PL193818B1

PL193818B1 - Sposób wytwarzania lipidów zawierających kwas dokozaheksaenowy i/lub kwas dokozapentaenowy,komórki mikroorganizmu Ulkenia, ekstrakt lipidowy, dodatkiodżywcze dla ludzi i zwierząt oraz zastosowanie mikroorganizmu jako dodatków odżywczych

Info

Publication number: PL193818B1
Application number: PL97331326A
Authority: PL
Inventors: Satohiro Tanaka; Toshiaki Yaguchi; Sakayu Shimizu; Tsutomu Sogo; Shigeaki Fujikawa
Original assignee: Nagase & Co Ltd; Nagase Chemtex Corp; Suntory Ltd
Priority date: 1996-07-23
Filing date: 1997-06-06
Publication date: 2007-03-30
Also published as: DE69737063T2; AU723553C; NO990270D0; CZ299658B6; JP2000513575A; EP2213750A1; EP0935667A1; WO1998003671A1; EP0935667B1; EE9900026A; HUP9903703A3; ES2281913T3; EP1785492A3; NO990270L; TR199900130T2; PT935667E; DE69737063D1; DK0935667T3; NO323173B1; EP1785492A2

Abstract

1. Sposób wytwarzania lipidów zawierajacych kwas dokozaheksanowy i/lub kwas dokozapen- taenowy, znamienny tym, ze obejmuje hodowanie w pozywce mikroorganizmu nalezacego do rodzaju Ulkenia zdolnego do wytwarza- nia lipidów zawierajacych kwas dokozaheksaenowy i/lub kwas dokozapentaenowy i odzyskiwanie lipidów z hodowli. PL PL PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania lipidów zawierających kwas dokozaheksaenowy (określany dalej także jako DHA) i/lub kwas dokozapentaenowy (określany dalej także jako DPA) metodą hodowania mikroorganizmu, a także sposób wytwarzania DHA i/lub DPA z lipidów. Wynalazek dotyczy ponadto mikroorganizmu należącego do rodzaju Ulkenia, posiadającego zdolność wytwarzania lipidów oraz ekstraktu lipidowego, dodatków odżywczych dla ludzi i zwierząt oraz zastosowania mikroorganizmu jako dodatków odżywczych.

DHA stanowi składnik oleju ryb należących do grupy ryb błękitnych. W szczególności DHA wchodzi w skład oleju sardynek i tuńczyków, przy czym jego zawartość wynosi około 20%.

Ostatnio, dzięki odkryciu źródeł surowca pochodzącego z ryb o wysokiej zawartości DHA, ciała tłuszczowego oczodołu tuńczyka, oraz dzięki postępowi w technologii wytwarzania wysoko oczyszczonych kwasów tłuszczowych, wkłada się dużo wysiłku w wyjaśnienie funkcji fizjologicznych DHA oraz zbadanie jego praktycznego zastosowania. Okazało się, że funkcje fizjologiczne DHA obejmują działanie obniżające poziom cholesterolu, antykoagulacyjne i hamujące rozwój raka. W przypadku przemian metabolicznych w mózgu stwierdzono, że DHA skutecznie wpływa na poprawę pamięci i zdolności uczenia się, zapobiega demencji starczej i działa leczniczo w terapii choroby Alzheimera. Ponadto zostało udowodnione, że DHA stanowi kwas tłuszczowy niezbędny dla wzrostu narybku. Z wymienionych powodów, DHA stosuje się w różnej żywności, karmie i przynętach.

Również DPA znany jest jako składnik oleju ryb, jakkolwiek zawartość jego jest niezwykle niska. Funkcje fizjologiczne DPA w zasadzie ciągle pozostają nieznane. Jedyną poznaną funkcję DPA stanowi jego przydatność jako nośnika przenoszącego środki farmakologiczne do mózgu [Publikacja japońskiego opisu patentowego (Kokai) nr 61-204136 (1986)]. Należy przypuszczać, że DPA może odgrywać rolę fizjologiczną w organizmie zwierząt ze względu na znane zjawisko wzrostu ilości DPA w organizmie kompensującego niedobór DHA [Homayoun i in., J.Neurochem., 51:45 (1988); Hamm i in., Biochem.J., 245:907 (1987) oraz Rebhung i in., Biosci. Biotech. Biochem., 58:314 (1994)].

Uzyskanie DHA i/lub DPA z oleju ryb jest obarczone licznymi niedogodnościami, takimi jak niskie stężenie pożądanych kwasów tłuszczowych, niemożliwość zapewnienia stabilnego źródła oleju ryb ze względu na migrację ryb oraz nieodłączny dla oleju z ryb intensywny zapach. Ponadto trudność sprawia uzyskanie lipidów o wiarygodnej jakości, ponieważ w skład oleju z ryb dodatkowo wchodzą nienasycone kwasy tłuszczowe takie jak kwas arachidonowy (ARA) i eikozapentaenowy (EPA), które zwiększają podatność lipidów na utlenianie.

Poza olejem z ryb źródło DHA i/lub DPA mogą stanowić ponadto lipidy zakumulowane w hodowanych komórkach mikroorganizmu posiadającego zdolność wytwarzania DHA i/lub DPA. Na przykład znane są następujące mikroorganizmy wytwarzające DHA i/lub DPA: Vibrio marinus ATCC 15381, bakteria wyizolowana z głębi morza; bakteria Vibrio wyizolowana z wnętrzności ryb głębinowych; grzyby wiciowcowe takie jak Thraustochytrium aureum ATCC 34304, Thraustrochytrium sp. ATCC 28211, ATCC 20890 i ATC 20891, Schizochytrium sp. ATCC 20888 i 20889 (patent Stanów Zjednoczonych nr 5340742), szczep Thraustochytrium SR21 (Nippon Nogei Kagaku Kaishi, vol.69, wydanie dodatkowe, 5 lipca 1995) i Japanochytrium sp. ATCC 28207 (japońska publikacja patentowa (Kokai) nr 1-199588 (1989)]; mikroalgi takie jak Cyclotella Cryptica, Crypthecodinium cohnii (japońska publikacja patentowa (Kohyo) nr 5-503425 (1993)] i Emiliania sp. (japońska publikacja patentowa (Kokai) nr 5-308978 (1993)].

Stosowaniu każdego z wymienionych wyżej mikroorganizmów towarzyszy szereg problemów, takich jak na przykład niska wydajność DHA i/lub DPA, bądź wymagania specyficznej pożywki lub warunków hodowania kultury. W przypadku zastosowania do produkcji alg takich jak Emiliania sp., można uzyskać wysoką wydajność DHA, ale towarzyszy jej niedogodność polegająca na tym, że hodowla jej wymaga światła. Proces ten nie jest przydatny w produkcji przemysłowej.

Obecny wynalazek umożliwia wytwarzanie zarówno DHA i/lub DPA jak i lipidów zawierających DHA i/lub DPA, przy zastosowaniu niedrogiej konwencjonalnej pożywki i prostych etapów wytwarzania, w krótkim czasie i z wysoką wydajnością.

Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania lipidów zawierających DHA i/lub DPA obejmującego hodowlę w pożywce mikroorganizmu należącego do rodzaju Ulkenia, posiadającego zdolność wytwarzania DHA i/lub DPA oraz wyodrębnianie lipidów z hodowli.

PL 193 818 B1

Wynalazek dotyczy ponadto sposobu wytwarzania DHA i/lub DPA obejmującego hodowlę na pożywce mikroorganizmu należącego do rodzaju Ulkenia, posiadającego zdolność wytwarzania DHA i/lub DPA, wyodrębnianie lipidów z hodowli i wydzielanie DHA i/lub DPA z mieszaniny lipidów.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania lipidów zawierających kwas dokozaheksaenowy i/lub kwas dokozapentaenowy, który obejmuje hodowanie w pożywce mikroorganizmu należącego do rodzaju Ulkenia zdolnego do wytwarzania lipidów zawierających kwas dokozaheksaenowy i/lub kwas dokozapentaenowy i odzyskiwanie lipidów z hodowli.

Sposób wytwarzania kwasu dokoheksaenowego i/lub dokozapentaenowego dodatkowo obejmuje oddzielenie kwasu dokozaheksaenowego i/lub dokozapentaenowego od lipidów.

Sposób wytwarzania strukturyzowanych lipidów zawierających kwas dokozaheksaenowy i/lub kwas dokozapentaenowy dodatkowo obejmuje traktowanie lipidów lipazą grzybową, aby przeprowadzić kwasy tłuszczowe w pozycjach 1i 3 w kwasy tłuszczowe o łańcuchu C8-12.

Mikroorganizmem stosowanym w sposobie według wynalazku jest Ulkenia sp. SAM 2179 (FERM BP-5601).

Przedmiotem wynalazku są także komórki szczepu mikroorganizmu Ulkenia sp. SAM 2179 (FERM BP-5601) zawierające lipidy obejmujące obojętne lipidy zawierające 30-38% kwasu palmitynowego, 40-48% kwasu dokozaheksaenowego, 8-13% kwasu dokozapentaenowego, 0-1% kwasu eikozapentaenowego, 0-0,6% kwasu arachidonowego i 10-20% innych kwasów tłuszczowych w procentach wagowych w przeliczeniu na łączną zawartość kwasów tłuszczowych.

Komórki szczepu mikroorganizmu Ulkenia sp. SAM 2179 (FERM BP-5601) zawierają lipidy obejmujące kwas dokozaheksaenowy i/lub kwas dokozapentaenowy, które to komórki obejmują obojętne lipidy zawierające triacyloglicerole składające się tylko z polinienasyconych kwasów tłuszczowych.

W komórkach obojętny lipid zawiera co najmniej 85% wagowych, korzystnie 90% wagowych triacylogliceroli.

Przedmiotem wynalazku jest także szczep Ulkenia sp. SAM 2179 (FERM BP-5601) zdolny do wytwarzania lipidów obejmujących obojętne lipidy zawierające 30-38% kwasu palmitynowego, 40-48% kwasu dokozaheksaenowego, 8-13% kwasu dokozapentaenowego, 0-1% kwasu eikozapentaenowego, 0-0,6% kwasu arachidonowego i 10-20% innych kwasów tłuszczowych w procentach wagowych w przeliczeniu na łączną zawartość kwasów tłuszczowych.

Ekstrakt lipidowy otrzymany z mikroorganizmu należącego do rodzaju Ulkenia sposobem określonym wyżej obejmuje obojętne lipidy zawierające 30-38% kwasu palmitynowego, 40-48% kwasu dokozaheksaenowego, 8-13% kwasu dokozapentaenowego, 0-1% kwasu eikozapentaenowego, 0-0,6% kwasu arachidonowego i 10-20% innych kwasów tłuszczowych w procentach wagowych w przeliczeniu na łączą zawartość kwasów tłuszczowych.

Ekstrakt lipidowy zawiera kwas dokozaheksaenowy i/lub dokozapentaenowy, przy czym ekstrakt lipidowy obejmuje obojętne lipidy zawierające triacyloglicerole składające się tylko z polinienasyconych kwasów tłuszczowych, a obojętny lipid zawiera co najmniej 85% wagowych, korzystnie 90% wagowych triacylogliceroli.

Ekstrakt lipidowy otrzymany z mikroorganizmu należącego do rodzaju Ulkenia zawierający lipidy, które obejmują kwas dokozaheksaenowy i/lub kwas dokozapentaenowy sposobem określonym wyżej obejmuje obojętne lipidy zawierające około 20% triacylogliceroli składających się tylko z polinienasyconych kwasów tłuszczowych.

Preparat strukturalnych lipidów wytworzony jest przez traktowanie ekstraktu lipidowego określonego wyżej lipazą grzybową, aby przeprowadzić kwasy tłuszczowe w pozycjach 1i 3 w kwasy tłuszczowe o łańcuchu C8-12.

Ekstrakt lipidowy lub preparat strukturyzowanych lipidów charakteryzuje się tym, że mikroorganizmem jest szczep Ulkenia sp. SAM 2179 (FERM BP-5601).

Przedmiotem wynalazku są także:

środek odżywczy uzupełniający żywność, zawierający ekstrakt lipidowy określony wyżej; zastępcze sztuczne mleko matki dla niemowląt odpowiednie dla żywienia niemowląt zawierające ekstrakt lipidowy określony wyżej;

zastępcze sztuczne mleko matki dla niemowląt odpowiednie dla żywienia niedojrzałych niemowląt zawierające ekstrakt lipidowy określony wyżej;

żywność dla niemowląt zawierający ekstrakt lipidowy określony wyżej;

żywność dla starych ludzi zawierająca ekstrakt lipidowy określony wyżej;

ekstrakt dojelitowy dla wspomagania żywienia zawierający ekstrakt lipidowy określony wyżej;

PL 193 818 B1 pasza dla zwierząt zawierająca ekstrakt lipidowy określony wyżej lub komórki określone wyżej; dodatek do paszy dla zwierząt zawierający ekstrakt lipidowy określony wyżej lub komórki określone wyżej;

przynęta zooplanktonu dla paszy zawierająca ekstrakt lipidowy określony wyżej lub komórki określone wyżej;

żywność dla spodziewających się dziecka lub karmiących matek zawierająca ekstrakt lipidowy określony wyżej.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie mikroorganizmu należącego do rodzaju Ulkenia posiadającego zdolność do wytwarzania lipidów zawierających kwas dokozaheksaenowy i/lub kwas dokozapentaenowy, korzystnie szczepu Ulkenia sp. SAM 2179 (FERM BP-5601) jako środka odżywczego stanowiącego dodatek uzupełniający żywność;

zastosowanie ekstraktu lipidowego określonego wyżej jako środka odżywczego stanowiącego dodatek uzupełniający żywność;

zastosowanie preparatu strukturyzowanych lipidów określonych wyżej jako środka odżywczego stanowiącego dodatek uzupełniający żywność;

zastosowanie określone wyżej, w którym dodatek żywności wprowadzony jest do produktu żywnościowego dla spodziewających się dziecka i karmiących matek, niemowląt, niedojrzałych niemowląt lub starych ludzi;

zastosowanie określone wyżej jako środek dojelitowy dla wspomagania żywienia;

zastosowanie określone wyżej jako paszy dla zwierząt;

zastosowanie określone wyżej jako przynęty zooplanktonu dla paszy oraz zastosowanie określone wyżej, w którym mikroorganizm należący do rodzaju Ulkenia jest zastosowany po suszeniu lub sterylizacji.

Sposób wytwarzania lipidów zawierających kwas dokozaheksaenowy i dokozapentaenowy według wynalazku, obejmuje hodowlę na pożywce mikroorganizmu należącego do rodzaju Ulkenia, posiadającego zdolność wytwarzania lipidów zawierających kwas dokozaheksaenowy i dokozapentaenowy i wyodrębnianie lipidów z hodowli.

Sposób wytwarzania kwasu dokozaheksaenowego według wynalazku obejmuje hodowlę na pożywce mikroorganizmu należącego do rodzaju Ulkenia, posiadającego zdolność wytwarzania lipidów zawierających kwas dokozaheksaenowy, wyodrębnianie lipidów z hodowli i wydzielanie kwasu dokozaheksaenowego z otrzymanych lipidów.

Sposób wytwarzania kwasu dokozapentaenowego według wynalazku obejmuje hodowlę na pożywce mikroorganizmu należącego do rodzaju Ulkenia, posiadającego zdolność wytwarzania lipidów zawierających kwas dokozapentaenowy, wyodrębnianie lipidów z kultury (hodowli) i wydzielanie kwasu dokozapentaenowego z otrzymanych lipidów.

Wynalazek ujawnia komórki mikroorganizmu należącego do rodzaju Ulkenia, zawierające lipidy, w których skład wchodzi kwas dokozaheptaenowy i/lub dokozaheptaenowy.

Wynalazek ujawnia ponadto szczep Ulkenia sp. SAM 2179, posiadający zdolność wytwarzania lipidów zawierających kwas dokozaheksaenowy i dokozapentaenowy.

Wynalazek obejmuje ponadto zawierające lipidy otrzymane jednym z wymienionych wyżej sposobów: środek odżywczy suplementujący żywność, preparat odpowiedni do karmienia niemowląt, preparat odpowiedni do karmienia przedwcześnie urodzonych niemowląt, odżywkę dla dzieci, odżywkę dla kobiet ciężarnych i karmiących, odżywkę dla osób starszych, środek dojelitowy wspomagający odżywianie, karmę dla zwierząt, dodatek do karmy dla zwierząt, pożywkę dla mikroorganizmów do przynęt.

Sposób wytwarzania lipidów strukturalnych zawierających kwas dokozaheksaenowy i dokozapentaenowy według wynalazku obejmuje hodowlę na pożywce mikroorganizmu należącego do gatunku Ulkenia, posiadającego zdolność wytwarzania lipidów zawierających kwas dokozaheksaenowy i dokozapentaenowy, wyodrębnianie tych lipidów z pożywki i poddanie otrzymanych lipidów działaniu lipazy z grzybów w celu przekształcenia kwasów tłuszczowych w pozycjach 1 i 3 w kwasy tłuszczowe o łańcuchu średniej długości (C: 8-12, patrz „SEIKAGAKUJITEN” (wyd. drugie), str.834, TOKYO KAGAKUDOJ1N (1990).

Zwięzłe objaśnienie rysunków

Na rysunku Fig. 1 przedstawiono chromatogram cieczowy triacylogliceroli w obojętnym lipidzie, otrzymanym według wynalazku.

PL 193 818 B1

Najbardziej korzystny sposób realizacji wynalazku

Niniejszy wynalazek zostanie opisany bardziej szczegółowo poniżej. Stosowane określenie „kwas dokozaheksaenowy” lub „DHA” odnosi się do szeregu (n-3) kwasu dokozaheksaenowego. Stosowane określenie „kwas dokozapentaenowy” lub „DPA odnosi się do szeregu (n-3) i/lub (n-6) kwasu dokozapentaenowego. Określenia „tłuszcze”, „lipidy” i „olej” są używane w opisie w tym samym znaczeniu.

W sposobie według wynalazku można stosować dowolny mikroorganizm należący do rodzaju Ulkenia, pod warunkiem, że posiada on zdolność wytwarzania DHA i/lub DPA. Mogą być na przykład stosowane szczepy Ulkenia sp. SAM 2180 i SAM 2179, wyizolowane z wody morskiej przez wynalazców. Bardziej skuteczny w wytwarzaniu DHA i DPA jest szczep SAM 2179. Szczep ten został zdeponowany w National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (adres: 1-3, Higashi 1 chome Sukuba-shi Baraki-ken 305, Japonia), dnia 23 lipca 1996 roku i otrzymał numer kolejny depozytu FERM BP-5601.

Charakterystyka mykologiczna szczepów Ulkenia sp. SAM 2179 i SAM 2180 jest następująca. Podczas hodowania tych mikroorganizmów w pożywce płynnej KMV (wyd. Fuller M. I Jaworski A.; Zoosporic Fungi in Teaching & Research VII, 303 str., Southeastern Publishing Corporation, Ateny 1987) w temperaturze 20°C w ciemności, obserwowano komórki kuliste lub owalne oraz zoospory dwuwiciowe. Jednakże nie obserwowano sieci filamentów ektoplazmy. Na tej podstawie, zgodnie z „Icons of the Japanese Water Mould with Precise Explanation” wg. Yosio Kobayasi i Kazuko Konno (publikacja prywatna autorów przez nich sponsorowana, str.169, 1986), mikroorganizmy te sklasyfikowano jako grzyby należące do Thraustochytriales. Ponadto, mikroorganizmy te tworzyły w pożywce płynnej KMV ryzoidy, bez odrostków oraz ameboidalne komórki. Stąd zidentyfikowano je jako grzyby należące do rodzaju Ulkenia, a dwa wyizolowane szczepy określono odpowiednio jako Ulkenia sp. SAM 2179 i SAM 2180.

Mikroorganizmy należące do rodzaju Ulkenia stosowane w sposobie według wynalazku nie ograniczają się do szczepu dziko występującego, ale mogą ponadto obejmować szczepy zmutowane lub zrekombinowane. Tak więc zastosowanie zmutowanego lub zrekombinowanego szczepu przeznaczonego do wytwarzania DHA i/lub DPA w sposób skuteczny, również wchodzi w zakres niniejszego wynalazku. Takie zmutowane lub rekombinowane szczepy obejmują mikroorganizmy zaprojektowane do wytwarzania lipidów o wyższej zawartości procentowej DHA i/lub DPA, wyższej całkowitej ilości lipidów lub obu tych cech jednocześnie, w porównaniu z zawartością procentową lub ilością produkowaną przez oryginalne dzikie szczepy bakterii przy wykorzystaniu takich samych substancji wyjściowych. Dzikie szczepy według wynalazku zawierają w lipidach co najmniej 25% DHA i/lub 5% DPA, korzystnie 40-48% DHA i 8-13% DPA. Szczepy te zawierają co najmniej 3 g DHA i/lub 0,5 g DPA, korzystnie 5 g DHA i/lub 1 g DPA na litr pożywki. Ponadto bierze się pod uwagę mikroorganizmy zaprojektowane do wytwarzania porównywalnej z otrzymywaną w przypadku odpowiednich dzikich szczepów ilości DHA i/lub DPA, wydajnie wykorzystujące substancje wyjściowe przy wyższych korzyściach ekonomicznych.

Mikroorganizmy według wynalazku hoduje się w pożywce stałej lub ciekłej, przez posiewanie pożywki stałej lub ciekłej prekulturami mikroorganizmów. Pożywka może, ale nie musi zawierać naturalną lub sztuczną wodę morską.

Źródła węgla dodawane do pożywki stanowią, nie ograniczając się do tych przykładów, dowolne znane źródła węgla, na przykład węglowodany takie jak glukoza, fruktoza, ksyloza, sacharoza, maltoza, skrobia rozpuszczalna, fukoza, glukozamina i dekstran, a ponadto kwas oleinowy, tłuszcze takie jak olej sojowy, kwas glutaminowy, melasy, glicerol, mannitol, czy octan sodu.

Źródła azotu stanowią naturalne źródła azotu, takie jak pepton, ekstrakt drożdży, ekstrakt słodowy, ekstrakt mięsny, kwas kazaminowy i wyciąg namokowy kukurydzy, makuch sojowy, organiczne źródła azotu takie jak glutaminian sodu i mocznik, lub nieorganiczne źródła azotu takie jak octan amonu, siarczan amonu, chlorek amonu i azotan amonu.

Ponadto w razie potrzeby można dodać jako mikroskładniki fosforany takie jak fosforan potasu i diwodorofosforan potasu, sole nieorganiczne takie jak siarczan amonu, siarczan sodu, siarczan magnezu, siarczan żelaza, siarczan miedzi, chlorek magnezu i chlorek wapnia a także witaminy.

Ilość tych składników w pożywce nie jest konkretnie sprecyzowana, pod warunkiem, że stężenia składników nie wywierają niekorzystnego działania na wzrost mikroorganizmów. Generalnie, źródła węgla dodaje się do uzyskania stężenia od 20 do 180 g na litr pożywki, zaś źródła azotu dodaje się do

PL 193 818 B1 uzyskania stężenia od 0,6 do 6 g na litr pożywki. Korzystnie, ilość źródła azotu wzrasta odpowiednio do wzrastającej ilości źródła węgla.

Po sporządzeniu pożywki, jej pH nastawia się w zakresie pomiędzy 3,0 a 8,0, korzystnie pomiędzy 3,5 a 5, a jeszcze korzystniej pomiędzy 3,5 a 4,5, stosując odpowiedni kwas lub zasadę, a następnie pożywkę poddaje się sterylizacji w autoklawie lub w inny sposób. Hodowlę mikroorganizmu prowadzi się zazwyczaj przez 2 do 7 dni, korzystnie przez 2 do 5 dni, w temperaturze od 10 do 35°C, korzystnie 17 do 30°C, stosując mieszanie przez napowietrzanie lub wytrząsanie bądź w warunkach hodowli stacjonarnej.

Ponadto, w celu przyspieszenia wytwarzania DHA i/lub DPA, do pożywki można dodać ich prekursory. Przykłady takich prekursorów stanową węglowodory takie jak tetradekan, heksadekan i oktadekan, kwasy tłuszczowe takie jak kwas oleinowy, linolowy i a-linolenowy, lub ich sole (na przykład sole sodowe lub potasowe) bądź estry. Ponadto, mogą być dodane tłuszcze zawierające jako składnik te kwasy tłuszczowe (na przykład oliwa, olej sojowy, olej z nasion bawełny, olej palmowy). Składniki te mogą być dodawane pojedynczo lub w postaci mieszaniny.

Źródła węgla, azotu, prekursory i pozostałe składniki można dodawać do pożywki przed lub podczas hodowli. Dodawanie tych składników może następować jednorazowo, periodycznie lub w sposób ciągły.

W celu wyodrębnienia lipidów zawierających DHA i/lub DPA w ilościach mających praktyczne znaczenie, korzystne jest stosowanie pożywki ciekłej i prowadzenie hodowli kultury w warunkach mieszania z napowietrzaniem. Można zastosować typowy mieszalnik fermentacyjny lub fermentor w postaci kolumny pęcherzykowej.

Prowadząc hodowlę w opisany sposób, otrzymuje się lipidy zawierające DHA i/lub DPA zakumulowane w komórkach. Stosując pożywkę ciekłą, lipidy zawierające DPA i/lub DHA wyodrębnia się z hodowli lub z wyjałowionej hodowli w trakcie procesu hodowania, po zakończeniu hodowli, bądź z wyhodowanych komórek lub też wysuszonych komórek zebranych z dowolnej ze wspomnianych kultur. Stosowane określenie „hodowla” obejmuje zarówno wyhodowane komórki, wysuszone wyhodowane komórki i przetworzone wyhodowane komórki, jak również brzeczkę hodowlaną zawierającą komórki i supernatanty hodowli.

DHA i/lub DPA wyodrębnia się z zawierających je lipidów wyodrębnionych z komórek hodowli w sposób następujący. Po zakończeniu hodowli, komórki wydziela się z hodowli znaną metodą rozdziału układu ciało stałe/ciecz, taką jak na przykład odwirowanie lub filtracja. Komórki intensywnie przemywa się wodą, a następnie, korzystnie, poddaje się suszeniu. Suszenie komórek prowadzi się metodą wymrażania, suszenia na powietrzu lub inną. Wysuszone komórki poddaje się następnie destrukcji np. w dynomłynie lub za pomocą ultradźwięków, po czym lipidy ekstrahuje się z komórek za pomocą rozpuszczalnika organicznego, korzystnie w strumieniu azotu. Jako rozpuszczalnik organiczny stosuje się eter, heksan, metanol, etanol, chloroform, dichlorometan lub eter naftowy. Alternatywny sposób stanowi ekstrakcja metanolem i eterem naftowym lub ekstrakcja w układzie mieszanych rozpuszczalników chloroform/metanol/woda. Wysokie stężenie lipidów zawierających DHA i/lub DPA uzyskuje się odparowując rozpuszczalnik organiczny z ekstraktu pod zmniejszonym ciśnieniem.

Alternatywnie, ekstrakcji poddaje się komórki mokre. W tym przypadku stosuje się rozpuszczalnik o powinowactwie do wody, taki jak metanol lub etanol lub rozpuszczalnik mieszany o powinowactwie do wody składający się z alkoholu(i) i wody i/lub inne rozpuszczalniki. Pozostałe procedury postępowania są takie same jak wcześniej opisano.

Sposób opisany wyżej pozwala na uzyskanie lipidów o zawartości DHA co najmniej 3 g na litr pożywki, korzystnie 5 g na litr pożywki. Ilość DPA w lipidach wynosi co najmniej 0,7 g na litr pożywki, korzystnie 1,0 g na litr pożywki.

W lipidach uzyskanych w opisany powyżej sposób, DHA i/lub DPA występuje w postaci lipidów obojętnych (na przykład triacyloglicerol) lub lipidów polarnych (na przykład fosfatydylocholina, fosfatydyloetanoloamina lub fosfatydyloinozytol). Triacyloglicerole zawierające DHA i/lub DPA oczyszcza się od lipidów je zawierających uzyskanych z hodowli, stosując znane techniki rozdziału, takie jak oddzielanie przez oziębianie lub chromatografia kolumnowa.

Zazwyczaj duży procent w całkowitej ilości lipidów we dług wynalazku (ponad 90% całkowitej ilości lipidów) stanowią lipidy obojętne. Reprezentatywny skład kwasów tłuszczowych w lipidach obojętnych jest następujący: kwas palmitynowy - 30-38%; (n-3) DHA - 40-48%; (n-6) DPA - 8-13%; (n-3) EPA 0-1%; ARA - 0-0,6%; inne kwasy tłuszczowe -10-20%.

PL 193 818 B1

Lipidy obojętne uzyskane z lipidów według wynalazku zawierają co najmniej 85% triacylogliceroli, korzystnie co najmniej 90% triacylogliceroli. Zawartość diacylogliceroli i monoacylogliceroli w lipidach obojętnych jest bardzo niska. Wolny sterol i/lub ester sterol stanowią 1-3% ich całkowitej ilości. Zazwyczaj w triacyloglicerolach znajdują się następujące cząsteczki: 16:0-16:0-22:5, 16:0-16:0-22:6, 16:0-22:5-22:6, 16:0-22:6-22:6, 22:5-22:6-22:6 i 22:6-22:6-22:6, przy czym na przykład „16:0” oznacza kwas tłuszczowy posiadający 16 atomów węgla i żadnego (0) wiązania podwójnego. Interesujący jest fakt, że w lipidach stanowiących przedmiot wynalazku, występują triacyloglicerole zawierające jedynie wielonienasycone kwasy tłuszczowe.

Wydzielanie DHA i/lub DPA z zawierających je lipidów prowadzi się poddając lipidy hydrolizie, a następnie zatężając i rozdzielając otrzymaną mieszaninę kwasów tłuszczowych lub otrzymanych z nich estrów, stosując znane metody takie jak dodanie mocznika, rozdział przez oziębianie lub chromatografia kolumnowa.

Otrzymane w wyżej opisany sposób DHA i/lub DPA, jak również zawierające je lipidy, mogą być dodawane do różnych środków odżywczych, pasz i przynęt dla wyrównania niedoboru DHA i/lub DPA. Przykłady takich środków odżywczych obejmują przykładowo środki odżywcze suplementujące żywność, preparaty o składzie odpowiednim do karmienia niemowląt lub przedwcześnie urodzonych niemowląt, zdrową żywność, odżywki dla dzieci, odżywki dla kobiet ciężarnych i karmiących, odżywki dla osób starszych. Środki paszowe obejmują karmę dla zwierząt domowych takich jak świnie i krowy, karmę dla ptactwa takiego jak kurczęta, karmę dla psów, kotów i podobnych oraz karmę do hodowli ryb. Przynęty obejmują na przykład pożywkę dla mikroorganizmów (tak zwanego zooplanktonu), stosowanego jako przynęta w hodowli ryb i skorupiaków.

W szczególności w przypadku paszy i przynęt korzystne i ekonomiczne jest stosowanie kultur mikroorganizmu według wynalazku, komórek zebranych z hodowli lub pozostałości komórek po wyodrębnieniu lipidów. Przykładowo, komórki mikroorganizmów wytwarzających DHA i/lub DPA mogą być stosowane bezpośrednio do karmienia narybku (młodych ryb) zamiast pośredniego karmienia ich zooplanktonem lub w podobny sposób. Te materiały mogą być używane po wysuszeniu lub w razie konieczności wyjałowieniu.

Lipidy według wynalazku można stosować do produkcji jaj drobiu wzbogaconych w DHA i/lub DPA, które otrzymuje się karmiąc drób przeznaczony do znoszenia jaj (zwłaszcza kurczęta) pożywieniem zawierającym lipidy według wynalazku. Ekstrahując w znany sposób olej z takich jaj drobiu lub z żółtka jaj, można uzyskać olej żółtka jaj wzbogacony w DHA i/lub DPA. Należy także mieć na uwadze preparaty zawierające olej żółtka jaj odpowiednie do karmienia niemowląt i przedwcześnie urodzonych niemowląt, odżywki dla dzieci, odżywki dla kobiet ciężarnych i karmiących.

Od dawna czynione są wysiłki mające na celu otrzymanie mleka w proszku dla dzieci o składzie podobnym do mleka ludzkiego. W szczególności ważnym jest uzyskanie kompozycji podstawowych składników mleka ludzkiego (to znaczy białka, tłuszczu i cukru) w mleku sproszkowanym zbliżonego do składu mleka ludzkiego. Powstał jednak problem polegający na tym, że znane mleka w proszku są ubogie w wielonienasycone kwasy tłuszczowe, nieodłącznie zawarte w mleku ludzkim. Opublikowano kilkanaście doniesień na temat składu nienasyconych kwasów tłuszczowych w mleku ludzkim (na temat nienasyconych kwasów tłuszczowych w mleku matek w Ameryce, Europie i Afryce patrz INFORM, 6(8):940-946 (1995), na temat wielonienasyconych kwasów tłuszczowych w mleku matek w Japonii patrz JJPEN, 13(9):765-772 (1991)).

Ostatnio wykazano, że ARA i DHA, wchodzące w skład mleka ludzkiego, wpływają na wzrost niemowląt (Advances in Polyunsaturated Fatty Acid Research”, Elsevier Science Publishers, str.161164 (1993)). Odnotowano także duży wpływ ARAi DHA na wzrost i rozwój mózgu (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1073-1077 (1993); Lancet, 344:1319-1322 (1994)).

Z faktu tego wynika wzmożone zainteresowanie dodawaniem ARA i DHA do modyfikowanego mleka. Na rynku znajduje się mleko modyfikowane zawierające olej z ryb jako źródło DHA. Olej z ryb zawiera jednak również EPA, w niewielkich ilościach obecny w mleku ludzkim, który jak odnotowano wywiera niepożądane działanie na wzrost niedojrzałych niemowląt („Advances in Polyunsaturated Fatty Acid Research”, Elsevier Science Publishers, str.261-264 (1993)). Lipidy stanowiące przedmiot wynalazku są użyteczne jako dodatek do modyfikowanego mleka ze względu na szczególnie niską zawartość EPA. Lipidy według wynalazku mogą ponadto stanowić dodatek do odżywek dla dzieci.

Lipidy według wynalazku można dodawać w celu dostarczenia DHA i/lub DPA bądź dla utrzymania dobrego stanu zdrowia do żywności, takiej jak środki odżywcze suplementujące żywność, odżywki dla osób starszych, zdrowa żywność. Żywność może być w postaci stałej lub płynnej lub też

PL 193 818 B1 w postaci zawierającej oleje. Korzystnie zawartość lipidów w żywności wynosi między 0,001 a 50% wagowych, zależnie od rodzaju żywności, do której dodaje się lipidy.

Przykłady żywności zawierającej oleje stanowią produkty naturalne nieodłącznie zawierające oleje (mięso, ryba, orzech), produkty do których lipidy dodaje się w trakcie gotowania (jak zupa), produkty w których lipidy stosuje się jako medium grzewcze (pączki), tłuszcze jadalne (masło), żywność przetworzona, do której lipidy dodaje się w trakcie obróbki (ciastka) lub żywność na którą lipidy nakłada się za pomocą rozpryskiwania lub po zakończeniu obróbki (twarde ciasteczka). Lipidy według wynalazku (lub wyizolowany DHA i/lub DPA) można ponadto dodawać do produktów roślinnych, produktów fermentacji, produktów ze zwierząt domowych, produktów morskich oraz napojów nie zawierających tłuszczy.

Alternatywnie lipidy według wynalazku mogą stanowić dodatek do żywności wykazującej fizjologiczne działanie funkcjonalne DHA i/lub DPA wpływające na wzmocnienie osłabionego funkcjonowania organizmu lub dla zapobiegania jego osłabieniu. Żywność funkcjonalna według wynalazku może mieć postać preparatu farmaceutycznego lub w postać przetworzoną (taką jak środek dojelitowy do wspomagania odżywania, proszek, granulki, kołaczyki, roztwory wewnętrzne, zawiesiny, emulsje, syropy i tym podobne), w których lipidy według wynalazku łączy się z białkami, cukrowcami, lipidami, pierwiastkami śladowymi, witaminami, czynnikami emulgującymi lub zapachowymi.

Ponadto, lipidy według wynalazku mogą być stosowane jako dodatki do środków kosmetycznych i myjących, bądź jako substancje wyjściowe do wytwarzania ich pochodnych mających zastosowanie jako środki lecznicze.

Następnie wynalazek zostanie zilustrowany za pomocą przykładów. Przykłady niczym nie ograniczają zakresu wynalazku.

Przykład 1.

Wytwarzanie lipidów przy użyciu mikroorganizmów należących do rodzaju Ulkenia (1)

Szczepy Ulkenia sp. SAM 2180 i SAM 2179 hodowano w fermentorze o pojemności 5 litrów (fermentor wytrząsany), zawierającym 3 l pożywki o następującym składzie i warunkach hodowli.

(1) Skład kompozycji:

1. Glukoza (g/l) 60

2. Fosforan potasu (g/l) 3

3. Siarczan amonu (g/l) 2

4. Wyciąg namokowy kukurydzy (g/l) 0,7

5. 50% sztuczna woda morska (1) 1

6.pH: 4,0 (2) Warunki hodowli

1. Temperatura hodowli (°C) 28

2. Wielkość napowietrzenia (obj/obj/min) 0,5

3. Szybkość mieszania (obr/min) 300

4. Regulacja pH: utrzymywania pH na poziomie 4 za pomocą 10% (wag/obj) roztworu wodorotlenku sodu i 1M kwasu siarkowego

Po zakończeniu hodowli, zebrano komórki przez ultrawirowanie i wysuszono przez wymrożenie, po czym oznaczono ilość (wagową) komórek na litr pożywki. Komórki poddano destrukcji i wyekstrahowano lipidy przez dodanie do suchych komórek mieszaniny chloroform/metanol (2:1, obj./obj/) w stosunku 100 objętości na masę komórek, a następnie homogenizując mieszaninę w obecności perełek szklanych. Po przemyciu ekstraktu według metody Folch'a, odparowano rozpuszczalnik, otrzymując oczyszczone lipidy, po czym oznaczono ich wagę.

W celu określenia składu otrzymanych oczyszczonych lipidów, przygotowano estry metylowe kwasów tłuszczowych przez rozpuszczenie frakcji lipidów w mieszanym rozpuszczalniku składającym się z równych objętości roztworu metanolu zawierającego 10% HCli dichlorometanu i podgrzewając mieszaninę w temp. 50°C przez 2 godziny. Estry poddano następnie chromatografii gazowej, analizując skład kwasów tłuszczowych. Warunki rozdziału w gazowej chromatografii cieczowej były następujące.

(3) Warunki rozdziału

1. Kolumna: kolumna kapilarna TC-70 (GL Science Co., LTD.), średnica wewnętrzna 0,25 mm x długość 30 m

2. Szybkość przepływu: 0,8 ml/min, 100 kPa (ciśnienie głowicy kolumny)

3. Gaz nośny: azot

PL 193 818 B1

4. Temperatura kolumny: układ rosnący, 170-220°C (4 C/min)

5. Detekcja: FID

Wyniki zestawiono w Tabeli 1 i Tabeli 2.

T a b el a 1.

Szczep	Czas hodowli (dni)	Waga suchych komórek (g)*1	Całkowita ilość lipidów (g)*1	Zawartość procentowa lipidów (% wag)*2	Ilość DHA (g)*1	Ilość DPA (g)*1
SAM 2180	3	23,2	14,1	61	4,0	0,9
SAM 2179	3	19,5	11,9	61	5,5	1,3

*1) Waga na litr pożywki *2) Ilość procentowa w stosunku do suchych komórek

T ab el a 2.

Szczep	14:0	15:0	16:0	17:0	18:0	20:4 (AA)	20:5 (EPA)	22:5 (DPA)	22:6 (DHA)
SAM 2180	2,7	2,4	55,0	1,0	1,4	-	0,2	6,7	28,7
SAM 2179	2,4	0,9	37,2	0,3	0,8	0,4	0,6	10,6	46,2

P r z y k ł a d 2.

Wytwarzanie lipidów przy użyciu mikroorganizmu należącego do rodzaju Ulkenia (2)

Szczep Ulkenia sp. SAM 2179 hodowano w fermentorze o pojemności 5 litrów (fermentor wytrząsany), zawierającym 3 l pożywki o następującym składzie i warunkach hodowli.

(1) Skład kompozycji:

1. Glukoza (g/l) 60

2. Fosforan potasu (g/l) 3

3. Siarczan amonu (g/l) 2

4. Chlorek magnezu (g/l) 1,3

5. Siarczan sodu (g/l) 1

6. Chlorek wapnia (g/l) 0,3

7. Wyciąg namokowy kukurydzy (g/l) 0,7

8. pH: 4,0 (2) Warunki hodowli

1. Temperatura hodowli (°C) 28

2. Wielkość napowietrzenia (obj/obj/min) 0,5

3. Szybkość mieszania (obr/min) 300

Po zakończeniu hodowli, zebrano komórki przez ultrawirowanie i wysuszono przez wymrożenie, po czym oznaczono ilość (wagową) komórek na litr pożywki. Komórki poddano destrukcji i wyekstrahowano lipidy przez dodanie do suchych komórek mieszaniny chloroform/metanol (2:1, obj./obj/) w stosunku 100 objętości na masę komórek, a następnie homogenizując mieszaninę w obecności perełek szklanych. Po przemyciu ekstraktu według metody Folch'a, odparowano rozpuszczalnik, otrzymując oczyszczone lipidy, po czym oznaczono ich masę.

W celu określenia składu otrzymanych oczyszczonych lipidów, przygotowano estry metylowe kwasów tłuszczowych przez rozpuszczenie frakcji lipidów w mieszanym rozpuszczalniku składającym się z równych objętości roztworu metanolu zawierającego 10% HCl i dichlorometanu i podgrzewając mieszaninę w temp. 60°C przez 2 godziny. Estry poddano następnie chromatografii gazowej, analizując skład kwasów tłuszczowych. Warunki rozdziału w gazowej chromatografii cieczowej opisano w przykładzie 1.

PL 193 818 B1

Rezultaty przedstawiono w Tabelach 3 i 4.

T ab el a 3.

Szczep	Czas hodowli (dnie)	Waga suchych komórek (g)*1	Całkowita ilość lipidów (g)*1	Zawartość procentowa lipidów (% wag)*2	Ilość DHA (g)*1	Ilość DPA (g)*1
SAM 2179	3	21,5	12,0	56	5,5	1,5

*1) Waga na litr pożywki *2) Ilość procentowa w stosunku do suchych komórek

T ab el a 4.

Szczep	14:0	15:0	16:0	17:0	18:0	20:4 (AA)	20:5 (EPA)	22:5 (DPA)	22:6 (DHA)
SAM 2179	2,0	1,5	34,3	0,5	0,9	0,7	0,7	12,4	45,8

P r z y k ł a d 3.

Analiza lipidów otrzymanych z Ulkenia SAM 2179.

Lipidy obojętne i polarne wyodrębniono z lipidów otrzymanych w przykładzie 1 znaną techniką podziału ciecz-ciecz, stosując heksan i 90% metanolu. Z 1 g lipidów otrzymano odpowiednio 0,92 g lipidów obojętnych i 0,05 g lipidów polarnych. Uzyskane lipidy obojętne i polarne analizowano metodą chromatografii cienkowarstwowej. Chromatograf rozwijano stosując kwas siarkowy, a otrzymane plamki identyfikowano porównując ich wartości Rf z wartościami dla lipidów odniesienia.

Ponad 90% lipidów obojętnych stanowiły triacyloglicerole. W skład lipidów polarnych wchodziły fosfatydylodicholina (60-80%), fosfatydyloetanoloamina (5-20%) i fosfatydyloinozytol (2-8%).

Triacyloglicerole w lipidach obojętnych analizowano, rozdzielając cząsteczki za pomocą chromatografii cieczowej (kolumna: ODS; faza ruchoma: aceton/acetonitryl (3:2); detekcja: refraktometr różnicowy) (patrz Fig. 1). Rozdzielano uzyskane frakcje, a następnie, po hydrolizie, przeprowadzano w estry metylowe. Reszty kwasów tłuszczowych identyfikowano metodą gazowej chromatografii cieczowej.

Zidentyfikowano 5 głównych pików zebranych w Tabeli 5. Triacyloglicerole składały się w 12,8% z 1,2,3-tridokozaheksaenoilo-triacyloglicerolu i w 8,0% z 1-dokozapentaenoilo-2,3-didokozaheksaenoilo-triacyloglicerolu. Około 20% całkowitej ilości triacylogliceroli stanowiło kompozycję tri-wielonienasyconych kwasów tłuszczowych.

T ab el a 5

Pik	Cząsteczka	Stosunek (%)
1	22:6-22:6-22:6	12,8
2	22:5-22:6-22:6	8,0
3	16:0-22:6-22:6	18,3
4	16:0-22:5-22:6	8,1
5	16:0-16:0-22:6	10,8

P r z y k ł a d 4.

Określenie pozycji przyłączenia reszt kwasów tłuszczowych w triacyloglicerolach

Pozycje przyłączenia reszt kwasów tłuszczowych w triacyloglicerolach otrzymanych w przykładzie 3 analizowano następująco. Triacyloglicerole otrzymane w przykładzie 3 (cząsteczki: 16:0-16:0-22:6) wysuszono i potraktowano lipazą (z Rhizopus japonicus), specyficzną w stosunku do pozycji 1,3. Otrzymane 2-monoacyloglicerole poddawano trimetylosililowaniu, po czym resztę kwasu tłuszczowego identyfikowano stosując chromatografię gazową/spektrografię masową. Reakcję z lipazą prowadzono w 2 ml buforu octanowego 50 nM (pH 5,5), stosując 1000 jedn. lipazy w temp. 35°C przez 30 minut.

PL 193 818 B1

Produkty reakcji ekstrahowano eterem i poddawano trimetylosililowaniu, stosując dostępny handlowo czynnik trimetylosililujący.

Obserwowano pik cząstkowy odpowiadający masie cząsteczkowej monoacylogliceroli, do których jest przyłączony 22:6, wskazujący, że triacyloglicerol, do którego w pozycji 2 szkieletu glicerolu przyłączona jest reszta kwasowa 22:6, stanowi triacyloglicerol 16:0-22:6-16:0.

P r zyk ł a d 5

Otrzymywanie modyfikowanego mleka zawierającego DHA i DPA

Modyfikowane mleko zawierające DHA i DPA przygotowano dodając do 100 g sproszkowanego mleka 0,44 g lipidów z Przykładu 1, zawierających 46,2% DHA i 10,6% DPA.

DHA i DPA w sproszkowanym mleku stanowiły odpowiednio 0,80% i 0,19% całkowitej ilości lipidów, wartość zbliżoną do kompozycji mleka ludzkiego.

P r zyk ł a d 6

Wytwarzanie lipidów strukturalnych zawierających DHA i DPA ml roztworu lipazy (5600 jedn/ml, lipaza specyficzna dla pozycji 1,3 z Rhizopus delemar) zmieszano z 2,5 g CaCO3 jako nośnikiem unieruchomionym. Enzym unieruchomiono i wytrącono, dodając do mieszaniny 40ml acetonu, po czym unieruchomiony enzym wysuszono. Aktywność specyficzna otrzymanego unieruchomionego enzymu wynosiła 9,3 jedn/ml. 120 mg unieruchomionego enzymu zmieszano z 1 g lipidów zawierających DHA i DPA, otrzymanych z SAM 2180 w Przykładzie 1, 2 g kwasu heptanokarboksylowego-1 i 60 mg wody, mieszając w temp.30°C przez 8 godzin. Triacyloglicerole wyodrębniano z mieszaniny reakcyjnej w znany sposób i określano skład kwasów tłuszczowych triacylogliceroli. Wyniki zebrano w Tabeli 6.

T ab el a 6.

	8:0	14:0	15:0	16:0	17:0	18:0	20:4 (AA)	20:5 (EPA)	22:5 (DPA)	22:6 (DHA)
Nie poddawane działaniu lipazy	0,0	2,7	2,4	55,0	1,0	1,4	0,0	0,2	6,7	28,7
Po działaniu lipazy	36,2	1,8	1,2	17,6	1,0	1,8	0,0	0,2	7,3	30,4

Ponad 30% triacylogliceroli posiada wielonienasycone kwasy tłuszczowe w pozycji SN2 gliceroli. A zatem, lipidy te są przydatne do wytwarzania lipidów strukturalnych zawierających kwasy tłuszczowe o średniej długości łańcucha w pozycji SN1 i SN3 gliceroli i wielonienasycone kwasy tłuszczowe w pozycji SN2 gliceroli.

Przemysłowe zastosowanie

Sposób według wynalazku umożliwia otrzymanie lipidów o wysokiej zawartości DHA i/lub DPA przy niskiej zawartości EPA. Z lipidów tych można następnie wyodrębnić DHA i/lub DPA.

Lipidy zawierające DHA i/lub DPA, wyizolowany DHA i wyizolowany DPA według wynalazku są użyteczne jako dodatki do żywności, karmy, przynęt, środków leczniczych i tym podobnych. W karmie i przynętach można stosować komórki zawierające DHA i/lub DPA. Karmiąc drób paszą według wynalazku można uzyskać jaja drobiu i żółtka jaj drobiu wzbogacone w DHA i/lub DPA.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania lipidów zawierających kwas dokozaheksanowy i/lub kwas dokozapentaenowy, znamienny tym, że obejmuje hodowanie w pożywce mikroorganizmu należącego do rodzaju Ulkenia zdolnego do wytwarzania lipidów zawierających kwas dokozaheksaenowy i/lub kwas dokozapentaenowy i odzyskiwanie lipidów z hodowli.
2. Sposób wytwarzania kwasu dokoheksaenowegoi/lub dokozapentaenowego według zastrz. 1, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje oddzielenie kwasu dokozaheksaenowego i/lub dokozapentaenowego od lipidów.
3. Sposób wytwarzania strukturyzowanych lipidów zawierających kwas dokozaheksaenowy i/lub kwas dokozapentaenowy według zastrz. 1, znamienny tym, że dodatkowo obejmujetraktowanie

PL 193 818 B1 lipidów lipazą grzybową, aby przeprowadzić kwasy tłuszczowe w pozycjach 1 i 3 w kwasy tłuszczowe o łańcuchu C8-12.
4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że mikroorganizmem jest Ulkenia sp. SAM 2179 (FERM BP-5601).
5. Komórki szczepu mikroorganizmu Ulkenia sp. SAM 2179 (FERM BP-5601) zawierające lipidy obejmujące obojętne lipidy zawierające 30-38% kwasu palmitynowego, 40-48% kwasu dokozaheksaenowego, 8-13% kwasu dokozapentaenowego, 0-1% kwasu eikozapentaenowego, 0-0,6% kwasu arachidonowego i 10-20% innych kwasów tłuszczowych w procentach wagowych w przeliczeniu na łączną zawartość kwasów tłuszczowych.
6. Komórki szczepu mikroorganizmu Ulkenia sp. SAM 2179 (FERM BP-5601) według zastrz. 5, zawierające lipidy obejmujące kwas dokozaheksaenowy i/lub kwas dokozapentaenowy, które to komórki obejmują obojętne lipidy zawierające triacyloglicerole składające się tylko z polinienasyconych kwasów tłuszczowych.
7. Komórki według zastrz. 5 albo 6 w których obojętny lipid zawiera co najmniej 85% wagowych, korzystnie 90% wagowych triacylogliceroli.
8. Szczep Ulkenia sp. SAM 2179 (FERM BP-5601) zdolny do wytwarzania lipidów obejmujących obojętne lipidy zawierające 30-38% kwasu palmitynowego, 40-48% kwasu dokozaheksaenowego, 8-13% kwasu dokozapentaenowego, 0-1% kwasu eikozapentaenowego, 0-0,6% kwasu arachidonowego i 10-20% innych kwasów tłuszczowych w procentach wagowych w przeliczeniu na łączną zawartość kwasów tłuszczowych.
9. Ekstrakt lipidowy otrzymany z mikroorganizmu należącego do rodzaju Ulkenia sposobem określonym w zastrz. 1, znamienny tym, że ten ekstrakt lipidowy obejmuje obojętne lipidy zawierające 30-38% kwasu palmitynowego, 40-48% kwasu dokozaheksaenowego, 8-13% kwasu dokozapentaenowego, 0-1% kwasu eikozapentaenowego, 0-0,6% kwasu arachidonowego i 10-20% innych kwasów tłuszczowych w procentach wagowych w przeliczeniu na łączą zawartość kwasów tłuszczowych.
10. Ekstrakt lipidowy według zastrz. 9, znamienny tym, że zawiera kwas dokozaheksaenowy i/lub dokozapentaenowy, przy czym ekstrakt lipidowy obejmuje obojętne lipidy zawierające triacyloglicerole składające się tylko z polinienasyconych kwasów tłuszczowych.
11. Ekstrakt lipidowy według zastrz. 9 albo 10, znamienny tym, że obojętny lipid zawiera co najmniej 85% wagowych, korzystnie 90% wagowych triacylogliceroli.
12. Ekstrakt lipidowy otrzymany z mikroorganizmu należącego do rodzaju Ulkenia zawierający lipidy, które obejmują kwas dokozaheksaenowy i/lub kwas dokozapentaenowy sposobem określonym w zastrz. 1, znamienny tym, że ekstrakt lipidowy obejmuje obojętne lipidy zawierające około 20% triacylogliceroli składających się tylko z polinienasyconych kwasów tłuszczowych.
13. Preparat strukturalnych lipidów, znamienny tym, że wytworzony jest przez traktowanie ekstraktu lipidowego określonego w zastrz. 9 albo 10, albo 11, albo 12 lipazą grzybową, aby przeprowadzić kwasy tłuszczowe w pozycjach 1i 3 w kwasy tłuszczowe o łańcuchu C8-12.
14. Ekstrakt lipidowy według zastrz. 9 albo 10, albo 11, albo 12, lub preparat strukturyzowanych lipidów określony w zastrz. 13, znamienny tym, że mikroorganizmem jest szczep Ulkenia sp. SAM 2179 (FERM BP-5601).
15. Środek odżywczy uzupełniający żywność, znamienny tym, że zawiera ekstrakt lipidowy określony w zastrz. 9 albo 10, albo 11, albo 12, albo 14.
16. Zastępcze sztuczne mleko matki dla niemowląt odpowiednie dla żywienia niemowląt, znamienne tym, że zawiera ekstrakt lipidowy określony w zastrz. 9 albo 10, albo 11, albo 12, albo 14.
17. Zastępcze sztuczne mleko matki dla niemowląt odpowiednie dla żywienia niedojrzałych niemowląt, znamienne tym, że zawiera ekstrakt lipidowy określony w zastrz. 9 albo 10, albo 11, albo 12, albo 14.
18. Żywność dla niemowląt, znamienna tym, że zawiera ekstrakt lipidowy określony w zastrz. 9 albo 10, albo 11, albo 12, albo 14.
19. Żywność dla starych ludzi, znamienna tym, że zawiera ekstrakt lipidowy określony w zastrz. 9 albo 10, albo 11, albo 12, albo 14.
20. Ekstrakt dojelitowy dla wspomagania żywienia, znamienny tym, że zawiera ekstrakt lipidowy określony w zastrz. 9 albo 10, albo 11, albo 12, albo 14.
21. Pasza dla zwierząt, znamienna tym, że zawiera ekstrakt lipidowy określony w zastrz. 9 albo 10, albo 11, albo 12, albo 14, lub komórki określone w zastrz. 5 albo 6, albo 7.

PL 193 818 B1
22. Dodatek do paszy dla zwierząt, znamienny tym, że zawiera ekstrakt lipidowy określony w zastrz. 9 albo 10, albo 11, albo 12, albo 14, lub komórki określone w zastrz. 5 albo 6, albo 7.
23. Przynęta zooplanktonu dla paszy, znamienna tym, że zawiera ekstrakt lipidowy określony w zastrz. 9 albo 10, albo 11, albo 12, albo 14, lub komórki określone w zastrz. 5 albo 6, albo 7.
24. Żywność dla spodziewających się dziecka lub karmiących matek, znamienna tym, że zawiera ekstrakt lipidowy określony w zastrz. 9 albo 10, albo 11, albo 12, albo 14.
25. Zastosowanie mikroorganizmu należącego do rodzaju Ulkenia posiadającego zdolność do wytwarzania lipidów zawierających kwas dokozaheksaenowy i/lub kwas dokozapentaenowy, korzystnie szczepu Ulkenia sp. SAM 2179 (FERM BP-5601) jako środka odżywczego stanowiącego dodatek uzupełniający żywność.
26. Zastosowanie ekstraktu lipidowego określonego w zastrz. 9 albo 10, albo 11, albo 12, albo 14 jako środka odżywczego stanowiącego dodatek uzupełniający żywność.
27. Zastosowanie preparatu strukturyzowanych lipidów określonych w zastrz. 13 albo 14, jako środka odżywczego stanowiącego dodatek uzupełniający żywność.
28. Zastosowanie według zastrz. 26 albo 27, w którym dodatek żywności wprowadzony jest do produktu żywnościowego dla spodziewających się dziecka i karmiących matek, niemowląt, niedojrzałych niemowląt lub starych ludzi.
29. Zastosowanie według zastrz. 26 albo 27, albo 28, jako środek dojelitowy dla wspomagania żywienia.
30. Zastosowanie według zastrz. 25 albo 26, albo 27, albo 28 jako paszy dla zwierząt.
31. Zastosowanie według zastrz. 25 jako przynęta zooplanktonu dla paszy.
32. Zastosowanie według zastrz. 30, w którym mikroorganizm należący do rodzaju Ulkenia jest zastosowany po suszeniu lub sterylizacji.