PL207850B1

PL207850B1 - Sposób wytwarzania bicyklicznych związków peptydowych

Info

Publication number: PL207850B1
Application number: PL377635A
Authority: PL
Inventors: Aldo Salimbeni; Davide Poma; Damiano Turozzi; Stefano Manzini; Carlo Alberto Maggi
Original assignee: Menarini Ricerche Spa
Priority date: 2002-12-06
Filing date: 2003-12-04
Publication date: 2011-02-28
Also published as: ES2330102T3; CN1720260A; KR101081256B1; BR0317029A; DE60328915D1; ITFI20020239A1; CA2508696C; JP4593284B2; WO2004052923A2; ATE440105T1; MXPA05005969A; US7999068B2; CN1318445C; CA2508696A1; AU2003289958A1; US20090163695A1; PL377635A1; EP1576000B1; RU2330045C9; WO2004052923A3

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy nowego sposobu wytwarzania bicyklicznych związków peptydowych o wzorze (I), przydatnych jako związki pośrednie do wytwarzania związków farmaceutycznie czynnych, a w szczególnoś ci do wytwarzania bicyklicznych glikopeptydów o wzorze (I-A), o dział aniu antagonistów receptora NK2 tachykininy.

Związki o wzorze (I-A), a zwłaszcza związek [N-4-(2-acetyloamino-2-deoksy-p-D-glukopiranozylo)-L-asparaginylo-L-a-aspartylo-L-tryptofylo-L-fenyloalanylo-L-2,3-diaminopropionylo-L-leucylo]-C-4,2-N-3,5-laktamo-C-1,6-N-2,1-laktam (związek o wzorze (I-A), w którym R1=R2=R3=H, znany pod nazwą handlową „nepadutant) są związkami o silnym działaniu jako antagoniści receptora NK2 tachykininy i w związku z tym mogą być stosowane do wytwarzania środków farmaceutycznych do leczenia chorób i są przydatne w leczeniu i profilaktyce chorób, w których tachykininy odgrywają rolę, jako neuromodulatory.

Związek ten i pewne związki pośrednie opisano w EP nr 815126 B1, zwłaszcza w przykładzie 4. W dokumencie tym, na stronach 4 i 5 opisano sposoby, znane z literatury, syntezy w roztworze lub w fazie stałej liniowych peptydów na drodze sekwencyjnego sprzęgania odpowiednio zabezpieczonych aminokwasów, a następnie ich końcową cyklizację, w celu otrzymania związków o ogólnym wzorze (I).

Sposoby te opisano bardzo ogólnie, a więcej szczegółów podano w opisie wytwarzania związków w przykładach 1 i 2. W przykładach tych jako syntezę zastosowano sprzęganie Fmoc-aminokwasów w fazie stałej do otrzymania liniowego peptydu, który po odłączeniu od żywicy cyklizuje się, oczyszcza metodą HPLC i cyklizuje ponownie. Należy podkreślić, że w tym sposobie syntezy boczną, grupę glikozydową wprowadza się na etapie syntezy w fazie stałej liniowego peptydu na żywicy, jako boczny łańcuch odpowiednio zabezpieczonej asparaginy.

Nieoczekiwanie odkryto nowy i bardziej wydajny sposób wytwarzania bicyklicznych związków peptydowych o wzorze (I), przydatnych jako związki pośrednie do wytwarzania związków o działaniu farmakologicznym.

Nowy sposób prowadzi się całkowicie w roztworze, a nie w fazie stałej, przy czym umożliwia on wytwarzanie produktów o wysokiej czystości i z wysoką wydajnością.

Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania bicyklicznych związków peptydowych o wzorze (I) (SEQ. ID. 1)

w fazie ciekłej, obejmującego następujące etapy:

1) odbezpieczanie liniowego pentapeptydu o wzorze (II) (SEQ. ID. 2) w obecności rozpuszczalnika z wytworzeniem związku o wzorze (III):

PL 207 850 B1

gdzie A1 i A2 oznaczają dwie różne grupy zabezpieczające atom azotu, a R5 i R6 są różne i oznaczają benzyloksyl lub niższy alkoksyl, w którym część alkilowa oznacza liniową lub rozgałęzioną grupę C1-C4;

2) wewnątrzcząsteczkową cyklizację związku o wzorze (III) z etapu 1) w obecności rozpuszczalnika i odpowiedniego środka sprzęgającego, z wytworzeniem związku o wzorze (IV) (SEQ. ID. 3):

gdzie R5 ma znaczenie podane wyżej;

3) odbezpieczanie związku o wzorze (IV) z etapu 2) w obecności rozpuszczalnika, z wytworze-

PL 207 850 B1

4) sprzęganie związku o wzorze (V) z etapu 3) z zabezpieczonym aminokwasem o wzorze (VIa) w obecnoś ci rozpuszczalnika, z wytworzeniem zwią zków o wzorze (VII) (SEQ.ID.4):

gdzie A3 oznacza grupę zabezpieczającą atom azotu; R7 oznacza benzyloksyl lub niższy alkoksyl, w którym część alkilowa oznacza liniową lub rozgałęzioną grupę C1-C4; R8 oznacza resztkową grupę pochodzącą z procedury aktywacji grupy karboksylowej;

5) odbezpieczanie związku o wzorze (VII) z etapu 4) w obecności rozpuszczalnika, z wytworzeniem związku o wzorze (VIII)

gdzie R7 ma znaczenie podane wyżej;

6) wewnątrzcząsteczkową cyklizację, w obecności rozpuszczalnika i odpowiedniego środka sprzęgającego, związku o wzorze (VIII) z etapu 5), z wytworzeniem bicyklicznego związku o wzorze (IX)

PL 207 850 B1

7) odbezpieczanie bicyklicznego związku o wzorze (IX) z etapu 6) w obecności rozpuszczalnika, z wytworzeniem związku o wzorze (I)

gdzie R7 ma znaczenie podane wyżej.

Związek o wzorze (III) jest przedstawiony SEQ. ID.2.

Związki o wzorze (I) można stosować np. do wytwarzania bicyklicznych związków glikopeptydowych o wzorze (I-A), które wykazują silne działanie antagonistyczne w stosunku do receptora NK2 tachykininy; w nowym sposobie wytwarzania, w którym boczną grupę glikozydową wprowadza się do związków o wzorze (I) w reakcji prowadzonej w roztworze, oczyszczanie w końcowym etapie na drodze HPLC nie jest konieczne, tak że produkcję tych związków w dużej skali można prowadzić przy kosztach zdecydowanie niższych niż w przypadku znanego sposobu.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania bicyklicznego związku glikopeptydowego o wzorze (I-A) (SEQ. ID. 5)

PL 207 850 B1 w którym R1, R2 i R3, które są takie same lub różne, mogą oznaczać atom wodoru lub grupę zabezpieczającą atom tlenu, obejmujący następujące etapy:

1A) aktywację bicyklicznych związków peptydowych o wzorze (I) odpowiednim środkiem sprzęgającym, z wytworzeniem pochodnej o wzorze (II-A)

w którym R oznacza benzotriazol, ewentualnie podstawiony atomem chlorowca, azabenzotriazol lub sukcynoimidyl;

2A) reakcję związku o wzorze (II-A) z etapu 1A) w obecności rozpuszczalnika z pochodną glikozydową o wzorze (III-A)

gdzie R, R1, R2 i R3 mają znaczenie podane wyżej, w którym stosuje się bicykliczny związek peptydowy o wzorze (I) otrzymany sposobem będącym przedmiotem wynalazku.

PL 207 850 B1

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania związku o wzorze (I-A) ze związków o wzorze (II) i o wzorze (III), z pośrednim wytwarzaniem związku o wzorze (I), jak to opisano w dwóch wyżej wspomnianych sposobach.

Sposoby według wynalazku, prowadzone wyłącznie jako reakcje w roztworze, a nie w fazie stałej, wykazują nieoczekiwanie wysokie wydajności i nie wymagają stosowania oczyszczania metodą HPLC, co umożliwia znaczące zmniejszenie kosztów produkcji i prowadzenie syntezy w dużej skali.

Grupy zabezpieczające atom azotu stosowane w sposobach według wynalazku można wybrać spośród dowolnych grup zabezpieczających, które można stosować w syntezie peptydów, takiej jak to opisano w M. Bodansky, Peptide Chemistry, Springer Verlag 1988 lub w J. Jones, „The Chemical Synthesis of Peptides, Clarendon Press, Oxford 1994.

Według wynalazku grupy zabezpieczające atom azotu korzystnie są wybrane spośród benzyloksykarbonylu i alkoksykarbonylu, w którym część alkilową stanowi liniowa lub rozgałęziona grupa C1-C4; korzystniej są one wybrane spośród t-butoksykarbonylu (Boc) i benzyloksykarbonylu (Z).

R8 oznacza resztkową grupę pochodzącą z procedury aktywacji, korzystnie wybraną z grupy obejmującej benzyloksykarbonyl, alkoksykarbonyl, w którym część alkilową stanowi liniowa lub rozgałęziona grupa, sukcynoimidyl, benzotriazol ewentualnie podstawiony atomem chlorowca i azabenzotriazol.

Liniowe peptydy o wzorze (II) można otrzymać z zastosowaniem jednej z następujących strategii:

a) Strategia stopniowa: W przypadku tej strategii aminokwasy niezbędne do otrzymania peptydu o wzorze (II) sprzęga się kolejno wychodząc z pochodnej aminokwasu Dpr o wzorze (X), zabezpieczonej przy atomie azotu i otrzymanej osobno lub wytworzonej in situ

gdzie:

A2 i A4, oznaczają różne grupy zabezpieczające atom azotu, tak to podano powyżej;

R9 oznacza resztkową grupę pochodzącą z procedury aktywacji, korzystnie wybraną z grupy obejmującej benzyloksykarbonyl, alkoksykarbonyl, w którym część alkilową stanowi liniowa lub rozgałęziona grupa i sukcynoimidyl;

pochodną o powyższym wzorze (X) poddaje się reakcji z estrem Leu (XI) w obecności rozpuszczalnika

w którym R5 ma znaczenie podane wyż ej, z wytworzeniem dipeptydu A4-Dpr (A2)-Leu-R5, który nastę pnie odbezpiecza si ę w odpowiedni sposób, zależny od grupy zabezpieczającej atom azotu, która ma być usunięta i kompatybilny z grupą zabezpieczającą, która ma być utrzymana.

Odbezpieczony w ten sposób dipeptyd następnie sprzęga się z uaktywnionym estrem aminokwasu Phe, a następnie kolejno z Trp i Asp, aż do otrzymania związków o wzorze (II).

b) Strategia 2+2+1: strategia ta obejmuje sprzęganie mono-odbezpieczonego dipeptydu H-Dpr(A2)-Leu-R5, otrzymanego w sposób opisany powyżej w strategii a), z uaktywnioną pochodną dipeptydu o wzorze (XII)

As-Trp-Phe-OH (XII) przy czym A2 i A5, oznaczają różne grupy zabezpieczające atom azotu, jak to określono powyżej; otrzymaną osobno lub wytworzoną in situ przez sprzęganie uaktywnionego estru Trp, zabezpieczonego przy atomie azotu, otrzymanego osobno lub wytworzonego in situ, z estrem Phe, a następnie hydrolizę grupy estrowej.

Otrzymany tetrapeptyd As-Trp-Phe-Dpr (A2)-Leu-R5 dogodnie odbezpiecza się przez usunięcie grupy przyłączonej do atomu azotu w Trp i sprzęga się ze związkiem o wzorze (VIb)

PL 207 850 B1

Α-,-ΗΝ COOR₈(VI b) w którym A1, R6 i R8 mają znaczenie podane wyżej.

c) Strategia 3+2: zgodnie z tą strategią tripeptyd A1-Asp(R6)-Trp-Phe-OH, otrzymany przez usunięcie grupy zabezpieczającej atom azotu ze związków o powyższym wzorze (XII), a następnie sprzęganie ze związkiem o powyższym wzorze (VIb), sprzęga się z mono-odbezpieczonym dipeptydem H-Dpr-(A2)-Leu-R5 otrzymanym w sposób opisany zgodnie z procedurą według strategii a).

W opisie określenie „niższy alkoksyl dotyczy grup alkoksylowych, w których część alkilowa oznacza liniową lub rozgałęzioną grupę C1-C4, korzystnie wybraną z grupy obejmującej metyl, etyl, propyl, butyl, izopropyl i t-butyl. Odnosi się to również do grup alkiloksykarbonylowych, w których część alkilową stanowi liniowa lub rozgałęziona grupa C1-C4, korzystnie wybrana z grupy obejmującej metyl, etyl, propyl, butyl, izopropyl i t-butyl.

Środek sprzęgający można wybrać spośród środków powszechnie stosowanych w syntezie peptydów, tak aby otrzymać uaktywnioną pochodną aminokwasu, przy czym środki te opisano np. w M. Bodansky, „Peptide Chemistry, Springer Verlag 1988 lub w J. Jones, „The Chemical Synthesis of Peptides, Clarendon Press, Oxford 1994.

Uaktywnione pochodne, jeśli nie są dostępne w handlu, można otrzymać osobno lub in situ w reakcji aminokwasu lub peptydu i z jednym lub większą liczbą rozlicznych znanych środków sprzęgających, takich jak chloromrówczan izobutylu (IBCF), karbodiimid wybrany spośród dicykloheksylokarbodiimidu (DCC) i chlorowodorku 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)-karbodiimidu (EDAC-HC1), ewentualnie w połączeniu z pochodną hydroksylową wybraną spośród 1-hydroksybenzotriazolu (HOBt), 1-hydroksy-7-azabenzotriazolu (HOAt), 6-chloro-1-hydroksybenzotriazolu (Cl-HOBt) i hydroksysukcynoimidu (HOSu); sól fosfoniowa, sól N-tlenku guanidyny lub sól uroniowa, np. heksafluorofosforan (benzotriazol-1-iloksy)tri(dimetyloamino)fosfoniowy(BOP), heksafluorofosforan (benzotriazol-1-iloksy)-tripirolidynofosfoniowy (PyBOP), heksafluorofosforan 3-tlenku 1[bis(dimetyloamino)metyleno]-1H-benzotriazoliowego(HBTU), heksafluorofosforan 3-tlenku 1-[bis(dimetyloamino)metyleno]-5-chloro-1H-benzotriazoliowego (HCTU), heksafluorofosforan 3-tlenku 1-[bis(dimetyloamino)metyleno]-1H-benzotriazoliowego (TBTU), heksafluorofosforan 3-tlenku 1-[bis(dimetyloamino)metyleno]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridyniowego (HATU), heksafluorofosforan 3-tlenku 1-[bis(dimetyloamino)metyleno]-5-chloro-1H-benzotriazoliowego (TCTU), tetrafluoroboran O-[(etoksykarbonylo)cyjanometylenoamino]-N,N,N',N'-tetrametylouroniowy (TOTU), tetrafluoroboran O-(bicyklo[2.2.1]-hept-5-eno-2,3-dicarboksyimido)-N,N,N',N'-tetrametyluroniowy (TNTU) lub tetrafluoroboran O-(N-sukcynoimidylo)-N,N,N',N'-tetrametyluroniowy (TSTU).

Gdy pochodną wytwarza się in situ, reakcję sprzęgania przeprowadza się bezpośrednio potem przez dodanie innego reagenta, który oczywiście, w przypadku wewnątrzcząsteczkowych cyklizacji, odpowiada wolnemu końcowi aminowemu obecnemu w samej cząsteczce.

Reakcję sprzęgania prowadzi się zazwyczaj w obecności trzeciorzędowej aminy, takiej jak N-metylomorfolina (NMM), trietyloamina (TEA) lub diizopropyloetyloamina (DIPEA) w rozpuszczalniku organicznym wybranym spośród rozpuszczalników zazwyczaj stosowanych w syntezie peptydów. Do korzystnych rozpuszczalników w reakcji sprzęgania należy octan etylu (AcOEt), dimetyloformamid (DMF) i N-metylopirolidon (NMP).

Reakcje sprzęgania można prowadzić w temperaturze, która nie powinna powodować degradacji lub zbyt powolnego przebiegu reakcji, przy czym korzystnie temperatura wynosi od -20 do +50°C.

Odbezpieczanie w sposobach według wynalazku przeprowadza się sposobami odpowiednimi dla usuwanych grup i kompatybilnymi z grupami, które mają być zachowane; zwykle reakcje odbezpieczania w sposobach według wynalazku prowadzi się jako katalityczne uwodornienie lub potraktowanie kwasem albo zasadą.

PL 207 850 B1

W przypadku uwodornienia katalizator można wybrać spośród różnych katalizatorów dostępnych i przydatnych w danym celu; korzystnie stosuje się 5% lub 10% pallad. Rozpuszczalnik w reakcjach odbezpieczania na drodze katalitycznego uwodornienia można wybrać spośród tych rozpuszczalników, które rozpuszczają związki w reakcji, z wyłączeniem ketonów, takich jak aceton, rozpuszczalników, które zatruwają katalizator i tych, które reagują ze składnikami reakcji. Do korzystnych rozpuszczalników w reakcji należy DMF, NMP, kwasy organiczne, takie jak kwas octowy i kwas p-toluenosulfonowy (PTSA) oraz alkohole, takie jak metanol, etanol i izopropanol lub ich mieszaniny. Temperatura reakcji uwodornienia wynosi od -20 do +50°C.

W przypadku odbezpieczania na drodze traktowania kwasem, korzystnie stosuje się kwasy mineralne, takie jak kwas chlorowodorowy lub kwasy organiczne, taki jak kwas trifluorooctowy lub kwas mrówkowy, które można stosować same lub w mieszaninie z innymi rozpuszczalnikami. Temperatura wynosi od -20 do +50°C.

W przypadku odbezpieczania na drodze traktowania zasadą , korzystnie stosuje się wodorotlenki metali alkalicznych i metali ziem alkalicznych, w obecności rozpuszczalnika, takiego jak woda, dioksan, acetonitryl, metanol, etanol, izopropanol lub ich mieszaniny; temperatura wynosi od -20 do +50°C.

Użyte w opisie określenie „grupa zabezpieczająca atom tlenu dotyczy grup zabezpieczających wybranych spośród grup powszechnie stosowanych do zabezpieczania grup -OH, dobrze znanych specjalistom, przy czym są one wybrane np. spośród grup -COR4, gdzie R4 oznacza liniową lub rozgałęzioną grupę alkilową o 1-4 atomach węgla, fenyl ewentualnie podstawiony atomem chlorowca, benzyl lub benzoil; grupę zabezpieczającą atom tlenu korzystnie stanowi acetyl.

Według wynalazku związki glikopeptydowe o wzorze (I-A) można otrzymać w reakcji pochodnej glikozydowej o wzorze (III-A) z uaktywnioną pochodną peptydu o wzorze (II-A), otrzymaną w reakcji aktywowania lub wytworzoną in situ ze związku o wzorze (I). W związku z tym w sposobie wytwarzania bicyklicznych związków glikopeptydowych o wzorze (I-A), grupę glikozydową wprowadza się nie do liniowego peptydu, ale do bicyklicznego związku peptydowego.

Gdy poddaje się reakcji związki o wzorze (III-A), w 30 którym R1, R2 i R3 mają znaczenie inne niż atom wodoru, otrzymane związki o wzorze (I-A) można przeprowadzić w odpowiednie związki, w których R1=R2=R3=H, drogą katalitycznego uwodornienia lub przez potraktowanie kwasem albo zasadą, w zależności od charakteru grup zabezpieczających R1, R2 i R3.

Związki glikozydowe o wzorze (III-A) korzystnie stosowane w sposobie według wynalazku, są wybrane z grupy obejmującej 2-acetamido-2-deoksy-(3-D-glukopiranozyloaminę i 2-acetamido-3,4,6-tri-O-acetylo-2-deoksy-e-D-glukopiranozyloaminę, związki znane z literatury, które można otrzymać np. w sposób opisany odpowiednio w I. Shin i inni, Tetrahedron Letters, 42 (2001), 1325-1328 oraz D. Macmillan i inni. Organic Letters, tom 4, nr 9, 2002.

Poniższe przykłady i schematy syntezy podano w celu zilustrowania wynalazku bez ograniczania jego zakresu.

Na schemacie 1 przedstawiono szlak syntezy, w którym wychodząc ze związków o wzorze (II) dochodzi się do związków o wzorze (I-A), podczas gdy schematy 2-4 przedstawiają 3 różne strategie wytwarzania związków o wzorze (II).

Jako przykładowe grupy zabezpieczające pokazano t-butoksykarbonyl (BOC) i benzyloksykarbonyl (Z) w przypadku aminowych grup końcowych oraz ester metylowy i ester t-butylowy w przypadku karboksylowych grup końcowych.

Liczby podane za każdym związkiem na poszczególnych schematach odpowiadają liczbom przypisanym związkom w przykładach.

Otrzymane związki identyfikowano i ich czystość oznaczano na podstawie analizy elementarnej, HPLC, ¹H-NMR, IR i analizy masowej.

PL 207 850 B1

Schemat 1: Synteza związków o wzorze (I-A)

NFk-Gk-NHAc

NH^GkOriOAcj-NHAc

IBTU, NMM, DMF

HATU, NMM, DMF

Cyklo- [Asp- Asp-Trp-Phe-Dpr-Leu]

Gk( tnO Ac )NHAc

Sposób A

Sposob B

MeONa. MeOH

Cykk>[Asp-Asp-Trp-Phe-Dpr-Leu]

Gk

NHAc

Z-Asp(OtBu)-Trp-Phe-Dpr(BOC)-Leu-OMe | HCOOH

Z-Asp(OH)-Trp-Phe-Dpr(H)-Leu-OMe

PyBOP, NMM, DMF Z- Asp-Τιp-Phe-Dpr-Leu-OMe

NaOH, dioksan - H_oO

Z-Asp-Trp-Plie-Dpr-Leu-OH

1) H₂, Pd/C 10%, NMM, DMF

2) HATU, DEPEA, DMF

Z-Asp(OIBu)-Asp-Tip-Phe-Dpr-Leu-OH

1) H₂, Pd/C 10%, NMM, DMF

2) HATU, DIPEA, DMF

Cyklo[Asp(OTBu)-Asp-Trp-Phe-Dpr-Leu]

HCOOH

Cykk>[Asp(OH)-Asp-Trp-Phe-Dpr-Leu]

PL 207 850 B1

Schemat 2: Synteza związków o wzorze (II) według strategii a) (strategia stopniowa)

Z-Dpr(BOC)-OH + H-Leu-OMe-HCl

1) HOSu, DCC, DMF I 2) NMM, DMF

Z-Dpr(BOC)-Leu-OMe

H₇, Pd/C 10%, MeOH, PTSA r

[H-Dpr(BOC)-Leu-OMe]

Z-Phe-OSu, NMM, DMF

Z-Phe-Dpr(BOC)-Leu-OMe 11

H₇, Pd/C 10%, DMF ▼

(H-Phe-Dpr(BOC)-Leu-OMe] 12

Z-Trp-OSu, NMM, DMF ▼

Z-Trp-Phe-Dpr(BOC)-Leu-OMe 13 | H₂, Pd/C 10%, NMP

[H-Trp-Phe-Dpr(BOC)-Leu-OMe] 14 j Z-Asp(OtBu)-Osu I DEPEA, NMP-CH₃CN

Z-Asp(OtBu)-Trp-Phe-Dpr(BOC)-Leu-OMe 15

PL 207 850 B1

Schemat 3: Synteza związków o wzorze (II) według strategii b) (strategia, 2+2+1)

PL 207 850 B1

Schemat 4: Synteza związków o wzorze (II) według strategii c) (strategia 3+2)

P r z y k ł a d 1

Wytwarzanie Z-Asp(OH)-Trp-Phe-Dpr(H)-Leu-OMe (SEQ. ID.1)

Roztwór Z-Asp(OtBu)-Trp-Phe-Dpr(BOC)-Leu-OMe o stężeniu 72 mmole/l, otrzymany w sposób opisany w przykładzie 15, w 95% kwasie mrówkowym ogrzewano w 40°C pod próżnią przez 4 godziny.

Mieszaninę reakcyjną odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość rozpuszczono w mieszaninie 8:2 CH3CN-H2O.

Zawiesinę ochłodzono do 15-20°C i wartość pH doprowadzono do 6 przez dodanie 20% wodnego roztworu NMM.

Acetonitryl odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem i otrzymaną zawiesinę przesączono.

Otrzymaną białawą substancję stałą przemyto H2O i wysuszono pod próżnią w 30-40°C, w wyniku czego otrzymano produkt z wydajnością 96,4%.

¹H-NMR dimetylosulfotlenek-d6 (DMSO-d6) δ:

0,86 (2d; 6H); 1,47-1,75 (m; 3H); 2,32-2,68 (m; 2H); 2,79-3, 55 (m; 6H); 3,63 (s; 3H); 4,25-4,65 (m; 5H); 4,99 (układ AB; 2H); 6,91-7,43 (m; 14H); 7,48-7,60 (2d; 2H); 7,82 (b; 2H); 8,03-8,43 (4d; 4H); 10,83 (s; 1H); 12,35 (b; 1H).

PL 207 850 B1

P r z y k ł a d 2

Z-Asp-Trp-Phc-Dpr-Leu-Ome

Wytwarzanie ' (SEQ. ID 2)

NMM (2,2 równoważnika) dodano do roztworu 24 mmole/l Z-Asp (OH)-Trp-Phe-Dpr (NH2)-LeuOme w DMF i po 5-10 minutach dodano 1,2 równoważnika PyBOP.

Po mieszaniu przez 2-3 godziny w temperaturze pokojowej roztwór odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem aż do otrzymania płynnej pozostałości, którą wkroplono do 0,5 M wodnego roztworu NaHCO3.

Otrzymaną zawiesinę przesączono i otrzymaną substancję stałą przemyto mieszaniną 4:6 DMF-H2O, a następnie H2O do osiągnięcia obojętnego odczynu pH i wysuszono pod próżnią w 3050°C, w wyniku czego otrzymano produkt z wydajnością 84,2%.

¹H-NMR (DMSO d6) δ:

0,83 (2d; 6H); 1,34-1,69 (m; 3H); 2,31-2,92 (m; 4H); 3,03-3,91 (m; 4H); 3,61 (s; 3H); 4,17-4,63 (m; 5H); 5,01 (układ AB; 2H); 6,84-7,48 (m; 16H); 7,60 (d; 1H); 7,87 (d; 2H); 8,01 (t; 1H); 8,27 (d; 1H); 10,81 (s; 1H).

P r z y k ł a d 3_

Wytwarzanie

Mętny roztwór zawierający 77 mmoli/l _(SEQ. ID 3)

Z-Asp-Trp-Phe-D[?r-LeihOme w mieszaninie 8:2 dioksanH2O ogrzano w 35°C i utrzymywano wartość pH 12,0-12,5 przez powolne i ciągłe dodawanie 1,5N NaOH. Po zakończeniu reakcji mętny roztwór doprowadzono do pH 9 przez dodanie 6N HCl, wyklarowano przez przesączenie przez złoże pomocniczego materiału filtracyjnego i zakwaszono do pH 3 przez ponowne dodanie 6N HCl.

Roztwór zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem do otrzymania dającego się sączyć roztworu. Odsączoną białawą substancję stałą przemyto mieszaniną 1:1 dioksan-H2O, a następnie H2O i wysuszono pod próżnią w 30-40°C, w wyniku czego otrzymano produkt z wydajnością 97,7%.

¹H-NMR (DMSO-d6) δ:

0,84 (2d; 6H); 1,42-1,76 (m; 3H); 2,29-3,48 (m; 7H); 3,85 (m; 1H); 4,10-4,65 (m; 5H); 5,00 (układ AB; 2H); 6,86-7,47 (m; 16H); 7,55-8,36 (4d+m; 5H); 10,80 (d; 1H); 12,65 (b; 1H).

P r z y k ł a d 4

Z-Asp(OtBu)-Asp-Trp-Phe-Dpr-Leu-OH

Wytwarzanie _¹----------- —l_ (SEQ. ID 4)

Z-Asp-Trp-Phe-Dpr-Leu-OH

Roztwór 66 mmoli/l w obecności 1 równoważnika NMM i katalitycznej ilości 10% Pd/C o zawartości wilgoci 50%.

Po prowadzeniu reakcji przez 6 godzin zawiesinę przesączono w celu usunięcia katalizatora, H-As p-T rp-Phe-Dpr-Leu-OH

DMF uwodorniano w temperaturze pokojowej a przesącz rozcieńczono DMF, tak że otrzymano roztwór o stężeniu 53 mmole/l, do którego dodano 4 równoważniki NMM i 1,05 równoważnika Z-Asp(OtBu)Osu.

Po mieszaniu przez 5 godzin w temperaturze pokojowej mieszaninę odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a otrzymaną pozostałość wkroplono do 0,05 NH2SO4.

Otrzymaną zawiesinę przesączono, a otrzymaną substancję stałą przemyto mieszaniną 1:1

DMF-H2O, a następnie H2O i wysuszono pod próżnią w 30-40°C, w wyniku czego otrzymano produkt z wydajnością 93,7%.

¹H-NMR (DMSO-d6) δ:

0,84 (2d; 6H), 1,35 (s; 9H); 1,40-1,70 (m; 3H); 2,20-3,94 (m; 10H); 4,10-4,81 (m; 6H); 4,92-5,12 (układ AB; 2H); 6,74-7,57 (m; 17H); 7,71-8,35 (4d+1t; 5H); 10,70 (s; 1H); 12,70 (b; 1H).

P r z y k ł a d 5

C yklo[ Asp{ OtBu )-Asp-T rp-Phe-Dpr-Leu]

Wytwarzanie_L____i (SEQ. ID 5)

Z-Asp(OtBu)-Asp-Trp-Phe-Dpr-Leu-OH

Roztwór_l —¹_o stężeniu 47 mmoli/l w DMF uwodorniano w temperaturze pokojowej, w obecności 1 równoważnika DIPEA i katalitycznej ilości 10% Pd/C o zawartości wilgoci 50%.

PL 207 850 B1

Po prowadzeniu reakcji przez około 2 godziny zawiesinę przesączono w celu usunięcia kataliH-Asp(OtBu)-Asp-Trp-Phe-Dpr-Leu-OH zatora i rozcieńczono DMF do osiągnięcia stężenia 19 mmoli/l ¹-¹ , po czym dodano 1,4 równoważnika DIPEA i 1,2 równoważnika HATU.

Po mieszaniu przez 30-60 minut w temperaturze pokojowej roztwór odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a otrzymaną pozostałość wkroplono do 0,5 M wodnego roztworu NaHCO3.

Otrzymaną zawiesinę przesączono, a otrzymaną substancję stałą przemyto obficie H2O do obojętnego odczynu pH i wysuszono pod próżnią w 30-50°C, w wyniku czego otrzymano produkt z wydajnością 94,1%.

¹H-NMR (DMSO-d6) δ:

0,88 (2d; 6H); 1,38 (s; 9H); 1,31-1,72 (m; 3H); 2,33-2,99 (m; 6H); 3,20-3,63 (m; 3H); 3,87-4,62 (m; 7H); 6,75-7,50 (m; 13H); 8,04 (b; 1H); 8,56 (d; 1H); 8,76 (d; 1H); 9,18 (b; 1H); 10,84 (s; 1H).

P r z y k ł a d 6_

Wytwarzanie

Cyklo [ Asp( OH)- Asp-Trp-Phe-Dpr-Leu]

I-Ϊ (SEQ. ID 6)

C yklo[ Asp( OtBu)-Asp-Trp-Phe-Dpr-Leu]

Roztwór o stężeniu 83 mmole/l w 90% kwasie mrówkowym ogrzewano w 40°C pod próżnią przez 2 godziny.

Mieszaninę reakcyjną odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a otrzymaną ciężką pozostałość rozpuszczono w H2O.

Otrzymaną zawiesinę przesączono, a otrzymaną substancję stałą przemyto H2O, wysuszono pod próżnią w 30-40°C i na koniec oczyszczono na kolumnie Sephadex LH-20, z elucją metanolem.

Otrzymano 314 g białej substancji stałej (czystość 95,2%, wydajność 82,0%).

¹H-NMR (DMSO-d6) δ:

0, 88 (2d; 6H); 1,31-1,77 (m; 3H); 2,32-3,73 (m; 9H); 3,80-4,65 (m; 7H); 6,82-7,51 (m; 13H); 7,94-9,19 (2d; 2b; 4H); 10,85 (s; 1H); 12,20 (s; 1H).

P r z y k ł a d 7

Cyklo[ As p-Asp-Trp-Phe-Dpr-Leu]

Wytwarzanie 3 równoważniki

GJc(tnOAc)NHAc (SEQ. ID 7)

NMM, 1,2 równoważnika HATU i 2-acetamido-3,4,6-tri-O-acetylo-2-deoksy-eC’ykło[Asp( OH)-Asp-Trp-Phe-Dpr-Leu]

I-—--Ϊ W DMF

-D-glukopiranozyloaminę dodano do roztworu 0,24 mola/l w odstępach 10 minutowych.

Po mieszaniu przez 1 godzinę w 0-4°C mieszaninę reakcyjną odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a otrzymaną płynną pozostałość wkroplono do 1% wodnego roztworu NaHCO3.

Otrzymaną zawiesinę przesączono, a otrzymaną substancję stałą przemyto H2O, wysuszono pod próżnią w 30-40°C i oczyszczono na drodze krystalizacji z mieszaniny EtOH-H2O.

Otrzymano 117 g białej substancji stałej (czystość 96,0%, wydajność 87,0%).

¹H-NMR (DMSO- d6) δ:

10,80 (d; 1H); 8,90 (b; 1H); 8,72 (d; 1H); 8,47 (d; 1H); 8,46 (d; 1H); 8,08 (b; 1H); 7,84 (d; 1H); 7,43 (dd; 1H); 7,33 (dd; 1H); 7,24 (b; 1H); 7,23 (m; 2H); 7,16 (m; 3H); 7,14 (d; 1H); 7,06 (dt; 1H); 7,00 (d; 1H); 6,98 (dt; 1H); 6,90 (t; 1H); 5,18 (dd; 1H); 5,12 (dd; 1H); 4,82 (dd; 1H); 4,18 (dd; 1H); 3,96 (dd; 1H); 3,85 (ddd; 1H); 3,80 (ddd; 1H); 4,53 (m, 1H); 4,47 (m; 1H); 4,43 (m; 1H); 4,39 (m; 1H); 4,16 (m; 1H); 4,08 (m; 1H), 3,58 (m; 1H); 3,30 (m; 1H); 2,98 (m; 1H); 2,88 (m; 1H); 2,86 (m; 1H); 2,70 (m; 1H); 2,65 (m; 1H); 2,60 (m; 1H); 2,19 (m; 1H); 2,00 (s, 3H); 1,96 (s; 3H); 1,90 (s; 3H), 1,73 (s; 3H); 1,65 (m; 1H); 1,52 (m; 1H); 1,37 (m; 1H); 0,92 (d; 3H); 0,85 (d; 3H).

P r z y k ł a d 8

Cvklo[ As p-Asp-Trp-Phe-Dpr-Leu] | I_I (Nepadutantu) (SEQ. ID. 8)

Wytwarzanie

Metoda a) równoważniki NMM i 1,3 równoważnika TBTU oraz 2-acetamido-2-deoksy-e-D-glukopiranozyloaminę dodano w 10 minutowych odstępach do roztworu 83 mmole/l w DMF

CykIo[Asp(OtBu)-Asp-Trp-Phe-Dpr-Leu] (otrzymanego w sposób opisany w przykładzie 6).

PL 207 850 B1

Po mieszaniu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, mieszaninę reakcyjną odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a otrzymaną pozostałość w postaci gęstego oleju rozpuszczono w mieszaninie 2:8 acetonitryl-t-butoksymetan (TBME).

Otrzymaną zawiesinę energicznie mieszano przez 30 minut w temperaturze pokojowej, po czym przesączono ją.

Otrzymaną substancję stałą przemyto TBME, wysuszono pod próżnią w 25-30°C i na koniec oczyszczono metodą preparatywnej HPLC z użyciem jako eluentu mieszanin acetonitrylu i wody.

Otrzymano 151 g białej substancji stałej (czystość 93,0%, wydajność 89,3%).

¹H-NMR (DMSO- d6) δ:

0,85 (d; 3H); 0,92 (d; 3H); 1,36 (m; 1H); 1,51 (m; 1H); 1,65 (m; 1H); 1,76 (s; 3H); 2,16 (dd; 1H); 2,57 (dd; 1H); 2,63 (dd; 1H); 2,67 (dd; 1H); 2,83 (dd; 1H); 2,88 (dd; 1H); 2,93 (m; 1H); 3,04-3,09 (m; 2H); 3,27-3,32 (m; 2H); 3,42 (m; 1H); 3,50 (ddd + b; 2H); 3,65 (dd; 1H); 3,96 (b; 1H); 4,09 (m; 1H); 4,12 (m; 1H); 4,35 (m; 1H); 4,43 (m; 1H); 4,50 (m; 1H); 4,53 (m + t; 2H); 4,81 (dd; 1H); 4,94 (d; 1H); 4,98 (d; 1H); 6,91 (b; 1H); 6,98 (t + b; 2H); 7,06 (t; 1H); 7,14-7,17 (m; 4H); 7,24 (t; 2H); 7,27 (b; 1H); 7,33 (d; 1H); 7,42 (d; 1H); 7,77 (d; 1H); 8,05 (b; 1H); 8,10 (d; 1H); 8,51 (d; 1H); 8,77 (d; 1H); 9,00 (b; 1H); 10,84 (d; 1H).

Metoda b)

0,1N NaOMe w MeOH (0,04 równoważnika) dodano do roztworu 0,89 mola/l

Cyklo[ Asp-Asp-Τι p-Phe-Dpr-Leu] _<jlc(tnQAc)NHAc_w MeOH, otrzymanego w sposób opisany w przykładzie 7.

Po mieszaniu przez 3 godziny w temperaturze pokojowej wartość pH doprowadzono do 6,5-7 i dodano żywicy Amberlyst® 15. Po usunięciu żywicy roztwór zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i otrzymano pozostałość, którą rozcieńczono TBME.

Otrzymaną zawiesinę przesączono i otrzymaną białą substancję stałą przemyto TBME i wysuszono pod próżnią w 35-40°C, w wyniku czego otrzymano produkt z wydajnością 94,8%.

P r z y k ł a d 9

Wytwarzanie Z-Dpr(BOC)-Leu-OMe

Sposób a)

NMM (1,2 równoważnika) dodano do roztworu 0,66 mola/l Z-Dpr(BOC)-OH w DMF. Roztwór ochłodzono do -25°C i wkroplono 1 równoważnik IBCF, utrzymując temperaturę poniżej -20°C.

Po około 10 minutach wkroplono uprzednio ochłodzono roztwór o stężeniu 0,78 mola/l zawierający 1 równoważnik H-Leu-OME*HCl i NMM w DMF, utrzymując przez cały czas temperaturę poniżej -15°C.

Po mieszaniu przez 1 godzinę mieszaninę reakcyjną wkroplono do 0,5 M wodnego roztworu NaHCO3.

Otrzymaną zawiesinę przesączono i otrzymaną substancję stałą przemyto kolejno H2O, 0,05 NH2SO4 i H2O do obojętnego odczynu pH i wysuszono pod próżnią w 30-50°C, w wyniku czego otrzymano produkt z wydajnością 89,0%.

temperatura topnienia 122-125°C;

¹H-NMR (DMSO-d6) δ:

0,85 (2d; 6H); 1,37 (s; 9H); 1,40-1,71 (m; 3H); 3,01-3,36 (m; 2H); 3,61 (s; 3H); 4,06-4,37 (m; 2H); 5,03 (s; 2H); 7,35 (s; 5H); 6,66 (t; 1H); 7,20 (d; 1H); 8,29 (d; 1H).

Sposób b)

DCC (1 równoważnik) dodano do roztworu 0,35 mola/l Z-Dpr(BOC)-OH w DMF zawierającym 1 równoważnik HOSu, ochłodzonym do 0-5°C. Mieszaninę doprowadzono do temperatury pokojowej i mieszano przez 1 godzinę. DCC odsączono i do klarownego przesączu dodano 1,2 równoważnika H-Leu-Ome*HCl i 2,6 równoważnika NMM. Po mieszaniu przez 2-3 godziny w temperaturze pokojowej mieszaninę rozcieńczono 0,5 N NaHCO3, a następnie ochłodzono do -5°C.

Otrzymaną zawiesinę przesączono i otrzymaną substancję stałą przemyto kolejno 0,5 N NaHCO3, mieszaniną 2:1 H2O-DMF i wodą, po czym wysuszono pod próżnią w 30-40°C, w wyniku czego otrzymano produkt z wydajnością 93%.

P r z y k ł a d 10

Wytwarzanie H-Dpr(BOC)-Leu-OMe

Roztwór 0,14 mola/l Z-Dpr(BOC)-Leu-OMe w MeOH zawierającym 1 równoważnik PTSA uwodorniano w temperaturze pokojowej w obecności katalitycznej ilości 10% Pd/C, 50% wilgoci.

PL 207 850 B1

Po prowadzeniu reakcji przez około 2 godziny zawiesinę przesączono w celu usunięcia katalizatora i przesącz rozcieńczono DMF.

MeOH i H2O całkowicie odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość w postaci roztworu DMF zawierającego dipeptyd zastosowano do prowadzonego następnie sprzęgania.

P r z y k ł a d 11

Wytwarzanie Z-Phe-Dpr(BOC)-Leu-OMe

Związek ten otrzymano z dipeptydu H-Dpr(BOC)-Leu-OMe z przykładu 10, w sposób opisany w przykładzie 9, z użyciem Z-Phe-OH.

¹H-NMR (DMSO-d6) δ:

0,86 (2d; 6H); 1,38 (s; 9H); 1,40-1,74 (m; 3H); 2,73-3,02 (m; 2H); 3,10-3,41 (m; 2H); 3,62 (s; 3H); 4,17-4,46 (m; 3H); 4,94 (układ AB; 2H); 7,18-7,39 (m; 10H); 6,52 (t; 1H); 7,52 (d; 1H); 8,13 (d; 1H); 8,25 (d, 1H).

P r z y k ł a d 12

Wytwarzanie H-Phe-Dpr(BOC)-Leu-OMe

Związek otrzymano z zabezpieczonej pochodnej z przykładu 11, sposobem według przykładu 10, z użyciem DMF jako rozpuszczalnika.

P r z y k ł a d 13

Wytwarzanie Z-Trp-Phe-Dpr(BOC)-Leu-OMe (SEQ. ID. 9)

Związek otrzymano sposobem według przykładu 9 z tripeptydu z przykładu 12, z użyciem Z-Trp-OH lub przez sprzęganie dwóch dipeptydów, Z-Trp-Phe-OH i H-Dpr(BOC)-Leu-OMe, otrzymanych w sposób opisany odpowiednio w przykładach 17 i 10.

¹H-NMR (DMSO-d6) δ:

0,86 (2d; 6H); 1,37 (s; 9H); 1,40-1,76 (m; 3H); 2,73-3,41 (m; 6H); 3,62 (s; 3H), 4,16-4,67 (m; 4H); 4,93 (układ AB; 2H); 6,89-7,65 (m; 16H); 6,55 (t; 1H); 8,07 (d; 1H); 8,11 (d; 1H); 8,29 (d; 1H); 10,79 (s; 1H).

P r z y k ł a d 14

Wytwarzanie H-Trp-Phe-Dpr(BOC)-Leu-OMe (SEQ. ID. 10) Związek otrzymano z zabezpieczonej pochodnej z przykładu 13, sposobem podanym w przykładzie 10, z użyciem NMP jako rozpuszczalnika.

P r z y k ł a d 15

Wytwarzanie Z-Asp(OtBu)-Trp-Phe-Dpr(BOC)-Leu-OMe (SEQ. ID. 11)

Sposób a)

CH3CN (1 objętość), 1,5 równoważnika DIPEA i 1,15 równoważnika Z-Asp(OtBu)-OSu dodano do roztworu 0,16 mola/l H-Trp-Phe-Dpr(BOC)-Leu-OMe w NMP, pochodzącego z reakcji uwodornienia. Po mieszaniu przez 3-4 godziny w temperaturze pokojowej mieszaninę reakcyjną ochłodzono do 5°C i rozcieńczono H2O. Otrzymaną zawiesinę przesączono i substancję stałą przemyto mieszaniną 3:7 CH3CN-H2O oraz H2O, a następnie wysuszono pod próżnią w 30-50°C, w wyniku czego otrzymano produkt z wydajnością 90%.

Sposób b)

DIPEA (1 równoważnik), 1,1 równoważnika TBTU oraz, po 5 minutach, 1 równoważnik roztworu 0,25 mola/l H-Dpr(BOC)-Leu-OMe w DMF, pochodzącego z reakcji uwodornienia (przykład 10), dodano do roztworu 0,22 mola/l Z-Asp-(OtBu)-Trp-Phe-OH w DMF, ochłodzonego do -5°C, utrzymując temperaturę poniżej -5°C.

Po mieszaniu przez około 2 godziny mieszaninę reakcyjną rozcieńczono 0,5 M wodnym roztworem NaHCO3.

Otrzymaną zawiesinę przesączono, a otrzymaną substancję stałą przemyto kolejno H2O, mieszaniną 3:4 DMF-0,5M NaHCO3 w H2O oraz H2O, po czym wysuszono pod próżnią w 30-40°C i otrzymano produkt z wydajnoś cią 84,4%.

temperatura topnienia 215-218°C;

¹H-NMR (DMSO-d6) δ:

0,86 (2d; 6H); 1,34 (s; 9H); 1,37 (s; 9H), 1,40-1,72 (m; 3H); 2,23-2,67 (m; 2H); 2,71-3,39 (m; 6H); 3,62 (s; 3H); 4,23-4,58 (m; 5H); 5,01 (układ AB, 2H); 6,89-7,58 (m; 16H); 6,50 (t; 1H); 7,87-8,29 (4d; 4H); 10,78 (s; 1H).

P r z y k ł a d 16

Wytwarzanie Z-Trp-Phe-OMe

PL 207 850 B1

Związek otrzymano sposobem z przykładu 9, przez sprzęganie dwóch aminokwasów, Z-Trp-OH i H-Phe-OMe.

¹H-NMR (CDCI3) δ:

2,88-2, 98 (m; 2H); 3,11 (dd; 1H); 3,32 (dd; 1H); 3,62 (s; 3H); 4,40-4,58 (m; 1H); 4,16-4,30 (m; 1H); 5,11 (s; 2H); 5,45 (d; 1H), 6,11 (d; 1H); 6,72-4,85 (m; 2H), 6,92-7,46 (m; 12H); 7,67 (d; 1H); 8,03 (s; 1H).

P r z y k ł a d 17

Wytwarzanie Z-Trp-Phe-OH

Związek otrzymano z estru metylowego z przykładu 16, w sposób opisany w przykładzie 3.

¹H-NMR (DMSO-d6) δ:

2,70-3,15 (m; 4H); 4,20-4,36 (m; 1H); 4,38-4,55 (m; 1H); 4,92 (s; 2H); 4,85-7,42 (m; 15H); 7,63 (d; 1H); 8,26 (d; 1H); 10,81 (s; 1H); 12,30 (b; 1H).

P r z y k ł a d 18

Wytwarzanie H-Trp-Phe-OH

Związek otrzymano z zabezpieczonej pochodnej z przykładu 17, sposobem z przykładu 10, z użyciem kwasu octowego jako rozpuszczalnika.

P r z y k ł a d 19

Wytwarzanie Z-Asp(OtBu)-Trp-Phe-OH

Związek otrzymano sposobem z przykładu 15 (sposób a) z dipeptydu z przykładu 18.

¹H-NMR (DMSO-d6) δ:

1,35 (s; 3H); 2,21-2,67 (m; 2H); 2,71-3,18 (m; 4H); 4,22-4,58 (m; 3H); 5,00 (układ AB; 2H); 6,877,43 (m; 14H); 7,55 (m; 2H); 7,94 (d; 1H); 8,17 (d; 1H); 10,80 (s; 1H); 12,25 (b; 1H).

PL 207 850 B1

LISTA SEKWENCJI <110> Menarini Ricerche S.p.A.

<120> Sposób wytwarzania bicyklicznych związków peptydowych

<130>	3874PTWO
<150>	FI2002A000239
<151>	12.06.2002
<160>	11
<170>	Patentln wersja 3.2
<210>	i
<211>	5
<212>	PRT
<213>	pentapeptyd
<220>
<221>	BINDING
<222>	(1) .. (i)
<223>	Asp jest związany z grupą	benzyloksykarbonylową
<220>
<221>	MISC FEATURE
<222>	(4).. (4)
<223>	X oznacza Dpr (czyli kwas	2,3-diaminopropionowy)
<220>
<221>	MOD RES
<222>	(5) . . (5)
<223>	METYLOWANIE
<400>	1
Asp Trp	Phe Xaa Leu
1	5
<210>	2
<211>	5
<212>	PRT
<213>	Sztuczna sekwencja
<220>
<223>	cykliczny pentapeptyd
<220>
<221>	BINDING
<222>	(1) · · (i)
<223>	Asp jest związany z grupą	benzyloksykarbonylową

PL 207 850 B1

<220> <221> <222> <223>	SITE (1) · . (4) Asp ί Dpr są połączone ze sobą i	tworzą pierścień
<220>
<221>	MISC FEATURE
<222>	(4) . , (4)
<223>	X oznacza Dpr (czyli kwas 2,3-diaminopropionowy)
<220>
<221>	MOD kES
<222>	(5).,(5)
<223>	METYLOWANIE
<400>	2
Asp Trp	Phe Xaa Leu
1	5
<210>	3
<211>	5
<91 9>	PRT

<213>	Sztuczna sekwencja
<220>
<223>	cykliczny pentapeptyd
<220>
<221>	BINDING
<222>	(1) ·. (i)
<223>	Asp jest związany z grupą benzyloksykarbonylową
<220>
<221>	SitE
<222>	(1)..(4)
<223>	Asp i Dpr są połączone ze sobą i	tworzą pierścień
<220>
<221>	MISC FEATURE
<222>	(4)..(4)
<223>	X O2h3C23 (czyli Icwcs 2^3 d-4.	ąminopropionowy)
<400>	3
Asp Trp	Phe Xaa Leu
1	5
<210>	4
<211>	6
<212>	PRT
<213>	Sztuczna sekwencja
<220>

PL 207 850 B1

<223>	cykliczny heksapeptyd
<220>
<221>	BINDING
<222>	(1) .. (i)
<223>	Asp jest związany z grupą benzyioksykarbonylową i grupą t-butylową
<220>
<221>	SITE
<222>	(2) . . (5)
<223>	Asp i Dpr są połączone ze sobą i tworzą pierścień
<220>
<221>	MISC FEATURE
<222>	(5) . . (5)
<223>	X oznacza Dpr (czyli kwas 2,3-aminopropionowy)
<400>	4
Asp Asp	Trp Phe Xaa Leu
1	b
<210>	5
<211>	6
<212>	PRT
<213>	Sztuczna sekwencja
<220>
<223>	Blcykliczny heksapeptyd
<220>
<221>	SITE
<222>	(1).. (6)
<223>	Asp i Leu są połączone ze sobą i tworzą pierścień
<220>
<221>	BINDING
<222>	(1) .. (1)
<223>	Asp jest związany z grupą t-butyiową
<220>
<221>	SITE
<222>	(2) .. (4)
<223>	Asp i Dpr są połączone ze sobą i tworzą pierścień
<220>
<221>	MISC FEATURE
<222>	(5) . . (5)
<223>	X oznacza Dpr (czyli kwas 2,3-diaminopropionowy)
<400>	5
Asp Asp	Trp Phe Xaa Leu
1	5

PL 207 850 B1

<2iu> <211> <212> <213>	6 6 PRT Sztuczna sekwencja
<220>
<223>	bicykliczny heksapeptyd
<220>
<221>	SITE
<222>	(1) (6)
<22 3>	Asp i Leu są połączone ze sobą i tworzą pierścień
<220>
<221>	SITE
<222>	(2)..(5)
<223>	Asp i Dpr są połączone ze sobą i tworzą pierścień
<220>
<221>	MISC FEATURE
<222>	(5) . . (5)
<223>	X oznacza Dpr (czyli kwas 2,3-diaminopropionowy)
<400>	6
Asp Asp	Trp Phe Xaa Leu
1	5

<2i0>	7
<211>	6
<212>	PRT
<213>	Sztuczna sekwencja
<220>
<223>	bicykliczny głikopeptyd
<220>
<221>	SITE
<222>	(1)--(6)
<223>	Asp i Leu są połączone ze sobą i tworzą pierścień

<220>

<221> CARBOHYD <222> (1)..(1) <223> Asp jest związany z 2-acetamido-3,4, 6-tri-0 acetyło-2-deoksy-p-D-głukopiranozyioaminą

<220>
<22i>	SITE
<222>	(2) . .	(5)
<223>	Asp i	Dpr są połączone ze sobą i tworzą pierścień
<220>

PL 207 850 B1 <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X oznacza Dpr {czyli kwas 2,3-diaminopropionowy) <400> Asp Asp 1

Trp rae xaa ueu 5 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223>

bicykiiczny glikopeptyd <220>

<221>

<222>

<223>

<220>

<221>

<222>

<223>

SITE (i) .· (6)

Asp i Leu są połączone ze sobą i tworzą pierścień

CARBOHYD (i) . . (1)

Asp jest związany z 2-acetamido-2-deoksy-p-D-glukopiranozyloaminą

<220>
<221>	SITE
<222>	(2).. (5)
<223>	Asp i Dpr są połączone ze
<220>
<221>	MISC EEATURE
<222>	(5) . . (5!
<223>	X oznacza Dpr (czyli kwas
<400>	9
Asp Asp	Trp Phe Xaa Leu
1	5
<210>	9
<211>	4
<212>	PRT
<213>	Sztuczna sekwencja
<220>
<223>	tetrapeptyd
<220>
<221>	BINDING
<222>	(1) . . (1)
<223>	Trp jest związany z grupą

PL 207 850 B1

<220> <221> <222> <223>	MISC FEATURE (3) . . (3) X oznacza Dpr (czyli kwas	2,3-diaminopropionowy)
<220>
<221>	BINDING
<222>	(3) . . (3)
<223>	Dpr jest związany z grupą	t-butoksykarbonylową
<220>
<221>	MOD RES
<222>	(4).. (4)
<223>	METYLOWANIE
<400>	9
Trp Phe	Xaa Leu
1
<210>	10
<211>	4
<212>	PRT
<213>	Sztuczna sekwencja
<220>
<223>	tetrapeptyd
<220>
<221>	MISC FEATURE
<222>	(3) . . (3)
<223>	X oznacza Dpr (czyli kwas	2,3-diaminopropionowy)
<220>
<221>	BINDING
<222>	(3) . . (3)
<223>	Dpr jest związany z grupą	t-butoksykarbonylową
<220>
<221>	MOD RES
<222>	(3).. (3)
<223>	METYLOWANIE
<400>	10
Trp Phe	Xaa Le.u
1
<210>	11
<211>	5
<2±2>	PRT
<213>	Sztuczna sekwencja
<220>

PL 207 850 B1

<223>	pentapeptyd
<220>
<221>	BINDING
<222>	(i).. (i)
<223>	Asp jest związany z grupą	t-butoksylową i z grupą
	benzyloksykarbonyiową
<220>
<221>	MISC FEATURE
<222>	(4) (4)
<223>	X oznacza Dpr (czyli kwas	2,3-diaminopropionowy)
<220>
<221>	BINDING
<222>	(4) . . (4)
<223>	Dpr jest związany z grupą	t-butoksykarbonylową
<220>
<221>	MOD RES
<222>	(4) . . (4)
<223>	METYLOWANIE
<400>	ii
Asp Trp	Phe Xaa Leu
1	5

Zastrzeżenia patentowe

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1) odbezpieczanie liniowego pentapeptydu o wzorze (II) w obecności rozpuszczalnika z wytworzeniem związku o wzorze (III):

PL 207 850 B1 gdzie A1 i A2 oznaczają dwie różne grupy zabezpieczające atom azotu, a R5 i R6 są różne i oznaczają benzyloksyl lub niższy alkoksyl, w którym część alkilowa oznacza liniową lub rozgałęzioną grupę C1-C4;

1. Sposób wytwarzania bicyklicznych związków peptydowych o wzorze (I), w fazie ciekł ej, obejmują cy nastę pują ce etapy:

2. Sposób według zastrz. 1, w którym liniowe peptydy o wzorze (II) wytwarza się według strategii kolejnego sprzęgania odpowiednich aminokwasów, wychodząc z pochodnej aminokwasu Dpr o wzorze (X), zabezpieczonej przy atomie azotu i otrzymanej osobno lub wytworzonej in situ gdzie:

A2 i A4, oznaczają różne grupy zabezpieczające atomy azotu; R9 oznacza resztkową grupę pochodzącą z procedury aktywacji, korzystnie wybraną z grupy obejmującej benzyloksykarbonyl, alkoksykarbonyl, w którym część alkilową stanowi liniowa lub rozgałęziona grupa i sukcynoimidyl; sposobem obejmującym następujące etapy:

- reakcję pochodnej o powyż szym wzorze (X) w obecnoś ci rozpuszczalnika, z estrem Leu o wzorze (XI) w którym R5 ma znaczenie podane w zastrz. 1, z wytworzeniem dipeptydu A4-Dpr (A2)-Leu-R5,

- odbezpieczanie dipeptydu A4-Dpr (A2)-Leu-R5, z wytworzeniem mono-odbezpieczonego dipeptydu H-Dpr (A2)-Leu-R5;

- sprzęganie mono-odbezpieczonego dipeptydu H-Dpr (A2)-Leu-R5 z uaktywnionym estrem następnego aminokwasu Phe, a następnie kolejno z Trp i Asp, aż do wytworzenia związków o wzorze (II).

2) wewnątrzcząsteczkową cyklizację związku o wzorze (III) z etapu 1) w obecności rozpuszczalnika i odpowiedniego środka sprzęgającego, z wytworzeniem związku o wzorze (IV):

3. Sposób według zastrz. 1, w którym liniowe peptydy o wzorze (II) wytwarza się według strategii syntezy obejmującej następujące etapy:

- sprzęganie mono-odbezpieczonego dipeptydu H-Dpr(A2)-Leu-R5, otrzymanego w sposób opisany w zastrz. 2, z uaktywnioną pochodną dipeptydu o wzorze (XII)

As-Trp-Phe-OH (XII) gdzie A2 i A5, oznaczają różne grupy zabezpieczające atom azotu, przy czym pochodna o wzorze (XII) została otrzymana osobno lub wytworzona in situ przez sprzęganie uaktywnionego estru Trp

PL 207 850 B1 zabezpieczonego przy atomie azotu, otrzymanego osobno lub wytworzonego in situ, z estrem Phe, a następnie hydrolizę grupy estrowej, z wytworzeniem tetrapeptydu A5-Trp-Phe-Dpr (A2)-Leu-R5;

- odpowiednie odbezpieczanie tetrapeptydu A5-Trp-Phe-Dpr (A2)-Leu-R5 przez usunięcie grupy przyłączonej do atomu azotu Trp;

- sprzęganie odbezpieczonego tetrapeptydu ze związkiem o wzorze (VIb) w którym A1, R6 i R8 mają znaczenie podane w zastrz. 1.

3) odbezpieczanie związku o wzorze (IV) z etapu 2) w obecności rozpuszczalnika, z wytworzeniem związku o wzorze (V) gdzie R5 ma znaczenie podane wyżej;

PL 207 850 B1

4. Sposób według zastrz. 1, w którym liniowe peptydy o wzorze (II) wytwarza się według strategii syntezy typu 3+2, obejmującej sprzęganie tripeptydu A1-Asp (R6)-Trp-Phe-OH, otrzymanego przez usunięcie grupy zabezpieczającej atom azotu ze związków o wyżej podanym wzorze (XII), a następnie sprzęganie ze związkiem o wyżej podanym wzorze (VIb), a potem dodatkowe sprzęganie z monoodbezpieczonym dipeptydem H-Dpr-(A2)-Leu-R5 otrzymanym w sposób opisany w zastrz. 2.

4) sprzęganie związku o wzorze (V) z etapu 3) z zabezpieczonym aminokwasem o wzorze (VIa) w obecności rozpuszczalnika, z wytworzeniem związków o wzorze (VII):

5. Sposób według zastrz. 1, w którym grupy zabezpieczające atom azotu są wybrane z grupy obejmującej benzyloksykarbonyl i alkoksykarbonyle, w których część alkilową stanowi liniowa lub rozgałęziona grupa C1-C4.

6. Sposób według zastrz. 5, w którym grupy zabezpieczające atom azotu są wybrane spośród t-butoksykarbonylu i benzyloksykarbonylu.

6) wewnątrzcząsteczkową cyklizację, w obecności rozpuszczalnika i odpowiedniego środka sprzęgającego, związku o wzorze (VIII) z etapu 5), z wytworzeniem bicyklicznego związku o wzorze (IX) gdzie R7 ma znaczenie podane wyżej;

PL 207 850 B1

7. Sposób według zastrz. 1, w którym R8 jest wybrany z grupy obejmującej benzyloksykarbonyl, alkiloksykarbonyl zawierający liniową lub rozgałęzioną grupę C1-C4 w części alkilowej, sukcynoimidyl, benzotriazol ewentualnie podstawiony atomem chlorowca i azabenzotriazol.

7) odbezpieczanie bicyklicznego związku o wzorze (IX) etapu 6) w obecności rozpuszczalnika, z wytworzeniem zwią zku wzorze (I)

8. Sposób według zastrz. 1-7, w którym liniowa lub rozgałęziona grupa C1-C4 jest wybrana z grupy obejmującej metyl, etyl, propyl, butyl, izopropyl i t-butyl.

9. Sposób wytwarzania bicyklicznego związku glikopeptydowego o wzorze (I-A) w którym R1, R2 i R3, które są takie same lub różne, mogą oznaczać atom wodoru lub grupę zabezpieczającą atom tlenu, obejmujący następujące etapy:

1A) aktywację bicyklicznych związków peptydowych o wzorze (I) odpowiednim środkiem sprzęgającym, z wytworzeniem pochodnej o wzorze (II-A) w którym R oznacza benzotriazol, ewentualnie podstawiony atomem chlorowca, azabenzotriazol lub sukcynoimidyl;

PL 207 850 B1

2A) reakcję związku o wzorze (II-A) z etapu lA) w obecności rozpuszczalnika z pochodną glikozydową o wzorze (III-A) gdzie R, R1, R2 i R3 mają znaczenie podane wyżej, znamienny tym, że stosuje się bicykliczny związek peptydowy o wzorze (I) otrzymany sposobem określonym w zastrzeżeniu nr 1.

10. Sposób według zastrz. 9, w którym związki o wzorze (I-A), w którym R1, R2 i R3 mają znaczenie inne niż H, przeprowadza się w odpowiednie związki o wzorze (I-A), w którym R1=R2=R3=H, w reakcji odbezpieczania w obecności rozpuszczalnika.

11. Sposób według zastrz. 9, w którym grupy zabezpieczające atom tlenu są wybrane z grupy obejmującej - COR4, gdzie R4 oznacza liniowy lub rozgałęziony C1-C4 alkil, fenyl ewentualnie podstawiony atomem chlorowca, benzyl lub benzoil.

12. Sposób według zastrz. 11, w którym C1-C4 alkil jest wybrany z grupy obejmującej metyl, etyl, propyl, butyl, izopropyl i t-butyl.

13. Sposób według zastrz. 12, w którym C1-C4 alkil stanowi metyl.

14. Sposób według zastrz. 9, w którym pochodne glikozydowe o wzorze (III-A) są wybrane z grupy obejmującej 2-acetamido-2-deoksy-e-D-glukopiranozyloaminę i 2-acetamido-3,4,6-tri-O-acetylo-2-deoksy-e-D-glukopiranozyloaminę.

15. Sposób według zastrz. 1 albo 9, w którym stosuje się środek sprzęgający wybrany z grupy obejmującej chloromrówczan izobutylu, karbodiimid ewentualnie w połączeniu z pochodną hydroksylową, sole fosfoniowe, sole N-tlenku guanidyny i sole uroniowe.

16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że karbodiimidy są wybrane spośród dicykloheksylokarbodiimidu i chlorowodorku 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu; pochodne hydroksylowe są wybrane spośród 1-hydroksybenzotriazolu, 6-chloro-1-hydroksybenzotriazolu, hydroksysukcynoimidu i 1-hydroksy-7-azabenzotriazolu; sole fosfoniowe, sole N-tlenku guanidyny i sole uroniowe są wybrane spośród heksafluorofosforanu (benzotriazol-1-iloksy) tri(dimetyloamino)fosfoniowego, heksafluorofosforanu (benzotriazol-1-iloksy)tripirolidynofosfoniowego, heksafluorofosforanu 3-tlenku 1-[bis(dimetyloamino)metyleno]-1H-benzotriazoliowego, heksafluorofosforanu 3-tlenku 1-[bis(dimetyloamino)metyleno]-5-chloro-1H-benzotriazoliowego, tetrafluoroboranu 3-tlenku 1-[bis(dimetyloamino)-metyleno]-1H-benzotriazoliowego, heksafluorofosforanu 3-tlenku 1-[bis(dimetyloamino)metyleno]PL 207 850 B1

-1H-1,2,3-triazolo [4,5-b]pirydyniowego, tetrafluoroboranu 3-tlenku 1-[bis(dimetyloamino)metyleno]-5-chloro-1H-benzotriazoliowego, tetrafluoroboranu O-[(etoksykarbonylo)cyjanometylenoamino]-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego, tetrafluoroboranu O(bicyklo[2.2.1]hept-5-eno-2,3-dikarboksyimido)N,N,N',N'-tetrametyluroniowego i tetrafluoroboranu O-(N-sukcynoimidylo)-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego.

17. Sposób według zastrz. 1 albo 9, w którym reakcje sprzęgania prowadzi się w obecności trzeciorzędowej aminy w organicznym rozpuszczalniku w temperaturze od -20 do +50°C.

18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że trzeciorzędowa amina jest wybrana z grupy obejmującej N-metylomorfolinę, trietyloaminę i diizopropyloetyloaminę, a rozpuszczalnik organiczny jest wybrany z grupy obejmującej octan etylu, dimetyloformamid i N-metylopirolidon.

19. Sposób według zastrz. 1 albo 10, znamienny tym, że reakcję odbezpieczania prowadzi się na drodze uwodornienia, w obecności katalizatora, w rozpuszczalniku wybranym spośród tych rozpuszczalników, które rozpuszczają składniki reakcji bez reagowania z nimi, z wyłączeniem ketonów i rozpuszczalników, które zatruwają katalizator, w temperaturze od -20 do +50°C.

20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że stosuje się katalizator wybrany spośród 5% i 10% palladu oraz rozpuszczalnik wybrany spoś ród dimetyloformamidu, N-metylopirolidonu, kwasu octowego, kwasu p-toluenosulfonowego, metanolu, etanolu, izopropanolu i ich mieszanin.

21. Sposób według zastrz. 1 albo 10, w którym reakcje odbezpieczania prowadzi się przez potraktowanie kwasem z użyciem samych kwasów lub kwasów zmieszanych z innymi rozpuszczalnikami, w temperaturze od -20 do +50°C.

22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że stosuje się kwas wybrany z kwasu chlorowodorowego, kwasu trifluorooctowego i kwasu mrówkowego.

23. Sposób według zastrz. 1 albo 10, znamienny tym, że reakcje odbezpieczania prowadzi się przez potraktowanie związkiem zasadowym w obecności rozpuszczalnika, w temperaturze od -20 do + 50°C.

24. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że stosuje się zasady wybrane spośród wodorotlenków metali alkalicznych i metali ziem alkalicznych, oraz rozpuszczalnik wybrany z grupy obejmującej wodę, dioksan, acetonitryl, metanol, etanol, izopropanol i ich mieszaniny.