PL193522B1

PL193522B1 - Cząsteczka DNA, białko, mikroorganizm Stenotrophomonas sp., sposób wytwarzania roślin oraz rośliny transformowane genem deacetylazy N-acetylofosfinotricyny

Info

Publication number: PL193522B1
Application number: PL97334530A
Authority: PL
Inventors: Klaus Bartsch; Guido Kriete; Inge Broer; Alfred Pühler
Original assignee: Hoechst Schering Agrevo Gmbh
Priority date: 1996-12-16
Filing date: 1997-12-03
Publication date: 2007-02-28
Also published as: PL334530A1; US6177616B1; CN1171993C; NZ335852A; EP0942965A2; BR9714513A; DE59712890D1; DE19652284A1; TR199901332T2; RU2205219C2; CA2275134A1; HUP0000396A2; HUP0000396A3; WO1998027201A2; ZA9711146B; ES2296318T3; EP0942965B1; JP2001506130A; CN1240476A; CZ216699A3

Abstract

1. Czasteczka DNA pochodzaca z Stenotrophomonas sp., który jest zdeponowany pod nr. DSM 9734, znamienna tym, ze koduje bialko o aktywnosci biologicznej deacetylazy N-acetylo- fosfinotricyny. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest cząsteczka DNA, białko, mikroorganizm Stenotrophomonas sp., sposób wytwarzania roślin oraz rośliny transformowane genem deacetylazy N-acetylo-fosfinotricyny.

Koncepcja chemicznie indukowalnej, odwracalnej męskiej sterylności u roślin przez specyficzną dla pylników ekspresję deacetylazy N-acetylofosfinotricyny (N-acetylo-PTT) jest opisana w Europejskim Zgłoszeniu Patentowym EP 531 716. Stosowany przy tym gen deacetylazy ze Streptomyces viridiochromogenes (deacetylaza N-acetylo-L-fosfinotricylo-alanylo-alaniny (N-acetylo PTT, dea) lub argE z Escherichia coli (deacetylaza N-acetylo-L-ornityny) kodują białka o specyficzności dla N-acetylo-L-PTT. Wykazano, że oba geny przy ekspresji specyficznej dla warstwy wyścielającej (tapetum) u roślin powodują występowanie męskosterylnych kwiatów po działaniu N-acetylo-L-PPT na pojedyncze pąki. Dla skutecznego zastosowania tego systemu, szczególnie przy traktowaniu całych roślin N-acetylo-PTT, korzystne jest w warunkach praktycznych użycie deacetylaz o wyższym powinowactwie w stosunku do substratu. Tak więc, poszukiwano innych deacetylaz z wyższym powinowactwem w stosunku do N-acetylo PPT.

Celem wynalazku jest dostarczenie cząsteczek DNA, które kodują białko o aktywności deacetylazy. Wykorzystując takie cząsteczki DNA kodujące deacetylazy można wytworzyć rośliny o częściach, które można celowo niszczyć. Szczególnie interesująca jest produkcja męsko- lub żeńskosterylnych roślin.

Wynalazek dotyczy cząsteczki DNA pochodzącej z Stenotrophomonas sp., który jest zdeponowany pod nr. DSM 9734, kodującej białko o aktywności biologicznej deacetylazy N-acetylofosfinotricyny.

Korzystnie cząsteczka DNA według wynalazku koduje białko obejmujące sekwencję aminokwasową o Id. Sekw. Nr 2 lub fragmenty tego białka posiadające aktywność biologiczną deacetylazy N-acetylo-fosfinotricyny. Korzystnie cząsteczka ta obejmuje sekwencję nukleotydową o Id. Sekw. Nr 1 lub sekwencję, która różni się od tej sekwencji ze względu na degenerację kodu genetycznego.

Wynalazek dotyczy również białka kodowanego przez cząsteczkę DNA według wynalazku. Właściwości enzymatyczne tych białek opisano w przykładach.

W zakres wynalazku wchodzi mikroorganizm Stenotrophomonas sp zdeponowany pod numerem DSM 9734.

W zakres wynalazku wchodzi też sposób wytwarzania roślin mających wybiórczo zniszczalne części, który obejmuje:

a) transformowanie komórek roślinnych genem deacetylazy N-acetylo-fosfinotricyny obejmującym cząsteczkę DNA według wynalazku, pod kontrolą promotora kierującego ekspresją w specyficznych częściach roślinnych, i

b) regenerowanie roślin z komórek roślinnych otrzymanych w etapie (a), przy czym rośliny te mają części, które mogą być wybiórczo zniszczone po potraktowaniu N-acetylo-fosfinotricyną (N-acetyl-PPT).

W korzystnym sposobie według wynalazku specyficzna ekspresja genu deacetylazy N-acetylofosfinotricyny jest pod kontrolą promotora specyficznego dla warstwy wyścielającej, korzystniej promotora genu tapl z Antirrhinum majus.

Wynalazek dotyczy także roślin transformowanych genem deacetylazy N-acetylo-fosfinotricyny obejmującym cząsteczkę DNA według wynalazku, będącą pod kontrolą promotora specyficznego dla ekspresji w określonych częściach roślin, w których to roślinach specyficzne części roślin mogą być wybiórczo zniszczone po potraktowaniu N-acetylo-fosfinotricyną (N-acetyl-PPT). Transgeniczne rośliny mogą być uzyskane za pomocą znanych technik z komórek roślinnych, które były transformowane cząsteczkami DNA według wynalazku i regenerowane do całych roślin.

Szczególnie interesujące są sposoby produkcji roślin mających części, które można celowo zniszczyć przez specyficzną ekspresję genu deacetylazy jak i sposoby produkcji roślin męsko- lub żeńskosterylnych, poprzez specyficzną ekspresję genu deacetylazy.

Rozwiązania według wynalazku umożliwiają:

(1) celowe wzbogacanie w mikroorganizmy z wysoką aktywnością deacetylazy N-acetylo-PPT;

(2) izolację odpowiednich genów deacetylazy (3) oczyszczenie i charakterystykę kodowanych przez te geny białek o wysokiej aktywności deacetylazy N-acetylo-PPT (4) ekspresję genu deacetylazy u roślin.

PL 193 522 B1

Stosując pożywkę mineralną z chityną jako jedynym źródłem węgla można było namnożyć bakterie z próbek gleby, które są w stanie rozszczepiać z wysoką skutecznością N-acetylo-PPT. W ten sposób możliwe było wyizolowanie dwóch szczepów bakterii jako czystych kultur: Stenotrophomonas sp. (nr. depozytu DSM 9734) i Comamonas acidovorans (Nr depozytu DSM 11070).

Jednak dla wymaganych w preparatyce przemysłowej warunków jest znacznie bardziej korzystne stosowanie oczyszczonego enzymu.

Poniżej opisano nowe deacetylazy specyficzne w stosunku do L-N-acetylo-PPT, i nowy i skuteczny sposób oczyszczania i charakterystyki tych enzymów ze wzbogaconej kultury tych mikroorganizmów gleby jak i zastosowanie tych deacetylaz.

Opisano również:

1. Deacetylazy z

- masą cząsteczkową 20000 do 100000 daltonów

- o optimum pH 6,5-10,0

- specyficzności substratowej w stosunku do L-N-acetylo-fosfinotricyny.

2. Sposób przygotowania deacetylazy, który polega na tym, że hoduje się mikroorganizm nie tworzący spór w pożywce zawierającej chitynę z kraba, i deacetylazę izoluje się z tego mikroorganizmu.

3. Zastosowania deacetylazy scharakteryzowanej w 1. do przygotowania roślin męskosterylnych jak i do stereospecyficznego przygotowania L-fosfinotricyny.

Białko według wynalazku o aktywności enzymatycznej ma optimum temperatury leżące między 30°C i 50°C.

Sposób wytwarzania deacetylaz korzystnie przeprowadza sięz mikroorganizmami, wybranymi z grupy, która składa się z organizmów opisanych powyżej.

Chitynę z kraba można otrzymać jak opisali Shimara, Kenzo i Takiguchi, Yasuyuki (Methods in Enzymology, tom 161, str. 417-423, 1988) lub jest do nabycia w firmie Sigma.

W celu oczyszczenia deacetylazy mikroorganizm hoduje się w pożywce odżywczej optymalnej dla jego wzrostu. Hodowanie mikroorganizmu przebiega w warunkach tlenowych, na przykład w hodowli zanurzeniowej przy wytrząsaniu lub mieszaniu w kolbach do wytrząsania lub fermentorach, ewentualnie przy wprowadzaniu powietrza lub tlenu. Fermentacja może zachodzić w temperaturze od około 20 do 40°C, korzystnie około 25 do 37°C, a szczególnie korzystnie przy 30 do 37°C. Hodowlę prowadzi się w zakresie pH między 5 i 8,5, korzystnie między 5,5 i 8.

W tych warunkach hodowli mikroorganizmu na ogół mikroorganizmy wykazują po 1 do 3 dni godną uwagi akumulację enzymu. Synteza deacetylazy zaczyna się w fazie logarytmicznej. Produkcję enzymu można śledzić za pomocą testu aktywności poprzez analizę HPLC lub fotometrycznie. Stosowana do produkcji pożywka płynna zawiera 0,2 do 5%, korzystnie 0,5 do 2% chityny z kraba i sole nieorganiczne.

Jako sole nieorganiczne pożywka płynna może zawierać na przykład chlorki, węglany, siarczany lub fosforany metali alkalicznych lub metali ziem alkalicznych, żelaza, cynku i manganu, ale także sole amonowe i azotany.

Do deacetylacji mogą być stosowane skuteczne ilości deacetylazy w postaci wolnej lub immobilizowanej, korzystnie wprowadzane do roślin, które wyrażają gen deac.

W celu unieruchomienia stosować można znane sposoby, takie jak opisano w niemieckich opisach wyłożeniowych 32 37 341 i 32 43 591.

Izolację i oczyszczanie enzymu można prowadzić według klasycznych procedur przez rozerwanie za pomocą ultradźwięków i prasy Frencha, strącanie siarczanem amonu, wymianę jonową, chromatografię powinowactwa i sączenie na żelu.

Preparat enzymatyczny można scharakteryzować za pomocą masy cząsteczkowej od 20000 do 100000 daltonów, korzystnie 30000 do 80000, szczególnie korzystnie 40000 do 70000 daltonów. Optimum pH enzymu leży w zakresie pH od 6,0 do 10,0, szczególnie 7,0 do 8,0. Optimum temperatury enzymu leży między 30 i 50°C, szczególnie między 35 i 45°C.

Kodujący deacetylazę gen sklonowano w E. coli. Dla genu deac-1 ze Stenotrophomonas sp. przygotowano fagmidowy bank ekspresyjny z genomowego DNA w E. coli i przeszukiwano pod kątem aktywności deacetylazy specyficznej w stosunku do N-acetylo-PTT. Gen deac2 z Comamonas acidovorans sklonowano poprzez komplementację mutanta E. coli argE za pomocą banku genomowego.

Sekwencje aminokwasów wyprowadzone z sekwencji DNA obu genów są do siebie podobne i posiadają ponadto homologię do hydrolaz hipuranowych, znanych z banków danych białek.

PL 193 522 B1

Rośliny transgeniczne mają wysoką wrażliwość tkanki na N-acetylo-PPT, co świadczy o wysokim powinowactwie w stosunku do substratu białka deac1 (Km =670 mM). Tak więc możliwe jest przy konstytutywnej ekspresji genu deac uzyskanie roślin, których liście są wrażliwe na stężenia do 0,4 mg/ml N-acetylo-D,L-PPT (= 0,2 mg/ml L-enancjomeru). Przy ekspresji specyficznej w stosunku do tapetum uzyskano sterylność męskich kwiatów przez działanie na pąki 2 mg/ml N-acetylo-D,L-PPT (= 1 mg/ml L-enancjomeru). Opisane wyniki dotyczą roślin szklarniowych. Ze względu na niskie stężenia substratu w razie potrzeby w warunkach otwartej przestrzeni możliwe jest bez problemu stosowanie dawki 5-10 razy wyższej.

Przedstawione przykłady służą do dalszego wyjaśnienia wynalazku. Procenty, o ile nie podano inaczej, są procentami wagowymi. Wynalazek jest dalej definiowany w zastrzeżeniach patentowych.

Przykład 1.

Izolacja i identyfikacja mikroorganizmów gleby ze specyficzną aktywnością deacetylazy N-acetylo-PPT

Po1g gleby (piaszczysta glina, Schwanheimer Duene) mieszano z 10 mM NaCl, 10 mM buforem Na-fosforan, pH = 7,0i ekstrahowano przez 1 godz. w temperaturze pokojowej. Do selekcji poszczególnych grup mikroorganizmów resztki gleby zaszczepiano do następujących pożywek płynnych.

(1) Pożywka MS-1 (dla eubakterii): 5 mM glukoza mM bursztynian 10 mM gliceryna 1 g/l NH4Cl ml/l roztworu A 50 ml/l roztworu B roztwór A: 50 g/l K2HPO4 roztwór B: 2,5 g/l MgSO4 0,5 g/l NaCl ml/l elementów śladowych (2) pożywka chitynowa dla Actinomycetes i Streptomycetes, jak i bakterii chitynożernych 10 g/l chityny z kraba 1 g/l (NH4)2SO4

0,5 g/l MgSO4 ml/l roztworu A ml/l elementów śladowych (3) Pożywka z antybiotykami (dla grzybów wyższych):

g/l ekstraktu słodowego 10 g/l glukozy g/l ekstraktu z drożdży 0,5 g/l (NH4)2SO4 50 mg/ml tetracykliny

Wszystkie pożywki zawierały 5 mM N-acetylo-PPT i były inkubowane po zaszczepieniu przez 3-5 dni w 28°C.

Wzbogacone kultury następnie testowano pod kątem aktywności deacetylacji N-acetylo-PPT. W tym celu komórki zwirowywano przy 10000 obr/min i w supernatancie badano wiązanie PPT wanalizatorze aminokwasów (Biotronic LC 5001). Wyłącznie kultury chitynowe okazały się deacetylazododatnie. Po wysianiu na agar z chityną z tych kultur wyizolowano w sumie 40 pojedynczych kolonii, ponownie hodowano je w chitynowej pożywce płynnej i znowu badano aktywność deacetylazy. Znaleziono 6 dodatnich izolatów, z których przez ponowne wysianie na płytki agarowe i dalszą hodowlę kolonii pojedynczych uzyskano aktywne kultury czyste. Szczep z najwyższą aktywnością deacetylazy został zidentyfikowany jako Stenotrophomonas sp. (numer depozytu DSM 9743).

Przykład 2:

Klonowanie i sekwencjonowanie genu deacetyalzy N-acetylo-PPT ze Stenotrophomonas sp.

Stosowane przy pracy standardowe metody biologii molekularnej opisano w Maniatis i wsp. 1982: Molecular Cloning: a Laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.

Genomowy DNA ze Stenotrophomonas sp. przygotowano według metody Meade i wsp., 1982, J.Bacteriol. 149:114-122. Po częściowym trawieniu SauSA wyizolowano frakcję o wielkości 5-10 kb i ligowano ją ze strawionym BamHI wektorem lambda-ZAP-Express z firmy Stratagene (ZAP Express vector kit, nr. Katalogu 239201; opis zestawu). Za pomocą pakowanej próbki ligacji uzyskano pierwotPL 193 522 B1 ny bank fagów lambda, i następnie poddano go amplifikacji. W ten sposób sporządzono za pomocą systemu fagmidowego pBK-CMV firmy Stratagene (nr katalogu 212209, instrukcja stosowania) fagmidowy bank ekspresyjny w Escherichia coli. W tym banku genomowym poszukiwano genu deacetylazy 14 poprzez badanie aktywności z [¹⁴-C] N-acetylo-L-PPT jako substratem. W tym celu zaszczepiono 2000 pojedynczych klonów w płytkach mikrotitracyjnych i inkubowano przez noc w pożywce LB w 37°C z 0,2 mM izopropylotiogalaktozydem (IPTG) jako induktorem i 50 m g/ml kanamycyny jako markerem 14 oporności. Komórki odwirowano i inkubowano każdą próbkę przez noc w 28°C 10 ml mM [¹⁴-C] N-acetylo-L-PPT. Następnie próbki zbierano po osiem i poddawano chromatografii cienkowarstwowej i autoradiografii pod kątem analizy przekształcenia N-acetylo-PPT do PPT (patrz EP 531 716, przykład 8) i przy pozytywnym wyniku badano pojedyncze klony. Za pomocą tej procedury udało się zidentyfikować dodatni klon ze wstawką 6 kb pośród 1920 transformantów. Ten fragment DNA poddano dokładniejszej analizie poprzez mapowanie restrykcyjne. Poprzez subklonowanie fragmentów restrykcyjnych wstawki w pUC18/19 i transformację zrekombinowanych plazmidów do E. coli udało się zlokalizować za pomocą opisanego powyżej testu aktywności gen struktury deac w fragmencie 2,5 kb (2487 par zasad) Sa1I/Smal (Fig. 1). Aktywność była zależna od orientacji fragmentu w stosunku do promotora lać wektora.

Fragment 2,5 kb poddano sekwencjonowaniu na obu niciach za pomocą metody Sangera (Sanger i wsp., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci USA 74:5463-5466). Cały fragment ma łączną długość 2487 nukleotydów (p. SEK NR ID. 1). Otwarta ramka odczytu o długości 1494 nukleotydów rozpoczyna się przy nukleotydzie Nr 367 i kończy się przy Nr. 1860.

Badania ekspresji z użyciem subfragmentów PCR w tym obszarze u E. coli wykazały, że aktywne białko deacetylazy jest kodowane przez obszar o długości 1365 nukleotydów od kodonu start w pozycji 496 do kodonu stop TGA w pozycji 1860. Wywiedziona z sekwencji DNA sekwencja aminokwasów stanowi polipeptyd złożony z 454 aminokwasów (SEQ NR ID 2) z obliczoną masą cząsteczkową 48,1 kDa.

Poszukiwanie homologii w bankach danych EMBL białek i DNA wykazało podobieństwa z opisaną po raz pierwszy w tym zgłoszeniu sekwencją deacetylazy N-acetylo-PPT z Comamonas acidovorans (37,4% identycznych aminokwasów), hydrolazy hipuranowej z Campylobacter jejuni (33,9%) i N-acetylo-L-amidohydrolazy z Bacillus stearothermophilus (33,7%). Dalej gen wyizolowany ze Stenotrophomonas będzie określany jako deac1. Ze względu na homologię można założyć, że także wymienione hydrolazy hipuranowe i amidohydrolazy w połączeniu ze specyficznymi tkankowo promotorami i po dalszej obróbce korzystnie mogą być wykorzystane do przygotowania roślin z tkankami, które można selektywnie niszczyć, szczególnie roślin męsko- i/lub żeńskosterylnych.

Przykład 3:

Charakterystyka białka Deac-1

W celu nadekspresji i oczyszczenia deacetylazy ze Stenotrophommonas sp. (deac1) zastosowano system fuzji genowej z S-transferazą glutationu firmy Pharmacia (Nr Katalogu 27-4581-01, Nr katalogu 27-4570-01). Metoda opisana jest w Smith i Johnson, 1988, Gene 67:31. Oczyszczanie fuzji białkowej przeprowadza się za pomocą chromatografii powinowactwa na glutationylo-Sepharose-4B.

Funkcjonalny gen deac przeklonowano do wektora fuzyjnego GST pGEX-4T-2 pod kontrolą promotora lać. Ekspresję zrekombinowanego białka fuzyjnego indukowano przez dodanie 0,1 mM IPTG. Białko fuzyjne jako prążek o wielkości 74 kDa można było wykazać w surowych ekstraktach transformantów E. coli za pomocą elektroforezy SDS/poliakryloamid.

W celu oczyszczania białek komórki pochodzące z 2 l kultury indukowanej dodatniej pod względem ekspresji transformanta E. coli otwierano za pomocą ultradźwięków i następnie rozpuszczano ekstrakt przez dodanie 1% Tritonu X 100. Supernatant wiązano z glutationylo-4B-Sepharose. Po wielokrotnym płukaniu buforem PBS (140 mM NaCl, 3 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4 pH= 7,3) rozszczepiano związane z macierzą Sepharose białko fuzyjne za pomocą trombiny. Eluat zawierał jako jedyny prążek białka produkt rozszczepienia o wielkości 48 kDa (po denaturującej elektroforezie SDS/poliakryloamid), który w oznaczeniu enzymatycznym (patrz poniżej) można było zidentyfikować jako deacetylazę N-acetylo-PPT. Za pomocą opisanej metody udało się oczyścić 200 mg białka deacetylazy do homogenności.

Aktywność białka deacetylazy mierzono za pomocą dwóch następujących oznaczeń:

(1) Test radioaktywny: po 2,5 mg oczyszczonego enzymu inkubowano w porcjach po 10 ml w buforze PBS z 0,1 mM [¹⁴C]-N-acetylo-L-PPT przez 15 minut w 37°C. Następnie próbki rozcieńczano 1:6 w 5 mM K2HPO4, 10% metanolu, pH = 1,92 i analizowano w HPLC z detektorem radioaktywności (ko6

PL 193 522 B1 lumna do rozdziału: Spherisorb SAX; roztwór do rozwijania 5 mM KH2PO4, 10% metanol, pH 1,92. 14 14

Tempo przepływu: 0,5 ml/min. W tych warunkach [¹⁴C]-L-PPT eluuje się przy 4,5 min. i [¹⁴C]-N14

-acetylo-L-PPT przy 6,5 min. Specyficzne aktywności deacetylazy podawano w [¹⁴C]-N-acetylo-L-PPT/min/mg białka. W celu ustalenia optimum pH przyrządzono próbki w układzie buforującym z40mM Bis-Tris, Tris i Caps między pH 6 i 9. Dla oznaczenia wartości Km trzykrotnie prowadzono 14 oznaczenia z [¹⁴C]-N-acetylo-L-PPT między 0,01 mM i 1 mM przy pH 8,0 w obecności 1 mM CoCl2.

(2) Test nieradioaktywny: W celu badania specyficzności substratowej po 5 mg oczyszczonego enzymu w próbkach po 20 ml w buforze PBS zawierającym 25 mM określonego N-acetylo lub N-acyloaminokwasu inkubowano przez 60 minut w 28°C. Następnie w próbkach mierzono wytwarzanie wolnych aminokwasów w analizatorze aminokwasów (Biotronic LC 5001). Specyficzne aktywności podano w nmolach aminokwasów/min/mg białka. Dla deacetylazy N-acetylo-PPT ustalono optimum pH = 8 (patrz Tabela 1) i optimum temperatury 37°C (p. Tabela 2). Kinetyczne pomiary dały wartość Km 670 mM. Przez dodatek 1 mM CoCl2 udało się podwyższyć aktywność enzymatyczną o 20%.

Tabela 1 Optimum pH deacetylazy N-acetylo-PPT
wartość pH	aktywność specyficzna [mol/min/mg białka]
6	2,4
7	7,2
8	12,0
9	8,5

Tabela 2 OptimumtemperaturydeacetylazyN-acetylo-PPT
temperatura [°C]	aktywność specyficzna [mol/min/mg białka]
28	9,6
37	16,8
50	14,9
60	4,3

Wyniki pomiarów specyficzności substratowej są podane w tabeli 3.

Enzym posiada stosunkowo szerokie spektrum substratowe. Najwyższe przetwarzanie stwierdzono z kwasem hipurowym (N-benzoilo-glicyna) i N-acetylo-L-glutaminianem. Powinowactwo w stosunku do N-acetylo-L-PPT wynosi około 50% poziomu stwierdzonego dla obu wymienionych substratów. Deacetylaza posiada wyłączną specyficzność dla N-acetylo-L-aminokwasów. Dla odpowiednich D-enancjomerów nie udało się zaobserwować żadnych reakcji.

PL 193 522 B1

T ab el a 3

Specyficzność substratowa deacetylazy N-acetylo-PPT

Substrat¹	Względna aktywność [%]
Kwas hipurowy (N-benzoilo-glicyna)	100
N-Ac-fosfinotricyna	43
N-Ac-ornityna	37
N-Ac-metionina	0
N-Ac-tryptofan	0,4
N-Ac-fenyloalaniana	24
N-Ac-tyrozyna	11
kwas N-Ac-glutaminowy	100
N-Ac-glutamina	30
N-Ac-glicyna	59
N-Ac-histydyna	43
N-Ac-leucyna	33
N-Ac-walina	2
N-ac-seryna	4
N-ac-prolina	0

¹ Przy wszystkich wiązaniach chodzi o L-enancjomery ² Aktywność specyficzna mierzona z kwasem hipurowym została określona jako 100% i inne wartości odnoszono do niej

P r zyk ł a d 4: Konstytutywna ekspresja genu deac-1 w tytoniu

Gen struktury deac-1 przeklonowano jako fragment 1,4kb BamHI/Sa1l-PCT do binarnego wektora pPCV801 (Koncz i Schell, 1986, Mol. Gen. Genet. 204: 383-396). Powstały plazmid pPCVK-DEAC (fig. 2) z wektorem ekspresyjnym promotor 35S-gen struktury deac1-terminator 35S wtransformowano za pomocą standardowych metod do Agrobacterium tumefaciens (szczep ATHV). Kawałeczki liści tytoniu (Nicotiana tabacum) transformowano zrekombinowanym Agrobacterium według metody Horsch i wsp., 1985, Science 227:1229-1231 i selekcjonowano na pożywce z kanamycyną, zregnerowano 18 niezależnych transformantów tytoniu i badano w nich ekspresję deacetylazy w liściach. W przypadku aktywności białka w transgenicznych roślinach należało liczyć się z wrażliwością liści na N-acetylo-PPT, jako że związek jest w roślinie przerabiany na działający jako herbicyd związek czynny fosfinotricynę.

W próbie kroplowej liście transgenicznych roślin jaki szeregu nietransgenicznych roślin kontrolnych traktowano po 5 ml następujących stężeń N-acetylo-D,L-PPT: 4 mg/ml (= 15 mM), 1 mg/ml (= 3,75 mM), 0,4 mg/ml (= 1,5 mM), 0,1 mg/ml (=0,38 mM). Miejsca traktowane badano po 1-2 tygodniach sprawdzając rozjaśnienie lub tworzenie nekrozy. Równocześnie mierzono aktywność deacetylazy specyficznej w stosunku do PPT w transformantach jak i roślinach kontrolnych w surowych ekstraktach. W tym celu homogenizowano po 100 mg materiału liści w 200 ml buforu PBS, odwirowano resztki komórek i dializowano zawierające białka supernatanty przez noc w 4°C. Po 10 ml tych próbek 14 inkubowano 37°C przez noc z 0,1 mM [¹⁴C]-N-acetylo-L-PPT. Próbki następnie analizowano w HPLC 14 jak opisano powyżej z badaniem wytwarzania [¹⁴-C]-L-PPT.

Wyniki badań prób kropli i testu aktywności podano dla wybranych roślin w Tabeli 4. Okazało się, że około 60% transformantów eksprymuje funkcjonalne białko deacetylazy i wyrażają odpowiedni fenotyp.

PL 193 522 B1

Tabel a 4

Wrażliwość roślin pPCVKDEAC1 na N-acetylo-PPT i aktywność deacetylazy w surowych ekstraktach

Rośliny	Próba kroplowa z: Aktywność DEAC w surowym ekstrakcie N-Ac-D,L-PPT
4mg/ml	1mg/	0,4mg/ml	0	1 mg/ml[%L-PPT]¹
	Obserwacje (liście)
Kontrola		-	-	-	-	0
pPCVK9		+++	+	-	-	14,2
pPCVK14	zwiędły	+	+	-	-	12,1
pPCVK15	zwiędły	++	+	+	-	36,0
pPCVK16	zwiędły	+	+	-	-	4,7
pPCVK16	zwiędły	+	+	-	-	4,3

¹ w stosunku do wprowadzonej radioaktywności [¹⁴C]-N-acetylo-L-PPT) + + +: silna nekroza ++ : wyraźne uszkodzenia +: słabe rozjaśnienie

-: brak objawów

P r zyk ł a d 5: Specyficzna w stosunku do tapetum ekspresja genu deac-1 u tytoniu

Za pomocą standardowych metod połączono specyficzny w stosunku do tapetum promotor genu tap-1 z lwiej paszczy (Antirrhinum majus) jako fragment 2,2 kb EcoRI/BamHI z genem struktury deac-1 (fragment PCR 1,4 kb BamHI/Sa1l) i terminatorem 35S w wektorze pUC18. W ten sposób powstałą kasetę ekspresyjną promotor tap-1-gen struktury deac-terminator 35S wklonowano jako fragment 3,8 kb EcoRI w miejsce regionu promotor 35S/terminator 35S w wektorze binarnym pPCV801 (plazmid pPCVTDEAC1, fig. 3). Transformację tytoniu przeprowadzono jak opisano w Przykładzie 4.

Przy ekspresji deacetylazy specyficznej w stosunku do tapetum powinny po traktowaniu pączków kwiatów N-acetylo-PPT powstawać męskosterylne kwiaty. Przekształcenie pochodnej PPT w czynny związek herbicydu fosfinotricynę prowadzi do selektywnego uszkodzenia tkanki tapetum, przez co zahamowane jest wytwarzanie funkcjonalnego pyłku.

Tylko jeden bok kwiatostanu (całego obszaru tworzących się pąków kwiatowych) traktowano N-acetylo-PPT, druga połowa kwiatostanów nie była traktowana aby upewnić się, że obserwowane zjawiska nie są wynikiem zniekształceń roślin. Traktowanie przeprowadzano w momencie, w którym pojedyncze pąki nie były większe od 5 mM (faza czynna promotora tapetum). Trans-formanty tytoniu jaki szereg roślin kontrolnych NT Sam NN w ciągu tygodnia poddawano 3x działaniu 0,2% N-acetylo-D,L-PPT (7,5 mM)/0,1% Genapol (środek sieciujący). Po zakwitnięciu pąków (ok. 9-11 dni po zakończeniu traktowania) badano rośliny pod kątem występowania męskosterylnych kwiatów.

Równocześnie badano specyficzną w stosunku do N-acetylo-PPT aktywność deacetylazy w niedojrzałych pylnikach transformantów jak i w roślinach kontrolnych. W tym celu niedojrzałe pylniki preparowano z pąków kwiatowych o wielkości około 5 mM i inkubowano przez noc każdy w 50 mM 14 roztworze [¹⁴C]-N-acetylo-L-PPT. Następnie pylniki płukano w1 x 500 ml buforu PBSi homogenizowano w 50 ml buforu PBS. Po odwirowaniu resztek komórek supernatanty zatężono w Speed-Vac a osady podnoszono w 30 ml buforu HPLC (5 mM KH2PO4, 10% metanol, pH = 1,92). Próbki analizowano w HPLC jak opisano powyżej pod kątem wytwarzania [¹⁴C]-L-PPT.

Wyniki traktowania kwiatów i testu aktywności podano dla wybranych roślin w Tabeli 5. U prawie wszystkich transformantów udało się stwierdzić obecność specyficznej w stosunku do pylników aktywności deacetylazy. W 3 transformantach ze strony traktowanej N-acetylo-PPT w gronach kwiatów kwiaty męskie stawały się męskosterylne tzn. nie tworzył się pyłek lub też obserwowano kwiaty o znacznie zmniejszonej ilości pyłku. Działanie na nowe, dojrzewające pąki pozostawało przez okres około trzech tygodni. Nietraktowane kwiaty transformantów jak i traktowane kwiaty roślin kontrolnych były we wszystkich wypadkach płodne. W męskosterylnych kwiatach nie stwierdzono powstawania plemników. Było jednak możliwe zapłodnienie krzyżowe męskosterylnych kwiatów, przez co wykazaPL 193 522 B1 no, że żeńskie części kwiatów w pełni zachowały swoją funkcjonalność (Nacken i wsp., 1991, Mol. Gen. Genet. 229:129-136).

Tabela 5

Indukowana męska sterylność u roślin pPCVTDEAC1 przez traktowanie kwiatów N-acetylo-PPT iaktywnośćdeacetylazywpylnikach

Roślina	Liczba kwiatów sterylnych lub o kwiatach ze zmniejszoną ilością pyłku	Aktywność deacetylazy w pylnikach [% L-PpT]¹
	traktowane	nietraktowane
Kontrola	0	0	0
pPCVT14	18	0	70,0
pPCVT15	0	0	13,8
pPCVT16	10	0	20,4

¹ W stosunku do wprowadzonej aktywności ([¹⁴C]-N-acetylo-L-PPT)

Przykład 6:

Izolacja i identyfikacja deacetylazy ze specyficznością w stosunku do N-acetylo-fosfinotricyny z Comamonas acidovorans

Próbkę gleby z Bangkoku rozprowadzono w pożywce z soli mineralnych (0,5 g K2HPO4, 0,2 g MgSO4, 2 g (NH4)2SO4, 0,01 g FeSO4 w 980 ml H2O), która zawierała chitynę (2 g/l) jako jedyne źródło węgla i następnie inkubowano w 30°C przez 48 godzin. Następnie przeprowadzono przeszczepienie do świeżej pożywki z solami mineralnymi i po kolejnych 48 godzinach inkubacji wysiewano szeregi rozcieńczeń na pożywce LB (Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Wśród rosnących kolonii znalazły się też kolonie szczepu bakterii, który się wyróżniał bardzo dobrym wykorzystaniem N-acetylo-glutaminianu jako jedynego źródła węgla (wysianie na pożywkę minimalną z solami mineralnymi z N-acetylo-glutaminianem (2 g/l, dodawać jako sterylizowany przez filtrowanie roztwór do autoklawowanej pożywki minimalnej z 14 g/l agaru) prowadzi w czasie inkubacji przez 12 godzin w 30°C do tworzenia wyraźnie widocznych kolonii). Deacetylację N-acetylo-PPT wykazano jak opisano powyżej. Szczep określony w laboratorium jako B6 został zidentyfikowany przez DSM jako Comamonas acidovorans (DSM 11070).

Przykład 7:

Klonowanie genu deacetylazy Comamonas acidovorans

Izolowano całkowity DNA z Comamonas acidovorans, strawiono EcoRI i zligowano ze strawionym EcoRI DNA wektora pA-CYC184 (Cang i Cohen, J. Bacteriol. 134, 1141-1156). Mieszaninę ligacyjną wykorzystano do elektroporacji mutanta argE E. coli XSID2 (Mountain i wsp., 1984, Mol. Gen. Genet. 187, 82-89). Poprzez selekcję na komplementację auksotrofa argininowego udało się wyizolować fragment EcoRI o wielkości 8,9 kb z genomu C. acidovorans, który wystarcza do komplementacji. Poprzez subklonowanie możliwe było ograniczenie obszaru komplementującego do wielkości 1,4 kb. Leżyonw określonej jako pGK83 pochodnej wektora do sekwencjonowania pSVB30 (Arnold i Puehler, 1989, Gene 70, 172-173).

Przykład 8:

Sekwencjonowanie genu deacetylazy z Comamonas acidovorans

Komplementujący fragment 1,4 kb (1387 par zasad) zsekwencjonowano całkowicie z obu nici stosując znane metody.

Przykład 9.

Analiza obszaru kodującego i porównanie homologii sekwencjonowanego obszaru

Analiza obszaru kodującego pokazała otwartą ramkę odczytu od pozycji 1 do 1206 (SEK NR ID 3), która koduje białko o wielkości 402 aminokwasów (SEK NR ID 4).

Porównanie homologii ze znanymi genami z baz danych wykazuje wyraźną homologię do N-acyloamidohydrolazy z Bacillus stearothermophilus (ama, Sakanyan i wsp., 1993, Appl. Environ. Microbiol. 59, 3878-3888) i hydrolazy hipuranowej z Campylobacter jejuni (dotychczas nieopublikowanej). W porównaniu białek hydrolaza hipuranowa wykazuje 43% identycznych aminokwasów (Tabela

PL 193 522 B1

6). Ponadto gen wykazuje na poziomie DNA i białka bardzo wyraźną homologię do genu deacetylazy wyizolowanego ze Stenotrophomonas sp. W oparciu o określenie genu ze Stenotrophomonas gen wyizolowany z C. acidovorans określono jako deac2.

Tabel a 6

Porównanie homologii ze znanymi sekwencjami

Gen	Organizm	funkcja	identyczne aminokwasy	konserwatywne aminokwasy
n. n.	Campylobacter jejuni	hydrolaza hipuranowa (383 AS)	43,1%	60,0%
deac2	Bacillus stearothermophilus	N-acylo-L-amidohydrolaza	37,0%	49,5%

P r z y k ł a d 10.

Nadekspresja genu deac2 z Comamonas acidovorans - konstrukty roślinne

W celu analizy specyficzności substratowej produktu genu deac2 z Comamonas acidovorans uzyskano jego nadekspresję. W tym celu wklonowano gen do wektora o wysokiej liczbie kopii pod kontrolą promotora lacz. Jednak ekspresja była ograniczona przez równoczesną, zachodzącą w innej ramce odczytu translację lacz-alfa. Dlatego przerwano ją przez wprowadzenie kodonu stop, aby wektor pGK81 umożliwiał nadekspresję genu deac2, na którą nie miała wpływu ekspresja genu lacz. Można było wykazać także fenotypowo, że ten konstrukt wykazuje wyraźnie silniejszą komplementację mutanta argE E. coli.

W celu transformacji roślin gen struktury deac2 przeklonowano z zastosowaniem wektora binarnego pROK1 (Baulcombe i wsp. 1986, Nature, 321:446-449) za konstytutywnym promotorem 35S lub specyficznym w stosunku do tapetum promotorem TA-29. Uzyskany plazmid ekspresyjny pGK83 i pMF9 przedstawiono na Figurach.

P r z y k ł a d 11:

Badanie specyficzności substratowej produktu genu deac2 z Comamonas acidovorans

W celu zbadania specyficzności substratowej produktu genu deac2 z Comamonas acidovorans zastosowano komórki szczepu E. coli XL1-Blue permeabilizowane za pomocą toluenu/etanolu z i bez wektora pGK81. Permeabilizowane komórki inkubowano przez 3 godziny w 30°C z różnymi N-acetylowanymi aminokwasami (stężenie końcowe 25 mM) i badano supernatanty za pomocą analizatora aminokwasów. Okazało się, że ponad 20% dostarczonej N-acetyloornityny było przekształcane. Także dla N-acetylofosfinotricyny dała się wykazać wzrastająca deacetylacja do fosfinotricyny zależna od stężenia wprowadzonej N-acetylofosfinotricyny (Tabela 7)

T a b e l a 7

N-acetyloornityna (25 mM)	N-acetylofenyloalanina (25 mM)	N-acetylofosfinotricyna
(12,5 mM)	(25mM)	(50 mM)
5860 nM	<5 nM	8,0 nM	20,0 nm	44,7 nM

Podano stężenia wprowadzonych N-acetyloaminokwasów i powstałych przez acetylację aminokwasów

Figura 1. Mapa restrykcyjna fragmentu 2,5 kb SalI/BamHI, który jest odpowiedzialny za specyficzną aktywność deacetylazy N-acetylo-PPT. Pozycja i orientacja genu struktury deac1 są zaznaczone za pomocą strzałki (bp - pary zasad)

Figura 2 Mapa plazmidu pPVCKDEAC1 do konstytutywnej ekspresji genu deac u roślin

Figura 3 Mapa plazmidu pPCVTDEAC1 do specyficznej w stosunku do tapeteum ekspresji genu deac u roślin

Figura 4 Mapa plazmidu pGK83

Figura 5 Mapa plazmidu pMF9

PL 193 522 B1

Traktat budapeszteński o międzynarodowym uznawaniu depozytu drobnoustrojów dla celów postępowania patentowego

Formularz międzynarodowy

Hoechst Schering Agravo GmbH

Forschung Biochemie H 672N

65926 Frankfurt/Main

Potwierdzenie otrzymania przy pierwszym depozycie wydane według par. 7 przez podane poniżej międzynarodowy organ depozytowy

I. Opis mikroorganizmu

Oznaczenie podane Oznaczenie podane przez przez deponującego międzynarodowy organ depozytowy

3010 DSM 9734

II. Opis naukowy i/lub proponowane określenie taksonomiczne

Z opisanym podl mikroorgainzmem załączono

() opis naukowy

() proponowane określenie taksonomiczne zaznaczyć co dotyczy

III. Złożenie i przyjęcie

Niniejszy międzynarodowy organ depozytowy przyjmuje podany w I mikroorganizm, który został otrzymany dn. 1995-02-14 (data pierwszego depozytu)

IV. Otrzymanie prośby o przekształcenie

Określony w I mikroorganizm został przyjęty przez niniejszy międzynarodowy organ depozytowy dn. (data pierwszego depozytu) a prośbę o przekształcenie tego depozytu w depozyt według Traktatu Budapeszteńskiego otrzymano w dn. (data otrzymania prośby o przekształcenie)

V. Międzynarodowy organ depozytowy

Nazwa: DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismem und Zellkulturen GmBh Adres: Massenroder Weg 1b D-38124 Braunschweig

Podpis(y) osoby(osób) upoważnionych do reprezentowania międzynarodowego organu depozytowego lub upoważnionego(ych) urzędnika(ów)

Data: 1995-02-21 w której uzyskano status międzynarodowego organu

Jeżeli dotyczy Reguła 6.4.c jest to data, depozytowego

Formularz międzynarodowy Prof. dr A. Puehler Katedra Genetyki Uniwersytet Bielefeld Skrzynka pocztowa 100132 D-33501 Bielefeld

I. Opis mikroorganizmu

B6 DSM 11070

II. Opis naukowy i/lub proponowane określenie taksonomiczne Z opisanym pod I mikroorganizmem załączono () opis naukowy (x) proponowane określenie taksonomiczne zaznaczyć co dotyczy

PL 193 522 B1

III. Wejście i przyjęcie

Niniejszy międzynarodowy organ depozytowy przyjmuje podany w I mikroorganizm, który został otrzymany dn. 1996-07-12 (data pierwszego depozytu)

IV. Otrzymanie prośby o przekształcenie

V. Międzynarodowy organ depozytowy

Nazwa: DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismem und Zellkulturen GmBh

Adres: Massenroder Weg 1b

D-38124 Braunschweig

Data: 1996-07-16

Jeżeli dotyczy Reguła 6.4.c jest to data, w której uzyskano status międzynarodowego organu depozytowego

Protokół sekwencji (1) Informacja ogólna (i) ZGŁASZAJĄCY (A) NAZWA: Hoechst Schering AgrEvo GmbH (B) ULICA: (C) MIEJSCE: Frankfurt (D) LAND: (E) KRAJ: Niemcy (F) KOD POCZTOWY: 65926 (G) TELEFON: 069-305-5596 (H) TELEFAKS: (+69) 357175 (I) TELEX: (ii) TYTUŁ ZGŁOSZENIA: Nowe geny kodujące deacetylazy aminokwasów ze specyficznością w stosunku do N-acetylo-L-fosfinotricyny, ich izolacja i zastosowanie (iii) LICZBA SEKWENCJI: 4 (iv) FORMA CZYTELNA KOMPUTEROWO (A) NOŚNIK DANYCH: dyskietka (B) KOMPUTER: Kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentin Release # 1.0, wersja # 1.25 (EPA) (2) INFORMACJA O SEK NR ID 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 1320 par zasad (B) RODZAJ: Kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (ix) CECHY CHARAKTERYSTYCZNE:

(A) NAZWA/KLUCZ: egzon (B) POŁOŻENIE: 1.. 1320

PL 193 522 B1 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID 1:

ATGATCCGCA	AGACCGTTCT	GTTGACTGCG	CTGTCCTGCG	CCCTGGCCTC	CGCGACAGCC	60
ACCGCCGCCG	AAGGCCAGCG	GCCCGAGGTG	GAGGCCGCCG	CCGCGCGCCT	GCAGCGGCAG	120
GTGGTGGAGT	GGCGCCGCGA	TTTCCACCAG	CATCCGGAGC	TGTCCAACCG	CGAGGTGCGC	180
ACCGCCGCCA	AGGTGGCCGA	GCGCCTGCGC	GCGATGGGCC	TGCAACCGCA	GACCGGCGTC	240
GCCGTGCACG	GCGTGGTGGC	GATCATCAAG	GGCGCCCTGC	CGGGGCCGAA	GATCGCCCTG	300
CGCGCGGACA	TGGACGCGCT	GCCGGTGACC	GAACAGACCG	GGCTGCCGTT	CGCCTCCACC	360
GCCACGGCCG	AGTACCGCGG	CGAGAAGGTC	GGGGTGATGC	ATGCCTGCGG	CCACGACGCC	420
CATACCGCCA	CCCTGCTCGG	CGTGGCCGAC	GCGCTGGTGG	CCATGCGCGA	CACGCTGCCC	480
GGCGAAGTAA	TGCTGATCTT	CCAGCCGGCC	GAGGAAGGCG	CGCCGCCGCC	GGAGCAGGGC	540
GGTGCCGAGC	TGATGCTCAA	GGAGGGGCTG	TTCAAGGAGT	TCAAGCCGGA	GGCGGTGTTC	600
GGCCTGCACG	TGTTCTCCAG	CGTCCAGGCC	GGGCAGATCG	CCGTGCGCGG	CGGCCCGCTG	660
ATGGCCGCCT	CCGACCGCTT	CGCCATCACC	GTCAACGGCC	GCCAGACCCA	TGGCTCGGCG	720
CCCTGGAACG	GCATCGATCC	GATTGTCGCC	GCCTCCGACC	TGATCGGCAC	CGCGCAGACC	780
ATCGTCAGCC	GCCGCGCCAA	CCTGTCCAAG	CAGCCGGCGG	TGCTGACCTT	CGGCGCGATC	840
AAGGGCGGCA	TCCGCTACAA	CATCATCCCC	GACTCGGTGG	AGATGGTCGG	CACCATCCGC	900
ACCTTCGACC	CGGACATGCG	CAAGCAGATC	TTCGCCGACT	TGCGCAACGT	CGCCGAGCAC	960
ACCGCTGCCG	CGCATGGCGC	CACCGCCACC	ACCGACATCT	ACGAGAAGGA	CGGCAACCCG	1020
GCCACGGTCA	ACGACCCGGC	GCTGACCGCG	CGCATGCTGC	CCAGCCTGCA	GGCCGTGGTC	1080
GGCAAGGACA	ACGTCTACGA	GCCGCCGCTG	CAGATOGGCT	CGGAGGACTT	CTCGCTGTAT	1140
GCGCAGCAGG	TGCCGGCGAT	GTTCTTCTTC	GTCGGCTCCA	CCGGCGCGGG	CATCGACCCG	1200
GCCACCGCGC	CCAGCAACCA	CTCGCCGAAG	TTCCTGCTCG	ACGAGAAGGC	GCTGGACGTG	1260
GGCCTGCGCG	CGCTGCTGCA	GGTGTCGCTG	GACTATCTGC	ACGGTGGCAA	GGCGGGGTGA	1320

PL 193 522 B1 (2) INFORMACJA O SEK NR ID 2 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 439 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (ix) CECHY CHARAKTERYSTYCZNE:

(A) NAZWA/KLUCZ: białko (B) POŁOŻENIE: 1...439

	(xi) OPIS	SEKWENCJI:	SEK	NR	ID 2:
Met 1	Ile Arg Lys	Thr Val Leu 5	Leu	Thr	Ala Leu Ser Cys Ala Leu Ala 10 15
Ser	Ala Thr Ala 20	Thr Ala Ala	Glu	Gly 25	Gin Arg Pro Glu Val Glu Ala 30
Ala	Ala Ala Arg 35	Leu Gin Arg	Gin 40	Val	Val Glu Trp Arg Arg Asp Phe 45
His	Gin His Pro 50	Glu Leu Ser 55	Asn	Arg	Glu Val Arg Thr Ala Ala Lys 60
Val 65	Ala Glu Arg	Leu Arg Ala 70	Met	Gly	Leu Gin Pro Gin Thr Gly Val 75 80
Ala	Val His Gly	Val Val Ala 85	Ile	Ile	Lys Gly Ala Leu Pro Gly Pro 90 95
Lys	Ile Ala Leu 100	Arg Ala Asp	Met	Asp 105	Ala Leu Pro Val Thr Glu Gin 110

PL 193 522 B1

Thr Gly	Leu 115	Pro Phe	Ala Ser Thr Ala Thr Ala Glu Tyr	Arg Gly	Glu
120	125
Lya Val	Gly	Val Met	His Ala Cys Gly His Asp Ala	His	Thr Ala	Thr
130			135 140
Leu Leu	Gly	Val Ala	Asp Ala Leu Val Ala Met Arg	Asp	Thr Leu	Pro
145			150 155			160
Gly Glu	Val	Met Leu	Ile Phe Gin Pro Ala Glu Glu	Gly	Ala Pro	Pro
		165	170		175
Pro Glu	Gin	Gly Gly	Ala Glu Leu Met Leu Lys Glu	Gly	Leu Phe	Lys
		180	185		190
Glu Phe	Lys	Pro Glu	Ala Val Phe Gly Leu His Val	Phe	Ser Ser	Val
	195		200	205
Gin Ala	Gly	Gin Ile	Ala Val Arg Gly Gly Pro Leu	Met	Ala Ala	Ser
210			215 220
Asp Arg	Phe	Ala Ile	Thr Val Asn Gly Arg Gin Thr	His	Gly Ser	Ala
225			230 235			240
Pro Trp	Asn	Gly Ile	Asp Pro Ile Val Ala Ala Ser	Asp	Leu Ile	Gly
		245	250		255
Thr Ala	Gin	Thr Ile	Val Ser Arg Arg Ala Asn Leu	Ser	Lys Gin	Pro
		260	265		270
Ala Val	Leu	Thr Phe	Gly Ala Ile Lys Gly Gly Ile	Arg	Tyr Asn	Ile
	275		280	2B5
Ile Pro	Asp	Ser Val	Glu Met Val Gly Thr Ile Arg	Thr	Phe Asp	Pro
290			295 300
Asp Met	Arg	Lys Gin	Ile Phe Ala Asp Leu Arg Asn	Val	Ala Glu	His
305			310 315			320
Thr Ala	Ala	Ala His	Gly Ala Thr Ala Thr Thr Asp :	Ile Tyr Glu Lys
		325	330		335
Asp Gly Asn	Pro Ala	Thr Val Asn Asp Pro Ala Leu Thr Ala Arg Met
		340	345	350

PL 193 522 B1

Leu

Pro

Ser 355

Leu

Gin

Ala

Val

Val 360

Gly

Lys

Asp Asn

Val 365

Tyr

Glu

Pro

Leu 370

Gin

Met

Gly

Ser

Glu 375

Asp

Phe

Ser

Leu

Tyr 380

Ala

Gin

val

Pro 385

Ala

Met

Phe

Phe 390

Val

Gly

Ser

Thr

Gly 395

Ala

Gly

Ile

Asp

Pro 400

Ala

Thr

Ala

Pro

Ser 405

Asn

His

Ser

Pro

Lys 410

Phe

Leu

Asp

Glu 415

Lys

Ala

Leu

Asp

Val 420

Gly

Leu

Arg

Ala

Leu 425

Leu

Gin

Val

Ser

Leu 430

Asp

Tyr

Leu

His

Gly 435

Gly

Lys

Ala

Gly

Arg

Lys

Asp

Leu

Pro

450

(2) INFORMACJA 0

SEK NR

ID

3

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 1273 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (ix) CECHY CHARAKTERYSTYCZNE:

(A) NAZWA/KLUCZ: egzon (B) POŁOŻENIE: 1...1273 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID 3:

ATGGCCTTGC	TGCAGGAGCT	GCTGGACAGC	GCACCCGAGA	TCACCGCGCT	GCGCCGCGAC	60
ATACATGCCC	ATCCCGAACT	GTGCTTCGAG	GAACTGCGCA	CCGCCOACCT	GGTGGCCCGG	120
CAGCTCGAAG	GCTGGGGCAT	TGCCGTGCAC	CGCGGCCTGG	GCCGCACGGG	CGTGGTGGGC	180

PL 193 522 B1

ACCATCCACG	GCCGTGACGG	CGGCGCCAGC	GGCCGGGCCA	TCGGGCTGCG	CGCCGACATG	240
GACGCCCTGC	CCATGCAGGA	GTTCAACACC	TTCGAGCACG	CCAGCCGCCA	CGCCGGAAAA	300
ATGCATGCCT	GCGGACATGA	CGGCCATGTC	GCCATGCTGC	TGGCCGCCGC	GCAGTACCTG	360
GCCGTGCACC	GCGACAGCTT	CGAGGGCACG	GTGCACCTGA	TCTTCCAGCC	GGCCGAAGAG	420
GGCGGCGGCG	GGGCGCGCGA	GATGGTCGAG	GACGGCCTGT	TCACCCAGTT	CCCCATGCAG	480
GCCGTGTTCG	GCATGCACAA	CTGGCCGGGC	ATGAAGGCCG	GCACCATGCC	GTGGGCCCCG	540
GGCCCGGCCA	TGGCGTCGAG	CAACGAGTTC	CGCATCGTCG	TGCGCGGCAA	GGGCGGCCAC	600

GCGGCCATGC	CGCACATGGT	GATCGACCCG	CTGCCCGTGG	CGGCCCAGCT	CATCCTGGGC	660
CTGCAGACCA	TCGTCAGCCG	CAACGTCAAG	CCCATCGAGG	CGGGCGTGGT	CTCGGTCACC	720
ATGGTCCATG	CGGGCGAGGC	CACGAACGTG	GTGCCCGACA	GCGTGGAGCT	GCAGGGCACG	780
GTGCGCACCT	TCACGCTGGA	GGTGCTGGAC	CTGATCGAGC	GGCGCATGAA	GGCCCTGGCC	840
GAGAGCATCT	GCGCGGCGCA	TGACACGCGC	TGCGAGTTCG	AGTTCGTGCG	CAACTACCCG	900
CCCACCATCA	ACTCCGCCCC	GGAGGCCGAG	TTCGCACGCC	GCGTCATGGC	CGAGGTCGTG	960
GGCGAGGCCA	ACGTGCTGCC	CCAGGAGCCG	TCCATGGGCG	CCGAGGACTT	CGCCTTCATG	1020
CTGCTGGAAA	AGCCCGGCGC	CTACTGCTTC	ATCGCCAATG	GCGACGGCGA	CCACCGCGCC	1080
ATCGGCCACG	GCGGCGGTCC	CTGCACGCTG	CACAACCCCA	GCTACGACTT	CAACGACCAG	1140
CTGATTCCGC	AGGGCGCCAC	GTTCTGGGTG	AAGCTGGCCC	agcgctggct	GAGCGAGCCC	1200
ACGCGCTGAG	GCCTTGCGGG	GTCCGGCCGA	CACCGGCATG	TCACACACCG	CACCTAGCAT	1260
GCGGTCCCTG	TGA					1273

PL 193 522 B1 (2) INFORMACJA O SEK NR ID 4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 402 aminokwasów (B, RODZAJ: aminokwasy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (ix) CECHY CHARAKTERYSTYCZNE:

(A) NAZWA/KLUCZ: białko (B) POŁOŻENIE: 1...402 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK NR ID 4:

Met 1

Ala

Leu

Gin 5

Glu

Leu

Asp

Ser 10

Ala

Pro

Glu

Ile

Thr 15'

Ala

Leu

Arg

Asp 20

, Ile

His

Ala

His

Pro 25

GlU

Leu

Cys

Phe

Glu 30

Glu

Leu

Arg

Thr

Ala 35

Asp

Leu

Val

Ala

Arg 40

Gin

Leu

Glu

Gly

Trp 45

Gly

Ile

Ala

Val

His

Arg

Gly

Leu

Gly

Arg

Thr

Gly

Val

Gly

Thr

Ile

His

Gly

55 60

Arg Asp Gly Gly Ala Ser Gly Arg Ala Ile Gly Leu Arg Ala Asp Met 65 70 75 80

Asp

Ala

Leu

Pro

Met 85

Gin

Glu

Phe

Asn

Thr 90

Phe

Glu

His

Ala

Ser 95

Arg

His

Ala

Gly

Lys 100

Met

His

Ala

cys

Gly 105

His

Asp

Gly

His

Val 110

Ala

Met

Leu

Ala 115

Ala

Gin

Tyr

Leu 120

Ala

Val

His

Arg

Asp 125

Ser

Phe

Glu

Gly

Thr 130

Val

His

Leu

Ile

Phe 135

Gin

Pro

Ala

Glu

Glu 14 0

Gly Gly

Gly

PL 193 522 B1

Ala 145

Arg

Glu

Met

Val

Glu ISO

Asp

Gly

Leu

Phe

Thr 155

Gin

Phe

Pro

Met

Gin 160

Ala

Val

Phe

Gly

Met 165

His

Asn

Trp

Pro

Gly 170

Met

Lys

Ala

Gly

Thr 175

Met

Pro

Trp

Ala

Pro 180

Gly

Pro

Ala

Met

Ala 185

Ser

Asn

Glu

Phe 190

Arg

Ile

Val

Arg 195

Gly

Lys

Gly

His 200

Ala

Met

Pro

His 205

Met

Val

Ile

Asp

Pro 210

Leu

Pro

Val

Ala

Ala 215

Gin

Leu

Ile

Leu

Gly 220

Leu

Glh

Thr

Ile

Val

Ser

Arg

Asn

Val

Lys

Pro

Ile

Glu

Ala

Gly

Val

Ser

Val

Thr

225 230 235 240

Met Val His Ala Gly Glu Ala Thr Asn Val Val Pro Asp Ser Val Glu 245 250 255

Leu Gin Gly Thr Val Arg Thr Phe Thr Leu Glu Val Leu Asp Leu Ile 260 265 270

Olu Arg Arg Met Lys Ala Leu Ala Glu Ser Ile Cys Ala Ala His Asp 275 280 285

Thr Arg Cys Glu Phe Glu Phe Val Arg Asn Tyr Pro Pro Thr Ile Asn 290 295 300

Ser Ala Pro Glu Ala Glu Phe Ala Arg Arg Val Met Ala Glu Val Val

305 310 315 320

Gly Glu Ala Asn Val Leu Pro Gin Glu Pro Ser Met Gly Ala Glu Asp

325 330 ' 335

Phe Ala Phe Met Leu Leu Glu Lys Pro Gly Ala Tyr Cys Phe Ile Ala 340 345 350

Asn Gly Asp Gly Asp His Arg Ala Ile Gly His Gly Gly Gly Pro Cys 355 360 365

Thr Leu His Asn Pro Ser Tyr Asp Phe Asn Asp Gin Leu Ile Pro Gin 370 375 380

Gly Ala Thr Phe Trp Val Lys Leu Ala Gin Arg Trp Leu Ser Glu Pro 385 390 395 400

Thr Arg

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Cząsteczka DNA pochodząca z Stenotrophomonas sp., który jest zdeponowany pod nr. DSM 9734, znamienna tym, że koduje białko o aktywności biologicznej deacetylazy N-acetylo-fosfinotricyny.
2. Cząsteczka DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że koduje białko obejmujące sekwencję aminokwasową o Id. Sekw. Nr 2 lub fragmenty tego białka posiadające aktywność biologiczną deacetylazy N-acetylo-fosfinotricyny.
3. Cząsteczka DNA według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że obejmuje sekwencję nukleotydową o Id. Sekw. Nr 1 lub sekwencję, która różni się od tej sekwencji ze względu na degenerację kodu genetycznego.
4. Białko kodowane przez cząsteczkę DNA określoną w zastrz. 1.
5. Mikroorganizm Stenotrophomonas sp zdeponowany pod numerem DSM 9734.
6. Sposób wytwarzania roślin mających wybiórczo zniszczalne części, znamienny tym, że obejmuje:

a) transformowanie komórek roślinnych genem deacetylazy N-acetylo-fosfinotricyny obejmującym cząsteczkę DNA określoną w zastrz. 1, pod kontrolą promotora kierującego ekspresją w specyficznych częściach roślinnych, i

b) regenerowanie roślin z komórek roślinnych otrzymanych w etapie (a), przy czym rośliny te mają części, które mogą być wybiórczo zniszczone po potraktowaniu N-acetylo-fosfinotricyną (N-acetyl-PPT).
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że specyficzna ekspresja genu deacetylazy N-acetylo-fosfinotricyny jest pod kontrolą promotora specyficznego dla warstwy wyścielającej.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że promotor specyficzny dla warstwy wyścielającej jest promotorem genu tap1 z Antirrhinum majus.
9. Rośliny transformowane genem deacetylazy N-acetylofosfinotricyny obejmującym cząsteczkę DNA określoną w zastrz. 1, będącą pod kontrolą promotora specyficznego dla ekspresji w określonych częściach roślin, w których to roślinach specyficzne części roślin mogą być wybiórczo zniszczone po potraktowaniu N-acetylo-fosfinotricyną (N-acetyl-PPT).