PL200908B1 - Sposób otrzymywania desglukodesramnoruscyny - Google Patents

Abstract

Sposób otrzymywania desglukodesramnoruscyny polegaj acy na przeprowadzaniu hydrolizy wi azania heterozydowego glikozydów steroidowych pochodz acych z Ruscus Aculeatus. PL PL PL PL

Description

Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania desglukodesramnoruscyny, która jest pochodną glikozydu steroidowego (ruskosaponiny) z Ruscus Aculeatus (Myszopłoch) na drodze hydrolizy enzymatycznej wiązania heterozydowego.

Znane są wprawdzie w stanie techniki metody enzymatycznej hydrolizy, np. przy użyciu betaglukozydazy z Aspergillus oryzae (DE 22 02 393), oraz ujawniona w publikacji Perepelista i wsp., Prikladnaya Biokhimiya Mikrobiologiya 1975, 11, str. 901-905 hydroliza steroidowej saponiny - protodioscyny przez Aspergillus niger. Jednakże hydrolazowa aktywność enzymatyczna ujawniona w stanie techniki nie pozwala na hydrolityczny rozkład wiązania ramnoza/arabinoza, zajmuje się natomiast rozkładem wiązania glukoza/ramnoza.

Przedmiotem wynalazku jest zatem sposób otrzymywania desglukodesramnoruscyny, polegający na tym, że przeprowadza się częściową hydrolizę enzymatyczną ruscyny, desglukoruscyny lub ruskozydu (ruskosaponiny) za pomocą nieoczyszczonych preparatów opartych o ekstrakty hydrolaz z Aspergillus niger, przy czym wspomniane preparaty enzymatyczne posiadają jednocześnie aktywność β-glukopiranozydazy i α-ramnopiranozydazy i prowadzi się sekwencyjne usuwanie reszty β-glukozydowej, po którym następuje usuwanie reszty α-ramnozowej.

Jak wspomniano wyżej, hydroliza enzymatyczna według wynalazku jest prowadzona za pomocą nie oczyszczonych preparatów enzymatycznych w oparciu o, ekstrahowane z Aspergillus niger, hydrolazy. Wspomniane preparaty są komercjalnie dostępne i są stosowane w przemyśle winiarskim i spożywczym. Szczególnie korzystnym jest zastosowanie preparatów dostępnych w sprzedaży z Gist Brocades, pod znakiem towarowym Cytolase PCL5.

Wspomniane preparaty enzymatyczne mają jednocześnie aktywność glukopiranozydazy i α-ramnopiranozydazy i dlatego zapewniają ciągłe usuwanie reszty β-glukozydowej a następnie usunięcia reszty α-ramnozowej do otrzymania pożądanego produktu.

Korzystnie w sposobie według wynalazku hydrolizę prowadzi się w wodnym roztworze o pH 5 lub w mieszaninie wodno-etanolowej zawierającej do 30% objętościowych etanolu.

Zaobserwowano, że w praktyce obecność etanolu nie zmienia niekorzystnie aktywności enzymatycznej; aktywność β-glukopiranozydazy wzrasta w obecności etanolu, podczas gdy z drugiej strony, aktywność α-ramnozopiranozydazy nieznacznie spada, lecz do stopnia, który w żaden sposób nie zmienia reakcji według wynalazku. Procentowa zawartość etanolu około 30% v/v jest konieczna do całkowitego rozpuszczenia desglukoruscyny, podczas gdy niższa zawartość procentowa około 17% v/v jest wymagane dla ruskozydu. Zastosowanie tej ostatniej może być czasem preferowane także dlatego, że nie wymagane jest wtedy specyficzne traktowanie wstępne i z powodu swoich właściwości środka powierzchniowo czynnego rozpuszcza desglukoruscynę pochodząca z pierwszego etapu hydrolizy enzymatycznej, która może być następnie bardziej skutecznie przekształcana w α-ramnozopiranozydazę.

Także korzystnie stężenie ruskosaponin wynosi od 5 do 40% w/v. Hydrolizę prowadzi się w temperaturze od 20 do 40°C przez czas od 3 do 7 dni, a produkt końcowy odzyskuje się przez wirowanie i przemywanie metanolem.

Na koniec tego procesu biokonwersji, ostateczny produkt desglukodesramnoruscyna, nierozpuszczalna w układzie reakcyjnym, może być łatwo przekształcana przez wirowanie i następnie przez przemywanie metanolem. Ponadto, sposób według wynalazku dzięki stabilności zastosowanego enzymu może być przeprowadzony w sposób ciągły, usuwając hydrolizowany produkt w określonym ustalonym czasie i dodając w sposób ciągły świeży substrat. Do tego celu, aby uniknąć zbierania się inhibitorów i cząsteczek denaturujących, korzystne będzie stosowanie bioreaktora wyposażonego w membranę do ultrafiltracji. Następujące przykłady szczegółowo ilustrują wynalazek.

P r z y k ł a d

Preparat enzymatyczny Cytolase PCL5 (Gist Brocades) przed zastosowaniem był diafiltrowany wobec 0,1 M buforu cytryniano-fosforanowego w aparacie Amicon wyposażonym w membranę XM (cut-off 50 kDa) w celu usunięcia czynników denaturujących i inhibitorów.

Mieszanina inkubacyjna była sporządzona przez dodanie w następującym porządku: substrat (desglukoruscyna lub ruskozyd), 0,1 M bufor cytrynianowofosforanowy pH 5,0, Cytolase PCL5 i powoli mieszając, etanol. Stężenie substratu wahało się od 5 do 40% (w/v) i stężenie etanolu od 0 do 30% (v/w). Reakcja była kontynuowana na płytkach silikażelu (60 F250 Merck) z eluentem octan etyPL 200 908 B1 lu/metanol/woda 100:15:10. Aktywacja preparatu enzymatycznego wynosiła 38 jednostek β-glukopiranozydazy i 2,3 jednostek α-ramnopiranozydazy na ml mieszaniny inkubacyjnej.

Biokonwersję przeprowadzano w temperaturze 25°C. Przekształcenie w desglukodesramnoruscynę zakończano w ciągu 72 godzin zaczynając z desglukoruscyny i w około 96 godzin zaczynając z ruskozydu.

Mieszanina inkubacyjna była następnie wirowana przy 12,000 g przez 30 minut w 4°C. Precypitat przemywano metanolem i powtórnie wirowano w takich samych warunkach takich jak wyżej. Etap ten powtarzano pięciokrotnie i supernatanty łączono. Roztwór metanolu był następnie odparowywany pod próżnią i otrzymany produkt był ucierany do otrzymania drobnego proszku o kolorze ciemnej czerwieni, zawierającym 20% desglukodesramnoruscynę (próba HPLC).

Claims (5)

1. Sposób otrzymywania desglukodefsamnoruscyny, znamienny tym, że przeprowadza się częściową hydrolizę enzymatyczną ruscyny, desglukoruscyny lub ruskozydu (ruskosaponiny) za pomocą nieoczyszczonych preparatów opartych o ekstrakty hydrolaz z Aspergillus niger, przy czym wspomniane preparaty enzymatyczne posiadają jednocześnie aktywność β-glukopiranozydazy i α-ramnopiranozydazy i prowadzi się sekwencyjne usuwanie reszty β-glukozydowej po którym następuje usuwanie reszty α-ramnozowej.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że hydrolizę prowadzi się w wodnym roztworze o pH 5 lub w mieszaninie wodno-etanolowej zawierającej do 30% objętościowych etanolu.

3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stężenie ruskosaponin wynosi od 5 do 40% w/v.

4. Sposób według zastrz. 1, albo 2, albo 3, znamienny tym, że hydrolizę prowadzi się w temperaturze od 20 do 40°C przez czas od 3 do 7 dni.

5. Sposób według zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4, znamienny tym, że produkt końcowy odzyskuje się przez wirowanie i przemywanie metanolem.