PL208008B1

PL208008B1 - Izolowany polipeptyd i jego zastosowanie, izolowany polinukleotyd, rekombinowany wektor, rekombinowana komórka gospodarza, kompozycja angiostatyczna i zestaw do hamowania neowaskularyzacji ocznej

Info

Publication number: PL208008B1
Application number: PL364596A
Authority: PL
Inventors: Paul Schimmel; Keisuke Wakasugi; Martin Friedlander
Original assignee: Scripps Research Inst
Priority date: 2001-02-23
Filing date: 2002-02-22
Publication date: 2011-03-31
Also published as: US20030017564A1; IL157558A; RU2003128420A; PL364596A1; NZ528193A; KR100869914B1; IL201755A; ZA200307383B; ATE420653T1; WO2002067970A1; IL157558A0; CN100486992C; RU2297425C2; EP1377305B1; EP2080520A1; CN1527719A; JP4448925B2; AU2007219318B2; CA2438273C; KR20030078935A

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest izolowany, rozpuszczalny w wodzie skrócony polipeptyd syntetazy tRNA i jego zastosowanie, izolowany polinukleotyd kodujący taki polipeptyd, obejmujący go rekombinowany wektor, rekombinowana komórka gospodarza, nadająca się do wstrzykiwania kompozycja angiostatyczna oraz zestaw do hamowania neowaskularyzacji ocznej.

Zastrzeżenie dotyczące pierwszeństwa

Niniejsze zgłoszenie zastrzega pierwszeństwo z Tymczasowego Zgłoszenia Patentowego USA o numerze seryjnym 60/270,951, złoż onego 23 lutego 2001 roku.

Niniejszy wynalazek powstał przy wsparciu finansowym Rządu Stanów Zjednoczonych w formie grantu nr GM23562, przyznanego przez Narodowy Instytut Zdrowia.

Syntetazy aminoacylo-tRNA, katalizujące aminoacylację cząsteczek tRNA, są białkami powstałymi wcześnie w procesie ewolucji, które odgrywają kluczową rolę w odkodowywaniu informacji genetycznej podczas procesu translacji. U wyższych organizmów eukariotycznych dziewięć syntetaz aminoacylo-tRNA wiąże się z przynajmniej trzema innymi polipeptydami tworząc supramolekularny kompleks wieloenzymatyczny (Mirande i wsp., Eur J Blochem, 147:281-89 (1985)). Każda z eukariotycznych syntetaz tRNA składa się z rdzenia enzymatycznego, ściśle spokrewnionego z prokariotycznym odpowiednikiem syntetazy tRNA, oraz z dodatkowej domeny przyłączonej do aminowego lub karboksylowego końca rdzenia enzymatycznego (Mirande, Prog Nucleic Acids Res Mol Biol, 40:95-142 (1991)).

W większości przypadków, przyłączone do rdzenia enzymatycznego domeny odgrywają pewną rolę w procesie tworzenia kompleksu wieloenzymatycznego. Jednakże obecność dodatkowej domeny nie jest ściśle skorelowana z procesem włączania się syntetazy do kompleksu wieloenzymatycznego.

Cząsteczki TrpRS ssaków mają dodatkową domenę przyłączoną do aminowego końca białka. W prawidłowych komórkach człowieka stwierdzić można obecność dwóch postaci TrpRS: częstszą postać odpowiadającą cząsteczce o pełnej długości (reszty aminokwasowe 1-471 SEK NR ID:3) oraz rzadszą skróconą postać („mini TrpRS”; reszty aminokwasowe 1-424 SEK NR ID:3). Postać skrócona tworzona jest przez delecję N-końcowej domeny, wprowadzoną w procesie alternatywnego składania pre-mRNA (Tolstrup i wsp., J Biol Chem, 270:397-403 (1995)). Aminowy koniec cząsteczki mini-TrpRS odpowiada reszcie metioniny w pozycji 48 cząsteczki TrpRS o pełnej długości (jw.). Alternatywnie, skrócona cząsteczka TrpRS może powstawać na drodze proteolizy (Lemaire i wsp., Eur J Blochem, 51:237-52 (1975)). Przykładowo, wołowa TrpRS wykazuje wysoki poziom ekspresji w trzustce, gdzie jest wydzielana do soku trzustkowego (Kisselev, Biochemie, 75:1027-39 (1993), co prowadzi do wytwarzania skróconej cząsteczki TrpRS. Wyniki te sugerują, że skrócone cząsteczki TrpRS mogą mieć funkcję inną niż aminoacylacja tRNA (jw.).

Angiogeneza, albo proliferacja nowych naczyń włosowatych z istniejących wcześniej naczyń krwionośnych, jest procesem fundamentalnym dla przebiegu rozwoju zarodka, wzrostu oraz regeneracji tkanki. Angiogeneza jest procesem warunkującym rozwój i różnicowanie siatki naczyń krwionośnych, a także wiele innych istotnych procesów fizjologicznych, włącznie z embriogenezą, wzrostem somatycznym, naprawą i regeneracją tkanek i organów, cyklicznym rozwojem ciałka żółtego oraz śluzówki macicy, a także rozwojem i różnicowaniem układu nerwowego. W przypadku żeńskiego układu rozrodczego, angiogeneza ma miejsce w pęcherzyku jajnikowym podczas jego rozwoju, w ciałku żółtym po nastąpieniu owulacji, oraz w łożysku, gdzie odgrywa ważną rolę w inicjowaniu i utrzymywaniu ciąży. Angiogeneza występuje ponadto w przypadku części procesów naprawczych ciała, np. w przypadku gojenia się ran lub złamań. Angiogeneza jest też ważnym czynnikiem w procesie rozwoju nowotworu, gdyż nowotwór musi stale stymulować wzrost nowych naczyń włosowatych w celu umożliwienia własnego wzrostu. Angiogeneza jest istotnym elementem procesu wzrostu guzów litych u człowieka, a zaburzenie angiogenezy związane jest też z innymi chorobami, takimi jak reumatoidalne zapalenie stawów, łuszczyca oraz retynopatia cukrzycowa (Folkman J oraz Klagsbrun M, Science, 235:442-447 (1987)).

Na rozwój procesu angiogenezy wpływa kilka czynników, np. cząsteczki kwaśnego i zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów, które obydwa są mitogenami dla komórek śródbłonka i innych typów komórek. Angiogenezę mogą pobudzać angiotropina oraz angiogenina, choć ich funkcja nie jest dokładnie znana (Folkman J, Cancer Medicine, 153-70, Lea and Fabriger Press (1993)). Wysoce selektywnym mitogenem dla komórek śródbłonka jest naczyniowy śródbłonkowy czynnik wzrostu, czyli VEGF (Ferrara N i wsp., Endor Rev, 13:19-32 (1992)).

Zdecydowana większość chorób wywołujących znaczną utratę wzroku związana jest z procesem tworzenia nowych naczyń (neowaskularyzacji); starcze zwyrodnienie plamki ocznej (ARMD - ang.

PL 208 008 B1 age-related macular degeneration) dotyka 12-15 milionów obywateli USA w wieku powyżej 65 lat i u 10-15% osób z tej grupy powoduje utratę wzroku wskutek naczyniówkowej (podsiatkówkowej) neowaskularyzacji. Wiodącą przyczną utraty wzroku wśród obywateli USA poniżej 65 roku życia jest cukrzyca; 16 milionów osób w USA cierpi na cukrzycę, a komplikacje dotyczące oczu dotykają 40000 osób rocznie, co często jest wynikiem siatkówkowej neowaskularyzacji. Choć zastosowanie fotokoagulacji laserowej okazało się być skuteczne w zapobieganiu poważnej utracie wzroku u części cukrzycowych pacjentów wysokiego ryzyka, częstość pojawiania się nowych przypadków choroby w perspektywie 10-letniego okresu nie uległa zasadniczej zmianie. Z wyjątkiem nielicznych przypadków, fotokoagulacja jest niestety nieskuteczna w zapobieganiu utracie wzroku u pacjentów z naczyniówkową neowaskularyzacją wskutek ARMD lub zapalnej choroby oka, takiej jak histoplazmoza oczna. Opracowane ostatnio niedestrukcyjne terapie fotodynamiczne dają nadzieję na czasową poprawę wzroku u poszczególnych pacjentów z nieuleczalną dotychczas postacią naczyniówkowej neowaskularyzacji, jednak tylko u 61,4% pacjentów, leczonych w 3-4 miesięcznych odstępach, stwierdzono poprawę lub stabilizację wzroku, w porównaniu do 45,9% pacjentów z grupy otrzymującej placebo.

U zdrowych dorosłych osób angiogeneza jest ściśle regulowana i ograniczona do procesu gojenia się ran powstających w wyniku ciąży i cyklu jajeczkowania. Proces angiogenezy jest uruchamiany przez swoiste cząsteczki angiogenne, takie jak kwaśny i zasadowy fibroblastowy czynnik wzrostu (FGF), naczyniowy śródbłonkowy czynnik wzrostu (VEGF), angiogenina, transformujący czynnik wzrostu (TGF), czynnik martwicy nowotworów α (TNF-α) oraz czynnik wzrostu z płytek krwi (PDGF). Angiogeneza może też zostać zahamowana przez takie cząsteczki inhibitorowe jak interferon-α, trombospondyna-1, angiostatyna oraz endostatyna. Prawidłowy przebieg procesu tworzenia nowych naczyń włosowatych kontrolowany jest więc poprzez równowagę między tymi naturalnie występującymi stymulatorami i inhibitorami. Kiedy równowaga ta zostaje zaburzona, tak jak ma to miejsce w pewnych stanach chorobowych, indukowana jest proliferacja, migracja i ostatecznie różnicowanie komórek śródbłonka naczyniowego.

Angiogeneza odgrywa główną rolę w przebiegu wielu chorób, włącznie z nowotworami oraz neowaskularyzacją oczu. Stały wzrost rozmaitych nowotworów i ich zdolność do tworzenia przerzutów są zależne od tworzenia się nowych naczyń krwionośnych w obrębie nowotworu, powstających w odpowiedzi na produkowane przez nowotwór czynniki angiogenne. Proliferacja nowych naczyń krwionośnych w odpowiedzi na rozmaite bodźce jest też dominującym objawem w licznych chorobach oczu, włącznie z proliferacyjną retinopatią cukrzycową (PDR), ARMD, jaskrą towarzyszącą cukrzycowym retinopatiom, miąższowym zapaleniem rogówki oraz retinopatią dziecięcą. W chorobach tych uszkodzenie tkanki może stymulować uwalnianie czynników angiogennych prowadzących do proliferacji naczyń włoskowatych. Główną rolę w neowaskularyzacji i związanych z nią retinopatiach odgrywa VEGF. Jednak choć badania jasno wykazują, że istnieje korelacja pomiędzy śródocznym poziomem VEGF a neowaskularyzacją oczną towarzyszącą niedokrwiennym retinopatiom, pewną rolę odgrywa tu też prawdopodobnie FGF. Wiadomo, że zarówno kwaśny jak i zasadowy FGF obecny jest w siatkówce zdrowych osób, choć wykrywalny poziom FGF nie zawsze skorelowany jest z przebiegiem procesu neowaskularyzacji. Może to wynikać głównie z faktu, że FGF wiąże się bardzo ściśle z obdarzonymi ładunkiem składnikami macierzy zewnątrzkomórkowej i w związku z tym może nie być łatwo dostępny w wolnej rozpuszczalnej postaci, którą wykrywa się właśnie w standartowych testach, jakim poddawany jest płyn śródoczny.

Ostatni szlak, występujący powszechnie w odpowiedzi angiogennej, obejmuje zachodzącą przy udziale integryn wymianę informacji pomiędzy proliferującą naczyniową komórką śródbłonkową a macierzą zewnątrzkomórkową. Receptory adhezyjne noszące nazwę integryn wyrażane są we wszystkich komórkach w postaci heterodimerów zawierających podjednostki α i β. Jedna z integryn, o nazwie a_ve₃, jest najbardziej reaktywnym białkiem z tej rodziny i umożliwia komórkom śródbłonka oddziaływanie z szeregiem składników macierzy zewnątrzkomórkowej. Peptydy i przeciwciała o działaniu antagonistycznym wobec tej integryny hamują angiogenezę poprzez selektywną indukcję apoptozy w proliferujących komórkach śródbłonka naczyniowego. Istnieją dwa szlaki angiogenezy zależne od cytokin, które mogą być zdefiniowane w oparciu o ich zależność od różnych integryn naczyniowych, a mianowicie od a_ve₃, oraz a_ve₅, Tak więc angiogeneza indukowana przez zasadowy FGF lub przez VEGF jest zależna odpowiednio od integryny a_ve₃ oraz a_ve₅, ponieważ przeciwciała antagonistyczne wobec każdej z tych integryn blokują selektywnie tylko jeden z tych szlaków angiogennych w króliczym rogówkowym układzie modelowym oraz w kurzym modelu kosmówkowym (CAM). Peptydy o działaniu antagonistycznym, które blokują wszystkie integryny a_v, hamują angiogenezę stymulowaną zarówno przez FGF, jak i VEGF. Podczas gdy prawidłowe naczynia oczne nie wykazują obecności integryny

PL 208 008 B1 α_νβ₃, ani α_νβ₅, pojawiają się one selektywnie w naczyniach krwionośnych z tkanek pacjentów dotkniętych chorobami oczu związanymi z neowaskularyzacją. W tkankach pacjentów z ARMD obserwuje się zawsze jedynie α_νβ₃, podczas gdy zarówno α_νβ₃ jak i α_νβ₅, obecne są w tkankach pacjentów z PDR. Systematyczne podawanie peptydów antagonistycznych wobec integryn blokowało proces tworzenia nowych naczyń w mysim modelu unaczyniania siatkówki.

Czynniki przeciwangiogenne mogą więc odgrywać pewną rolę w leczeniu zwyrodnienia siatkówki, zapobiegając szkodliwym skutkom działania przedstawionych powyżej czynników odżywczych i wzrostowych. Czynniki angiogenne odgrywać mogą również pozytywną rolę w inicjowaniu pożądanego procesu unaczyniania, mającego na celu zatrzymanie degeneracji siatkówki poprzez wzmocnienie napływu krwi do komórek.

Przemiotem wynalazku jest izolowany, rozpuszczalny w wodzie polipeptyd składający się z sekwencji reszt aminokwasowych SEK NR ID:12, lub jego fragment hamujący angiogenezę, przy czym izolowany polipeptyd ma wielkość nieprzekraczającą 45000 jednostek masy atomowej. Korzystnie polipeptyd według wynalazku jest fragmentem hamującym angiogenezę, zdolnym do hamowania neowaskularyzacji ocznej, korzystniej fragmentem obejmującym przynajmniej jedną spośród sygnaturowych sekwencji reszt aminokwasowych HVGH (SEK NR ID:10) oraz KMSAS (SEK NR ID:11), a najkorzystniej fragmentem obejmującym sygnaturową sekwencję reszt aminokwasowych HVGH (SEK NR ID:10). Również korzystnie polipeptyd według wynalazku jest fragmentem hamującym angiogenezę, zdolnym do hamowania neowaskularyzacji ocznej, o wielkości mniejszej niż 43000 jednostek masy atomowej.

Przedmiotem wynalazku jest także izolowany polipeptyd o sekwencji reszt aminokwasowych SEK NR ID:7.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest izolowany polinukleotyd o sekwencji nukleotydowej polinukleotydu wybranego z grupy składającej się z polinukleotydu SEK NR ID:6 oraz polinukleotydu kodującego polipeptydy o sekwencji SEK NR ID:7 lub SEK NR ID:12.

Rekombinowany wektor obejmujący izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku i zawierająca go rekombinowana komórka gospodarza również stanowią przedmiot wynalazku.

Wynalazek dostarcza również rekombinowanej komórki gospodarza wyrażającej polipeptyd według wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie rozpuszczalnego w wodzie polipeptydu według wynalazku lub jego fragmentu hamującego neowaskularyzację oczną do wytwarzania leku do hamowania neowaskularyzacji ocznej u pacjenta, przy czym lek jest przeznaczony do podawania pacjentowi w ilości hamującej neowaskularyzację oczną. Korzystnie lek otrzymywany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest przeznaczony do podawania codziennie, co tydzień, co miesiąc, raz na kwartał lub co pół roku.

Również korzystnie lek otrzymywany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest przeznaczony do podawania pacjentowi w dawce dziennej dostarczającej od 20 do 100 mikrogramów polipeptydu lub w dawce kwartalnej dostarczającej od 2 do 9 miligramów polipeptydu. Ponadto korzystnie lek ten jest przeznaczony do podawania drogą śródszklistkową, drogą śródoczną, przy zastosowaniu urządzenia do przedłużonego dostarczania, przy zastosowaniu terapii genowej lub przez dostarczanie oczne w oparciu o komórki.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest nadająca się do wstrzykiwania kompozycja angiostatyczna obejmująca polipeptyd składający się z sekwencji SEK NR ID:12 lub jego fragment hamujący angiogenezę, oraz dopuszczalną farmakologicznie zaróbkę wodną, przy czym kompozycja obejmuje polipeptyd w stężeniu wynoszącym przynajmniej 0,1 miligrama na mililitr zaróbki wodnej. Korzystnie kompozycja angiostatyczna według wynalazku zawiera polipeptyd o sekwencji reszt aminokwasowych SEK NR ID:12 w stężeniu o zakresie od 0,1 do 0,5 miligrama na mililitr zaróbki wodnej.

Wynalazek dotyczy również zestawu do hamowania neowaskularyzacji ocznej obejmującego ilość polipeptydu według wynalazku wystarczającą do podawania przynajmniej jednej dawki, zapakowaną do odpowiednio uszczelnionego pojemnika; przynajmniej jedną samouszczelniającą się igłę do strzykawki o rozmiarze mniejszym niż 33, nadającą się do wykonywania iniekcji śródszklistkowej; oraz przynajmniej jedną dokładnie wykalibrowaną strzykawkę. Korzystnie zestaw według wynalazku obejmuje wydrukowany materiał informacyjny, opisujący kompozycję, sposoby jej podawania.

Polipeptydy wywodzące się z syntetazy tryptofanylo-tRNA, krótsze niż te występujące w naturze, wykazują aktywność chemokin i mają zastosowanie naukowe, diagnostyczne, prognostyczne i lecznicze. W jednym z zastosowań, polipeptydy wywodzące się z syntetazy tryptofanylo-tRNA wykorzyPL 208 008 B1 stywane mogą być do regulowania funkcji komórek śródbłonka naczyniowego, a w szczególności do hamowania angiogenezy, zwłaszcza neowaskularyzacji ocznej.

Te skrócone polipeptydy, wywodzące się z syntetazy tryptofanylo-tRNA, mają skrócony koniec aminowy, ale obejmować mogą domenę wiążącą nukleotydy (zwój Rossmanna). Polipeptydy te są zdolne do regulowania funkcji komórek śródbłonka naczyniowego.

Kompozycje oraz różne postacie dawkowania obejmujące skrócone polipeptydy wywodzące się z syntetazy tryptofanylo-tRNA oraz odpowiednią zaróbkę mogą być stosowane do podawania śródocznego, np. podawania śródszklistkowego, podsiatkówkowego itp., a także do podawania układowego, np. przezskórnego, przezśluzówkowego, wewnątrzjelitowego lub pozajelitowego.

Hamujące angiogenezę ilości polipeptydu wraz z odpowiednim, fizjologicznie zgodnym, nośnikiem lub zaróbką są użyteczne w leczeniu chorób oczu związanych z neowaskularyzacją, takich jak starcze zwyrodnienie plamki ocznej, oczne komplikacje towarzyszące cukrzycy, jaskra towarzysząca cukrzycowym retinopatiom, retinopatie dziecięce, zapalenie rogówki, retinopatie niedokrwienne (np. niedokrwistość sierpowata), patologiczna krótkowzroczność, histoplazmoza oczna, pterygia, niezapalne zwyrodnienie naczyniówki, itp.

Krótki opis rysunków

Figura 1 przedstawia sekwencję aminokwasową polipeptydu syntetazy tryptofanylo-tRNA (SEK NR ID:1), obejmującą oznaczone ramką sekwencje sygnaturowe (SEK NR ID:10 oraz SEK NR ID:11), zawarte również w postaci skróconej (o sekwencji odpowiadającej resztom aminokwasowym 94-471 z SEK NR ID:1).

Figura 2 przedstawia fotomikrografię ilustrującą rozwój naczyń siatkówki w modelu mysim.

Figura 3 przedstawia graficzną reprezentację wyników otrzymanych w przykładzie 3, opisanym poniżej.

Figura 4 przedstawia graficzną reprezentację wyników otrzymanych w przykładzie 4, opisanym poniżej.

Figura 5 przedstawia fotomikrografię pokazującą miejsce przyłączania fragmentu TrpRS (T2) w mysim modelu siatkówkowym.

Szczegółowy opis korzystnych zastosowań

Definicje

Termin „skrócone polipeptydy syntetazy tRNA” oznacza polipeptydy, które są krótsze, niż odpowiadająca im syntetaza tRNA o pełnej długości.

„TrpRS” oznacza syntetazę tryptofanylo-tRNA.

Termin „hodowla komórkowa” obejmuje pożywkę hodowlaną oraz hodowane w niej komórki.

Zwrot „izolowanie polipeptydu z hodowli komórkowej” obejmuje izolowanie rozpuszczalnego lub wydzielanego przez komórkę polipeptydu z pożywki hodowlanej, jak również izolowanie integralnych białek błonowych z hodowanych komórek.

„Wyciąg komórkowy” obejmuje pożywkę hodowlaną, w szczególności taką z której usunięte zostały komórki. Przez wyciąg komórkowy zawierający DNA lub białko będące przedmiotem zainteresowania, powinien być rozumiany homogenny preparat lub preparat bezkomórkowy otrzymany z komórek wyrażających pożądane białko lub zawierających pożądany DNA.

„Plazmid” jest autonomiczną cząsteczką DNA, zdolną do samodzielnej replikacji, i oznaczany jest małą literą „p” po której następują (lub którą poprzedzają) wielkie litery i/lub liczby. Prezentowane tu wyjściowe plazmidy są plazmidami dostępnymi bez ograniczeń w sprzedaży, lub też skonstruowane są na bazie dostępnych plazmidów przy zastosowaniu opublikowanych procedur. Dodatkowo, specjalistom z tej dziedziny znane są lub są dla nich oczywiste inne równoważne plazmidy o właściwościach opisanych tutaj.

Termin „trawienie” DNA odnosi się do katalitycznego cięcia cząsteczek DNA przez enzymy restrykcyjne, które oddziałują tylko z określonymi sekwencjami DNA. Zastosowane tu rozmaite enzymy restrykcyjne są dostępne handlowo, a warunki reakcji, kofaktory i inne wymagania mogą być modyfikowane w sposób znany specjalistom z tej dziedziny. Do celów analitycznych stosowano zazwyczaj μg plazmidu lub fragmentu DNA oraz około 2 jednostek enzymu w całkowitej objętości 20 μΐ buforu. Do celów izolacji fragmentów DNA lub konstruktów plazmidowych trawiono zazwyczaj 5-50 μg DNA przy użyciu 20-250 jednostek enzymu w odpowiednio większej objętości. Rodzaj stosowanych buforów i ilości substratów dla poszczególnych enzymów restrykcyjnych określone są przez producenta.

Zazwyczaj stosowano czas inkubacji równy jednej godzinie w temperaturze 37°C, lecz mogą one się różnić w zależności od wskazań producenta. Produkty reakcji otrzymane po trawieniu poddawane są

PL 208 008 B1 elektroforezie w żelu poliakryloamidowym w celu wyizolowania pożądanego fragmentu. Nukleotydy tworzące rozmaite fragmenty DNA lub RNA przedstawione są tutaj przy użyciu standardowego kodu jednoliterowego (A, T, C, G, U) stosowanego w dziedzinie.

„Polinukleotyd” stanowiący przedmiot wynalazku może występować w postaci RNA lub DNA, przy czym DNA obejmuje cDNA, genomowy DNA, lub syntetyczny DNA. DNA może być dwuniciowy lub jednoniciowy, a jednoniciowy DNA może występować w postaci nici kodującej lub niekodującej (antysensownej). Sekwencja kodująca, która koduje dojrzały polipeptyd, może być identyczna z sekwencją kodującą przedstawioną jako SEK NR ID:6, lub też może być inną sekwencją kodującą (w wyniku zjawiska degeneracji kodu genetycznego) tę samą sekwencję dojrzałego polipeptydu przedstawioną jako SEK NR 1D:7.

Termin „polinukleotyd kodujący polipeptyd” obejmuje polinukleotyd, który zawiera jedynie sekwencję kodującą polipeptyd, jak i polinukleotyd zawierający dodatkową sekwencję kodującą i/lub niekodującą.

Termin „oligonukleotydy” odnosi się do jednoniciowego polinukleotydu lub dwóch komplementarnych nici polinukleotydowych, które mogą być syntetyzowane chemicznie. Oligonukleotydy takie nie posiadają grupy fosforanowej na końcu 5' i nie mogą ulegać ligacji z innym oligonukleotydem bez uprzedniego dodania fosforanu w postaci ATP w obecności kinazy. Syntetyczny oligonukleotyd można zligować z fragmentem, który nie był poddany defosforylacji.

Termin „reszta aminokwasowa” odnosi się do aminokwasu, który jest częścią polipeptydu. Opisane tu reszty aminokwasowe występujące korzystnie w postaci izomerycznej „L”. Reszty występujące w postaci izomerycznej „D” mogą być jednak podstawione za dowolną resztę w postaci L, o ile polipeptyd zachowywać będzie pożądaną aktywność funkcjonalną. NH2 odnosi się do wolnej grupy aminowej na aminowym końcu polipeptydu. Zgodnie ze standardową nomenklaturą polipeptydów opisaną w J Biol Chem, 243:3552-59 (1969) i przyję tą przez C.F.R § § 1.821 - 1.822, zastosowano skróty reszt aminokwasowych przedstawionych w poniższej tabeli:

T a b e l a 1

Tabela symboli aminokwasowych

SYMBOL
Jednoliterowy	Trzyliterowy	Aminokwas
1	2	3
Y	Tyr	tyrozyna
G	Gly	glicyna
F	Phe	fenyloalanina
M	Met	metionina
A	Ala	alanina
S	Ser	seryna
I	Ile	izoleucyna
L	Leu	leucyna
T	Thr	treonina
V	Val	walina
P	Pro	prolina
K	Lys	lizyna
H	His	histydyna
Q	Gln	glutamina
E	Glu	kwas glutaminowy
Z	Glx	Glu i/lub Gln
W	Trp	tryptofan

PL 208 008 B1 cd. tabeli 1

1	2	3
R	Arg	arginina
D	Asp	kwas asparaginowy
N	Asn	asparagina
B	Asx	Asn lub Asp
C	Cys	cysteina
X	Xaa	nieznany lub inny

Orientacja wszystkich zaprezentowanych tu sekwencji reszt aminokwasowych odpowiada powszechnej regule zapisywania sekwencji od końca aminowego (po stronie lewej) do końca karboksylowego (po stronie prawej). Ponadto, termin „reszta aminokwasowa” jest dość szeroko zdefiniowany i obejmuje zarówno aminokwasy umieszczone w tabeli 1, jak i zmodyfikowane oraz nietypowe aminokwasy, takie jak te wymienione w odnośniku 37 C.F.R. § § 1.821 - 1.822. Myślnik umieszczony przed lub po sekwencji reszt aminokwasowych wskazuje na wiązanie peptydowe z inną sekwencją reszt aminokwasowych, jedną lub więcej resztami aminokwasowymi lub też z grupą N-końcową, taką jak NH2, lub z grupą C-końcową, taką jak COOH.

Specjalistom z tej dziedziny znane są możliwości konserwatywnego podstawiania reszt aminokwasowych w peptydzie lub w białku, tak aby nie powodowało to zmian w biologicznej aktywności nowo powstałej cząsteczki. Specjaliści zdają sobie również sprawę z tego, że pojedyncze podstawienia aminokwasowe w nieistotnych regionach polipeptydu nie zmieniają na ogół biologicznej aktywności (patrz np. Watson i wsp., Molecular Biology of the Gene, wydanie 4, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co., str. 224).

Substytucje takie są korzystnie wprowadzane zgodnie z regułami przedstawionymi w tabeli 2:

T a b e l a 2

Wyjściowa reszta	Konserwatywne podstawienie
Ala (A)	Gly; Ser
Arg (R)	Lys
Asn(N)	Gln; His
Cys(C)	Ser
Gln (Q)	Asn
Glu (E)	Asp
Gly (G)	Ala; Pro
His (H)	Asn; Gln
Ile (I)	Leu; Val
Leu (L)	Ile; Val
Lys (K)	Arg; Gln; Glu
Met (M)	Leu; Tyr; Ile
Phe (F)	Met; Leu; Tyr
Ser (S)	Thr
Thr (T)	Ser
Trp (W)	Tyr
Tyr (Y)	Trp; Phe
Val (V)	Ile; Leu

PL 208 008 B1

Możliwe są także inne podstawienia, które mogą być określone doświadczalnie lub na podstawie znanych konserwatywnych podstawień.

Termin „wektor komplementujący” opisuje wektory plazmidowe które dostarczają kwasy nukleinowe do pakującej linii komórkowej w celu stabilnej integracji z chromosomem w genomie komórkowym.

Termin „plazmid dostarczający” dotyczy wektora plazmidowego, który przenosi lub dostarcza kwasy nukleinowe kodujące leczniczy gen, albo gen kodujący leczniczy produkt lub jego prekursor, albo też gen regulatorowy lub inny czynnik, wywołujący lecznicze skutki po dostarczeniu go in vivo lub po wprowadzeniu do linii komórkowej (takiej jak np. pakująca linia komórkowa) w celu namnożenia wektorów wirusowych.

Opisano tu rozmaite wektory. Przykładowo, jeden z wektorów jest wykorzystany do dostarczania określonych cząsteczek kwasu nukleinowego do pakującej linii komórkowej w celu uzyskania stabilnej integracji z chromosomem. Ten typ wektora jest tu najczęściej określany jako wektor komplementujący. Inny opisany tu typ wektora przenosi lub dostarcza cząsteczki kwasu nukleinowego do linii komórkowej (np. do pakującej linii komórkowej) w celu namnożenia leczniczych wektorów wirusowych; dlatego też wektory te są tu na ogół określane jako wektory dostarczające. Trzeci „typ” opisanych tu wektorów wykorzystywany jest do przenoszenia cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących lecznicze białka lub polipeptydy, albo też białka regulatorowe lub sekwencje regulatorowe, do swoistych komórek lub typów komórek w organizmie wymagającym leczenia; wektory te są tu na ogół określane jako lecznicze wektory wirusowe lub rekombinowane wektory adenowirusowe lub wektory pochodzące z wektorów adenowirusowych (ang. Ad-derived vectors) i występują w postaci cząsteczki wirusa zawierającej wirusowy kwas nukleinowy obejmujący kastę ekspresyjną służącą do wywoływania ekspresji leczniczego genu.

Określenie „homolog DNA lub kwasu nukleinowego” odnosi się do kwasu nukleinowego obejmującego uprzednio określoną konserwowaną sekwencję nukleotydową, taką jak sekwencja kodująca leczniczy polipeptyd. Termin „znaczna homologia” oznacza występowanie przynajmniej 80% homologii, korzystnie przynajmniej 90%, najkorzystniej przynajmniej 95% homologii, albo też mniejszy udział procentowy dotyczący homologii lub identyczności przy zachowaniu aktywności lub funkcji biologicznej.

Terminy „homologia” oraz „identyczność” są tu często używane wymiennie. Stopień homologii lub identyczności może być np. określony poprzez porównanie informacji zawartej w sekwencji przy użyciu oprogramowania komputerowego GAP. Program GAP wykorzystuje metodę dopasowywania sekwencji opisaną przez Needlemana i Wunscha (J Mol Biol, 48:443 (1981)) a następnie udoskonaloną przez Smitha i Watermana (Adv Appl Math, 2:482 (1981)). W skrócie, program GAP określa podobieństwo jako liczbę dopasowanych symboli (tj. nukleotydów lub aminokwasów), które są do siebie podobne, podzieloną przez ogólną liczbę symboli w krótszej spośród porównywanych sekwencji. Korzystne domyślne parametry wyjściowe stosowane w programie GAP mogą obejmować: (1) jednoskładnikową macierz porównawczą (obejmującą wartość 1 dla identyczności oraz 0 dla braku identyczności) oraz ważoną macierz porównawczą Gribskova i Burgessa (Nucleic Acids Res, 14:6745 (1986), wg opisu Schwartza i Dayhoffa (Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, str. 353-358 (1979)); (2) karę równą 3,0 za każdą przerwę oraz karę równą 0,10 za każdy symbol w każdej przerwie; oraz (3) brak kary za przerwy na końcach. To, czy sekwencje nukleotydowe dwóch analizowanych cząsteczek kwasu nukleinowego wykazują przynajmniej 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, czy też 99% identyczności można określić przy użyciu znanych algorytmów komputerowych, takich jak program „FASTA”, wykorzystujący np. domyślne parametry wyjściowe określone przez Pearsona i Lipmana (Proc Natl Acad Sci USA, 85:2444 (1988)). Alternatywnie, do określenia identyczności wykorzystać można funkcję BLAST w bazie danych NCBl (National Center for Biotechnology Information). Na ogół sekwencje dopasowywane są w ten sposób, aby uzyskać największą liczbę przyporządkowania. „Identyczność” sama w sobie ma znaczenie rozpoznawane przez specjalistów i może być obliczana przy użyciu opublikowanych technik (patrz np. Computational Molecular Biology, (ed.) Lesk AM, Oxford University Press, Nowy Jork (1993); Griffin AM oraz Griffin HG (ed.), Computer Analysis of Sequence Data, part I, Humana Press, New Jersey (1994); von Heinje G, Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press (1987); Gribskov M oraz Devereux J (ed.), Sequence Analysis Primer, M Stockton Press, Nowy Jork (1991)). Istnieją liczne sposoby mierzenia poziomu identyczności pomiędzy dwoma sekwencjami polinukleotydowymi lub polipeptydowymi, a termin „identyczność” jest dobrze znany specjalistom z tej dziedziny (Carillo H i Lipton D, SIAM J Applied Math, 48:1073 (1998)). Powszechnie stosowane sposoby określania identyczności lub podobieństwa

PL 208 008 B1 obejmują m.in. te opisane przez Martina J Bishopa (Guide to Huge Computers, Academic Press, San Diego (1994) oraz Carillo H i Liptona D, SIAM J Apphed Math, 48:1073 (1998)). Sposoby określana identyczności i podobieństwa są zakodowane w programach komputerowych. Korzystne programy komputerowe określające identyczność lub podobieństwo pomiędzy sekwencjami obejmują m.in. pakiet programowy GCG (Devereux J i wsp., Nucleic Acids Res, 12(I):387 (1984)), BLASTP, BLASTN oraz FASTA (Atschul SF i wsp., J Molec Biol, 215:403 (1990)).

Termin „identyczność” dotyczy porównania pomiędzy testową a referencyjną sekwencją polipeptydową lub polinukleotydową. Przykładowo, testowy polipeptyd może być zdefiniowany jako dowolny polipeptyd, który wykazuje 90% lub więcej identyczności w odniesieniu do polipeptydu referencyjnego. Używany tu termin „przynajmniej 90% identyczności” odnosi się do procentowej identyczności w zakresie od 90 do 99,99 w odniesieniu do polipeptydu referencyjnego. Identyczność na poziomie 90% lub większą można przedstawić łatwo na przykładzie testowej i referencyjnej sekwencji polipeptydowej, których długość wynosi 100 aminokwasów. W tym wypadku nie więcej niż 10% aminokwasów (tj. 10 spośród 100) w sekwencji testowej będzie różniło się od tych w sekwencji polipeptydu referencyjnego. Podobne porównanie można wykonać dla testowego i referencyjnego polinukleotydu. Obserwowane różnice w sekwencji mogą być reprezentowane przez mutacje punktowe rozsiane losowo na całej długości sekwencji aminokwasowej, lub też mogą być one zlokalizowane w jednym lub kilku miejscach, gdzie tworzyć mogą odcinki nie przekraczające dozwolonego maksimum (tj. 10/100 aminokwasów w przypadku 90% identyczności). Różnice określane są jako substytucje lub delecje nukleotydowe lub aminokwasowe.

Termin „terapia genowa” lub „terapia genetyczna” dotyczy przenoszenia heterologicznego DNA do określonych komórek (komórek docelowych) ssaka, zwłaszcza człowieka, cierpiącego na chorobę, wobec której stosowana jest owa terapia. DNA jest przenoszony do wybranych komórek docelowych w taki sposób, aby heterologiczny DNA uległ ekspresji i aby wyprodukowany został leczniczy produkt. Terapia genetyczna może też być wykorzystana do wprowadzenia kwasu nukleinowego kodującego określony produkt genu w celu zastąpienia genu defektywnego, lub też w celu zwiększenia (wspomożenia) produkcji owego produktu genowego przez organizm ssaka lub komórkę. Wprowadzony kwas nukleinowy może kodować związek leczniczy, taki jak czynnik wzrostu lub jego inhibitor, albo czynnik martwicy nowotworu lub jego inhibitor (np. jego receptor), który to związek leczniczy nie jest w normalnych warunkach produkowany przez komórki ssaczego gospodarza, lub też który nie jest produkowany w terapeutycznie skutecznych ilościach albo w terapeutycznie istotnym okresie czasu. Heterologiczny DNA, kodujący leczniczy produkt, może być poddany modyfikacji przed wprowadzeniem go do komórek dotkniętego chorobą gospodarza w celu wzmocnienia ekspresji lub spowodowania innej zmiany dotyczącej owego produktu lub jego ekspresji.

„Heterologiczny DNA” jest to DNA, który koduje RNA i białko produkowane naturalnie in vivo przez komórkę, w której wprowadzony DNA ulega ekspresji. Może to być też DNA kodujący czynnik zmieniający ekspresję endogennego DNA poprzez wpływanie na jego transkrypcję, translację lub inne procesy regulowane biochemicznie. Heterologiczny DNA może być również określany jako obcy DNA. Tak więc każdy DNA, który specjalista rozpozna jako heterologiczny lub obcy w stosunku do komórki, w której ulega ekspresji, jest tutaj obję ty terminem heterologicznego DNA. Przyk ł ady heterologicznego DNA obejmują m.in. DNA kodujący wykrywane w łatwy sposób białka markerowe, takie jak białka nadające oporność na lek, DNA kodujący substancje skuteczne terapeutycznie, takie jak czynniki przeciwrakowe, enzymy oraz hormony, a także DNA kodujący inne typy białek, np. przeciwciała. Przeciwciała kodowane przez heterologiczny DNA mogą ulegać sekrecji lub być umieszczane na powierzchni komórek, do których wprowadzono heterologiczny DNA. Tak więc terminy „heterologiczny DNA” lub „obcy DNA” odnoszą się do cząsteczek DNA, które nie są obecne w takiej samej orientacji lub takiej samej pozycji, jak odpowiadająca im cząsteczka DNA występująca w odpowiednim adenowirusie typu dzikiego. Termin ten może się także odnosić do cząsteczki DNA z innego organizmu lub gatunku (tj. egzogennego DNA) lub też z innego serotypu adenowirusowego (Ad).

„Terapeutycznie skuteczny produkt DNA” jest produktem kodowanym przez heterologiczny DNA, który to produkt po wprowadzeniu heterologicznego DNA do komórki gospodarza ulega ekspresji powodującej skuteczne osłabienie lub cofnięcie się objawów choroby (dziedzicznej lub nabytej), lub też który leczy tę chorobę. Zazwyczaj, DNA kodujący pożądany produkt klonowany jest w wektorze plazmidowym i wprowadzany do tzw. komórek produkujących (np. komórek pakujących wirusy) przy uży10

PL 208 008 B1 ciu jednego z rutynowych sposobów, takich jak np. użycie fosforanu wapnia lub mikroiniekcja. Po namnożeniu w komórkach produkujących, wektor zawierający heterologiczny DNA może być wprowadzony do wybranych komórek docelowych.

Termin „wektor ekspresyjny lub dostarczający” odnosi się do dowolnego plazmidu lub wirusa, do którego wprowadzić można heterologiczny DNA, ulegający następnie ekspresji w komórkach gospodarza - co oznacza syntetyzowanie kodowanego przez DNA białka lub polipeptydu w systemie komórkowym gospodarza. Wektory zdolne do kierowania ekspresją segmentów DNA (genów), kodujących jedno lub więcej białek, określane są tutaj jako „wektory ekspresyjne”. Omawiane są również wektory pozwalające na klonowanie tzw. komplementarnego DNA (cDNA - ang. complementary DNA) otrzymywanego z produkowanego mRNA przy użyciu odwrotnej transkryptazy.

„Gen” jest cząsteczką kwasu nukleinowego, którego sekwencja nukleotydowa koduje RNA lub polipeptyd. Gen może być zarówno cząsteczką DNA, jak i RNA. Geny obejmować mogą regiony poprzedzające region kodujący (sekwencja liderowa) i następujące po nim, a także sekwencje rozdzielające (introny) położone pomiędzy poszczególnymi sekwencjami kodującymi (eksonami).

Termin „izolowany” w odniesieniu do cząsteczek kwasu nukleinowego, polipeptydów, lub innych cząsteczek biologicznych, oznacza, że kwas nukleinowy lub polipeptyd zostały oddzielone od ich środowiska genetycznego, z którego owe cząsteczki były otrzymane. Termin ten może również oznaczać zmianę w stosunku do stanu naturalnego. Przykładowo, polinukleotyd lub polipeptyd występujący naturalnie w żywym organizmie zwierzęcym nie jest „izolowany”, lecz ten sam polinukleotyd lub polipeptyd oddzielony od materiałów współwystępujących z nim w stanie naturalnym określa się jako „izolowany” w użytym tutaj sensie. Tak więc polipeptyd lub polinukleotyd produkowany i/lub zawarty w rekombinowanej komórce gospodarza uważany jest za wyizolowany. Jako „izolowany polipeptyd” lub „izolowany polinukleotydy” określane są także polipeptydy i polinukleotydy, które poddane zostały częściowemu lub znacznemu oczyszczeniu w procesie ich otrzymywania z komórek gospodarza lub z naturalnego źródła występowania. Przykładowo, cząsteczka związku produkowanego przy użyciu technik rekombinacji DNA może być w znacznym stopniu oczyszczona poprzez wykorzystanie jednoetapowej procedury opisanej przez Smitha i Johnsona (Gene, 67:31-40 (1988)). Terminy „izolowany” i „oczyszczony” są czasami używane wymiennie. Polinukleotyd może być nadal częścią wektora, a polinukleotyd lub polipeptyd mogą być nadal częścią kompozycji, i mimo to będą rozpatrywane jako „izolowane” w tym sensie, że ów wektor lub owa kompozycja nie są częścią swojego naturalnego środowiska.

Termin „izolowany polinukleotyd” oznacza, że kwas nukleinowy jest wolny od sekwencji kodujących tych genów, które w naturalnie występującym genomie organizmu (jeśli taki występuje) bezpośrednio flankują fragment kwasu nukleinowego (gen) będący przedmiotem zainteresowania. Wyizolowany DNA może mieć postać jedno- lub dwuniciową. Może to być genomowy DNA, cDNA, rekombinowany hybrydowy DNA, lub też syntetyczny DNA. Może on być identyczny z naturalnie występującą sekwencją DNA, lub też może różnić się od tej sekwencji występowaniem delecji, addycji, lub podstawienia jednego lub większej liczby nukleotydów.

Terminy „izolowany” lub „oczyszczony”, użyte w odniesieniu do preparatów uzyskanych z komórek biologicznych, oznaczają dowolny wyciąg komórkowy zawierający wskazany DNA lub białko i obejmują też surowy wyciąg zawierający DNA lub białko, będące przedmiotem zainteresowania. Przykładowo, w przypadku białka otrzymać można oczyszczony preparat przy użyciu pojedynczej techniki lub serii technik preparatywnych lub biochemicznych, przy czym stopień oczyszczenia DNA lub białka będących przedmiotem zainteresowania i obecnych w takich preparatach może być różny. Procedury te mogą przykładowo obejmować m.in. frakcjonowanie przy użyciu siarczanu amonu, filtrację żelową, chromatografię jonowymienną, chromatografię powinowactwa, wirowanie w gradiencie gęstości oraz elektroforezę.

Preparat DNA lub białka który jest „oczyszczony w znacznym stopniu” jest preparatem wolnym od występujących naturalnie materiałów, z którymi ów DNA lub owe białko jest związane w stanie naturalnym. Termin „w zasadzie czysty” powinien być rozumiany jako oznaczający „wysoce” oczyszczony preparat, który zawiera przynajmniej 95% DNA lub białka, będących przedmiotem zainteresowania.

„Pakująca linia komórkowa” jest linią komórkową dostarczającą brakujący produkt genu lub jego ekwiwalent.

„Cząstka adenowirusa” jest minimalną jednostką strukturalną lub funkcjonalną wirusa. Termin „wirus” może odnosić się do pojedynczej cząstki, zbioru cząstek, lub do genomu wirusowego. Cząstka adenowirusa (Ad) jest relatywnie złożona i może być podzielona na rozmaite struktury niższego rzędu.

PL 208 008 B1 „Posttranskrypcyjny element regulatorowy” (PRE - ang. posttranscription regulatory element) jest elementem regulatorowym występującym w wirusowym lub komórkowym RNA, nie ulegającym usunięciu w procesie składania mRNA. Przykłady obejmują m.in. ludzkiego wirusa opryszczki, wirusa opryszczki świstaka, gen TK oraz mysi gen białka histonowego. PRE może znajdować się przed sekwencją poli-A lub za sekwencją heterologicznego DNA.

Termin „pseudotypowanie” opisuje produkcję wektorów adenowirusowych posiadających zmodyfikowane białko kapsydu lub też białka kapsydu odpowiadające serotypowi innemu, niż serotyp samego wektora. Przykładem może być produkcja cząstek wektora adenowirusowego 5, zawierających białko włókna Ad37. Można to osiągnąć poprzez produkowanie wektorów adenowirusowych w pakujących liniach komórkowych, wyrażających inne białka włókna.

„Promotory będące przedmiotem zainteresowania” mogą być promotorami indukowanymi lub konstytutywnymi. Promotory indukowane będą inicjować transkrypcję jedynie w obecności dodatkowej cząsteczki; promotory konstytutywne nie wymagają obecności żadnej dodatkowej cząsteczki regulującej ekspresję genu. Regulowany lub indukowany promotor może być również opisany jako promotor, w którego przypadku proces wiązania polimerazy RNA i inicjacji transkrypcji jest regulowany przez bodźce zewnętrzne. Bodźce te obejmują m.in. rozmaite związki lub kompozycje, światło, ciepło, stres oraz chemiczne źródła energii. Promotory indukowane oraz promotory podlegające supresji lub represji określane są terminem promotorów regulowanych. Korzystne promotory są promotorami ulegającymi selektywnej ekspresji w komórkach oka, zwłaszcza w komórkach fotoreceptorowych.

Termin „receptor” odnosi się do biologicznie czynnej cząsteczki, która wiąże się swoiście z innymi cząsteczkami. Termin „białko receptorowe” może być stosowane do zaznaczenia białkowego charakteru określonego receptora.

Termin „rekombinowany” odnosi się do wszelkich elementów potomnych powstałych w wyniku stosowania inżynierii genetycznej. Termin ten może być również użyty do opisu wirusa powstałego w wyniku rekombinacji plazmidu w komórce pakującej.

Terminy „transgen” lub „terapeutyczna cząsteczka kwasu nukleinowego” obejmują cząsteczki DNA lub RNA kodujące RNA lub polipeptyd. Mogą to być cząsteczki „natywne', czyli naturalnie występujące sekwencje; mogą to być także cząsteczki „nienatywne” lub „obce”, które uzyskiwane są ze źródeł naturalnych lub powstają na drodze rekombinacji. Termin „transgen”, który może być tu używany wymiennie z terminem „terapeutyczna cząsteczka kwasu nukleinowego”, jest często używany do opisania heterologicznego lub egzogennego (obcego) genu, przenoszonego przez wektor wirusowy i wprowadzanego do komórki gospodarza. Terapeutyczne cząsteczki kwasu nukleinowego obejmują sekwencje antysensowne lub sekwencje nukleotydowe, które mogą być transkrybowane do sekwencji antysensownych. Wszystkie terapeutyczne sekwencje nukleotydowe (lub transgeny) obejmują cząsteczkę kwasu nukleinowego, której funkcją jest doprowadzenie do pożądanego efektu w komórce lub w jądrze komórkowym, do których takie terapeutyczne cząsteczki kwasu nukleinowego są dostarczane. Przykładowo, terapeutyczna cząsteczka kwasu nukleinowego obejmować może sekwencję nukleotydów kodującą funkcjonalne białko, które zamierza się dostarczyć do komórki, która jest niezdolna do produkcji tego funkcjonalnego białka.

Termin „ciało szkliste oka” dotyczy materiału wypełniającego komorę znajdującą się za soczewką oka (tj. ciecz szklista lub ciało szkliste).

Termin „region promotorowy” oznacza fragment DNA genu, kontrolujący transkrypcję DNA, z którym jest operacyjnie połączony. Region promotorowy obejmuje swoiste sekwencje DNA, które są wystarczające dla rozpoznania, wiązania się i inicjacji transkrypcji przez polimerazę RNA. Sekwencje te mogą działać w układzie cis, lub też mogą być wrażliwe na czynniki działające w układzie trans. W zależności od sposobu regulowania, promotory mogą być konstytutywne lub regulowane.

Termin „operacyjnie połączony” oznacza, że sekwencje lub segmenty zostały kowalencyjnie połączone w jeden odcinek DNA, w postaci jedno- lub dwuniciowej, przez co sekwencje kontrolne na jednym segmencie kontrolują ekspresję lub replikację lub sprawują inny rodzaj kontroli wobec drugiego segmentu. Jednakże między obydwoma segmentami nie musi być koniecznie ciągłości.

Termin „opakowanie” oznacza obudowę z materiału w postaci stałej, takiego jak szkło, tworzywo sztuczne (np. polietylen, polipropylen lub poliwęglan), papier, folia, itp., zdolną do przechowywania polipeptydu, przeciwciała poliklonalnego, lub przeciwciała monoklonalnego. Przykładowo, opakowanie może być szklaną buteleczką wykorzystywaną do przechowania miligramowych ilości polipeptydu rozpatrywanego tutaj, lub też może nim być płytka do miareczkowania, w której umieszczone mogą

PL 208 008 B1 być (i przyłączone do podłoża) mikrogramowe ilości rozpatrywanego polipeptydu lub przeciwciała, co umożliwia odpowiednio zajście immunologicznego wiązania z przeciwciałem lub antygenem.

„Instrukcje użytkowania” obejmują zazwyczaj opis obejmujący stężenia odczynnika, lub przynajmniej jeden parametr dotyczący jego wykorzystywania, np. proporcje odczynnika i próbki poddawanych zmieszaniu, czas przechowywania mieszaniny odczynnika i próbki, temperatura, skład buforu, itp.

Termin „system diagnostyczny” w kontekście niniejszego wynalazku obejmuje również znacznik lub element sygnalizujący, które zdolne są do sygnalizacji zajścia procesu tworzenia się kompleksu immunologicznego, zawierającego polipeptyd lub cząsteczkę przeciwciała.

Termin „kompleks” w użytym tu znaczeniu odnosi się do produktu swoistej reakcji wiązania, takiej jak reakcja przeciwciała z antygenem lub receptora z ligandem. Przykładowymi kompleksami mogą być produkty reakcji immunologicznej.

Terminy „znacznik” lub „element sygnalizujący” (użyte w różnej formie gramatycznej) odnoszą się do pojedynczych atomów i cząsteczek, które są bezpośrednio lub pośrednio związane z generowaniem wykrywalnego sygnału, wskazującego na obecność kompleksu. Dowolny znacznik lub element sygnalizujący może być użyty oddzielnie lub zostać włączony lub wbudowany do ulegającego ekspresji białka, polipeptydu, lub cząsteczki przeciwciała będącego częścią kompozycji przeciwciała. Atomy lub cząsteczki tworzące znacznik lub element sygnalizujący mogą być wykorzystane same lub w połączeniu z innymi odczynnikami. Znaczniki takie są dobrze znane w klinicznej chemii diagnostycznej i stanowią część tego wynalazku tylko w takim zakresie, w jakim są uż ywane w połączeniu z nowymi białkami, sposobami i/lub systemami.

Omówienie

Polipeptyd przedstawiony w fig. 1 jako reszty aminokwasowe 94-471 sekwencji SEK NR ID:1 (np. SEK NR ID:12), a także ten o sekwencji aminokwasowej SEK NR 1D:7, lub polipeptyd kodowany przez cDNA o sekwencji SEK NR ID:6, stanowią przedmiot niniejszego wynalazku. Niniejszy wynalazek obejmuje polinukleotydy kodujące taki sam polipeptyd jak ten przedstawiony w SEK NR 1D:7, SEK NR ID:12, oraz polipeptyd kodowany przez cDNA o sekwencji SEK NR ID:6, a także warianty powyższych polinukleotydów, kodujące fragment hamujący angiogenezę, będący pochodną lub analogiem polipeptydu SEK NR ID:7 lub SEK NR ID:12.

Jak zaznaczono powyżej, polinukleotyd może zawierać sekwencję kodującą, która stanowi naturalnie występujący wariant alleliczny sekwencji kodującej przedstawionej jako SEK NR ID:6. Taki wariant alleliczny jest alternatywną postacią sekwencji polinukleotydowej, zawierającą podstawienie, delecję lub addycję jednego lub większej liczby nukleotydów, co nie zmienia zasadniczo funkcji kodowanego polipeptydu.

Określenie T1, w użytym tu znaczeniu, odnosi się zarówno do polipeptydu o sekwencji aminokwasowej SEK NR ID:13, jak i do polipeptydu o sekwencji aminokwasowej SEK NR ID:5, znakowanego His6. Określenie T2, w użytym tu znaczeniu, odnosi się zarówno do polipeptydu o sekwencji aminokwasowej SEK NR ID:12, jak i do polipeptydu o sekwencji aminokwasowej SEK NR ID:7, znakowanego His6. Określenie TrpRS, w użytym tu znaczeniu, odnosi się zarówno do polipeptydu o sekwencji aminokwasowej odpowiadającej resztom 1-471 w SEK NR ID:1, jak i do polipeptydu o sekwencji aminokwasowej SEK NR ID:1, znakowanego His6.

Sekwencję polinukleotydu kodującą dojrzały polipeptyd można poddać fuzji (z zachowaniem tej samej ramki odczytu) z polinukleotydem, który ułatwia ekspresję i sekrecję polipeptydu z komórki gospodarza, np. z sekwencją liderową funkcjonującą jako sekwencja sekrecyjna kontrolująca transport polipeptydu na zewnątrz komórki. Białko posiadające sekwencję liderową jest białkiem niedojrzałym (preproteiną), a jego sekwencja liderowa może ulec odcięciu w komórce gospodarza, co prowadzi do powstania dojrzałej postaci polipeptydu. Polinukleotydy mogą także kodować dojrzałą postać białka, która również posiada dodatkowe aminokwasy na swym aminowym końcu. Dojrzałe białko posiadające taką sekwencję (prosekwencję) nazywane jest proproteiną i jest nieaktywną postacią białka. Po odcięciu prosekwencji powstaje aktywna postać białka.

Przykładowo więc polinukleotyd może kodować dojrzałe białko, lub białko posiadające prosekwencję, albo też białko posiadające zarówno prosekwencję, jak i presekwencję (sekwencję liderową).

Polinukleotydy mogą być też poddane fuzji (z zachowaniem ramki odczytu) z sekwencją markerową pozwalającą na oczyszczenie polipeptydu według niniejszego wynalazku. Sekwencja markerowa może być znacznikiem sześciohistydynowym dostarczonym w wektorze pQE-9, umożliwiającym oczyszczenie dojrzałego polipeptydu połączonego z markerem, gdy jest on wyrażany w bakteriach. Sekwencją markerową może być też znacznik hemaglutyninowy (HA), jeśli komórki gospodarza są koPL 208 008 B1 mórkami ssaczymi, np. komórkami COS-7. Znacznik HA odpowiada epitopowi pochodzącemu z białka hemaglutyniny wirusa grypy (Wilson I i wsp., Cell, 37:767 (1984)).

Niniejszym opisano także polinukleotydy hybrydyzujące z opisanymi powyżej sekwencjami, jeśli poziom identyczności pomiędzy takimi sekwencjami wynosi przynajmniej 50%, korzystnie przynajmniej 70%, a w szczególności takie, które hybrydyzują do opisanych powyżej polinukleotydów w ostrych warunkach hybrydyzacji. Termin „ostre warunki hybrydyzacji”, w użytym tu znaczeniu, oznacza hybrydyzację, która zachodzi tylko wtedy, gdy poziom identyczności między sekwencjami wynosi przynajmniej 95%, korzystnie przynajmniej 97%. Polinukleotydy hybrydyzujące z opisanymi powyżej sekwencjami kodują polipeptydy, które zachowują zasadniczo taką samą funkcję lub aktywność, jaką wykazuje dojrzały polipeptyd kodowany przez cDNA o sekwencji SEK NR 1D:6.

W odniesieniu do polipeptydu SEK NR ID:7, SEK NR ID:12, lub też do polipeptydu kodowanego przez polinukleotyd o sekwencji SEK NR ID:6, termin „fragment” oznacza część polipeptydu, która zachowuje zasadniczo taką samą angiostatyczną (tj. hamującą angiogenezę) funkcję lub aktywność, jaką wykazuje dany polipeptyd.

Polipeptyd według niniejszego wynalazku może być polipeptydem rekombinowanym, polipeptydem występującym naturalnie, lub też polipeptydem syntetycznym, korzystnie polipeptydem rekombinowanym.

Hamujący angiogenezę fragment, pochodna lub analog polipeptydu SEK NR ID:7, SEK NR ID:12, lub polipeptydu kodowanego przez polinukleotyd o sekwencji SEK NR ID:6, może być takim w którym: (i) jedna lub więcej reszt aminokwasowych uległo konserwatywnemu lub niekonserwatywnemu podstawieniu resztami aminokwasowymi (korzystnie konserwatywnemu podstawieniu resztami aminokwasowymi), przy czym taka podstawiona reszta aminokwasowa może być kodowana przez kod genetyczny, lub też może nie być kodowana przez kod genetyczny; lub (ii) jeden lub większa liczba aminokwasów zawiera podstawioną grupę; lub (iii) polipeptyd jest połączony z innym związkiem, np. takim, który wydłuża okres połowicznego rozpadu polipeptydu (np. glikol polietylenowy); lub (iv) polipeptyd poddano fuzji z jednym lub większą liczbą aminokwasów, takich jak sekwencja liderowa lub eksportująca, lub też sekwencja ułatwiająca oczyszczanie polipeptydu, albo sekwencja proproteinowa. Takie fragmenty, pochodne oraz analogi mogą być projektowane przez specjalistów z tej dziedziny na podstawie zawartych tu wskazówek.

Polipeptydy oraz polinukleotydy według niniejszego wynalazku są dostarczane w postaci wyizolowanej, a korzystniej w postaci oczyszczonej do stanu homogenności.

Niniejszy wynalazek obejmuje także wektory zawierające polinukleotydy według niniejszego wynalazku oraz komórki gospodarza poddane procesowi inżynierii genetycznej przy użyciu wektorów według niniejszego wynalazku.

Komórki gospodarza poddawane są procesowi inżynierii genetycznej (poprzez transdukcję, transformację lub transfekcję) przy użyciu wektora według niniejszego wynalazku, którym może być np. wektor do klonowania lub wektor ekspresyjny. Wektor może mieć np. postać plazmidu, cząstki wirusowej, faga, itp. Poddane procesowi inżynierii genetycznej komórki mogą być hodowane w konwencjonalnych pożywkach modyfikowanych w odpowiedni sposób w celu aktywacji promotorów, selekcjonowania transformantów, lub namnażania genów dla polipeptydu syntetazy tRNA. Warunki hodowli, takie jak temperatura, pH, itp., są takie same jak te stosowane uprzednio do komórek gospodarza wyselekcjonowanych w celu uzyskania ekspresji, i będą oczywiste dla specjalistów z tej dziedziny.

Polinukleotyd według niniejszego wynalazku może być wykorzystany do wytwarzania odpowiadającego mu polipeptydu przy użyciu technik rekombinacji DNA. Tak więc przykładowo, sekwencja polinukleotydowa może być wprowadzona do jakiegokolwiek wektora ekspresyjnego, np. do plazmidu umożliwiającego ekspresję kodowanego polipeptydu. Wektory takie zawierać mogą chromosomalne, niechromosomalne oraz syntetyczne sekwencje DNA, np. pochodne SV40, plazmidy bakteryjne, DNA faga, plazmidy drożdżowe, wektory uzyskane poprzez połączenie plazmidów z fagowym DNA, DNA wirusów, takich jak wirusa ospy krowiej, adenowirusa, wirusa ospy drobiu oraz wirusa choroby Aujeszkyego (wścieklizny rzekomej). Korzystnym wektorem jest wektor pET20b, jednak można zastosować dowolny inny plazmid lub wektor, o ile ulega replikacji i podtrzymuje swoje funkcje w danym gospodarzu.

Jak opisano powyżej, odpowiednia sekwencja DNA może być wprowadzona do wektora przy użyciu rozmaitych procedur. Zazwyczaj, sekwencja DNA jest wprowadzana w odpowiednie miejsce restrykcyjne przy użyciu procedur znanych specjalistom z tej dziedziny. Procedury te, podobnie jak i inne, należą do zakresu procedur znanych specjalistom z tej dziedziny.

PL 208 008 B1

Sekwencja DNA w wektorze ekspresyjnym jest połączona operacyjnie z odpowiednią sekwencją kontrolującą ekspresję (promotorem), która kieruje syntezą mRNA. Reprezentacyjne przykłady takich promotorów obejmują promotor LTR, promotor SV40, promotory lac oraz trp z E. coli, promotor faga lambda PL, oraz inne promotory kontrolujące ekspresję genów komórek prokariotycznych lub eukariotycznych, lub ich wirusów. Wektor ekspresyjny zawiera również miejsce wiązania rybosomu, umożliwiające inicjację translacji, oraz sygnał terminacji transkrypcji. Wektor zawierać też może odpowiednie sekwencje zwiększające poziom ekspresji.

Dodatkowo, wektory ekspresyjne zawierają korzystnie gen odpowiedzialny za cechę fenotypową, która umożliwia selekcję transformowanych komórek gospodarza. Cechą taką może być np. aktywność reduktazy dihydrofolianu lub oporność na neomycynę w przypadku hodowli komórek eukariotycznych, lub oporność na tetracyklinę lub ampicylinę w przypadku bakterii E. coli.

Wektor zawierający odpowiednią sekwencję DNA, opisaną powyżej, a także odpowiedni promotor lub sekwencję regulacyjną, może być wykorzystany do stransformowania odpowiedniego gospodarza w celu otrzymania ekspresji białka. Reprezentacyjne przykłady odpowiednich gospodarzy obejmują komórki bakteryjne, takie jak E. coli. Salmonella typhimurium, Streptomyces, komórki grzybów, takich jak drożdże, komórki owadzie, takie jak komórki muszki Drosophila oraz komórki Sf9, komórki zwierzęce, takie jak CHO, COS, lub czerniaka Bowesa, komórki roślinne, itp. Wybór odpowiedniego gospodarza należy do zakresu procedur znanych specjalistom z tej dziedziny.

Prezentowany wynalazek obejmuje w szczególności rekombinowane konstrukty, zawierające jedną lub więcej spośród opisanych tu szeroko sekwencji. Konstrukty takie obejmują wektor, np. wektor plazmidowy lub wirusowy, do którego wprowadzono sekwencję według niniejszego wynalazku (w orientacji prawidłowej lub odwrotnej). W korzystnym aspekcie tego zastosowania, konstrukt taki zawiera także sekwencje regulatorowe, obejmujące np. promotor, połączony operacyjnie z sekwencją. Specjalistom z tej dziedziny znanych jest wiele odpowiednich wektorów i promotorów, które dostępne są w sprzedaży komercyjnej. Jako przykład podać można następujące wektory: Bakteryjne: pQE70, pQE-9 (Qiagen), pBs, phagescript, PsiX174, pBluescript SK, pBsKS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3 pDR540, PRIT5 (Pharmacia). Eukariotyczne: pWLneo, pSV2cat, pOG44, pXTl, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, PMSG, pSVL (Pharmacia) oraz pET20B. W jednym z korzystnych zastosowań wektorem jest pET20B, jednak zastosować można dowolny inny wektor, o ile ulega replikacji i podtrzymuje swoje funkcje w danym gospodarzu.

Regiony promotorowe mogą być wybrane z dowolnego pożądanego genu, np. przy użyciu wektorów zawierających gen CAT (gen transferazy chloramfenikolowej) lub innych wektorów zawierających markery selekcyjne. Dwa odpowiednie wektory to pKK232-8 oraz pCM7. Przykładowe promotory bakteryjne obejmują lacI, lacZ, T3, T7, gpt, lambda Pr, PL oraz trp. Promotory eukariotyczne obejmują wczesny bezpośredni promotor wirusa CMV, promotor kinazy tymidynowej wirusa HSV, wczesny i póź ny promotor wirusa SV40, retrowirusowe promotory LTR, oraz promotor mysiego genu metalotioneiny I. Wybór odpowiedniego wektora i promotora należy do zakresu procedur znanych specjalistom z tej dziedziny.

W kolejnym zastosowaniu, niniejszy wynalazek dotyczy komórek gospodarza zawierających opisany powyżej konstrukt. Komórka gospodarza może być komórką eukariotyczną, np. komórką ssaczą, lub komórką niższego organizmu eukariotycznego, np. komórka drożdżowa, lub też może to być komórka prokariotyczna, taka jak np. komórka bakteryjna. Konstrukt może być wprowadzony do komórki gospodarza przy pomocy transfekcji z użyciem fosforanu wapnia, transfekcji z użyciem DEAE-dekstranu, lub przy pomocy elektroporacji (Davis L, Dibner M, Battey I, Basic Methods in Molecular Biology, (1986)).

Konstrukty obecne w komórkach gospodarza mogą być wykorzystane w konwencjonalny sposób do wytwarzania produktu genowego, kodowanego przez rekombinowaną sekwencję. Alternatywnie, polipeptydy według niniejszego wynalazku mogą być produkowane syntetycznie, przy użyciu konwencjonalnych syntetyzatorów peptydów.

Białka mogą ulegać ekspresji w komórkach ssaków, drożdży, bakterii, lub w innych komórkach, pod kontrolą odpowiednich promotorów. Do produkowania tych białek wykorzystać też można bezkomórkowe systemy translacyjne oraz RNA uzyskany z konstruktów DNA według niniejszego wynalazku. Odpowiednie wektory do klonowania oraz wektory ekspresyjne, dla gospodarzy prokariotycznych oraz eukariotycznych, opisane są przez Sambrooka i wsp. w opracowaniu włączonym tutaj w charakterze odnośnika (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wydanie 2, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)).

PL 208 008 B1

Transkrypcja DNA, kodującego polipeptyd według niniejszego wynalazku, w wyższych organizmach eukariotycznych jest wzmacniana dzięki wprowadzeniu do wektora sekwencji wzmacniających (enhancerów). Enhancery są działającymi w pozycji cis elementami DNA, o długości zazwyczaj od 10 do około 30 par zasad (pz), które wzmacniają poziom transkrypcji poprzez oddziaływanie z promotorem. Przykłady obejmują enhancer SV40 położony obok miejsca startu replikacji (po jego późnej stronie, między 100 a 270 pz), enhancer wczesnego promotora CMV, enhancer wirusa poliomy położony obok miejsca startu replikacji (po jego późnej stronie), oraz enhancery adenowirusowe.

Rekombinowane wektory ekspresyjne będą na ogół zawierać miejsca startu replikacji, markery selekcyjne umożliwiające transformowanie komórek gospodarza, np. takie jak gen oporności na ampicylinę E. coli lub gen TRPl S. cerevisiae, oraz promotor pochodzący z genu o wysokim poziomie ekspresji, który to promotor kierował będzie transkrypcją położonej za nim sekwencji strukturalnej. Promotory takie mogą pochodzić z operonów kodujących enzymy glikolityczne, takie jak kinaza 3-fosfoglicerynianowa (PGK - ang. 3-phosphoglycerate kinase), czynnik α, kwaśna fosfataza, białka szoku termicznego, itp. Heterologiczna sekwencja strukturalna ulokowana jest tak, aby zachowana była odpowiednia faza dla sekwencji startu i terminacji replikacji, a korzystnie także dla sekwencji liderowej, umożliwiającej sekrecję produkowanego białka do przestrzeni periplazmatycznej lub do pożywki. Opcjonalnie, heterologiczna sekwencja kodować może białko fuzyjne obejmujące N-końcowy peptyd o pożądanych właściwościach, np. stabilizujący rekombinowany produkt lub upraszczający jego oczyszczanie.

Po stransformowaniu odpowiedniego szczepu gospodarza i hodowaniu stransformowanych komórek do momentu osiągnięcia odpowiedniej gęstości, wybrany promotor poddawany jest derepresji (np. poprzez zmianę temperatury lub indukcję chemiczną), a komórki hodowane są jeszcze przez dodatkowy okres czasu.

Komórki są zazwyczaj zbierane poprzez zwirowywanie, rozbijane przy użyciu środków fizycznych lub chemicznych, a powstający w ten sposób surowy wyciąg jest zachowywany do dalszego oczyszczania.

Komórki mikroorganizmów, wykorzystywane do uzyskiwania ekspresji białek, mogą być rozbijane przy użyciu dowolnego konwencjonalnego sposobu, włącznie z cyklicznym zamrażaniem i rozmrażaniem, sonikacją, rozbijaniem mechanicznym, lub z wykorzystaniem czynników lizujących komórki.

Do uzyskiwania ekspresji rekombinowanych białek zastosować można także rozmaite systemy hodowli komórek ssaczych. Przykłady ssaczych systemów ekspresyjnych obejmują linię małpich fibroblastów nerkowych COS-7, opisaną przez Gluzmana (Cell, 23:175 (1981)), oraz inne linie komórkowe zdolne do wyrażania kompatybilnych wektorów, jak np. linie komórkowe C127, 3T3, CHO, HeLa oraz BHK. Ssacze wektory ekspresyjne zawierać będą miejsce startu replikacji, odpowiedni promotor i enhancer, a także wszystkie niezbędne miejsca wiązania rybosomu, miejsca poliadenylacji, miejsca donorowe i akceptorowe dla procesu składania, sekwencje terminacji transkrypcji, oraz flankujące niekodujące sekwencje z końca 5'. Do otrzymania wymaganych nietranskrybowanych elementów genetycznych wykorzystać można np. sekwencje DNA z genomu wirusa SV40, takie jak miejsce startu replikacji wirusa SV40, wczesny promotor, enhancer, miejsca wymagane do zajścia procesu składania oraz miejsca poliadenylacji.

Odzyskiwanie i oczyszczanie polipeptydów z hodowli rekombinowanych komórek przeprowadza się przy użyciu powszechnie stosowanych sposobów, takich jak precypitacja przy użyciu siarczanu amonu lub etanolu, ekstrakcja kwasem, chromatografia jonowymienna, chromatografia fosfocelulozowa, chromatografia oddziaływań hydrofobowych, chromatografia powinowactwa, chromatografia hydroksyapatytowa oraz chromatografia lektynowa. Korzystne jest utrzymywanie niskiego stężenia jonów wapnia (około 0,1-5 mM) podczas procesu oczyszczania (Price i wsp., J Biol Chem, 244:917 (1969)). Jeśli jest to konieczne, wprowadzić można etap ponownego fałdowania (tzw. refolding) oczyszczonych białek, w celu otrzymania dojrzałego białka o odpowiedniej konfiguracji. Ostatni etap oczyszczenia obejmować może zastosowanie wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC - ang. high performance liquid chromatography).

Polipeptydy według niniejszego wynalazku mogą być produktem oczyszczonym naturalnie, produktem syntezy chemicznej, lub też produktem uzyskiwanym z prokariotycznego lub eukariotycznego gospodarza (np. z hodowli komórek bakteryjnych, drożdżowych, roślinnych, owadzich lub ssaczych) przy zastosowaniu technik rekombinacji. W zależności od gospodarza wykorzystanego w zastosowanych procedurach produkcji rekombinowanego produktu, polipeptydy według niniejszego wynalazku mogą być glikozylowane przy użyciu ssaczych lub innych eukariotycznych węglowodanów, lub też mogą nie być poddane glikozylacji.

PL 208 008 B1

Polipeptydy według niniejszego wynalazku mogą być poddawane modyfikacji w celu polepszenia stabilności oraz zwiększenia skuteczności działania, przy użyciu sposobów znanych specjalistom. Przykładowo, aminokwasy w postaci L mogą być zastąpione aminokwasami w postaci D, aminowy koniec polipeptydu może być poddany acetylacji, lub też zmodyfikowany może zostać koniec karboksylowy, np. poprzez przyłączenie czapeczki etyloaminowej (Dawson DW i wsp., Mol Pharmacol, 55:332-338 (1999)).

Polipeptyd według niniejszego wynalazku może być również zastosowany w terapii genowej, poprzez wywoływanie jego ekspresji in vivo zgodnie z założeniami prezentowanego wynalazku.

Do terapii genowej według niniejszego wynalazku zastosować można rozmaite wektory wirusowe, takie jak adenowirusy, wirus opryszczki, wirus ospy krowiej, wirus związany z adenowirusem (AAV ang. adeno-associated virus), lub korzystnie wirus RNA, taki jak retrowirus. Korzystnie wektor retrowirusowy pochodzi od mysiego lub ptasiego retrowirusa, lub jest to wektor lentiwirusowy. Korzystnym wektorem wirusowym jest wektor lentiwirusowy. Przykłady wektorów retrowirusowych, do których można wprowadzić pojedynczy obcy gen, obejmują m.in.: wirusa MoMuLV (ang. Moloney murine leukemia virus), wirusa HaMuSV (ang. Harvey murine sarcoma virus), wirusa MuMTV (ang. murine mammary tumor virus), wirusy SIV, BIV i HIV, oraz wirusa mięsaka Rousa (RSV - ang. Rous sarcoma virus). Do wielu innych wektorów retrowirusowych wprowadzać można liczne geny. Wszystkie te wektory mogą przenosić lub wbudowywać gen markera selekcyjnego, stosowanego w celu identyfikowania transdukowanych komórek i ich otrzymywania. Wektor można też uczynić swoistym wobec komórek docelowych, co można np. osiągnąć poprzez wprowadzenie sekwencji kodującej polipeptyd wiążący DNA (oparty na motywie palca cynkowego) wraz z innym genem kodującym liganda dla receptora występującego na powierzchni swoistej komórki docelowej. Retrowirusowe wektory mogą więc być uczynione swoistymi wobec komórek docelowych poprzez wprowadzenie polinukleotydu kodującego określone białko. Korzystne celowanie osiąga się poprzez wykorzystanie przeciwciała rozpoznającego wektor retrowirusowy. Specjaliści z tej dziedziny potrafią ocenić, bez potrzeby przeprowadzania zbędnych eksperymentów, jakie swoiste sekwencje polinukleotydowe należy wprowadzić do genomu retrowirusa aby uzyskać swoiste wobec komórki docelowej dostarczenie wektora retrowirusowego zawierającego polinukleotyd kodujący białko z domeną palca cynkowego, wiążące DNA.

Ponieważ rekombinowane retrowirusy są defektywne, wymagają pewnej pomocy, aby mogły produkować infekcyjne cząstki wirusowe. Pomoc tę można dostarczyć stosując np. pomocnicze linie komórkowe, zawierające plazmidy kodujące wszystkie geny strukturalne retrowirusa pod kontrolą sekwencji regulatorowych w LTR. Plazmidom tym brakuje sekwencji nukleotydowych umożliwiających rozpoznawanie transkryptu RNA przez mechanizm pakujący odpowiedzialny za enkapsydację. Pomocnicze linie komórkowe posiadające delecje sygnału pakowania obejmują m.in. linie Ψ2, PA317 oraz PA12. Linie te produkują puste wiriony, gdyż nie jest do nich pakowany żaden genom. Jeśli do takich komórek wprowadzony zostanie wektor retrowirusowy, który zawiera nieuszkodzony sygnał pakowania, lecz nie posiada genów strukturalnych, które zostały zastąpione innymi genami będącymi przedmiotem zainteresowania, wówczas możliwe jest pakowanie wektorów i produkowanie wirionów wektorowych. Wektor wirusowy otrzymywany tym sposobem może być następnie wykorzystany do infekowania tkankowej linii komórkowej, takiej jak NIH3T3, w celu wyprodukowania dużych ilości chimerowych wirionów retrowirusowych.

Innym kierowanym systemem dostarczania polinukleotydów kodujących polipeptydy o strukturze palca cynkowego, wiążące DNA, jest system rozpraszania koloidalnego. System rozpraszania koloidalnego obejmuje kompleksy makrocząsteczkowe, nanokapsułki, mikrosfery, drobne kuleczki, oraz systemy oparte na lipidach, takie jak emulsje typu olej w wodzie, micele, mieszane micele oraz liposomy. Korzystny system koloidalny stanowią liposomy. Liposomy są sztucznymi pęcherzykami błonowymi, które stosowane są jako środki dostarczania w systemie in vitro oraz in vivo. Zostało wykazane, że duże jednowarstwowe pęcherzyki (LUV - ang. large unilamellar vesiles), o rozmiarach od 0,2 do 4,0 um, mogą wprowadzić do swego wnętrza znaczną procentową objętość buforu wodnego zawierającego duże makrocząsteczki. RNA, DNA oraz całe wiriony mogą być wraz z wodą wprowadzane do wnętrza takich pęcherzyków, a następnie dostarczane do komórek w biologicznie aktywnej postaci (Fraley i wsp., Trends Blochem Sci, 6:77 (1981)). Oprócz komórek ssaczych, liposomy są też używane do dostarczania polinukleotydów roślinom, komórkom drożdżowym i bakteryjnym. Aby liposom był wydajnym środkiem transportu dla genów, powinien posiadać następujące cechy: (1) wysoka wydajność enkapsulacji genów będących przedmiotem zainteresowania bez szkody dla ich biologicznej aktywności; (2) prefemcyjne i wydajne wiązanie się z docelowymi komórkami, w porównaniu do komórek nie będąPL 208 008 B1 cych celem; (3) wysoka wydajność dostarczania wodnej zawartości pęcherzyka do cytoplazmy komórki docelowej; oraz (4) dokładna i skuteczna ekspresja informacji genetycznej (Mannino i wsp., Biotechniques, 6:682 (1988)).

Skład liposomu stanowi zazwyczaj kombinację różnych fosfolipidów, zwłaszcza fosfolipidów o wysokiej temperaturze zmiany faz, zwykle w połączeniu ze sterydami, zwłaszcza cholesterolem. Stosowane mogą też być inne fosfolipidy lub inne lipidy. Fizyczne właściwości liposomów zależą od pH, siły jonowej oraz obecności dwuwartościowych kationów.

Przykłady lipidów użytecznych w produkcji liposomów obejmują związki fosfatydylowe, takie jak fosfatydyloglicerol, fosfatydylocholina, fosfatydyloseryna, fosfatydyloetanoloamina, sfingolipidy, cerebrozydy oraz gangliozydy. Szczególnie użyteczne są diacylofosfatydyloglicerole, w których łańcuch lipidowy zawiera 14-18 atomów węgla, zwłaszcza 16-18 atomów węgla, i jest nasycony. Przykładowe fosfolipidy to fosfatydylocholina jaja kurzego, dipalmitoilofosfatydylocholina oraz distearoilofosfatydylocholina.

Nakierowywanie liposomów sklasyfikowano w oparciu o czynniki anatomiczne i mechanistyczne. Klasyfikacja anatomiczna oparta jest na poziomie selektywności i obejmuje np. takie kategorie jak swoistość względem narządu, swoistość względem, komórki, czy też swoistość względem organelli. Mechaniczna klasyfikacja procesów nakierowywania bierze pod uwagę różnicę między pasywnym i aktywnym kierowaniem. Pasywne kierowanie wykorzystuje naturalną skłonność liposomów do łączenia się z komórkami układu siateczkowo-śródbłonkowego (RES - ang. reticulo-endothelial system) w narządach zawierających włośniczki zatokowe. Natomiast kierowanie aktywne dotyczy sytuacji, gdy liposom zostaje zmieniony poprzez przyłączenie do niego swoistego liganda, takiego jak przeciwciało monoklonalne, cukier, glikolipid, lub białko, albo poprzez zmianę składu lub rozmiaru liposomu w celu osiągnięcia kontaktu z narządami i typami komórek, innymi niż te, do których liposom docierał naturalnie.

Powierzchnia wykorzystywana w systemie kierowanego dostarczania może być modyfikowana w rozmaity sposób. W przypadku liposomowego systemu kierowanego dostarczania, do dwuwarstwy lipidowej liposomu mogą być wbudowywane grupy lipidowe w celu zapewnienia stabilnego połączenia między dwuwarstwą liposomu a cząsteczką liganda, odpowiedzialną za nakierowywanie. Do utworzenia wiązania między owym ligandem celującym a łańcuchami lipidowymi wykorzystać można rozmaite grupy sprzęgające.

Związkami przyłączonymi do powierzchni systemu kierowanego dostarczania są zazwyczaj ligandy oraz receptory, które pozwalają na odnalezienie pożądanej komórki i zakotwiczenie się na jej powierzchni. Ligandem może być dowolny związek będący przedmiotem zainteresowania, który będzie wiązał się z innym związkiem, np. z receptorem.

Receptorami nazywane są zazwyczaj powierzchniowe białka błonowe, wiążące się swoiście z cząsteczkami efektorowymi. Do nakierowywania liposomów do swoistych ligandów na powierzchni komórek wykorzystywane mogą być przeciwciała. Przykładowo, pewne antygeny wyrażane są swoiście na powierzchni komórek nowotworowych, i określane są jako antygeny związane z nowotworami (TAA - ang. tumor-associated antigen). Mogą one być więc wykorzystane do naprowadzania liposomów, zawierających przeciwciało oraz białko z wiążącym DNA motywem palca cynkowego, bezpośrednio do komórek złośliwego nowotworu. Ponieważ produkt genu kodującego białko z palcem cynkowym wiążącym DNA może nie różnicować swej aktywności w zależności od typu komórki, system kierowanego dostarczania stanowi znaczne usprawnienie w porównaniu do losowego, niespecyficznego wstrzykiwania zawartości liposomów. Kowalencyjne wiązanie między poliklonalnym lub monoklonalnym przeciwciałem a dwuwarstwą liposomu można osiągnąć przy pomocy rozmaitych procedur. Liposomy kierowane przeciwciałami zawierać mogą przeciwciała monoklonalne lub poliklonalne, lub ich części, takie jak Fab lub F(ab')2, o ile wiążą się one skutecznie z epitopem antygenowym na powierzchni komórki docelowej. Liposomy mogą być również kierowane na komórki wyrażające receptory hormonów lub innych czynników osocza.

Specjalistom w tej dziedzinie dostępnych jest wiele wirusowych i niewirusowych sposobów wprowadzania cząsteczki kwasu nukleinowego do komórki docelowej. Dobrze znane specjalistom są też sposoby manipulowania informacją genetyczną pierwotnych komórek nowotworowych. Genetyczną modyfikację komórki można przeprowadzić przy użyciu jednej lub większej liczby technik znanym specjalistom z dziedziny terapii genowej (Mulligan RC, Human Gene Therapy, 5(4):543-563 (1993)). Sposoby transdukcji wirusowej mogą obejmować zastosowanie rekombinowanych wirusów DNA lub RNA, zawierających sekwencję kwasu nukleinowego, która kieruje ekspresją lub hamuje ekspresję białka o aktywności sialylotransferazy. Odpowiednie wirusy DNA przeznaczone do wykorzystania według niniejszego wynalazku to m.in. adenowirusy (Ad), wirusy związane z adenowirusem (AAD), wirus

PL 208 008 B1 opryszczki, wirus ospy krowiej, lub wirus polio. Odpowiednie wirusy RNA przeznaczone do wykorzystania według niniejszego wynalazku to m.in. retrowirusy oraz wirus Sindbis. Dla specjalistów z tej dziedziny jest oczywiste, że istnieje kilka takich wirusów DNA lub RNA, które mogą być wykorzystane w ramach niniejszego wynalazku.

Wirusy adenowirusowe są przydatne do przenoszenia genów do komórek eukariotycznych, do badania ekspresji genów eukariotycznych, do rozwijania szczepionek oraz do prowadzenia badań na modelach zwierzęcych. Terapię genową z wykorzystaniem adenowirusów przeprowadza się również u ludzi, czego przykładem może być wprowadzanie genu CFTR (ang. cystic fibrosis transmemhrane conductance regulator) do płuc. Stosowane drogi podawania rekombinowanego adenowirusa do różnych tkanek in vivo obejmują np. wkraplanie dooskrzelowe, wstrzykiwanie domięśniowe, wstrzykiwanie do żył obwodowych, oraz stereotaktyczną inokulację w mózgu. Wektory adenowirusowe są więc łatwo dostępne dla specjalistów i użyteczne w ramach niniejszego wynalazku.

Wirus związany z adenowirusem (AAV) został ostatnio wprowadzony jako nowy system przenoszenia genów o potencjalnym zastosowaniu w terapii genowej. Wirus AAV typu dzikiego demonstruje wysoką infektywność, szeroki zakres gospodarza oraz swoistość odnośnie wbudowywania się do genomu komórki gospodarza. Atrakcyjnym systemem wektorowym jest też wirus opryszczki HSV-1, zwłaszcza w przypadku zastosowania do systemu nerwowego, co wynika z jego neurotropowych właściwości. Jako wektory ekspresyjne stosowane są też wirusy ospy krowiej oraz inne wirusy z rodziny wirusów ospy. Każdy z opisanych powyżej wirusów jest dostępny fachowcom z tej dziedziny i mógłby być wykorzystany w ramach prezentowanego wynalazku.

Wektory retrowirusowe zdolne są do bardzo wydajnego infekowania komórek docelowych oraz do wbudowywania się (integracji) w genom komórki gospodarza. Retrowirusy zaczęto wykorzystywać jako wektory do przenoszenia genów wcześniej niż inne wirusy i były jako pierwsze wykorzystane do skutecznej transdukcji cDNA deaminazy adenozynowej (ADA) do ludzkich limfocytów. Korzystnymi wirusami są lentiwirusy. W korzystnych zastosowaniach stosowany jest retrowirus wybrany z grupy obejmującej HIV, BIV oraz SIV.

„Niewirusowe” techniki dostarczania kwasów nukleinowych, które są wykorzystywane lub proponowane dla terapii genowej obejmują: kompleksy DNA i liganda; kompleksy adenowirusa, liganda i DNA; bezpośrednie wstrzyknięcie DNA; precypitację z użyciem CaPO4; techniki typu „gene gun”; elektroporację, liposomy oraz lipofekcję. Każdy z tych sposobów jest dostępny specjalistom z tej dziedziny i każdy może być wykorzystany w ramach niniejszego wynalazku. Specjalistom dostępne są też inne odpowiednie sposoby i należy mieć świadomość, że prezentowany wynalazek może być zrealizowany przy zastosowaniu każdego z tych sposobów transfekcji. Kilka z tych sposobów było już wykorzystywanych, z różnym sukcesem, przez specjalistów. Lipofekcja polega na enkapsulacji wyizolowanej cząsteczki DNA przez cząstkę liposomu, a następnie doprowadzeniu do kontaktu owej cząstki liposomu z błoną komórkową komórki docelowej. Liposomy są samorzutnie powstającymi koloidalnymi cząstkami, w których dwuwarstwa lipidowa, zbudowana z amfifilowych cząsteczek, takich jak fosfatydyloseryna lub fosfatydylocholina, zawiera w swym wnętrzu część otaczającego płynu. Dwuwarstwa lipidowa otacza więc hydrofilową zawartość liposomu. Tworzone mogą być jednowarstwowe lub wielowarstwowe liposomy, których wnętrze zawiera pożądany związek chemiczny, lek, lub też, jak w niniejszym wynalazku, wyizolowaną cząsteczkę DNA.

Komórki mogą być transfekowane in vivo, ex vivo, lub in vitro. Transfekować można pierwotne komórki wyizolowane od pacjenta, lub też linie komórkowe pochodzące z komórek pierwotnych. Transfekowane komórki nie muszą być koniecznie autologiczne wobec komórek pacjenta, któremu ostatecznie są owe komórki podawane. Po transfekcji przeprowadzonej ex vivo lub in vitro komórki mogą być wszczepione gospodarzowi.

W celu otrzymania transkrypcji kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku wewnątrz docelowej komórki wykorzystuje się transkrypcyjny region regulatorowy, zdolny do kierowania ekspresją genu w komórce docelowej. Taki transkrypcyjny region regulatorowy obejmować może promotor, enhancer, silencer (wyciszacz) lub element represorowy, przy czym region ten jest funkcjonalnie połączony z kwasem nukleinowym według niniejszego wynalazku. Korzystnie, transkrypcyjny region regulatorowy kieruje wysokim poziomem ekspresji w komórce docelowej. Transkrypcyjne regiony regulatorowe, znajdujące zastosowanie w niniejszym wynalazku, obejmują m.in. bezpośredni wczesny enhancer/promotor ludzkiego wirusa CMV, wczesny enhancer/promotor wirusa SV40, promotor poliomowirusa JC, promotor albuminy, PGK oraz promotor α-aktyny sprzężony z enhancerem CMV.

PL 208 008 B1

Wektory według niniejszego wynalazku mogą być konstruowane przy użyciu standardowych technik rekombinacyjnych, znanych dobrze specjalistom z tej dziedziny. Techniki te opisane są w powszechnie znanych opracowaniach z dziedziny biologii molekularnej, takich jak Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Goeddel D (ed.), Gene Expression Technology, w serii: Methods in Enzymology, tom 185, Academic Press, San Diego, CA (1991); oraz Innnis i wsp., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, CA (1990).

Wprowadzanie polipeptydu lub kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku do komórki docelowej in vivo może być przeprowadzane przy użyciu rozmaitych technik, znanych specjalistom z tej dziedziny.

Wektory według niniejszego wynalazku mogą być podawane doustnie, pozajelitowo, poprzez inhalacje, doodbytniczo, lub miejscowo w porcjowanych preparatach zawierających konwencjonalne dopuszczalne farmaceutycznie nośniki, adiuwanty i zaróbki. Termin „pozajelitowo”, w użytym tu znaczeniu, obejmuje podawanie podskórne, dożylne, domięśniowe, domostkowe, poprzez wlew lub dootrzewnowe. Czopki do doodbytniczego podawania leku mogą być przygotowane poprzez zmieszanie leku z odpowiednią niedrażniącą zaróbką, taka jak masło kakaowe lub glikole polietylenowe, które mają postać stałą w temperaturze pokojowej, jednak przyjmują postać płynną w temperaturze, jaka panuje w odbytnicy. Dlatego czopki takie ulegają rozpuszczeniu w odbytnicy, gdzie uwalniany jest lek.

Sposób określania dawki w przypadku leczenia choroby przy użyciu wektorów według niniejszego wynalazku lub kompozycji według tego wynalazku oparty jest na rozmaitych czynnikach, które obejmują rodzaj choroby, wiek, masę ciała, płeć, stan zdrowia pacjenta, ciężkość choroby, drogę podawania leku, oraz rodzaj stosowanego związku. Tak więc dawkowanie może różnić się bardzo w poszczególnych przypadkach, jednak może być ustalone przy zastosowaniu standartowych sposobów.

Aktywne farmaceutycznie związki według niniejszego wynalazku mogą być poddane procesowaniu, przy użyciu konwencjonalnych sposobów farmaceutycznych, w celu wyprodukowania kompozycji medycznych lub czynników przeznaczonych do podawania pacjentom, którymi mogą być ludzie lub inne ssaki. W przypadku podawania doustnego, kompozycja farmaceutyczna może występować np. w postaci płynu, wkładki ocznej, kapsułki, tabletki, lub zawiesiny. Korzystnie, kompozycja farmaceutyczna jest produkowana w jednostkach dawkowania, które zawierają określoną ilość czynnika aktywnego. Przykładowo, jednostki te mogą zawierać około 10³-10¹⁵ cząstek wirusowych, korzystnie około 10⁶-10¹² cząstek wirusowych. Odpowiednia dzienna dawka dla człowieka lub innego ssaka może różnić się w zależności od stanu zdrowia pacjenta i innych czynników, ale, tak jak uprzednio, może być określona przy użyciu rutynowych sposobów. Podawanie może być przeprowadzone poprzez wstrzyknięcie aktywnego czynnika jako kompozycji wraz z odpowiednim dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem, takim jak roztwór soli, dekstroza, lub woda.

Choć kwasy nukleinowe i/lub wektory według wynalazku mogą być podawane jako jedyny aktywny farmaceutycznie czynnik, to mogą być też one stosowane w połączeniu z jednym lub większą liczbą wektorów według wynalazku, lub innymi czynnikami. Czynniki lecznicze podawane w formie łącznej mogą być oddzielnymi kompozycjami podawanymi jednocześnie lub o innym czasie, albo też mogą być podawane jako pojedyncza kompozycja.

Polipeptyd według niniejszego wynalazku może być stosowany w połączeniu z dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem. Takie kompozycje obejmują terapeutycznie skuteczną dawkę białka oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub zaróbkę. Nośnikiem mogą być m.in. roztwór soli, zbuforowany roztwór soli, dekstroza, woda, glicerol, etanol, lub też ich kombinacje. Skład preparatu powinien być odpowiedni dla sposobu podawania.

Opisany tu zestaw farmaceutyczny może obejmować jeden lub więcej pojemników, wypełnionych jednym lub większą liczbą składników wchodzących w skład kompozycji farmaceutycznej. Takim pojemnikom powinna towarzyszyć notatka w formie akceptowanej przez agencję rządową regulującą produkcję, stosowanie oraz sprzedaż produktów farmaceutycznych lub biologicznych. Notatka taka powinna zaświadczać o zgodzie agencji na produkowanie, stosowanie i sprzedawanie kompozycji leczniczej podawanej ludziom. Ponadto, polipeptyd według niniejszego wynalazku może być zastosowany w połączeniu z innymi związkami leczniczymi.

Kompozycje farmaceutyczne mogą być podawane w odpowiedni dla danego zastosowania sposób, np. śródocznie, jako krople do oczu, lub poprzez podawanie systemowe. Dawkowanie podawanych pacjentowi polipeptydów pochodzących z syntetazy tRNA zależeć będzie od wielu czynników, takich jak droga podawania, rodzaj leczonej choroby, masa ciała leczonego osobnika, oraz ocena

PL 208 008 B1 prowadzącego lekarza. Ogólnie mówiąc, polipeptyd podawany jest w skutecznych leczniczo dawkach przynajmniej 10 μg/kg masy ciała. Korzystnie, dawka wynosi od około 10 μg/kg masy ciała do około 1 mg/kg masy ciała dziennie, biorąc pod uwagę częstość, drogę podawania, objawy, itp.

Terapia angiostatyczna przy użyciu TrpRS może być zastosowana do przeciwdziałania angiogennej aktywności endogennych i egzogennych czynników angiogennych, oraz do zapobiegania dalszemu wzrostowi lub nawet do wywołania regresji guzów litych, ponieważ angiogeneza oraz neowaskularyzacją są istotnymi etapami w rozwoju guzów litych. Tego typu terapie mogą być również wykorzystane do leczenia reumatoidalnego zapalenia stawów, łuszczycy oraz cukrzycowej retinopatii, które to choroby związane są z nieprawidłową angiogenezą.

Dostarczane są kompozycje zawierające terapeutycznie skuteczne dawki i stężenia rekombinowanych wektorów adenowirusowych, służące dostarczeniu terapeutycznych produktów genowych do komórek wyrażających określony receptor. Komórki te obejmują komórki oka, a zwłaszcza komórki fotoreceptorowe oka. Podawanie może obejmować dowolne sposoby, zapewniający osiągnięcie kontaktu z fotoreceptorami. Aby zapewnić dostęp do komórek fotoreceptorowych, korzystne sposoby podawania obejmują m.in. wstrzyknięcie podsiatkówkowe lub wstrzyknięcie śródszklistkowe.

Przygotować można również kompozycje, zawierające rekombinowane wirusy, które wszczepiane mogą być do przedniej lub tylnej komory oka, korzystnie do ciała szklistego, w postaci preparatów ulegających podtrzymywanemu uwalnianiu, np. preparatów otrzymywanych dzięki adsorpcji do komponentów ulegających biodegradacji, takich jak gąbki kolagenowe, lub też występujących w postaci liposomów. Preparaty działające na zasadzie podtrzymywanego uwalniania mogą być przygotowane do podawania w wielu dawkach, tak aby w ciągu danego okresu czasu, np. miesiąca lub roku, podano kilka dawek. Przykładowo, preparat zawierający liposomy może być podawany w ten sposób, że pojedyncza dawka wstrzykiwana jest od dwóch do pięciu lub więcej razy.

Wektory połączone są z dopuszczalnym oftalmologicznie nośnikiem i podawane śródocznie, korzystnie śródszklistkowo, w objętości od około 0,05 do 0,15 ml, korzystnie od około 0,05 do 0,1 ml.

Kompozycje mogą być dostarczane w szczelnie zamkniętej sterylnej fiolce, zawierającej taką ilość czynnika aktywnego, która po podaniu śródocznym dostarczy wystarczającą ilość cząstek wirusa do fotoreceptorów w objętości 50-150 μ|, która to objętość zawiera przynajmniej około 10⁷, korzystnie przynajmniej około 10⁸ jednostek tworzących łysinki. Zazwyczaj fiolki zawierać więc będą o, 15 ml kompozycji.

Kompozycje mogą zawierać nośnik, który chroni czynnik aktywny przed szybkim usunięciem z ciała. Służą do tego np. preparaty o stopniowym uwalnianiu lub preparaty powlekane. Odpowiednie nośniki obejmują nośniki wykorzystywane do tworzenia preparatów z kontrolowanym uwalnianiem, takie jak m.in. mikrokapsułkowy system dostarczania, ulegające biodegradacji i biokompatybilne polimery, takie jak octan etylenowinylowy, polianhydrydy, kwas poliglikolowy, poliortoestry, kwas polimlekowy, oraz inne typy implantów, które mogą być umieszczane bezpośrednio w komorze przedniej lub tylnej, albo w ciele szklistym oka. Kompozycje mogą być również podawane w peletkach, takich jak peletki ELVAX® (żywica kopolimeru etylenu i octanu winylu, DuPont).

PL 208 008 B1

Zawiesiny liposomów, obejmujące liposomy nakierowywane na określone tkanki, mogą również służyć jako dopuszczalny farmaceutycznie nośnik. Przykładowo, preparaty liposomowe można przygotowywać w oparciu o sposoby znane specjalistom z tej dziedziny (patrz np. Kimm i wsp., Bloch Bioph Acta, 728:339-398 (1983); Assil i wsp., Arch Ophtalmol, 105:400 (1987); oraz Patent USA nr 4,522,811). Cząstki wirusowe mogą być poddane enkapsulacji w fazie wodnej systemu liposomowego.

Materiały i czyimiki aktywne mogą być mieszane z innymi aktywnymi materiałami, które nie zaburzają ich pożądanej aktywności, a także z materiałami, które stanowią dodatek do ich aktywności lub wykazują inną aktywność. Materiały te obejmują kwas hialuronowy, sprzedawany jako preparat o nazwie handlowej HEALON® (Pharmacia, Inc), będący roztworem wysokocząsteczkowej (MW = 3000000) frakcji hialuronianu sodu (patrz np. opisy patentowe USA nr 5,292,362, 5,282,851, 5,273,056, 5,229,127, 4,517,295 oraz 4,328,803), a także żywice sprzedawane pod nazwą handlową VISCOAT® (dostępne w Alcon Surgical, Inc), będące zawierającymi fluor polimetakrylanami, takimi jak 1H,1H,2H,2H-heptadekafluorodecylometakrylan (patrz np. Patent USA nr 5,278,126, 5,273,751 oraz 5,214,080), żywice sprzedawane pod nazwą handlową ORCOLON® (Optical Radiation Corporation, patrz np. Patent USA nr 5,273,056) oraz metylocelulozy, metylohialuroniany, poliakrylamidy i polimetaakrylamidy (patrz np. Patent USA nr 5,273,751). Materiały lepkosprężyste obecne są zazwyczaj w ilościach od 0,5% do 5,0%, korzystnie od 1 do 3% (wagowo) i służą jako powłoka ochronna. Kompozycje mogą również zawierać barwniki, takie jak błękit metylenowy lub inny obojętny biologicznie barwnik, stosowany po to, aby kompozycja była widoczna po wstrzyknięciu do oka. Do kompozycji włączone też mogą być dodatkowe czynniki aktywne.

Kompozycje mogą być zawarte w ampułkach, jednorazowych strzykawkach, albo w fiolkach (w pojedynczych lub wielokrotnych dawkach) zrobionych ze szkła, plastiku lub innych odpowiednich materiałów. Tak upakowane kompozycje mogą być dostarczane w zestawach. W szczególności, niniejszy wynalazek dostarcza zestawu zawierającego fiolki, ampułki, lub inne pojemniki, korzystnie jednorazowe fiolki z wystarczającą ilością kompozycji (0,100 ml), oraz jednorazowe igły, korzystnie samouszczelniające się igły o rozmiarze 25-33, lub mniejsze.

Ostateczne kompozycje mogą więc występować w postaci zapakowanych produktów, obejmujących materiał służący do opakowania (zazwyczaj fiolka), dopuszczalną oftalmologicznie kompozycję zawierającą polipeptyd według niniejszego wynalazku, oraz etykietę, wskazującą na terapeutyczne zastosowanie kompozycji.

Dostarczone są również zestawy do praktycznego wykorzystywania opisanych tu zastosowań. Zestawy obejmują jeden lub więcej pojemników, takich jak uszczelnione fiolki, zawierających wystarczającą ilość kompozycji dla jednej dawki, a także jedną lub więcej igieł, takich jak samouszczelniające się igły o rozmiarze 25-33 lub mniejsze, korzystnie igły o rozmiarze 33 lub mniejsze, z precyzyjnie wykalibrowanymi strzykawkami lub innymi precyzyjnie wykalibrowanymi urządzeniami wstrzykującymi, nadającymi się do wstrzykiwania śródszklistkowego.

Kompozycja podawana jest korzystnie drogą wstrzykiwania śródocznego, choć inne drogi podawania mogą również być skuteczne, jeśli wystarczająca ilość związku osiągnie kontakt z ciałem szklistym. Efekt wstrzyknięcia śródocznego może być osiągnięty poprzez wstrzyknięcie śródszklistkowe, wstrzyknięcie do cieczy wodnistej lub wstrzyknięcie do zewnętrznych warstw oka, np. wstrzyknięcie podspojówkowe, lub też poprzez podanie miejscowe na rogówkę, jeśli zastosowany zostanie preparat ulegający penetracji.

Dla każdego poszczególnego pacjenta powinno być przyjęte indywidualne dawkowanie, opracowane z uwzględnieniem indywidualnych potrzeb i profesjonalnej oceny dokonanej przez osobę nadzorującą podawanie rekombinowanych wirusów. Podane tu zakresy stężeń i ilości stanowią jedynie przykład i nie ograniczają zakresu zastrzeganych niniejszym rozwiązań.

Podane poniżej przykłady ilustrują szczególne zastosowania wynalazku. Mają one jedynie charakter ilustracyjny i przykładowy, dlatego nie powinny być traktowane jako narzucane ograniczenia.

P r z y k ł a d 1

Otrzymanie wolnej od endotoksyny rekombinowanej TrpRS

Rekombinowaną TrpRS, wolną od endotoksyny, otrzymywano jak następuje. Przygotowano plazmidy kodujące TrpRS o pełnej długości (reszty aminokwasowe 1-471 w SEK NR ID:1), lub skróconą TrpRS, oznaczaną dalej jako T2 (SEK NR ID:12), zawierającą reszty 94-471 z SEK NR ID:1 (tj. reszty 94-471 z TrpRS o pełnej długości), oraz drugą skróconą TrpRS, oznaczana dalej jako T1 (SEK NR ID:13), zawierającą reszty 71-471 z SEK NR ID:1. Każdy plazmid kodował także C-końcowy znacznik składający się z sześciu reszt histydynowych (np. reszty aminokwasowe 472-484 w SEK NR

PL 208 008 B1

ID:1) oraz inicjacyjną resztę metioninową. T1 znakowany His6 ma sekwencję aminokwasową SEK NR ID:5, natomiast T2 znakowany His6 ma sekwencję aminokwasową SEK NR ID:7.

Powyższe plazmidy wprowadzono do E. coli szczep BL21 (DE3) (Novagen, Madison, WI). Podobnie przygotowano do użycia ludzki dojrzały EMAPII, również kodujący C-końcowy znacznik zawierający sześć reszt histydynowych. Nadekspresję rekombinowanej TrpRS indukowano traktując komórki izopropylo-e-D-tiogalaktopiranozydem przez 4 godziny. Następnie lizowano komórki a białka z supernatantu oczyszczano na kolumnach niklowych HIS-BIND® (Novagen) stosując się do protokołu zalecanego przez producenta. Po oczyszczeniu białek TrpRS inkubowano je w buforze PBS zawierającym 1 uM ZnSO₄, następnie usuwano Zn²+ (Kisselev i wsp., Eur J Blochem, 120:511-17 (1981)).

Endotoksynę usuwano z próbki białkowej poprzez rozdzielenie faz z zastosowaniem Tritonu X-114 (Liu i wsp., Clin Blochem, 30:455-63 (1997)). Przy użyciu testu E-TOXATE® (Sigma, St. Loius, MO) oceniono, że próbki białkowe zawierają mniej niż 0,01 jednostki endotoksyny na ml. Stężenie białka określano przy użyciu testu Bradforda (Bio-Rad, Hercules, CA), stosując albuminę z surowicy wołowej (BSA) jako standard.

P r z y k ł a d 2

Cięcie ludzkiej TrpRS przez elastazę PMN

Testowano cięcie ludzkiej TrpRS o pełnej długości przez elastazę PMN. TrpRS traktowano elastazą PMN w buforze PBS (pH 7,4) przy zachowaniu proporcji proteaza:białko wynoszącej 1:3000 przez 0, 15, 30 lub 60 minut. Po cięciu analizowano próbki w 12% żelu poliakryloamidowym z SDS. Przecięcie przez elastazę PMN białka TrpRS o pełnej długości (53 kDa), kodowanego przez nukleotydy 3428-4738 z SEK NR ID:2, prowadziło do pojawienia się dwóch nowych fragmentów, większego o masie 46 kDa (SEK NR ID:5) oraz mniejszego o masie 43 kDa (SEK NR ID:7, T2 posiadający C-końcowy znacznik histydynowy).

Analiza typu „Western biot” przeprowadzona przy użyciu przeciwciał skierowanych przeciwko C-końcowemu znacznikowi histydynowemu rekombinowanego białka TrpRS ujawniła, że oba fragmenty posiadały znacznik histydynowy na swych karboksylowych końcach. Tak więc białka skrócone zostały jedynie o swoje końce aminowe. N-końcowe sekwencje fragmentów TrpRS określano stosując degradację Edmana oraz sekwenator ABl 494. Sekwencjonowanie tych fragmentów wykazało obecność N-końcowych sekwencji S-N-H-G-P (SEK NR ID:8) oraz S-A-K-G-I (SEK NR ID:9), co wskazywało, że N-końcowe reszty większego i mniejszego fragmentu odpowiadały odpowiednio pozycjom 71 i 94 białka TrpRS o pełnej długości. Podsumowanie informacji o ludzkich konstruktach TrpRS zawiera fig. 1. Sekwencje sygnaturowe -HVGH- (SEK NR ID:10) oraz -KMSAS- (SEK NR ID:11) przedstawiono w ramkach. Aktywność angiostatyczną większego i mniejszego fragmentu TrpRS analizowano w teście na angiogenezę. W teście zastosowano rekombinowane formy większego i mniejszego fragmentu TrpRS (SEK NR ID:5 oraz SEK NR ID:7). Oba fragmenty TrpRS posiadały C-końcowy znacznik histydynowy (reszty aminokwasowe 472-484 w SEK NR ID:1) i oba były zdolne do hamowania angiogenezy.

P r z y k ł a d 3

Skrócone fragmenty TrpRS wykazują silne działanie angiostatyczne hamując angiogenezę w siatkówce

Testowano aktywność angiostatyczną skróconych postaci syntetazy tryptofanylo-tRNA (TrpRS 53 kDa, SEK NR ID:1) w mysim modelu postnatalnej angiogenezy w siatkówce. Friedlander i wsp. (IOVS, 41(4):138-139, streszczenia 709-B84 oraz 714-B89, 15 marca 2000) stwierdzili, że postnatalna angiogeneza w siatkówce myszy przebiega etapami. Niniejszym opisano sposób testowania hamowania angiogenezy, wykorzystującego to etapowe unaczynianie siatkówki.

Wolne od endotoksyny rekombinowane polipeptydy mini-TrpRS (48 kDa, wariant „splicingowy” znakowanego histydyną TrpRS; SEK NR ID:3) oraz T2 (43kDa, produkt cięcia znakowanego histydyną TrpRS; SEK NR ID:7) zostały przygotowane jako białka rekombinowane. Białka te wstrzyknięto śródszklistkowo noworodkom myszy Balb/C w 7 lub 8 dniu po urodzeniu, a siatkówki pobierano w dniu 12 lub 13. W celu wizualizacji naczyń w preparatach siatkówkowych wykorzystano przeciwciało przeciwko kolagenowi IV oraz drugorzędowe przeciwciało sprzężone z fluoresceiną. Aktywność przeciwangiogenną analizowano przy użyciu mikroskopu konfokalnego oceniając wpływ wstrzykniętych białek na formowanie się głębokiego, zewnętrznego splotu naczyniowego. Iniekcję śródszklistkową oraz izolację siatkówki przeprowadzano przy użyciu mikroskopu SMZ 645 (Nikon, Japonia) z oprzyrządowaniem do mikromanipulacji. W 7 dniu po urodzeniu (P7) odkrywano przy pomocy skalpela szczelinę w powiece, odsłaniając gałkę oczną w celu wykonania iniekcji polipeptydu T2 (5 pikomoli) lub TrpRS (5 pikomoli). Próbki (0,5 ul) wstrzykiwano przy użyciu strzykawki z igłą o rozmiarze 32 (Hamilton ComPL 208 008 B1 pany, Reno, NV). Iniekcji dokonywano pomiędzy równikiem gałki ocznej a rąbkiem rogówki; podczas wstrzykiwania monitorowano pozycję końca igły, pilnując aby znajdował się on w ciele szklistym. Oczy z naruszoną przez igłę soczewką lub uszkodzoną siatkówką były wykluczane z dalszych badań. Po iniekcji przywracano uprzednią pozycję powiek w celu zamknięcia szczeliny.

W 12 dniu po urodzeniu zwierząt (P12) uśmiercano je i wydobywano z nich oczy. Po 10 minutach inkubacji w 4% paraformaldehydzie (PFA) wycinano rogówkę, soczewki, twardówkę i ciało szkliste poprzez przecinanie ich brzegów. Wyizolowaną siatkówkę przygotowywano do barwienia umieszczając ją w metanolu na 10 minut (w lodzie), a następnie na 1 godzinę w roztworze blokującym, zawierającym 50% płodową surowicę wołową (Gibco, Grand Island, NY) oraz 20% surowicę kozią (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) w buforze PBS (w lodzie). Naczynia krwionośne uwidaczniano barwiąc siatkówkę przez 18 godzin w temperaturze 4°C przy użyciu króliczego przeciwciała przeciwko mysiemu kolagenowi IV (Chemicon, Temecula, CA), rozcieńczonemu 1:200 w buforze blokującym. Następnie inkubowano siatkówkę z kozim przeciwciałem przeciwko króliczej IgG, sprzężonym z barwnikiem fluoroscencyjnym ALEXA FLUOR® 594, przez 2 godziny w temperaturze 4°C. Siatkówki umieszczano na szkiełku mikroskopowym w płynie zapobiegającym blaknięciu (slow-fade mounting media M, Molecular Probes, OR).

Aktywność angiostatyczna określano na podstawie oceny przebiegu angiogenezy w głębszej, zewnętrznej siatkówkowej warstwie naczyniowej (warstwa druga), tworzącej się pomiędzy P8 a P12. Wygląd wewnętrznej sieci naczyń krwionośnych (warstwa pierwsza) oceniano pod względem prawidłowości rozwoju i występowania oznak toksyczności. Żaden ze stosowanych w tym przykładzie konstruktów białkowych nie powodował jakichkolwiek niepożądanych zmian w warstwie pierwszej.

Figura 2 zawiera fotomikrografię, przedstawiające zdolność T2 do hamowania unaczyniania drugorzędowej głębokiej warstwy mysiej siatkówki. W rzędzie A przedstawiono sieć naczyń poddanych działaniu TrpRS, w rzędzie B pokazano sieć naczyń siatkówki poddanych działaniu mini-TrpRS, natomiast rząd C przedstawia sieć naczyń siatkówki poddanych działaniu polipeptydu T2 według niniejszego wynalazku. Pierwsza (lewa) kolumna przedstawia pierwszorzędową powierzchniową warstwę, natomiast druga kolumna przedstawia drugą głębszą warstwę. Jak widać na fig. 2, żaden z polipeptydów nie wpłynął na obraz pierwszej powierzchniowej sieci naczyń, podczas gdy jedynie T2 w znaczącym stopniu zahamował unaczynianie drugiej głębszej sieci.

Większość oczu traktowanych samym PBS wykazywała prawidłowy rozwój naczyń siatkówki, jednak w 8,2% przypadków (n=73) stwierdzano całkowite zahamowanie rozwoju zewnętrznej sieci naczyń. Takie całkowite zahamowanie stwierdzano w 28% (n=75) przypadków oczu traktowanych mini TrpRS (0,5 mg/ml). Mniejsza skrócona postać (T2) była dużo silniejszym inhibitorem angiogenezy, wykazując przy tym zależność skutku działania od dawki. W tym przypadku 14,3% oczu wykazywało całkowite zahamowanie po podaniu 0,1 mg/ml T2 (n=14), 40% po podaniu 0,25 mg/ml (n=20), a 69,8% po podaniu 0,5 mg/ml (n=53). Wyniki dla stężenia 0,5 mg/ml przedstawiono graficznie na fig. 3. Wyciągi z mysiej siatkówki zawierają białko o takiej samej masie molekularnej i immunoreaktywności, jak ludzki polipeptyd mini-TrpRS, co wykazała analiza „Western biot” poprzedzona elektroforezą w SDS-PAGE. Mysie i ludzkie białko TrpRS o pełnej długości wykazują około 88% identyczności i zawierają odpowiednio 475 i 471 aminokwasów. Skrócone postacie TrpRS, zwłaszcza T2, wykazują silne działanie angiostatyczne wobec rozwoju naczyń w siatkówce.

P r z y k ł a d 4

Ocena procesu angiogenezy przy użyciu testu wykorzystującego żel „matrigel”

Ocenę aktywności angiostatycznej polipeptydu T2 (SEK NR ID:7) przeprowadzono przy użyciu testu wykorzystującego żel „matrigel”, zgodnie ze sposobem opisanym przez Brooksa i wsp. (Methods Mol Biol, 129:257-269 (1999)) oraz Eliseiri i wsp. (Mol Cell, 4:915-924 (1999)). Do opisanego tam sposobu wprowadzono kilka modyfikacji. Nie posiadającym grasicy myszom wehi wszczepiano podskórnie 400 μl pozbawionego czynnika wzrostu żelu „matrigel” (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), zawierającego 20 nM VEGF. Angiostatyczne właściwości T2 testowano początkowo wprowadzając 2,5 μΜ T2 do wszczepianej wkładki żelowej. Siłę działania T2 oceniano następnie wprowadzają różne wartości stężenia T2 we wkładce. Po upływie 5 dni wstrzykiwano myszom śródszklistkowo wyznakowaną fluoresceiną i wiążącą się z komórkami śródbłonka lektynę Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia I, izolektynę B4 (Vector Laboratories, Burlingame, CA), po czym wycinano wkładkę żelową. Zawartość fluoresceiny w każdej wkładce oceniano spektrofotometrycznie po roztarciu wkładki w buforze RIPA (10 mM fosforan sodu, pH 7,4, 150 mM chlorek sodu, 1% Nonidet P-40, 0,5% deoksycholan sodu, 0,1% SDS).

PL 208 008 B1

P r z y k ł a d 5

Lokalizacja wiązania T2 w obrębie siatkówki

W celu dokonania oceny wydajnoś ci pobierania oraz lokalizacji wprowadzonego do siatkówki polipeptydu T2, wstrzykiwano śródszklistkowo, w 7 dniu (P7) po urodzeniu myszy, polipeptyd T2 wyznakowany fluoresceiną (ALEXA® 488, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR). W czasie P8 i P12 zbierano gałki oczne i utrwalano je w 4% PFA przez 15 minut. Następnie oddzielano siatkówki od pozostałych tkanek i inkubowano w 4% PFA przez noc w temperaturze 4°C a następnie zatapiano w podłożu TISSUE-TEK® (O.C.T, Sakura, FineTechnical Co., Japonia) na suchym lodzie. Otrzymane po kriosekcji skrawki (o grubości 10 mikronów) poddawano rehydratacji w buforze PBS i blokowaniu w roztworze 5% BSA, 2% surowicy koziej w PBS. Naczynia krwionośne wizualizowano przy pomocy przeciwciała przeciwko mysiemu kolagenowi IV, wg powyższego opisu. Następnie umieszczano skrawki tkankowe na szkiełku mikroskopowym w podłożu VECTASHIELD® (Vector Laboratories, Burlingame, CA), zawierającym wybarwiający jądra komórkowe DAPI.

Alternatywnie, niebarwione skrawki siatkówki inkubowano z 200 nM znakowanym fluoresceiną polipeptydem TrpRS, lub znakowanym fluoresceiną polipeptydem T2, w buforze blokującym przez noc w temperaturze 4°C. Skrawki płukano następnie sześciokrotnie po 5 minut w buforze PBS i inkubowano z 1 μο/ml DAPI przez 5 minut w celu wizualizacji jąder komórkowych. Wstępne blokowanie z nieznakowanym T2 prowadzono inkubując skrawki z nieznakowanym T2 (1 μΜ) przez 8 godzin w temperaturze 4°C przed inkubacją z T2 znakowanym fluoresceiną. Otrzymane preparaty siatkówek analizowano przy użyciu multifotonowego mikroskopu konfokalnego BioRad MRC1024. Trójwymiarowe obrazy otrzymywano z serii przekrojów horyzontalnych przy użyciu oprogramowania Confocal Assistant (BioRad, Hercules, CA).

Działanie angiostatyczne T2 w mysim teście z wkładkami żelowymi.

Sprawdzaliśmy, czy T2 (SEK NR ID:7) posiada aktywność angiostatyczną pomimo utraty aktywności aminoacylacyjnej. Do oceny aktywności angiostatycznej in vivo wykorzystano test z wkładkami żelowymi. VEGF165 indukuje rozwój naczyń krwionośnych w mysich wkładkach żelowych. Po dodaniu T2 do żelu zawierającego VEGF165 angiogeneza ulegała zahamowaniu w sposób zależny od dawki (IC50=1,7 nM), jak pokazano na fig. 4.

Wyznakowany fluoresceiną T2 obecny jest w naczyniach krwionośnych siatkówki.

W celu dokonania oceny lokalizacji T2 (SEK NR ID:7) we wnętrzu oka określano dystrybucję znakowanego fluoresceiną T2 po jego wstrzyknięciu, przeprowadzonym w 7 dniu po urodzeniu się myszy. Siatkówki były pobierane następnego dnia, cięte na skrawki i analizowane pod mikroskopem. Lokalizacja wprowadzonego do oka białka była ograniczona do naczyń krwionośnych. Lokalizację tę potwierdzono wykonując jednoczesne barwienie preparatów oczu, które były traktowane wyznakowanym T2, wyznakowanymi fluoresceiną (ALEXA® 594) przeciwciałami przeciwko kolagenowi IV (wyniki nie przedstawione). Zielony sygnał fluorescencyjny wyznakowanego T2 był wciąż widoczny po pięciu dniach (w dniu P12) od wstrzyknięcia wyznakowanego fluoresceiną T2 (fig. 5A). W siatkówkach tych nie obserwowano obecności drugiej warstwy naczyń w dniu P12, co wskazuje, że wyznakowany fluoresceiną T2 zachował angiostatyczną aktywność porównywalną z nieznakowanym T2. Siatkówki, do których wprowadzono wyznakowany fluoresceiną polipeptyd TrpRS o pełnej długości w dniu P7, wykazywały obecność drugiej warstwy naczyń w dniu P12, jednak nie obserwowano wówczas wybarwienia naczyń (fig. 5B). Na fig. 5, białka znakowane fluoresceiną są zielone, naczynia identyfikowane przy użyciu przeciwciał przeciwko kolagenowi są czerwone, natomiast jądra komórkowe są niebieskie.

W celu dokonania dalszej oceny zdolności znakowanego T2 do wiązania się, skrawki zawierające przekroje prawidłowych siatkówek noworodkowych barwiono polipeptydem T2 wyznakowanym fluoresceiną. W tych warunkach, wyznakowany fluoresceiną T2 wiązał się jedynie z naczyniami krwionośnymi (fig. 5C). Wiązanie to było specyficzne, gdyż można je było zablokować poprzez wstępną inkubację z nieznakowanym T2 (wyniki nie przedstawione). Nie obserwowano sygnału odpowiadającego naczyniom siatkówki, gdy preparaty traktowane były wyznakowanym fluoresceiną polipeptydem TrpRS o pełnej długości (fig. 5D), co zgodne jest z brakiem aktywności angiostatycznej w przypadku enzymu o pełnej długości.

Jak przedstawiono na fig. 5, wyznakowany fluoresceiną polipeptyd T2 ma właściwości angiostatyczne i lokalizowany jest w naczyniach krwionośnych siatkówki. Wyznakowany fluoresceiną polipeptyd T2 (fig. 5A) lub TrpRS o pełnej długości (fig. 5B) wstrzykiwano (0,5 μ!, śródszklistkowo) w 7 dniu życia (P7). Siatkówki pobierano w dniu P8 i barwiono przeciwciałem przeciwko kolagenowi IV oraz barwnikiem wybarwiającym jądra komórkowe (DAPI). Wyznakowany T2 (górna strzałka wskazująca

PL 208 008 B1 naczynie na fig. 5A) zlokalizowano w naczyniach krwionośnych w pierwszej powierzchniowej warstwie (1°). Należy zwrócić uwagę, że druga głębsza warstwa jest zupełnie nieobecna (2°). Choć zarówno pierwsza (1°), jak i druga (2°) warstwa naczyniowa są obecne w oczach do których wprowadzono wyznakowany fluoresceiną peptyd TrpRS o pełnej długości (strzałki na fig. 5B), nie ulegają one wybarwieniu.

W oddzielnej grupie doświadczeń, barwiono zamrożone skrawki siatkówki z dnia P15 przy pomocy wyznakowanego fluoresceiną polipeptydu T2 (fig. 5C) lub wyznakowanego fluoresceiną polipeptydu TrpRS o pełnej długości (fig. 5D) a następnie analizowano je przy użyciu konfokalnego mikroskopu laserowego. Wyznakowany T2 obecny był wyłącznie w naczyniach krwionośnych i widoczny był jako jasne zielone naczynie penetrujące pierwszą i drugą warstwę naczyniową siatkówki tuż pod znakiem 2° na fig. 5C. Nie zaobserwowano żadnego barwienia w przypadku TrpRS o pełnej długości (fig. 5D).

TrpRS o pełnej długości posiada unikalną domenę N-końcową i nie wykazuje aktywności angiostatycznej. Usunięcie części lub całej tej domeny prowadzi do uzyskania białka o właściwościach angiostatycznych. Struktury odpowiedzialne za aktywność angiostatyczną polipeptydu T2 wydają się być zawarte w zwoju Rossmanna w obrębie domeny wiążącej nukleotydy. N-końcowa domena, która może być usunięta w procesie alternatywnego składania lub poprzez proteolizę, może regulować angiostatyczną aktywność TrpRS, prawdopodobnie przez odsłonięcie miejsca wiązania niezbędnego dla angiostazy, które jest niedostępne w TrpRS o pełnej długości.

Angiogeneza indukowana przez VEGF w mysim modelu żelowym była hamowana przez T2, podobnie jak fizjologiczna angiogeneza w siatkówce noworodków. Co ciekawe, najsilniejsze działanie przeciwangiogenne wykazywane przez fragmenty TrpRS in vitro oraz w modelach CAM i żelowym obserwowane jest w przypadku angiogenezy stymulowanej przez VEGF. Wyniki otrzymane dla angiogenezy w siatkówce mysich noworodków są zgodne z koncepcją istnienia związku pomiędzy angiogenezą stymulowaną przez VEGF a angiostatycznym działaniem fragmentów TrpRS. Angiogeneza zachodząca w siatkówce w tym naturalnym systemie może być kierowana przez VEGF. Ponadto, inhibicja stwierdzana w modelu siatkówkowym była swoiście nakierowana na nowo powstające naczynia; istniejące uprzednio (w momencie iniekcji) naczynia pierwszej warstwy naczyniowej nie uległy zmianie pod wpływem zabiegu. Choć mechanizm angiostatycznego działania T2 jest nieznany, to specyficzna lokalizacja T2 w śródbłonku naczyń siatkówki oraz selektywne działanie T2 na nowo powstające naczynia sugerują, że T2 może działać poprzez śródbłonkowe receptory komórkowe, ulegające ekspresji w komórkach dzielących się (proliferujących) lub migrujących. Pełniejsze zrozumienie mechanizmu angiostatycznego działania polipeptydu T2 wymaga zidentyfikowania odpowiedniego receptora komórkowego.

Liczne typy komórek, które wytwarzają, po stymulacji interferonem-γ, angiostatyczne miniTrpRS, produkują także takie angiostatyczne czynniki jak IP-10. Tak więc wyniki te sugerują możliwość odgrywania przez TrpRS określonej roli w prawidłowych, istotnych fizjologicznie szlakach związanych z angiogenezą. Inne powszechne białko komórkowe pro-EMAPII (p43) pełni dwie niezwiązane ze sobą funkcje, podobne do tych, jakie prezentuje TrpRS. Pro-EMAPII bierze udział w translacji białek wiążąc się z kompleksem multisyntetazowym syntetazy aminoacylo-tRNA u ssaków. Ulega też obróbce i sekrecji jako EMAPII, przy czym sugeruje się, że EMAPII pełni funkcję pośrednika w procesie angiostazy podczas rozwoju płuc.

Tak więc T2 może być wykorzystywany mającym istotne znaczenie fizjologiczne procesie angiogenezy, obserwowanym zarówno w warunkach prawidłowych, jak i patologicznych. W przypadku prawidłowej angiogenezy, T2 może pomagać w tworzeniu ważnych fizjologicznie obszarów beznaczyniowych, występujących w niektórych narządach, jak np. dołkowa strefa beznaczyniowa w centralnym obszarze siatkówki. Patologiczna angiogeneza może być konsekwencją zahamowania procesu cięcia cząsteczki TrpRS o pełnej długości, co prowadziłoby do przerostu naczyń.

W przypadku chorób oczu, neowaskularyzacja może prowadzić do głębokiej utraty wzroku. Pacjenci tacy uzyskać by mogli znaczną korzyść z terapii hamującej angiogenezę. Naczyniowy śródbłonkowy czynnik wzrostu wiązany jest z neowaskularyzacją oraz obrzękiem plamki żółtej w siatkówce, choć i inne czynniki angiogenne odgrywają też zapewne znaczną rolę w angiogenezie siatkówkowej. Zaobserwowaliśmy związek występujący między angiogenezą stymulowaną przez VEGF a silnym działaniem angiostatycznym fragmentów TrpRS, co czyni te cząsteczki użytecznymi w leczeniu retinopatii proliferacyjnych związanych z niedotlenieniem i innych. W literaturze brak jest doniesień o czynnikach przeciwangiogennych, całkowicie hamujących angiogenezę w 70% przypadków, jak to czyni T2 według niniejszego wynalazku (fig. 5). Inną zaletą fragmentów TrpRS jest to, że reprezentują one wy26

PL 208 008 B1 stępujące naturalnie, a więc nieimmunogenne czynniki przeciwangiogenne. Cząsteczki te mogą być dostarczane poprzez system kierowanej terapii, opartej na wektorach wirusowych lub komórkach. Ponieważ wielu pacjentów z neowaskularną chorobą oczu cierpi na towarzyszące tej chorobie układowe niedotlenienie, pożądane jest miejscowe leczenie przeciwangiogenne, w którym genetycznie zmodyfikowane komórki lub wektory wirusowe umieszczane są bezpośrednio w oku.

Oprócz leczenia angiogennych retinopatii, fragmenty TrpRS według niniejszego wynalazku, a zwłaszcza T2 oraz jego fragmenty hamujące angiogenezę, mogą również hamować wzrost guzów litych poprzez zapobieganie unaczynianiu guza. Fragmenty TrpRS według wynalazku blokują indukowaną przez VEGF proliferację oraz chemotaksję komórek śródbłonka in vitro. Mogą więc być użyteczne w leczeniu każdego stanu patologicznego obejmującego niepożądaną proliferację i unaczynianie komórek śródbłonka.

PL 208 008 B1

Lista sekwencji <110> Schimmel, Paul

Wakasugi, Keisuke

Friedlander, Martin

The Scripps Reasearch Institute <120> Polipeptydy syntetazy tryptofanylo-tRNA użyteczne w regulowaniu angiogenezy <130> TSRI-813.1 CA <150> PCT/US02/05185 <151> 2002-02-22 <150> 60/270,951 <151> 2001-02-23 <160> 13 <17 0> FastSEQ for Windowa Version 4.0 <210> 1 <211> 484 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<22 3 > Rekombinowany ludzki trpRS <400> 1

Met

Pro

Asn

Ser

Glu

Pro

Ala

Ser

Leu

Glu

Leu

Phe

Asn

Ser

Ile

1

5

10

15

Ala

Thr

Gin

Gly

Glu

Leu

Val

Arg

Ser

Leu

Lys

Ala

Gly

Asn

Ala

Ser

20

25

30

Lys

Asp

Glu

Ile

Asp

Ser

Ala

Val

Lys

Met

Leu

Val

Ser

Leu

Lys

Met

35

40

45

Ser

Tyr

Lys

Ala

Gly

Glu

Asp

Tyr

Lys

Ala

Asp

Cys

Pro

50

55

60

Gly

Asn

Pro

Ala

Pro

Thr

Ser

Asn

His

ciy

Pro

Asp

Ala

Thr

Glu

Ala

65

70

75

80

Glu

Asp

Phe

Val

Asp

Pro

Trp

Thr

Val

Gin

Thr

Ser

Ala

Lys

85

90

95

Gly

Ile

Asp

Tyr

Asp

Lys

Leu

Ile

Val

Arg

Phe

Gly

Ser

Lys

Ile

100

105

110

Asp

Lys

Glu

Leu

Ile

Asn

Arg

Ile

Glu

Arg

Ala

Thr

Gly

Gin

Arg

Pro

115

120

125

His

Phe

Leu

Arg

Gly

Ile

Phe

Ser

His

Arg

Asp

Met

Asn

130

135

140

Gin

Val

Leu

Asp

Ala

Tyr

Glu

Asn

Lys

Pro

Phe

Tyr

Leu

Tyr

Thr

145

150

155

160

Gly

Arg

Gly

Pro

Ser

Glu

Ala

Met

His

Val

Gly

His

Leu

Ile

Pro

165

170

175

Phe

Ile

Phe

Thr

Lys

Trp

Leu

Gin

Asp

val

Phe

Asn

Val

Pro

Leu

Val

180 185 190

Ile Gin Met Thr Asp Asp Glu Lys Tyr Leu Trp Lys Asp Leu Thr Leu 195 200 205

Asp Gin Ala Tyr Gly Asp Ala Val Glu Asn Ala Lys Asp Ile Ile Ala 210 215 220

PL 208 008 B1

Cys

Gly

Phe

Asp

Ile

Asn

Lys

Thr

Phe

Ile

Phe

Ser

Asp

Leu

Asp

Tyr

225

230

235

240

Met

Gly

Met

Ser

Gly

Phe

Tyr

Lys

Asn

Val

Lys

Ile

Gln

Lys

245

250

255

His

Val

Thr

Phe

Asn

Gln

Val

Lys

Gly

Ile

Phe

Gly

Phe

Thr

Asp

Ser

260

265

270

Asp

Cys

Ile

Gly

Lys

Ile

Ser

Phe

Pro

Ala

Ile

Gln

Ala

Pro

Ser

275

280

285

Phe

Ser

Asn

Ser

Phe

Pro

Gln

Ile

Phe

Arg

Asp

Arg

Thr

Asp

Ile

Gln

290

295

300

Cys

Leu

Ile

Pro

Cys

Ala

Ile

Asp

Gln

Asp

Pro

Tyr

Phe

Arg

Met

Thr

305

310

315

320

Arg

Asp

val

Ala

Pro

Arg

Ile

Gly

Tyr

Pro

Lys

Pro

Ala

Leu

His

325

330

335

Ser

Thr

Phe

Pro

Ala

Leu

Gln

Gly

Ala

Gln

Thr

Lys

Met

Ser

Ala

340

345

350

Ser

Asp

Pro

Asn

Ser

Ile

Phe

Leu

Thr

Asp

Thr

Ala

Lys

Gln

Ile

355

360

365

Lys

Thr

Lys

Val

Asn

Lys

His

Ala

Phe

Ser

Gly

Arg

Asp

Thr

Ile

370

375

380

Glu

His

Arg

Gln

Phe

Gly

Asn

Cys

Asp

Val

Asp

Val

Ser

Phe

385

390

3 95

400

Met

Tyr

Leu

Thr

Phe

Leu

Glu

Asp

Lys

Leu

Glu

Gln

Ile

405

410

415

Arg

Lys

Asp

Tyr

Thr

Ser

Gly

Ala

Met

Leu

Thr

Gly

Glu

Leu

Lys

420

425

430

Ala

Leu

Ile

Glu

Val

Leu

Gln

Pro

Leu

Ile

Ala

Glu

His

Gln

Ala

Arg

435

440

445

Arg

Lys

Glu

Val

Thr

Asp

Glu

Ile

Val

Lys

Glu

Phe

Met

Thr

Pro

Arg

450

455

460

Lys

Leu

Ser

Phe

Asp

Phe

Gln

Lys

Leu

Ala

Leu

Glu

His

465 470 475 480

His His His His <210> 2 <211> 4877 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Rekombinowany ludzki mini-TrpRS w pET20B <221> CDS <222> (3428)...(4738) <400> 2 tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60 cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120 ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180 gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240 acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300 ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360 ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420 acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480 tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540 tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat 600 gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt 660 ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg 720 agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga 780 agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg 840 tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt 900 tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg 960

PL 208 008 B1 cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg 1020 aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga 1080 tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc 1140 tgcagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc 1200 ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc 1260 ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg 1320 cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac 1380 gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc 1440 actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt 1500 aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 1560 caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 1620 aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 1680 accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 1740 aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg 1800 ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 1860 agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 1920 accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 1980 gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct 2040 tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 2100 cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 2160 cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 2220 cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt 2280 ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 2340 taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 2400 gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatatgg 2460 tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat 2520 cgctacgtga ctgggtcatg gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct 2580 gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct 2640 gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagctg cggtaaagct 2700 catcagcgtg gtcgtgaagc gattcacaga tgtctgcctg ttcatccgcg tccagctcgt 2760 tgagtttctc cagaagcgtt aatgtctggc ttctgataaa gcgggccatg ttaagggcgg 2820 ttttttcctg tttggtcact gatgcctccg tgtaaggggg atttctgttc atgggggtaa 2880 tgataccgat gaaacgagag aggatgctca cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc 2940 ggttactgga acgttgtgag ggtaaacaac tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa 3000 aaatcactca gggtcaatgc cagcgcttcg ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta 3060 gccagcagca tcctgcgatg cagatccgga acataatggt gcagggcgct gacttccgcg 3120 tttccagact ttacgaaaca cggaaaccga agaccattca tgttgttgct caggtcgcag 3180 acgttttgca gcagcagtcg cttcacgttc gctcgcgtat cggtgattca ttctgctaac 3240 cagtaaggca accccgccag cctagccggg tcctcaacga caggagcacg atcatgcgca 3300 cccgtggcca ggacccaacg ctgcccgaga tctcgatccc gcgaaattaa tacgactcac 3360 tatagggaga ccacaacggt ttccctctag aaataatttt gtttaacttt aagaaggaga 3420

tatacat

atg Met 1

agc Ser

tac Tyr

aaa gct gcc

gcg Ala

ggg Gly

gag Glu

gat Asp 10

tac Tyr

aag Lys

gct Ala

gac Asp

3469

Lys Ala 5

Ala

tgt cct

cca

399

aac

cca gca

cct

acc

agt

aat

cat

ggc

cca

gat

gcc

3517

Cys Pro

Pro

Gly

Asn

Pro Ala

Pro

Thr

Ser

Asn

His

Gly

Pro

Asp

Ala

15

20

25

30

aca gaa

gct

gaa

gag

gat ttt

gtg

gac

cca

tgg

aca

gta

cag

aca

agc

3565

Thr Glu

Ala

Glu

Asp Phe

Val

Asp

Pro

Trp

Thr

Val

Gin

Thr

Ser

35

40

45

agt gca

aaa

ggc

ata

gac tac

gat

aag

ctc

att

gtt

cgg

ttt

gga

agt

3613

Ser Ala

Lys

Gly

Ile

Asp Tyr

Asp

Lys

Leu

Ile

Val

Arg

Phe

Gly

Ser

50

55

60

agt aaa

att

gac

aaa

gag eta

ata

aac

ega

ata

gag

aga

gcc

acc

ggc

3561

Ser Lys

Ile

Asp

Lys

Glu Leu

Ile

Asn

Arg

Ile

Glu

Arg

Ala

Thr

Gly

65

70

75

caa aga

cca

cac

ttc ctg

ege

aga

ggc

atc

ttc

tea

cac

aga

3709

Gin Arg

Pro

His

Phe Leu

Arg

Gly

Ile

Phe

Ser

His

Arg

80

85

90

PL 208 008 B1 gat atg aat cag gtt ctt gat gcc tat gaa aat aag aag cca ttt tat 3757

Asp Met Asn Gin Val Leu Asp Ala Tyr Glu Asn Lys Lys Pro Phe iyr

100 105 110 ctg tac acg ggc cgg ggc ccc tct tct gaa gca atg cat gta ggt cac 3805

Leu Tyr Thr Gly Arg Gly Pro Ser Ser Glu Ala Met His Val Gly His

115 120 125 ctc att cca ttt att ttc aca aag tgg ctc cag gat gta ttt aac gtg 3853

Leu Ile Pro Phe Ile Phe Thr Lys Trp Leu Gin Asp Val Phe Asn Val

130 135 140 ccc ttg gtc atc cag atg acg gat gac gag aag tat ctg tgg aag gac 3901

Pro Leu Val Ile Gin Met Thr Asp Asp Glu Lys Tyr Leu Trp Lys Asp

145 150 155 ctg acc ctg gac cag gcc tat ggc gat gct gtt gag aat gcc aag gac 3949

Leu Thr Leu Asp Gin Ala Tyr Gly Asp Ala Val Glu Asn Ala Lys Asp

160 165 170

atc Ile 175

atc Ile

gcc Ala

tgt Cys

ggc Gly

ttt Phe 180

gac Asp

atc Ile

aac Asn

aag Lys

act Thr 185

ttc Phe

ata Ile

ttc Phe

tct Ser

gac Asp 190

3997

ctg

gac

tac

atg

ggg

atg

agc

tca

ggt

ttc

tac

aaa

aat

gtg

aag

4045

Leu

Asp

Tyr

Met

Gly

Met

Ser

Gly

Phe

Tyr

Lys

Asn

Val

Lys

195

200

205

att

caa

aag

cat

gtt

acc

ttc

aac

caa

gtg

aaa

ggc

att

ttc

ggc

ttc

4093

Ile

Gin

Lys

His

Val

Thr

Phe

Asn

Gin

Val

Lys

Gly

Ile

Phe

Gly

Phe

210

215

220

act

gac

agc

gac

tgc

att

ggg

aag

atc

agt

ttt

cct

gcc

atc

cag

gct

4141

Thr

Asp

Ser

Asp

Cys

Ile

Gly

Lys

Ile

Ser

Phe

Pro

Ala

Ile

Gin

Ala

225

230

235

gct

ccc

tcc

ttc

agc

aac

tca

ttc

cca

cag

atc

ttc

ega

gac

agg

acg

4189

Ala

Pro

Ser

Phe

Ser

Asn

Ser

Phe

Pro

Gin

Ile

Phe

Arg

Asp

Arg

Thr

240

245

250

gat

atc

cag

tgc

ctt

atc

cca

tgt

gcc

att

gac

cag

gat

cct

tac

ttt

4237

Asp

Ile

Gin

Cys

Leu

Ile

Pro

Cys

Ala

Ile

Asp

Gin

Asp

Pro

Tyr

Phe

255

260

265

270

aga

atg

aca

agg

gac

gtc

gcc

ccc

agg

atc

ggc

tat

cct

aaa

cca

gcc

4285

Arg

Met

Thr

Arg

Asp

Val

Ala

Pro

Arg

Ile

Gly

Tyr

Pro

Lys

Pro

Ala

275

280

285

ctg

ttg

cac

tcc

acc

ttc

cca

gcc

ctg

cag

ggc

gcc

cag

acc

aaa

4333

Leu

His

Ser

Thr

Phe

Pro

Ala

Leu

Gin

Gly

Ala

Gin

Thr

Lys

290

295

300

atg

agt

gcc

agc

gac

cca

aac

tcc

atc

ttc

ctc

acc

gac

acg

gcc

4381

Met

Ser

Ala

Ser

Asp

Pro

Asn

Ser

Ile

Phe

Leu

Thr

Asp

Thr

Ala

305

310

315

aag

cag

atc

aaa

acc

aag

gtc

aat

aag

cat

gcg

ttt

tct

gga

ggg

aga

4429

Lys

Gin

Ile

Lys

Thr

Lys

Val

Asn

Lys

His

Ala

Phe

Ser

Gly

Arg

320

325

330

gac

acc

atc

gag

cac

agg

cag

ttt

ggg

ggc

aac

tgt

gat

gtg

gac

4477

Asp

Thr

Ile

Glu

His

Arg

Gin

Phe

Gly

Asn

Cys

Asp

Val

Asp

335

340

345

350

PL 208 008 B1 gtg tct ttc atg tac ctg acc ttc ttc ctc gag gac gac gac aag ctc 4525

Val Ser Phe Met Tyr Leu Thr Phe Phe Leu Glu Asp Asp Asp Lys Leu

355 360 365 gag cag atc agg aag gat tac acc agc gga gcc atg ctc acc ggt gag 4573

Glu Gin Ile Arg Lys Asp Tyr Thr Ser Gly Ala Met Leu Thr Gly Glu

370 375 380 ctc aag aag gca ctc ata gag gtt ctg cag ccc ttg atc gca gag cac 4621

Leu Lys Lys Ala Leu Ile Glu Val Leu Gin Pro Leu Ile Ala Glu His

385 390 395

cag gcc

cgg Arg

cgc Arg

aag gag gtc

acg gat

gag Glu

ata Ile

gtg Val 410

aaa Lys

gag Glu

ttc Phe

atg Met

4669

Gin

Ala 400

Lys

Glu

Val 405

Thr

Asp

act

ccc

cgg

aag

ctg

tcc

ttc

gac

ttt

cag

aag

ctt

gcg

gcc

gca

ctc

4717

Thr

Pro

Arg

Lys

Leu

Ser

Phe

Asp

Phe

Gin

Lys

Leu

Ala

Leu

415

420

425

430

gag cac cac cac cac cac cac tgagatccgg ctgctaacaa agcccgaaag 4768

Glu His His His His His His

435 gaagctgagt tggctgctgc caccgctgag caataactag cataacccct tggggcctct 4828 aaacgggtct tgaggggttt tttgctgaaa ggaggaacta tatccggat 4877 <210> 3 <211> 437 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> ludzki mini-TrpRS w pET20B <400> 3

Met

Ser

Tyr

Lys

Ala

Gly

Glu

Asp

Tyr

Lys

Ala

Asp

Cys

Pro

1

5

10

15

Pro

Gly

Asn

Pro

Ala

Pro

Thr

Ser

Asn

His

Gly

Pro

Asp

Ala

Thr

Glu

20

25

30

Ala

Glu

Asp

Phe

Val

Asp

Pro

Trp

Thr

Val

Gin

Thr

Ser

Ala

35

40

45

Lys

Gly

Ile

Asp

Tyr

Asp

Lys

Leu

Ile

Val

Arg

Phe

Gly

Ser

Lys

50

55

60

Ile

Asp

Lys

Glu

Leu

Ile

Asn

Arg

Ile

Glu

Arg

Ala

Thr

Gly

Gin

Arg

65

70

75

80

Pro

His

Phe

Leu

Arg

Gly

Ile

Phe

Ser

His

Arg

Asp

Met

85

90

95

Asn

Gin

Val

Leu

Asp

Ala

Tyr

Glu

Asn

Lys

Pro

Phe

Tyr

Leu

Tyr

100

105

110

Thr

Gly

Arg

Gly

Pro

Ser

Glu

Ala

Met

His

Val

Gly

His

Leu

Ile

115

120

125

Pro

Phe

Ile

Phe

Thr

Lys

Trp

Leu

Gin

Asp

Val

Phe

Asn

Val

Pro

Leu

130

135

140

Val

Ile

Gin

Met

Thr

Asp

Glu

Lys

Tyr

Leu

Trp

Lys

Asp

Leu

Thr

145

150

155

160

Leu

Asp

Gin

Ala

Tyr

Gly

Asp

Ala

Val

Glu

Asn

Ala

Lys

Asp

Ile

165

170

175

Ala

Cys

Gly

Phe

Asp

Ile

Asn

Lys

Thr

Phe

Ile

Phe

Ser

Asp

Leu

Asp

180

185

190

Tyr

Met

Gly

Met

Ser

Gly

Phe

Tyr

Lys

Asn

Val

Lys

Ile

Gin

195

200

205

Lys

His

Val

Thr

Phe

Asn

Gin

Val

Lys

Gly

Ile

Phe

Gly

Phe

Thr

Asp

PL 208 008 B1

210

215

220

Ser

Asp

Cys

Ile

Gly

Lys

Ile

Ser

Phe

Pro

Ala

Ile

Gin

Ala

Pro

225

230

235

240

Ser

Phe

Ser

Asn

Ser

Phe

Pro

Gin

Ile

Phe

Arg

Asp

Arg

Thr

Asp

Ile

245

250

255

Gin

Cys

Leu

Ile

Pro

Cys

Ala

Ile

Asp

Gin

Asp

Pro

Tyr

Phe

Arg

Met

260

265

270

Thr

Arg

Asp

Val

Ala

Pro

Arg

Ile

Gly

Tyr

Pro

Lys

Pro

Ala

Leu

275

280

285

His

Ser

Thr

Phe

Pro

Ala

Leu

Gin

Gly

Ala

Gin

Thr

Lys

Met

Ser

290

295

300

Ala

Ser

Asp

Pro

Asn

Ser

Ile

Phe

Leu

Thr

Asp

Thr

Ala

Lys

Gin

305

310

315

320

Ile

Lys

Thr

Lys

Val

Asn

Lys

His

Ala

Phe

Ser

Gly

Arg

Asp

Thr

325

330

335

Ile

Glu

His

Arg

Gin

Phe

Gly

Asn

Cys

Asp

Val

Asp

Val

Ser

340

345

350

Phe

Met

Tyr

Leu

Thr

Phe

Leu

Glu

Asp

Lys

Leu

Glu

Gin

355

360

365

Ile

Arg

Lys

Asp

Tyr

Thr

Ser

Gly

Ala

Met

Leu

Thr

Gly

Glu

Leu

Lys

370

375

380

Lys

Ala

Leu

Ile

Glu

Val

Leu

Gin

Pro

Leu

Ile

Ala

Glu

His

Gin

Ala

385

390

395

400

Arg

Lys

Glu

Val

Thr

Asp

Glu

Ile

Val

Lys

Glu

Phe

Met

Thr

Pro

405

410

415

Arg

Lys

Leu

Ser

Phe

Asp

Phe

Gin

Lys

Leu

Ala

Leu

Glu

His

420

425

430

His

435

<210> 4 <211> 4811 <212> DNA <213 > Sekwencja sztuczna <220>

<223> Produkt Τ 1 cięcia rekombinowanego ludzkiego TrpRS <221> CDS <222> (3428) .. . (4672) <400> 4 tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60 cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120 ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180 gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240 acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300 ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360 ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420 acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480 tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540 tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat 600 gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt 660 ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg 720 agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga 780 agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg 840 tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt 900 tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg 960 cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg 1020 aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga 1080 tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc 1140 tgcagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc 1200 ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc 1260

PL 208 008 B1 ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg 1320 cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac 1380 gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc 1440 actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt 1500 aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 1560 caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 1620 aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 1680 accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 1740 aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg 1800 ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 1860 agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 1920 accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 1980 gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct 2040 tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 2100 cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 2160 cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 2220 cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt 2280 ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 2340 taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 2400 gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatatgg 2460 tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat 2520 cgctacgtga ctgggtcatg gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct 2580 gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct 2640 gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagctg cggtaaagct 2700 catcagcgtg gtcgtgaagc gattcacaga tgtctgcctg ttcatccgcg tccagctcgt 2760 tgagtttctc cagaagcgtt aatgtctggc ttctgataaa gcgggccatg ttaagggcgg 2820 ttttttcctg tttggtcact gatgcctccg tgtaaggggg atttctgttc atgggggtaa 2880 tgataccgat gaaacgagag aggatgctca cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc 2940 ggttactgga acgttgtgag ggtaaacaac tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa 3000 aaatcactca gggtcaatgc cagcgcttcg ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta 3060 gccagcagca tcctgcgatg cagatccgga acataatggt gcagggcgct gacttccgcg 3120 tttccagact ttacgaaaca cggaaaccga agaccattca tgttgttgct caggtcgcag 3180 acgttttgca gcagcagtcg cttcacgttc gctcgcgtat cggtgattca ttctgctaac 3240 cagtaaggca accccgccag cctagccggg tcctcaacga caggagcacg atcatgcgca 3300 cccgtggcca ggacccaacg ctgcccgaga tctcgatccc gcgaaattaa tacgactcac 3360 tatagggaga ccacaacggt ttccctctag aaataatttt gtttaacttt aagaaggaga 3420

tatacat

atg Met 1

agt Ser

aat Asn

cat His

ggc Gly 5

cca gat

gee Ala

aca Thr

gaa Glu 10

get Ala

gaa Glu

gag Glu

gat Asp

3469

Pro

Asp

ttt gtg

gac

cca

tgg

aca

gta

cag

aca

age

agt

gca

aaa

ggc

ata

gac

3517

Phe Val

Asp

Pro

Trp

Thr

Val

Gln

Thr

Ser

Ala

Lys

Gly

Ile

Asp

15

20

25

30

tac gat

aag

etc

att

gtt

cgg

ttt

gga

agt

aaa

att

gac

aaa

gag

3565

Tyr Asp

Lys

Leu

Ile

Val

Arg

Phe

Gly

Ser

Lys

Ile

Asp

Lys

Glu

35

40

45

eta ata

aac

ega

ata

gag

aga

gee

acc

ggc

caa

aga

cca

cac

ttc

3613

Leu Ile

Asn

Arg

Ile

Glu

Arg

Ala

Thr

Gly

Gln

Arg

Pro

His

Phe

50

55

60

ctg ege

aga

ggc

atc

ttc

tea

cac

aga

gat

atg

aat

cag

gtt

ctt

3661

Leu Arg

Arg

Gly

Ile

Phe

Ser

His

Arg

Asp

Met

Asn

Gln

Val

Leu

65

70

75

gat gee

tat

gaa

aat

aag

cca

ttt

tat

ctg

tac

acg

ggc

cgg

ggc

3709

Asp Ala

Tyr

Glu

Asn

Lys

Pro

Phe

Tyr

Leu

Tyr

Thr

Gly

Arg

Gly

80

85

90

ccc tet

tet

gaa

gca

atg

cat

gta

ggt

cac

etc

att

cca

ttt

att

ttc

3757

Pro Ser

Ser

Glu

Ala

Met

His

Val

Gly

His

Leu

Ile

Pro

Phe

Ile

Phe

95

100

105

110

PL 208 008 B1

aca Thr

aag Lys

tgg Trp

ctc Leu

cag Gin 115

gat Asp

gta Val

ttt Phe

aac Asn

gtg Val 120

ccc Pro

ttg Leu

gtc Val

atc Ile

cag Gin 125

atg Met

3805

acg

gat

gac

gag

aag

tat

ctg

tgg

aag

gac

ctg

acc

ctg

gac

cag

gcc

3853

Thr

Asp

Glu 130

Lys

Tyr

Leu

Trp

Lys 135

Asp

Leu

Thr

Leu

Asp 140

Gin

Ala

tat

ggc

gat

gct

gtt

gag

aat

gcc

aag

gac

atc

gcc

tgt

ggc

ttt

3901

Tyr

Gly

Asp 145

Ala

Val

Glu

Asn

Ala 150

Lys

Asp

Ile

Ala 155

Cys

Gly

Phe

gac

atc

aac

aag

act

ttc

ata

ttc

tet

gac

ctg

gac

tac

atg

ggg

atg

3949

Asp

Ile 160

Asn

Lys

Thr

Phe

Ile 165

Phe

Ser

Asp

Leu

Asp 170

Tyr

Met

Gly

Met

agc

tca

ggt

ttc

tac

aaa

aat

gtg

aag

att

caa

aag

cat

gtt

acc

3997

Ser 175

Ser

Gly

Phe

Tyr

Lys 180

Asn

Val

Lys

Ile 185

Gin

Lys

His

Val

Thr 190

ttc

aac

caa

gtg

aaa

ggc

att

ttc

ggc

ttc

act

gac

agc

gac

tgc

att

4045

Phe

Asn

Gin

Val

Lys 195

Gly

Ile

Phe

Gly

Phe 200

Thr

Asp

Ser

Asp

Cys 205

Ile

999

aag

atc

agt

ttt

cct

gcc

atc

cag

gct

ccc

tcc

ttc

agc

aac

4093

Gly

Lys

Ile

Ser 210

Phe

Pro

Ala

Ile

Gin 215

Ala

Pro

Ser

Phe 220

Ser

Asn

tca

ttc

cca

cag

atc

ttc

ega

gac

agg

acg

gat

atc

cag

tgc

ctt

atc

4141

Ser

Phe

Pro 225

Gin

Ile

Phe

Arg

Asp 230

Arg

Thr

Asp

Ile

Gin 235

Cys

Leu

Ile

cca

tgt

gcc

att

gac

cag

gat

cct

tac

ttt

aga

atg

aca

agg

gac

gtc

4189

Pro

Cys 240

Ala

Ile

Asp

Gin

Asp 245

Pro

Tyr

Phe

Arg

Met 250

Thr

Arg

Asp

Val

gcc

ccc

agg

atc

ggc

tat

cct

aaa

cca

gcc

ctg

ttg

cac

tcc

acc

ttc

4237

Ala 255

Pro

Arg

Ile

Gly

Tyr 260

Pro

Lys

Pro

Ala

Leu 265

Leu

His

Ser

Thr

Phe 270

ttc

cca

gcc

ctg

cag

ggc

gcc

cag

acc

aaa

atg

agt

gcc

agc

gac

cca

4285

Phe

Pro

Ala

Leu

Gin 275

Gly

Ala

Gin

Thr

Lys 280

Met

Ser

Ala

Ser

Asp 285

Pro

aac

tcc

atc

ttc

ctc

acc

gac

acg

gcc

aag

cag

atc

aaa

acc

aag

4333

Asn

Ser

Ile 290

Phe

Leu

Thr

Asp

Thr 295

Ala

Lys

Gin

Ile

Lys 300

Thr

Lys

gtc

aat

aag

cat

gcg

ttt

tet

gga

ggg

aga

gac

acc

atc

gag

cac

4381

Val

Asn

Lys 305

His

Ala

Phe

Ser

Gly 310

Gly

Arg

Asp

Thr

Ile 315

Glu

His

agg

cag

ttt

ggg

ggc

aac

tgt

gat

gtg

gac

gtg

tet

ttc

atg

tac

ctg

4429

Arg

Gin 320

Phe

Gly

Asn

Cys 325

Asp

Val

Asp

Val

Ser 330

Phe

Met

Tyr

Leu

acc

ttc

ctc

gag

gac

aag

ctc

gag

cag

atc

agg

aag

gat

4477

Thr 335

Phe

Leu

Glu

Asp 340

Asp

Lys

Leu

Glu 345

Gin

Ile

Arg

Lys

Asp 350

tac

acc

agc

gga

gcc

atg

ctc

acc

ggt

gag

ctc

aag

gca

ctc

ata

4525

Tyr

Thr

Ser

Gly

Ala

Met

Leu

Thr

Gly

Glu

Leu

Lys

Ala

Leu

Ile

355 360 365

PL 208 008 B1

gag gtt

ctg Leu

cag Gin 370

ccc Pro

ttg atc gca gag cac

cag Gin

gcc Ala

cgg Arg

cgc Arg 380

aag Lys

gag Glu

4573

Glu

Val

Leu

Ile Ala

Glu His 375

gtc

acg

gat

gag

ata

gtg

aaa

gag

ttc

atg

act

ccc

cgg

aag

ctg

tcc

4621

Val

Thr

Asp

Glu

Ile

Val

Lys

Glu

Phe

Met

Thr

Pro

Arg

Lys

Leu

Ser

385

390

395

ttc

gac

ttt

cag

aag

ctt

gcg

gcc

gca

ctc

gag

cac

4669

Phe

Asp

Phe

Gin

Lys

Leu

Ala

Leu

Glu

His

400

405

410

cac tgagatccgg ctgctaacaa agcccgaaag gaagctgagt tggctgctgc 4722

His

415 caccgctgag caataactag cataacccct tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt 4782 tttgctgaaa ggaggaacta tatccggat 4811 <210> 5 <211> 415 <212> PRT <213 > Sekwencja sztuczna <22 O >

<223> Produkt T 1 cięcia rekombinowanego ludzkiego TrpRS <400> 5

Met

Ser

Asn

His

Gly

Pro

Asp

Ala

Thr

Glu

Ala

Glu

Asp

Phe

Val

1

5

10

15

Asp

Pro

Trp

Thr

Val

Gin

Thr

Ser

Ala

Lys

Gly

Ile

Asp

Tyr

Asp

20

25

30

Lys

Leu

Ile

Val

Arg

Phe

Gly

Ser

Lys

Ile

Asp

Lys

Glu

Leu

Ile

35

40

45

Asn

Arg

Ile

Glu

Arg

Ala

Thr

Gly

Gin

Arg

Pro

His

Phe

Leu

Arg

50

55

60

Arg

Gly

Ile

Phe

Ser

His

Arg

Asp

Met

Asn

Gin

Val

Leu

Asp

Ala

65

70

75

80

Tyr

Glu

Asn

Lys

Pro

Phe

Tyr

Leu

Tyr

Thr

Gly

Arg

Gly

Pro

Ser

B5

90

95

Ser

Glu

Ala

Met

His

Val

Gly

His

Leu

Ile

Pro

Phe

Ile

Phe

Thr

Lys

100

105

110

Trp

Leu

Gin

Asp

Val

Phe

Asn

val

Pro

Leu

Val

Ile

Gin

Met

Thr

Asp

115

120

125

Asp

Glu

Lys

Tyr

Leu

Trp

Lys

Asp

Leu

Thr

Leu

Asp

Gin

Ala

Tyr

Gly

130

135

14 0

Asp

Ala

Val

Glu

Asn

Ala

Lys

Asp

Ile

Ala

Cys

Gly

Phe

Asp

Ile

14 5

150

155

160

Asn

Lys

Thr

Phe

Ile

Phe

Ser

Asp

Leu

Asp

Tyr

Met

Gly

Met

Ser

165

170

175

Gly

Phe

Tyr

Lys

Asn

Val

Lys

Ile

Gin

Lys

His

Val

Thr

Phe

Asn

180

185

190

Gin

Val

Lys

Gly

Ile

Phe

Gly

Phe

Thr

Asp

Ser

Asp

Cys

Ile

Gly

Lys

195

200

205

Ile

Ser

Phe

Pro

Ala

Ile

Gin

Ala

Pro

Ser

Phe

Ser

Asn

Ser

Phe

210

215

220

Pro

Gin

Ile

Phe

Arg

Asp

Arg

Thr

Asp

Ile

Gin

Cys

Leu

Ile

Pro

Cys

225

230

235

240

Ala Ile Asp Gin Asp Pro Tyr Phe Arg Met Thr Arg Asp Val Ala Pro

245 250 255

Arg

Ile

Gly

Tyr 260

Pro Lys

Pro

Ala

Leu Leu His Ser Thr Phe

Phe

Pro

265

270

Ala

Leu

Gin

Gly

Ala

Gin

Thr

Lys

Met

Ser

Ala

Ser

Asp

Pro

Asn

Ser

275

280

285

PL 208 008 B1

Ser

Ile

Phe

Leu

Thr

Asp

Thr

Ala

Lys

Gin

Ile

Lys

Thr

Lys

Val

Asn

290

295

300

Lys

His

Ala

Phe

Ser

Gly

Arg

Asp

Thr

Ile

Glu

His

Arg

Gin

305

310

315

320

Phe

Gly

Asn

Cys

Asp

Val

Asp

Val

Ser

Phe

Met

Tyr

Leu

Thr

Phe

325

330

335

Phe

Leu

Glu

Asp

Lys

Leu

Glu

Gin

Ile

Arg

Lys

Asp

Tyr

Thr

340

345

350

Ser

Gly

Ala

Met

Leu

Thr

Gly

Glu

Leu

Lys

Ala

Leu

Ile

Glu

Val

355

360

365

Leu

Gin

Pro

Leu

Ile

Ala

Glu

His

Gin

Ala

Arg

Lys

Glu

Val

Thr

370

375

380

Asp

Glu

Ile

Val

Lys

Glu

Phe

Met

Thr

Pro

Arg

Lys

Leu

Ser

Phe

Asp

385

390

395

400

Phe

Gin

Lys

Leu

Ala

Leu

Glu

His

405

410

415

<210> 6 <211> 4742 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Produkt Τ2 cięcia rekombinowanego ludzkiego TrpRS <221> CDS <222> (3428) . . . (4603) <400> 6 tggcgaatgg cagcgtgacc ctttctcgcc gttccgattt acgtagtggg ctttaatagt ttttgattta acaaaaattt tcggggaaat tccgctcatg gagtattcaa ttttgctcac agtgggttac agaacgtttt tattgacgcc tgagtactca cagtgctgcc aggaccgaag tcgttgggaa tgcagcaatg ccggcaacaa ggcccttccg cggtatcatt gacggggagt actgattaag aaaacttcat caaaatccct aggatcttct accgctacca aactggcttc ccaccacttc agtggctgct accggataag gcgaacgacc gacgcgccct gctacacttg acgttcgccg agtgctttac ccatcgccct ggactcttgt taagggattt aacgcgaatt gtgcgcggaa agacaataac catttccgtg ccagaaacgc atcgaactgg ccaatgatga gggcaagagc ccagtcacag ataaccatga gagctaaccg ccggagctga gcaacaacgt ttaatagact gctggctggt gcagcactgg caggcaacta cattggtaac ttttaattta taacgtgagt tgagatcctt gcggtggttt agcagagcgc aagaactctg gccagtggcg gcgcagcggt tacaccgaac gtagcggcgc ccagcgccct gctttccccg ggcacctcga gatagacggt tccaaactgg tgccgatttc ttaacaaaat cccctatttg cctgataaat tcgcccttat tggtgaaagt atctcaacag gcacttttaa aactcggtcg aaaagcatct gtgataacac cttttttgca atgaagccat tgcgcaaact ggatggaggc ttattgctga ggccagatgg tggatgaacg tgtcagacca aaaggatcta tttcgttcca tttttctgcg gtttgccgga agataccaaa tagcaccgcc ataagtcgtg cgggctgaac tgagatacct attaagcgcg agcgcccgct tcaagctcta ccccaaaaaa ttttcgccct aacaacactc ggcctattgg attaacgttt tttatttttc gcttcaataa tccctttttt aaaagatgct cggtaagatc agttctgcta ccgcatacac tacggatggc tgcggccaac caacatgggg accaaacgac attaactggc ggataaagtt taaatctgga taagccctcc aaatagacag agtttactca ggtgaagatc ctgagcgtca cgtaatctgc tcaagagcta tactgtcctt tacatacctc tcttaccggg ggggggttcg acagcgtgag gcgggtgtgg cctttcgctt aatcgggggc cttgattagg ttgacgttgg aaccctatct ttaaaaaatg acaatttcag taaatacatt tattgaaaaa gcggcatttt gaagatcagt cttgagagtt tgtggcgcgg tattctcaga atgacagtaa ttacttctga gatcatgtaa gagcgtgaca gaactactta gcaggaccac gccggtgagc cgtatcgtag atcgctgaga tatatacttt ctttttgata gaccccgtag tgcttgcaaa ccaactcttt ctagtgtagc gctctgctaa ttggactcaa tgcacacagc ctatgagaaa tggttacgcg tcttcccttc tccctttagg gtgatggttc agtccacgtt cggtctattc agctgattta gtggcacttt caaatatgta ggaagagtat gccttcctgt tgggtgcacg ttcgccccga tattatcccg atgacttggt gagaattatg caacgatcgg ctcgccttga ccacgatgcc ctctagcttc ttctgcgctc gtgggtctcg ttatctacac taggtgcctc agattgattt atctcatgac aaaagatcaa caaaaaaacc ttccgaaggt cgtagttagg tcctgttacc gacgatagtt ccagcttgga gcgccacgct

120 ISO 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 84 0 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040

PL 208 008 B1 tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 2100 cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 2160 cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 2220 cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt 2280 ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 2340 taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 2400 gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatatgg 2460 tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat 2520 cgctacgtga ctgggtcatg gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct 2580 gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct 2640 gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagctg cggtaaagct 2700 catcagcgtg gtcgtgaagc gattcacaga tgtctgcctg ttcatccgcg tccagctcgt 2760 tgagtttctc cagaagcgtt aatgtctggc ttctgataaa gcgggccatg ttaagggcgg 2820 ttttttcctg tttggtcact gatgcctccg tgtaaggggg atttctgttc atgggggtaa 2880 tgataccgat gaaacgagag aggatgctca cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc 2940 ggttactgga acgttgtgag ggtaaacaac tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa 3000 aaatcactca gggtcaatgc cagcgcttcg ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta 3060 gccagcagca tcctgcgatg cagatccgga acataatggt gcagggcgct gacttccgcg 3120 tttccagact ttacgaaaca cggaaaccga agaccattca tgttgttgct caggtcgcag 3180 acgttttgca gcagcagtcg cttcacgttc gctcgcgtat cggtgattca ttctgctaac 3240 cagtaaggca accccgccag cctagccggg tcctcaacga caggagcacg atcatgcgca 3300 cccgtggcca ggacccaacg ctgcccgaga tctcgatccc gcgaaattaa tacgactcac 3360 tatagggaga ccacaacggt ttccctctag aaataatttt gtttaacttt aagaaggaga 3420

tatacat

atg Met 1

agt Ser

gca Ala

aaa Lys

ggc Gly 5

ata Ile

gac Asp

tac Tyr

gat Asp

aag Lys 10

ctc Leu

att Ile

gtt Val

cgg Arg

3469

ttt gga

agt

aaa

att

gac

aaa

gag

eta

ata

aac

ega

ata

gag

aga

3517

Phe Gly 15

Ser

Lys

Ile 20

Asp

Lys

Glu

Leu

Ile 25

Asn

Arg

Ile

Glu

Arg 30

gcc acc

ggc

caa

aga

cca

cac

ttc

ctg

ege

aga

ggc

atc

ttc

3565

Ala Thr

Gly

Gin

Arg 35

Pro

His

Phe

Leu 40

Arg

Gly

Ile

Phe 45

Phe

tca cac

aga

gat

atg

aat

cag

gtt

ctt

gat

gcc

tat

gaa

aat

aag

3613

Ser His

Arg

Asp 50

Met

Asn

Gin

Val

Leu 55

Asp

Ala

Tyr

Glu

Asn 60

Lys

cca ttt

tat

ctg

tac

acg

ggc

cgg

ggc

ccc

tct

gaa

gca

atg

cat

3661

Pro Phe

Tyr 65

Leu

Tyr

Thr

Gly

Arg 70

Gly

Pro

Ser

Glu 75

Ala

Met

His

gta ggt

cac

ctc

att

cca

ttt

att

ttc

aca

aag

tgg

ctc

cag

gat

gta

3709

Val Gly 80

His

Leu

Ile

Pro

Phe 85

Ile

Phe

Thr

Lys

Trp 90

Leu

Gin

Asp

Val

ttt aac

gtg

ccc

ttg

gtc

atc

cag

atg

acg

gat

gac

gag

aag

tat

ctg

3757

Phe Asn 95

Val

Pro

Leu

Val 100

Ile

Gin

Met

Thr

Asp 105

Asp

Glu

Lys

Tyr

Leu 110

tgg aag

gac

ctg

acc

ctg

gac

cag

gcc

tat

ggc

gat

gct

gtt

gag

aat

3805

Trp Lys

Asp

Leu

Thr 115

Leu

Asp

Gin

Ala

Tyr 120

Gly

Asp

Ala

Val

Glu 125

Asn

gcc aag

gac

atc

gcc

tgt

ggc

ttt

gac

atc

aac

aag

act

ttc

ata

3853

Ala Lys

Asp

Ile 130

Ile

Ala

Cys

Gly

Phe 135

Asp

Ile

Asn

Lys

Thr 140

Phe

Ile

ttc tct

gac

ctg

gac

tac

atg

ggg

atg

agc

tca

ggt

ttc

tac

aaa

aat

3901

Phe Ser

Asp 145

Leu

Asp

Tyr

Met

Gly 150

Met

Ser

Gly

Phe 155

Tyr

Lys

Asn

gtg gtg

aag

att

caa

aag

cat

gtt

acc

ttc

aac

caa

gtg

aaa

ggc

att

3949

PL 208 008 B1

Val Val 160

Lys

Ile

Gln

Lys His Val Thr Phe Asn Gln Val

Lys

Gly Ile

165

170

ttc

ggc

ttc

act

gac

agc

gac

tgc

att

ggg

aag

atc

agt

ttt

cct

gcc

Phe

Gly

Phe

Thr

Asp

Ser

Asp

Cys

Ile

Gly

Lys

Ile

Ser

Phe

Pro

Ala

175

130

185

190

atc

cag

gct

ccc

tcc

ttc

agc

aac

tca

ttc

cca

cag

atc

ttc

ega

Ile

Gln

Ala

Pro

Ser

Phe

Ser

Asn

Ser

Phe

Pro

Gln

Ile

Phe

Arg

195 200 205 gac agg acg gat atc cag tgc ctt atc cca tgt gcc att gac cag gat 4093

Asp Arg Thr Asp Ile Gln Cys Leu Ile Pro Cys Ala Ile Asp Gln Asp

210 215 220

cct Pro

tac Tyr

ttt Phe 225

aga Arg

atg Met

aca Thr

agg Arg

gac Asp 230

gtc val

gcc Ala

ccc Pro

agg Arg

atc Ile 235

ggc Gly

tat Tyr

cct Pro

4141

aaa

cca

gcc

ctg

ttg

cac

tcc

acc

ttc

cca

gcc

ctg

cag

ggc

gcc

4189

Lys

Pro

Ala

Leu

His

Ser

Thr

Phe

Pro

Ala

Leu

Gln

Gly

Ala

240

245

250

cag

acc

aaa

atg

agt

gcc

agc

gac

cca

aac

tcc

atc

ttc

ctc

acc

4237

Gln

Thr

Lys

Met

Ser

Ala

Ser

Asp

Pro

Asn

Ser

Ile

Phe

Leu

Thr

255

260

265

270

gac

acg

gcc

aag

cag

atc

aaa

acc

aag

gtc

aat

aag

cat

gcg

ttt

tet

4285

Asp

Thr

Ala

Lys

Gln

Ile

Lys

Thr

Lys

Val

Asn

Lys

His

Ala

Phe

Ser

275

280

285

gga

ggg

aga

gac

acc

atc

gag

cac

agg

cag

ttt

ggg

ggc

aac

tgt

4333

Gly

Arg

Asp

Thr

Ile

Glu

His

Arg

Gln

Phe

Gly

Asn

Cys

290

295

300

gat

gtg

gac

gtg

tet

ttc

atg

tac

ctg

acc

ttc

ctc

gag

gac

4381

Asp

Val

Asp

Val

Ser

Phe

Met

Tyr

Leu

Thr

Phe

Leu

Glu

Asp

305

310

315

gac

aag

ctc

gag

cag

atc

agg

aag

gat

tac

acc

agc

gga

gcc

atg

ctc

4429

Asp

Lys

Leu

Glu

Gln

Ile

Arg

Lys

Asp

Tyr

Thr

Ser

Gly

Ala

Met

Leu

320

325

330

acc

ggt

gag

ctc

aag

gca

ctc

ata

gag

gtt

ctg

cag

ccc

ttg

atc

4477

Thr

Gly

Glu

Leu

Lys

Ala

Leu

Ile

Glu

Val

Leu

Gln

Pro

Leu

Ile

335

340

345

350

gca

gag

cac

cag

gcc

cgg

ege

aag

gag

gtc

acg

gat

gag

ata

gtg

aaa

4525

Ala

Glu

His

Gln

Ala

Arg

Lys

Glu

Val

Thr

Asp

Glu

Ile

Val

Lys

355

360

365

gag

ttc

atg

act

ccc

cgg

aag

ctg

tcc

ttc

gac

ttt

cag

aag

ctt

gcg

4573

Glu

Phe

Met

Thr

Pro

Arg

Lys

Leu

Ser

Phe

Asp

Phe

Gln

Lys

Leu

Ala

370

375

380

gcc

gca

ctc

gag

cac

tgagatccgg i

ctgctaacaa

4623

Ala

Leu

Glu

His

385 390 agcecgaaag gaagctgagt tggctgctgc caccgctgag caataactag cataacccct 4683 tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt tttgctgaaa ggaggaacta tatccggat 4742 <210> 7 <211> 392

PL 208 008 B1 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<22 3 > Produkt T2	cięcia	rekombinowanego ludzkiego TrpRS
<400> 7
Met Ser Ala Lys	Gly Ile	Asp Tyr Asp Lys Leu Ile Val Arg Phe Gly
1	5	10 15
Ser Ser Lys Ile	Asp Lys	Glu Leu Ile Asn Arg Ile Glu Arg Ala Thr
20		25 30
Gly Gin Arg Pro	His His	Phe Leu Arg Arg Gly Ile Phe Phe Ser His
35		40 45
Arg Asp Met Asn	Gin Val	Leu Asp Ala Tyr Glu Asn Lys Lys Pro Phe
50		55 60
Tyr Leu Tyr Thr	Gly Arg	Gly Pro Ser Ser Glu Ala Met His Val Gly
65	70	75 80
His Leu Ile Pro	Phe Ile	Phe Thr Lys Trp Leu Gin Asp Val Phe Asn
	85	90 95
Val Pro Leu Val	Ile Gin	Met Thr Asp Asp Glu Lys Tyr Leu Trp Lys
100		105 110
Asp Leu Thr Leu	Asp Gin	Ala Tyr Gly Asp Ala Val Glu Asn Ala Lys
115		120 125
Asp Ile Ile Ala	Cys Gly	Phe Asp Ile Asn Lys Thr Phe Ile Phe Ser
130		135 140
Asp Leu Asp Tyr	Met Gly	Met Ser Ser Gly Phe Tyr Lys Asn Val Val
145	150	155 160
Lys Ile Gin Lys	His Val	Thr Phe Asn Gin Val Lys Gly Ile Phe Gly
	165	170 175
Phe Thr Asp Ser	Asp Cys	Ile Gly Lys Ile Ser Phe Pro Ala Ile Gin
180		185 190
Ala Ala Pro Ser	Phe Ser	Asn Ser Phe Pro Gin Ile Phe Arg Asp Arg
195		200 205
Thr Asp Ile Gin	Cys Leu	Ile Pro Cys Ala Ile Asp Gin Asp Pro Tyr
210		215 220
Phe Arg Met Thr	Arg Asp	Val Ala Pro Arg Ile Gly Tyr Pro Lys Pro
225	230	235 240
Ala Leu Leu His	Ser Thr	Phe Phe Pro Ala Leu Gin Gly Ala Gin Thr
	245	250 255
Lys Met Ser Ala	Ser Asp	Pro Asn Ser Ser Ile Phe Leu Thr Asp Thr
260		265 270
Ala Lys Gin Ile	Lys Thr	Lys Val Asn Lys His Ala Phe Ser Gly Gly
275		280 285
Arg Asp Thr Ile	Glu Glu	His Arg Gin Phe Gly Gly Asn Cys Asp Val
290		295 300
Asp Val Ser Phe	Met Tyr	Leu Thr Phe Phe Leu Glu Asp Asp Asp Lys
305	310	315 320
Leu Glu Gin Ile	Arg Lys	Asp Tyr Thr Ser Gly Ala Met Leu Thr Gly
	325	330 335
Glu Leu Lys Lys	Ala Leu	Ile Glu Val Leu Gin Pro Leu Ile Ala Glu
340		345 350
His Gin Ala Arg	Arg Lys	Glu Val Thr Asp Glu Ile Val Lys Glu Phe
355		360 365
Met Thr Pro Arg	Lys Leu	Ser Phe Asp Phe Gin Lys Leu Ala Ala Ala
370		375 380
Leu Glu His His	His His	His His

385 390 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213 > Homo sapiens

PL 208 008 B1

<210> 12 <211> 378 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12

Ser

Ala

Lys

Gly

Ile

Asp

Tyr

Asp

Lys

Leu

Ile

Val

Arg

Phe

Gly

Ser

1

5

10

15

Ser

Lys

Ile

Asp

Lys

Glu

Leu

Ile

Asn

Arg

Ile

Glu

Arg

Ala

Thr

Gly

20

25

30

Gln

Arg

Pro

His

Phe

Leu

Arg

Gly

Ile

Phe

Ser

His

Arg

35

40

45

Asp

Met

Asn

Gln

Val

Leu

Asp

Ala

Tyr

Glu

Asn

Lys

Pro

Phe

Tyr

50

55

60

Leu

Tyr

Thr

Gly

Arg

Gly

Pro

Ser

Glu

Ala

Met

His

Val

Gly

His

65

70

75

80

Leu

Ile

Pro

Phe

Ile

Phe

Thr

Lys

Trp

Leu

Gln

Asp

Val

Phe

Asn

Val

85

90

95

Pro

Leu

Val

Ile

Gln

Met

Thr

Asp

Glu

Lys

Tyr

Leu

Trp

Lys

Asp

100

105

110

Leu

Thr

Leu

Asp

Gln

Ala

Tyr

Gly

Asp

Ala

Val

Glu

Asn

Ala

Lys

Asp

115

120

125

Ile

Ala

Cys

Gly

Phe

Asp

Ile

Asn

Lys

Thr

Phe

Ile

Phe

Ser

Asp

130

135

140

Leu

Asp

Tyr

Met

Gly

Met

Ser

Gly

Phe

Tyr

Lys

Asn

Val

Lys

145

150

155

160

Ile

Gln

Lys

His

Val

Thr

Phe

Asn

Gln

Val

Lys

Gly

Ile

Phe

Gly

Phe

165

170

175

Thr

Asp

Ser

Asp

Cys

Ile

Gly

Lys

Ile

Ser

Phe

Pro

Ala

Ile

Gln

Ala

PL 208 008 B1

180 185 190

Ala Pro Ser

Phe Ser

Asn Ser

Phe Pro Gin 200

Ile

Phe

Arg 205

Asp

Arg

Thr

195

Asp

Ile

Gin

Cys

Leu

Ile

Pro

Cys

Ala

Ile

Asp

Gin

Asp

Pro

Tyr

Phe

210

215

220

Arg

Met

Thr

Arg

Asp

Val

Ala

Pro

Arg

Ile

Gly

Tyr

Pro

Lys

Pro

Ala

225

230

235

240

Leu

His

Ser

Thr

Phe

Pro

Ala

Leu

Gin

Gly

Ala

Gin

Thr

Lys

245

250

255

Met

Ser

Ala

Ser

Asp

Pro

Asn

Ser

Ile

Phe

Leu

Thr

Asp

Thr

Ala

260

265

270

Lys

Gin

Ile

Lys

Thr

Lys

Val

Asn

Lys

His

Ala

Phe

Ser

Gly

Arg

275

280

265

Asp

Thr

Ile

Glu

His

Arg

Gin

Phe

Gly

Asn

Cys

Asp

Val

Asp

290

295

300

Val

Ser

Phe

Met

Tyr

Leu

Thr

Phe

Leu

Glu

Asp

Lys

Leu

305

310

315

320

Glu

Gin

Ile

Arg

Lys

Asp

Tyr

Thr

Ser

Gly

Ala

Met

Leu

Thr

Gly

Glu

325

330

335

Leu

Lys

Ala

Leu

Ile

Glu

Val

Leu

Gin

Pro

Leu

Ile

Ala

Glu

His

340

345

350

Gin

Ala

Arg

Lys

Glu

Val

Thr

Asp

Glu

Ile

Val

Lys

Glu

Phe

Met

355

360

365

Thr

Pro

Arg

Lys

Leu

Ser

Phe

Asp

Phe

Gin

370

375

<210» 13 <211» 401 <212» PRT <213> Homo s

lapiens

<400» 13

Ser

Asn

His

Gly

Pro

Asp

Ala

Thr

Glu

Ala

Glu

Asp

Phe

Val

Asp

1

5

10

15

Pro

Trp

Thr

Val

Gin

Thr

Ser

Ala

Lys

Gly

Ile

Asp

Tyr

Asp

Lys

20

25

30

Leu

Ile

Val

Arg

Phe

Gly

Ser

Lys

Ile

Asp

Lys

Glu

Leu

Ile

Asn

35

40

45

Arg

Ile

Glu

Arg

Ala

Thr

Gly

Gin

Arg

Pro

His

Phe

Leu

Arg

50

55

60

Gly

Ile

Phe

Ser

His

Arg

Asp

Met

Asn

Gin

Val

Leu

Asp

Ala

Tyr

65

70

75

80

Glu

Asn

Lys

Pro

Phe

Tyr

Leu

Tyr

Thr

Gly

Arg

Gly

Pro

Ser

85

90

95

Glu

Ala

Met

His

Val

Gly

His

Leu

Ile

Pro

Phe

Ile

Phe

Thr

Lys

Trp

100

105

110

Leu

Gin

Asp

Val

Phe

Asn

Val

Pro

Leu

Val

Ile

Gin

Met

Thr

Asp

115

120

125

Glu

Lys

Tyr

Leu

Trp

Lys

Asp

Leu

Thr

Leu

Asp

Gin

Ala

Tyr

Gly

Asp

130

135

140

Ala

Val

Glu

Asn

Ala

Lys

Asp

Ile

Ala

Cys

Gly

Phe

Asp

Ile

Asn

145

150

155

160

Lys

Thr

Phe

Ile

Phe

Ser

Asp

Leu

Asp

Tyr

Met

Gly

Met

Ser

Gly

165

170

175

Phe

Tyr

Lys

Asn

Val

Lys

Ile

Gin

Lys

His

Val

Thr

Phe

Asn

Gin

180

185

190

val

Lys

Gly

Ile

Phe

Gly

Phe

Thr

Asp

Ser

Asp

Cys

Ile

Gly

Lys

Ile

195

200

205

Ser

Phe

Pro

Ala

Ile

Gin

Ala

Pro

Ser

Phe

Ser

Asn

Ser

Phe

Pro

210

215

220

Gin

Ile

Phe

Arg

Asp

Arg

Thr

Asp

Ile

Gin

Cys

Leu

Ile

Pro

Cys

Ala

225

230

235

240

Ile

Asp

Gin

Asp

Pro

Tyr

Phe

Arg

Met

Thr

Arg

Asp

Val

Ala

Pro

Arg

PL 208 008 B1

245

250

255

Ile

Gly

Tyr

Pro

Lys

Pro

Ala

Leu

His

Ser

Thr

Phe

Pro

Ala

260

265

270

Leu

Gin

Gly

Ala

Gin

Thr

Lys

Met

Ser

Ala

Ser

Asp

Pro

Asn

Ser

275

280

285

Ile

Phe

Leu

Thr

Asp

Thr

Ala

Lys

Gin

Ile

Lys

Thr

Lys

Val

Asn

Lys

290

295

300

His

Ala

Phe

Ser

Gly

Arg

Asp

Thr

Ile

Glu

His

Arg

Gin

Phe

305

310

315

320

Gly

Asn

Cys

Asp

Val

Asp

Val

Ser

Phe

Met

Tyr

Leu

Thr

Phe

325

330

335

Leu

Glu

Asp

Lys

Leu

Glu

Gin

Ile

Arg

Lys

Asp

Tyr

Thr

Ser

340

345

350

Gly

Ala

Met

Leu

Thr

Gly

Glu

Leu

Lys

Ala

Leu

Ile

Glu

Val

Leu

355

360

365

Gin

Pro

Leu

Ile

Ala

Glu

His

Gin

Ala

Arg

Lys

Glu

Val

Thr

Asp

370

375

380

Glu

Ile

Val

Lys

Glu

Phe

Met

Thr

Pro

Arg

Lys

Leu

Ser

Phe

Asp

Phe

385

390

395

400

Gin

Zastrzeżenia patentowe

Claims

1. Izolowany, rozpuszczalny w wodzie polipeptyd składający się z sekwencji reszt aminokwasowych

SAKGIDYDKL

NQVLDAYENK

QMTDDEKYLW

SSGFYKNWK

PQIFRDRTDI

QGAQTKMSAS

CDVDVSFMYL

EHQARRKEVT

IVRFGSSKID

KPFYLYTGRG

KDLTLDQAYG

IQKHVTFNQV

QCLIPCAIDQ

DPNSSIFLTD

TFFLEDDDKL

DEIVKEFMTP

KELINRIERA PSSEAMHVGH DAVENAKDII KGIFGFTDSD DPYFRMTRDV TAKQIKTKVN EQIRKDYTSG RKLSFDFQ (

TGQRPHHFLR LIPFIFTKWL ACGFDINKTF CIGKISFPAI APRIGYPKPA KHAFSGGRDT AMLTGELKKA < NR ID:12)

RGIFFSHRDM

QDVFNVPLVI

IFSDLDYMGM

QAAPSFSNSF

LLHSTFFPAL

IEEHRQFGGN

LIEVLQPLIA lub jego fragment hamujący angiogenezę, przy czym izolowany polipeptyd ma wielkość nieprzekraczającą 45000 jednostek masy atomowej.

2. Izolowany polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że jest fragmentem hamującym angiogenezę, zdolnym do hamowania neowaskularyzacji ocznej.

3. Izolowany polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że jest fragmentem hamującym angiogenezę, zdolnym do hamowania neowaskularyzacji ocznej, który obejmuje przynajmniej jedną spośród sygnaturowych sekwencji reszt aminokwasowych HVGH (SEK NR ID:10) oraz KMSAS (SEK NR ID:11).

4. Izolowany polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że jest fragmentem hamującym angiogenezę, zdolnym do hamowania neowaskularyzacji ocznej, który obejmuje sygnaturową sekwencję reszt aminokwasowych HVGH (SEK NR ID:10).

5. Izolowany polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że jest fragmentem hamującym angiogenezę, zdolnym do hamowania neowaskularyzacji ocznej, o wielkości mniejszej niż 43000 jednostek masy atomowej.

6. Izolowany polipeptyd o sekwencji reszt aminokwasowych SEK NR ID:7.

7. Izolowany polinukleotyd o sekwencji nukleotydowej polinukleotydu wybranego z grupy składającej się z polinukleotydu SEK NR ID:6, polinukleotydu kodującego polipeptyd o sekwencji SEK NR ID:7, oraz polinukleotydu kodującego polipeptyd o sekwencji SEK NR ID:12.

PL 208 008 B1

8. Rekombinowany wektor obejmujący izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego określoną w zastrz. 7.

9. Rekombinowana komórka gospodarza, znamienna tym, że obejmuje wektor określony w zastrz. 8.

10. Rekombinowana komórka gospodarza wyrażająca polipeptyd określony w zastrz. 1.

11. Zastosowanie rozpuszczalnego w wodzie polipeptydu składającego się z sekwencji reszt aminokwasowych

SAKGIDYDKL

NQVLDAYENK

QMTDDEKYLW

SSGFYKNWK

PQIFRDRTDI

QGAQTKMSAS

CDVDVSFMYL

EHQARRKEVT

IVRFGSSKID

KPFYLYTGRG

KDLTLDQAYG

IQKHVTFNQV

QCLIPCAIDQ

DPNSSIFLTD

TFFLEDDDKL

DEIVKEFMTP

TGQRPHHFLR LIPFIFTKWL ACGFDINKTF CIGKISFPAI APRIGYPKPA KHAFSGGRDT AMLTGELKKA K NR ID: 12)

RGIFFSHRDM

QDVFNVPLVI

IFSDLDYMGM

QAAPSFSNSF

LLHSTFFPAL

IEEHRQFGGN

LIEVLQPLIA lub jego fragmentu hamującego neowaskularyzację oczną do wytwarzania leku do hamowania neowaskularyzacji ocznej u pacjenta, przy czym lek jest przeznaczony do podawania pacjentowi w ilości hamującej neowaskularyzację oczną.

12. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do podawania codziennie.

13. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do podawania co tydzień.

14. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do podawania co miesiąc.

15. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do podawania raz na kwartał.

16. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do podawania co pół roku.

17. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do podawania pacjentowi w dawce dziennej dostarczającej od 20 do 100 mikrogramów polipeptydu.

18. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do podawania pacjentowi w dawce kwartalnej dostarczającej od 2 do 9 miligramów polipeptydu.

19. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do podawania drogą śródszklistkową.

20. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do podawania drogą śródoczną.

21. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do podawania przy zastosowaniu urządzenia do przedłużonego dostarczania.

22. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do podawania przy zastosowaniu terapii genowej.

23. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do podawania przez dostarczanie oczne w oparciu o komórki.

PL 208 008 B1

24. Nadająca się do wstrzykiwania kompozycja angiostatyczna, znamienna tym, że obejmuje polipeptyd składający się z sekwencji reszt aminokwasowych

SAKGIDYDKL IVRFGSSKID KELINRIERA TGQRPHHFLR RGIFFSHRDM

NQVLDAYENK KPFYLYTGRG PSSEAMHVGH LIPFIFTKWL QDVFNVPLVI

QMTDDEKYLW KDLTLDQAYG DAVENAKDII ACGFDINKTF IFSDLDYMGM

SSGFYKNWK IQKHVTFNQV KGIFGFTDSD CIGKISFPAI QAAPSFSNSF

PQIFRDRTDI QCLIPCAIDQ DPYFRMTRDV APRIGYPKPA LLHSTFFPAL

QGAQTKMSAS DPNSSIFLTD TAKQIKTKVN KHAFSGGRDT IEEHRQFGGN

CDVDVSFMYL TFFLEDDDKL EQIRKDYTSG AMLTGELKKA LIEVLQPLIA

EHQARRKEVT DEIVKEFMTP RKLSFDFQ (SEK NR ID: 12) lub jego fragment hamujący angiogenezę, oraz dopuszczalną farmakologicznie zaróbkę wodną przy czym kompozycja obejmuje polipeptyd w stężeniu wynoszącym przynajmniej 0,1 miligrama na mililitr zaróbki wodnej.

25. Kompozycja angiostatyczna według zastrz. 24, znamienna tym, że polipeptyd ma sekwencję reszt aminokwasowych SEK NR ID:12, i obecny jest w stężeniu o zakresie od 0,1 do 0,5 miligrama na mililitr zaróbki wodnej.

26. Zestaw do hamowania neowaskularyzacji ocznej, znamienny tym, że obejmuje ilość polipeptydu określonego w zastrz. 1 wystarczającą do podawania przynajmniej jednej dawki, zapakowaną do odpowiednio uszczelnionego pojemnika; przynajmniej jedną samouszczelniającą się igłę do strzykawki o rozmiarze mniejszym niż 33, nadającą się do wykonywania iniekcji śródszklistkowej; oraz przynajmniej jedną dokładnie wykalibrowaną strzykawkę.

27. Zestaw według zastrz. 26, znamienny tym, że obejmuje wydrukowany materiał informacyjny, opisujący kompozycję, sposoby jej podawania.