PL208246B1 - Roślina jęczmienia, jej część, ziarno, potomstwo rośliny, produkt roślinny, zastosowanie produktu roślinnego i zastosowanie rośliny jęczmienia, jej części, ziarna i potomstwa - Google Patents

Roślina jęczmienia, jej część, ziarno, potomstwo rośliny, produkt roślinny, zastosowanie produktu roślinnego i zastosowanie rośliny jęczmienia, jej części, ziarna i potomstwa

Info

Publication number
PL208246B1
PL208246B1 PL363480A PL36348001A PL208246B1 PL 208246 B1 PL208246 B1 PL 208246B1 PL 363480 A PL363480 A PL 363480A PL 36348001 A PL36348001 A PL 36348001A PL 208246 B1 PL208246 B1 PL 208246B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
plant
lox
barley
leu
activity
Prior art date
Application number
PL363480A
Other languages
English (en)
Other versions
PL363480A1 (pl
Inventor
Anna Christiana Douma
Albert Doderer
Varena Cameron-Mills
Birgitte Skadhauge
Lene Molskov Bech
Nathalie Schmitt
Jolanda Carolina Heistek
Mechelen Johannes Reinier Van
Original Assignee
Carlsberg Res Lab
Heineken Tech Services
Kronenbourg Brasseries
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US09/751,687 external-priority patent/US6660915B2/en
Priority claimed from PCT/IB2000/002045 external-priority patent/WO2002053720A1/en
Application filed by Carlsberg Res Lab, Heineken Tech Services, Kronenbourg Brasseries filed Critical Carlsberg Res Lab
Publication of PL363480A1 publication Critical patent/PL363480A1/pl
Publication of PL208246B1 publication Critical patent/PL208246B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
    • C12C12/00—Processes specially adapted for making special kinds of beer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
    • C12C1/00—Preparation of malt
    • C12C1/18—Preparation of malt extract or of special kinds of malt, e.g. caramel, black malt
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
    • C12Y113/11—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of two atoms of oxygen (1.13.11)
    • C12Y113/11012—Linoleate 13S-lipoxygenase (1.13.11.12)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
    • C12C2200/00—Special features
    • C12C2200/01—Use of specific genetic variants of barley or other sources of fermentable carbohydrates for beer brewing

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Cereal-Derived Products (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Non-Alcoholic Beverages (AREA)

Description

Opis wynalazku
Niniejszy wynalazek dotyczy rośliny jęczmienia zawierającej zmutowane białko LOX-1 o obniżonej lub niewystępującej aktywności w porównaniu z nie-zmutowaną kontrolą, części takiej rośliny, jej ziarna, potomstwa, produktu roślinnego, zastosowania takiego produktu roślinnego i zastosowania rośliny jęczmienia, jej części, ziarna lub potomstwa.
Dziedzina wynalazku
Wynalazek ten dotyczy dziedziny biotechnologii roślin. Dokładniej, wynalazek dotyczy zmutowanego genu lipooksygenazy 1 jęczmienia kodującego enzym o silnie zredukowanej aktywności tworzenia kwasu 9-hydroperoksyoktadekanowego. Wynalazek dotyczy również zastosowania odmian uprawnych jęczmienia homozygotycznych pod względem lox-1 w procesie warzenia w celu zredukowania tworzenia obcego smaku w produktach warzonych, takich jak piwo, podczas przechowywania.
Stan techniki
Lipooksygenazy należą do rodziny enzymów (EC 1.13.11.12), które katalizują dioksydację wolnych i zestryfikowanych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych zawierających konfigurację 1(Z), 4(Z)pentadienową. Przez długi czas podejrzewano, że produkty reakcji katalizowanych przez lipooksygenazy są głównymi sprawcami pojawiania się nieświeżego posmaku (ang. stale flavors) w produktach żywnościowych z ziarna/nasion roślin i pochodzących z ziarna/nasion (Robinson i wsp., 1995, Food Chem., 54:33 - 43). Lipooksygenazy są również zaangażowane w wytwarzanie lotnych aldehydów heksanalowych wytwarzanych podczas obróbki soi, które cechują się niepożądanym aromatem, co ogranicza zastosowanie białek soi w produktach żywnościowych. Uważa się, że do oksydacji lipidów i tworzenia heksanali przyczyniają się trzy izoenzymy lipooksygenazy eksprymowane w nasionach soi. W celu zmniejszenia tworzenia heksanalu i poprawienia stabilnoś ci ich smaku wytworzono mutanty soi pozbawione jednego lub więcej z tych izoenzymów. Powodzenie tych eksperymentów oceniane było przez Hilderbrada i wsp., J. Agric. Food Chem., 38:1934 - 1936. Mutanty nieposiadające lipooksygenazy 3 z soi wytwarzały wyższe poziomy haksanalu, co sugeruje, że izoenzym ten przekształca 13-hydroksyperoksyoktadekanoidy, wytwarzane przez oksydację tłuszczy, w produkty nielotne. Badania polowe potrójnie-zerowych linii soi, nieposiadających wszystkich trzech lipooksygenaz z nasion wykazały, że enzymy te nie są niezbędne dla prawidłowej charakterystyki agronomicznej oraz ziarna (Narvel i wsp., 1998, Crop Sci, 38:926 - 928).
Lipooksygenazy uwikłane są również w wytwarzanie obcego smaku (ang. off-flavors) w ryżu, który może się pojawić w trakcie przechowywania ziarna. W magazynowanym ziarnie można wykryć uwalnianie wolnych kwasów tłuszczowych, co wskazuje na metabolizm rezerw trój glicerydów. Stwierdzono, że odmiana ryżu Daw Dam akumuluje mniejsze poziomy pentanali i haksanali, co skutkuje lepszą stabilnością smaku podczas przechowywania. (Susuki i wsp., 1999, J. Agric. Food Chem., 47: 1119-1124). Do tego pożądanego fenotypu przyczyniał się brak lipooksygenazy-3 z ryżu, która utlenia nienasycone łańcuchy lipidowo-acylowe z wytworzeniem pozycyjnych izomerów 9-hydroksyperoksyoktadekanowych.
Stwierdzono, że szlak lipooksygenazowy jest złożony i posiada wiele odgałęzień, a jego rola w szeregu aspektach wzrostu i fizjologii roślin nie została w pełni zrozumiana. Proponuje się, że modyfikacje szlaku lipooksygenazowego, które zmieniają aktywność 9-hydroperoksydacji w plonach nasiennych regulują ich podatność na zanieczyszczenie mykotoksyną przez Aspegillus ssp. (WO 9726364), co pozostaje w zgodzie z udziałem tego szlaku w odporności roślin na patogeny, ale nie jest związane z celami tu opisanego wynalazku.
Wśród wielu zapachowych substancji lotnych, które mają wpływ na smak piwa wyższe nienasycone aldehydy o 6 - 12 węglowym łańcuchu posiadają szczególnie niski organoleptyczny próg wyczuwalności smakowej (ang. flavor treshhold) (Meigaard 19975, MBAA Tech. Quart. 12: 151 - 168). Trans-2-nonenal, który jest członkiem tej grupy, wykazuje zarówno niezwykle niski próg wyczuwalności smakowej 0,11 ppb, jak i przyczynia się do pojawienia się nieprzyjemnego podobnego do słomianego, „kartonowego” smaku piwa. Charakterystyczny obcy smak spowodowany trans-2-nonenalem jest typową cechą piw przechowywanych 1 - 3 miesięcy lub dłużej i jest szczególnie szkodliwy dla piwa typu lager (piwa dolnej fermentacji), które warzy się z lekkimi słodami i które ma delikatny smak.
Długo uważano, że siarczyn poprawia stabilność smaku piwa nie tylko poprzez wiązanie tlenu i działanie jako antyutleniacz, ale również poprzez tworzenie lotnych dwusiarczynowych związków addycyjnych z aldehydami i ketonami obecnymi w piwie. Dwoma głównymi źródłami siarczynu w piwie są siarczyny wytwarzane podczas fermentacji drożdżowej poprzez szlak asymilacji siarki oraz siarczyny
PL 208 246 B1 dodawane do piwa przed rozlewaniem. Warunki fermentacji, które zwiększają wytwarzanie i wydzielanie siarczynów przez drożdże pozwolą na tworzenie siarczynowo-karbonylowych związków addycyjnych z karbonyli obecnych w brzeczce i zabezpieczą przed ich dalszym metabolizowaniem przez drożdże. (Dufour 1991, Proc. Eur. Brew. Conv. Congr., Lizbona, str. 209 - 216). W ten sposób karbonyle, takie jak aldehyd octowy i diacetyl, mogą zostać przeniesione do piwa. Zdolność siarczynu do zapobiegania występowaniu związku karbonylowego, trans-2-nonenalu, podczas starzenia piwa została wykazana poprzez warzenie piwa z użyciem szczepu drożdży z blokadą w szlaku asymilacji siarki. (Johannesen i wsp., 1999, Proc. Eur. Brew. Conv. Congr., Nicea, str. 655 - 662). Po butelkowaniu piwo poddano wymuszonemu starzeniu przez przechowywanie przez 7 dni w 37°C, po którym to okresie poziomy trans-2-nonenalu były dużo powyżej progu wyczuwalności smakowej. Gdy 10 ppm siarczynu dodano do nisko siarczynowego piwa bezpośrednio przed butelkowaniem znacząco zmniejszyło się występowanie trans-2-nonenalu podczas wymuszonego starzenia. Reakcja między siarczynem a karbonylem jest odwracalna i znajduje się pod kontrolą termodynamiczną i kinetyczną. Obserwowane stałe równowagi dla związków dwusiarczynowych mieszczą się w zakresie od 10-6 dla związków karbonylowych, takich jak aldehyd octowy, heksanal, dekanal, do 10-3 dla diacetylu i pirogronianu (Dufour 1991, powyżej). Podczas przechowywania piwa wymiana gazowa przez opakowanie pozwoli na wniknięcie tlenu do piwa i siarczyn zostanie utracony, tak, że słabsze dwusiarczynowe związki addycyjne ulegną dysocjacji, pozwalając na wystąpienie w piwie wolnych karbonyli. Podczas gdy siarczyny bezsprzecznie zwiększają stabilność smaku piwa, szczególnie w krótkim okresie, to jego czas utrzymywania się w zapakowanym piwie w dużym stopniu zależy od wymiany gazowej przez opakowanie i temperatury. W końcowym piwie naturalne poziomy siarczynu wytworzonego podczas fermentacji są zróżnicowane a dodanie siarczynu przed butelkowaniem nie jest uniwersalnie akceptowaną praktyką. Z tych powodów sam siarczyn nie dostarcza wiarygodnego sposobu zwiększania długoterminowej stabilności smaku piwa w różnych warunkach przechowywania piwa stosowanych na świecie.
Ogólnie rzecz biorąc przyjmuje się, że wykrywany w piwie trans-2-nonenal jest wynikiem utleniania wielonienasyconych kwasów tłuszczowych pochodzących z lipidów ziarna jęczmienia, w których 18-węglowy łańcuch kwasu tłuszczowego, kwas linolowy [klasyfikowany jako 18:2, n-6 wielonienasycony kwas tłuszczowy (Broun, Gettner i Somerville 1999, Annu. Rev. Nutr. 19: 197 - 216)] występuje najliczniej. Jednakże nie ma zgodności w literaturze w jaki sposób tworzy się trans-2-nonenal. Sugerowano obecność szlaków enzymatycznych prowadzących do tworzenia trans-2-nonenalu z wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, ale nigdy nie przedstawiono eksperymentalnie poszczególnych etapów w ziarnie jęczmienia lub podczas procesu słodowania (Gardner 1988, Adv. Cereal Sci. Technol., 9: 161 - 215). Zaproponowano koncepcję zastosowania technologii antysensownej lub współ supresji genu w celu zmniejszenia poziomów lipooksygenazy 1 w ziarnie jęczmienia i w ten sposób kontrolowania 9-hydroperoksydacji oraz zmniejszania poziomów aldehydu i alkoholu w końcowym ziarnie jęczmienia w celu kontrolowania tworzenia obcego smaku, ale wyników takiego doświadczenia nie przedstawiono (McElroy i Jacobsen, 1995, Bio/Technology 13: 245 - 249).
Opracowano test tłoczenia (ang. forcing test) jako sposób szacowania potencjału trans-2-nonenalu w piwie, w którym indukuje się tworzenie trans-2-nonenalu w brzeczce lub piwie przez poddanie próbek działaniu podwyższonych temperatur i zmniejszonego pH, (100°C, przy pH 4,0 przez 2 godziny). Próby skorelowania potencjału trans-2-nonenalu w brzeczce i końcowym piwie z całkowitym poziomem aktywności lipooksygenazy w wysuszonym słodzie wskazywały, że lipooksygenaza może przyczyniać się do występowania trans-2-nonenalu w starym piwie (Drost i wsp., 1990, J. Am. Soc. Brew. Chem. 48: 124 - 131). Wnioski, które można wysunąć z tego badania, są jednakże poważnie ograniczone faktem, że aktywność lipooksygenazy w słodzie jęczmiennym regulowano na końcu procesu słodowania przez stopień inaktywacji enzymu podczas suszenia w piecu. Zatem badano jedynie wpływ pozostającej aktywności lipooksygenazy w słodzie na potencjał trans-2-nonenalu w pochodnej brzeczce i końcowym piwie. Badanie nie pozwoliło na okreś lenie lipooksygenaz, które katalizują pierwszy etap w enzymatycznym szlaku lipooksygenazowym w ziarnie jęczmienia w trakcie rozwoju i słodowania, i ich roli jako determinant poziomów trans-2-nonenalu wykrywanych w piwie. Rzeczywiście brak odmian uprawnych jęczmienia pozbawionych jednego lub więcej izoenzymów lipooksygenazy uniemożliwił dostarczenie przekonujących dowodów na to, że szlak lipooksygenazowy w słodzie jęczmiennym odgrywa rolę w kontrolowaniu tworzenia trans-2-nonenalu. Tego rodzaju eksperymenty potrzebne są do oceny udziału szlaku enzymatycznego, w porównaniu do szlaków autooksydacyjnych/chemicznych, w tworzeniu trans-2-nonenalu w piwie. Proces warzenia wymaga etapu
PL 208 246 B1 wysokiej temperatury przy gotowaniu brzeczki, w którym uważa się, że zachodzą reakcje nieenzymatyczne (Noel i wsp., 1999, J. Agric. Food Chem. 47: 4323 - 4326).
Podsumowanie wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest roślina jęczmienia lub jej część, charakteryzująca się tym, że zawiera zmutowane białko LOX-1, przy czym aktywność LOX-1 rośliny lub części rośliny jest zmniejszona lub nie występuje w porównaniu z niezmutowaną kontrolą, i przy czym to zmutowane białko LOX-1 zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID NO: 12, w której Xaa oznacza kwas asparaginowy, kwas glutaminowy, histydynę, lizynę, argininę, treoninę, serynę, tyrozynę, tryptofan, asparaginę albo glutaminę.
Korzystnie aktywność LOX-1 obejmuje katalizę utleniania wolnych i zestryfikowanych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych oraz wielonienasyconych oktadekanowych kwasów tłuszczowych do wytworzenia pochodnych 9-hydroperoksy kwasu tłuszczowego.
Korzystnie Xaa stanowi kwas glutaminowy albo kwas asparaginowy.
Korzystniej Xaa stanowi kwas asparaginowy.
Przedmiotem wynalazku jest także ziarno lub potomstwo rośliny, charakteryzujące się tym, że zawiera zmutowane białko LOX-1, przy czym aktywność LOX-1 tej rośliny lub części rośliny jest zmniejszona lub nie występuje w porównaniu z nie-zmutowaną kontrolą, i przy czym zmutowane białko LOX-1 zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID NO: 12, w której Xaa oznacza kwas asparaginowy, kwas glutaminowy, histydynę, lizynę, argininę, treoninę, serynę, tyrozynę, tryptofan, asparaginę albo glutaminę, i przy czym ziarno lub potomstwo rośliny jest wytworzone z rośliny lub części rośliny jak określono w jednym z zastrz. 1 do 4.
Przedmiotem wynalazku jest też produkt roślinny, charakteryzujący się tym, że zawiera zmutowane białko LOX-1, przy czym aktywność LOX-1 tej rośliny lub części rośliny jest zmniejszona lub nie występuje w porównaniu z nie-zmutowaną kontrolą, i przy czym zmutowane białko LOX-1 zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID NO: 12, w której Xaa oznacza kwas asparaginowy, kwas glutaminowy, histydynę, lizynę, argininę, treoninę, serynę, tyrozynę, tryptofan, asparaginę albo glutaminę, i przy czym ten produkt roślinny jest wytworzony z rośliny lub części rośliny jak określono w jednym z zastrz. 1 do 4 albo ziarna lub potomstwa rośliny jak określono w zastrz. 5.
Korzystnie produkt ten stanowi słód.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie produktu roślinnego określonego powyżej, do wytwarzania napoju wykazującego właściwości organoleptyczne, które pozostają stabilne podczas mierzonego okresu czasu lub w podwyższonych temperaturach przechowywania w porównaniu do napoju wytworzonego z produktu roślinnego z niezmutowanej kontroli.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie rośliny jęczmienia lub jej części, ziarna lub potomstwa rośliny, lub produktu roślinnego jak określono powyżej, do wytwarzania napoju.
Przedmiotem wynalazku jest też zastosowanie rośliny jęczmienia lub jej części, ziarna lub potomstwa rośliny, lub produktu roślinnego jak określono powyżej, do wytwarzania słodu lub piwa.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie rośliny jęczmienia lub jej części, ziarna lub potomstwa rośliny, lub produktu roślinnego jak określono powyżej, do stabilizowania właściwości organoleptycznych produktu warzonego podczas mierzonego okresu czasu w porównaniu z kontrolnym produktem warzonym wytworzonym przy użyciu niezmutowanej rośliny jęczmienia lub jej części, ziarna lub potomstwa rośliny, lub produktu roślinnego.
Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie rośliny jęczmienia lub jej części, ziarna lub potomstwa rośliny, lub produktu roślinnego jak określono powyżej, do wytwarzania produktu warzonego posiadającego obniżone poziomy wolnego trans-2-nonenalu podczas mierzonego okresu czasu lub w warunkach o podwyższonej temperaturze przechowywania w porównaniu z kontrolnym produktem warzonym wytworzonym z użyciem nie-zmutowanej rośliny jęczmienia lub jej części, ziarna lub potomstwa rośliny, lub produktu roślinnego.
Wynalazek ten dostarcza odmian uprawnych jęczmienia posiadających w dużym stopniu zmniejszoną aktywność lipooksygenazy 1. W jednym wykonaniu rośliny jęczmienia według wynalazku posiadają zmutowany gen lox-1 eksprymujący zmniejszone w dużym stopniu poziomy izoenzymu lipooksygenazy 1. W alternatywnym wykonaniu rośliny jęczmienia zawierają heterologiczną sekwencję kwasu nukleinowego eksprymującą sekwencję antysensowną dla dzikiego typu lox-1, zmniejszając w ten sposób aktywność enzymu.
Jak tu wykazano słód i brzeczka wytworzone z jęczmienia o obniżonej aktywności lipooksygenazy według wynalazku, na przykład z odmian uprawnych jęczmienia homozygotycznych pod względem
PL 208 246 B1 genu lox-1, są użyteczne do wytwarzania piwa o znacząco zwiększonej stabilności smaku i obniżonych poziomach trans-2-nonenalu, zwłaszcza w warunkach o których wiadomo, że promują występowanie T2N. Wynalazek przedstawia korelację między aktywnością lipooksygenazy 1 ze słodu jęczmiennego w wytwarzaniu kwasów 9-hydroksyperoksy-oktadekadienowych (9-HPOD) a obecnością trans-2-nonenalu w piwie. Wynalazek demonstruje ponadto, że zastosowanie jęczmienia homozygotycznego pod względem zmutowanego genu lox-1 w procesie warzenia poprawia stabilność smaku piwa zarówno podczas przechowywania, jak i podczas przechowywania w podwyższonych temperaturach.
Właściwości te zwiększają jakość piwa i są użyteczne do przedłużenia ich przydatności do spożycia oraz zmniejszają potrzebę chłodzenia piwa podczas transportu i przechowywania.
Wynalazek dostarcza roślin jęczmienia i ich części o zmniejszonej aktywności lipooksygenazy 1, w tym roś liny ję czmienia eksprymują ce zmutowane biał ko LOX-1 jak tu opisano. Zgodnie z wynalazkiem opisano również sposoby wytwarzania takich roślin jęczmienia, części roślin, produktów z tych roślin a zwłaszcza produktów słodowych i piwnych wytworzonych z roślin jęczmienia według wynalazku.
Krótki opis figur
Figura 1 przedstawia wykres pokazujący wpływ inhibitora kwasu nordihydrogwajakowego (NDGA) na aktywność oczyszczonej z użyciem chromatografii immunopowinowactwa lipooksygenazy 1 i 2 z zarodków ziarna jęczmienia 3 dni po skiełkowaniu.
Figura 2 przedstawia wykres pokazujący mokrą masę rozwijającego się ziarna Linii G i cv Vintage od 5 dni po kwitnieniu do pełnej dojrzałości (FM). Każdy wynik stanowi średnią masą pojedynczego ziarna z 6 kłosów.
Figura 3 przedstawia wykres pokazujący suchą masę rozwijającego się ziarna Linii G i cv Vintage od 5 dni po kwitnieniu do pełnej dojrzałości (FM). Każdy wynik stanowi średnią masą pojedynczego ziarna z 3 próbek z 5 ziaren.
Figura 4 przedstawia wykres pokazujący całkowitą aktywność lipooksygenazy w rozwijającym się ziarnie Linii G i cv Vintage od 5 dni po kwitnieniu do pełnej dojrzałości (FM).
Figura 5 przedstawia wykres pokazujący produkty 9- i 13-HPOD utlenienia kwasu linolowego powstałe dzięki aktywności liposooksygenazy w rozwijającym się ziarnie Linii G.
Figura 6 przedstawia wykres pokazujący całkowitą aktywność lipooksygenazy w zarodkach kiełkującego ziarna Linii G i cv Vintage wyrażone jako μmol/min/10 zarodków (jednostka/10 zarodków).
Figura 7 przedstawia wykres pokazujący produkty 9- i 13-HPOD utlenienia kwasu linolowego powstałe dzięki aktywności liposooksygenazy w rozwijającym się ziarnie Linii G i cv Vintage i pokazujący poziomy 9-HPOD i 13-HPOD.
Figura 8 przedstawia Western biot pokazujący immunodetekcję lipooksygenazy 1 w zarodkach rozwijającego się ziarna Linii G i cv Vintage [dziki typ] od 5 dni po kwitnieniu do pełnej dojrzałości (FM).
Figura 9 przedstawia Western biot pokazujący immunodetekcję lipooksygenazy 1 w zarodkach się ziarna Linii G i cv Vintage [dziki typ] kiełkowanych przez 0-6 dni.
Figura 10 przedstawia Nothern biot sondowany regionem 3' nie transkrybowanym cDNA lox-1 i obrazujący transkrypty lipooksygenazy 1 wykrywane w rozwijającym się ziarnie Linii G i cv Vintage [dziki typ] od 5 dni po kwitnieniu do pełnej dojrzałości (FM).
Figura 11 przedstawia Nothern biot sondowany z regionem 3' nietranskrybowanym cDNA lox-1 i obrazujący transkrypty lipooksygenazy 1 wykrywane w zarodkach ziarna Linii G i cv Vintage [dziki typ] kiełkowanych przez 0-6 dni.
Figura 12 A - 12 G stanowi dopasowanie sekwencji nukleotydowej promotora i transkrybowanego regionu lox-1 allelu dzikiego typu cv Vintage (DT) oraz allelu Linii G (LG). W sekwencjach genowych pokreślono miejsce startu transkrypcji (+1), kodon startu ATG (+69), oraz kodon stopu dla translacji (+4231). Mutacje nukleotydowe zidentyfikowane w allelu Linii G przedstawione są za pomocą pogrubionej kursywy i wskazane gwiazdką.
Figura 13 schematycznie przedstawia gen lox-1 cv Vintage (dziki typ) oraz zmutowany gen lox-1 Linii G. Transkrypt od +1 do +4375 składa się z 7 eksonów (kropkowane kasetki) i 6 intronów (białe kasetki). Wskazano dwie mutacje genu lox-1.
Figura 14 schematycznie przedstawia kasety genowe dla krótkotrwałej ekspresji dzikiego typu cDNA lox-1 i genu lox-1 oraz zmutowanego genu lox-1 z Linii G. Sekwencje kodujące lipooksygenazę wklonowano pomiędzy konstytutywnym promotorem ubikwityny z kukurydzy z intronem 1 (Ubi-1) a terminatorem nos.
PL 208 246 B1
Figura 15 stanowi wykres słupkowy przedstawiający aktywność Lipooksygenazy 1 w aleuronowych protoplastach jęczmienia transfekowanych kasetami genowymi zawierającymi cDNA dzikiego typu lox-1; zmutowany gen lox-1 z Linii G; gen DT lox-1oraz kontrolny gen reporterowy GUS. Aktywność lipooksygenazy w ekstraktach transfekowanych protoplastów oznaczano na płytkach do mikromianowania przez utlenianie KI i oznaczano ilościowo spektrofotometrycznie. Aktywność lipooksygenazy wyrażono jako jednostki na μg białka w ekstrakcie i przedstawiono jako średnią z 3 pomiarów z dwóch powtórzonych oznaczeń.
Figura 16 stanowi dopasowanie sekwencji wykazujące, że RFLP między dzikiego typu a zmutowanym genem lox-1 wynika z mutacji punktowej nukleotydu 2347, tworzącej dodatkowe miejsce cięcia dla enzymu restrykcyjnego AatII.
Figura 17 schematycznie przedstawia fragmenty PCR lox-1 zamplifikowane i cięte w łańcuchowej reakcji polimerazy - oznaczeniu cięcia zamplifikowanego miejsca polimorficznego (PCR-CAPS). Pozycje starterów do PCR wskazano strzałkami a miejsca Aat II przedstawiono powyżej genu (pozycja sekwencyjna). Regiony eksonów i intronów w obrębie produktów PCR rozróżniono oznaczeniem jako odpowiednio kropkowane lub białe kasetki oraz przedstawiono wielkości fragmentów trawienia Aat II.
Figura 18 stanowi obraz agarozowego żelu elektroforetycznego przedstawiający fragmenty PCR lox-1 (652 pz) zamplifikowane w pierwszym etapie oznaczenia PCR-CAPS na matrycy genomowego DNA Linii G i cv Vintage.
Figura 19 stanowi obraz agarozowego żelu elektroforetycznego przedstawiający RFLP wykryty przez PCR-CAPS w dzikiego typu i zmutowanym genie lox-1. Fragmenty trawienia Aat II zmutowanego genu obejmują unikalny fragment restrykcyjny 313 pz wskazany gwiazdką.
Figura 20 stanowi tabelę przedstawiającą program krzyżowania wstecznego dla pojedynczej recesywnej pary genowej ll (cecha niskiej aktywności lipooksygenazy) Linii G do cv Alexis. Genotyp LL stanowią rośliny eksprymujące aktywność lipooksygenazy dzikiego typu (allel dominujący), genotyp ll stanowią rośliny o niskiej aktywności lipooksygenazy (allel recesywny). LI stanowią heterozygotyczne rośliny zawierające zarówno allel dzikiego typu jak i allel niskiej aktywności lipooksygenazy. Ponieważ cecha niskiej aktywności lipooksygenazy jest cechą recesywną rośliny LI wykazują aktywność lipooksygenazy dzikiego typu. Po każdej rundzie krzyżowania wstecznego (włączając samozapylenie), oczekuje się, że potomstwo ll będzie stanowiło 25% potomstwa. Wskazano zaobserwowane częstotliwości występowania niskiej aktywności lipooksygenazy. Obliczony odsetek genetycznego tła o niskiej aktywności lipooksygenazy dla cv Alexis oznaczono jako % Alexis.
Figura 21 pokazuje agarozowy żel elektroforetyczny przedstawiający wykrywanie przez PCRCAPS zmutowanego genu lox-1 w potomstwie ll z programu krzyżowania wstecznego Linii G - Alexis. PCR-CAPS na genomowym DNA Linii G (linia 2), cv Vintage (linia 3), potomstwa ll trzeciej (linia 4) i czwartej (linie 5-9). Drabinka DNA (linia 1). Kontrola, krzyżowana wstecznie linia z wysoką aktywnością lox (linia 10).
Figury 22A - 22B stanowią porównawcze dopasowanie sekwencji aminokwasowych lipooksygenaz z soi LOX-1 (Gm1), LOX-2 (Gm2), LOX-3 (Gm3) oraz lipooksygenaz z jęczmienia LOX-1 (Hv1) i LOX-2 (Hv2).
Szczegółowy opis wynalazku
Zgodnie z wynalazkiem opisano materiały roślinne, produkty roślinne oraz sposoby wytwarzania napoju, takiego jak piwo, przy czym piwo posiada zmniejszoną zawartość związku przyczyniającego się do obcego smaku, trans-2-nonenalu, tak, że stabilność smaku napoju, np. piwa, w trakcie przechowywania i wystawienia na działanie podwyższonych temperatur jest poprawiona w stosunku do kontrolnego napoju. Dokładniej, wynalazek dostarcza odmian jęczmienia, którego rozwijające się i kiełkujące ziarno wytwarza znacząco zmniejszone poziomy enzymu lipooksygenazy 1, oznaczonej LOX-1, którego zastosowanie, na przykład, w procesie warzenia piwa skutkuje wytworzeniem piwa o zmniejszonych poziomach trans-2-nonenalu w porównaniu do kontrolnej odmiany jęczmienia.
Poniżej opisano sposoby stosowane do wytwarzania, charakteryzowania i oceny odmiany jęczmienia o znacząco obniżonej aktywności LOX-1 oraz zastosowania tego typu jęczmienia do wytwarzania piwa o stabilnym smaku.
1. Definicje
Następujące, użyte tu terminy posiadają wskazane definicje:
„Część rośliny” oznacza roślinę lub specyficzną część rośliny, taką jak łodyga, liście, korzenie, kwiaty, nasiona, ziarna, owoce lub pąki.
PL 208 246 B1 „LOX-1” oznacza białko lipooksygenazy 1; „lox-1” oznacza gen kodujący LOX-1.
„Zmutowany lox-1 z jęczmienia” oznacza poddany mutagenezie gen z jęczmienia kodujący zmutowany polipeptyd lipooksygenazy 1.
„Niezmutowana kontrola” oznacza roślinę, kwas nukleinowy, gen, polipeptyd, część rośliny lub produkt roślinny zawierający dzikiego typu gen lub białko.
„Heterologiczny” oznacza sekwencję niewystępującą naturalnie (nienatywną), np. sekwencję pochodzącą z innego gatunku, wytworzoną rekombinacyjnie lub sekwencję sztuczną, która różni się od sekwencji natywnej.
„Produkt roślinny” oznacza produkt będący wynikiem obróbki rośliny lub części rośliny i obejmuje, na przykład, słód i brzeczkę.
„Aminokwas kwasowy” oznacza kwas asparaginowy lub glutaminowy.
„Aminokwas zasadowy” oznacza histydynę, lizynę lub argininę.
„Aminokwas polarny” oznacza treoninę, serynę, tyrozynę, tryptofan, asparaginę lub glutaminę.
„Właściwości organoleptyczne” oznaczają właściwości ujawniające się zmysłom węchu i smaku, które są analizowane, na przykład przez wyszkolony zespół degustatorów.
„Produkt warzony” oznacza produkt wytworzony przez zacieranie, gotowanie i fermentowanie, np. piwo.
„Zmniejszony trans-2-nonenal” oznacza mniej niż około 50% w porównaniu z warunkami dzikiego typu (kontrolnymi).
2. Aktywność lipooksygenazy
Enzymy lipooksygenazy katalizują utlenianie wielonienasyconych kwasów tłuszczowych. Znane są izoenzymy LOX-1 i LOX-2 jęczmienia. LOX-1 zasadniczo katalizuje 9-hydroperoksydację, podczas gdy LOX-2 zasadniczo katalizuje 13-peroksydację wielonienasyconych oktadekanowch kwasów tłuszczowych. Dane ukazane w przykładach poniżej przedstawiają korelację pomiędzy aktywnością 9-hydroperoksydacji LOX-1 jęczmienia a obecnością trans-2-nonenalu w piwie. Zgodnie z tym jęczmień o zmniejszonej aktywnoś ci LOX-1 jest użyteczny do wytwarzania piwa o zmniejszonym poziomie i/lub potencjale trans-2-nonenalu w porównaniu z kontrolą .
3. Wytwarzanie jęczmienia o niskiej aktywności lipooksygenazy
Do wytworzenia roślin według wynalazku można zastosować szereg różnych podejść genetycznych, to jest do zmniejszenia poziomu aktywności enzymatycznej lipooksygenazy 1 eksprymowanej w roślinie jęczmienia w stabilny, dziedzicznie przekazywany sposób. Podejścia te obejmują, ale bez ograniczania, technologię antysensowną i mutagenezę, taką jak mutageneza indukowana chemicznie lub promieniowaniem, jak również mutageneza ukierunkowana.
Transformacja jęczmienia. Jęczmień można transformować różnymi cząsteczkami kwasu nukleinowego zaprojektowanymi do manipulowania ekspresją genu lox-1 lub zmiany architektury genu lox-1. Do udanego wprowadzania kwasów nukleinowych do komórki jęczmienia, na przykład protoplastu, kalusa lub zarodka można stosować różne sposoby na przykład transfer z udziałem Agrobaeterium tumofaciens (Tingay i wsp., 1997, Plant J., 11: 1369 - 1376), bombardowanie cząsteczkowe (Wan i Lemaux, 1994, Plant Physiol., 104: 37 - 48) lub pobieranie DNA wywoł ane glikolem polietylenowym PEG (Funatsuki i Kihara, 1995, Theor. Appl. Genet., 91: 707 - 712).
Do kierowania ekspresją genu będącego przedmiotem zainteresowania można zastosować różne promotory. Do ekspresji wektorów zawierających lox-1, włączając sekwencje antysensowne, można zastosować natywny region promotorowy lox-1. Sekwencja promotorowa lox-1 zawarta jest między nukleotydami 2602 - 3511, obejmując region 5' UTR o numerze dostępu EMBL U83904. Alternatywnie można zastosować promotory, które kierują ekspresją genu będącego przedmiotem zainteresowania konstytutywnie, na przykład promotor ubikwityny Ubi. 1 (Wan i Lemaux, powyżej; Kjaerulff i wsp., w P. Mathis wyd. 1995, Photosynthesis: from light to Biosphere, tom II, 151 - 154). Wektory ekspresyjne mogą również zawierać region terminacji transkrypcji, na przykład terminator 3' genu syntazy nopaliny (3' nos) (Bevan i wsp., 1983, Nuci. Acids res., 11: 369 - 385) poddano fuzji z genami eksprymowanymi w transgenicznym jęczmieniu (Wan i Lemaux, powyżej; Funatsuki i Kihara, powyżej).
Wektory ekspresyjne mogą również zawierać gen pozwalający na selekcję stransformowanych komórek, w przypadku gdy wektor z powodzeniem uległ integracji do komórki. Geny te mogą kodować antybiotyk lub geny oporności na herbicyd, na przykład gen fosfotransferazy neomycyny (npt) lub acetylotransferazy fosfinotrycyny (bar). Gdy takie geny oporności ulegają ekspresji pozwalają na wzrost
PL 208 246 B1 transformowanej komórki w pożywkach zawierających odpowiednio neomycynę lub bialafos. (Patrz na przykład Wan i Lemaux, powyżej; Funatsuki i Kihara, powyżej; Kjaerulff i wsp., w P. Mathis, powyżej).
Po transformacji komórki można hodować w pożywkach selekcyjnych przez pewien okres czasu a nastę pnie moż na je hodować tak, aby pozwolić na tworzenie kieł ków, nastę pnie systemów korzeniowych a następnie roślin. Udana procedura transformacji jęczmienia została opracowana przez Funatsuki i Kihara (powyżej), w której transformacja protoplastów jęczmienia przez PEG wektorami ekspresyjnymi zawierającymi fosfotransferazę neomycyny i następnie selekcja z użyciem neomycyny w efekcie pozwoli ł a na otrzymanie pł odnych roś lin zawierają cych transgen. Wykazano, ż e transgen integrował do genomu a większość roślin transgenicznych wykazywała ekspresję białka kodowanego przez transgen.
Zrozumiałym jest, że wiele różnorodnych sposobów transformacji, wektorów ekspresyjnych, promotorów, markerów selekcyjnych i tym podobnych jest znanych i użytecznych do zastosowania do transformowania jęczmienia.
Mutageneza jęczmienia. Gen lox-1 może być namierzony do mutagenezy ukierunkowanej z uż yciem oligonukleotydów RNA/DNA. Wykazano, że te chimeryczne oligonukleotydy RNA/DNA z powodzeniem wprowadzają mutacje do komórek roślinnych (Zhu i wsp., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci., 96: 8168 - 8773; i Beetham i wsp., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci., 96: 8774 -8778) oraz komórek ssaczych (Yoon i wsp., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci., 93: 2071 - 2076) w pożądanych położeniach. Chimeryczne oligonukleotydy RNA/DNA mogą być transformowane do protoplastów jęczmienia lub komórek będących przedmiotem zainteresowania szeregiem różnych sposobów opisanych powyżej, na przykład transformacji z PEG lub transformacji z udziałem bombardowania cząsteczkowego. Pojedyncze protoplasty lub komórki mogą być następnie regenerowane z użyciem hodowli tkankowej do całych płodnych roślin a zajście mutacyjne można potwierdzić z użyciem podejścia opartego na PCR jak szczegółowo opisano w Przykładach poniżej.
Ten sposób ukierunkowanej mutagenezy można zastosować do zmutowania specyficznych miejsc w genie lox-1. Gen lox-1 może zostać zmutowany w jednym lub więcej pozycjach nukleotydowych w regionie promotorowym aby obniżyć lub znieść transkrypcję lox-1. Specyficzną mutagenezę można również zastosować do wprowadzenia zmian w regionie kodującym lox-1, które na przykład zmniejszają aktywność enzymu. Takie mutacje obejmują, ale bez ograniczenia, insercje, delecje, substytucje, skutkujące przesunięciem ramki odczytu, skróceniem białka LOX-1 i/lub zmianą natury obojętnej i hydrofobowej kieszeni substratowej enzymu.
Ekspresja antysensowna. Zmniejszenie ekspresji lox-1 można również osiągnąć poprzez ekspresję konstruktu antysensownego lox-1 w komórkach jęczmienia. Donoszono o sposobach ekspresji konstruktów antysensownych w jęczmieniu w celu zmniejszania ekspresji docelowego białka, na przykład w Gilphin, M.J. i wsp., 1998, W: Photosynthesis: Mechanisms and Effects, G. Grab, wyd., Tom IV, 2983 2986; Kjaeruff i wsp., 1995, W: Photosynthesis: from Light to Biosphere, P. Mathis, Wyd., Tom II, 151 - 154.
Komórki jęczmienia można transformować konstruktem ekspresyjnym zawierającym antysensowna sekwencję kwasu nukleinowego. Konstrukt ekspresyjny wytwarza cząsteczkę anysensownego RNA zdolną do specyficznego wiązania się do przynajmniej części mRNA wytworzonego z dzikiego typu genu lox-1, poprzez komplementarne parowanie się zasad oraz zdolny do przerwania składania pre-mRNA lub translacji tego mRNA. Ekspresja antysensownej cząsteczki kwasu nukleinowego może być kierowana przez promotor konstytutywny lub tkankowo/czasowo specyficzny, na przykład opisany powyżej promotor lox-1 z jęczmienia.
Mutageneza chemiczna. Do mutagenezy jęczmienia powszechnie stosowany był chemiczny mutagen, azydek sodu, (NaN3) i wiadomo, że wprowadzał do sekwencji DNA (kwas nukleinowy) genomu jęczmienia stabilne mutacje (Olsen i wsp., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 8043 - 8047). Do indukowania mutacji DNA można użyć również inne chemiczne mutageny, na przykład metanosulfonian etylu (EMS), azydoglicerol (AG, 3-azydo-1,2-propanediol), metylo-nitrozomocznik (MNU), hydrazyd maleinowy (MH) (Rank, J. i wsp., 1997, Mutat. Res. 390: 121 - 7), jak również promieniowanie UV.
Jak pokazano w poniższych Przykładach ziarno odmian uprawnych jęczmienia (cv) Vintage i Caruso traktowano azydkiem sodu i propagowano przez samozapylenie do trzeciego pokolenia (M3).
4. Identyfikacja i selekcja jęczmienia o niskiej aktywności lipooksygenazy.
Identyfikację i selekcję roślin jęczmienia posiadających zmniejszoną aktywność izoenzymu lipooksygenazy w ziarnie można przeprowadzić, na przykład poprzez analizę aktywności lipooksygenazy.
PL 208 246 B1
Do oznaczania aktywności dwóch głównych lipooksygenaz o których wiadomo, że występują zarówno w dojrzałym jak i kiełkującym ziarnie, LOX-1 i LOX-2, można zastosować oznaczenia enzymatyczne. Takie oznaczenia powinny rozróżniać aktywność LOX-1 od aktywności LOX-2.
Jedno wybiórcze oznaczenie LOX-1 i LOX-2 opiera się na utlenianiu wielonienasyconego kwasu tłuszczowego przez lipooksygenazę i detekcji spektrofotometrycznej produktu hydronadtlenkowego takiego utleniania. Specyfika tego oznaczenia wykorzystuje porównawczą niewrażliwość LOX-1 na inhibitor, na przykład NDGA, w odniesieniu do LOX-2.
Wybiórcze oznaczenie można również osiągnąć przez immunoprecypitację aby selektywnie usunąć LOX-1 lub LOX-2 z oznaczenia. Specyficzne przeciwciała anty- LOX-1 lub anty-LOX-2, na przykład przeciwciała monoklonalne, można wytworzyć z oczyszczonych LOX-1 lub LOX-2 jak opisano w Holtman i wsp., 1996, powyżej.
Te sposoby oznaczania mogą być przystosowane do procedur oznaczeń na płytkach do mikromianowiania lub innych znanych, powtarzalnych, wysokowydajnych formatów oznaczeniowych, pozwalając na szybkie przeszukiwanie wielu próbek. Jakość tych oznaczeń można ocenić poprzez przeszukiwanie wąsów roślinnych kiełkującego ziarna w sposób nieuszkadzający, tak że wyszukane przy przeszukiwaniu sadzonki mogą być dalej propagowane.
Utratę aktywności LOX-1 przez przypuszczalne mutanty można potwierdzić oznaczeniem aktywności enzymatycznej. Na przykład ekstrakty z ziarna można inkubować z kwasem linolowym i analizowa ć produkty utleniania kwasu linolowego, na przykł ad przez HPLC w odwróconej fazie. Względne ilości 9-HPOD i 13-HPOD wytworzonych z kwasu linolowego stanowi miernik aktywności LOX-1, której głównym produktem jest 9-HPOD.
Jak pokazano w Przykładach poniżej w przybliżeniu 20000 ziarna Pokolenia M3 zmutagenizowanego cv Vintage i Caruso przeszukano ze względu na aktywność LOX-1 i LOX-2 z użyciem oznaczenia utleniania w obecności inhibitora, a także z użyciem oznaczeń immunoprecypitacyjnych. Z uż yciem tych sposobów przeszukiwania wyszukano mutanta cv Vintage o znacznym zmniejszeniu aktywności LOX-1 i oznaczono go jako Linia G. Zmutowany fenotyp dziedziczony był w pokoleniach M4 i M5.
Nasiona wytworzone z jęczmienia Linii G zdeponowano 4 stycznia 2001 roku w Narodowych Kolekcjach Bakterii Przemysłowych, Spożywczych i Morskich (National Collections of Industrial, Food and Marinę Bacteria, NCIMB), Machar Drive, Aberdeen, Szkocja, UK, zgodnie z Traktatem budapeszteńskim jako Numer Dostępu: NCIMB 41078.
5. Sekwencje genetyczne
Dokładny opis zmiany genotypowej, która ma znaczenie dla fenotypu o niskiej aktywności lipooksygenazy w roślinach jęczmienia według wynalazku użyteczny jest do identyfikowania roślin posiadających tę zmianę genetyczną i do krzyżowania tej cechy do innych odmian uprawnych jęczmienia w programie hodowlanym. Do oceny podstaw genetycznych fenotypu o niskiej aktywnoś ci lipooksygenazy można zastosować różnorodne sposoby molekularne i biochemiczne.
Ogólnie wiadomo, że zarówno sekwencje genetyczne działające w cis, jak i trans mogą determinować ekspresję danego genu w genomie oraz aktywność produktu genu. Punkty kontrolne ekspresji genu obejmują regulację czasu trwania, specyficzności tkankowej i szybkości transkrypcji genu, stabilności transkryptu i szybkości translacji transkryptu.
Zarówno poziom ekspresji genu, stabilność i specyficzna aktywność kodowanego enzymu będzie determinować poziom aktywności enzymu wykrywany w tkance.
Zmiany w sekwencji roślinnego genu można oszacować przez sekwencjonowanie DNA istotnych części genomu, podczas gdy analiza metodą Northern zapewnia narzędzia do monitorowania poziomów stabilnego konstruktu w danej tkance roślinnej. Enzym ulegający ekspresji w tkance roślinnej można ocenić przez ekstrakcję enzymu z tkanki i pomiar aktywności enzymatycznej.
Jak pokazano w Przykładach poniżej tożsamość zmian genetycznych, które determinują fenotyp mutanta Linii G o niskiej aktywności lipooksygenazy indukowany w cv Vintage określono w następujący sposób. Gen strukturalny kodujący białko LOX-1 zarówno w rodzicielskim cv Vintage jak i w Linii G zamplifikowano z użyciem łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) a sekwencje powyż ej promotora, które regulują ekspresję genu, jak również całą sekwencję kodującą obejmującą sekwencje intronowe i eksonowe zsekwencjonowano.
Porównanie sekwencji nukleotydowych genu lox-1 z Linii G i dzikiego typu cv Vintage ujawniło substytucje nukleotydowe w 2 eksonach, z których jedna (w pozycji +2347) doprowadziła do niekonserwatywnej substytucji aminokwasowej (glicyna 368 asparaginian) w eksprymowanym białku.
PL 208 246 B1
Figura 22 przedstawia dopasowanie lipooksygenaz z soi (Gm: Glycine max) LOX1 (Nr dostępu P08170), LOX2 (Nr dostępu P08170), LOX3 (Nr dostępu AAB41727) i lipooksygenaz z jęczmienia (hv:Hordeum vulgare) LOX1 (Nr dostępu P29114) i LOX2 (Nr dostępu AAB70865.1). Konserwowane reszty aminokwasowe i konserwowane substytucje aminokwasów obdarzonych ładunkiem przedstawiono pogrubioną czcionką. Dopasowania struktury drugorzędowej dla LOX3 z soi Glycine max, w których H = alfa helisy a E= beta kartki przedstawione są powyżej dopasowania, a reszty istotne dla funkcjonowania enzymu (zidentyfikowane gwiazdką lub wypełnionym kółkiem) przedstawiono jak opisano w Skrzypczak-Jankun i wsp., 1997, Proteins 29: 15 - 31.
Reszty aminokwasowe, które uczestniczą w wiązaniu żelaza nie-hemowego lub zasadnicze dla katalizy (*) w LOX3 z soi obejmują: H518, H523, H709 [atomy 3N]; N713, I857. Równoważne reszty w LOX1 z jęczmienia to H517, H522, H708, N712 i I862. Reszty w LOX3 z soi o przewidywanej roli w katalizie (•) stanowią: H266, H513, H766, F264, F272, F714, W519, R552, R726, D766, D779, K278. Równoważne reszty w LOX1 z jęczmienia to H261, H512, H775/ F259, F267, F713, W518, R551, R725, D778 i K278.
Reszty proliny ( + ) (P86, 109, 167, 171, 223, 234, 291, 311, 324, 343, 345, 371, 381, 382, 486, 541, 548, 600, 616, 627, 658, 726, 734, 788, 829, 833, 839, 857) i glicyny (G49, 67, 68, 70, 91, 107, 137, 187, 192, 210, 217, 218, 260, 306, 307, 336, 392, 409, 458, 474, 490, 569, 607, 674, 676, 720, 736, 783, 828, 850, 855) zlokalizowane w pętlach i pozycjach przykrywających helisę w strukturze drugorzędowej białka mogą ułatwiać ostre skręty i zwijanie szkieletu peptydowego.
Dopasowania pokrewnych lipooksygenaz soi wskazywały, że glicyna-368 w LOX-1 jęczmienia jest silnie konserwowana. Co więcej reszta ta, odpowiadająca glicynie-353 w LOX-1 soi, jest jedną z 35 wysoce konserwowanych reszt na 58 reszt wyścielających kieszeń substratowa II enzymu, jak widać ze struktury jej kryształu. Te konserwowane reszty są wyróżnione (kasetki) w dopasowaniu sekwencji lipooksygenaz roślinnych przedstawionym na Fig. 22 (Minor i wsp., 1996, Biochemistry 35: 10687 - 10701) i obejmują następujące reszty LOX-1 jęczmienia: Y224, L268, W355, E364, G368, V369, N370, I374, L424, L499, K501, A502, V504, D508, S509, H512, Q513, L514, H517, W518, H522, I556, L559, A560, L564, I565, 1570, T574, S585, Q715, Y718, N724, R725, P726, T727, L772 i I862. Wszystkie z 35, z wyjątkiem 7, konserwowanych reszt są resztami obojętnymi lub hydrofobowymi. Substytucja obdarzonej ładunkiem reszty w pozycji glicyna-368 w jęczmieniu lub innej konserwowanej hydrofobowej lub obojętnej reszty wyściełającej kieszeń substratowa II przypuszczalnie zaburzy strukturalne i funkcjonalne właściwości enzymu. Mutacja G D368 LOX1 Linii G jęczmienia (♦) zlokalizowana jest pomiędzy helisą alfa H6 a harmonijką beta E12.
Jak pokazano na Fig. 22 rodzina enzymów lipooksygenaz cechuje się wysokim stopniem konserwowania sekwencji, co znajduje odzwierciedlenie w ich konserwowanej strukturze drugorzędowej, określonej dla kilku członków rodziny lipooksygenaz roślinnych, włączając LOX1 i LOX3 z soi (Skrzypczak-Jankun i wsp., 1997, powyżej). LOX1 z jęczmienia cechuje się 56,9% identycznością sekwencji oraz 67,8% podobieństwem sekwencji do LOX3 z soi. Kilka reszt aminokwasowych w izoenzymie LOX3 z soi zidentyfikowano jako ligandy dla żelaza nie-hemowego lub sugeruje się, że są zasadnicze dla jej aktywności (oznaczone przez * •). W świetle silnego konserwowania sekwencji między LOX1 z jęczmienia a LOX3 z soi nie bezzasadnym będzie przewidywanie, że reszty w sekwencji LOX1 z jęczmienia, które są homologiczne do tych zidentyfikowanych jako ważne dla funkcjonowania LOX3 mogą być również istotne dla jej aktywności enzymatycznej. Zatem, niekonserwatywne substytucje aminokwasowe w dowolnej z tych pozycji, włączając substytucje tych reszt w LOX1 z jęczmienia odpowiadających 35 wysoce konserwowanym resztom LOX3 z soi, które wypełniają kieszeń substratowa oraz w innych pozycjach istotnych dla funkcjonowania enzymu, prawdopodobnie zmniejszą aktywność lipoksygenazy.
Wiadomo, że reszty aminokwasowe proliny i glicyny ułatwiają zwroty szkieletu peptydowego, gdy zlokalizowane są pomiędzy elementami struktury drugorzędowej, które pozwalają na przyjęcie przez białko zwiniętej trzeciorzędowej struktury. Reszty proliny i glicyny są również powszechne w motywach przykrywających helisę (Parker i Hefford, 1997, Protein Eng., 10: 487 - 496, http://www.expasy.ch). Pojedyncza niekonserwatywna substytucja w LOX1 Linii G, w której glicyną zlokalizowaną pomiędzy dwoma przewidywanymi elementami strukturalnymi zastąpiono asparaginianem doprowadziła do znaczącej utraty aktywności enzymatycznej. Przewiduje się zatem, że mutacja w genie LOX1 wywołująca niekonserwatywne substytucje aminokwasowe w jednym lub wielu resztach proliny lub glicyny w LOX1 z jęczmienia zlokalizowanych w regionach poza elementami strukturalnymi może w podobny sposób zapobiegać zwijaniu natywnego białka i w konsekwencji zmniejszać aktywność kodowanego enzymu.
PL 208 246 B1
Zatem, w jednym wykonaniu użyteczna roślina zmutowanego jęczmienia o zmniejszonej aktywności lipooksygenazy 1 według wynalazku zawiera zmutowaną sekwencję kwasu nukleinowego, która zmienia obojętną lub hydrofobową naturę kieszeni substratowej enzymu poprzez insercję jednego lub więcej kwasowego, zasadowego lub polarnego aminokwasu. Na przykład, użyteczna sekwencja kwasu nukleinowego [SEQ ID NO: 11] koduje białko LOX-1 z jęczmienia (SEQ ID NO:12] posiadające substytucję aminokwasu w pozycji 368 z glicyny do Xaa, przy czym Xaa oznacza aminokwas kwasowy, zasadowy lub polarny. Jedną specyficzną sekwencją aminokwasową zmutowanej LOX-1 z jęczmienia według wynalazku stanowi sekwencja, w której Xaa stanowi kwas asparaginowy, np. Linia G.
Jak pokazano w Przykładach poniżej zmiany genotypowe w Linii G nie mają żadnego wykrywalnego wpływu na ekspresję genu lox-1 ale aktywność LOX-1 wykrywana w dojrzałym i kiełkującym ziarnie Linii G stanowiła w przybliżeniu 9% aktywności wykrywanej w ziarnie linii rodzicielskiej, cv Vintage. W celu dostarczenia bezpośredniego dowodu, że mutacja aminokwasową w LOX-1 Linii G była odpowiedzialna za fenotyp o niskiej aktywności LOX-1, poddano przejściowej ekspresji w protoplastach z aleuronu jęczmienia sekwencję kodującą lox-1 Linii G i lox-1 cv Vintage, i wykazano znacząco zmniejszoną aktywność zmutowanego enzymu LOX-1 w porównaniu z enzymem LOX-1 dzikiego typu.
6. Transfer pomiędzy liniami hodowlanymi
Wykrywanie zmian cechy genetycznej roślin jęczmienia genotypu według wynalazku jest użyteczne do wykrywania obecności specyficznej genetycznej cechy w linii jęczmienia oraz do ułatwienia transferu tej cechy pomiędzy liniami hodowlanymi w programie hodowlanym. Dostępnych jest dużo różnorodnych narzędzi molekularnych do wykrywania zmian w sekwencji genomowej. Metody takie obejmują, ale bez ograniczenia, wykrywanie polimorfizmów długości fragmentów restrykcyjnych (Gebhard i Salamini 1992, Int. Rev. Cytology., 135: 201 - 237), sposoby wykrywania oparte na ilościowej reakcji PCR, takie jak amplifikacja z użyciem starterów fluorescencyjnych, np. Systemów sondy starterowej TagMan (Ibraham i wsp., 1998, Anal. Chem., 70, 2013 - 2017). Wybór sposobu wykrywania będzie zależał od specyficznej cechy genetycznej, ale dogodnie powinien być szybki i dostarczać jasno interpretowalnych danych.
Jak pokazano w Przykładach poniżej, oznaczenie PCR-Cięcia Zamplifikowanego Miejsca Polimorficznego (ang. PCR-Cleavage Amplified Polimorphic Site, PCR-CAPS) zapewniło wykrywanie zmutowanego genu lox-1 Linii G. Substytucja nukleotydowa w genie lox-1 Linii G w pozycji +2347 wprowadziła dodatkowe miejsce rozpoznawane przez endonukleazę restrykcyjną Aat ll, które może być wykrywane przy pomocy oznaczenia PCR-CAPS. Odpowiednie sposoby wykrywania lox-1 nie są ograniczone do tego oznaczenia, ale równie dobrze mogą być oparte na technologii TaqMan i innych znanych sposobach wykrywania.
Jak pokazano w Przykładach poniżej, oznaczenie PCR-CAPS zastosowano do 4 pokoleń materiału hodowlanego z programu krzyżowania wstecznego, w którym fenotyp o niskiej aktywności lipooksygenazy w Linii G był systematycznie krzyżowany wstecznie do cv Alexis. Wykazano, że dziedziczenie fenotypu o niskiej aktywności lipooksygenazy następuje po dziedziczeniu genu lox-1 a fenotyp określono jako recesywny i obserwowano go jedynie w liniach homozygotycznych pod względem genu lox-1.
W zwią zku z tym, potomstwo roś liny wedł ug wynalazku obejmuje linie hodowlane, na przykł ad pochodzące z programu krzyżowania wstecznego, które zawierają zmutowany lox-1 i wykazują fenotyp o niskiej aktywności lipooksygenazy.
7. Warzenie
Rośliny jęczmienia według wynalazku, w tym potomstwo rośliny, ziarno i produkty roślinne, takie jak słód i brzeczka, o niskiej aktywności lipooksygenazy 1 przedstawiono tu jako użyteczne do wytwarzania napoju o obniżonych poziomach wolnego trans-2-nonenalu w czasie mierzonego okresu czasu lub w warunkach podwyższonej temperatury przechowywania w porównaniu do napoju wytworzonego z kontrolnej odmiany ję czmienia dzikiego typu. W celu przeprowadzenia tych porównań kontroluje się zawartość siarczynu w piwie na poziomie 5 ppm lub niższym, ponieważ stwierdzono, że wyższe poziomy siarczynu na etapie butelkowania będą czasowo opóźniały pojawienie się wolnego trans-2-nonenalu. Na przykład piwo warzone ze słodu uzyskanego ze zmutowanego jęczmienia Linii G tu opisanego posiadało ustabilizowane właściwości organoleptyczne w czasie mierzonego okresu czasu w porównaniu z piwem warzonym ze sł odu uzyskanego z kontrolnego nie-zmutowanego ję czmienia.
Próby warzenia i ocena butelkowanego piwa dostarczają najlepszego sposobu oceniania wpływu różnych składników na jakość i stabilność końcowego piwa. Do przetestowania wpływu różnych słodów jęczmiennych potrzeba wystarczającej ilości ziarna aby przeprowadzić próby słodowania
PL 208 246 B1 i warzenia na skalę pilotażową oraz pół-przemysłową. Podczas okresu propagacji jęczmienia można ocenić polową wydajność linii jęczmienia. Właściwości słodowania linii jęczmienia można ocenić w trakcie słodowania na skałę pilotażową lub pół-przemysłową i powinny się one dogodnie mieścić w krajowych rekomendacjach dotyczących jakości słodowania np. Europejskiej Konwencji dotyczącej Warzenia (ang. European Brewing Convention) (Analytica-EBC/ European Brewing Convention, 1998, Publ. Hans Carl Getranke-Fachverlag, Nijrnberg, Niemcy). Po warzeniu na skalę pilotażową lub półprzemysłową piwo pakuje się do brązowych butelek i schładza do 5 °C dla optymalnego przechowywania. Na tym etapie świeże piwo może być zanalizowane przez zespół wyszkolonych degustatorów zdolny do wykrycia specyficznych smaków piwa, w tym obcego smaku związku trans-2-nonenalu. Ponadto, piwo analizuje się chemicznie pod względem głównych składników, w tym trans-2-nonenalu. Te sposoby analizy jakości piwa stosuje się ponownie po przechowywaniu w różnych warunkach, o których wiadomo, że ujawniają długoterminową stabilność w przechowywaniu piwa, na przykład poddawane wymuszonemu starzeniu.
Jak pokazano w Przykładach poniżej jęczmień Linii G propagowano w warunkach polowych przez kilka sezonów aby poddać słodowaniu 10 ton tej linii w słodowni przemysłowej. Kontrolne odmiany jęczmienia cv Vintage i cv Nevada obydwie o fenotypie typu dzikiego słodowano w podobnych warunkach. Suszony słód z Linii G i kontrolnych odmian uprawnych jęczmienia mieścił się w specyfikacjach wymaganych dla prób warzenia na skalę pół-przemysłową.
Próby warzenia przeprowadzono w skali 30 hl a ocena świeżo butelkowanych piw ujawniła, że piwa warzone z zarówno Linii G jak i kontrolnych odmian uprawnych posiadały zawartość trans-2-nonenalu poniżej progu wyczuwalności smakowej i zostały uznane za satysfakcjonujące przez zespół degustatorów. Aby ocenić stabilność smaku piwa zastosowano dwie procedury poddawania wymuszonemu starzeniu, albo przechowywanie w 37°C przez 7 dni albo przechowywanie w 30°C przez 6-12 tygodni. Stabilność smaku piwa warzonego ze słodu Linii G okazała się najlepsza w porównaniu ze słodem kontrolnym, zarówno z uwagi na ocenę panelu analizującego smak, jak również poziom trans-2-nonenalu i wykazano, że poprawa jest statystycznie znacząca.
Przykłady
Niniejszy wynalazek jest dalej zdefiniowany w Przykładach poniżej. Powinno być zrozumiałym, że Przykłady gdy wskazują zalecane wykonania przedstawia się jedynie na zasadzie ilustracji.
P r z y k ł a d 1
Przeszukiwanie i selekcja mutantów izoenzymu lipooksygenazy w zmutagenizowanym jęczmieniu
1. Mutageneza jęczmienia
Ziarna jęczmienia Hordeum vulgare cv Vintage i cv Caruso zmutagenizowano azydkiem sodu zgodnie z opublikowaną procedurą (Kleinhofs i wsp., 1978 Mutation Research 51: 29 - 35). Mutageneza wprowadza mutacje punktowe w genomowym DNA tak, że może skutkować powstaniem zmian aminokwasowych w kodowanych białkach. Zmutowane ziarna M1 propagowano w szklarni przez dwa pokolenia i ziarno M3 zebrano do przeszukiwania. Obserwowana częstotliwość występowania mutantów pod względem pojedynczej cechy genowej w pokoleniu M2, zgodnie z Kleinhofs i wsp., 1978, powyżej, to 1,0 - 2,7 mutantów na 10,000 ziaren z pokolenia M2. Ponieważ większość mutacji genowych jest recesywna i wykrywalna jedynie w stanie homozygotycznym, zmutagenizowaną populację przeszukiwano na etapie pokolenia M3, gdzie oczekiwana proporcja zmutowanego homozygotycznego ziarna byłaby większa. W zmutagenizowanym materiale na etapie pokolenia M3 oczekiwano częstotliwości mutacji 0,9 0 - 2,3 na 10,000 ziaren.
2. Niedestruktywne oznaczenie aktywności lipooksygenazy 1 (LOX-1) i lipooksygenazy 2 (LOX-2) w zmutagenizowanym ziarnie M3
Opracowano szybką procedurę przeszukiwania do detekcji zmutowanego ziarna jęczmienia o zmniejszonej aktywności LOX-1 w oparciu o następujące kryteria:
Procedura przeszukiwania nie powinna zapobiegać propagacji ziarna/sadzonki; wyselekcjonowana tkanka ziarna/sadzonki powinna eksprymować możliwe do oceny ilościowej poziomy aktywności lipooksygenazy; oznaczenie powinno rozróżniać aktywność LOX-1 od aktywności LOX-2 i procedura oznaczenia powinna obejmować wielokrotne próbki.
Poziomy całkowitej aktywności lipooksygenazy w różnych tkankach kiełkującego ziarna, mianowicie pędu, korzenia i tkanki tarczki zarodka i endospermu oceniano jak następuje: przygotowano ekstrakty tkanki sadzonki jęczmienia przez homogenizowanie tkanki w schłodzonym lodem 20 mM Tris-HCL, pH 7,5 zawierającym 2 mM NaN3 i 0,5 mM fenylometylosulfonylofluorku (PMSF), po czym usuwano materiał nierozpuszczalny przez wirowanie przy 1000 g przez 10 minut. Oceniano aktywność
PL 208 246 B1 lipooksygenazy w 100 μΐ ekstraktu w 25°C przez dodanie 2,9 ml 20 mM substratu kwasu linolowego przygotowanego przez dyspersję 35 μl kwasu linolowego (wolny kwas, L-1376, Sigma, USA) w 5 ml H2O zawierającej 1% Tween 20. Reakcje śledzono spektrofotometrycznie przy czym szybkość wzrostu absorbancji przy 234 nm (A234 nm) spowodowanego tworzeniem skoniugowanego dienu w produkcie hydronadlenkowym jest proporcjonalna do obecnej aktywności enzymatycznej. Jedną jednostkę aktywności lipooksygenazy definiuje się jako Δ A234 = 0, 001 na minutę w 3-ml objętości reakcji, równoważnik utlenienia 0,12 priola kwasu linowego.
Tkanka liścia ziarna kiełkowanego przez 4 dni w ciemności posiadała najwyższe wykrywane poziomy aktywności lipooksygenazy (Holtman i wsp., 1996, Plant Physiology 111: 569 - 576). Wąsy roślinne z 4-dniowych sadzonek wyszukiwano do niedestruktywnego oznaczenia przeszukiwania lipooksygenzy. Optimum pH całkowitej aktywności lipooksygenazy z jęczmienia testowano w zakresie pH 4,5 - 9,0 i stwierdzono że przypada na pH 6,5. Zatem do oznaczenia przeszukiwania wybrano 25 mM bufor HEPES (pH 6,5) zawierający 0,2 M kwas borny.
Ponieważ obydwa enzymy LOX-1 i LOX-2 wykryto testem immunologicznym w pędach 4-dniowych sadzonek (Holtman i wsp., 1996, powyżej) zastosowano specyficzne oznaczenie LOX-1 i LOX-2. Okazało się, że inhibitor lipooksygenazy kwas nordihydrogwajakowy (NDGA), zidentyfikowany przez Eskin'a i wsp., 1997, Crit. Rev. Food, Science and Nutrition 9: 1 - 40), jest selektywnym inhibitorem lipooksygenaz z jęczmienia. NDGA w stężeniu 1 x 10-5 silnie hamował oczyszczoną LOX-2 z jęczmienia, podczas gdy LOX-1 utrzymywała 47% aktywności (Figura 1). Testowano selektywność tego inhibitora w oznaczeniu wąsów roślinnych przez określanie stosunku 9-hydroperoksyoktadekanoidu (9-HPOD) do 13-hydroperoksyoktadekanoidu (13-HPOD), który powstawał w wyniku utleniania kwasu linolowego przez odpowiednio LOX-1 i LOX-2. W oznaczeniu lipooksygenazy z wąsów roślinnych cv Vintage proporcja 13-HPOD wytworzonego spadła z 24,5% do 9,5% przy dodaniu 1 x 10-5 M NDGA.
Selektywne oznaczenie aktywności LOX-2 w ekstraktach z wąsów roślinnych oparte było na zastosowaniu przeciwciała monoklonalnego specyficznego wobec LOX-1 (5D2) (Holtman i wsp., 1996, powyżej) do immunoprecypitacji LOX-1 obecnej w ekstraktach. Pozostająca wykrywana aktywność lipooksygenazy w ekstraktach po precypitacji LOX-1 dostarczała pomiaru aktywności LOX-2. Wydajność immunoprecypitacji (opisana poniżej) oceniana była przez ilościową ocenę pozostającej LOX-1 i LOX-2 w nadsączach ekstraktów z użyciem oznaczenia ELISA, stosując specyficzne przeciwciała monoklonalne przeciw LOX-1 (oznaczone 5D2) i LOX-2 (oznaczone 5.8) (Holtman i wsp., 1996, powyżej). Immunoprecypitacja LOX-1 usuwała z ekstraktów wąsów roślinnych cv Vintage 85% białka LOX-1 i 15% białka LOX-2.
Immunoprecypitację przeprowadzano V-dennych płytkach 96-dołkowych przez dodanie 5 μl ziaren Dynabeads pokrytych 5D2 (Dynal) i 75 μl buforu [20 mM Tris-HCL pH 7,5, 1% Wołowej Surowicy Cielęcej (Hyclone) do 20 μl każdego ekstraktu wąsów roślinnych. Płytkę inkubowano na wytrząsarce do płytek (MTS4, IKA, Labor Technik) przez 1 godzinę w 4°C. Immunoprecypitat osadzono przez wirowanie w 4°C w wirówce Sigma 302-K przez 10 minut przy 2000 rpm. Nadsącza (70 μΓ> z każdej próbki oznaczano ze względu na obecność aktywność lipooksygenazy w płaskodennej płytce 96-dołkowej, jak opisano poniżej, ale z dodatkiem 100 μl buforu testowego (25 mM HEPES, 0,2 M kwas borny, pH 6,5).
Oznaczenia LOX-1 i LOX-2 dostosowano do wysokowydajnego sposobu przeszukiwania. Wąsy roślinne (1 cm) z ośmiu 4-dniowych kiełkowanych ziaren pojedynczo homogenizowano w 150 μl schłodzonego lodem buforu (20 mM Tris-HCL, pH 7,5) przez 2 x 30 sekund w homogenizatorze wielopojemnikowym (Berg i wsp., 1992, Electrophoresis 13: 76 - 81). Po wirowaniu przez 15 minut przy 3000 rpm 40 μl nadsączu każdego ekstraktu przeniesiono do płaskodennej płytki 96-dołkowej. Do każdego dołka dodano 170 μl (25 mM HEPES, 0,2 M kwas borny, pH 6,5, 1 x 10-5 NDGA) oraz 10 μl substratu (20 mM kwas linolowy) i następnie inkubowano przez 20 minut w 25°C. Reakcję zakończono przez dodanie 20 μl wysyconego roztworu jodku potasu (KI) i inkubowano przez następne 8 minut w 25°C. Reakcja redoks pomiędzy dienami hydronadtlenków a KI dawała I2, co było monitorowane przez jego maksimum ekstynkcji przy 350 nm w czytniku do płytek (Multiskan MCC/340).
3. Identyfikacja potencjalnych mutantów lipooksygenazy w ziarnie M3 i M4 zmutagenizowanego jęczmienia
Ziarno pokolenia M3 cv Vintage i cv Caruso przechowywano w 45 °C przez 6,5 dnia aby przerwać stan uśpienia, zapewniając 95% częstotliwość kiełkowania. Ziarno M3 cv Vintage (9218) i cv Caruso (9633) kiełkowano i przeszukiwano pod katem linii, których aktywność LOX-1 stanowiła 15%
PL 208 246 B1 lub mniej aktywności ziarna dzikiego typu. Przypuszczalne zmutowane linie (50 linii cv Vintage i 42 linii cv Caruso) propagowano do pokolenia M4, zebrano i skiełkowane ziarno ponownie poddano przeszukiwaniu. Po pomiarze aktywności lipooksygenazy w ekstraktach z 5 wąsów roślinnych z każdej linii potwierdzono występowanie zmutowanego fenotypu LOX-1 w jednej linii cv Vintage i sześciu liniach cv Caruso. Gdy zbadano aktywności LOX-1 i LOX-2 w kiełkujących zarodkach tych siedmiu przypuszczalnych mutantów okazało się, że jedynie mutant cv Vintage (oznaczony Linia G) wykazywał duże zmniejszenie pod względem LOX-1. W dojrzałym uśpionym ziarnie obecna w zarodku aktywność lipooksygenazy stanowi prawie wyłącznie aktywność LOX-1, ze względu na różnicujący wzór ekspresji tych dwóch izoenzymów (Schmitt i van Mechelen, 1997, Plant Sci. 128: 141 - 150). Całkowita aktywność lipooksygenazy w ekstraktach z zarodków Linii G dojrzałego suchego ziarna (pokolenie M5) wynosiła 0,06 ± 0,04 U/mg białka w porównaniu do 0,74 ± 0,44 U/mg białka w ekstraktach z zarodków cv Vintage, jak określono przez spektrofotometryczne oznaczenie lipooksygenazy opisane w sekcji 2 Przykładu 1. Stwierdzono, że pozostająca aktywność lipooksygenazy w dojrzałych zarodkach Linii G zarówno w pokoleniach M4 jak i M5 stanowiła w przybliżeniu 9% tej z linii rodzicielskiej.
P r z y k ł a d 2
Linia G jest mutantem cv Vintage o fenotypie niskiej aktywności lipooksygenazy
W materiale z pokolenia M5 analizowano właściwości agronomiczne oraz zmutowany fenotyp Linii G. Wstępne analizy przeprowadzono w celu potwierdzenia, czy analizowany materiał M5 był homozygotyczny pod względem zmutowanego fenotypu. Fenotyp o niskiej aktywności LOX-1 w Linii G, wykrywany w pokoleniu M3, mógłby wynikać z dominującej bądź recesywnej mutacji. Jeżeli Linia G wyselekcjonowana na etapie pokolenia M3 była heterozygotyczna pod względem mutacji dominującej, to następne pokolenia wykazywałyby segregację cech fenotypowych. Mierzono aktywność lipooksygenazy w 26 pojedynczych zarodkach Linii G z ziarna w stanie uśpienia pokolenia M5 i porównano do zarodków cv Vintage dzikiego typu. Aktywność lipooksygenazy we wszystkich zarodkach Linii G była bardzo niska, z przeciętną 0,06 ± 0,04 U lipooksygenazy na mg białka, w porównaniu z 0,74 ± 0,44 U lipooksygenazy na mg białka w zarodkach cv Vintage dzikiego typu. Dane potwierdziły, że Linia G w pokoleniu M5 była homozygotyczna pod względem cechy niskiej aktywności lipooksygenazy.
1. Linia G charakteryzuje się fizjologią wzrostu i rozwojem ziarna dzikiego typu.
Ziarno Linii G i cv Vintage kiełkowano i hodowano w komorze klimatycznej przy 16 godzinach światła w 15°C i 8 godzinach ciemności w 12°C oraz wilgotności względnej 80%. Charakterystyka wzrostu roślin Linii G i cv Vintage była podobna w odniesieniu do wysokości rośliny, ilości odrośli na roślinę, występowania kwitnienia i ilości ziaren na kłos. Świeża masa (Figura 2) i sucha masa (Figura 3) ziarna Linii G i cv Vintage dzikiego typu podczas rozwoju od 5 dnia po kwitnieniu (ang. day after flowering, DAF, DPK - Dzień Po Kwitnieniu) do pełnej dojrzałości, w przybliżeniu 90 DPK, były bardzo podobne.
2. Linia G posiada fenotyp o niskiej aktywności lipooksygenazy podczas rozwoju.
Aktywność lipooksygenazy mierzono w ekstraktach z rozwijającego się ziarna jęczmienia Linii G (pokolenie M5) i dzikiego typu cv Vintage. Ziarno homogenizowano w schłodzonym lodem buforze 20 mM Tris-HCL pH 7,5 zawierającym 0,1% (objętościowo) Nonidet-40, niejonowy detergent, który zwiększa ekstrakcję lipooksygenazy, i wirowano przy 15 000 g przez 20 minut aby usunąć nierozpuszczalny materiał. Aktywność lipooksygenazy w ekstraktach zmierzono polarograficznie w 200 ul wysyconego tlenem buforu (0,2 M kwas borny, 25 mM HEPES, pH 6,5) zawierającego 1,2 mM kwas linolowy w 25°C z użyciem elektrody typu Clarka do pomiaru konsumpcji tlenu. Aktywność lipooksygenazy wzrosła podczas pierwszych 20 dni rozwoju ziarna zarówno w ziarnie Linii G jak i ziarnie dzikiego typu, ale jedynie w Linii G poziom aktywności spadł podczas dojrzewania ziarna (Figura 4).
Względne ilości 9-HPPOD i 13-HPOD wytworzonych podczas utleniania kwasu linolowego stanowi pomiar poziomów aktywności LOX-1 i LOX-2 w ekstraktach z ziarna. W tym przypadku pominięto Nonidet P-40 z buforu ekstrakcyjnego do ziarna aby uniknąć współ-ekstrakcji enzymów zużywających hydronadtlenek. Ekstrakty (100 μΐ) zmieszane z 10 ml 50 mM buforu fosforanowego pH 6,5 zawierającymi 200 uM kwas linolowy inkubowano przez 20 minut. Reakcje przerwano przez dostosowanie pH do 3,5 i dodano wewnętrzny standard. Hydronadtlenki wytworzone w oznaczeniu związano na oktadecylowej kolumnie fazy stałej (Bakerbond, Baker) i eluowano metanolem. 9-HPPOD i 13-HPOD oddzielano z użyciem HPLC odwrotnej fazy na kolumnie C-18 z izokratycznym rozpuszczalnikiem do elucji (tetrahydrofuran: Metanol: H2O: kwas octowy; 25:30:44,9:0,1 (objętościowo) doprowadzonym do pH 5,5 stężonym amoniakiem) przy szybkości przepływu 0,5 ml/minutę jak opisano w Aarle i wsp.,
PL 208 246 B1
1991, FEBS Letters 280: 159 - 162. Hydronadtlenki wykrywano przy 234 nm a maksima HPOD korygowano w stosunku do wewnętrznego standardu, prostaglandyny B2.
Figura 5 przedstawia, że 13-HPOD był głównym produktem aktywności lipooksygenazy obecnej w ziarnie podczas pierwszych 20 DPK (Dni Po Kwitnieniu), podczas gdy 9-HPOD tworzony był przez aktywność lipooksygenazy podczas dojrzewania ziarna. Chociaż zarówno ekstrakty z ziarna Linii G jak i dzikiego typu charakteryzowały się podobnym profilem aktywności syntetyzującej 13-HPOD, to Linia G nie wykazywała dzikiego typu wzrostu aktywności syntetyzującej 9-HPOD. Dane te pozostają w zgodzie z utratą aktywności LOX-1 w dojrzewającym ziarnie jęczmienia Linii G.
3. Linia G posiada fenotyp o niskiej aktywności lipooksygenazy na etapie kiełkowania
Oznaczono całkowitą aktywność lipooksygenazy w ekstraktach z zarodków ziarna kiełkowanego w 15°C jak opisano w Przykładzie 1. Aktywność lipooksygenazy obecna w ziarnie dzikiego typu w stanie uśpienia zmniejszyła się podczas pierwszych 4 dni kiełkowania a następnie wzrosła (Figura 6). W Linii G aktywność lipooksygenazy w ziarnie w stanie uśpienia była bardzo niska, ale wzrosła po 4 dniach.
Analiza HPOD wytworzonych przez aktywność lipoksygenazy w kiełkujących zarodkach wykazała, że 9-HPOD był głównym produktem lipooksygenaz obecnych w ziarnie w stanie uśpienia. Poziom tworzenia 9-HPOD spadł wraz ze spadkiem aktywności lipoksygenazy w ekstraktach. Wzrostowi aktywności lipooksygenazy po 4 dniach towarzyszyło tworzenie zarówno 9-HPOD jak i 13-HPOD. Niska aktywność lipooksygenazy w ziarnie Linii G w stanie uśpienia była związana z brakiem tworzenia HPOD, podczas gdy wzrost aktywności po 4 dniach wytwarzał 13-HPOD. Dane te dostarczają dowodu, że aktywność LOX-1 prowadząca do tworzenia 9-HPOD jest w dużym stopniu zmniejszona w zarodkach zarówno rozwijającego się, uśpionego lub kiełkującego ziarna jęczmienia Linii G, podczas gdy aktywność LOX-2 prowadząca do tworzenia 13-HPOD w Linii G pozostaje niezmieniona.
P r z y k ł a d 3
Linia G posiada zmutowany gen Lipooksygenazy (lox-1) wywołując fenotyp o niskiej aktywności lipooksygenazy
Podstawę molekularną fenotypu niskiej aktywności LOX-1 Linii G badano w celu dostarczenia pełnego opisu mutanta. Następujące analizy przeprowadzono w celu dostarczenia pełnej charakterystyki fenotypu:
1. Lipooksygenaza syntetyzowana jest w rozwijającym się i kiełkującym ziarnie Linii G
Równolegle z pomiarem aktywności lipooksygenazy przeprowadzono analizy typu Western biot ekstraktów z zarodków z rozwijającego się i kiełkującego ziarna jęczmienia, jak opisano w Przykładzie 2. Surowe ekstrakty rozdzielano z użyciem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z siarczanem dodecylu (SDS-PAGE) zgodnie z Laemmli, 1970, Nature 227: 680 - 685. Rozdzielone białka przeniesiono na nitrocelulozę z użyciem semi-suchej hybrydyzacji zgodnie z Towbin i wsp., (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350 - 4354. Biot sondowano przeciwciałem monoklinalnym specyficznym wobec LOX-1, 5D2, jak opisano w Holtman i wsp., 1996, Plant Physiology 111: 569 - 576, przy 500 x rozcieńczeniu i następującej inkubacji z kozim anty-mysim przeciwciałem sprzężonym z alkaliczną fosfatazą i wykrywano w użyciem substratów alkalicznej fosfatazy błękitem nitrotetrazolowym i 5-bromo-4-chloro-3-indolilofosforanem jak opisano przez Holtman i wsp., 1996, Plant Physiol. 111: 569 - 576. Analizy typu Western wykazały, że białko LOX-1 było wykrywane w rozwijającym się ziarnie od 10 DPK w zarodkach cv Vintage a poziom wzrósł podczas dojrzewania ziarna (Figura 8). Białko było również obecne w zarodku ziarna cv Vintage w stanie uśpienia, ale powoli zmniejszało się podczas kiełkowania (Figura 9). Pomimo, że LOX-1 rozpoznaje się w ekstraktach zarodków Linii G i migruje ono w czasie SDS-PAGE jako białko o podobnej masie cząsteczkowej co LOX-1 cv Vintage, to możliwe do immunnodetekcji poziomy białka w Linii G było nieco niższe niż w cv Vintage.
2. Gen lox-1 eksprymowany jest w rozwijającym się i kiełkującym ziarnie Linii G
Równolegle z pomiarem aktywności lipooksygenazy, opisanym w Przykładzie 2, wyizolowano całkowity RNA z zarodków rozwijającego się i kiełkującego ziarna jęczmienia, zgodnie z procedurą Hengens i van Os-Ruygrok, 1989, Rice Genet. Newslett. 6: 163 - 168. Próbki RNA (7,5 μg) rozdzielono w denaturujących żelach agarozowych i przeprowadzono hybrydyzację typu Northern jak opisano przez Sambrook i wsp., 1989 w Molecular Cloning, a Laboratory Manuał, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY. Bioty hybrydyzowano z sondą znakowaną 32P wytworzoną z regionu nieulegającego translacji 3' jęczmienia, nukleotydy 2659 -2801 [SEQ ID NO: 1] cDNA lox-1 (EMBL Numer Dostępu L35931), jak opisano przez Holtman i wsp., 1996 Plant Physiol. 111: 569 - 576, z użyciem zestawu Amersham Random Prime Kit.
PL 208 246 B1
Transkrypty lox-1 kodujące LOX-1 wyrywano w zarodkach rozwijającego się i dojrzałego ziarna cv Vintage i Linii G od 30 DPK (Figura 10). Poziom transkryptów lox-1 wzrósł podczas kiełkowania zarówno w zarodkach cv Vintage jak i Linii G, wskazując na ekspresję de novo genu lox-1 (Figura 11). Ponieważ wykrywalne poziomy transkryptów lox-1 w zarodkach Linii G i cv Vintage były podobne, to ani zmniejszona transkrypcja lox-1 ani stabilność transkryptu nie mogła przyczyniać się do fenotypu Linii G o niskiej aktywności lipooksygenazy.
3. Gen lox-1 Linii G koduje zmutowaną formę lipoksygenazy-1
W celu określenia molekularnej podstawy fenotypu niskiej aktywności LOX-1, który charakteryzuje się normalną transkrypcją genu lox-1, ale zmniejszoną akumulacją i aktywnością eksprymowanego enzymu lipooksygenazy w ziarnie, analizowano i porównywano sekwencję nukleotydową genu lox-1 Linii G i cv Vintage.
Genomowy DNA izolowano z tkanki liścia sadzonki Linii G i dzikiego typu cv Vintage zgodnie ze sposobem opisanym przez Pich i Schubert 1993, Nucleic Acids Res. 21: 3328. Gen lox-1 w preparatach genomowego DNA zamplifikowano z użyciem łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) stosując startery oparte na sekwencji genu lox-1 z jęczmienia (van Mechelen i wsp., 1995, BBA 1254: 221 - 225; Rouster i wsp., 1997, Plant J. 11: 513 - 523). Pozycja i sekwencja starterów oligonuklotydowych stosowanych do amplifikacji promotora i regionów kodujących lox-1wskazanych na Figurze 12 były jak następuje:
Do amplifikowania za pomocą PCR domeny promotorowej (-361 do 68) lox-1 Linii G i lox-1 cv Vintage użyto lewy starter 5'-GAA AAG CTT GGA GGT AGA CGC TGC -3' [SEQ ID NO: 2] i prawy starter 5'-TAT AGG ATC CTT GTT CTT GGC CTC CTC TCC TGC-3' [SEQ ID NO: 3].
Do amplifikowania za pomocą PCR regionu kodującego lox-1 Linii G użyto lewy starter 5'-AGT GAA AAA CAG TGT GCT GGT G-3' [SEQ ID NO: 4] i prawy starter 5'-GGC TTA AAG AGC AAC TGA-3' [SEQ ID NO: 5].
Lewy starter 5'-CAA GAT GCA TAT GCT GCT GGG AG-3' [SEQ ID NO: 6] i prawy starter 5'-CGA TGG TTT AAA TTA GAT GGA GAT GCT GT-3' [SEQ ID NO: 7] zamplifikowały w PCR region kodujący lox-1 cv Vintage.
Reakcje PCR składały się z 250 ng genomowego DNA w objętości 50 μl zawierajęcej 50 pmola statera i 2 U polimerazy DNA Pfu (Promega) zgodnie z instrukcjami dostawcy enzymu. Amplifikacje PCR przeprowadzono w Stratagene Robocycler: 1 minuta w 94 °C, 1 cykl, 1 minuta w 94°C, 2 minuty w 62°C i 5 minut w 72°C, 30 cykli; 10 minut w 72°C, 1 cykl. Produkty PCR rozdzielono w 1,2% żelu agarozowym. Fragmenty DNA odpowiadające długością amplifikowanemu regionowi oczyszczono z użyciem zestawu do ekstrakcji Qiax II Gel (Qiagen) i wklonowano do plazmidu pcDNA2.1 (Invitrogen). Sekwencje nukleotydowe obydwu nici sklonowanego promotora lox-1 i regionów kodujących określono z użyciem dideoksynukleotydowej terminacji łańcucha ze specyficznymi starterami oligonukleotydowymi i analizowano na ABI PRISM® 310 Analizatorze Genetycznym (PE Biosystems). Porównania sekwencji przeprowadzono z użyciem pakietu oprogramowania do analizy sekwencji DNA STAR (DNA STAR Inc., USA).
Region promotorowy i struktura intron-ekson regionu kodującego lox-1 jęczmienia przedstawione są na Figurze 13, i zostały wydedukowane na podstawie porównania sekwencji nukleotydowej dzikiego typu lox-1 sekwencji genomowej i cDNA (Figura 12). Zsekwencjonowany region od -363 do +68 z regionu promotorowego lox-1 (ponumerowany względem miejsca startu transkrypcji; van Mechelen i wsp., 1995, BBA 1254: 221 - 225) jest wystarczający aby kierować zarodkowo-specyficzną i tymczasowo-regulowaną charakterystyką ekspresji natywnego genu (Rouster i wsp., 1998, Plant J 15: 435 - 440). Promotor i region transkrybowany dzikiego typu genu lox-1 [SEQ ID NO: 8] posiada 4663 nukleotydy długości i zawiera 6 intronów o długości między 82 nt a 634 nt, które nie występują w odpowiednim cDNA [SEQ ID NO: 10] a zatem muszą być usunięte podczas obróbki RNA.
Porównanie sekwencji nukleotydowej lox-1 Linii G z dzikim typem (Figura 12) wykazało, że allel lox-1 Linii G posiada dwie mutacje punktowe. Jedna jest cichą substytucją C >T w pozycji 221 w eksonie 1 a druga jest substytucją G >A w pozycji 2347 w eksonie 3 (Figura 13). Dzikiego typu gen lox-1 jęczmienia koduje białko o 862 resztach aminokwasowych [SEQ ID NO 9], podczas gdy mutacja w pozycji 2347 wywołuje w allelu lox-1 Linii G substytucję aminokwasową glicyny do kwasu asparaginowego w pozycji 368 kodowanego białka.
Porównania pokrewnych lipoksygenaz roślinnych wskazały, że glicyna-368 LOX-1 jęczmienia jest silnie konserwowana. Co więcej reszta ta, która odpowiada glicynie-353 LOX-1 z soi, jest jedną z 51 obojętnych lub hydrofobowych reszt, które wyściełają kieszeń substratowa enzymu, jak zobaczono
PL 208 246 B1 na podstawie jej struktury krystalicznej (Minor i wsp., 1996, Biochemistry 35: 10687 - 10801 i przedstawiono na Figurze 22. Zatem insercja obdarzonej ładunkiem reszty aminokwasowej prawdopodobnie zaburzy właściwości strukturalne i funkcjonalne enzymu.
4. Zmutowane białko LOX-1 kodowane przez allel lox-1 Linii G posiada niską aktywność enzymatyczną i jest odpowiedzialne za fenotyp Linii G o niskiej aktywności lipoksygenazy.
Mutageneza z użyciem azydku sodu ziarna cv Vintage, która zaindukowała powstanie zmutowanego allelu lox-1 w Linii G, mogła również wywołać dodatkowe mutacje w genomie Linii G. Podjęto dwa podejścia eksperymentalne aby wykazać, że to raczej zmutowany allel lox-1 w Linii G jest odpowiedzialny za jej fenotyp o niskiej aktywności lipooksygenazy, a nie inne mutacje w genomie. Aby udowodnić, że substytucja glicyna kwas asparaginowy w zmutowanym enzymie wywołuje zmniejszoną stabilność i aktywność, określono aktywność enzymatyczną LOX-1 kodowanej przez allel zmutowany i dzikiego typu lox-1. Dwa geny lox-1 poddano przejściowej ekspresji w protoplastach aleuronowych izolowanych z dojrzałego zaprawionego ziarna, ponieważ oczekiwano, że poziom endogennej ekspresji lipooksygenazy w tych komórkach będzie poniżej limitów wykrywania. Żadnego ze zidentyfikowanych genów lipooksygenazy jęczmienia, które są eksprymowane w kiełkującym jęczmieniu nie wykrywa się w tkance aleuronowej (van Mechelen i wsp., 1999 powyżej). Aby kierować przejściową ekspresją genu lox-1 w protoplastach aleuronowych poddano fuzji translacyjnej ich regiony kodujące do konstytutywnego promotora, o którym wiadomo było, że jest aktywny w tych protoplastach.
Regiony kodujące zmutowanego (pozycje sekwencyjne +1 do +4350) i dzikiego typu genu lox-1 (pozycje sekwencyjne +69 do +4230) oraz dzikiego typu lox-1 cDNA (pozycje sekwencyjne +69 do +2654) każdy wklonowany w plazmid pc DNA2.1 (patrz sekcja 3), wycięto przez trawienia miejsc KpnI i EcoRV w miejscu polilinkera wektora. Regiony kodujące klonowano w plazmidzie pUBARN (Jensen i wsp., 1998, Hereditas 129: 215 -225) pomiędzy konstytutywnie aktywnym promotorem ubikwityny Ubi (jak opisano w patencie USA o numerze 005510474A) a terminatorem Nos, w miejsce genu bar, który koduje acetylotransferazę fosfoinotricyny (Figura 14).
Wyizolowano protoplasty z tkanki aleuronowej zaprawionego Hordeum vulgare cv Himalaya zgodnie z protokołem Skriver i wsp. 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7266 - 7270. Wielokrotne rozcieńczenia 2 x 10 protoplastów transfekowano w 0°C z ~100 μg plazmidowego DNA (równomolowe ilości każdego z plazmidów) przez przyjęcie DNA z udziałem glikolu polietylenowego (PEG) (Lee i wsp., 1997, Plant. Mol. Biol. 13: 21 - 29) i następnie inkubowano w pożywkach hodowlanych do protoplastów aleuronowych w 25°C jak wcześniej opisano (Skriver i wsp., 1991, powyżej). Po 48 godzinach inkubacji ostrożnie usunięto pożywkę hodowlaną a protoplasty ponownie zawieszono i homogenizowano w 300 μl buforu do oznaczania lipopksygenazy (0,2 mM kwas borny, 25 mM HEPES, pH 6,5). Homogenaty wirowano przy 15 000 g przez 5 minut aby osadzić nierozpuszczalny materiał a nadsącza (10 μθ następnie oznaczono ze względu na całkowitą aktywność lipooksygenazy z użyciem szybkiego oznaczenia przeszukiwania opisanego w Przykładzie 1, sekcja 1, ale z pominięciem inhibitora NDGA. Zawartość białka w ekstraktach protoplastowych zmierzono z użyciem oznaczenia wiązania barwnika Bradforda (Bradford 1976, Anal. Blochem., 72: 248) dostarczonego przez Bio-Rad Laboratories, Hercules, California, USA a aktywność lipooksygenazy wyrażono na mg białka w ekstrakcie.
Protoplasty transfekowane plazmidem kontrolnym, pUBI-GUS, w którym promotor ubikwityny-1 z kukurydzy kieruje ekspresją genu reporterowego β-glukuronidazy, nie dawały wykrywalnej aktywności lipooksygenazy. Przejściowa ekspresja zarówno dzikiego typu genu lox-1 i cDNA w protoplastach dawała wysokie poziomy aktywności lipooksygenazy w ekstraktach protoplastowych (Figura 15). Wyższa ekspresja dzikiego typu cDNA lox-1 w porównaniu z sekwencją genomową może być związana z wyższą częstotliwością transfekcji dla mniejszego plazmidu ekspresyjnego cDNA lox-1 (4929 pz a 6505 pz konstruktu genowego lox-1). Przejściowa ekspresja zmutowanego genu lox-1 dawała niskie poziomy aktywności lipooksygenazy, ~10% aktywności lipooksygenazy dzikiego typu. Dane te jasno pokazują, że zmutowany gen lox-1 w Linii G koduje lipooksygenazę o znacząco zmniejszonej aktywności lipooksygenazy, która przyczynia się do fenotypu o niskiej aktywności lipooksygenazy.
P r z y k ł a d 4
Oznaczenie PCR cięcia zamplifikowanego miejsca polimorficznego (PCR-CAPS) - sposób stosowany do zidentyfikowania zmutowanego genu lox-1.
W oparciu o oznaczenie PCR-CAPS opracowano analityczny sposób pozwalający na zidentyfikowanie zmutowanego genu lox-1 w dowolnym tle genetycznym. Oznaczenie wykorzystuje amplifikację PCR genomowych fragmentów DNA, po której następuje trawienie zamplifikowanych sekwencji
PL 208 246 B1 specyficzną endonukleazą restrykcyjną w celu uwidocznienia polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP).
Sekwencja kodująca zmutowanego genu lox-1 niesie dwie mutacje punktowe (patrz Przykład 3), przy czym mutacja w pozycji 2347 (Figura 12) wprowadza dodatkowe miejsce cięcia endonukleazy restrykcyjnej Aat II, które nie występuje w dzikiego typu genie lox-1. (Figura 16). Ukazano, że następujące oznaczenie PCR-CAPS oparte na polimorfizmie stworzonym przez obecność tego miejsca restrykcyjnego w genie lox-1 rozróżnia dzikiego typu gen lox-1 i zmutowany gen lox-1.
Z młodych liści z sadzonki M6 Hordeum vulgare, L. Cv Vintage i Linii G wyizolowano genomowy DNA zgodnie z procedurą Pich i Schubert (1993), powyżej). Sekwencję DNA obejmującą pozycję 2347 (miejsce mutacji genu lox-1 Linii G) zamplifikowano z użyciem PCR, stosując startery specyficzne dla genu lox-1 [SEQ ID NO: 8]. Fragmenty DNA zamplifikowane przez wybrany lewy starter 5'-CGCTACGACGTCTACAACGA-3' [SEQ ID NO: 13] i prawy starter 5'-CAGACTACTTTTTGGCGGGA-3' [SEQ ID NO: 14] przedstawiono na Figurze 17. Reakcje PCR przeprowadzono z 250 ng genomowego DNA w objętości 50 μl zawierającej 50 pmoli każdego startera i 1 jednostkę polimerazy DNA Taq (Promega) zgodnie z instrukcjami dostawców. Amplifikacje PCR przeprowadzono w Robocycler Stratagene jak następuje: 1 minuta w 94°C, 1 cykl; 1 minuta w 94°C, 1,5 minuty w 60°C i 2 minuty w 72°C, 30 cykli; 10 minut w 72°C, 1 cykl. Zamplifikowane fragmenty zmutowanego i dzikiego typu genu lox-1 stanowiły 650 pz (Figura 18), odpowiadając oczekiwanej wielkości (Figura 17). Produkty PCR, oczyszczone na kolumnie do wirowania (Qiagen) trawiono 25 jednostkami endonukleazy restrykcyjnej Aat II przez 24 godziny w 37°C i analizowano w 1,2% żelu agarozowym.
W skutek trawienia produktu PCR dzikiego typu lox-1otrzymano fragmenty DNA 10, 179 i 462 pz, a z produktu PCR zmutowanego lox-1 fragmenty 10, 149, 179 i 313 pz, przy czym dodatkowe fragmenty DNA związane były z częściowym trawieniem produktu PCR lox-1 (Figura 19). Wzór fragmentowy odpowiada oczekiwanemu RFLP wynikającemu z tej mutacji, przy czym fragment 313 pz jest unikalny dla mutanta lox-1. To oznaczenie PCR-CAPS dostarcza powtarzalnego i specyficznego narzędzia do identyfikacji allelu lox-1 w jęczmieniu i może być zatem wykorzystywany w programach hodowli jęczmienia, których celem jest wprowadzenie tego genu do nowych odmian jęczmienia.
P r z y k ł a d 5
Krzyżowanie wsteczne fenotypu o niskiej aktywności lipooksygenazy Linii G do cv Alexis wykazuje genetyczne sprzężenie ze zmutowanym genem lox-1
Zastosowano powtarzane krzyżowanie wsteczne do przeniesienia fenotypu niskiej aktywności lipooksygenazy do rodzica powtarzającego się (w tym przypadku cv Alexis). Program krzyżowania wstecznego przedstawiony na Figurze 20, w połączeniu z selekcją fenotypu o niskiej aktywności lipooksygenazy, progresywnie zastępuje genom Linii G genomem rodzica powtarzającego się. Co więcej, eliminacji ulegną inne mutacje wprowadzone do Linii G podczas mutagenezy z użyciem azydku sodu. W pierwszej krzyżówce wstecznej homozygotycznej Linii G o niskiej aktywności lipooksygenazy (oznaczonej genotyp ll ) do cv Alexis (oznaczonej genotyp LL) potomstwo będzie heterozygotyczne (oznaczone genotyp LI ). Fenotyp o niskiej aktywności lipooksygenazy ze względu na mutację recesywną nie będzie wykrywany w liniach heterozygotycznych pod względem tej mutacji. Potomstwo poddaje się samozapyleniu i uzyskuje się ulegającą prawidłowej segregacji populację Mendlowską, mianowicie 1 LL: 2 LI: 1 ll. Homozygotyczny genotyp ll o niskiej aktywności lox wynikający z pierwszej krzyżówki wstecznej będzie miał 50% genetycznego tła cv Alexis. Po dziesięciu rundach krzyżowania wstecznego rodzica powtarzającego się tło będzie stanowiło w przybliżeniu 99,9%.
W czasie programu krzyżowania wstecznego Hordeum vulgare, L. cv Alexis i Linię G propagowano w szklarni. Ziarna potomstwa krzyżowanego wstecznie kiełkowano na szalkach Petri'ego na papierze filtrowym, nasączonym 4 ml H2O, przez 3 dni w ciemności w temperaturze 22°C. Linie o niskiej aktywności lipooksygenazy przeszukiwano przez mierzenie całkowitej aktywności lipooksygenazy w ekstraktach koleoptylu (szczyt 7 mm) z kiełkujących sadzonek, jak opisano w Przykładzie 1. Potomstwo trzeciej i czwartej krzyżówki wstecznej poddano również analizie dziedziczności zmutowanego genu lox-1 z użyciem oznaczenia PCR-CAPS opisanego w Przykładzie 4.
Oczekiwana częstotliwość fenotypu o niskiej aktywności lipooksygenazy w ulegającym segregacji potomstwie czterech generacji krzyżówki wstecznej wynosiła 25% dla mutacji recesywnej. Obserwowana częstotliwość fenotypu o niskiej aktywności lipooksygenazy w potomstwie (24 ziarna) czterech generacji krzyżowania wstecznego pozostaje w zgodzie z częstotliwością oczekiwaną (Figura 20). Gdy potomstwo trzeciej i czwartej krzyżówki wstecznej o homozygotycznym genotypie o niskiej aktywności lox analizowano z użyciem oznaczenia PCR-CAPS u wszystkich wykryto diagnostyczny
PL 208 246 B1 fragment 313 pz, podczas gdy potomstwo o dzikim typie aktywności lipooksygenazy było pozbawione tego fragmentu (Figura 21).
Program krzyżowania wstecznego wykazuje, że zmutowany allel lox-1 może być przeniesiony do nowego tła genetycznego i jest dziedziczony w sposób recesywny jednoczynnikowy po segregacji Mendlowskiej. Ponieważ tło rodzica powtarzającego się stanowi w potomstwie czwartej krzyżówki wstecznej 93,8% to współdziedziczenie zmutowanego genu lox-1 i fenotypu o niskiej aktywności lipooksygenazy dostarcza potwierdzenia ich genetycznego sprzężenia.
P r z y k ł a d 6
Piwo warzone ze słodu jęczmiennego z Linii G akumuluje mniej trans-2-nonenalu podczas przechowywania, co skutkuje poprawioną stabilnością smaku.
Hordeum vulgare, L. cv Vintage i Linie G propagowano w warunkach polowych przez kilka sezonów, aby zapewnić wystarczającą ilość ziarna do słodowania przemysłowego. Następujące słodowanie na skalę przemysłową i próby warzenia, jak również analizy ukończonego piwa przeprowadzono w celu wykazania wartości jęczmienia Linii G o niskiej aktywności lipooksygenazy dla poprawionej stabilności smaku.
1. Przemysłowe słodowanie i suszenie Linii G i cv Vintage.
Przeprowadzono słodowanie w skali 10 ton w przemysłowej słodowni w dwóch doświadczeniach jak następuje: Doświadczenie 1: Ziarno jęczmienia Linii G (zbiór 1996)
Warunki moczenia: 8 godzin mokry, 14 godzin suchy, 8 godzin mokry, 10 godzin suchy, 4 godziny mokry w 16°C wodzie do moczenia. Warunki słodowania: 12 godzin w 18°C; 24 godziny w 16°C; 24 godziny w 14°C; 60 godzin w 12°C. Warunki suszenia: 12 godzin w 60°C; 3 godziny w 68°C; 4 godziny w 74°C; 3 godziny w 80°C.
Doświadczenie 2: cv Vintage i Linia G (zbiór 1996/1997)
Warunki moczenia: 8 godzin mokry, 10 godzin suchy, 6 godzin mokry, 15 godzin suchy, 4 godziny mokry w 15°C wodzie do moczenia. Warunki słodowania: 5 dni z wlotowym powietrzem o 15°C i zraszaniu aby utrzymać poziom nawilżenia. Warunki suszenia: 10 godzin w 50°C; 2 godziny w 60°C; 2,5 godziny w 80°C.
Analizy słodowania 2 próbek słodu Linii G z Doświadczenia 1 porównanych ze słodem kontrolnym, cv Nevada (Tabela 1) oraz z Doświadczenia 2 porównanych z cv Vintage (Tabela 2) potwierdziły, że słód Linii G był odpowiedni do prób warzenia.
T a b e l a 1
SŁODOWANIE PRÓBA 1
Odmiana jęczmienia cv Nevada Linia G Linia G
Rok zbioru 1996 1996 1996
Analizy słodu
Wilgotność % 4,7 4,3 4,4
Ekstrakt czysty jak jest % j.j. 76,9 76,1 75,3
Ekstrakt czysty sucha masa (s.m.) % s.m. 81,4 79,5 78,7
Czas scukrzania Min. < 10 < 10 < 10
Siła diastatyczna % WK 252 373 365
Kolor EBC 2,8 4,4 3,8
PH 6,16 5,97 5,99
Mętność EBC 9,0 2,5 2,4
Całkowite białko s.m. % 10.35 10,74 12,03
Azot rozpuszczalny MG/L 647 787 756
Rozp. białko % słód s.m. % s.m. 3,7 4,4 4,3
Liczba Kolbacha 35,3 40,8 35,4
PL 208 246 B1 ciąg dalszy Tabeli 1
Wolny azot aminowy mg/l 97 125 118
Kruchość % 89,5 85,6 89,5
Całe niemodyfikowane ziarna % 1,1 0,6 0,5
Częściowo niezmodyfikowane ziarna % 2,3 1,0 0,6
β-glukan w brzeczce mg/l 114 66 36
β-glukan w słodzie %obj. 0,24 0,11 0,05
S-metylometionina/DMS równ. μg/g 2,4 6,4 8,4
Wolny DMS μg /g 1,0 6,6 4,7
NDMA μg /kg n.d. β 0,3/0,6 0,3/0,3
T a b e l a 2
SŁODOWANIE PRÓBA 2
Odmiana jęczmienia Vintage Linia G Linia G
Rok zbioru 1996 1996 1997
Analizy słodu
Wilgotność % 4,1 4,1 4,3
Ekstrakt czysty jak jest % j.j. 77,0 765,6 77,5
Ekstrakt czysty sucha masa (s.m.) % s.m. 80,3 78,8 80,9
Różnica czysty/nieobrobiony % s.m. 0,7 1,6 1,7
Czas scukrzania Min. - - < 10
Siła diastatyczna % WK 343 342 268
Kolor EBC 2,5 2,8 3,4
PH 6,05 6,01 6,12
Mętność EBC 1,5 1,3 2,5
Całkowite białko s.m. % 10,98 12,22 9,82
Azot rozpuszczalny mg/L 696 741 610
Rozp. białko % słód s.m. % s.m. 3,9 4,1 3,4
Liczba Kolbacha 35,2 33,7 34,6
Wolny azot aminowy mg/l 110 117 100
Kruchość % 91,3 81,8 89,5
Całe niemodyfikowane ziarna % 0,7 1,1 1,3
Częściowo niezmodyfikowane ziarna % 1,0 2,7 2,7
β-glukan w brzeczce mg/l 97 172 117
β-glukan w słodzie % obj. - - 0,3
S-metylometionina/DMS równ. μg/g - - -
Wolny DMS μg/g - - -
PL 208 246 B1
2. Warzenie przemysłowe ze słodem Linii G, cv Vintage oraz słodem kontrolnym cv Nevada.
Przeprowadzono dwie próby warzenia z użyciem brzeczki przygotowanej ze słodu Linii G i kontrolnego słodu cv Nevada w próbie 1 oraz ze słodu Linii G i kontrolnego słodu cv Vintage w Próbie 2.
Piwo warzono na skalę przemysłową 30-hl z 475 kg słodu zgodnie z następującym schematem: Zacieranie w 50°C; 30 minut w 50°C; 30 minut ogrzewanie od 50 do 70°C; 15 minut w 70°C. Część brzeczki podgrzewano przez 20 minut od 70 do 100°C i 5 minut w 100°C, natomiast główny zacier trzymano w 70°C przez 25 minut a następnie obydwa zaciery łączono i trzymano w 76°C przez 10 minut. Etapy warzenia - gotowanie brzeczki, oddzielanie w leju wodnym wysłodzin, chłodzenie, fermentacja, leżakowanie i butelkowanie do butelek z brązowego szkła były zgodne ze standardową praktyką warzenia.
3. Stabilność smaku oraz zawartość T2N w piwie warzonym ze słodu Linii G, cv Vintage i kontrolnego słodu cv Nevada
Świeżo butelkowane piwo przechowywano w 5°C i analizowano w czasie 2 miesięcy od produkcji. Stabilność smaku świeżego i przechowywanego piwa oceniano w dwóch niezależnych laboratoriach po dwóch różnych typach warunków przechowywania piwa. W laboratorium A piwo poddano przyspieszonemu procesowi starzenia, piwo przechowywano w 37°C przez 7 dni, podczas gdy w laboratorium B piwo przechowywano w 30°C przez 6 i 12 tygodni. Poziomy trans-2-nonenalu w piwie oceniano z użyciem chromatografii gazowej i spektrometrii masowej po derywatyzacji karbonyli 0-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzylo)-hydroksylaminą, zasadniczo jak opisano przez Gronqvist i wsp., 1993 Preeciding of the 24th EBC Congress, Oslo, 421 - 428. Wyszkolony zespół degustatorów smaku piwa oceniał ogólną punktację smaku piwa, która obejmuje wykrywanie posmaku kartonowego, wskaźnika wolnego trans-2-nonenalu w piwie.
Laboratorium A: Tolerancja na przyspieszone starzenie
Porównanie piwa warzonego ze słodu Linii G i słodu kontrolnego, cv Vintage w pierwszej próbie warzenia (Tabela 3) wykazało, że piwo z Linii G miało większą stabilność smaku i niższą zawartość trans-2-nonenalu po przyspieszonym starzeniu w porównaniu z kontrolami. Druga próba, porównująca piwo warzone ze słodu Linii G z piwem warzonym ze słodu cv Vintage, rodzicielskiej odmiany uprawnej, potwierdziła wstępne dane (Tabela 4).
T a b e l a 3
WARZENIE PRÓBA 1
Słód jęczmienny cv Nevada Linia G
Zawartość SO2 (mg/ml) 1 1
T2N** (ppb) - Świeże Piwo 0,009 0,005
T2N** (ppb) - Stare Piwo (37°C/7 dzień) 0,117 0,025
Smak* - Świeże Piwo 5,9 5,3
Smak* - Stare Piwo (37°C/7 dzień) 1,3 5,1
* skala 1-10 oceny smaku o wzrastającej jakości; ** trans-2-nonenal
T a b e l a 4
WARZENIE PRÓBA 2
Słód jęczmienny cv Vintage Linia G
Zawartość SO2 (mg/ml) 2 2,5
T2N** (ppb) - Świeże Piwo 0,023 0,019
T2N** (ppb) - Stare Piwo (37°C/7 dzień) 0,078 0,035
Smak* - Świeże Piwo 5,5 6,1
Smak* - Stare Piwo (37°C/7 dzień) 2,9 5,9
* skala 1-10 oceny smaku o wzrastającej jakości; ** trans-2-nonenal
PL 208 246 B1
Laboratorium B: tolerancja przechowywania w 30°C Piwo warzone ze słodu Linii G posiadało niższe poziomy trans-2-nonenalu po 6 i 12 tygodniach w podwyższonej temperaturze przechowywania 30°C w porównaniu z piwem warzonym z obydwu słodów kontrolnych (Tabela 5 i 6) i posiadało lepszą stabilność smaku jak osądził zespół degustatorów. Próg wyczuwalności smaku dla trans-2-nonenalu w tych analizowanych piwach wynosi blisko 0,08 ppb.
T a b e l a 5
WARZENIE PRÓBA 1
Słód jęczmienny cv Nevada Linia G
trans-2-nonenal (ppb) - Świeże Piwo 0,050 0,044
trans-2-nonenal (ppb) - 30°C/6 tygodni 0,072 0,037
trans-2-nonenal (ppb) - 30°C/12 tygodni 0,095 0,046
Smak trans-2-nonenalu* - Świeże Piwo 0,6 0,3
Smak trans-2-nonenalu* - 30°C/6 tygodni 3,7 1,4
Smak trans-2-nonenalu* - 30°C/12 tygodni 2,5 0,6
* wynik detekcji smaku trans-2-nonenalu na skali 1-10
T a b e l a 6
WARZENIE PRÓBA 2
Słód jęczmienny cv Vintage Linia G
trans-2-nonenal (ppb) - Świeże Piwo 0,070 0,062
trans-2-nonenal (ppb) - 30°C/6 tygodni 0,093 0,070
trans-2-nonenal (ppb) - 30°C/12 tygodni 0,133 0,080
Smak trans-2-nonenalu*- Świeże Piwo 0,3 0,9
Smak trans-2-nonenalu*- 30°C/6 tygodni 2,5 1,7
Smak trans-2-nonenalu*- 30°C/12 tygodni 2,2 1,3
* wynik detekcji smaku trans-2-nonenalu na skali 1-10
Wykazano, że poprawiona stabilność smaku piwa warzonego ze słodu Linii G, po zmierzeniu za pomocą poziomów trans-2-nonenalu wykrywanych w piwie po przechowywaniu w 30°C z połączonych danych z prób warzenia, jest statystycznie znacząca (Tabela 7).
T A B E L A 7
TRANS-2-NONENAL W PRZECHOWYWANYM PIWIE
Świeże Średnia Odchylenie standardowe Różnica Obustronny p Znaczący (p < 0,05)
Odniesienie 0,060 0,012 0,007 0,34 nie
Linia G 0,053 0,011
6 tygodni, 30°C Średnia Odchylenie standardowe Różnica Obustronny p Znaczący (p < 0,05)
Odniesienie 0,083 0,013 0,029 0,031 tak
Linia G 0,054 0,021
12 tygodni, 30°C Średnia Odchylenie standardowe Różnica Obustronny p Znaczący (p < 0,05)
Odniesienie 0,114 0,023 0,051 0,003 tak
Linia G 0,063 0,020
PL 208 246 B1
Ponieważ naturalne poziomy siarczynu były niskie w obydwu próbach warzenia to poziomy wolnego trans-2-nonenalu w dojrzałym piwie odzwierciedlałyby blisko potencjał trans-2-nonenalu różnych piw, mianowicie poziom adduktów trans-2-nonenalu w świeżym piwie. Dodawanie siarczynu może przejściowo opóźniać proces zwietrzania poprzez kompleksowanie wolnego trans-2-nonenalu do czasu gdy poziomy siarczynu zmniejszą się przez utlenianie wynikające z wymiany gazowej przez opakowanie.
Opisane próby warzenia ze słodem jęczmiennym o niskiej aktywności LOX jęczmienia dostarczają pierwszego jednoznacznego dowodu, że aktywność LOX-1 w jęczmieniu podczas procesu słodowania i warzenia jest kluczową determinantą wystąpienia obcego smaku związku trans-2-nonenalu w starym piwie.
PL 208 246 B1
LISTA SEKWENCJI <110» Douma, Anneke Doderer, Albert cameron-Mills, verena Skadhauge, Blrgitte eech, Lene <120» Roślina jęczmienia, jej część, ziarno, potomstwo rośliny, produkt roślinny, zastosowanie produktu roślinnego i zastosowanie rośliny jęczmienia, jej części, ziarna i potomstwa <130» 11225.12WO01 <160» 18 <170» Patentln wersja 3-0 <210» 1 <211» 143 <212» ONA <2l3> Hordeum vulgare <400> 1 ctaagccatc ggcaaccatg gatgaaraaa gggcgttcgc cacgtacgaa acttgtcgag 60 agattggtgt agtgtgtgtc tgtgacagta ctatgtcagc agttgctctt taagccgaat 120 aaataaagca gatttgcttc caa 143 <210» 2 <211» 24 <212» ONA <213» Hordeum yulgare <400» 2 gaaaagcttg gaggtagacg ctgc 24
PL 208 246 B1 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Hordeum vu1gare <40Ο> 3 tataggatcc ttgttcttgg cctcctctcc tcg
<210> 4
<2ii> 22
<212> DNA
<213> Hordeum vulgare
<400> 4 agtgaaaaac agtgtgctgg tg
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Hordeum yulgare
<400> S ggcttaaaga gcaactgctg a
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Hordeum vulgare
<400> 6 caagatgcat atgctgctgg gag
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> Hordeum vu1gare
PL 208 246 B1 <400> 7 cgatggttta aattagatgg agatgctgt <210> 8 <2łl> 4663 <212> DNA <213> Hordeum vuTgare
<400> 8 cagccccatg catgcacatg cacatgcaca tgcacatgca gtgcagccaa gcaccgctcg 60
atgggcgatc acccgtcacg ggaccggagc gcgccatgcg aagcacgagg agggcacgtc 120
accgtccgcg cgcagcacgt ggagagcacg tcgccgtccg atccatctct ccaaagccga 180
gcgccacacc accgggaccg gacccggacc ggcctataaa ttgcccggac cgagctgcaa 240
gcagctcctc acacacactc acgcaacaca catccatctt cactgaaaag tgaaaaacag 300
tgtgctggtg ccattggttg gagcagtgaa agcgaggaga ggaggccaag aacaagatgc 360
tgctgggagg gctgatcgac accctcacgg gggcgaacaa gagcgcccgg ctcaagggca 420
cggtggtgct catgcgcaag aacgtgctgg acctcaacga cttcggcgcc accatcatcg 480
acggcatcgg cgagttcctc ggcaagggcg tcacctgcca gcttatcagc tccaccgccg 540
tcgaccaagg taatcactac cctectccgg ccttctcctc tgtttacaag atatagtatt 600
tctttcgtgt gggccggcgg ccarggatgg atggatgtgt ctggatcggc taaagaagat 660
aggatagcta gccctggccg gtcgtcttta cctgagcatg ggcatatgcc atcgaaaaaa 720
gagacaacag catgcatgca tggtgcgcgc accagaccac gcagagcacc ggatgctcga 780
gacaaagcaa cacaacaagc aaggacgaca cgtcaaaagc aacacaacaa gcaaggacgg 840
cacgtcaaaa gcaacacaaa cctaaactaa agcacaaaga cgtaagagca agcacacaat 900
cagcaggcta taaacagttg tcatcaaaaa caacgctgga agagagagag aaggaaggaa 960
gtagtagcca tgaaaaatta aatcaccggg cgttgctctt tgcccaacaa ttaatcaagc 1020
agggtacgtg gcatgtatag ttcttgtaag taaactaagc atgtgatatg agaaggtacg 1080
tggtggtgca gacaacggcg gtcgcgggaa ggtgggcgcg gaggcggagc tggagcagtg 1140
ggtgacgagc ctgccgtcgc tgacgacggg ggagtccaag ttcggcctca ccttcgactg 1200
ggaggtggag aagctcgggg tgccgggcgc catcgtcgtc aacaactacc acagctccga 1260
gttcctgctt aaaaccatca ccctccacga cgtccccggc cgcagcggca acctcacctt 1320
cgtcgccaac tcatggatct accccgccgc caactaccga tacagccgcg tcttcttcgc 1380
caacgaegtg cgtggatttt cctcracttt CCtCtCCttt cattttcacc gccttcgtca 1440
PL 208 246 B1 ttcatggtcg atcattaagt cttgccagga caatagatga tgagctagga gtggttacca 1500 cttagcagta cgtacattat ttattccgtg ttggtagaaa aggatatggt ttggtgcaga 1560 tcgacacaag attgaatgaa agttgcaccg tggcaccgtg gcagcgtggt aggtgaaaat 1620 aactgttgca cggatccacc cacatgattg ttttcatgaa taaacttttt aaggatgtgt 1680 ctagccacat cragatgcat gtcacataat tattgcatac eaaaacgatt aaattaagca 1740 taaaaagaaa aggaaaaaaa tactcacata tctcgacgta agatcaatga tatagtattt 1800 agatatgcaa tatttatctt acatctaaac ctttcttcat tcttaaatat aagacatttg 1860 taagatttca ctatggacaa catacgaaac aaaatcagtg gatctctcta tgcattcatt 1920 atgtagtcta taataaaatc tttaaaagat cgtatatttt gcaacggagg gagtaaaaca 1980 taacttttta atagtaatgt tgcacggctc cacactcgca gaegtacctg ccgagccaga 2040 tgccggcggc gctgaagccg taccgcgacg acgagctccg gaacccgcgt ggcgacgacc 2100 agcagggccc gtaccaggag cacgaccgca rctaccgcta cgacgtctac aacgacctcg 2160 gcgagggccg ccccatcctc ggcggcaact ccgaccaccc ttacccgcgc cgcggccgca 2220 cggagcgcaa gcccaacgcc agcgacccga gcctggagag ccggctgtcg crgctggagc 2280 agatctacgt gccgcgggac gagaagttcg gccacctcaa gacgtccgac ttcctgggct 2340 actccatcaa ggccatcacg cagggcatcc tgccggccgt gcgcacctac gtggacacca 2400 cccccggcga gttcgactcc ttccaggaca tcatcaacct ctatgagggc ggcatcaagc 2460 tgcccaaggt ggccgccctg gaggagctcc gtaagcagtt cccgctccag ctcatcaagg 2520 acctcctccc cgtcggcggc gactccctgc ttaagctccc cgtgccccac atcatccagg 2580 agaacaagca ggcgtggagg accgacgagg agttcgcacg ggaggtgctc gccggcgtca 2640 acccggtcat gatcacgcgt ctcacggtga gtcagcgatt atttgttcat tgtgtgtgta 2700 tggtgtccat ggtgagaaag tgcagatctt gatttgcgtt gggtcgcatg cacgcatgct 2760 gcatgcatgc aggagttccc gccaaaaagt agtctggacc ctagcaagtt tggtgaccac 2820 accagcacca tcacggcgga gcacatagag aagaacctcg agggcctcac ggtgcagcag 2880 graattggtc caagccatcg acatcaacta tgatttacct aggagtaatt ggtagctgta 2940 gataatttgg cttcgttgca attaatttga tgctggccga tcaagtgatc gtattgggrt 3000 tgaaatttgc aggcgctgga aagcsacagg ctgtacatcc ttgatcacca tgaccggttc 3060 atgccgttcc tgatcgacgt caacaacctg cccggcaact tcatctacgc cacgaggacc 3120 ctcttcttec tgcgcggcga cggcaggctc acgccgctcg ccatcgagct gagcgagccc 3180 atcatccagg gcggccttac cacggccaag agcaaggttt acacgccggt gcccagcggc 3240 tccgtcgaag gctgggtgtg ggagctcgcc aaggcctacg tcgccgtcaa tgactccggg 3300 tggcaccagc tcgtcagcca ctggtacgtt ctccacggtc gatgtgattc agtcagtcga 3360
PL 208 246 B1
tgcacaacaa ctgatcgaaa tatgattgat tgaaacgcgc aggctgaaca ctcacgcggt 3420
gatggagccg ttcgtgatct cgacgaaccg gcaccttagc gtgacgcacc cggtgcacaa 3480
gctgctgagc ccgcactacc gcgacaccat gaccatcaac gcgctggcgc ggcagacgct 3540
catcaacgcc ggcggcatct tcgagatgac ggtgttcccg ggcaagttcg cgttggggat 3600
gtcggccgtg gtgtacaagg actggaagtt caccgagcag ggactgccgg acgatctcat 3660
caagaggtac gtacctggta aatgttatga atgtgtaaaa caaattgggc gtctcgctca 3720
ctgacaggaa cgtggtaaaa aaaatgcagg ggcatggcgg tggaggaccc gtcgagcccg 3780
tacaaggtgc ggttgctggt gtcggactac ccgtacgcgg cggacgggct ggcgatctgg 3840
cacgccattg agcagtacgt gagcgagtac ctggccatct actacccgaa cgacggcgtg 3900
ctgcagggcg atacggaggt gcaggcgtgg tggaaggaga cgcgcgaggt cgggcacggc 3960
gacctcaagg acgccccatg gtggcccaag atgcaaagtg tgccggagct ggccaaggcg 4020
tgcaccacca tcatctggat cgggtcggcg ctgcatgcgg cagtcaactt cgggcagtac 4080
ccctacgcgg ggttcctccc gaaccggccg acggtgagcc ggcgccgcat gccggagccc 4140
ggcacggagg agtacgcgga gctggagcgc gacccggagc gggccttcat ccacaccatc 4200
acgagccaga tccagaccat catcggcgtg tcgctgctgg aggtgctgtc gaagcactcc 4260
tccgacgagc tgtacctcgg gcagcgggac acgccggagt ggacctcgga cccaaaggcc 4320
ctggaggtgt tcaagcggtt cagcgaccgg ctggtggaga tcgagagcaa ggtggtgggc 4380
atgaaccatg acccggagct caagaaccgc aacggcccgg ctaagtttcc ctacatgctg 4440
ctctacccca acacctccga ccacaagggc gccgctgccg ggcrtaccgc caagggcarc 4500
cccaacagca tctccatcta atctaagcca tcggcaacca tggatgaata aagggcgttc 4560
gceacgtacg aaacttgtcg agagartggt gtagtgtgtg tctgtgacag tactatgtca 4620
gcagttgctc tttaagccga ataaataaag cagatttgct tcc 4663
<210> 9 <211> 862 <212> PRT <213> nordeum vulgare
<400> 9
Met Leu Leu Gly Gly Leu ile Asp Thr Leu Thr Gly Ala Asn Lys Ser 15 10 15
Ala Arg Leu Lys Gly Thr val val Leu Met Arg lys Asn val Leu Asp 20 25 30
PL 208 246 B1
Leu Asn 1 ASp 35 i Phe Gly Ala ; Thr Ile 40 > ile > Asp Gly > Ile ! Gly 45 ’ Glu i Phe Leu
Gly ' Lys 50 Gly val Thr cys Gir 55 i Leu Ile ; Ser ser • Thr 60 Ala . val Asp Gin
ASp 65 i Asn Gly Gly Arg ciy 70 Lys ; val Gly - Ala , Glu 75 Ala , Glu Leu Glu Gin 80
Trp ! val Thr Ser Leu 85 Pro Ser Leu Thr Thr 90 Gly Glu Ser Lys Phe Gly 95
Leu Thr Phe ASP 100 Trp Glu val Glu Lys 105 teu Gly val pro Gly 110 Ala Ile
val val Asn 115 Α5Π Tyr His Ser Ser 120 Glu Phe Leu Leu Lys 125 Thr Ile Thr
Leu His 130 ASP val Pro Gly Arg 135 Ser Gly Asn Leu Thr 140 Phe val Ala Asn
Ser 145 Trp Ile Tyr pro Ala 150 Ala Asn Tyr Arg Tyr 155 Ser Arg val Phe Phe 160
Ala Asn ASp Thr Tyr 165 Leu Pro Ser Gin Met 170 pro Ala Ala Leu L^S Pro
Tyr Arg ASp Asp 180 Glu Leu Arg Asn Leu 185 Arg Gly Asp ASP Gin 190 Gin Gly
Pro Tyr Gin 195 Glu His Asp Arg Ile 200 Tyr Arg Tyr Asp Val 205 Tyr Asn Asp
Leu Gly 210 Glu Gly Arg Pro Ile 215 Leu Gly Gly Asn Ser 220 A5p His Pro Tyr
Pro 225 Arg Arg Gly Arg Thr 230 Glu Arg Lys Pro Asn 235 Ala ser ASP Pro Ser 240
Leu Gl u ser Arg Leu 245 Ser Leu Leu Glu Gin 250 ile Tyr val Pro Arg Asp 255
Glu Lys phe Gly 260 His Leu Lys Thr Ser 265 ASP Phe Leu Gly Ser ile
Lys Ala Ile 275 Thr Gin Gly Ile Leu 280 Pro Ala val Arg Thr 285 Tyr val ASp
Thr Thr 290 pro Gly Glu Phe ASP 295 ser Phe Gin ASP ile 300 Ile Asn Leu Tyr
Glu 305 Gly Gly ile Lys Leu 310 Pro Lys val Ala Ala 315 Leu Glu Glu Leu Arg 320
Lys Gin Phe Pro Leu 325 Gin Leu Ile Lys Asp 330 Leu Leu Pro val 33? 61y
Asp Ser teu Leu 340 Lys Leu Pro val Pro 345 His He Ile Gin Glu 350 Α5Π Lys
Gin , Ala 1 Trp 355 Arg Thr Asp Glu Glu 360 Phe Ala Arg Glu val 365 Leu Ala Gly
Val . ASn i pro ’ val Met Ile Thr Arg Leu Thr. GlU Phe Pro pro Lys Ser
PL 208 246 B1
370 375 380
Ser Leu Asp Pro Ser Lys Phe Gly Asp His Thr Ser Thr ile Thr Ala 385 390 395 400
Glu His Ile Glu Lys Asn Leu Glu Gly Leu Thr.val Gin Gin Ala Leu
405 410 415
Glu ser Asr i Arg i leu i Tyr Ile ! Leu Asp His ί His ; Asp * Arg i Phe ! Met : Pro
420 ) 425 430
Phe i Leu i Ile t ASP val Asn Α5Π i Leu i Pro i Gly ' Asn Phe ile Tyr Ala Thr
435 440 445
Arg Thr Leu Phe Phe Leu Arg Gly ASP Gly Arg Leu Thr Pro Leu Ala
450 455 460
Ile 465 Gl u Leu Ser Glu Pro 470 Ile ile Gin Gly 55? Leu Thr Thr Ala Lys 480
ser Lys val Tyr Thr Pro val Pro Ser Gly Ser val Glu Gly Trp val
485 490 495
Trp Glu Leu Ala Lys Ala Tyr val Ala val Asn ASp Ser Gly Trp His
500 505 510
Gin Leu val Ser His Trp Leu Asn Thr His Ala val Met Glu Pro Phe
515 520 525
val He Ser Thr Asn Arg His Leu Ser val Thr His Pro val His Lys
530 535 540
Leu Leu Ser Pro His Tyr Arg ASP Thr Met Thr ile ASn Ala teu Ala
545 550 555 560
Arg Gin Thr Leu Ile Α5Π Ala Gly Gly ile Phe Glu Met Thr val Phe
565 570 575
Pro Gly Lys Phe 580 Ala Leu Gly Met Ser 585 Ala val val Tyr Lys 590 Asp Trp
Lys Phe Thr Glu Gin Gly Leu pro ASp ASP Leu Ile Lys Arg Gly Met
595 600 605
Ala val Glu ASp pro ser Ser pro Tyr Lys val Arg Leu Leu val Ser
610 615 620
Asp 625 Tyr Pro Tyr Ala Ala 630 ASP Gly Leu Ala ile 635 Trp His Ala Ile Glu 640
Gin 7yr val ser Glu 645 Tyr Leu Ala Ile Tyr 650 Tyr Pro Asn ASp Gly 655 val
Leu Gl n Gly ASP Thr Glu val Gin Ala Trp Trp Lys Glu Thr Arg Glu
660 665 670
val Gly His 675 Gly Asp Leu Lys Asp 680 Ala Pro Trp Trp Pro 685 Lys Met Gin
ser val pro Glu Leu Ala Lys Ala Cys Thr Thr Ile Ile Trp ile Gly
690 695 700
Ser Ala Leu His Ala Ala val Asn Phe Gly Gin Tyr Pro Tyr Ala Gly
705 710 715 720
PL 208 246 B1
Phe teu Pro Asn Arg 725 Pro Thr val Ser Arg 730 : Arg Arg Met Pro Glu 735 pro
Gly Thr Glu Glu Tyr Ala Glu Leu Glu Arg Asp Pro Glu Arg Ala Phe
740 745 750
ile His Thr Ile Thr ser Gin Ile Gin Thr Ile Ile Gly val Ser teu
755 760 765
Leu Glu val Leu Ser Lys His ser Ser Asp Glu Leu Tyr Leu Gly Gin
770 775 780
Arg ASp Thr Pro Glu Trp Thr Ser ASp Pro Lys Ala Leu Glu val Phe
785 790 795 800
Lys Arg phe ser Asp 805 Arg Leu val Glu., Ile 810 Glu Ser i-ys val Val 815 Gly
Met Α5Π Hi S ASP 820 Pro Glu Leu Lys Asn 825 Arg Asn Gly Pro Ala 830 Lys Phe
pro Tyr Met Leu Leu Tyr pro Asn Thr ser Asp His Lys Gly Ala Ala
835 840 845
Ala Gly leu Thr Ala Lys Gly Ile pro Asn Ser ile Ser Ile
850 855 860
<2l0> 10
<211> 2818
<212> ONA
<213» Kordeum vulgare
<400» 10 agtgaaaaac agtgtgctgg tgccattggt tggagcagtg aaagcgagga gaggaggcca 60
agaacaagat gctgctggga gggctgatcg acaccctcac 99999C9aac aagagcgccc 120
ggctcaaggg cacggtggtg ctcatgcgca agaacgtgct ggacctcaac gacttcggcg 180
ccaccateat cgacggcatc ggcgagttcc tcggcaaggg cgtcacctgc cagcttatca 240
gctccaccgc cgtcgaccaa gacaacggcg gtcgcgggaa ggtgggcgcg gaggcggagc 300
tggagcagtg ggtgacgagc ctgccgtcgc tgacgacggg ggagtccaag ttcggcctca 360
ccttcgactg ggaggtggag aagctcgggg tgccgggcgc catcgtcgtc aacaactacc 420
acagctccga gttcctgctt aaaaccatca ccctccacga cgtccccggc cgcagcggca 480
acctcacctt cgtcgccaac tcatggatct accccgccgc caactaccga tacagccgcg 540
tcttcttcgc caacgacacg tacctgccga gccagatgcc ggcggcgctg aagccgtacc 600
gcgacgacga gctccggaac ctgcgtggcg acgaccagca gggcccgtac caggagcacg 660
accgcatcta ccgctacgac gtctacaacg acctcggcga gggccgcccc atcctcggcg 720
gcaactccga ccacccttac ccgcgccgcg gccgcacgga gcgcaagccc aacgccagcg 780
PL 208 246 B1 acccgagcct ggagagccgg ctgtcgctgc tggagcagat ctacgtgccg cgggacgaga 840 agttcggcca cctcaagacg tccgacttcc tgggctactc catcaaggce atcacgcagg 900 gcatcctgcc ggccgtgcgc acctacgtgg acaccacccc cggcgagttc gactccttcc 960 aggacatcat caacctctat gagggcggca tcaagctgcc caaggtggec gccctggagg 1020 agctccgtaa gcagttcccg ctccagctca tcaaggacct cctccccgtc ggcggcgact 1080 ccctgcttaa gctccccgtg ccccacatca tccaggagaa caagcaggcg tggaggaccg 1140 acgaggagtt cgcacgggag gtgctcgccg gcgtcaaccc ggtcatgatc acgcgtctca 1200 cggagttccc gccaaaaagt agtctggacc ctagcaagtt tggtgaccac accagcacca 1260 tcacggcgga gcacatagag aagaacctcg agggcctcac ggtgcagcag gcgctggaaa 1320 gcaacaggct gtacatcctt gatcaccatg accggttcat gccgttcctg atcgacgtca 1380 acaacctgcc cggcaactte atctacgcca cgaggaccct cttcttcctg cgcggcgacg 1440 gcaggctcac gccgctcgcc atcgagctga gcgagcccat catccagggc ggccttacca 1500 cggccaagag caaggtttac acgccggtge ccagcggctc cgtcgaaggc tgggtgtggg 1560 agctcgccaa ggcctacgtc gccgtcaatg actccgggtg gcaccagctc gtcagccact 1620 ggctgaacac tcacgcggtg atggagccgt tcgtgatctc gacgaaccgg caccttagcg 1680 tgacgcaccc ggtgcacaag ctgctgagcc cgcactaccg cgacaccatg accatcaacg 1740 cgctggcgcg gcagacgctc atcaacgccg gcggcatctt cgagatgacg gtgttcccgg 1800 gcaagttcgc gttggggatg tcggccgtgg tgtacaagga ctggaagttc accgagcagg 1860 gactgccgga cgatctcatc aagaggggca tggcggtgga ggacccgtcg agcccgtaca 1920 aggtgcggtt gctggtgtcg gactacccgt acgcggcgga egggctggcg atctggcacg 1980 ccattgagca gtacgtgagc gagtacctgg ccatctacta cccgaacgac ggcgtgctgc 2040 agggcgatac ggaggtgcag gcgtggtgga aggagacgcg cgaggtcggg cacggcgacc 2100 tcaaggacgc cccatggtgg cccaagatgc aaagtgtgcc ggagctggcc aaggcgtgca 2160 ccaccatcat ctggatcggg tcggcgctgc atgcggcagt caacttcggg cagtacccct 2220 acgcggggtt cctcccgaac cggccgacgg tgagccggcg ccgcatgccg gagcccggca 2280 cggaggagta cgcggagctg gagcgcgacc cggagcgggc cttcatccac accatcacga 2340 gccagatcca gaccatcatc ggcgtgtcgc tgctggaggt gctgtcgaag cactcctccg 2400 acgagctgta cctcgggcag cgggacacgc cggagtggac ctcggaccca aaggccctgg 2460 aggtgttcaa gcggttcagc gaccggctgg tggagatcga gagcaaggtg gtgggcatga 2520 accatgaccc ggagctcaag aaccgcaacg gcccggctaa gtttccctac atgctgctct 2580 accccaacac ctccgaccac aagggcgccg ctgccgggct taccgccaag ggcatcccca 2640 acagcatctc catctaatct aagccatcgg caaccatgga tgaataaagg gcgttcgcca 2700
PL 208 246 B1 cgtacgaaac ttgtcgagag attggtgtag tgtgtgtctg tgacagtact atgtcagcag 2760 ttgctcttta agccgaataa ataaagcaga tttgcttcca aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2818 <210> 11 <211> 4663 <212> DNA <213> Hordeum vuTgare <22O>
<221> wariant <222> (2346)..(2348) <223> ”n to a, C. t lub g kodujące aminokwas kwasowy, zasadowy lub polarny i
<400> 11 cagccccatg catgcacatg cacatgcaca tgcacatgca gtgcagccaa gcaccgctcg 60
atgggcgatc acccgtcacg ggaccggagc gcgccatgcg aagcacgagg agggcacgtc 120
accgtccgcg cgcagcacgt ggagagcacg tcgccgtccg atccatctct ccaaagccga 180
gcgccacacc accgggaccg gacccggacc ggcctataaa trgcccggac cgagctgcaa 240
gcagctcctc acacacactc acgcaacaca catccatctt cactgaaaag tgaaaaacag 300
tgtgctggtg ccattggttg gagcagtgaa agcgaggaga ggaggccaag aacaagatge 360
tgctgggagg gctgatcgac accctcacgg gggcgaacaa gagcgcccgg ctcaagggca 420
cggtggtgct catgcgcaag aacgtgctgg acctcaacga cttcggcgcc accatcatcg 480
acggcategg cgagttcctc ggcaagggtg tcacctgcca gcttatcagc tccaccgccg 540
tcgaccaagg taatcactac cctcctccgg ccttctcctc tgtttacaag atatagtatt 600
tctttcgtgt gggccggcgg ccatggatgg atggatgtgt ctggatcggc taaagaagat 660
aggatagcta gccctggccg gtcgtcttta cctgagcatg ggcatatgcc atcgaaaaaa 720
gagacaacag catgcatgca tggtgcgcgc accagaccac gcagagcacc ggatgctcga 780
gacaaagcaa cacaacaagc aaggacgaca cgtcaaaagc aacacaacaa gcaaggacgg 840
cacgtcaaaa gcaacacaaa cctaaaetaa agcacaaaga cgtaagagca agcacacaat 900
cagcaggcta taaacagttg tcatcaaaaa caacgctgga agagagagag aaggaaggaa 960
gtagtagcca tgaaaaatta aatcaccggg cgttgctctt tgcccaacaa ttaatcaagc 1020
agggtacgtg gcatgtatag ttcttgtaag taaactaagc atgtgatatg agaaggtacg 1080
PL 208 246 B1 tggtggtgca gacaacggcg gtcgcgggaa ggtgggcgcg gaggcggagc tggagcagtg 1140 ggtgacgagc ctgccgtcgc tgacgacggg ggagtccaag ttcggcctca ccttcgactg 1200 ggaggtggag aagctcgggg tgccgggcgc catcgtcgtc aacaactacc acagctccga 1260 gttcctgctt aaaaccatca ccctccacga cgtccccggc cgcagcggca acctcacctt 1320 cgtcgccaac tcatggatct accccgccgc caactaccga tacagccgcg tcttcttcgc 1380 caacgacgtg cgtggatttt cctctacttt cctctccttt cattttcacc gccttcgtca 1440 ttcatggtcg atcattaagt cttgccagga caatagatga tgagctagga gtggttacca 1500 cttagcagta cgtacattat ttattccgtg ttggtagaaa aggatatggt ttggtgcaga 1560 tcgacacaag attgaatgaa agttgcaccg tggcaccgtg gcaęcgtggt aggtgaaaat 1620 aactgttgca cggatccacc cacatgattg ttttcatgaa taaacttttt aaggatgtgt 1680 ctagccacat ctagatgcat gtcacataat tattgcatac eaaaacgatt aaattaagca 1740 taaaaagaaa aggaaaaaaa tactcacata tctcgacgta agatcaatga tatagtattt 1800 agatatgcaa tatttatctt acatctaaac ctttcttcat tcttaaatat aagacatttg 1860 taagatttca ctatggacaa catacgaaac aaaatcagtg gatctctcta tgcattcatt 1920 atgtagtcta taataaaatc tttaaaagat cgtatatttt gcaacggagg gagtaaaaca 1980 taacttttta atagtaatgt tgcacggctc cacactcgca gaegtacctg ccgagccaga 2040 tgccggcggc gctgaagccg taccgcgacg acgagctccg gaacctgcgt ggcgacgacc 2100 agcagggccc gtaccaggag cacgaccgca tctaccgcta cgacgtctac aacgacctcg 2160 gcgagggccg ccccatcctc ggcggcaact ccgaccaccc ttacccgcgc cgcggccgca 2220 cggagcgcaa gcccaacgcc agcgacccga gcctggagag ccggctgtcg ctgctggagc 2280 agatctacgt gccgcgggac gagaagttcg gccacctcaa gacgtccgac ttcctgggct 2340 actccatcaa ggccatcacg cagggcatcc tgccggccgt gcgcacctac gtggacacca 2400 cccccggcga gttcgactcc ttccaggaca tcatcaacct ctatgagggc ggcatcaagc 2460 tgcccaaggt ggccgccctg gaggagctcc gtaagcagtt cccgctccag ctcatcaagg 2520 acctcctccc cgtcggcggc gactccctgc ttaagctccc cgtgccccac atcatccagg 2580 agaacaagca ggcgtggagg accgacgagg agttcgcacg ggaggtgctc gccnnngtca 2640 acccggtcat gatcacgcgt ctcacggtga gtcagcgatt atttgttcat tgtgtgtgta 2700 tggtgtccat ggtgagaaag tgcagatctt gatttgcgtt gggtcgcatg cacgcatgct 2760 gcatgcatgc aggagttccc gccaaaaagt agtctggacc ctagcaagtt tggtgaccac 2820 accagcacca tcacggcgga gcacatagag aagaacctcg agggcctcac ggtgcagcag 2880 graattggtc caagccatcg acatcaacta tgatttacct aggagtaatt ggtagctgta 2940 gataatttgg cttcgttgca attaatttga tgctggccga tcaagtgatc gtattgggtt 3000
PL 208 246 B1 aagcaacagg ctgtacatcc ttgatcacca tgaccggttc 3060 caacaacctg cccggcaact tcatctacgc cacgaggacc 3120 cggcaggctc acgccgctcg ccatcgagct gagcgagccc 3180 cacggccaag agcaaggttt acacgccggt gcccagcggc 3240 ggagctcgcc aaggcctacg tcgccgteaa tgactccggg 3300 ctggtacgtt ctccacggtc gatgtgattc agtcagtcga 3360 tatgattgat tgaaacgcgc aggctgaaca ctcacgcggt 3420 cgacgaaccg gcaccttagc gtgacgcacc cggtgcacaa 3480 gcgacaccat gaccatcaac gcgctggcgc ggcagacgct 3540 tcgagatgac ggtgttcccg ggcaagttcg cgttggggat 3600 actggaagtt caccgagcag ggaćtgccgg acgatctcat 3660 aatgttatga atgtgtaaaa caaattgggc gtctcgctca 3720 aaaatgcagg ggcatggcgg tggaggaccc gtcgagcccg 3780 gtcggactac ccgtacgcgg cggacgggct ggcgatctgg 3840 gagcgagtac ctggccatct actacccgaa cgacggcgtg 3900 gcaggcgtgg tggaaggaga cgcgcgaggt cgggcacggc 3950 gtggcccaag atgcaaagtg tgccggagct ggccaaggcg 4020 cgggtcggcg ctgcatgcgg cagtcaactt cgggcagtac 4080 gaaccggccg acggtgagcc ggcgccgcat gccggagccc 4140 gctggagege gacccggagc gggccttcat ccacaccatc 4200 catcggcgtg tcgctgctgg aggtgctgtc gaagcactcc 4260 gcagcgggac acgccggagt ggacctcgga cccaaaggcc 4320 cagcgaccgg ctggtggaga tcgagagcaa ggtggtgggc 4380 caagasccgc aacggcccgg ctaagtttcc ctacatgctg 4440 ccacaagggc gcęgctgceg ggcttaccgc caagggcatc 4500 atctaagcca tcggcaacca tggatgaata aagggcgttc 4560 agagattggt gtagtgtgtg tctgtgacag tactatgtca 4620 ataaataaag cagatttgct tcc 4663 tgaaatttgc aggcgctgga atgccgttcc tgatcgacgt ctcttcttcc tgcgcggcga atcatccagg gcggccttac tccgtcgaag gctgggtgtg tggcaccagc tcgtcagcca tgcacaacaa ctgatcgaaa gatggagccg ttcgtgatct gctgctgagc ccgcactacc catcaacgcc ggcggcatct gtcggccgtg gtgtacaagg caagaggtac gtacctggta ctgacaggaa cgtggtaaaa tacaaggtgc ggttgctggt cacgccattg agcagtacgt ctgcagggcg atacggaggt gacctcaagg acgccccatg tgcaccacca tcatetggat ccctacgcgg ggttcctccc ggcacggagg agtacgcgga acgagccaga tccagaccat rccgacgagc tgtacctegg ctggaggtgt tcaagcggtt atgaaccatg acccggagct ccctacccca acacctccga cccaacagca tctccatcta gccacgtacg aaacttgtcg gcagrtgctc tttaagccga <2lO> 12 <211> 862 «212» PRT <213» Hordeum vulgare
PL 208 246 B1 <22 0>
<221> wariant <222> (368)..(368) <223> Χδδ” aminokwas kwasowy, zasadowy lub polarny <400> 12
Met 1 Leu Leu Gly Gly 5 Leu ile ASP Thr Leu 10 Thr Gly Ala Asn ΪΓ Ser
Ala Arg Leu Lys Gly Thr val val Leu Met Arg tyś Asn val Leu Asp
20 25 30
Leu Asn ASp Phe Gly Ala Thr Ile Ile ASP Gly Ile Gly Glu Phe Leu
35 40 45
Gly Lys Gly val Thr cys Gln Leu Ile Ser Ser Thr Ala val Asp Gln
50 55 60
ASp Asn Gly Gly Arg Gly Lys val Gly Ala Glu Ala Glu Leu Glu Gln
65 70 75 80
Trp val Thr Ser Leu Pro Ser Leu Thr Thr Gly Glu Ser Lys phe Gly
85 90 95
Leu Thr Phe asp Trp 100 Glu val Glu Lys 105 Leu Gly val pro Gly Ala Ile 110
Val val Asn Asn Tyr His Ser ser Glu Phe Leu Leu Lys Thr Ile Thr
115 120 125
Leu His ASp val pro Gly Arg ser Gly Asn Leu Thr Phe val Ala Asn
130 135 140
Ser Trp Ile Tyr pro Ala Ala Asn Tyr Arg Tyr Ser Arg val Phe Phe
145 150 155 160
Ala Asn Asp Thr Tyf- Leu pro Ser Gln Met pro Ala Ala Leu Lys Pro
US 170 175
Tyr Arg ASp Asp Glu Leu Arg Asn Leu Arg Gly ASP Asp Gln Gin Gly
180 185 190
Pro Tyr Gln Glu His ASp Arg Ile Tyr Arg Tyr ASP val Tyr Asn Asp
195 200 205
Leu Gly Glu Gly Arg pro Ile Leu Gly Gly Asn ser Asp His Pro Tyr
210 215 220
Pro Arg Arg Gly Arg Thr Glu Arg Lys pro ASO Ala Ser Asp Pro Ser
225 230 235 240
Leu Glu ser Arg Leu ser Leu Leu Glu Gln Ile Tyr val Pro Arg ASp
245 250 255
Glu tys phe Gly His Leu Lys Thr Ser Asp Phe Leu Gly Tyr Ser ile
PL 208 246 B1
260 265 270
Lys Ala . Ile Thr Gin Gly Ile Leu Pro Ala val Arg Thr Tyr val Asp
275 280 285
Thr Thr pro Gly Glu Phe ASP Ser Phe Gin Asp Ile Ile Asn Leu Tyr
290 295 300
Glu 305 Gly Gly Ile Lys Leu 310 Pro Lys val Ala Ala 315 Leu Glu Gl u Leu Arg 320
Lys Gin phe Pro Leu 325 Gin Leu ile Lys Asp Leu 330 Leu pro val Gly 335 Gly
ASP Ser teu Leu 340 uys Leu Pro val Pro 345 wis Ile ile Gin Glu 350 Asn Lys
Gin Ala Trp Arg Thr ASP Glu Glu Phe Ala Arg Glu val Leu Ala xaa
355 360 365
val Asn pro val Met ile Thr Arg teu Thr Glu Phe pro Pro Lys Ser
370 375 380
ser Leu ASp Pro Ser Lys Phe Gly Asp His Thr Ser Thr ile Thr Ala
385 390 395 400
Glu His ile Glu Lys Asn Leu Glu Gly teu Thr Val Gin Gin Ala Leu
405 410 415
Glu ser Asn Arg Leu Tyr ile Leu ASp His His ASP Arg phe Met Pro
420 425 430
phe Leu ile ASp val Asn Asn Leu Pro Gly Asn Phe ile Tyr Ala Thr
435 440 445
Arg Thr Leu Phe Phe teu Arg Gly Asp Gly Arg Leu Thr Pro Leu Ala
450 455 460
Ile Glu Leu Ser Glu Pro ile Ile Gin Gly Gly Leu Thr Thr Ala Lys
465 470 475 480 ser Lys val Tyr Thr Pro val Pro ser cly Ser val Glu Gly Trp val
485 4 495
Trp Glu Leu Ala Lys Ala Tyr Val Ala val Asn Asp Ser Gly Trp His 500 505 510
Gin Leu val ser His Trp Leu Asn Thr his Ala val Met Glu pro Phe 515 520 525 val ile ser Thr Asn Arg His Leu ser val Thr His Pro val His Lys 530 535 540
Leu Leu Ser Pro His Tyr Arg Asp Thr Met Thr Ile Asn Ala Leu Ala
545 550 555 560
Arg Gin Thr Leu ile Asn Ala Gly Gly Ile Phe Glu Met Thr yal Phe
565 570 575
Pro Gly Lys Phe Ala Leu Gly Met Ser Ala val val Tyr Lys asp Trp
Lys Phe Thr Glu Gin Gly Leu Pro asp Asp Leu Ile Lys Arg Gly Met
S9S 600 605
PL 208 246 B1
Ala val Glu 610 Asp Pro Ser Ser Pro Tyr 615 Lys val Arg 620 Leu Leu val Ser
Asp Tyr Pro Tyr Ala Ala Asp Gly Leu Ala Ile Trp His Ala ile Glu
625 630 635 640
Gin Tyr val Ser Glu Tyr Leu Ala ile Tyr Tyr Pro Asn ASP Gly val
645 650 655
Leu Gin Gly ASP Thr Glu val Gin Ala Trp Trp Lys Glu Thr Arg Glu
660 665 670
Val Gly His Gly Asp Leu Lys ASP Ala Pro Trp Trp Pro Lys Met Gin
675 680 685
Ser val Pro Glu Leu Ala Lys Ala Cys Thr Thr Ile Ile rrp Ile Gly
690 695 700
Ser Ala Leu His Ala Ala Val Asn Phe Gly Gin Tyr Pro Tyr Ala Gly
705 710 715 720
Phe ueu Pro Asn Arg Pro Thr val ser Arg Arg Arg Met Pro Glu Pro
725 730 73S
Gly Thr Glu Glu Tyr Ala Glu teu Glu Arg Asp Pro Glu Arg Ala Phe
740 745 750
Ile Hi s Thr 755 ile Thr Ser Gin ile 760 Gin Thr ile ile & Val Ser Leu
teu Glu val Leu Ser Lys His ser ser ASP Glu Leu Tyr Leu Gly Gin
770 775 780
Arg Asp Thr Pro Glu Trp Thr Ser Asp Pro Lys Ala Leu Glu val Phe
785 790 795 800
Lys Arg Phe Ser ASp Arg Leu val Glu Ile Glu Ser Lys val val Gly
805 810 815
Met Asn His Asp Pro Gl u Leu LyS Asn Arg Asn Gly Pro Ala Lys Phe
820 825 830
Pro Tyr Met Leu Leu Tyr Pro Asn Thr Ser Asp His Lys Gly Ala Ala
635 840 845
Ala Gly 850 Leu Thr a! a Lys & Ile Pro Asr Ser ile 860 Ser Ile
<2l0> 13
<211> 20
<212> ONA
<213> Hordeum vulgare
<40G> 13
cgctacgacg tctacaacga <21O> 14
PL 208 246 B1 «211> 20 <212> DNA <213> Hordeum vulgare <400> 14 cagactactt tttggcggga <210> 15 <211> 839 <212> PP.T <213> Glycine rnax <400> 15
Met 1 Phe ser Ala Gly 5 HiS Lys Ile Lys Gly 10 Thr val val Leu Met 15 pro
Lys Asn Glu Leu 20 Glu val Asn Pro ASp 25 Gly Ser Ala val ASp 30 Asn Leu
Asn Ala Phe Leu Gly Arg Ser val Ser Leu Gin Leu Ile ser Ala Thr
35 40 45
lys Ala 50 ASp Ala HiS Gly kf Gly Lys val Gly Lys 60 Asp Thr Phe Leu
Glu 65 Gly Ile Asn Thr Ser 70 Leu pro Thr Leu Gly 75 Ala Gly Glu ser Ala 80
phe Asn ile His Phe Glu Trp ASp Gly Ser Met Gly Ile Pro Gly Ala
85 90 95
phe Tyr ile Lys 100 Asn Tyr Met Gin val 105 Gl U phe Phe Leu Lys 110 Ser Leu
Thr Leu Glu Ala Ile Ser Asn Gin Gly Thr ile Arg Phe val Cys Asn
115 120 125
Ser Trp 130 Val Tyr Asn Thr kil Leu Tyr Lys ser val 140 Arg Ile Phe Phe
Ala 145 Asn His Thr Tyr val 150 Pro Ser Glu Thr pro 155 Ala Pr© teu val Ser 160
Tyr Arg Glu Glu Glu 165 Leu Lys Ser Leu Arg 170 Gly Asn Gly Thr ciy 175 Glu
Arg Lys Glu Tyr 180 Asp Arg Ile Tyr ASP 185 Tyr ASp val Tyr Asn 190 ASp Leu
Gly Asn Pro ASP Lys Ser Glu Lys 200 Leu Ala Arg Pro val 205 Leu Gly Gly
PL 208 246 B1
Ser Ser Thr Phe Pro Tyr pro Arg Arg Gly Arg Thr Gly Arg Gly Pro 210 215 220
Thr val Thr Asp pro Asn Thr Glu Lys Gin Gly Glu val Phe Tyr val
225 230 235 240 pro Arg Asp Glu Asn Leu Gly wis Leu Lys Ser Lys Asp Ala Leu Glu
245 250 255
Ile Gly Thr Lys Ser Leu Ser Gin ile val Gin Pro Ala Phe Glu Ser 260 265 270
Ala Phe Asp Leu Lys Ser Thr Pro ile Glu Phe His Ser Phe Gin Asp 275 280 285 val His Asp Leu Tyr clu Gly Gly ile Lys teu Pro Arg Asp val Ile 290 295 300
Ser Thr ile ile Pro Leu Pro val ile Lys Glu Leu Tyr Arg Thr Asp 305 310 315 320
Gly Gin Hi s ile Leu 325 Lys Phe Pro Gin Pro His 330 val val Gin val 335 Ser
Gin Ser Ala Trp wet Thr Asp Glu Glu Phe Ala Arg Glu Met ile Ala
340 345 350
Gly val Α5Π Pro Cys val ile Arg Gly Leu Glu Glu Phe Pro Pro Lys
355 360 365
Ser Asn teu Asp Pro Ala Ile Tyr Gly Asp Gin Ser Ser Lys ile Thr
370 375 380
Ala Asp ser Leu ASp Leu ASP Gly Tyr Thr Met ASP Glu Ala Leu Gly
385 390 395 400
Ser Arę Arg teu Phe 405 Met Leu ASp Tyr Hi S 410 ASp Ile Phe wet pro 415 Tyr
Val Arg Gin Ile Asn Gin Leu Asn ser Ala Lys Thr Tyr Ala Thr Arg
420 425 430
Thr ile Leu Phe Leu Arg Glu Asp Gly Thr Leu Lys Pro val Ala Ile
435 440 445
Glu Leu ser Leu Pro His Ser Ala Gly ASP Leu 5er Ala Ala val Ser
4S0 4 55 460
Gin val val Leu Pro Ala LyS Glu Gly val Glu Ser Thr ile Trp Leu
465 470 475 480
teu Ala tys Ala Tyr val He val Asn ASP Ser cys Tyr His Gin teu
485 490 495
Met Ser His Trp Leu Asn Thr His Ala Ala Met Glu Pro Phe val Ile
500 505 510
Ala Thr His Arg His Leu Ser val Leu His pro Ile Tyr Lys Leu Leu
515 520 525
Thr Pro His Tyr Arg Asn Asn Met Asn ile Α5Π Ala Leu Ala Arg Gin
530 535 540
Ser Leu Ile Asn Ala A$n Gly Ile ll e Glu Thr Thr Phe Leu Pro Ser
PL 208 246 B1
545 550 555 560
Lys Tyr Ser val Glu wet Ser Ser Ala val Tyr Lys Asn Trp val Phe 565 570 575
Thr ASP Gin Ala Leu Pro Ala ASp teu Ile Lys Arg Gly val Ala Ile
580 585 590
Lys ASP Pro 595 Ser Thr Pro His Gly 600 val Arg Leu Leu Ile 605 Glu ASP Tyr
Pro Tyr Ala Ala ASp Gly Leu Glu Ile Trp Ala Ala Ile Lys Thr Trp
610 615 620
val Gin Glu Tyr val Pro Leu Tyr Tyr Ala ASP Asp Asp val Lys
625 630 635 640
Asn Asp Ser Glu Leu Gin His Trp ΤΓΡ Lys Glu Ala val Glu Lys Gly
645 650 655
His Gly ASp Leu 660 Lys Asp Lys Pro Trp 665 Trp Pro Lys Leu Gin 670 Thr Leu
Glu Asp Leu val Gl u Val cys Leu ile Ile ile Trp Ile Al a Ser Ala
675 680 685
Leu Hi s Ala Ala val Asn phe Gly Gin Tyr Pro dy Gly Leu Ile
690 695 700
Met 705 Asn Arg Pro Thr Ala 710 Ser Arg Arg Leu Leu 715 Pro Glu Lys Gly Thr 720
pro Gl u Tyr Glu Glu 725 Met Ile Α5Π Asn HIS 730 Glu Lys Ala Tyr Leu 735 Arg
Thr Ile Thr Ser Lys Leu pro Thr Leu Ile Ser Leu Ser val ile Glu
740 745 750
Ile Leu Ser Thr Hi s a! a Ser A5P Glu val Tyr Leu Gly Gin Arg Asp
7S5 760 765
Asn Pro His Trp Thr ser ASP Ser Lys Ala Leu Gin Ala Phe Gin Lys
770 775 780
Phe 785 Gly Asn Lys Leu tys 790 Gl u Ile Glu Glu Lys 795 Leu Val Arg Arg Asn 800
Asn Asp Pro Ser Leu 805 Gin Gly Asn Arg Leu 810 Gly pro val Gin Leu 815 ΡΓΟ
Tyr Thr Leu Leu 820 Tyr pro Ser Ser Glu 825 Glu Gly Leu Thr Phe 830 Arg Gly
ile Pro Asn Ser Ile Ser Ile
835 <210> 16 <211> 855 <212> PRT <213> Glycine max
PL 208 246 B1
<40 0> 16
Met Phe ser val Pro Gly val Ser Gly Ile teu Asn Arg Gly Gly Gly
1 5 10 15
His Lys Ile uys Gly Thr val val Leu Met Arg Lys ASn val Leu Asp
20 25 30
Phe Asn ser val Ala Asp Leu Thr Lys Gly Asn val Gly Gly Leu Ile
35 40 45
Gly Thr Gly Leu Asn val val Gly Ser Thr Leu ASP Asn Leu Thr Ala
50 55 60
Phe Leu Gly Arg Ser val Ala Leu Gin Leu Ile Ser Ala Thr Lys pro
65 70 75 80
Leu Ala Asn Gly Lys Gly Lys val Gly Lys Asp Thr Phe Leu Glu Gly
85 90 95
ile Ile val Ser Leu pro Thr Leu Gly Ala Gly Glu Ser Ala Phe Asn
100 105 110
Ile Gin Phe Glu Trp ASP Glu Ser Met Gly Ile Pro Gly Ala Phe Tyr
115 120 125
ile Lys Asn Tyr Met Gin val Gl u phe Tyr Leu Lys Ser Leu Thr Leu
130 135 140
Glu Asp val Pro Asn Gin Gly Thr Ile Arg Phe val Cys Asn Ser Trp
145 150 155 160 val Tyr Asn Thr Lys teu Tyr Lys Ser val Arg Ile Phe Phe Ala Asn
165 170 175
His Thr Tyr val Pro Ser Glu Thr Pro a! a Al a Leu val Gly Tyr Arg
180 185 190
Glu Glu Glu Leu Lys Asn Leu Arg Gly Asp Gly Lys Gly Glu Arg Lys
195 200 205
Glu His ASp Arg ile Tyr Asp Tyr ASP val Tyr Asn ASp Leu Gly Asn
210 215 220
pro Asp His Gly Glu Asn Phe Ala Arg Pro Ile Leu Gly Gly Ser ser
225 230 235 240
Thr His pro Tyr Pro Arg Arg Gly Arg Thr Gly Arg Tyr ΡΓΟ Thr Arg
245 250 255
Lys ASp Gin Asn Ser Glu Lys pro Gly Glu val Tyr val pro Arg Asp
260 265 270
Glu Α5Π Phe Gly His Leu Lys Ser Ser ASp Phe Leu Ala Tyr Gly Ile
275 280 285
Lys Ser Leu Ser Gin Tyr val Leu Pro Ala Phe Glu Ser val Phe ASp
290 295 300
Leu Asn Phe Thr pro Asn Glu Phe Asp Ser Phe Gin ASp val Arg ASP
305 310 315 320
PL 208 246 B1
teu HIS Glu Gly Gly 325 ile Lys Leu Pro Thr Glu val 330 ile Ser Thr 335 Ile
Met Pro Leu Pro val val tys Glu Leu Phe Arg Thr ASP Gly Glu Gin
340 345 350
val Leu Lys Phe Pro Pro Pro His val Ile Gin val ser Lys ser Ala
355 360 365
Trp wet Thr Asp Glu Glu Phe Ala Arg Glu Met va1 Ala Gly val Asn
370 375 380
Pro Cys val ile Arg Gly Leu Gin Glu Phe Pro Pro tys Ser Asn Leu
385 390 395 400
ASp Pro Thr ile Tyr Gly Gllł Gin Thr Ser Lys Ile Thr Ala Asp Ala
405 410 415
Leu ASp Leu ASP Gly Tyr Thr val ASp Glu Ala Leu Ala Ser Arg Arg
420 425 430
Leu phe Met Leu ASp Tyr His Asp val Phe Met pro Tyr He Arg Arg
435 440 445
ile Α5Π Gin Thr Tyr Ala Lys Ala Tyr Ala Thr Arg Thr Ile Leu Phe
450 455 450
Leu Arg Glu Asn Gly Thr Leu Lys Pro val Ala Ile Glu Leu ser Leu
465 470 475 480
Pro Hi s Pro Ala Gly ASP Leu Ser Gly Ala val ser Gin val ile Leu
485 490 495
Pro Ala Lys Glu Gly val Glu ser Thr ile Trp Leu Leu Ala Lys Ala
500 505 510
Tyr V3l val val Asn ASP ser cys Tyr His Gin Leu Met Ser His Trp
515 520 525
Leu Asn Thr His Ala val Ile Gl u Pro Phe Ile ile Ala Thr Asn Arg
530 535 540
His Leu Ser Ala Leu His Pro Ile Tyr Lys Leu teu Thr Pro His Tyr
545 550 555 560
Arg Asp Thr Met Asn Ile Asn Ala Leu Ala Arg Gin Ser Leu Ile Asrt
565 570 575
Ala ASP Gly ile Ile Glu Lys Ser Phe Leu Pro Ser Lys His Ser val
580 585 590
Glu Met ser Ser Ala val Tyr Lys Asn Trp val Phe Thr ASP Gin Ala
595 600 605
teu Pro Ala ASP Leu Ile tys Arg Gly val Ala Ile Lys ASP Pro Ser
610 615 620
Ala Pro His Gly Leu Arg teu lcu Ile Glu ASP Tyr Pro Tyr Ala val
625 630 635 640
ASP Gly Leu Glu Ile 645 Trp Ala Ala Ile Lys 650 Thr Trp val Gin Glu 655 Tyr
val Ser teu Tyr Tyr Ala Arg ASp Asp ASP val Lys Pro ASP ser Glu
PL 208 246 B1
660 665 670
Leu Gin Gin Trp Trp Lys Glu Ala Va1 Glu Lys Gly His Gly Asp Leu 675 680 685
Lys Asp Lys Pro Trp Trp Pro Lys Leu Gin Thr He Glu Glu Leu va1 690 695 700
Glu Ile Cys Thr ile He Ile Trp Thr Ala Ser Ala Leu His Ala Ala 705 710 715 720
va1 Asn phe Gly Gin Tyr 725 pro Tyr Gly Gly Phe Ile Leu 730 Asn Arg 735 Pro
Thr ser Ser Arg Arg Leu Leu Pro Glu Lys Gly Thr pro Glu Tyr Glu
740 745 750
Glu Met va1 Lys ser His Gin Lys Ala Tyr Leu Arg Thr ile Thr ser
755 760 765
Lys Phe Gin Thr Leu val ASP Leu ser val ile Glu Ile Leu Ser Arg
770 775 780
His Ala Ser Asp Glu val Tyr Leu Gly Gin Arg ASP Asn Pro His Trp
785 790 795 800
Thr Ser ASP Ser Lys Ala Leu Gin Ala Phe Gin Lys Phe Gly Asn Lys
805 810 815
Leu Lys Glu Ile Glu Glu Lys Leu Ala Arg Lys Asn ASn Asp Gin ser
820 825 830
Leu Ser Asn Arg Leu ciy Pro va1 Gin Leu pro Tyr Thr Leu Leu His
835 840 845
pro Asn Ser Glu Gly Leu Thr cys Arg Gly ile Pro Asn Ser ile Ser
850 855 860
ile
865 <210> 17 <2ll> 857 <212» PRT <213» Glycine max
<400> 17
Met Leu Gly Gly Leu teu His Arg ciy His Lys ile tys Gly Thr va1
1 5 10 15
va1 ueu Met Arg Lys Asn Val Leu Asp va1 Asn ser val Thr Ser va1
20 25 30
Gly Gly Ile Ile Gly Gin Gly Leu Asp Leu va1 Gly Ser Thr teu Asp 35 40 45
Thr Leu Thr Ala Phe Leu Gly Arg ser va1 ser Leu Gin Leu Ile Ser 50 55 60
PL 208 246 B1
Ala Thr Lys Ala Asp Ala Asn Gly Lys Gly Lys Leu Gly Lys Ala Thr ¢5 70 75 80
Phe Leu Glu Gly Ile Ile Thr Ser Leu Pro Thr Leu Gly Ala Gly Gln
90 95 ser Ala Phe Lys Ile Asn Phe Glu Trp Asp Asp Gly ser Gly Ile Pro 100 105 110
Gly Ala Phe Tyr ile Lys Asn Phe Met Gln Thr Glu Phe Phe Leu val y 115 120 125 ser Leu Thr Leu Glu Asp Ile Pro Asn wis Gly Ser ile His Phe val
130 135 140
Cys Asn ser Trp 145 Ile Tyr Asn Ala Lys Leu 150 Phe 155 Lys ser Asp Arg Ile 160
Phe Phe Ala Asn Gln Thr Tyr Leu Pro Ser Glu Thr pro Ala Pro Leu
165 170 175
val tys Tyr Arg 180 Glu Glu Glu Leu His 185 Asn Leu Arg Gly Asp 190 Gly Thr
Gly Glu Arg 195 Lys Glu Trp Glu Arg 200 ile Tyr ASP Tyr ASp 205 val Tyr Asn
ASp teu Gly ASp Pro Asp t/S Gly Glu Asn His Ala Arg pro val Leu
210 215 220
Gly Gly Asn ASP Thr Phe Pro Tyr Pro Arg Arg Gly Arg Thr Gly
225 230 235 240
Lys Pro Thr Arg Lys ASP Pro Asn ser Glu Ser Arg Ser Asn Asp val
245 250 255
Tyr Leu Pro Arg ASP Glu Ala Phe ciy His Leu Lys Ser Ser ASp phe
260 265 270
Leu Thr Tyr Gly Leu Lys Ser val ser Gln Asn val Leu Pro Leu Leu
275 280 285
Gln Ser Ala Phe ASp Leu Asn Phe Thr Pro Arg Glu Phe ASP ser Phe
290 295 300
ASp Glu val His Gly Leu Tyr Ser Gly Gly Ile Lys Leu Pro Thr ASp
305 310 315 320
Ile He Ser Lys Ile Ser Pro Leu pro val Leu Lys Glu Ile Phe Arg
32S 330 335
Thr Asp Gly Glu 340 Gln Ala Leu Lys Phe 345 Pro Pro pro Lys val 350 Ile Gln
val ser Lys 355 Ser Ala Trp Mex Thr 360 ASP Glu Glu Phe Ala 365 Arg Glu Met
Leu Ala Gly val Asn Pro Asn Leu Ile Arg Cys Leu Lys Asp Phe pro
370 375 380
Pro 385 Arg Ser Lys Leu ASP 390 ser Gln val Tyr Gly 395 Asp His Thr ser Gln 400
PL 208 246 B1
Ile Thr tys Glu His Leu Glu Pro Asn Leu Glu Gly Leu Thr val Asp 405 410 415
Glu Ala Ile Gin Asn Lys Arg leu Phe Leu Leu Asp His His Asp Pro 420 425 430
Ile Met Pro Tyr Leu Arg Arg ile Asn Ala Thr Ser Thr tys Ala Tyr 435 440 445
Ala Thr Arg Thr Ile Leu Phe Leu Lys Asn Asp Gly Thr Leu Arg Pro 450 455 460
Leu Ala ile Glu Leu Ser Leu Pro His Pro Gin Gly Asp Gin Ser Gly
465 470 475 480
Ala Phe Ser Gin val Phe Leu Pro Ala Asp Glu Gly val Glu Ser Ser
485 490 495
Ile Trp Leu Leu Ala Lys Ala Tyr val val val Asn Asp Ser cys Tyr 500 505 510
Hi5 Gin Leu val Ser His Trp Leu Asn Thr His Ala val val Glu Pro 515 520 525
Phe Ile ile Ala Thr Asn Arg His Leu Ser va! va1 His Pro ile Tyr 530 535 540
Lys 54 5 Leu Leu Hi s pro Hi s 550 Tyr Arg ASp Thr Met 555 Asn Ile Asn Gly 1 Leu 560
Ala Arg Leu Ser Leu val Asn Asp Gly Gly val Ile Gl u Gin Thr Phe
565 570 575
Leu Trp Gly Arg Tyr ser val Glu Met Ser Ala val val Tyr tys ASP
580 585 590
Trp val phe Thr ASP Gin Ala Leu pro Ala Asp Leu Ile tys Arg Gly
595 600 605
Met Ala Ile Glu ASP Pro Ser Cys Pro His Gly Ile Arg Leu val He
510 615 620
Glu Asp Tyr Pro Tyr Thr val Asp Gly Leu Glu Ile Trp Asp Ala Ile
625 630 63S 640
Lys Thr Trp val His Glu Tyr val Phe Leu Tyr Tyr tys 5er ASP ASp
645 650 655
Thr Leu Arg Glu ASp Pro Glu Leu Gin Ala Cys Trp Lys Glu Leu val
660 665 670
Glu val Gly His Gly Asp tys Lys Asn Glu Pro Trp Trp Pro tys Met
675 680 685
Gin Thr Arg Glu Glu Leu val Glu Ala Cys Ala ile Ile Ile Trp Thr
690 695 700
Ala Ser Ala Leu His Ala Ala val Asn phe Gly Gin Tyr Pro Tyr Gly
705 710 715 720
Gly Leu ile Leu Asn Arg Pro Thr Leu ser Arg Arg Phe Met pro Glu
725 730 735
Lys i Gly Ser Ala Glu Tyr Glu Glu ueu , Arg tys Asn Pro Gin Lys Ala
PL 208 246 B1
740 745 750
Tyr Leu Lys Thr ile Thr pro Lys Phe Gin Thr Leu Ile Asp Leu Ser
755 760 765
val Ile Glu Ile Leu Ser Arg Hi s Ala Ser ASp Glu val Tyr teu Gly
770 775 780
Glu Arg ASP Α5Π Pro Asn Trp Thr Ser Asp Thr Arg Ala Leu Glu Ala
785 790 795 800
Phe Lys Arg Phe Gly Asn Lys Leu Ala Gin Ile Glu Asn Lys Leu Ser
805 810 815
Glu Arg Asn Asn ASp Glu Lys Leu Asn Arg Cys Gly Pro val Gin
820 825 830
Met pro Tyr Thr Leu Leu Leu Pro Ser Ser Lys Glu Gly Leu Thr Phe
835 840 845
Arg Gly ile PrO ASrt Ser Ile Ser Ile
850 855
<210> 18
<211> 864
<212> PRT
<2l3> Hordeum vulgare
<400> 18
wet 1 Leu Gly val Gly 5 Gly Ile val Ser Asp 10 Leu Thr Gly Gly ile 15 Arg
Gly Ala His Leu Lys Gly Ser Val Val Leu Met Arg Lys Asn Ala Leu
20 25 30
ASp Phe Asn ASP Phe Gly Ala His val Met ASp Gly val Thr Glu Leu
35 40 45
Leu Gly 50 Arg Gly val Thr Cys 55 Gin Leu Ile Ser Ser 60 Thr Asn val ASP
Hi s Asn Asn Gly Gly Arg Gly Lys val Gly Ala Glu Ala Asn Leu Glu
65 70 75 80
Gin Trp Leu Leu Pro Thr Asn Leu Pro Phe Ile Thr Thr Gly Glu Asn
85 90 95
Lys Phe Ala va1 Thr Phe ASp Trp Ser val ASp Lys Leu Gly val Pro
100 105 110
Gly Ala Ile Ile val Lys Asn Asn His Ala ser Glu Phe Phe Leu Lys
115 120 125
Thr Ile Thr Leu ASp Asn val Pro Gly Arg Gly Thr Ile val Phe val
130 135 140
Ala Asn ser Trp val Tvr Pro Gin Ala Lys Tyr Arg Tyr Asn Arg val
145 150 155 160
PL 208 246 B1
Phe Phe Ala Asn Asp Thr Tyr Leu Pro His Gin Met Pro Ala Ala Leu 165 170 175
Lys Pro Tyr Arg Asp Asp Glu Leu Arg Asn Leu Arg Gly Asp Asp Gin 7 180 185 190
Gin Gly Pro Tyr Leu Asp His Asp Arg val Tyr Arg Tyr Asp val Tyr
19S 200 205
Asn Asp Leu Gly Asp ser Arg Asp val Leu Gly Gly ser Lys Asp Leu 210 215 220 pro Tyr Pro Arg Arg cys Arg Thr Gly Arg Lys pro Ser Asp Ser Lys
225 230 235 240 pro asp His Glu Ser Arg Leu Leu Leu teu val Gin Asn val Tyr val
245 250 255
Leu Arg Asp Glu Leu Phe Gly His Leu Lys Gin Ser Asp Leu Leu Gly 260 265 270
Tyr Thr Leu Lys Gly Trp Leu Asp Gly Ile Ile Leu Ala Ile Arg Thr 275 280 285
Tyr val Asp Leu ser Pro Gly Glu Phe Asp Ser Phe Ala Asp Ile Leu 290 295 300
Lys Leu Tyr Glu Gly Gly Ile Lys Leu pro ASn Ile Pro Ala Leu Glu
305 310 315 320
Glu val Arg Lys Arg Phe Pro Leu Gin Leu val Lys ASP Leu ile pro
325 330 335
Lys Gly Gly Asp Phe Leu Leu Lys Leu Pro Lys pro Glu Ile Ile Lys
340 345 350
val ASp Gin Lys Ala Trp Met Thr ASP Glu Glu Phe Ala Arg Glu Met
355 360 365
Leu Ala Gly val Α5Π Pro Met Met Ile Lys Arg Leu Thr Glu phe Pro
370 375 380
Pro Lys Ser Thr Leu ASP Pro Ser Lys Tyr Gly ASP His Thr Ser Thr
385 390 395 400
Met Thr Glu Glu Hi s val Ala Lys ser Leu Glu Gly Leu Thr val Gin
405 410 415
Gin Ala Leu Ala Gly Asn Arg Leu Tyr Ile val ASp Gin His ASp ASn
420 425 430
Leu Met Pro Phe Leu Ile Asp Ile Asn Asn Leu ASp Ala ser Phe val
435 440 445
Tyr Ala Thr Arg Thr Leu Leu phe Leu Arg Gly ASp Gly Thr Leu Ala
450 455 460
pro val Ala ile Glu Leu Ser Ser Pro Leu ile Gin Gly Glu Leu Thr
465 470 475 480
Thr Al a Lys Ser Ala val Tyr Thr Pro Gin His Ala Gly val Glu Gly
485 490 495
PL 208 246 B1
Trp ile Trp Gin Leu Ala Lys Ala Tyr Ala Ser val Asn Asp Tyr Gly 500 505 510
Trp His Gin Leu ile Ser His Trp Leu Asn Thr His Ala val Met Glu 515 520 525
Pro Phe val Ile Ala Thr Asn Arg Gin Leu Ser val Thr His Pro val 530 535 540
Tyr Lys Leu Leu His Pro His Tyr Arg Asp Thr Met Asn Ile Asn Ala
545 550 555 560
Arg Ala Arg Gly Leu teu Ile Asn Ala Gly Gly val Ile Glu Met Thr
565 570 575 val Phe Pro His Lys His Ala Met Pro Met Ser Ser Met val Tyr Lys 580 585 590
His Trp Asn Phe Thr Glu Gin Ala teu Pro Ala Asp Leu Ile Lys Arg 595 600 605
Gly wet Ala val Glu Asp Ala ser Ser Pro His Lys val Arg Leu teu €10 615 620 ile Lys asp Tyr Pro Tyr Ala Thr Asp Gly Leu Ala val Trp Asp Ala
625 630 635 640
Ile Glu Gin Trp val Ser Asp Tyr Leu Thr Ile Tyr Tyr pro Asn Asp
645 650 655
Gly val Leu Gin Gly 660 Asp val Glu Leu 665 Gin Ala Trp Trp Lys 670 Glu val
Arg Glu val Gly His Gly ASP Leu Lys ASp Ala Ala Trp Trp Pro Lys
675 680 685
wet Gin Thr val Ala Glu Leu ile Lys Ala Cys Ala Thr Ile Ile Trp
690 695 700
Thr Gly ser Ala Leu His Ala Ala val Asn Phe Gly Gin Tyr Pro
705 710 715 720
Ser Gly Tyr His Pro Asn Lys Pro Ser Ala ser Arg Arg Pro Met Pro
725 730 735
val Gin Gly Ser Glu Glu Tyr Ala Glu Leu Glu Arg ASP pro Gl u Lys
740 745 750
Ala Phe Ile Arg Thr Ile Thr ser Gin Phe His Ala Leu val Gly ile
755 760 765
Ser Leu Met Gl U Ile Leu ser Lys His Ser Ser ASP Glu val Tyr teu
770 775 780
Gly Gin His ASP Thr pro Ala Trp Thr Ser ASP Ala Lys Ala Leu Glu
785 790 795 800
Ala Phe tys Arg Phe 805 Gly Ala Lys Leu Glu 810 Gly ile Glu Lys Gin 815 val
val Ala Met Asn Ser Asp pro Gin Leu Lys Asn Arg Thr Gly Pro Ala
820 825 830
Lys Phe Pro Tyr Met Leu Leu Tyr pro Asn Thr Ser Asp His Thr Gly
835 840 845
Gin Ala Glu Gly Leu Thr Ala Arg Gly Ile Pro Asn Ser Ile Ser 850 855 860

Claims (12)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Roślina jęczmienia lub jej część, znamienna tym, że zawiera zmutowane białko LOX-1, przy czym aktywność LOX-1 rośliny lub części rośliny jest zmniejszona lub nie występuje w porównaniu z niezmutowaną kontrolą, i przy czym to zmutowane białko LOX-1 zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID NO: 12, w której Xaa oznacza kwas asparaginowy, kwas glutaminowy, histydynę, lizynę, argininę, treoninę, serynę, tyrozynę, tryptofan, asparaginę albo glutaminę.
  2. 2. Roślina jęczmienia lub jej część według zastrz. 1, znamienna tym, że aktywność LOX-1 obejmuje katalizę utleniania wolnych i zestryfikowanych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych oraz wielonienasyconych oktadekanowych kwasów tłuszczowych do wytworzenia pochodnych 9-hydroperoksy kwasu tłuszczowego.
  3. 3. Roślina jęczmienia lub część według zastrz. 1, znamienna tym, że Xaa stanowi kwas glutaminowy albo kwas asparaginowy.
  4. 4. Roślina jęczmienia lub część według zastrz. 3, znamienna tym, że Xaa stanowi kwas asparaginowy.
  5. 5. Ziarno lub potomstwo rośliny, znamienne tym, że zawiera zmutowane białko LOX-1, przy czym aktywność LOX-1 tej rośliny lub części rośliny jest zmniejszona lub nie występuje w porównaniu z nie-zmutowaną kontrolą, i przy czym zmutowane białko LOX-1 zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID NO: 12, w której Xaa oznacza kwas asparaginowy, kwas glutaminowy, histydynę, lizynę, argininę, treoninę, serynę, tyrozynę, tryptofan, asparaginę albo glutaminę, i przy czym ziarno lub potomstwo rośliny jest wytworzone z rośliny lub części rośliny jak określono w jednym z zastrz. 1 do 4.
  6. 6. Produkt roślinny, znamienny tym, że zawiera zmutowane białko LOX-1, przy czym aktywność LOX-1 tej rośliny lub części rośliny jest zmniejszona lub nie występuje w porównaniu z niezmutowaną kontrolą, i przy czym zmutowane białko LOX-1 zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID NO: 12, w której Xaa oznacza kwas asparaginowy, kwas glutaminowy, histydynę, lizynę, argininę, treoninę, serynę, tyrozynę, tryptofan, asparaginę albo glutaminę, i przy czym ten produkt roślinny jest wytworzony z rośliny lub części rośliny jak określono w jednym z zastrz. 1 do 4 albo ziarna lub potomstwa rośliny jak określono w zastrz. 5.
  7. 7. Produkt roślinny według zastrz. 6, znamienny tym, że stanowi słód.
  8. 8. Zastosowanie produktu roślinnego określonego w zastrz. 6 albo 7, do wytwarzania napoju wykazującego właściwości organoleptyczne, które pozostają stabilne podczas mierzonego okresu czasu lub w podwyższonych temperaturach przechowywania w porównaniu do napoju wytworzonego z produktu roślinnego z niezmutowanej kontroli.
  9. 9. Zastosowanie rośliny jęczmienia lub jej części, ziarna lub potomstwa rośliny, lub produktu roślinnego jak określono w jednym z zastrz. 1-7, do wytwarzania napoju.
  10. 10. Zastosowanie rośliny jęczmienia lub jej części, ziarna lub potomstwa rośliny, lub produktu roślinnego jak określono w jednym z zastrz. 1-7, do wytwarzania słodu lub piwa.
  11. 11. Zastosowanie rośliny jęczmienia lub jej części, ziarna lub potomstwa rośliny, lub produktu roślinnego jak określono w jednym z zastrz. 1-7, do stabilizowania właściwości organoleptycznych produktu warzonego podczas mierzonego okresu czasu w porównaniu z kontrolnym produktem warzonym wytworzonym przy użyciu niezmutowanej rośliny jęczmienia lub jej części, ziarna lub potomstwa rośliny, lub produktu roślinnego.
  12. 12. Zastosowanie rośliny jęczmienia lub jej części, ziarna lub potomstwa rośliny, lub produktu roślinnego jak określono w jednym z zastrz. 1-7, do wytwarzania produktu warzonego posiadającego obniżone poziomy wolnego trans-2-nonenalu podczas mierzonego okresu czasu lub w warunkach o podwyższonej temperaturze przechowywania w porównaniu z kontrolnym produktem warzonym wytworzonym z użyciem niezmutowanej rośliny jęczmienia lub jej części, ziarna lub potomstwa rośliny, lub produktu roślinnego.
PL363480A 2000-12-29 2001-01-22 Roślina jęczmienia, jej część, ziarno, potomstwo rośliny, produkt roślinny, zastosowanie produktu roślinnego i zastosowanie rośliny jęczmienia, jej części, ziarna i potomstwa PL208246B1 (pl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/751,687 US6660915B2 (en) 2000-12-29 2000-12-29 Low lipoxygenase 1 barley
PCT/IB2000/002045 WO2002053720A1 (en) 2000-12-29 2000-12-29 Low-lipoxygenase 1 barley
PCT/IB2001/000207 WO2002053721A1 (en) 2000-12-29 2001-01-22 Low-lipoxygenase 1 barley

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL363480A1 PL363480A1 (pl) 2004-11-15
PL208246B1 true PL208246B1 (pl) 2011-04-29

Family

ID=26318622

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL363480A PL208246B1 (pl) 2000-12-29 2001-01-22 Roślina jęczmienia, jej część, ziarno, potomstwo rośliny, produkt roślinny, zastosowanie produktu roślinnego i zastosowanie rośliny jęczmienia, jej części, ziarna i potomstwa

Country Status (19)

Country Link
EP (2) EP2305797A3 (pl)
JP (1) JP5004402B2 (pl)
CN (1) CN100372930C (pl)
AT (1) ATE531794T1 (pl)
BG (1) BG66243B1 (pl)
BR (1) BR0116579A (pl)
CA (1) CA2433250C (pl)
CZ (1) CZ298689B6 (pl)
DK (1) DK1346030T3 (pl)
EA (1) EA007955B1 (pl)
EE (1) EE05567B1 (pl)
ES (1) ES2376415T3 (pl)
HU (1) HUP0401290A3 (pl)
NZ (1) NZ527171A (pl)
PL (1) PL208246B1 (pl)
PT (1) PT1346030E (pl)
SK (1) SK9372003A3 (pl)
UA (1) UA88130C2 (pl)
WO (1) WO2002053721A1 (pl)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4113795B2 (ja) * 2003-03-25 2008-07-09 サッポロビール株式会社 大麦リポキシゲナーゼ−１遺伝子、大麦の選抜方法、麦芽アルコール飲料用原料及び麦芽アルコール飲料の製造方法
US7420105B2 (en) * 2004-03-11 2008-09-02 Carlsberg A/S Barley for production of flavor-stable beverage
US9587210B2 (en) 2008-12-03 2017-03-07 Carlsberg Breweries A/S Energy saving brewing method
MX2011005619A (es) 2008-12-03 2011-09-09 Carlsberg Breweries As Bebidas derivadas de cebada y malta con niveles bajos de sulfuro de dimetilo.
SA109310019B1 (ar) 2008-12-30 2014-09-10 Carlsberg Breweries As شعير له نشاط ليبوأوكسجيناز منخفض
WO2011074964A1 (en) * 2009-12-18 2011-06-23 Keygene N.V. Improved bulked mutant analysis
CN103209584B (zh) 2010-06-03 2014-10-29 嘉士伯酿酒有限公司 节能酿造方法
JP2017205038A (ja) * 2016-05-17 2017-11-24 サッポロビール株式会社 ビールテイスト飲料、ビールテイスト飲料の製造方法、及びビールテイスト飲料の香味向上方法
JP2017205036A (ja) * 2016-05-17 2017-11-24 サッポロビール株式会社 ビールテイスト飲料、ビールテイスト飲料の製造方法、及びビールテイスト飲料の香味向上方法
JP6691826B2 (ja) * 2016-06-01 2020-05-13 サッポロビール株式会社 蒸留酒類
RS67705B1 (sr) 2016-07-01 2026-02-27 Carlsberg Breweries As Prerađena pića zasnovana na žitaricama
CN106405024B (zh) * 2016-08-25 2018-08-24 青岛啤酒股份有限公司 一种评价麦芽脂质氧化程度的方法
ES2986024T3 (es) 2017-12-28 2024-11-08 Carlsberg As Métodos rápidos para preparar extractos de cereales
UA128208C2 (uk) 2017-12-28 2024-05-08 Карлсберг А/С Спосіб одержання водного екстракту зернової культури та спосіб одержання напою
EP3784058A1 (en) 2018-04-25 2021-03-03 Carlsberg A/S Barley based beverages
CN111718974B (zh) * 2020-06-29 2021-09-24 中食都庆（山东）生物技术有限公司 绿豆肽在制备促排铅的药物中的应用、活性肽及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1339684C (en) 1988-05-17 1998-02-24 Peter H. Quail Plant ubquitin promoter system
AU7443596A (en) * 1995-10-13 1997-04-30 Purdue Research Foundation Improvement of fruit quality by inhibiting production of lipoxygenase in fruits
US5844121A (en) 1996-01-19 1998-12-01 The Texas A & M University System Method of inhibiting mycotoxin production in seed crops by modifying lipoxygenase pathway genes

Also Published As

Publication number Publication date
HUP0401290A2 (hu) 2004-09-28
WO2002053721A1 (en) 2002-07-11
DK1346030T3 (da) 2012-02-13
EP1346030B1 (en) 2011-11-02
UA88130C2 (uk) 2009-09-25
PT1346030E (pt) 2012-02-08
NZ527171A (en) 2005-07-29
CA2433250A1 (en) 2002-07-11
HUP0401290A3 (en) 2005-06-28
CA2433250C (en) 2015-08-11
EP2305797A3 (en) 2011-07-13
CZ298689B6 (cs) 2007-12-19
BR0116579A (pt) 2004-04-20
ES2376415T3 (es) 2012-03-13
PL363480A1 (pl) 2004-11-15
EA200300743A1 (ru) 2004-02-26
CN1487995A (zh) 2004-04-07
JP2004522434A (ja) 2004-07-29
CN100372930C (zh) 2008-03-05
EE200300257A (et) 2003-10-15
ATE531794T1 (de) 2011-11-15
BG107971A (bg) 2004-09-30
SK9372003A3 (en) 2004-05-04
EA007955B1 (ru) 2007-02-27
EP2305797A2 (en) 2011-04-06
EE05567B1 (et) 2012-08-15
JP5004402B2 (ja) 2012-08-22
CZ20031872A3 (cs) 2003-11-12
BG66243B1 (bg) 2012-08-31
EP1346030A1 (en) 2003-09-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102333440B (zh) 脂加氧酶活性降低的大麦
CN1981041B (zh) 产生风味稳定饮料的大麦
EP1346030B1 (en) Low-lipoxygenase 1 barley
JP6007174B2 (ja) エネルギーを節約した醸造法
US6660915B2 (en) Low lipoxygenase 1 barley
AU2001230454B2 (en) Low-lipoxygenase 1 Barley
WO2002053720A1 (en) Low-lipoxygenase 1 barley
AU2001230454A1 (en) Low-lipoxygenase 1 Barley
LI et al. GERSTE MIT REDUZIERTER LIPOXYGENASE AKTIVITÄT UND EIN DAMIT HERGESTELLTES GETRÄNK ORGE À ACTIVITÉ RÉDUITE EN LIPOXYGÉNASE ET UNE BOISSON PRODUITE À PARTIR DE CETTE ORGE
HK1162851B (en) Barley with reduced lipoxygenase activity and beverage prepared therefrom

Legal Events

Date Code Title Description
VDSO Invalidation of derivated patent or utility model

Ref document number: 391445

Country of ref document: PL

Kind code of ref document: A1