PL208126B1 - Sposób wyznaczania objętości próbki biologicznej - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wyznaczania objętości próbki biologicznej.

Dziedziną wynalazku jest elektrochemiczne wyznaczenie analitu w płynach biologicznych, zwłaszcza elektrochemiczne wyznaczenie odpowiedniej objętości próbki płynu biologicznego, która ma być badana pod kątem stężenia analitu.

Wyznaczenie stężenia analitu w płynach biologicznych, np. krwi lub produktach krwiopochodnych, takich jak plazma, ma ciągle rosnące znaczenie dla współczesnego społeczeństwa. Oznaczenia takie wykorzystywane są w wielu zastosowaniach i układach, obejmujących kliniczne badania laboratoryjne, badania domowe, itd., w których wyniki badania odgrywają dużą rolę w diagnozowaniu i postępowaniu w wielu stanach chorobowych. Typowe wchodzące w grę anality obejmują glukozę do leczenia cukrzycy, cholesterol do monitorowania stanu układu sercowo-naczyniowego i tym podobne. W odpowiedzi na to rosnące znaczenie wyznaczania stężenia analitu opracowano wiele procedur i urzą dzeń do wykrywania analitu zarówno do u ż ytku klinicznego jak i domowego.

Jedynym z rodzajów stosowanych sposobów do wykrywania analitu jest sposób na bazie elektrochemicznej. W sposobach takich ciekłą próbkę wodną umieszcza się w strefie reakcji w ogniwie elektrochemicznym wykonanym co najmniej z dwóch elektrod, to znaczy elektrody pomocniczej//odniesienia i elektrody pracującej, w którym elektrody mają impedancję czyniącą je odpowiednimi do pomiarów amperometrycznych. Składnikowi, który ma być analizowany, to znaczy analitowi pozwala się reagować bezpośrednio z elektrodą lub bezpośrednio albo pośrednio z regentem redoks do utworzenia utlenialnej (lub redukowalnej) substancji w ilości odpowiadającej stężeniu analitu. Ilość obecnej substancji utlenialnej (lub redukowalnej) jest następnie oznaczana elektrochemicznie i odnoszona do ilości analitu obecnej w próbce początkowej.

Zazwyczaj ogniwo elektrochemiczne jest w postaci paska testowego jednorazowego użytku, na którym osadza się próbkę biologiczną i który umieszcza się w przyrządzie pomiarowym, za pomocą którego wykonuje się elektrochemiczny pomiar stężenia analitu. Przykładowe układy do oznaczania, w których wykorzystano tego rodzaju paski do badań, często nazywane biosensorami, i mierniki można znaleźć w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 942 102, 6 174 420 B1 i 6 179 979 B1. Wyznaczenie st ężenia analitu w próbce biologicznej za pomocą tych ukł adów obejmuje najpierw uzyskanie próbki biologicznej i doprowadzenie do zetknięcia tej próbki z obszarem reakcyjnym paska testowego tak, że próbka biologiczna, a bardziej szczegółowo analit o który chodzi, lub jego pochodna, mogą reagować z substancjami chemicznymi, na przykład reagentem lub reagentami testującymi związanymi z obszarem reakcyjnym. W celu uzyskania dokładnego pomiaru określonego analitu lub analitów, o które chodzi, na obszar reakcyjny musi być nałożona minimalna objętość próbki. Nie jest rzadkością, że nakładana jest nieodpowiednia wielkością objętość próbki, często wskutek błędu użytkownika lub niedoświadczenia pacjenta albo błędnej oceny. Niedokładne pomiary mogą powodować błędną diagnozę lub niewłaściwe leczenie, takie jak podawanie nieodpowiedniej dawki leku, niestosowanie się pacjenta do zaleceń itp. Może to powodować poważne konsekwencje, nawet zagrażające życiu, w przypadku osób, których życie zależy od częstego monitorowania analitu w ciele, na przykład osób chorujących na cukrzycę.

Jednym ze sposobów zapewnienia odpowiedniej objętości próbki biologicznej jest przesycenie lub użycie większej ilości badanego płynu niż niezbędna do wypełnienia obszaru reakcyjnego paska testowego. Wadą stosowania niepotrzebnie dużej objętości badanego płynu, zwłaszcza próbki krwi, jest konieczność pobierania większej objętościowo próbki krwi od pacjenta. Wymaga to stosowania objętości próbki, która jest raczej duża, narzucając przez to potrzebę stosowania igły o większej średnicy i/lub głębszego wnikania w skórę. Czynniki te mogą zwiększać dyskomfort i ból odczuwany przez pacjenta i mogą stwarzać trudności przy uzyskaniu w przypadku osób, których krew z naczyń włosowatych nie ujawnia się z łatwością. Jako, że proces pobierania próbek może być powtarzany często w ciągu jednego dnia, przykładowo przez wielu diabetyków zwiększenie bólu staje się gorzej tolerowane lub w ogóle nie tolerowane.

Opracowano kilka biosensorów do wykrywania analitu w celu dostarczenia wizualnego potwierdzenia odpowiedniości objętości próbki, jednakże nie wyklucza to potencjalnego błędu pacjenta przy ocenie, czy próbka ma odpowiednią objętość, np. diabetycy mogą mieć gorszy wzrok. Niektóre inne biosensory do wyznaczania analitu zapewniają niezależne od użytkownika elementy do określania odpowiedniości objętości próbki. Przykłady takich biosensorów ujawnione są w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr nr 5 628 8 90 i 5 650 062 oraz publikacji zgłoszenia patentowego

PL 208 126 B1

PCT nr WO 99/32881 (zgłoszenie patentowe PCT nr PCT/US98/27203). W szczególności publikacja WO 99/32881 opisuje układ do elektrochemicznego monitorowania glukozy, który próbuje określić czy odpowiednia jest objętość próbki wkładanej do biosensora przez przykładanie do biosensora sygnału prądu zmiennego dla napięcia w stanie 0 (bez napięcia niezrównoważenia prądu stałego) o znanej częstotliwości i mierzenie zarówno składowej rzeczywistej jak i składowej urojonej wynikowej impedancji. Te wartości impedancji są następnie porównywane z tablicą funkcji w pamięci programu mikroprocesora. Dokładność tego sposobu może być ponadto kwestionowana, biorąc pod uwagę, że układ ten jest zależny od poziomów hematokrytu we krwi i zmian temperatury otoczenia.

Inną wadą techniki ujawnionej w publikacji WO 99/32881 jest to, że testu pomiarowego analitu nie można kontynuować, jeśli okaże się, że objętość próbki, jest nieodpowiednia, to znaczy wystąpi sytuacja „idź-stój-idź”. Powoduje to potrzebę pobierania kolejnej próbki od pacjenta, co, jak wspomniano uprzednio, jest niedogodne i może być bardzo bolesne dla pacjenta, powodując w rezultacie prawdopodobne niestosowanie się jego lub jej do reżimu leczenia. Ponadto badanie musi być powtórzone, dając w wyniku marnotrawstwo pasków testowych i zwiększając koszt procedury.

Występuje ciągła potrzeba opracowania nowych technik dokładnego, precyzyjnego pomiaru odpowiedniej objętości próbki stosowanej do elektrochemicznego wyznaczania stężenia analitu. Szczególnie interesujące byłoby opracowanie sposobów mogących bardzo dokładnie i szybko określić odpowiednią objętość próbki. Byłoby ponadto korzystne opracowanie takiej techniki wyznaczania odpowiedniej objętości próbki, w której określenie, że objętość próbki jest nieodpowiednia nie wymaga przerwania testu pomiarowego stężenia analitu. W sytuacji idealnej technika ta kompensowałaby mniejszą od optymalnej objętość próbki i zapewniała dokładny pomiar stężenia analitu bez konieczności dostarczania nowej próbki lub przeprowadzania nowego badania.

Niniejszy wynalazek zapewnia sposób pomiaru objętości próbki biologicznej i wyznaczenia, czy taka objętość jest odpowiednia do uzyskania dokładnego pomiaru co najmniej jednej własności próbki biologicznej, takiej jak stężenie zawartego w niej analitu. Sposób taki oraz układ do jego realizacji pełnią dodatkową funkcję kompensowania objętości próbki wyznaczonej jako mniejsza od odpowiedniej w celu kontynuowania procedury pomiarowej.

Sposób wyznaczania objętości próbki biologicznej po jej utrzymywaniu w ogniwie biosensora elektrochemicznego, mającym co najmniej parę usytuowanych w odstępie od siebie elektrod, odznacza się według wynalazku tym, że przykłada się do ogniwa biosensora z utrzymywaną w nim próbkę zmienne napięcie mające wybraną amplitudę i wybraną częstotliwość, mierzy się prąd wytworzony przez przyłożenie zmiennego napięcia, określa się pojemność biosensora na podstawie zmierzonego prądu, wyznacza się pole powierzchni biosensora stykające się z próbką w oparciu o wyznaczoną pojemność i wyznacza się objętość próbki w biosensorze na podstawie wyznaczonego pola powierzchni.

Korzystnie określa się, czy objętość próbki jest odpowiednia do zmierzenia jednej lub więcej wybranych własności próbki.

Korzystnie ponadto mierzy się stężenie jednego lub więcej wybranych analitów obecnych w próbce, po okreś leniu, czy obję tość próbki jest odpowiednia.

Korzystnie po określeniu, że objętość próbki jest nieodpowiednia, mierzy się stężenie jednego lub więcej wybranych analitów obecnych w próbce, w którym to pomiarze wyznacza się współczynnik kompensacji niezbędny do wyrównania nieodpowiedniej objętości dla dokładnego pomiaru co najmniej jednego stężenia analitu i kompensuje się tę nieodpowiednią objętość próbki.

Korzystnie określenie niezbędnego współczynnika kompensacji obejmuje wyznaczenie stosunku pojemności biosensora przy całkowitym wypełnieniu próbką do pojemności biosensora przy nieodpowiedniej objętości próbki.

Korzystnie ponadto określa się oporność biosensora na podstawie zmierzonego prądu.

Korzystnie wyznacza się pole powierzchni biosensora stykające się z próbką w oparciu o wyznaczoną pojemność i wyznaczoną oporność.

Korzystnie ponadto przykłada się napięcie prądu stałego do biosensora.

Korzystnie napięcie prądu stałego i napięcie prądu zmiennego przykłada się jednocześnie.

W niniejszym wynalazku wykorzystuje się biosensor, taki jak elektrochemiczny pasek do badań , na którym osadzana jest objętość próbki roztworu biologicznego i miernik ukształtowany do umieszczania takiego paska testowego i pomiaru stężenia wybranych analitów w próbce biologicznej. Elektrochemiczny pasek testowy, jak zostanie pełniej opisane poniżej, zawiera ogniwo elektrochemiczne

PL 208 126 B1 złożone z dwóch umieszczonych naprzeciwko siebie elektrod, które wyznaczają strefę reakcji, do umieszczania próbki biologicznej, przy czym strefa reakcji ma określoną grubość i objętość.

Gdy przyłoży się odpowiednie napięcie do ogniwa elektrochemicznego, zachodzi zarówno ładowanie warstwy podwójnej jak i reakcja elektrochemiczna. W wyniku tego ładunek płynie do elektrod ogniwa elektrycznego. Granica faz elektroda-roztwór jest analogiczna do tej w kondensatorze. Stosunek ładunku do napięcia określa pojemność granicy faz elektroda-roztwór. Jako, że całkowity ładunek spowodowany jest ładowaniem warstwy podwójnej i reakcją elektrochemiczną, dwie odrębne składowe pojemnościowe, odpowiednio Cdl i Cs, przyczyniają się do całkowitej lub równoważnej pojemności ogniwa (patrz Bard, A.J. i Faulkner, L.R. Electrochemical Methods, 1980).

Wynalazcy odkryli, że równoważna pojemność ogniwa elektrochemicznego jest najbardziej stosownym czynnikiem przy precyzyjnym określaniu objętości próbki, ponieważ równoważna pojemność ogniwa jest liniowo proporcjonalna do wielkości pola powierzchni elektrod ogniwa stykających się z próbką („pokryty obszar ogniwa”) a zatem jest liniowo proporcjonalna do obję toś ci próbki w ogniwie, to znaczy pomiędzy elektrodami. Wynalazcy odkryli również, że równoważna oporność ogniwa elektrochemicznego jest ponadto stosowana dla precyzyjnego wyznaczenia objętości próbki, ponieważ oporność równoważna ogniwa jest odwrotnie proporcjonalna do pokrytego obszaru ogniwa, a zatem jest odwrotnie proporcjonalna do objętości próbki.

A zatem cechą niniejszego wynalazku jest wyznaczanie takiego pokrytego obszaru ogniwa i odpowiedniej obję tości próbki z równoważ nej pojemnoś ci ogniwa lub zarówno z równoważ nej pojemności ogniwa jak i równoważnej oporności ogniwa.

Inną cechą niniejszego wynalazku jest kontrolowanie pewnych innych czynników (np. grubości ogniwa, stężenia jonów, itp.), które mogą przeszkadzać w dokładnym pomiarze objętości próbki, w tym celu, aby wartość równoważnej pojemności ogniwa była niezależna i nie ulegała wpływowi stężenia glukozy i poziomów hematokrytu krwi w próbce, temperatury otoczenia, cech szczególnych dawcy krwi i innych zazwyczaj przeszkadzających składników krwi.

Jeszcze dalszą cechą niniejszego wynalazku jest zapewnienie dodatkowej funkcji kompensacji dla objętości próbki określonej jako mniejsza niż odpowiednia w celu kontynuowania dokładnego pomiaru stężenia analitu.

Odpowiednio do tego, niniejszy wynalazek dostarcza sposób wyznaczania odpowiedniości objętości próbki biologicznej do stosowania dla wyznaczania stężenia jednego lub więcej wybranych analitów w próbce donorowej, które osiągają te cele i zapewniają te cechy.

W okreś lonych wykonaniach przedmiotowego sposobu, napię cie prą du zmiennego (napię cie AC) o niskiej amplitudzie i mające wybraną częstotliwość przykładane jest do biosensora zawierającego próbkę biologiczną, która ma być testowana, ładując przez to biosensor. Opcjonalnie, napięcie prądu stałego (napięcie DC) może być przykładane jednocześnie z napięciem AC w celu zwiększenia prędkości, z jaką pojemność biosensora staje się ustabilizowana. Wynikowy prąd zmienny wytworzony z takiego ładowania jest nastę pnie mierzony i wyznaczona zostaje z wynikowego prądu zmiennego równoważna pojemność ogniwa biosensora. Równoważna pojemność ogniwa jest następnie używana do wyznaczania wielkość obszaru powierzchni biosensora w styku z roztworem próbki, który to obszar powierzchni jest następnie używany do wyznaczania objętości próbki wewnątrz biosensora. Po określeniu, że objętość próbki jest odpowiednia do wykonania dokładnego pomiaru stężenia analitu, mierzone jest to stężenie analitu. Z drugiej strony, jeśli określi się, że objętość próbki jest nieodpowiednia, przedmiotowy sposób może dalej zawierać kompensację dla takiej nieodpowiedniej objętości próbki podczas procesu pomiaru stężenia analitu. Kompensacja nieodpowiedniej objętości próbki obejmuje wyznaczanie koniecznego współczynnika kompensacji, który obejmuje, przynajmniej częściowo, wyznaczanie stosunku równoważnej pojemności ogniwa biosensora zawierającego rzeczywistą objętość próbki do pojemności ogniwa biosensora wtedy, kiedy wypełniona jest cała dostępna pojemność.

Układ do realizacji sposobu według wynalazku zawiera elektroniczne elementy składowe i/lub zespół obwodów przeznaczony do stosowania z i przyłączony elektronicznie do biosensora, np. elektrochemiczne ogniwo pomiarowe w postaci np. paska testowego jednorazowego użytku, w którym zostaje osadzony testowany próbkowany roztwór, lub jest wciągany poprzez efekt kapilarny w procesie. Najbardziej typowo, taki elektroniczny zespół obwodów jest wbudowany w miernik lub inne urządzenie automatyczne skonstruowane do odbioru i operacyjnego sprzężenia z takim ogniwem elektrochemicznym, np. paskiem testowym jednorazowego użytku, i do pomiaru jednej lub więcej własności fizycznych lub chemicznych próbki biologicznej utrzymywanej wewnątrz ogniwa elektrochemicznego. Najbardziej typowo, takie własności obejmują stężenie jednego lub więcej analitów docelowych

PL 208 126 B1 w próbce biologicznej. Taki zespół obwodów elektronicznych moż e zawierać dyskretne elektroniczne elementy składowe, np. zasilanie napięciowe, i/lub obwody scalone mające wiele elementów obwodów i/lub urządzeń półprzewodnikowych, np. mikroprocesor zaprogramowany odpowiednio do wykonywania określonych etapów lub funkcji przedmiotowego sposobu, oparty na określonych wejściach sygnałów lub danych otrzymanych z ogniwa elektrochemicznego.

W określonych wykonaniach układy do realizacji sposobu według niniejszego wynalazku obejmują taki elektroniczny zespół obwodów i takie automatyczne urządzenie pomiarowe lub miernik, jak opisane wyżej, w którym elektroniczny zespół obwodów jest całkowicie strukturalnie i funkcjonalnie zintegrowany w automatycznym urządzeniem pomiarowym.

Chociaż zgodny z wynalazkiem sposób i układ do jego realizacji mogą być użyte do wyznaczania objętości próbki różnych próbek biologicznych, takich jak mocz, łzy, ślina i tym podobne, nadają się one szczególnie do wyznaczania objętości próbki krwi lub frakcji krwi i podobnych. Co więcej, podczas gdy zgodny z wynalazkiem sposób wyznaczania objętości próbki i układ do jego realizacji są użyteczne w przygotowaniu do pomiaru wielu różnych fizycznych i chemicznych własności próbki, są one szczególnie przydatne w przygotowaniu do pomiaru stężenia wybranych analitów w próbce.

Te i inne cele, korzyści i cechy wynalazku staną się oczywiste dla fachowca po przeczytaniu szczegółów sposobu według niniejszego wynalazku oraz układu do jego realizacji opisanych poniżej.

Wynalazek w przykładzie wykonania został bliżej objaśniony na podstawie rysunku, na którym fig. 1 przedstawia rozstrzelony widok przykładowego konwencjonalnego elektrochemicznego paska testowego dla elektrochemicznego wyznaczania stężenia analitu, który jest stosowany z niniejszym wynalazkiem, fig. 2 - schematycznie obwód przedstawiający równoważną impedancję ogniwa paska testowego z fig. 1, fig. 3 - schemat blokowy układu operacyjnie sprzężonego z elektrochemicznym biosensorem dla pomiaru równoważnej pojemności ogniwa biosensora elektrochemicznego, przy przyłożonym napięciu do biosensora, fig. 4 - wykres opisujący zależność zmiany w równoważnej pojemności ogniwa (oś y) od czasu (oś x) elektrochemicznego ogniwa paska testowego z fig. 1, przy całkowitym wypełnieniu ogniwa i, odpowiednio, wypełnieniu do połowy roztworem próbkowanym, fig. 5 - wykres opisują cy zależ ność zmiany w równoważ nej opornoś ci (oś y) ogniwa elektrochemicznego od czasu (oś x), przy ogniwie paska testowego z fig. 1 całkowicie wypełnionym i odpowiednio wypełnionym do połowy roztworem próbkowanym fig. 6 - wykres kolumnowy opisujący zależność zmiany równoważnej pojemności ogniwa (oś x) ogniwa elektrochemicznego paska testowego z fig. 1 w 0,5 sekundy po podaniu roztworu próbki na pasek testowy (oś y), przy całkowitym wypełnieniu ogniwa i, odpowiednio, wypełnieniu do połowy próbkowanym roztworem, fig. 7 - wykres opisujący stosunek równoważnej pojemności ogniwa i równoważnej oporności ogniwa (oś y) w czasie (oś x) przy elektrochemicznym ogniwie paska testowego z fig. 1 całkowicie wypełnionym i, odpowiednio, wypełnionym do połowy roztworem próbkowanym, fig. 8 - wykres rozrzutu stosunku równoważnej pojemności ogniwa i równoważnej oporności ogniwa (oś y) do równoważnej pojemności ogniwa (oś x) mierzonej w 0,5 sekundy po podaniu próbki, przy ogniwie elektrochemicznym całkowicie wypełnionym i, odpowiednio, wypełnionym do połowy roztworem próbkowanym.

Szczegółowy opis preferowanych przykładów wykonania

Wynalazek niniejszy dostarcza sposobu wyznaczania objętości próbki biologicznej do celów pomiaru wybranych własności próbki, np. stężenia analitu, i określania, czy ta objętość jest odpowiednia do wykonania dokładnego pomiaru takiej wybranej własności. Taki sposób zapewnia dodatkową funkcję kompensacji dla objętości próbki określonej jako mniejsza niż odpowiednia w celu zapewnienia dokładnego pomiaru takiej własności.

Zanim niniejszy wynalazek zostanie opisany bardziej szczegółowo, należy zrozumieć, że nie jest on ograniczony do szczególnych opisanych przykładów wykonania, ponieważ mogą się one, oczywiście, zmieniać. Należy również zrozumieć, że zastosowana tu terminologia przeznaczona jest tylko do opisania określonych przykładów wykonania, i nie może być ograniczająca.

Tam, gdzie występuje zakres wartości, rozumie się, że każda wartość leżąca w tym zakresie, do jednej dziesiątej części jednostki dolnej granicy, chyba, że z kontekstu jasno wynika co innego, pomiędzy górną i dolną granicą zakresu, objęta jest wynalazkiem. Górne i dolne granice tych mniejszych zakresów mogą, niezależnie, być zawarte w mniejszych zakresach, są również objęte wynalazkiem, z uwzglę dnieniem specjalnie wykluczonego ograniczenia w wymienionym zakresie. Tam gdzie wymieniony zakres obejmuje jedną lub obie granice, zakresy wyłączające zarówno obydwie granice są również objęte wynalazkiem.

PL 208 126 B1

Jeśli nie zostało to inaczej zdefiniowane, wszystkie określenia techniczne i naukowe tu zastosowane mają znaczenie takie jak powszechnie używane przez przeciętnego fachowca w dziedzinie do której należy wynalazek. Chociaż w praktyce lub testowaniu niniejszego wynalazku mogą być też stosowane dowolne sposoby i materiały podobne do tych lub równoważne tu opisanym, została tu opisana ograniczona liczba przykładowych sposobów i materiałów.

Należy zauważyć, że stosowana w opisie i zastrzeżeniach liczba pojedyncza rzeczowników obejmuje odniesienia do liczby mnogiej, chyba, że z kontekstu jasno wynika co innego.

Wszystkie wymienione tu publikacje zostały umieszczone w związku z ujawnieniem i opisaniem sposobu i/lub materiałów, w związku z którymi zacytowane zostały te publikacje. Wszystkie omawiane tu publikacje są zamieszczone tylko ze względu na ich ujawnienie przed datą zgłoszenia niniejszego zgłoszenia. Nic tutaj nie może być interpretowane jako uznanie, że niniejszy wynalazek nie jest upoważniony do antydatowania takiej publikacji na podstawie uprzedniego wynalazku. Dalej, zamieszczone daty publikacji mogą się różnić od rzeczywistych dat publikacji, co może wymagać niezależnego potwierdzenia.

Definicje

Określenie „warstwa podwójna” tu stosowane odnosi się do całego układu naładowanych materiałów i zorientowanych dipoli istniejących na granicy faz pomiędzy powierzchnią elektrody i roztworem, np. próbka roztworu biologicznego, w styku z powierzchnią elektrody wtedy, kiedy do elektrody przyłożone jest napięcie.

Określenie „pojemność podwójnej warstwy”, Cdl, oznacza pojemność otrzymaną przez ładowanie podwójnej warstwy na granicy faz elektroda-roztwór.

Określenie „pojemność faradajowska”, Cs, odnosi się do składowej pseudopojemności na skutek procesu reakcji elektrochemicznej, który występuje na powierzchni elektrody.

Określenie „prąd faradajowski”, iF, oznacza prąd lub transfer elektronów który występuje na powierzchni elektrody do której przyłożone zostało napięcie. Określenie „równoważna pojemność ogniwa”, C, jeśli jest tu stosowane w odniesieniu do ogniwa elektrochemicznego oznacza całkowitą równoważną pojemność ogniwa elektrochemicznego, która powstaje wtedy, kiedy do ogniwa elektrochemicznego zostało przyłożone napięcie. Równoważna pojemność ogniwa jest zdominowana przez pojemność warstwy podwójnej i pojemność faradajowską.

Określenie „równoważna oporność ogniwa”, R, używane tu w odniesieniu do ogniwa elektrochemicznego oznacza całkowitą równoważną oporność ogniwa elektrochemicznego, która powstaje wtedy, kiedy do ogniwa elektrochemicznego zostało przyłożone napięcie.

Określenie „równoważna impedancja ogniwa”, Z, używane tu wymiennie w odniesieniu do obwodu elektrycznego lub elementu składowego, np. ogniwa elektrochemicznego, oznacza całkowitą impedancję objętego obwodu, ale niekoniecznie ograniczoną do kombinacji równoważnej pojemności ogniwa i równoważnej oporności ogniwa, która powstaje wtedy, kiedy do ogniwa elektrochemicznego zostało przyłożone napięcie.

Określenie „prąd faradajowski”, iF, oznacza prąd powstały w wyniku transferu elektronów pomiędzy elementem składowym próbki i powierzchnią elektrody w wyniki reakcji elektrochemicznej wtedy, kiedy zostało przyłożone napięcie.

Określenia „wyprowadzać, „wyznaczać”, „obliczać” i tym podobne oraz ich pochodne są tu stosowane wymiennie.

Niniejszy wynalazek zostanie obecnie opisany szczegółowo. W dalszym opisie wynalazku, przykładowe biosensory elektrochemiczne stosowane w sposobie według wynalazku i układzie do jego realizacji zostaną opisane najpierw, a za nimi nastąpi opis sposobu według wynalazku i układu do jego realizacji, jak również opis zestawów, które zawierają układy do stosowania przy wykonywaniu sposobu według wynalazku.

Biosensory elektrochemiczne

Jak to krótko podano wyżej, wynalazek dostarcza sposobu do pomiaru objętości próbki materiału biologicznego stosowanego do pomiaru stężenia analitu i określania, czy ta objętość jest odpowiednia do wykonania dokładnego pomiaru stężenia analitu. Ten sposób i układ do jego realizacji są używane z biosensorem, bardziej szczegółowo z biosensorem opartym na ogniwie elektrochemicznym, w którym materiał biologiczny jest osadzany lub do którego jest przenoszony. Istnieją róż ne konstrukcje biosensorów opartych na ogniwie elektrochemicznym. Najbardziej powszechne z tych konstrukcji, stosowane w dziedzinie monitorowania stężenia analitu zawierają konfiguracje pasków testowych, takie jak ujawnione w opisie patentowym USA nr 6 193 873 i zgłoszeniach patentowych USA nr

PL 208 126 B1 nr 09/497304, 09/497269, 09/736788 i 09/746116. Takie paski testowe są stosowane z miernikami skonstruowanymi do pomiarów elektrochemicznych, takimi jak ujawnione w podanych wyżej opisach patentowych.

Inne niż paski testowe biosensory elektrochemiczne mogą również nadawać się do stosowania z wynalazkiem. Na przykł ad, ogniwo elektrochemiczne moż e mie ć budowę cylindryczną , w której elektroda rdzeniowa jest usytuowana współosiowo w drugiej tulejowej elektrodzie. Takie konfiguracje ogniw elektrochemicznych mogą być w postaci mikroigieł i, jako takie, są integralne w strukturze igły dla pomiarów in situ (np. typowo pod powierzchnią powłoki) lub inaczej, w fizycznym lub płynowym połączeniu ze strukturą mikroigły. Przykłady takiej mikroigły są ujawnione w zgłoszeniach patentowych USA nr nr 09/878742 i 09/879106. Dla celów niniejszego ujawnienia, przedmiotowe urządzenia zostaną opisane w stosowaniu z ogniwami elektrochemicznymi w konfiguracjach pasków testowych. Jednakże, fachowcy docenią to, że urządzenia mogą być stosowane z dowolną odpowiednią konfiguracją ogniwa elektrochemicznego, włączając konfiguracje mikroigieł.

Wykonywany typ pomiarów elektrochemicznych może zmieniać w zależności od szczególnej natury oznaczenia i miernika, z którym stosowany jest elektrochemiczny pasek testowy, np. w zależności od tego, czy oznaczenie jest kulometryczne, amperometryczne lub potencjometryczne. Ogniwo elektrochemiczne dokona pomiaru ładunku w oznaczeniu kulometrycznym, prądu w amperometrycznym i potencjału w potencjometrycznym. Dla celów tego ujawnienia, niniejszy wynalazek zostanie opisany w kontekście oznaczeń amperometrycznych, jednakże urządzenia do stosowania sposobu zgodne z wynalazkiem mogą być używane z dowolnym typem oznaczenia i pomiaru elektrochemicznego.

Generalnie, w dowolnej konfiguracji, ogniwo elektrochemiczne zawiera co najmniej dwie elektrody oddalone od siebie w układzie naprzeciwko siebie lub obok siebie, w tej samej płaszczyźnie. W pierwszym układzie, elektrody rozdzielone są cienką warstwą przekładkową, która wyznacza obszar lub strefę reakcji, lub komorę, w której osadzana jest próbka biologiczna lub, do której jest przenoszona dla pomiaru stężenia analitu. W konfiguracji jedna obok drugiej, elektrody znajdują się w komorze o okreś lonej gruboś ci i obję toś ci. W obszarze reakcji lub komorze, obecne są , tj. okrywają jedną lub więcej leżących naprzeciw siebie powierzchni elektrod, jeden lub więcej reagentów redoks wybranych do selektywnego chemicznego przereagowania z docelowym(i) analitem(ami). Takie reagenty redoks, typowo, zawierają co najmniej jeden enzym i mediator.

Fig. 1 pokazuje w widoku rozstrzelonym przykładowy konwencjonalny elektrochemiczny pasek testowy 2 używany z niniejszym wynalazkiem. Pasek testowy 2 jest wykonany z dwóch elektrod 4, 8 oddzielonych warstwą przekładkową 12, która ma wycięty odcinek, wyznaczający strefę lub obszar reakcji 14. Generalnie, elektrody 4, 8 są ukształtowane w postaci wydłużonych prostokątnych pasków, z których każdy ma długość w zakresie od około 2 do 6 cm, zwykle od około 3 do 4 cm, i szerokość w zakresie od około 0,3 do 1,0 cm, zwykle od około 0,5 do 0,7 cm, i grubość w zakresie od około 0,2 do 1,2 mm, zwykle od 0,38 do 0,64 mm.

Powierzchnie elektrod 4, 8, które zwrócone są do obszaru reakcji w pasku są wykonane z materiału przewodzącego, korzystnie z metalu, przy czym wchodzą w grę pallad, złoto, platyna, iryd, domieszkowany tlenek indowo-cynowy, stal nierdzewna, węgiel i podobne. Powierzchnie zewnętrzne 6, 10 elektrod 4, 8 są wykonane z podpór obojętnych lub materiału podłożowego. Dowolny obojętny materiał podłożowy może być użyty z elektrodami 4, 8, gdzie typowo, materiał jest materiałem sztywnym, zdolnym do stanowienia konstrukcyjnej podpory dla elektrody i, z kolei, elektrochemicznego paska testowego jako całości. Takie odpowiednie materiały obejmują tworzywa sztuczne, np. PET, PETG, poliimid, poliwęglan, polistyren, silikon, ceramikę, szkło i tym podobne. Elektrody 4, 8 i pasek testowy 2 mogą być wytwarzane przy użyciu dowolnej z wielu technologii produkcji znanych fachowcom w tej dziedzinie techniki.

Jak opisano wyżej, cienka warstwa przekładkowa 12 umieszczona jest lub włożona pomiędzy elektrody 4, 8. Grubość warstwy przekładkowej 12 zwykle wynosi od około 1 do 500 μm, typowo od około 50 do 150 urn. Warstwa przekładkowa 12 może być wykonana z dowolnego dogodnego materiału, przy czym wybrane odpowiednie materiały obejmują PET, PETG, poliimid, poliwęglan i tym podobne. Powierzchnie warstwy przekładkowej 12 mogą zostać obrobione tak, aby były adhezyjne z odpowiednimi elektrodami 4, 8 i przez to utrzymywały konstrukcję elektrochemicznego paska testowego 2.

Warstwa przekładkowa 2 jest przecięta po to, aby dostarczyć strefy lub obszaru reakcji 14 mającego właściwy kształt kołowy, kwadratowy, trójkątny, prostokątny, lub nieregularny. Wierzch i spód

PL 208 126 B1 strefy względnie obszaru reakcji 14 wyznaczony jest przez zwrócone ku sobie powierzchnie elektrod 4, 8, podczas gdy warstwa przekładkowa 12 wyznacza ściany boczne obszaru reakcji 14. Objętość obszaru reakcji wynosi od co najmniej około 0,1 do 10 gL, zwykle od około 0,2 do 5,0 μL i jeszcze częściej od około 0,3 do 1,6 gL.

W obszarze reakcji 14 obecny jest układ reagentów redoks, który to układ reagentów redoks zapewnia materiał, który jest wykrywany przez elektrodę i dlatego jest używany do wyprowadzania stężenia analitu w próbce biologicznej. Układ reagentów redoks obecny w obszarze reakcji normalnie zawiera co najmniej jeden enzym(y) i mediator. W wielu wykonaniach, człon(y) enzymowy układu reagentów redoks jest enzymem lub wieloma enzymami, które pracują zgodnie, aby utlenić interesujący analit. Innymi słowy, składnik enzymowy układu reagentów redoks utworzony jest z jednego enzymu utleniającego pojedynczego analitu lub zbioru dwu lub więcej enzymów pracujących zgodnie dla utlenienia analitu, będącego przedmiotem zainteresowania. Typowe enzymy wchodzące w grę obejmują oksydoreduktazy, hydrolazy, transferazy i tym podobne; jednakże określony enzym obecny w obszarze reakcji zależy od określonego analitu do wykrywania którego przeznaczony jest pasek do badań elektrochemicznych. W przypadku gdy analitem będącym przedmiotem zainteresowania jest na przykład glukoza, odpowiednie enzymy obejmują oksydazę glukozową, dehydrogenazę glukozową/ albo (NAD) na bazie dinukleotydu β-nikotynoamidowo-adeninowego albo (PQQ) na bazie kwasu 4,5-dihydro-4,5-diokso-1H-pirolo[2,3-f]chinolino-2,7,9-trikarboksylowego/. Gdy analitem jest cholesterol, odpowiednie enzymy obejmują esterazę cholesterolową i oksydazę cholesterolową. Dla innych analitów mogą być zastosowane enzymy obejmujące, ale bez ograniczenia do nich, lipazę lipoproteinową, kinazę glicerolową, oksydazę glicerolo-3-fosforanową, oksydazę mleczanową, dehydrogenazę mleczanową, oksydazę pirogronianową, oksydazę alkoholową, oksydazę bilirubinową, urykazę i tym podobne.

Drugim składnikiem układu reagentów redoks jest składnik pośredniczący czyli mediator, utworzony z jednego lub więcej czynników pośredniczących. Znanych jest wiele różnorodnych czynników pośredniczących obejmujących: żelazicyjanek, etylosiarczan fenazyny, metylosiarczan fenazyny, fenylenodiaminę, metylosiarczan 1-metoksyfenazyny, 2,6-dimetylo-1,4-benzochinon, 2,5-dichloro-1,4-benzochinon, pochodne ferrocenów, bipirydylowe kompleksy osmu, związki, kompleksowe rutenu i tym podobne. W tych przykładach wykonania, w których analitem będącym przedmiotem zainteresowania jest glukoza, a składnikami enzymowymi oksydaza glukozowa lub dehydrogenaza glukozowa, szczególnie odpowiednim mediatorem jest żelazicyjanek. Inne reagenty, które mogą znajdować się w obszarze reakcji obejmują środki buforowe, np. cytrakonian, cytrynian, fosforan, bufory „Good” i tym podobne.

Układ reagentów redoks występuje zwykle w postaci suchej. Ilości różnych składników mogą się zmieniać, podczas gdy ilość składnika enzymowego zazwyczaj jest w zakresie od około 0,1 do 20% wagowych.

Jak zsumowano powyżej, przedmiot wynalazku obejmuje sposób określania objętości próbki biologicznej osadzanej lub przenoszonej do ogniwa elektrochemicznego mającego strefę reakcji lub komorę o określonej pojemności i określania, czy taka objętość jest odpowiednia dla wykonywania dokładnego pomiaru stężenia analitu. Jak wspomniano powyżej, cechą przedmiotowego sposobu przy określaniu objętości próbki stanowi określanie równoważnej pojemności ogniwa oraz równoważnej oporności ogniwa. Jako taki, przedmiotowy sposób zapewnia dokładniejszy pomiar objętości próbki od tego jaki był osiągany w stanie techniki.

Inną cechę przedmiotowego sposobu przy określaniu równoważnej pojemności i oporności ogniwa i objętości próbki stanowi pomijanie pewnych cech charakterystycznych lub czynników próbkowanego roztworu lub warunków otoczenia, które albo nie mają wpływu na określanie równoważnej pojemności i/lub równoważnej oporności lub są inaczej ściśle kontrolowane tak, że nie mają takiego wpływu. Takie czynniki, które są kontrolowane lub niezależne od równoważnej pojemności obejmują stężenie jonów, hematokryt krwi, stężenie glukozy we krwi, temperaturę otoczenia, dawcę krwi, interferencje sensorowe typowo stwierdzane we krwi, grubość ogniwa i starzenie się biosensorów, lecz nie ograniczają się do nich.

W celu zrozumienia opisu przedmiotowego sposobu pokazany został na fig. 2 uproszczony model obwodu 40 impedancji ogniwa elektrochemicznego paska testowego z fig 1. Obwód 40 impedancji przedstawia czynniki impedancyjne paska testowego, gdy zawiera on próbkę roztworu biologicznego i przyłożone jest do niego napięcie. Gdy do ogniwa przyłożone jest zarówno napięcie prądu zmiennego (AC) jak i prądu stałego (DC), wówczas obwód 40 impedancji obejmuje równoważną pojemPL 208 126 B1 ność (C) 42, ogniwa, która zawiera podwójną warstwę i pojemności faradayowskie oraz równoważną oporność (R) 46 ogniwa elektrochemicznego.

Przed zastosowaniem sposobu według wynalazku konieczne jest najpierw uzyskanie przeznaczonej do pomiaru próbki biologicznej i umieszczenie takiej próbki w obrębie ogniwa paska testowego. Umieszczenie próbki wewnątrz paska testowego może być dokonane przez włożenie najpierw paska testowego do miernika testowego i potem przyłożenia próbki do paska testowego („dozowanie w mierniku”), lub przez przyłożenie próbki do paska testowego, a potem umieszczenie paska testowego w mierniku testowym („dozowanie poza miernikiem”). Ta ostatnia kolejność jest często preferowana w środowiskach szpitalnych, ponieważ bardziej prawdopodobne jest zanieczyszczenie wzajemne wewnątrz miernika. Przyrząd pomiarowy wykrywa wówczas, że próbka biologiczna została wprowadzona do ogniwa elektrochemicznego (jak to ujawniono w opisie patentowym amerykańskim nr 6193873).

Gdy taka próbka zostaje wykryta, pierwszy etapem sposobu według wynalazku jest przyłożenie do biosensora napięcia prądu zmiennego (VAC) o małej amplitudzie. Amplituda doprowadzonego napięcia AC jest tak dobrana, że jego przyłożenie nie wywołuje prądu fardayowskiego (iF), to jest przenoszenia elektronów, które występuje na powierzchni elektrody, w wyniku reakcji elektrochemicznej przy przyłożeniu napięcia do elektrody. Jako taka, amplituda przyłożonego napięcia AC mieści, się w zakresie od około 2 do 100 mV napięcia skutecznego, zwykle w zakresie od około 5 do 75 mV napięcia skutecznego. Częstotliwość (f) przyłożonego napięcia AC jest też tak dobrana, aby zmaksymalizować sygnał do współczynnika szumów (to jest, stosunku mierzonej pojemności równoważnej ogniwa do zmienności mierzonej pojemności równoważnej ogniwa) ogniwa. Jako taka, możliwa do przyjęcia częstotliwość przyłożonego napięcia AC mieści się w zakresie od około 50 do 10 000 Hz, typowo w zakresie od około 75 do 1000 Hz, a bardziej typowo wynosi około 100 Hz.

Opcjonalnie można do biosensora przyłożyć napięcie prądu stałego (DC), albo równocześnie z napięciem AC lub ułamki sekund przed przyłożeniem napięcia AC. To napięcie DC mieści się na ogół w zakresie od około 0 do 600 mV, typowo od około 200 do 500 mV, a bardziej typowo od 300 do 400 mV. Składnik napięcia DC powoduje szybszą stabilizację równoważnej pojemności ogniwa elektrochemicznego niż przy samym tylko napięciu AC. Szybka stabilizacja pojemności, ogniwa umożliwia określanie objętości próbki przed rozpoczęciem pomiaru analitu, zmniejszając w ten sposób do minimum całkowity czas testu.

Po przyłożeniu napięć AC i DC mierzy się natężenie prądu zmiennego (iAC) wywoływane ładowaniem ogniwa elektrochemicznego. Można wówczas równoważną pojemność ogniwa biosensora określić z amplitudy i fazy wypadkowego prądu zmiennego.

Żeby równoważna pojemność ogniwa zależała tylko od pola powierzchni ogniwa, z którą styka się próbka biologiczna, musi być ściśle kontrolowana odległość rozdzielenia (ddl) ładowania pojemności podwójnej warstwy, tak aby była ona stała podczas określania objętości roztworu próbki. Grubość kondensatora z podwójną warstwą zależy od przykładanego napięcia, stężenia naładowanych jonów w roztworze. W celu zapewnienia stałej grubości odległość rozdzielenia ładowania, a tym samym zapewnienia dokładnego określania pola powierzchni każdej elektrody stykającej się z roztworem próbki i dokładnego określenia objętości próbki, jest ściśle kontrolowane stężenia jonów w reagencie redoks, podczas gdy stężenie jonów w próbce jest kontrolowane fizjologicznie w bardzo wąskim zakresie.

Jak wspomniano powyżej, oporność równoważna ogniwa elektrochemicznego jest ponadto stosowana do dokładnego określania objętości próbki. Tak więc ustalenie, że równoważna oporność (R) ogniwa jest odwrotnie proporcjonalna do pola powierzchni ogniwa pokrywanej przez próbkę i że równoważna pojemność (C) ogniwa jest liniowo proporcjonalna do pokrywanego pola powierzchni ogniwa, jest przedstawione przez następujące zależności:

R = pl/A i C χ A gdzie ρ stanowi oporność właściwą ogniwa elektrochemicznego, l jest długością elektrody ogniwa, a A pole powierzchni przewodzącej ogniwa, przy czym istnieje następująca zależność:

C/R χ A²

Tak więc wielkość pola powierzchni ogniwa pokrywana przez próbkę może być określona przez stosunek równoważnej pojemności ogniwa do równoważnej oporności ogniwa. Przez uwzględnienie wpływu objętości próbki na dwa składniki impedancji (pojemność i oporność) ogniwa zamiast tylko na

PL 208 126 B1 jeden z nich (np. pojemność), ustalona została zależność, która zapewnia większą czułość przy reagowaniu na zmiany w wielkości pola powierzchni ogniwa pokrywanego przez próbkę biologiczną. Biorąc dokładniej, stosunek pojemności ogniwa do oporności ogniwa zapewnia zależność kwadratową zamiast zależności liniowej w odniesieniu do pola powierzchni, ogniwa pokrytego przez próbkę biologiczną, zwiększając w ten sposób czułość w odniesieniu do mierzonej(-ych) zmiany/zmian pokrytego pola powierzchni. Dlatego określanie pokrytego pola ogniwa jest jeszcze dokładniejsze niż gdy brana jest pod uwagę tylko równoważna pojemność ogniwa.

Po określeniu pola powierzchni elektrody stykającej się z lub pokrywanej przez roztwór próbki, objętość (VS) roztworu próbki w obrębie biosensora, to jest w obrębie strefy reakcji ogniwa elektrochemicznego, może być następnie określana według następującego równania:

VS = A • d gdzie d jest odległością pomiędzy elektrodami ogniwa przy ustawieniu elektrod powierzchniami do siebie lub głębokością ogniwa przy konfiguracji z ustawieniem elektrod obok siebie.

Określa się wówczas, czy objętość próbki dostarczonej do paska testowego jest odpowiednia do tego, aby prowadzić dalej pomiar stężenia analitu. Określanie takie dokonywane jest przez porównanie obliczonej objętości próbki z całkowitą objętością ogniwa elektrochemicznego. Jak to omówiono dokładniej poniżej w odniesieniu do układu do realizacji sposobu według wynalazku, niektóre parametry, do których należą wartość całkowitej objętości ogniwa, zakres temperatury roboczej, właściwe umieszczenie paska testowego mierniku, lecz bez ograniczenia do nich, pośród innych danych (zarówno statycznych jak i dynamicznych) lub parametry odnoszące się do poszczególnego ogniwa, są przechowywane w pamięci mikroprocesora, na przykład po kalibracji miernika i innych części składowych układu.

Jeśli próbka została określona jako odpowiednia wykonywany jest pomiar wymaganej cechy charakterystycznej, na przykład stężenia analitu, którego wynik może być pokazany na zespole wyświetlacza, opisanym bardziej szczegółowo w odniesieniu do układów do realizacji sposobu według wynalazku. Z drugiej strony, jeśli objętość próbki zostanie określona jako nieodpowiednia, to jest jako za mała, aby zapewnić dokładny pomiar, zespół wyświetlacza może być tak skonfigurowany, aby ukazywał ikonę małej objętości.

Jak podano powyżej, niektóre postaci realizacji sposobu według wynalazku zawierają dodatkową funkcję wyrównywania nieodpowiedniej objętości roztworu próbki, w celu wykonania dokładnego pomiaru wybranej cechy charakterystycznej, na przykład stężenia docelowego analitu, bez konieczności powtarzania próbkowania i etapów testu.

Wiadomo ze stanu techniki, że stężenie wybranego analitu, takiego jak glukoza, próbki biologicznej w obrębie ogniwa jest proporcjonalne do prądu faradajowskiego (IF) przechodzącego przez ogniwo elektrochemiczne, gdy przyłożone jest napięcie DC, że prąd ogniwa jest proporcjonalny do pola powierzchni ogniwa pokrytej przez roztwór próbny. Jak wspomniano powyżej, twórcy wynalazku stwierdzili, że takie pole powierzchni jest proporcjonalne do równoważnej pojemności ogniwa. Tak więc, stężenie wybranego analitu jest proporcjonalne do równoważnej pojemności ogniwa. Przez określenie równoważnej pojemności ogniwa, gdy obecny jest roztwór próbny i znając pojemność ogniwa przy całkowitym jego wypełnieniu roztworem biologicznym (określoną w procesie kalibracji), współczynnik wyrównania (Fcf), potrzebny dla skompensowania dla próbki o małej objętości i dla zapewnienia dokładnego pomiaru stężenia analitu, może być określony zgodnie z poniższym równaniem:

Fcf = Cf/Cpf gdzie Cf jest równoważną pojemnością całkowicie wypełnionego ogniwa elektrochemicznego i Cpf jest równoważną pojemnoś cią ogniwa elektrochemicznego zawierającego nieodpowiednią objętość próbki biologicznej. Poprawny pomiar (G) stężenia analitu jest wówczas wykonywany z odpowiednim współczynnikiem wyrównania (Fcf) zgodnie z następującym równaniem:

G = Fcf • Gpf gdzie Gpf jest stężeniem analitu wyliczonym z ogniwa zawierającego nieodpowiednią objętość próbki biologicznej. Będąc w stanie kompensować nieodpowiednio małą objętość próbki, sposób według wynalazku pozwala unikać strat pasków testowych, zmniejsza koszty i redukuje czas potrzebny dla przeprowadzenia pomiaru analitu.

PL 208 126 B1

Tak więc, reasumując ogólnie zgodnie z powyższymi zasadami i odkryciami, sposób według niniejszego wynalazku zawiera etapy z przykładaniem napięcia AC mającego wybraną amplitudę i wybraną częstotliwość do biosensora z przykładaniem także napięcia DC lub bez do biosensora; mierzenia prądu AC wytwarzanego przez przyłożenie napięcia (napięć); określania pojemności lub zarówno pojemności jak i oporności biosensora od mierzonego prądu AC; określania pola powierzchni części biosensora stykającej się z próbką w oparciu o określoną pojemność lub w oparciu o zarówno określoną pojemność jak i określoną oporność, a następnie określania objętości próbki w obrębie biosensora w oparciu o określone pole powierzchni.

Korzystnie sposób według wynalazku zawiera ponadto etap mierzenia jednej lub kilku fizycznych lub chemicznych cech charakterystycznych próbki biologicznej, takich jak stężenie jednego lub kilku analitów, w oparciu o stwierdzenie, że objętość próbki jest nieodpowiednia. Jeszcze inny wariant sposobu według wynalazku obejmuje wyrównywanie nieodpowiedniej objętości próbki biologicznej trzymanej w obrębie elektrochemicznego biosensora do pomiaru co najmniej jednej cechy charakterystycznej w celu dokładnego pomiaru wartości tej cechy charakterystycznej. Taki sposób wyrównywania obejmuje określanie współczynnika wyrównania koniecznego do skompensowania dla nieodpowiedniej próbki, jeśli taka została stwierdzona, a potem wyrównywanie nieodpowiedniej objętości próbki przy pomiarze, na przykład, stężenia wybranego analitu obecnego w próbce. Etap określania koniecznego współczynnika wyrównania obejmuje określanie stosunku równoważnej pojemności biosensora przy kompletnym wypełnieniu próbką do określonej równoważnej pojemności biosensora z nieodpowiednią obję toś cią próbki. Wartość równoważ nej pojemności biosensora przy cał kowitym wypełnieniu w wymienionej próbce może być pobierana ze środków do przechowywania w pamięci.

Opisano także układ do przeprowadzania wyżej wymienionego sposobu. Ogólnie opisując taki układ może zawierać następujące elementy składowe do przeprowadzania etapów sposobu według niniejszego wynalazku: zasilacz napięciowy skonfigurowany tak aby przykładać napięcie do ogniwa elektrochemicznego, środki do mierzenia prądu wytwarzanego przez ogniwo gdy napięcie jest przykładane do ogniwa, środki do wyprowadzania pojemności i/lub oporności ogniwa na podstawie zmierzonego prądu, środki do wyprowadzania pola powierzchni ogniwa pokrytego biologiczną próbką na podstawie pojemności i/lub oporności ogniwa i środki do wyprowadzania objętości próbki biologicznej na podstawie pola powierzchni ogniwa. Pewne układy zawierają ponadto środki do określania czy objętość próbki jest odpowiednia do wykonania dokładnego pomiaru co najmniej jednej wybranej właściwości próbki biologicznej włączając w to, ale niewyłącznie, stężenie co najmniej jednego wybranego analitu w próbce biologicznej. Niektóre z tych układów zawierają ponadto środki do wyrównywania niedostatecznej objętości próbki przy wybranej właściwości próbki biologicznej.

Fig. 3 przedstawia schemat blokowy przykładowego układu 50 do realizacji niniejszego wynalazku. Układ 50 zawiera elektroniczne elementy składowe i zespół obwodów elektrycznych połączonych elektronicznie z biosensorem 70, na przykład z elektrochemicznym ogniwem pomiarowym w postaci paska testującego, jak opisano w nawiązaniu do fig. 1, na którym jest osadzana lub na który jest przenoszona próbka testowanego roztworu biologicznego. Bardziej szczegółowo układ 50 zawiera zasilacz napięciowy 52 do wytwarzania wymaganych napięć wejściowych AC i DC na biosensorze 70. Ponadto układ 50 zawiera przetwornik prądowo-napięciowy 54, przetwornik analogowo-cyfrowy 56 i mikroprocesor 58, które wspólnie działają aby uzyskać i przetworzyć dane z biosensora 70. W szczególności przetwornik prądowo-napięciowy 54 jest operacyjnie połączony z końcówką wyjściową biosensora 70 do otrzymywania sygnału prądu wyjściowego z biosensora 70 przy napięciu wywoływanym przez zasilacz napięciowy 52 i do przetwarzania tego sygnału prądowego na odpowiedni sygnał napięciowy. Następnie ten odpowiedni sygnał napięciowy jest dostarczany jako sygnał wejściowy do przetwornika analogowo-cyfrowego 56, który przetwarza analogowy sygnał napięciowy na odpowiednią wartość cyfrową. Ta cyfrowa wartość napięcia jest następnie dostarczana jako sygnał wejściowy do mikroprocesora 58, który jest zaprogramowany tak aby wyprowadzał i/lub określał czynniki lub parametry będące przedmiotem zainteresowania, na przykład równoważną pojemność ogniwa, równoważną oporność ogniwa, pole powierzchni biosensora w kontakcie z próbką, objętość próbki biologicznej, objętość czynnika kompensacyjnego, itp. i aby kontrolował czas każdej z tych czynności. Jak stwierdzono poprzednio, mikroprocesor 58 może zawierać środki do przechowywania w pamięci dla gromadzenia uprzednio określonych, wstępnie wyselekcjonowanych i skalibrowanych danych lub informacji takich jak całkowita objętość ogniwa elektrochemicznego, parametry kalibracji, zakres temperatur pracy, informacja o typie próbki, informacja o wykrywaniu próbki i tym podobne, które są konieczne lub użyteczne do przeprowadzania etapów i czynności przedmiotowego sposobu. Chociaż

PL 208 126 B1 mikroprocesor został przeznaczony do celów gromadzenia i przetwarzania danych w związku z niniejszym wynalazkiem, to osoby biegłe w tej dziedzinie rozpoznają, że i inne dyskretne elektroniczne elementy składowe mogą być razem zestawione tak, aby uzyskać cele niniejszego wynalazku.

Ponadto układ może zawierać urządzenie lub jednostkę wyświetlającą 60 do wyświetlania wybranych empirycznych lub symbolicznych danych, informacji lub wyjść dostarczanych przez urządzenie kontrolujące lub mikroprocesor. Takie dane, informacje lub wyjścia mogą zawierać, lecz nie są tylko do tego ograniczone, zmierzone lub wyprowadzone wartości wybranych sygnałów wyjściowych i czynników impedancji, wielkość objętości próbki, piktogramy wskaźnika całkowitej/niecałkowitej objętości, czynniki kompensujące nieodpowiednią objętość, stężenia analitów o które chodzi, piktogramy wskaźnika próbki biologicznej względem próbki kontrolnej, wyniki wzorcowania, etc.

W wielu postaciach realizacji przyłożenie sygnału elektrochemicznego, pomiar, wyprowadzenie, obliczanie, etapy kompensacji i wyświetlania jak opisano powyżej, są przeprowadzane automatycznie przez układy przeznaczone do pracy z ogniwem elektrochemicznym. W ten sposób, elektroniczny zespół obwodów elektrycznych układu może być strukturalnie lub operacyjnie połączony z ogniwem elektrochemicznym, przykładowo paskiem testującym i do mierzenia co najmniej jednej fizycznej lub chemicznej właściwości próbki biologicznej trzymanej w ogniwie elektrochemicznym. Przeważnie takie właściwości obejmują stężenie co najmniej jednego głównego analitu docelowego w próbce biologicznej. W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 6 193 873/B1 ujawniono odpowiednie urządzenie pomiarowe lub urządzenie do automatycznego przeprowadzania niektórych z tych samych lub podobnych etapów lub czynności, w związku z czym użytkownik potrzebuje tylko włożyć próbkę biologiczną w strefę reakcji ogniwa elektrochemicznego, a następnie odczytać w urządzeniu końcowy wynik stężenia analitu.

Osoby biegłe w tej dziedzinie docenią fakt, że układy te mogą pracować z układami do oznaczania, które nie zawierają biosensorów typu opisanego powyżej. Te inne układy zawierają na przykład ogniwo elektrochemiczne mające co najmniej dwie elektrody i układ reagentów redoks mający stałe stężenie jonów, przy czym elektrody są ukształtowane do umieszczania w próbce biologicznej lub środowisku mającym stałe stężenie jonów.

W związku z niniejszym wynalazkiem zaobserwowano następujące wyniki. Na fig. 4-8 pokazano zmianę wyników eksperymentalnych pomiarów pasków testujących mających właściwą objętość próbki (to znaczy pasków testujących mających strefy reakcji całkowicie wypełnione roztworem lub materiałem próbki) oraz pasków testujących mających mniejszą niż odpowiednia objętość próbki (to znaczy pasków testujących mających strefy reakcji w połowie wypełnione roztworem lub materiałem próbki). Bardziej szczegółowo, pomiary równoważnej pojemności ogniw elektrochemicznych i oporności roztworu próbki zostały przeprowadzone w wybranych odcinkach czasu, w czasie których przykładano odpowiednie napięcia do pasków testujących. Uzyskane wyniki badawcze są pokazane za pomocą ilustracji, ale nie w celu ograniczenia do nich. Pokazane wyniki były zbierane poprzez nakładanie na paski krwi pochodzącej od 5 różnych dawców krwi, przy zawartości glukozy w zakresie 40-600 mg/dL, hematokrytu 20% i 70%, w temperaturze pokojowej.

Fig. 4 przedstawia porównanie zmian równoważnych pojemności ogniwa (oś y) w czasie (oś x) pasków testujących 130 całkowicie wypełnionych próbkami krwi i pasków testujących 132 w połowie wypełnionych próbkami krwi. Wykres pokazuje, że całkowicie wypełnione paski testujące 130 wytwarzały równoważną pojemność ogniwa dwa razy większą niż równoważną pojemność w połowie wypełnionych pasków testujących 132.

Fig. 5 przedstawia porównanie zmian równoważnej pojemności ogniwa (oś y) w czasie (oś x) pasków testujących 136 całkowicie wypełnionych próbkami krwi i pasków testujących 134 w połowie wypełnionych próbkami krwi. Wykres pokazuje, że próbka krwi o większej objętości wytworzyła równoważną oporność ogniwa stanowiącą około połowy równoważnej oporności pasków testujących wypełnionych mniejszą objętością próbki krwi.

Fig. 6 przedstawia histogram równoważnej pojemności ogniwa (oś) pasków testujących 140 całkowicie wypełnionych próbkami krwi i pasków testujących 138 w połowie wypełnionych próbkami krwi, przy czym równoważna pojemność ogniwa jest mierzona co 0,5 sekundy po nałożeniu próbki krwi na pasek testujący. Wykres pokazuje, że całkowicie wypełnione paski testujące 140 wytwarzają równoważną pojemność ogniwa dwa razy większą niż równoważna pojemność w połowie wypełnionych pasków testujących 138 przy bardzo dobrej odtwarzalności

Fig. 7 przedstawia porównanie zmian stosunku równoważnej pojemności ogniwa do równoważnej oporności ogniwa (C/R) (oś Y) w czasie (oś x) pasków testujących 142 całkowicie wypełnionych

PL 208 126 B1 próbkami krwi i pasków testujących 144 w połowie wypełnionych próbkami krwi. Wykres pokazuje, że całkowicie wypełnione paski testujące 142 wytworzyły C/R około cztery razy większe niż C/R w połowie wypełnionych pasków testujących 144.

Fig. 8 przedstawia porównanie wykresu rozrzutu stosunku równoważnej pojemności ogniwa do równoważnej oporności ogniwa (C/R) (oś y) w funkcji równoważnej pojemności ogniwa (oś x) pasków testujących 146 całkowicie wypełnionych próbkami krwi i pasków testującymi 148 w połowie wypełnionymi, próbkami krwi, przy czym pojemność i oporność są mierzone co 0,5 sekundy po nałożeniu próbki krwi na pasek testujący. Wykres pokazuje, że C/R wykazała więcej czułości względem objętości próbki w porównaniu do równoważnej pojemności ogniwa C.

Do realizacji w praktyce przedmiotowego sposobu stosuje się zestawy obejmujące układ zawierający elektroniczny zespół obwodów elektrycznych, jak opisano powyżej albo w postaci przyrządu mierzącego, albo innego automatycznego instrumentu, jak opisano powyżej, do określania czy objętość próbki nałożona na pasek testujący jest dostatecznie odpowiednia do tego aby wykonać dokładny pomiar stężenia analitu niektórych. W innych zestawach układy do realizacji sposobu według wynalazku kompensują taką nieodpowiednią objętość przy wykonaniu pomiaru stężenia analitu. Ponadto zestawy mogą zawierać instrukcje do stosowania układów zgodnie z przedmiotowym sposobem, z elektrochemicznym ogniwem w postaci paska testującego lub mikroigły lub temu podobnych przy określaniu objętości roztworu lub materiału próbnego trzymanego wewnątrz ogniwa elektrochemicznego. Te instrukcje mogą być przedstawione co najmniej na opakowaniu, wkładce etykiety lub tym podobnym.

Z powyższego opisu wynika w sposób wyraźny, że cechy przedmiotowego sposobu przezwyciężają wiele wad rozwiązań znanych ze stanu techniki, służących do określania objętości próbki biologicznej osadzonej na pasku testującym w celu przeprowadzania elektrochemicznej analizy stężenia analitu i mają pewne zalety, ale nie tylko, polegające na dostarczeniu bardzo dokładnych środków i techniki do takiego wyznaczenia objętości próbki i skrócenia czasu potrzebnego do przeprowadzenia pomiarów stężenia analitu. Ponadto, takie wyznaczenie objętości próbki nie podlega zmianom pochodzącym od stężenia cukru we krwi, poziomu hematokrytu we krwi, krwiodawcy, temperatury badań i nagromadzenia interferencji często obecnej w próbkach krwi. Inne zalety wynalazku polegają na możliwości kompensowania niewłaściwej objętości próbki i prowadzenia pomiaru stężenia analitu bez konieczności zaniechania procedury testowania, zmniejszenia strat i kosztów. W ten sposób przedmiot wynalazku stanowi znaczny wkład w dziedzinie wyznaczania objętości próbki biologicznej płynu i pomiaru stężenia analitu.

Przedmiot wynalazku jest przedstawiony i opisany w oparciu o najbardziej praktyczny i korzystny przykład wykonania. Jednakże stwierdzono, że mogą być wykonane pewne odstępstwa bez wykraczania poza zakres ochrony wynalazku i, że dla osoby biegłej w tej dziedzinie, po przeczytaniu tego ujawnienia, oczywiste staną się modyfikacje.

Claims (9)

1. Sposób wyznaczania objętości próbki biologicznej po jej utrzymywaniu w ogniwie biosensora elektrochemicznego mającym co najmniej parę usytuowanych w odstępie od siebie elektrod, znamienny tym, że przykłada się do ogniwa biosensora z utrzymywaną w nim próbką zmienne napięcie mające wybraną amplitudę i wybraną częstotliwość, mierzy się prąd wytworzony przez przyłożenie zmiennego napięcia, określa się pojemność biosensora na podstawie zmierzonego prądu, wyznacza się pole powierzchni biosensora stykające się z próbką w oparciu o wyznaczoną pojemność i wyznacza się objętość próbki w biosensorze na podstawie wyznaczonego pola powierzchni.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ponadto określa się, czy objętość próbki jest odpowiednia do zmierzenia jednej lub więcej wybranych własności próbki.

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że ponadto mierzy się stężenie jednego lub więcej wybranych analitów obecnych w próbce po określeniu, że objętość próbki jest odpowiednia.

4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że ponadto po określeniu, że objętość próbki jest nieodpowiednia, mierzy się stężenie jednego lub więcej wybranych analitów obecnych w próbce, w którym to pomiarze wyznacza się współczynnik kompensacji niezbędny do wyrównania nieodpowiedniej objętości dla dokładnego pomiaru co najmniej jednego stężenia analitu i kompensuje się tę nieodpowiednią objętość próbki.

PL 208 126 B1

5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że określenie niezbędnego współczynnika kompensacji obejmuje wyznaczenie stosunku pojemności biosensora przy całkowitym wypełnieniu próbką do pojemności biosensora przy nieodpowiedniej objętości próbki.

6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ponadto określa się oporność biosensora na podstawie zmierzonego prądu.

7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że wyznacza się pole powierzchni biosensora stykające się z próbką w oparciu o wyznaczoną pojemność i wyznaczoną oporność.

8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ponadto przykłada się napięcie prądu stałego do biosensora.

9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że napięcie prądu stałego i napięcie prądu zmiennego przykłada się jednocześnie.