler Katedra Genetyki Uniwersytet Bielefeld Skrzynka pocztowa 100132 D-33501 Bielefeld
Potwierdzenie otrzymania przy pierwszym depozycie wydane według par. 7 przez podane poniżej międzynarodowy organ depozytowy
I. Opis mikroorganizmu
Oznaczenie podane Oznaczenie podane przez przez deponującego międzynarodowy organ depozytowy
B6 DSM 11070
II. Opis naukowy i/lub proponowane określenie taksonomiczne Z opisanym pod I mikroorganizmem załączono () opis naukowy (x) proponowane określenie taksonomiczne zaznaczyć co dotyczy
PL 193 522 B1
III. Wejście i przyjęcie
Niniejszy międzynarodowy organ depozytowy przyjmuje podany w I mikroorganizm, który został otrzymany dn. 1996-07-12 (data pierwszego depozytu)
IV. Otrzymanie prośby o przekształcenie
Określony w I mikroorganizm został przyjęty przez niniejszy międzynarodowy organ depozytowy dn. (data pierwszego depozytu) a prośbę o przekształcenie tego depozytu w depozyt według Traktatu Budapeszteńskiego otrzymano w dn. (data otrzymania prośby o przekształcenie)
V. Międzynarodowy organ depozytowy
Nazwa: DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismem und Zellkulturen GmBh
Adres: Massenroder Weg 1b
D-38124 Braunschweig
Podpis(y) osoby(osób) upoważnionych do reprezentowania międzynarodowego organu depozytowego lub upoważnionego(ych) urzędnika(ów)
Data: 1996-07-16
Jeżeli dotyczy Reguła 6.4.c jest to data, w której uzyskano status międzynarodowego organu depozytowego
Protokół sekwencji (1) Informacja ogólna (i) ZGŁASZAJĄCY (A) NAZWA: Hoechst Schering AgrEvo GmbH (B) ULICA: (C) MIEJSCE: Frankfurt (D) LAND: (E) KRAJ: Niemcy (F) KOD POCZTOWY: 65926 (G) TELEFON: 069-305-5596 (H) TELEFAKS: (+69) 357175 (I) TELEX: (ii) TYTUŁ ZGŁOSZENIA: Nowe geny kodujące deacetylazy aminokwasów ze specyficznością w stosunku do N-acetylo-L-fosfinotricyny, ich izolacja i zastosowanie (iii) LICZBA SEKWENCJI: 4 (iv) FORMA CZYTELNA KOMPUTEROWO (A) NOŚNIK DANYCH: dyskietka (B) KOMPUTER: Kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentin Release # 1.0, wersja # 1.25 (EPA) (2) INFORMACJA O SEK NR ID 1:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 1320 par zasad (B) RODZAJ: Kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (ix) CECHY CHARAKTERYSTYCZNE:
(A) NAZWA/KLUCZ: egzon (B) POŁOŻENIE: 1.. 1320
PL 193 522 B1 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID 1:
ATGATCCGCA AGACCGTTCT GTTGACTGCG CTGTCCTGCG CCCTGGCCTC CGCGACAGCC 60
ACCGCCGCCG AAGGCCAGCG GCCCGAGGTG GAGGCCGCCG CCGCGCGCCT GCAGCGGCAG 120
GTGGTGGAGT GGCGCCGCGA TTTCCACCAG CATCCGGAGC TGTCCAACCG CGAGGTGCGC 180
ACCGCCGCCA AGGTGGCCGA GCGCCTGCGC GCGATGGGCC TGCAACCGCA GACCGGCGTC 240
GCCGTGCACG GCGTGGTGGC GATCATCAAG GGCGCCCTGC CGGGGCCGAA GATCGCCCTG 300
CGCGCGGACA TGGACGCGCT GCCGGTGACC GAACAGACCG GGCTGCCGTT CGCCTCCACC 360
GCCACGGCCG AGTACCGCGG CGAGAAGGTC GGGGTGATGC ATGCCTGCGG CCACGACGCC 420
CATACCGCCA CCCTGCTCGG CGTGGCCGAC GCGCTGGTGG CCATGCGCGA CACGCTGCCC 480
GGCGAAGTAA TGCTGATCTT CCAGCCGGCC GAGGAAGGCG CGCCGCCGCC GGAGCAGGGC 540
GGTGCCGAGC TGATGCTCAA GGAGGGGCTG TTCAAGGAGT TCAAGCCGGA GGCGGTGTTC 600
GGCCTGCACG TGTTCTCCAG CGTCCAGGCC GGGCAGATCG CCGTGCGCGG CGGCCCGCTG 660
ATGGCCGCCT CCGACCGCTT CGCCATCACC GTCAACGGCC GCCAGACCCA TGGCTCGGCG 720
CCCTGGAACG GCATCGATCC GATTGTCGCC GCCTCCGACC TGATCGGCAC CGCGCAGACC 780
ATCGTCAGCC GCCGCGCCAA CCTGTCCAAG CAGCCGGCGG TGCTGACCTT CGGCGCGATC 840
AAGGGCGGCA TCCGCTACAA CATCATCCCC GACTCGGTGG AGATGGTCGG CACCATCCGC 900
ACCTTCGACC CGGACATGCG CAAGCAGATC TTCGCCGACT TGCGCAACGT CGCCGAGCAC 960
ACCGCTGCCG CGCATGGCGC CACCGCCACC ACCGACATCT ACGAGAAGGA CGGCAACCCG 1020
GCCACGGTCA ACGACCCGGC GCTGACCGCG CGCATGCTGC CCAGCCTGCA GGCCGTGGTC 1080
GGCAAGGACA ACGTCTACGA GCCGCCGCTG CAGATOGGCT CGGAGGACTT CTCGCTGTAT 1140
GCGCAGCAGG TGCCGGCGAT GTTCTTCTTC GTCGGCTCCA CCGGCGCGGG CATCGACCCG 1200
GCCACCGCGC CCAGCAACCA CTCGCCGAAG TTCCTGCTCG ACGAGAAGGC GCTGGACGTG 1260
GGCCTGCGCG CGCTGCTGCA GGTGTCGCTG GACTATCTGC ACGGTGGCAA GGCGGGGTGA 1320
PL 193 522 B1 (2) INFORMACJA O SEK NR ID 2 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 439 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (ix) CECHY CHARAKTERYSTYCZNE:
(A) NAZWA/KLUCZ: białko (B) POŁOŻENIE: 1...439
(xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID 2:
Met 1 Ile Arg Lys Thr Val Leu 5 Leu Thr Ala Leu Ser Cys Ala Leu Ala 10 15
Ser Ala Thr Ala 20 Thr Ala Ala Glu Gly 25 Gin Arg Pro Glu Val Glu Ala 30
Ala Ala Ala Arg 35 Leu Gin Arg Gin 40 Val Val Glu Trp Arg Arg Asp Phe 45
His Gin His Pro 50 Glu Leu Ser 55 Asn Arg Glu Val Arg Thr Ala Ala Lys 60
Val 65 Ala Glu Arg Leu Arg Ala 70 Met Gly Leu Gin Pro Gin Thr Gly Val 75 80
Ala Val His Gly Val Val Ala 85 Ile Ile Lys Gly Ala Leu Pro Gly Pro 90 95
Lys Ile Ala Leu 100 Arg Ala Asp Met Asp 105 Ala Leu Pro Val Thr Glu Gin 110
PL 193 522 B1
Thr Gly Leu 115 Pro Phe Ala Ser Thr Ala Thr Ala Glu Tyr Arg Gly Glu
120 125
Lya Val Gly Val Met His Ala Cys Gly His Asp Ala His Thr Ala Thr
130 135 140
Leu Leu Gly Val Ala Asp Ala Leu Val Ala Met Arg Asp Thr Leu Pro
145 150 155 160
Gly Glu Val Met Leu Ile Phe Gin Pro Ala Glu Glu Gly Ala Pro Pro
165 170 175
Pro Glu Gin Gly Gly Ala Glu Leu Met Leu Lys Glu Gly Leu Phe Lys
180 185 190
Glu Phe Lys Pro Glu Ala Val Phe Gly Leu His Val Phe Ser Ser Val
195 200 205
Gin Ala Gly Gin Ile Ala Val Arg Gly Gly Pro Leu Met Ala Ala Ser
210 215 220
Asp Arg Phe Ala Ile Thr Val Asn Gly Arg Gin Thr His Gly Ser Ala
225 230 235 240
Pro Trp Asn Gly Ile Asp Pro Ile Val Ala Ala Ser Asp Leu Ile Gly
245 250 255
Thr Ala Gin Thr Ile Val Ser Arg Arg Ala Asn Leu Ser Lys Gin Pro
260 265 270
Ala Val Leu Thr Phe Gly Ala Ile Lys Gly Gly Ile Arg Tyr Asn Ile
275 280 2B5
Ile Pro Asp Ser Val Glu Met Val Gly Thr Ile Arg Thr Phe Asp Pro
290 295 300
Asp Met Arg Lys Gin Ile Phe Ala Asp Leu Arg Asn Val Ala Glu His
305 310 315 320
Thr Ala Ala Ala His Gly Ala Thr Ala Thr Thr Asp : Ile Tyr Glu Lys
325 330 335
Asp Gly Asn Pro Ala Thr Val Asn Asp Pro Ala Leu Thr Ala Arg Met
340 345 350
PL 193 522 B1
Leu Pro Ser 355 Leu Gin Ala Val Val 360 Gly Lys Asp Asn Val 365 Tyr Glu Pro
Pro Leu 370 Gin Met Gly Ser Glu 375 Asp Phe Ser Leu Tyr 380 Ala Gin Gin val
Pro 385 Ala Met Phe Phe Phe 390 Val Gly Ser Thr Gly 395 Ala Gly Ile Asp Pro 400
Ala Thr Ala Pro Ser 405 Asn His Ser Pro Lys 410 Phe Leu Leu Asp Glu 415 Lys
Ala Leu Asp Val 420 Gly Leu Arg Ala Leu 425 Leu Gin Val Ser Leu 430 Asp Tyr
Leu His Gly 435 Gly Lys Ala Gly
Arg Lys Lys Asp Leu Pro
450
(2) INFORMACJA 0 SEK NR ID 3
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 1273 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (ix) CECHY CHARAKTERYSTYCZNE:
(A) NAZWA/KLUCZ: egzon (B) POŁOŻENIE: 1...1273 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID 3:
ATGGCCTTGC TGCAGGAGCT GCTGGACAGC GCACCCGAGA TCACCGCGCT GCGCCGCGAC 60
ATACATGCCC ATCCCGAACT GTGCTTCGAG GAACTGCGCA CCGCCOACCT GGTGGCCCGG 120
CAGCTCGAAG GCTGGGGCAT TGCCGTGCAC CGCGGCCTGG GCCGCACGGG CGTGGTGGGC 180
PL 193 522 B1
ACCATCCACG GCCGTGACGG CGGCGCCAGC GGCCGGGCCA TCGGGCTGCG CGCCGACATG 240
GACGCCCTGC CCATGCAGGA GTTCAACACC TTCGAGCACG CCAGCCGCCA CGCCGGAAAA 300
ATGCATGCCT GCGGACATGA CGGCCATGTC GCCATGCTGC TGGCCGCCGC GCAGTACCTG 360
GCCGTGCACC GCGACAGCTT CGAGGGCACG GTGCACCTGA TCTTCCAGCC GGCCGAAGAG 420
GGCGGCGGCG GGGCGCGCGA GATGGTCGAG GACGGCCTGT TCACCCAGTT CCCCATGCAG 480
GCCGTGTTCG GCATGCACAA CTGGCCGGGC ATGAAGGCCG GCACCATGCC GTGGGCCCCG 540
GGCCCGGCCA TGGCGTCGAG CAACGAGTTC CGCATCGTCG TGCGCGGCAA GGGCGGCCAC 600
GCGGCCATGC CGCACATGGT GATCGACCCG CTGCCCGTGG CGGCCCAGCT CATCCTGGGC 660
CTGCAGACCA TCGTCAGCCG CAACGTCAAG CCCATCGAGG CGGGCGTGGT CTCGGTCACC 720
ATGGTCCATG CGGGCGAGGC CACGAACGTG GTGCCCGACA GCGTGGAGCT GCAGGGCACG 780
GTGCGCACCT TCACGCTGGA GGTGCTGGAC CTGATCGAGC GGCGCATGAA GGCCCTGGCC 840
GAGAGCATCT GCGCGGCGCA TGACACGCGC TGCGAGTTCG AGTTCGTGCG CAACTACCCG 900
CCCACCATCA ACTCCGCCCC GGAGGCCGAG TTCGCACGCC GCGTCATGGC CGAGGTCGTG 960
GGCGAGGCCA ACGTGCTGCC CCAGGAGCCG TCCATGGGCG CCGAGGACTT CGCCTTCATG 1020
CTGCTGGAAA AGCCCGGCGC CTACTGCTTC ATCGCCAATG GCGACGGCGA CCACCGCGCC 1080
ATCGGCCACG GCGGCGGTCC CTGCACGCTG CACAACCCCA GCTACGACTT CAACGACCAG 1140
CTGATTCCGC AGGGCGCCAC GTTCTGGGTG AAGCTGGCCC agcgctggct GAGCGAGCCC 1200
ACGCGCTGAG GCCTTGCGGG GTCCGGCCGA CACCGGCATG TCACACACCG CACCTAGCAT 1260
GCGGTCCCTG TGA 1273
PL 193 522 B1 (2) INFORMACJA O SEK NR ID 4:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 402 aminokwasów (B, RODZAJ: aminokwasy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (ix) CECHY CHARAKTERYSTYCZNE:
(A) NAZWA/KLUCZ: białko (B) POŁOŻENIE: 1...402 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID 4:
Met 1 Ala Leu Leu Gin 5 Glu Leu Leu Asp Ser 10 Ala Pro Glu Ile Thr 15' Ala
Leu Arg Arg Asp 20 , Ile His Ala His Pro 25 GlU Leu Cys Phe Glu 30 Glu Leu
Arg Thr Ala 35 Asp Leu Val Ala Arg 40 Gin Leu Glu Gly Trp 45 Gly Ile Ala
Val His Arg Gly Leu Gly Arg Thr Gly Val Val Gly Thr Ile His Gly
55 60
Arg Asp Gly Gly Ala Ser Gly Arg Ala Ile Gly Leu Arg Ala Asp Met 65 70 75 80
Asp Ala Leu Pro Met 85 Gin Glu Phe Asn Thr 90 Phe Glu His Ala Ser 95 Arg
His Ala Gly Lys 100 Met His Ala cys Gly 105 His Asp Gly His Val 110 Ala Met
Leu Leu Ala 115 Ala Ala Gin Tyr Leu 120 Ala Val His Arg Asp 125 Ser Phe Glu
Gly Thr 130 Val His Leu Ile Phe 135 Gin Pro Ala Glu Glu 14 0 Gly Gly Gly Gly
PL 193 522 B1
Ala 145 Arg Glu Met Val Glu ISO Asp Gly Leu Phe Thr 155 Gin Phe Pro Met Gin 160
Ala Val Phe Gly Met 165 His Asn Trp Pro Gly 170 Met Lys Ala Gly Thr 175 Met
Pro Trp Ala Pro 180 Gly Pro Ala Met Ala 185 Ser Ser Asn Glu Phe 190 Arg Ile
Val Val Arg 195 Gly Lys Gly Gly His 200 Ala Ala Met Pro His 205 Met Val Ile
Asp Pro 210 Leu Pro Val Ala Ala 215 Gin Leu Ile Leu Gly 220 Leu Glh Thr Ile
Val Ser Arg Asn Val Lys Pro Ile Glu Ala Gly Val Val Ser Val Thr
225 230 235 240
Met Val His Ala Gly Glu Ala Thr Asn Val Val Pro Asp Ser Val Glu 245 250 255
Leu Gin Gly Thr Val Arg Thr Phe Thr Leu Glu Val Leu Asp Leu Ile 260 265 270
Olu Arg Arg Met Lys Ala Leu Ala Glu Ser Ile Cys Ala Ala His Asp 275 280 285
Thr Arg Cys Glu Phe Glu Phe Val Arg Asn Tyr Pro Pro Thr Ile Asn 290 295 300
Ser Ala Pro Glu Ala Glu Phe Ala Arg Arg Val Met Ala Glu Val Val
305 310 315 320
Gly Glu Ala Asn Val Leu Pro Gin Glu Pro Ser Met Gly Ala Glu Asp
325 330 ' 335
Phe Ala Phe Met Leu Leu Glu Lys Pro Gly Ala Tyr Cys Phe Ile Ala 340 345 350
Asn Gly Asp Gly Asp His Arg Ala Ile Gly His Gly Gly Gly Pro Cys 355 360 365
Thr Leu His Asn Pro Ser Tyr Asp Phe Asn Asp Gin Leu Ile Pro Gin 370 375 380
Gly Ala Thr Phe Trp Val Lys Leu Ala Gin Arg Trp Leu Ser Glu Pro 385 390 395 400
Thr Arg

Claims (9)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Cząsteczka DNA pochodząca z Stenotrophomonas sp., który jest zdeponowany pod nr. DSM 9734, znamienna tym, że koduje białko o aktywności biologicznej deacetylazy N-acetylo-fosfinotricyny.
  2. 2. Cząsteczka DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że koduje białko obejmujące sekwencję aminokwasową o Id. Sekw. Nr 2 lub fragmenty tego białka posiadające aktywność biologiczną deacetylazy N-acetylo-fosfinotricyny.
  3. 3. Cząsteczka DNA według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że obejmuje sekwencję nukleotydową o Id. Sekw. Nr 1 lub sekwencję, która różni się od tej sekwencji ze względu na degenerację kodu genetycznego.
  4. 4. Białko kodowane przez cząsteczkę DNA określoną w zastrz. 1.
  5. 5. Mikroorganizm Stenotrophomonas sp zdeponowany pod numerem DSM 9734.
  6. 6. Sposób wytwarzania roślin mających wybiórczo zniszczalne części, znamienny tym, że obejmuje:
    a) transformowanie komórek roślinnych genem deacetylazy N-acetylo-fosfinotricyny obejmującym cząsteczkę DNA określoną w zastrz. 1, pod kontrolą promotora kierującego ekspresją w specyficznych częściach roślinnych, i
    b) regenerowanie roślin z komórek roślinnych otrzymanych w etapie (a), przy czym rośliny te mają części, które mogą być wybiórczo zniszczone po potraktowaniu N-acetylo-fosfinotricyną (N-acetyl-PPT).
  7. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że specyficzna ekspresja genu deacetylazy N-acetylo-fosfinotricyny jest pod kontrolą promotora specyficznego dla warstwy wyścielającej.
  8. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że promotor specyficzny dla warstwy wyścielającej jest promotorem genu tap1 z Antirrhinum majus.
  9. 9. Rośliny transformowane genem deacetylazy N-acetylofosfinotricyny obejmującym cząsteczkę DNA określoną w zastrz. 1, będącą pod kontrolą promotora specyficznego dla ekspresji w określonych częściach roślin, w których to roślinach specyficzne części roślin mogą być wybiórczo zniszczone po potraktowaniu N-acetylo-fosfinotricyną (N-acetyl-PPT).
PL97334530A 1996-12-16 1997-12-03 Cząsteczka DNA, białko, mikroorganizm Stenotrophomonas sp., sposób wytwarzania roślin oraz rośliny transformowane genem deacetylazy N-acetylofosfinotricyny PL193522B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19652284A DE19652284A1 (de) 1996-12-16 1996-12-16 Neue Gene codierend für Aminosäure-Deacetylasen mit Spezifität für N-Acetyl-L-Phosphinothricin, ihre Isolierung und Verwendung
PCT/EP1997/006755 WO1998027201A2 (de) 1996-12-16 1997-12-03 Gene codierend für aminosäure-deacetylasen mit spezifität für n-acetyl-l-phosphinothricin, ihre isolierung und verwendung

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL334530A1 PL334530A1 (en) 2000-02-28
PL193522B1 true PL193522B1 (pl) 2007-02-28

Family

ID=7814866

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL97377650A PL193489B1 (pl) 1996-12-16 1997-12-03 Cząsteczka DNA, białko, mikroorganizm Comamonas acidovorans, sposób wytwarzania roślin oraz roślinytransformowane genem deacetylazy N-acetylofosfinotricyny
PL97334530A PL193522B1 (pl) 1996-12-16 1997-12-03 Cząsteczka DNA, białko, mikroorganizm Stenotrophomonas sp., sposób wytwarzania roślin oraz rośliny transformowane genem deacetylazy N-acetylofosfinotricyny

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL97377650A PL193489B1 (pl) 1996-12-16 1997-12-03 Cząsteczka DNA, białko, mikroorganizm Comamonas acidovorans, sposób wytwarzania roślin oraz roślinytransformowane genem deacetylazy N-acetylofosfinotricyny

Country Status (18)

Country Link
US (1) US6177616B1 (pl)
EP (1) EP0942965B1 (pl)
JP (1) JP2001506130A (pl)
CN (1) CN1171993C (pl)
AT (1) ATE377072T1 (pl)
AU (1) AU727831B2 (pl)
BR (1) BR9714513A (pl)
CA (1) CA2275134A1 (pl)
CZ (1) CZ216699A3 (pl)
DE (2) DE19652284A1 (pl)
ES (1) ES2296318T3 (pl)
HU (1) HUP0000396A3 (pl)
NZ (1) NZ335852A (pl)
PL (2) PL193489B1 (pl)
RU (1) RU2205219C2 (pl)
TR (1) TR199901332T2 (pl)
WO (1) WO1998027201A2 (pl)
ZA (1) ZA9711146B (pl)

Families Citing this family (122)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19933362A1 (de) * 1999-07-20 2001-02-08 Aventis Cropscience Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren aus ihren racemischen N-Acetyl-D,L-Derivaten durch enzymatische Racemat-Spaltung mittels isolierter, rekombinanter Enzyme
US6384304B1 (en) 1999-10-15 2002-05-07 Plant Genetic Systems N.V. Conditional sterility in wheat
WO2002072804A2 (en) * 2001-03-12 2002-09-19 Bayer Bioscience N.V. Novel genes for conditional cell ablation
EP1258531A1 (en) * 2001-05-14 2002-11-20 Givaudan SA Compounds and methods for inhibiting axillary malodour
AU2002315526A1 (en) 2001-07-06 2003-01-21 Monsanto Technology Llc Methods for enhancing segregation of transgenes in plants and compositions thereof
US7132590B2 (en) * 2001-12-18 2006-11-07 The Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Methods of making male-sterile plants by underexpressing allene oxide synthase
BRPI0409816B8 (pt) 2003-04-29 2022-12-06 Pioneer Hi Bred Int Genes de glifosato-n-acetiltransferase (gat), construtos os compreendendo, célula bacteriana, polipeptídeo tendo atividade de gat, bem como método para a produção de uma planta transgênica resistente ao glifosato e métodos para controlar ervas daninhas em um campo contendo uma safra
WO2005001101A1 (en) 2003-06-03 2005-01-06 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Conditional sterility in plants
CA2531170C (en) * 2003-07-02 2011-05-10 Teva Gyogyszergyar Reszvenytarsasag Aztreonam l-lysine and methods for the preparation thereof
US7491811B2 (en) 2004-01-15 2009-02-17 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Repressor-mediated tissue-specific gene expression in plants
BRPI0708480A2 (pt) * 2006-03-02 2011-05-31 Athenix Corp processos e composições para aperfeiçoada atividade de enzima em plantas transgênicas
US7951995B2 (en) 2006-06-28 2011-05-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean event 3560.4.3.5 and compositions and methods for the identification and detection thereof
US8097712B2 (en) 2007-11-07 2012-01-17 Beelogics Inc. Compositions for conferring tolerance to viral disease in social insects, and the use thereof
US8748695B2 (en) * 2008-07-23 2014-06-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Molecular markers linked to PPO inhibitor tolerance in soybeans
US8697941B2 (en) 2008-07-23 2014-04-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Molecular markers linked to PPO inhibitor tolerance in soybeans
CN102216453B (zh) 2008-09-26 2014-02-05 巴斯夫农化产品有限公司 除草剂-抗性的ahas-突变体及使用方法
US8466342B2 (en) 2009-06-09 2013-06-18 Pioneer Hi Bred International Inc Early endosperm promoter and methods of use
US8962584B2 (en) 2009-10-14 2015-02-24 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem, Ltd. Compositions for controlling Varroa mites in bees
MX2012004819A (es) 2009-10-26 2012-06-25 Pioneer Hi Bred Int Promotor especifico de ovulo somatico y metodos de uso.
AR080022A1 (es) 2010-01-26 2012-03-07 Pioneer Hi Bred Int Secuencias de polinucleotidos y polipeptidos asociadas con la tolerancia a los herbicidas
MY163887A (en) 2010-03-08 2017-11-15 Monsanto Technology Llc Polynucleotide molecules for gene regulations in plants
WO2012021797A1 (en) 2010-08-13 2012-02-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for targeting sequences of interest to the chloroplast
WO2012071039A1 (en) 2010-11-24 2012-05-31 Pioner Hi-Bred International, Inc. Brassica gat event dp-061061-7 and compositions and methods for the identification and/or detection thereof
CA2810180C (en) 2010-11-24 2015-07-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Brassica gat event dp-073496-4 and compositions and methods for the identification and/or detection thereof
TWI667347B (zh) 2010-12-15 2019-08-01 瑞士商先正達合夥公司 大豆品種ｓｙｈｔ０ｈ２及偵測其之組合物及方法
EP2756084B1 (en) 2011-09-13 2020-06-03 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for weed control
CN103930549B (zh) 2011-09-13 2020-09-18 孟山都技术公司 用于杂草控制的方法和组合物
US10760086B2 (en) 2011-09-13 2020-09-01 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
CN107739737A (zh) 2011-09-13 2018-02-27 孟山都技术公司 用于杂草控制的方法和组合物
US10806146B2 (en) 2011-09-13 2020-10-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
UA115534C2 (uk) 2011-09-13 2017-11-27 Монсанто Текнолоджи Ллс Спосіб та композиція для боротьби з бур'янами (варіанти)
AR087862A1 (es) 2011-09-13 2014-04-23 Monsanto Technology Llc Metodos y composiciones para el control de malezas
CN110066794A (zh) 2011-09-13 2019-07-30 孟山都技术公司 用于杂草控制的方法和组合物
US9840715B1 (en) 2011-09-13 2017-12-12 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for delaying senescence and improving disease tolerance and yield in plants
EP3382027A3 (en) 2011-09-13 2018-10-31 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for weed control
WO2013040116A1 (en) 2011-09-13 2013-03-21 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US10829828B2 (en) 2011-09-13 2020-11-10 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US9920326B1 (en) 2011-09-14 2018-03-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for increasing invertase activity in plants
WO2013096818A1 (en) 2011-12-21 2013-06-27 The Curators Of The University Of Missouri Soybean variety s05-11268
WO2013096810A1 (en) 2011-12-21 2013-06-27 The Curators Of The University Of Missouri Soybean variety s05-11482
US20130180008A1 (en) 2012-01-06 2013-07-11 Pioneer Hi Bred International Inc Ovule Specific Promoter and Methods of Use
WO2013103365A1 (en) 2012-01-06 2013-07-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Pollen preferred promoters and methods of use
US9499831B2 (en) 2012-01-17 2016-11-22 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant transcription factors, promoters and uses thereof
WO2013138358A1 (en) 2012-03-13 2013-09-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genetic reduction of male fertility in plants
WO2013138309A1 (en) 2012-03-13 2013-09-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genetic reduction of male fertility in plants
EP2855680B8 (en) 2012-05-24 2020-04-15 Monsanto Technology LLC Compositions and methods for silencing gene expression
CA2876426A1 (en) 2012-06-15 2013-12-19 E. I. Du Pont De Nemours And Company Methods and compositions involving als variants with native substrate preference
AU2012208997B1 (en) 2012-07-30 2013-09-19 Dlf Usa Inc. An alfalfa variety named magnum salt
CA2887571A1 (en) 2012-10-11 2014-04-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Guard cell promoters and uses thereof
MX364070B (es) 2012-10-18 2019-04-10 Monsanto Technology Llc Métodos y composiciones para el control de plagas vegetales.
US20140173775A1 (en) 2012-12-13 2014-06-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for producing and selecting transgenic plants
CN105008541A (zh) 2012-12-21 2015-10-28 先锋国际良种公司 用于生长素类似物缀合的组合物和方法
UY35251A (es) 2013-01-01 2014-07-31 Seeds Ltd Ab MOLÉCULAS DE dsRNA AISLADAS Y MÉTODOS PARA USARLAS PARA SILENCIAR MOLÉCULAS DIANA DE INTERÉS
US10683505B2 (en) 2013-01-01 2020-06-16 Monsanto Technology Llc Methods of introducing dsRNA to plant seeds for modulating gene expression
US10000767B2 (en) 2013-01-28 2018-06-19 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for plant pest control
UA121846C2 (uk) 2013-03-13 2020-08-10 Монсанто Текнолоджи Ллс Спосіб та гербіцидна композиція для контролю видів рослини роду lolium
CN105074008A (zh) 2013-03-13 2015-11-18 孟山都技术有限公司 用于杂草控制的方法和组合物
WO2014159306A1 (en) 2013-03-13 2014-10-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Glyphosate application for weed control in brassica
AU2014236162A1 (en) 2013-03-14 2015-09-17 Arzeda Corp. Compositions having dicamba decarboxylase activity and methods of use
CA2905595A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions having dicamba decarboxylase activity and methods of use
US20140283211A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Monsanto Technology Llc Methods and Compositions for Plant Pest Control
CN105143248A (zh) 2013-03-14 2015-12-09 先锋国际良种公司 玉蜀黍胁迫相关转录因子18及其用途
MX369750B (es) 2013-03-14 2019-11-20 Pioneer Hi Bred Int Composiciones y metodos para controlar plagas de insectos.
US10568328B2 (en) 2013-03-15 2020-02-25 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US10023877B2 (en) 2013-03-15 2018-07-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. PHI-4 polypeptides and methods for their use
BR112015023700A2 (pt) 2013-03-15 2017-07-18 Pioneer Hi Bred Int método de aprimoramento da tolerância ao estresse abiótico em uma planta de cultura agrícola , planta de milho transgênica, célula vegetal, semente, método de regulação negativa de um gene de acc oxidase endógeno em uma planta de milho.
EP2781151A1 (en) 2013-03-18 2014-09-24 Bayer CropScience AG Methods of separating hybrid seed from a mixture of seeds
EP3608412A3 (en) 2013-07-19 2020-04-08 Monsanto Technology LLC Compositions and methods for controlling leptinotarsa
US9850496B2 (en) 2013-07-19 2017-12-26 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling Leptinotarsa
WO2015013509A1 (en) 2013-07-25 2015-01-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method for producing hybrid brassica seed
MX359026B (es) 2013-08-16 2018-09-12 Pioneer Hi Bred Int Proteinas insecticidas y metodos de uso.
US10667524B2 (en) 2013-09-13 2020-06-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
CA2927180A1 (en) 2013-10-18 2015-04-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Glyphosate-n-acetyltransferase (glyat) sequences and methods of use
WO2015061548A1 (en) 2013-10-25 2015-04-30 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Stem canker tolerant soybeans and methods of use
US9540642B2 (en) 2013-11-04 2017-01-10 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Compositions and methods for controlling arthropod parasite and pest infestations
UA119253C2 (uk) 2013-12-10 2019-05-27 Біолоджикс, Інк. Спосіб боротьби із вірусом у кліща varroa та у бджіл
MX368629B (es) 2014-01-15 2019-10-08 Monsanto Technology Llc Metodos y composiciones para el control de malezas utilizando polinucleotidos de 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (epsps).
CN114763376A (zh) 2014-02-07 2022-07-19 先锋国际良种公司 杀昆虫蛋白及其使用方法
WO2015120276A1 (en) 2014-02-07 2015-08-13 Pioneer Hi Bred International Inc Insecticidal proteins and methods for their use
WO2015153339A2 (en) 2014-04-01 2015-10-08 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling insect pests
AU2015280252A1 (en) 2014-06-23 2017-01-12 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for regulating gene expression via RNA interference
EP3161138A4 (en) 2014-06-25 2017-12-06 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for delivering nucleic acids to plant cells and regulating gene expression
US9686931B2 (en) 2014-07-07 2017-06-27 Alforex Seeds LLC Hybrid alfalfa variety named HybriForce-3400
AR101348A1 (es) 2014-07-29 2016-12-14 Monsanto Technology Llc Composiciones y métodos para el control de pestes por insectos
WO2016022516A1 (en) 2014-08-08 2016-02-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Ubiquitin promoters and introns and methods of use
WO2016044092A1 (en) 2014-09-17 2016-03-24 Pioneer Hi Bred International Inc Compositions and methods to control insect pests
US9648826B2 (en) 2014-09-29 2017-05-16 Alforex Seeds LLC Low lignin non-transgenic alfalfa varieties and methods for producing the same
EP3207143B1 (en) 2014-10-16 2023-11-22 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
US20170359965A1 (en) 2014-12-19 2017-12-21 E I Du Pont De Nemours And Company Polylactic acid compositions with accelerated degradation rate and increased heat stability
EP3244727B1 (en) 2015-01-15 2025-10-22 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
JP6942632B2 (ja) 2015-01-22 2021-09-29 モンサント テクノロジー エルエルシー Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ防除用組成物及びその方法
CN108064233B (zh) 2015-05-19 2022-07-15 先锋国际良种公司 杀昆虫蛋白及其使用方法
EP3302053B1 (en) 2015-06-02 2021-03-17 Monsanto Technology LLC Compositions and methods for delivery of a polynucleotide into a plant
WO2016196782A1 (en) 2015-06-03 2016-12-08 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for introducing nucleic acids into plants
MX2017016119A (es) 2015-06-16 2018-03-07 Pioneer Hi Bred Int Composiciones y metodos para controlar plagas de insectos.
EP3943602A1 (en) 2015-08-06 2022-01-26 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant derived insecticidal proteins and methods for their use
US11104911B2 (en) 2015-12-22 2021-08-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Embryo-preferred Zea mays promoters and methods of use
US11096344B2 (en) 2016-02-05 2021-08-24 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genetic loci associated with brown stem rot resistance in soybean and methods of use
WO2017192560A1 (en) 2016-05-04 2017-11-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
EP3472323A1 (en) 2016-06-16 2019-04-24 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
CN109642237B (zh) 2016-06-24 2022-09-30 先锋国际良种公司 植物调节元件及其使用方法
US11155829B2 (en) 2016-07-01 2021-10-26 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins from plants and methods for their use
US20210292778A1 (en) 2016-07-12 2021-09-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
BR112019008800A2 (pt) 2016-11-01 2019-07-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. polipeptídeo inseticida, composição inseticida, polinucleotídeo recombinante, construto de dna, célula de planta ou planta transgênica, método para inibir o crescimento ou exterminar uma população de praga de inseto agrícola, método para inibir o crescimento ou exterminar uma praga de inseto, método para controlar infestação de inseto lepidoptera e/ou coleoptera em uma planta transgênica e fornecer gerenciamento de resistência de inseto e uso de pelo menos um polipeptídeo inseticida
CA2968905A1 (en) 2017-05-31 2018-11-30 Bayer Cropscience Lp Canola hybrid variety 5cn0125
CA2968938A1 (en) 2017-05-31 2018-11-30 Bayer Cropscience Lp Canola hybrid variety 5cn0130
EP3688171A1 (en) 2017-09-25 2020-08-05 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Tissue-preferred promoters and methods of use
CN109988806B (zh) * 2017-12-29 2023-02-28 弈柯莱生物科技(上海)股份有限公司 一种n-乙酰-草铵膦盐的消旋方法
ES3036459T3 (en) 2018-03-12 2025-09-19 Pioneer Hi Bred Int Methods for plant transformation
CN116410286A (zh) 2018-03-14 2023-07-11 先锋国际良种公司 来自植物的杀昆虫蛋白及其使用方法
CA3092078A1 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins from plants and methods for their use
CA3004115A1 (en) 2018-05-07 2019-11-07 Bayer Cropscience Lp Canola hybrid variety 6cn0122
WO2019226508A1 (en) 2018-05-22 2019-11-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant regulatory elements and methods of use thereof
BR112020026640A2 (pt) 2018-06-28 2021-04-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Métodos para selecionar plantas transformadas
AU2019369415A1 (en) 2018-10-31 2021-03-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods for Ochrobactrum-mediated plant transformation
CA3040289A1 (en) 2019-04-12 2020-10-12 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Canola hybrid variety 7cn0298
CA3047768A1 (en) 2019-06-21 2020-12-21 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Canola hybrid variety 7cn0425
US11672218B2 (en) 2020-04-24 2023-06-13 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Canola hybrid variety 7CN0065
US11997966B2 (en) 2020-04-24 2024-06-04 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Canola hybrid variety 7CN0020
US11997965B2 (en) 2020-04-24 2024-06-04 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Canola hybrid variety 8CN0001
CN115867564A (zh) 2020-07-14 2023-03-28 先锋国际良种公司 杀昆虫蛋白及其使用方法
CN112940963B (zh) * 2021-01-22 2022-06-14 上海交通大学 脱乙酰酶DacApva、编码基因及其在脱乙酰反应中的应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE531716C (de) 1930-06-08 1931-08-18 Mergenthaler Setzmaschfab Gmbh Einrichtung zum Ausrichten der Giessform gegenueber dem Giessformtraeger von Matrizensetz- und Zeilengiessmaschinen
DK158316C (da) * 1974-01-23 1990-10-08 Toyo Jozo Kk Fremgangsmaade til fremstilling af 3-substituerede 7-amino-3-cephem-4-carboxylsyrederivater
DE4126414A1 (de) 1991-08-09 1993-02-11 Hoechst Ag Deacetylasegene zur erzeugung von phosphinothricin oder phosphinothricyl-alanyl-alanin, verfahren zu ihrer isolierung und ihre verwendung
DE4308061A1 (de) * 1993-03-13 1994-09-15 Hoechst Ag Neue Aminosäure-Deacetylase mit Spezifität für L-N-Acetyl-Phosphinothricin, ihre Herstellung und Verwendung
GB9313975D0 (en) * 1993-07-06 1993-08-18 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
DE19639463A1 (de) * 1996-09-26 1998-04-02 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Verfahren zur Herstellung weiblich steriler Pflanzen

Also Published As

Publication number Publication date
ES2296318T3 (es) 2008-04-16
CN1171993C (zh) 2004-10-20
CZ216699A3 (cs) 1999-10-13
BR9714513A (pt) 2000-03-21
ATE377072T1 (de) 2007-11-15
CA2275134A1 (en) 1998-06-25
US6177616B1 (en) 2001-01-23
ZA9711146B (en) 1998-06-17
DE59712890D1 (de) 2007-12-13
EP0942965A2 (de) 1999-09-22
JP2001506130A (ja) 2001-05-15
WO1998027201A3 (de) 1999-03-04
EP0942965B1 (de) 2007-10-31
NZ335852A (en) 2001-06-29
HUP0000396A2 (hu) 2000-06-28
TR199901332T2 (xx) 1999-09-21
PL193489B1 (pl) 2007-02-28
HUP0000396A3 (en) 2002-02-28
AU727831B2 (en) 2001-01-04
WO1998027201A2 (de) 1998-06-25
AU5753598A (en) 1998-07-15
DE19652284A1 (de) 1998-06-18
PL334530A1 (en) 2000-02-28
CN1240476A (zh) 2000-01-05
RU2205219C2 (ru) 2003-05-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL193522B1 (pl) Cząsteczka DNA, białko, mikroorganizm Stenotrophomonas sp., sposób wytwarzania roślin oraz rośliny transformowane genem deacetylazy N-acetylofosfinotricyny
AU653845B2 (en) Deacetylase genes for the production of phosphinothricin or phosphinothricyl-alanyl-alanine, processes for their isolation, and their use
US20020002710A1 (en) Process for producing plants with female sterility
CA2324442A1 (en) Polynucleotide sequences and their use in a method of producing plants with an increased number of stomata
AU676468B2 (en) Recombinant gibberellin DNA and uses thereof
WO1999066785A1 (en) Water stress or salt stress tolerant transgenic cereal plants
HUT62333A (en) Process ofr producing herbicide-resistant mutants of acetohydroxy acid synthesis enzyme
US6555733B2 (en) Genes coding for amino acid deacetylases with specificity for N-acetyl-L-phosphinothricin, their isolation and use
US20030041352A1 (en) Arabitol or ribitol as positive selectable markers
CA2151627A1 (en) Recombinant gibberellin dna and uses thereof
US6399858B1 (en) Chitinase gene from stenotrophomonas maltophilia
US20090158469A1 (en) Herbicide-resistance gene and utilization thereof
AU714454B2 (en) Recombinant Gibberellin DNA and uses thereof
CN118599900A (zh) BoEDR1基因在芸薹属蔬菜抗真菌病害中的应用、基因编辑系统和表达载体
JP2000500002A (ja) 新規なｄｎａ配列及び植物における防御誘導因子を同定するためのこれらの使用
KR19990067302A (ko) 벼 nadh-의존성 환원효소, 그의 유전자 및 그의 용도
HK1024024A (en) Novel genes coding for amino acid deacetylases with speciticity for n-acetyl-l-phosphinothricin, their isolation and their use
MXPA00012786A (en) Water stress or salt stress tolerant transgenic cereal plants
AU2642500A (en) Recombinant gibberellin DNA uses thereof
JPWO1997023627A1 (ja) イネｎａｄｈ依存性還元酵素、その遺伝子およびその使用
JPH05317038A (ja) アグロバクテリウム・リゾゲネスｍａｆｆ０３−１７２４変異株及びその製造方法
WO2001066779A2 (en) Arabitol or ribitol as positive selectable markers
HK1022331A (en) Process for producing plants with female sterility

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20081203